JP2013514059A - 多能性幹細胞を製作するための材料と方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図4A
Description
一つの態様において、本発明はiPS細胞を得るための方法を提供する。いくつかの実施形態において、該方法は、羊膜上皮細胞のフィーダー層(AECs)で体細胞を充分な時間をかけて培養し、体細胞を脱分化また再プログラミングさせることを含む。
一つの実施形態において、羊膜上皮細胞(AEC)は、iPS細胞に脱分化する体細胞を誘導する、即ち「再プログラミング」のために体細胞を培養する際のフィーダー層として使用されるものである。AECは、受精後約8日目の胞胚の初期内部細胞塊から得られる。用語「羊膜」は、母体と胎児との間の重要な物質輸送用組織であり、胎膜を指す。AECは、ヒト、ブタ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラットなどの哺乳動物に由来することができる。
再プログラミングすることができる体細胞の類型については特に限定がない。任意の種類の体細胞を使用することができる。成熟した体細胞が使用できるのと同様に、胚段階の体細胞も使用することができる。体細胞は初代培養細胞または不死化細胞であってもよい。このような細胞は、新たに動物から分離されたものと初代培養細胞(非不死化細胞)である可能性があり、または細胞株(不死化細胞)に由来する可能性がある。一つの実施形態では、体細胞は哺乳動物の細胞である、例えば、ヒト細胞またはマウス細胞である。従来の方法では、異なる器官から公知の方法によって得ることが可能であるが、例えば皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、尿道や他の泌尿器官に限らず、またはいかなる活性細胞(living somatic cells)を有する器官または組織、または血液細胞から採取できる。本発明において有用な哺乳類の体細胞は、成体幹細胞、脂肪細胞、間葉系細胞、セルトリ細胞、内皮細胞、顆粒膜上皮細胞、神経細胞、膵島細胞、表皮細胞、上皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球(BおよびTリンパ球)、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、線維芽細胞、心筋細胞、その他の既知の筋肉細胞、及び一般的には、任意の生きている体細胞である。特定の実施形態においては、線維芽細胞が使用されている。本明細書で使用される用語「体細胞」は、また、「成体幹細胞」をも含むことを意図している。成体幹細胞は、特定の組織のあらゆる細胞のタイプを生成することができる細胞である。典型的な成体幹細胞は造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞を含む。
一つの態様において、本発明はiPS細胞を生成するために、体細胞を再プログラミングおよび増殖するための方法を提供したものである。羊膜上皮細胞(AEC)をフィーダー条件として、細胞が成長して継代の細胞を得ることで、iPSを得ることができる。例えば、体細胞は、適切な媒体、例えば、ウシ胎児血清で強化されたDMEMでAECのフィーダー層上に培養することができる。細胞は、約2−14日間、典型的には約7日間、または細胞が未分化幹細胞の形態学的特徴を示すまで、培養される。
本発明はさらに、一過性または安定した方式で、遺伝子改変されたiPS細胞を得るためのシステムを提供するものである。細胞は、未分化している状態では所望の特性を付与するために改変することができ、これによってそれが他の細胞に分化する際は所望の特性を有するようにする。または方法を提供し、肯定的または否定的な選択による、特に未分化または分化した表現型の選択に必要な特性を与えるものである。
本発明は、本明細書で記載する方法で生成したiPS細胞、及びこのような細胞群を提供することを開示している。再プログラミングした細胞は、多くの種類の細胞に分化させることができ、様々な応用と治療における用途を有している。幹細胞の基本的な特性(例えば無限の自己複製能力、及び体中の各種細胞タイプに分化することができる)のため、幹細胞は治療における理想的な選択肢となっている。
この実施例は、ヒト羊膜上皮細胞(hAECs)の調製について記載している。ヒト羊膜は帝王切開の妊婦から得たものである。ヒト羊膜を胎盤上から剥離した後、下にあるスポンジ層及び線維芽細胞層を取り除いた後、羊膜細胞と基底膜ゾーン(BMZ)(重層上皮の下にある)を含む羊膜を得て、膜上から羊膜細胞を分離した。膜を細かく裁断し、RPMI 1640培地の入っている250mlのフラスコに入れた。細胞は0.25%トリプシン/EDTAで30分間消化させ、二回目は15分間消化させた。細胞を遠心分離により収集し、6ウェルプレートに播種した。細胞はDMEM培養基+10%FBS(PAA Austria)、及び一般的に細胞培養で使用されている抗生物質を有するものにおいて細胞培養され、37°C,5%CO2で培養した。
この実施例は成人皮膚線維芽細胞(ADSF)の調製について説明したものである。ADSF細胞を含む成人皮膚組織または瘢痕組織を分離して、冷PBS中に置いた。皮膚は約1mm2大きさの片に切断され、0.25%トリプシン、0.2mg/mlDNaseIを含むPBSにおいて37℃で30分間培養して、15%の熱不活化ウマ血清を含むDMEMで中和した。細胞濃度を約1×106/mlに調整して、6ウェルプレートに播種する。細胞は、37℃、5%CO2で培養した。
この実施例はマウス線維芽細胞の分離について説明している。無菌条件下において、マウスの耳から採取した組織を、約1mm3の断片に切断した。組織は、PBSで2回洗浄し、6ウェルプレートの、DMEM培地中に置かれ、終夜培養した。二日目に、2mlの培地を添加し、プレートの約90%が細胞で覆われるまで培養を継続した。細胞を37℃、5%CO2条件下で培養した。
この実施例は、ブタ胚性線維芽細胞の分離について説明している。無菌条件下において、ブタの胚をPBSで2−3回洗浄した。豚の頭部及び内臓を廃棄して、残りの胚組織を約1mm3の断片に切断した。PBSで2回洗浄して、血液細胞を除去した。DMEM培地を加え、組織を37℃、5%CO2で終夜培養した。二日目に、6mlの培地を加えて、プレートの約90%が被覆されるまで培養を継続した。
ADSF細胞は中国福祉会国際平和婦幼保健院(International Peace Maternity and Children’s Hospital of the China Welfare Institute)によって提供され、実施例2に記載のように調製した。細胞はhAECフィーダー層と共に、KO−DMEM培地(10ng/mlβFGF、5%ヒト臍帯血清及び12ng/ml hLIFを含む)を使用して培養した。細胞の状態については培養過程を通して観察された。培養は37°C、5%CO2条件下で培養した。その結果は図1に示すとおりである。7日間培養した後に、外観がES細胞に似たクローンが見られた。
実施例2に記載のようにマウス線維芽細胞を調製した。細胞は、KO−DMEM培地(10ng/mlβFGF、5%ヒト臍帯血清、12ng/ml hLIFを含む)にhAECフィーダー層と共に培養した。細胞の状態については培養過程を通して観察された。培養は37°C、5%CO2条件下で培養した。その結果は図5に示すとおりである。3日間培養した後に、外観がES細胞に似たクローンが見られた。
実施例2に記載のようにブタ胚性線維芽細胞を調製した。細胞は、KO−DMEM培地(10ng/mlβFGF、5%ヒト臍帯血清、12ng/ml hLIFを含む)にhAECフィーダー層と共に培養した。細胞の状態については培養過程を通して観察された。培養は37°C、5%CO2、5%O2条件下で培養した。その結果は図7に示すとおりである。5〜7日間培養した後に、外観がES細胞に似たクローンが見られた。
この例は免疫蛍光技術を用いることで、iPS細胞の幹細胞マーカー遺伝子の発現について分析することを説明している。細胞はPBSで3回洗浄し、室温において2%パラホルムアルデヒドで固定した。PBSで3回洗浄し、毎回5分間であった。0.1%TritonX−100で室温において15min浸透させた。次に、PBSで3回洗浄して、毎回5分間であった。5%BSAで室温において2時間ブロッキングした。SSEA−4、NANOG、OCT−4に対する一次抗体を加え、終夜培養した。PBSで3回洗浄して、毎回5分間であった。室温下において二次蛍光マーカーで1時間反応させ、標識させた。細胞は室温下において、暗い環境中で、Hochest染料(1:1000)と共に、培養した。グリセリン神経節溶解後に陽性細胞が観察される。ADSF−iPS細胞の分析の結果は、図2に示すとおりである。ADSF−iPS細胞中の陽性幹細胞マーカーは染色されていることがわかる。MF−iPS細胞の分析の結果は、図6に示すとおりである。
この実施例は、RT−PCR技術を用いてiPS細胞の幹細胞マーカー遺伝子の発現の分析について説明している。mRNAの抽出及びRT−PCR法は、製造メーカの指示(Promega AS−1050)に従って行われた。それぞれのマーカー遺伝子に使用したPCRプライマーは表1に示すとおりである。各グループの細胞のcDNAをリアルタイムPCR(Eppendorf社のRealPlex装置を用いる)のテンプレートとした。RT−PCRは2ステップ法によって行い、ターゲットとなるフラグメントの増幅は、18s rRNA量の相対的定量方法によって計算した。
細胞の調製。マウス線維芽細胞から派生した1×106の多能性細胞を100mm培養皿に播種した。48時間の培養後、培地を変更して(5mL)一晩インキュベートした。次に、70ng/mLのコルヒチンを添加し、培養を5時間続けた。細胞を回収し、75mMのKC1で10〜20分間処理して、固定液(メタノール:酢酸=3:1(vol/vol))で固定した細胞懸濁液を得た。
本実施例では、奇形腫を形成するためにiPS細胞の能力を調べた。iPS細胞はマウス皮膚線維芽細胞から、ヒト羊膜上皮細胞の存在下で誘導した。体内での誘導多能性細胞の多能性を調べるために、細胞を免疫不全ヌードマウスの背側腹部に皮下移植した。注射の8週間後、腫瘍の形成が観察された。検査では腫瘍が多種の組織を含み(図9)、腺組織(内胚葉)、筋肉(中胚葉)、皮膚組織(外胚葉)を含むことがわかる。奇形腫の組織構造は、iPS細胞が発生多能性を有していることを示した。
一つの態様において、本発明はiPS細胞を得るための方法を提供する。いくつかの実施形態において、該方法は、羊膜上皮細胞のフィーダー層(AECs)で体細胞を充分な時間をかけて培養し、体細胞を脱分化また再プログラミングさせることを含む。
一つの実施形態において、羊膜上皮細胞(AEC)は、iPS細胞に脱分化する体細胞を誘導する、即ち「再プログラミング」のために体細胞を培養する際のフィーダー層として使用されるものである。AECは、受精後約8日目の胞胚の初期内部細胞塊から得られる。用語「羊膜」は、母体と胎児との間の重要な物質輸送用組織であり、胎膜を指す。AECは、ヒト、ブタ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラットなどの哺乳動物に由来することができる。
再プログラミングすることができる体細胞の類型については特に限定がない。任意の種類の体細胞を使用することができる。成熟した体細胞が使用できるのと同様に、胚段階の体細胞も使用することができる。体細胞は初代培養細胞または不死化細胞であってもよい。このような細胞は、新たに動物から分離されたものと初代培養細胞(非不死化細胞)である可能性があり、または細胞株(不死化細胞)に由来する可能性がある。一つの実施形態では、体細胞は哺乳動物の細胞である、例えば、ヒト細胞またはマウス細胞である。従来の方法では、異なる器官から公知の方法によって得ることが可能であるが、例えば皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、尿道や他の泌尿器官に限らず、またはいかなる活性細胞(living somatic cells)を有する器官または組織、または血液細胞から採取できる。本発明において有用な哺乳類の体細胞は、成体幹細胞、脂肪細胞、間葉系細胞、セルトリ細胞、内皮細胞、顆粒膜上皮細胞、神経細胞、膵島細胞、表皮細胞、上皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球(BおよびTリンパ球)、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、線維芽細胞、心筋細胞、その他の既知の筋肉細胞、及び一般的には、任意の生きている体細胞である。特定の実施形態においては、線維芽細胞が使用されている。本明細書で使用される用語「体細胞」は、また、「成体幹細胞」をも含むことを意図している。成体幹細胞は、特定の組織のあらゆる細胞のタイプを生成することができる細胞である。典型的な成体幹細胞は造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞を含む。
一つの態様において、本発明はiPS細胞を生成するために、体細胞を再プログラミングおよび増殖するための方法を提供したものである。羊膜上皮細胞(AEC)をフィーダー条件として、細胞が成長して継代の細胞を得ることで、iPSを得ることができる。例えば、体細胞は、適切な媒体、例えば、ウシ胎児血清で強化されたDMEMでAECのフィーダー層上に培養することができる。細胞は、約2−14日間、典型的には約7日間、または細胞が未分化幹細胞の形態学的特徴を示すまで、培養される。
本発明はさらに、一過性または安定した方式で、遺伝子改変されたiPS細胞を得るためのシステムを提供するものである。細胞は、未分化している状態では所望の特性を付与するために改変することができ、これによってそれが他の細胞に分化する際は所望の特性を有するようにする。または方法を提供し、肯定的または否定的な選択による、特に未分化または分化した表現型の選択に必要な特性を与えるものである。
本発明は、本明細書で記載する方法で生成したiPS細胞、及びこのような細胞群を提供することを開示している。再プログラミングした細胞は、多くの種類の細胞に分化させることができ、様々な応用と治療における用途を有している。幹細胞の基本的な特性(例えば無限の自己複製能力、及び体中の各種細胞タイプに分化することができる)のため、幹細胞は治療における理想的な選択肢となっている。
この実施例は、ヒト羊膜上皮細胞(hAECs)の調製について記載している。ヒト羊膜は帝王切開の妊婦から得たものである。ヒト羊膜を胎盤上から剥離した後、下にあるスポンジ層及び線維芽細胞層を取り除いた後、羊膜細胞と基底膜ゾーン(BMZ)(重層上皮の下にある)を含む羊膜を得て、膜上から羊膜細胞を分離した。膜を細かく裁断し、RPMI 1640培地の入っている250mlのフラスコに入れた。細胞は0.25%トリプシン/EDTAで30分間消化させ、二回目は15分間消化させた。細胞を遠心分離により収集し、6ウェルプレートに播種した。細胞はDMEM培養基+10%FBS(PAA Austria)、及び一般的に細胞培養で使用されている抗生物質を有するものにおいて細胞培養され、37°C,5%CO2で培養した。
この実施例は成人皮膚線維芽細胞(ADSF)の調製について説明したものである。ADSF細胞を含む成人皮膚組織または瘢痕組織を分離して、冷PBS中に置いた。皮膚は約1mm2大きさの片に切断され、0.25%トリプシン、0.2mg/mlDNaseIを含むPBSにおいて37℃で30分間培養して、15%の熱不活化ウマ血清を含むDMEMで中和した。細胞濃度を約1×106/mlに調整して、6ウェルプレートに播種する。細胞は、37℃、5%CO2で培養した。
この実施例はマウス線維芽細胞の分離について説明している。無菌条件下において、マウスの耳から採取した組織を、約1mm3の断片に切断した。組織は、PBSで2回洗浄し、6ウェルプレートの、DMEM培地中に置かれ、終夜培養した。二日目に、2mlの培地を添加し、プレートの約90%が細胞で覆われるまで培養を継続した。細胞を37℃、5%CO2条件下で培養した。
この実施例は、ブタ胚性線維芽細胞の分離について説明している。無菌条件下において、ブタの胚をPBSで2−3回洗浄した。豚の頭部及び内臓を廃棄して、残りの胚組織を約1mm3の断片に切断した。PBSで2回洗浄して、血液細胞を除去した。DMEM培地を加え、組織を37℃、5%CO2で終夜培養した。二日目に、6mlの培地を加えて、プレートの約90%が被覆されるまで培養を継続した。
ADSF細胞は中国福祉会国際平和婦幼保健院(International Peace Maternity and Children’s Hospital of the China Welfare Institute)によって提供され、実施例2に記載のように調製した。細胞はhAECフィーダー層と共に、KO−DMEM培地(10ng/mlbFGF、5%ヒト臍帯血清及び12ng/ml hLIFを含む)を使用して培養した。細胞の状態については培養過程を通して観察された。培養は37°C、5%CO2条件下で培養した。その結果は図1に示すとおりである。7日間培養した後に、外観がES細胞に似たクローンが見られた。
実施例2に記載のようにマウス線維芽細胞を調製した。細胞は、KO−DMEM培地(10ng/mlbFGF、5%ヒト臍帯血清、12ng/ml hLIFを含む)にhAECフィーダー層と共に培養した。細胞の状態については培養過程を通して観察された。培養は37°C、5%CO2条件下で培養した。その結果は図5に示すとおりである。3日間培養した後に、外観がES細胞に似たクローンが見られた。
実施例2に記載のようにブタ胚性線維芽細胞を調製した。細胞は、KO−DMEM培地(10ng/mlbFGF、5%ヒト臍帯血清、12ng/ml hLIFを含む)にhAECフィーダー層と共に培養した。細胞の状態については培養過程を通して観察された。培養は37°C、5%CO2、5%O2条件下で培養した。その結果は図7に示すとおりである。5〜7日間培養した後に、外観がES細胞に似たクローンが見られた。
この例は免疫蛍光技術を用いることで、iPS細胞の幹細胞マーカー遺伝子の発現について分析することを説明している。細胞はPBSで3回洗浄し、室温において2%パラホルムアルデヒドで固定した。PBSで3回洗浄し、毎回5分間であった。0.1%TritonX−100で室温において15min浸透させた。次に、PBSで3回洗浄して、毎回5分間であった。5%BSAで室温において2時間ブロッキングした。SSEA−4、NANOG、OCT−4に対する一次抗体を加え、終夜培養した。PBSで3回洗浄して、毎回5分間であった。室温下において二次蛍光マーカーで1時間反応させ、標識させた。細胞は室温下において、暗い環境中で、Hochest染料(1:1000)と共に、培養した。グリセリン神経節溶解後に陽性細胞が観察される。ADSF−iPS細胞の分析の結果は、図2に示すとおりである。ADSF−iPS細胞中の陽性幹細胞マーカーは染色されていることがわかる。MF−iPS細胞の分析の結果は、図6に示すとおりである。
この実施例は、RT−PCR技術を用いてiPS細胞の幹細胞マーカー遺伝子の発現の分析について説明している。mRNAの抽出及びRT−PCR法は、製造メーカの指示(Promega AS−1050)に従って行われた。それぞれのマーカー遺伝子に使用したPCRプライマーは表1に示すとおりである。各グループの細胞のcDNAをリアルタイムPCR(Eppendorf社のRealPlex装置を用いる)のテンプレートとした。RT−PCRは2ステップ法によって行い、ターゲットとなるフラグメントの増幅は、18s rRNA量の相対的定量方法によって計算した。
細胞の調製。マウス線維芽細胞から派生した1×106の多能性細胞を100mm培養皿に播種した。48時間の培養後、培地を変更して(5mL)一晩インキュベートした。次に、70ng/mLのコルヒチンを添加し、培養を5時間続けた。細胞を回収し、75mMのKC1で10〜20分間処理して、固定液(メタノール:酢酸=3:1(vol/vol))で固定した細胞懸濁液を得た。
本実施例では、奇形腫を形成するためにiPS細胞の能力を調べた。iPS細胞はマウス皮膚線維芽細胞から、ヒト羊膜上皮細胞の存在下で誘導した。体内での誘導多能性細胞の多能性を調べるために、細胞を免疫不全ヌードマウスの背側腹部に皮下移植した。注射の8週間後、腫瘍の形成が観察された。検査では腫瘍が多種の組織を含み(図9)、腺組織(内胚葉)、筋肉(中胚葉)、皮膚組織(外胚葉)を含むことがわかる。奇形腫の組織構造は、iPS細胞が発生多能性を有していることを示した。
Claims (20)
- 誘導多能性幹細胞を製作するための方法であって、
一つまたは複数の体細胞を、羊膜細胞のフィーダー層上で一定時間培養し、該一定時間は体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングするのに十分な時間であることを特徴とする、誘導多能性幹細胞を製作するための方法。 - 上記羊膜細胞は羊膜上皮細胞、胚体外の間葉系細胞または羊水細胞であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記羊膜上皮細胞は哺乳動物の羊膜上皮細胞であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 上記哺乳動物の羊膜上皮細胞は霊長類、ブタ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ウサギ及びげっ歯類に由来することを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 上記羊膜上皮細胞は、ヒト羊膜上皮細胞であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 上記羊膜上皮細胞は、継代培養6代目以内のもの(P0−P5)であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記羊膜上皮細胞は、新たに分離されたP0羊膜上皮細胞であることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 上記体細胞は成熟した体細胞であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記体細胞は胚ステージからの体細胞であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記体細胞は成人皮膚線維芽細胞(ADSF)、ヒト胚性線維芽細胞(HEF)、マウス線維芽細胞(MF)、マウス胚性線維芽細胞(MEF)、ブタ線維芽細胞(PF)、及びブタ胚性線維芽細胞(PEF)からなる群より選ばれたものであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記細胞はKO−DMEM培地で培養されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記KO−DMEM培地はβ−FGF、ヒト臍帯血清、新生児ウシ血清、胎児ウシ血清及びLIFを含むことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 上記KO−DMEM培地は10ng/mlβ−FGF、5%ヒト臍帯血清及び12ng/ml LIFを含むことを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法によって得られた誘導多能性幹細胞。
- 請求項14に記載の多能性幹細胞を誘導分化することにより得られた体細胞、生殖細胞、組織または器官。
- (1)対象から体細胞を採取すること、
(2)請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法により、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングすること、
(3)多能性幹細胞の分化を誘導することを含む、幹細胞を用いて治療をする方法。 - 多能性幹細胞の誘導分化は、生体内で行われることを特徴とする請求項16に記載の方法。
- 多能性幹細胞の誘導分化は、生体外で行われることを特徴とする請求項16に記載の方法。
- 分化した細胞を対象に移植することをさらに含むことを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 上記幹細胞療法は、再生医療、組織工学療法または動物育種に用いられることを特徴とする請求項16に記載の方法。
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