CN102725399B

CN102725399B - 制备多能干细胞的材料和方法

Info

Publication number: CN102725399B
Application number: CN200980162975.1A
Authority: CN
Inventors: 郭礼和; 刘天津
Original assignee: Shanghai United Stem Cell Technology Co Ltd; Sino-American iCELL (Shanghai) Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing victory Biotechnology Co., Ltd.; Chongqing United Stem Cell Technology Co., Ltd.; Guangzhou victory Biotechnology Co., Ltd.; Shanghai United Stem Cell Technology Co., Ltd.; SINO-AMERICAN ICELL (SHANGHAI) BIOTECHNOLOGY CO., LTD.; Xuzhou cell Medical Co., Ltd.
Priority date: 2009-12-18
Filing date: 2009-12-18
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2029-12-18
Also published as: EP2513297B1; JP2013514059A; EP2513297A4; US20120269782A1; EP2513297A1; JP5745533B2; WO2011072461A1; US9234179B2; CN102725399A

Abstract

本发明公开一种将体细胞重编程，制备诱导多能干（iPS）细胞的方法，得到的iPS细胞可以分化为外胚层、中胚层和内胚层的体细胞。此外本发明提供所述iPS细胞，制备和维持iPS细胞的方法，以及iPS细胞应用的方法。

Description

制备多能干细胞的材料和方法

技术领域

本发明涉及普遍的细胞生物学领域。更具体地说，涉及到多能性干细胞的繁殖，培养条件和材料，促进传播和利用干细胞。

技术背景

为了便于读者的理解，提供下面的说明。不能将说明提供的信息或者所引用的参考看做本发明的现有技术。

干细胞具有自我更新能力，可无限分化，并在适当情况下，分化成不同类型细胞。胚胎干细胞（ES细胞）从早期胚胎建立，可以长时间培养，同时保持多能分化成各种活体细胞的能力。相比之下，成体干细胞位于已发育的器官中，有能力分裂并创造其他细胞。

Thomson等(U.S.Pat.No.5,843,780；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995)首次成功分离和增殖灵长类动物多能干细胞。他们随后由人类囊胚细胞系获得人类胚胎干细胞（hES）(Science 282:114,1998)。Gearhart和同事由胎儿性腺组织获得人类胚胎生殖细胞系（hEG）(Shamblott et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998；U.S.Pat.No.6,090,622)。hES和hEG细胞具有多能性干细胞的特点，即他们可以持续培养不会分化，他们有一个正常的染色体和核型，可生产一些重要的细胞。

诱导多能干细胞（iPS）来自非多能干细胞，通常是成人体细胞经人工改造的多能干细胞。2006年，山中等用四个基因（OCT-4，SOX2的，c-MYC，KLF4）转染小鼠成纤维细胞获得iPS细胞。随后，从人类成人体细胞获得了iPS细胞。(Takahashi et al.Cell,131:861-872(2007);Yu et al.Science,318:1917-1920,2007).

再生医学领域旨在帮助修补，更换，或再生受损的细胞，组织或器官。干细胞疗法有望治疗多种疾病，包括老年痴呆症，帕金森氏症，中风，脊髓损伤，心脏病，肾功能衰竭，骨质疏松，I型糖尿病，多发性硬化症，风湿性关节炎，烧伤和创伤。然而，这种治疗方法的进展受到了重重阻碍，其中包括胚胎干细胞的供体与受体免疫不相容，有可能引起免疫排斥反应。

发明内容

本发明涉及生成干细胞的方法。一方面，本发明为取得诱导多能干细胞的方法，即在羊膜上皮细胞滋养层上培养一个或多个体细胞。在一个实施方式中，羊膜上皮细胞是哺乳动物羊膜上皮细胞。在一个实施方式中，哺乳动物的羊膜上皮细胞来自：人，猪，狗，马，牛，羊，鼠和其它啮齿类等哺乳动物。在一个实施方式中，羊膜上皮细胞为人羊膜上皮细胞(hAEC)。在一个实施方式中，羊膜上皮细胞培养不超过6代（P0–P5）。在一个实施方式中，羊膜上皮细胞为新分离的P0羊膜上皮细胞。

在一个实施方式中，体细胞选自：成人皮肤成纤维细胞（ADSF），人类胚胎成纤维细胞（HEF），小鼠成纤维细胞（MF），小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），猪成纤维细胞（PF），猪胚胎成纤维细胞（PEF）。在一个实施方式中，体细胞是成人皮肤成纤维细胞（ADSF）。

在一个实施方式中，细胞培养采用KO-DMEM培养液。在一个实施方式中，KO-DMEM培养液中包括bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)，人脐静脉血清或小牛血清或胎牛血清和LIF(白血病抑制因子)。

在说明性实施方式中，KO-DMEM培养液由10ng/ml bFGF，5％人脐血和12ng/ml LIF。

一方面，本发明提供了按照上述方法得到的诱导多能干细胞。一方面，本发明提供了多能干细胞诱导的分化的体细胞。

一方面，本发明提供了一个干细胞治疗方法,包括：（1）分离和收集病人的体细胞或动物体细胞；（2）体细胞重编程为多能干细胞；（3）多能性干细胞的诱导分化；（4）移植来源于病人或动物的分化细胞；以及（5）多能干细胞用于再生和/或组织工程或育种。

附图说明

图1是显示成人皮肤成纤维细胞（ADSF）在人羊膜上皮细胞(hAEC)滋养层培养的显微图片。观察7天后，出现外观上类似胚胎干细胞的细胞克隆。

图2是ADSF细胞在hAEC滋养层上培养7天的克隆球干细胞标记物染色的一系列显微照片。结果显示，得到的细胞表达OCT-4,NANOG，SSEA-4,KLF4,C-MYC,TAR-81,TAR-60等常见的干细胞标记。

图3A,3B,3C表示培养7天ADSF-iPS细胞标记物定量表达及比较。

图4A,4B,4C显示了经过12天培养的各类细胞的干细胞标记物定量表达。

图5是显示小鼠成纤维细胞（MF）在hAEC滋养层上培养，3天后观察到外观上类似胚胎干细胞的细胞克隆。

图6是显示hAEC滋养层诱导3天小鼠成纤维细胞形成克隆球的干细胞标记物一系列染色显微照片。

图7是显示猪胚胎成纤维细胞（MEF）的在hAEC滋养层培养显微图像。

图8是地高辛标记抗体对小鼠染色体着丝粒的显微图像，观察到的着丝粒位于染色体的顶端，这表明没有发生hAEC染色体污染。且小鼠染色体为20对，图像中显示40条染色体，符合正常小鼠染色体的核型。

图9A图9B图9C是源于iPS细胞的畸胎瘤组织结构的显微图像，A：腺体组织（内胚层）；B：肌肉（中胚层）；C:皮肤组织（外胚层）。hAEC诱导小鼠皮肤成纤维细胞得到的小鼠iPS的组织学的畸胎瘤。畸胎瘤的组织结构表明iPS细胞发育多能性的能力。

具体实施方式

以下从详细描述了本发明的某些方面，模式，等同物，变化和特点，以便读者更好理解本发明。

在本发明的操作中，采用了分子生物学，蛋白质生物化学，细胞生物学，免疫学，微生物学和DNA重组使用的许多传统技术。这些技术是众所周知的，可参考Current Protocols in Molecular Biology,Vols.I-III,Ansubel,Ed.(1997)；Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Ed.(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY，1989)；DNA Cloning:A Practical Approach,Vols.I and II,Glover,Ed.(1985)；OligonucleotideSynthesis,Gait,Ed.(1984)；Nucleic Acid Hybridization,Hames &Higgins,Eds.(1985)；Transcription and Translation,Hames&Higgins,Eds.(1984)；AnimalCell Culture,Freshney,Ed.(1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning；the series,Meth.Enzymol.,(Academic Press,Inc.,1984)；Gene Transfer Vectors for MammalianCells,Miller &Calos,Eds.(Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1987)；andMeth.Enzymol.,Vols.154and 155,Wu &Grossman,and Wu,Eds.。多肽基因表达产物水平（即基因翻译水平）的检测方法为本领域内公知，包括多肽检测方法如抗体检测和定量技术。（参见Strachan &Read,Human MolecularGenetics,Second Edition.(John Wiley and Sons,Inc.,NY，1999)）。

除非另外指明，本文所用的技术和术语均为本领域技术人员常规理解的含义。权利要求和说明书中的单数形式包括复数形式，除非另外指明。例如“一个细胞”包括复数的细胞，包括其混合物。

本文中所使用的术语“氨基酸”包括天然的氨基酸和合成氨基酸，以及功能类似于天然氨基酸的氨基酸类似物，氨基酸类似物的。天然氨基酸由遗传密码编码而成，包括后修饰的氨基酸例如，羟脯氨酸，γ-羧基和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指和天然氨基酸具有相同化学结构的化合物，即α-碳原子上有一个氢原子，一个羧基，一个氨基和一个R基团，如，丝氨酸，亮氨酸，蛋氨酸亚砜，蛋氨酸甲基硫。这种类似物有已修饰的R基团（例如，亮氨酸）或改造的肽骨架，但同时保留天然氨基酸的基本化学结构。氨基酸类似物是指有一个异于氨基酸一般化学结构的化合物，但其功能类似天然氨基酸。氨基酸可用俗称三个字母符号或IUPAC-IUB生化命名委员会建议的一个字母来表达。核苷酸，同样也可以采用普遍接受的单字母代码。

本文中所使用的术语“抗体”是指从多肽包含来自免疫球蛋白基因或抗原结合片段的框架区，可以和抗原特异性结合和识别。抗体的使用意味着，包括整个抗体，其中包括单链整合抗体。术语“抗体”包括双特异性抗体和多特异性抗体只要表现出理想的生物活性或功能。

本文中所使用的术语“表达”包括但不限于一个或多个以下：基因的转录入先导mRNA，前体mRNA的剪接和其他加工产生成熟的mRNA；mRNA稳定性；成熟mRNA翻译到蛋白质（包括密码子应用和tRNA的可用性）；和翻译产物的糖基化和/或其他修饰，如果需要适当的表达和功能。

本文中所使用的术语“滋养层细胞”是指一种细胞，可与另一种的细胞共同培养，为其提供优良的环境生长发育。在一些实施方式中，体细胞和滋养层细胞，如羊膜上皮细胞一起培养可以体细胞重编程为iPS细胞。

本文中所使用的术语“基因”是指DNA片段，其中包含调节一个RNA产物生物合成，包括启动子，外显子，内含子以及其他非翻译区控制表达的所有信息。

本文中所使用的术语“分离”正常情况下天然伴随物尽可能减少，或最大幅度完全消除。因此，术语“分离的细胞”是指细胞实质上完全脱离其他天然伴随物质（如其他细胞，蛋白质，核酸等）。术语“分离”和核酸和多肽连一起是指，例如，用重组DNA技术生产时核酸或多肽不带细胞物质或培养基；而当化学合成时，无前体化学物质或其他化学物质。分离的核酸一般没有核酸提取微生物的基因序列。

本文中所使用的术语“多能干细胞”（PS细胞）能够在适当的条件下生产几种不同类型细胞的细胞。PS细胞能够产生属于三个胚层（内胚层，中胚层和外胚层）的子代细胞，根据领域内可接受的测试，如在合适的宿主产生畸胎瘤的能力或分化成三胚层典型组织类型标记细胞。根据定义PS细胞包括多种胚胎细胞，如ES细胞，以及来自成人体细胞重编程的iPS细胞。

本领域技术人员理解，除非另外指明，PS细胞包括原始组织和含有表型特征的PS细胞的细胞系，以及保有形成三胚层细胞能力的细胞系衍生物。PS细胞培养物被描述为“分化”或“明显未分化”，当干细胞及其衍生物大部分显示未分化的细胞形态特征，明显区别于胚胎或成人起源的分化细胞。本领域技术人员很容易辨别未分化PS细胞，通常显微镜下，细胞核/细胞质比例高，核仁明显。未分化细胞克隆通常被周围已分化细胞包围。然而，在合适条件培养或传代的情况下，未分化细胞可以维持，单独的未分化细胞是细胞群的重要组成部分。未分化培养含至少20%未分化PS细胞，可包含至少40%,60%,或80%的未分化PS细胞。

本文中所使用的术语“诱导多能干细胞”（简称“iPS细胞”）是指来源于非多能干细胞，具有类似胚胎干细胞特性的未分化细胞。

本文中所使用的术语“重编程”部是指改变或逆转分化或终末分化的体细胞的分化状态的过称。一个体细胞的重编程可能是对体细胞的分化状态部分或完全逆转。在一些实施方式中，重编程完成时，体细胞重编程为iPS。不过，有时可能是部分重编程，如回归到分化程度较低的阶段。举例来说，将一个终端分化的细胞恢复到一个分化程度较低的阶段，如多能细胞。

本文中所使用的术语“体细胞”是指任何非生殖细胞，如卵子，一个精子，或其他的细胞，它不直接传递其DNA给下一代。通常，体细胞几乎无多能性。本文的体细胞可以是天然的也可基因改造。

概述

在一方面，本发明公开提供了一种方法来获得iPS细胞。在一些实施方式中，方法培养的方法，包括用羊膜上皮细胞（AECs）滋养层来培养体细胞一定时间，使之分化和重编程。

在另一方面，本发明提供iPS细胞和从这些iPS细胞分化得到的体细胞。iPS细胞可以是哺乳动物细胞，例如小鼠，人，大鼠，牛，羊，马，鼠，狗，豚鼠，或猿细胞。例如，体细胞重新编程有可能去创造病人或疾病特异性的多能干细胞。从形态、增殖、基因表达、畸胎瘤形成，无法区分iPS细胞和ES细胞。此外，经过胚胎移植时，iPS细胞可以引起具有生殖系传递能力的成年嵌合体，(Maherali et al.Cell Stem Cell 1:55-70,2007；Okita et al.Nature448:313-17,2007；Wernig et al.Nature 448:318-324,2007)。人类iPS细胞与人类胚胎干细胞（ES）在形态和增殖细胞的功能相同也很难区分。此外，这些细胞能够在体外和畸胎瘤分化成三个胚层的细胞类型。

本发明的优点之一是无需卵子，胚胎或胚胎干细胞的情况下，从体细胞制备iPS细胞。优点之二是体细胞诱导iPS无须添加外源核酸或化合物。优点之三用人羊膜上皮细胞做滋养层，不添加丝裂霉素C(mitomycin C)，而丝裂霉素C破坏DNA会引起iPS细胞核溶解，丝裂霉素C的使用给将来的临床应用带来潜在风险。优点之四操作简单，成本低，高效重复性好，明显优于现有的iPS制备方法。

不希望受理论的限制，相信使用AEC滋养层细胞，或源自滋养层细胞的细胞外基质，可提供一种多多种物质足以诱导多能性并促进干细胞生长。相信这些物质是膜结合或由细胞分泌扩散到周围介质的可溶性产物。

AEC细胞的制备

在一个实施方式中，羊膜上皮细胞（AEC）作为体细胞培养的滋养层，诱导体细胞去分化成iPS细胞，即“重编程”。AEC源于早期的受精后约8天的囊胚内细胞团。术语“羊膜”是指胎膜，是孕产妇和胎儿之间重要的物质运输通道。AEC可以来自哺乳动物，如人类，猪，牛，羊，小鼠，大鼠。

在适当的实施方式中，AEC是人类AEC。hAECs来自人羊膜。本领域技术人员可用已知的方法进一步纯化和富集活性细胞。另外，羊膜组织去除绒毛膜和其他胎盘组织。羊膜层可从底层绒毛层采用钳和无菌手术刀轻轻地剥离。羊膜层可以被机械分解或与消化酶和/或螯合剂处理，分离细胞，得到单个细胞的悬浮液。在另一实施方式中，胎盘的绒毛膜或蜕膜也可以作为一个AEC的来源。

酶法分离处理羊膜可以采用多种消化酶。这种酶包括但不限于，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胶原酶，弹性蛋白酶和/或透明质酸酶。在一个实施方式中，分离的羊膜细胞用胰蛋白酶处理获得单个细胞。在一个实施方式中，组织孵化所用胰蛋白酶的浓度约为0.05％。在一个实施方式中，组织消化时间大约为10-40min，30min最合适。组织也可用多种酶处理。组织分类的技术可参考，例如，Freshney,Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Technique,2d Ed.,A.R.Liss,Inc.,New York,1987,Ch.9,pp.107-126.

制得单细胞悬液后，细胞可用基础培养液培养，可添加血清，激素，生长因子，细胞因子抗生素，微量元素及其他添加剂。生长因子及细胞因子可能包括成纤维细胞生长因子（FGFs），表皮生长因子（EGF），转化生长因子-β（TGF-β），肝细胞生长因子（HGF）或抑瘤米。培养液中的添加剂的可包括胰岛素、转铁蛋白、胰岛素铁硒传递蛋白（ITS）、葡萄糖、白介素-6和组蛋白去乙酰化酶抑制剂如丁酸钠或曲古抑菌素A（tricostatin A）。

在一个实施方式中，羊膜源细胞移到培养皿中，DMEM培养液，10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，EGF(10ng/ml),胰岛素(10μg/ml),转铁蛋白(5.5μg/ml),胰岛素铁硒传递蛋白(6.7ng/ml)和乙醇胺（2μg/ml）。此外，丙酮酸钠和非必需氨基酸（1％）也可添加到培养液中。本专业技术人员也可添加其他物质加入培养液作为添加剂或中期替换用于支持该AEC的生长。这些细胞可以冷冻保存，解冻时可保留功能和活力。

这些细胞可放于组织培养皿或可在烧瓶培养细胞悬浮液，形成球状细胞体。当在组织培养皿生长时，表面可涂布静电或与细胞外基质成分。培养皿长满前进行细胞传代，以避免接触抑制，维持增殖条件。

体细胞的来源

对可能被重新编程的体细胞类型并不特别限制，任何种类的体细胞都可以使用。不仅成熟的体细胞可以使用，胚胎阶段的体细胞也可。体细胞可能是原代细胞或永生化细胞。这种细胞可能是原代细胞（非永生细胞），例如刚刚从动物分离的，也可能是源于一个细胞系（永生化细胞）。在一个实施方式中，体细胞是哺乳动物的细胞，例如，人类细胞或小鼠细胞。用现有的方法，从不同的器官取得，如，但不仅限于皮肤，肺，胰腺，肝，胃，小肠，心脏，生殖器官，膀胱癌，肾癌，尿道等泌尿器官，或任何含有活体细胞的器官或组织，或从血细胞。本发明中有用的哺乳动物体细胞包括，成人干细胞，脂肪细胞，间质细胞，支持细胞，内皮细胞，颗粒上皮细胞，神经细胞，胰岛细胞，表皮细胞，上皮细胞，肝细胞，毛囊细胞，角质形成细胞，造血细胞，黑色素细胞，软骨细胞，淋巴细胞（B和T淋巴细胞），红细胞，巨噬细胞，单核细胞，成纤维细胞，心肌细胞，其他已知的肌肉细胞，一般的活体细胞中单个核细胞。实施方式中有使用成纤维细胞。此处的体细胞，也包括成人干细胞。成人干细胞是具有产生特定组织的所有细胞类型的能力的一种细胞。典型的成人干细胞包括造血干细胞，神经干细胞和间质干细胞。

获得人类体细胞的方法早已确立，如Schantz and Ng(2004),A Manual forPrimary Human Cell Culture,World Scientific Publishing Co.,Pte,Ltd.在某些情况下，方法包括获得组织样本，例如，通过活检（例如皮肤样本），抽血等。从组织得到细胞的最初密度取决于预期的活力以及细胞核组织的粘附性。获得人类体细胞的不同类型的方法包括，但不仅限于以下示范的方法。

骨髓。供者全身麻醉后，俯卧位。髂后上棘处进行穿刺，注射器抽吸骨髓。从骨髓成骨区分离骨髓细胞，富集成体干细胞。通过密度梯度离心，制备单核细胞，收集的在使用前用本文介绍的方法培养后用于重编程。

皮肤组织。采集含有真皮组织的皮肤，比如，从膝盖内侧或臀部。皮肤组织，然后孵育30min，37℃，0.6％胰蛋白酶/DMEM/F-12加1％抗生素，或抗真菌药，内侧皮肤朝下。翻转皮肤组织，用镊子轻轻擦皮肤内侧。用剪刀将皮肤组织切成一毫米见方的碎片，然后在室温1200rpm离心10min。去除上清液，加入25ml 0.1％胰酶/DMEM/F-12加1%抗生素或抗真菌药物。混合物在搅拌器中200-300rpm，37℃，搅拌40min。确认该组织的沉淀完全消化，加入3ml胎牛血清（FBS），用纱布,100μm尼龙筛,40μm尼龙筛分别过滤顺序。1200rpm，室温离心10min得到的滤液除去上清液，加入DMEM/F-12加1％抗生素或抗真菌药物清洗沉淀，然后在1200rpm时室温离心10min。得到的细胞在重编程之前培养。

上皮干细胞可通过可以通过人类头皮组织（0.5-2cm2或更小）富集。人类头皮组织经冲洗，修剪，除去多余的脂肪组织，并切成小块。这些组织碎片用12.5mg/ml中性蛋白酶（Invitrogen,Carlsbad,Calif.）+DMED 4℃，消化24小时。酶处理后，表皮从真皮脱落；毛囊从真皮脱出。在显微镜下解剖毛囊球部和完整的外根鞘（ORS）。用细针将球部从上部毛囊剥离。将清洗后的球部转移到一个新的培养皿中加入DMEM/F12培养基和10％胎牛血清培养。

骨骼肌。含有肌肉的结缔组织表皮（如对肱二头肌或腿部缝匠肌外侧头），切断，肌肉组织被切除。整个肌肉所得用剪刀或手术刀切碎，然后悬浮在DMEM（高糖）含0.06％胶原酶IA和10％胎牛血清，并在37℃孵育2小时。离心切碎肌肉收集细胞，将其悬浮在DMEM培养液（高糖）含10％胎牛血清。让悬浮液先后通过一个40μm孔径和一个20μm孔径的网筛，得到的细胞可作为含未分化肝细胞的纯化细胞粗品培养，可用于iPS细胞诱导。

脂肪组织源于脂肪组织的细胞可通过本领域技术人员熟知的方法分离。脂肪组织的一大来源是大网膜脂肪组织。人体中，脂肪细胞通常从脂肪分离。在一个分离细胞的方法中，脂肪组织用0.01％至0.5％胶原酶；0.01％至0.5％胰蛋白酶和/或0.5ng/ml至10ng/m中性蛋白酶或有效量透明质酸酶或酶，约0.01至约2.0Mm EDTA在25℃至50℃处理10min至3h。细胞通过孔径为20μm至800μm的尼龙或纱布网筛过滤。然后在培养液中的细胞直接差速离心或采用Ficoll，Percoll或其他粒子梯度。4-50℃下，细胞离心100-3000g，1min-4h。采用所述方法获得的脂肪组织源性细胞作为含未分化肝细胞的纯化细胞粗品培养，可用于iPS细胞诱导。

血液采集50ml至500ml静脉血液或脐带血，用Ficoll-Hypaque方法获得单核细胞，参考Kanof et al.,(1993),Current Protocols in Immunology,J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevack,and W.Strober,eds.,ch.7.1.1.-7.1.5,John Wiley &Sons,New York。分离单核细胞，将大约1x107到1x108人外周血单个核细胞悬浮在RPMI1640培养基含10％胎牛血清、100μg/ml链霉素和100单位/ml青霉素，洗两次后，回收细胞。回收的细胞悬浮在RPMI 1640培养基中，然后在一个100mm的塑料培养皿接种密度每个培养皿1x107细胞，并在37℃，8％CO2培养箱培养。10min后，清除贴壁细胞，用移液器收集悬浮细胞。产生的贴壁单核细胞培养后进行重编程。在某些情况下，用所述方法获得的外周血或脐血衍生的贴壁细胞作为含未分化肝细胞的纯化细胞粗品培养，可用于iPS细胞诱导。

外周血中的巨噬细胞可以用低葡萄糖DMEM添加10％热灭活胎牛血清（FBS；JRH Biosciences,Lenexa,Kans），2mM L-谷氨酰胺，50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素培养富集。为了扩增巨噬细胞，外周血单核细胞2x106/ml的密度铺于培养皿中，培养皿用10μg/ml FN（Sigma,St.Louis,Mo）处理在4℃过夜。细胞不加额外的生长因子，在37℃，5％CO2，加湿环境中培养。3天更换一次培养基。观察成纤维细胞特征的巨噬细胞可用于重编程。

当iPS细胞用于治疗疾病时，最好从病人分离体细胞。例如，致病的体细胞，参与治疗的体细胞都可以使用。

体细胞重编程获取iPS细胞

在一方面，本发明提供了体细胞重编程增殖产生iPS细胞的方法。以羊膜上皮细胞（AEC）为滋养层条件,进行细胞传代，可得到iPS。例如，体细胞置于AEC滋养层加上合适的培养液，如胎牛血清加强培养液。这些细胞培养2至14天，一般约7天，或直至细胞表现出未分化的干细胞的形态特征。

本方法的培养液可以选择常用的细胞培养液。含血清培养液中通常由80％DMEM培养液和20％特定的胎牛血清（FBS）、1％非必需氨基酸、1Mm L-谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇。培养液过滤，4℃保存不超过2周。无血清培养液是由80％KO DMEM培养液，20％血清替代(Gibco#10828-028)、1％非必需氨基酸、1Mm L-谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇。使用前，可添加bFGF到终浓度为48ng/mL。在一个实施方式中，DMEM培养液添加10％胎牛血清、链霉素、青霉素和谷氨酰胺。可以添加人血清和/或脐血。

另外，从培养液中挑选诱导多能干细胞的方法不限于本发明所述，其他已知合适的方法都可采用，例如，手段，耐药基因或类似的可用于作为一个标记基因，以耐药性为指标分离诱导多能干细胞。本领域技术人员可使用广泛应用于胚胎干细胞的方法来确定分离iPS发的分化和增殖能力。

iPS细胞具有未分化的干细胞特征的形态特征。在一个标准的显微图像中，iPS细胞，细胞核/细胞质的比例高，核仁明显，细胞系可用标准的G带技术测得核型后和公布的人类核型比较。获取的iPS具有“正常核型”，意味着细胞是整倍体的，其中所有人类染色体都存在，且没有明显改变。iPS细胞也可通过细胞标记抗体（流式细胞仪或免疫细胞）或逆转录PCR检测。

PCR技术可用于检测标记基因的表达。iPS细胞可以表达任意多能干细胞标记物，其中包括：碱性磷酸酶（AP）；ABCG2；阶段性胚胎抗原-1(SSEA-1)；SSEA-3；SSEA-4；TRA-1-60；TRA-1-81；Tra-2-49/6E；ERas/ECAT5,E-钙粘附蛋白;Ⅲ型β微管蛋白；α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)；成纤维细胞生长因子4(FGF4),Cripto,Dax1；锌指蛋白296(Zfp296)；N-乙酰转化酶-1(Nat1)；胚胎干细胞相关转录因子1(ECAT1)；ESG1/DPPA5/ECAT2；ECAT3；ECAT6；ECAT7；ECAT8；ECAT9；ECAT10；ECAT15-1；ECAT15-2；Fthll7；Sall4；未分化的胚胎细胞转录因子(Utf1)；Rex1；p53；G3PDH;端粒酶,包括TERT；沉默的X染色体基因；Dnmt3a；Dnmt3b；TRIM28；F盒蛋白15(Fbx15)；Nanog/ECAT4；Oct3/4；Sox2；KLF4；c-MYC；Esrrb；TDGF 1；GABRB3；Zfp42,FoxD3；GDF3；CYP25A1；多能发育相关蛋白2(DPPA2)；T细胞淋巴瘤1(Tcl1)；DPPA3/Stella；DPPA4；其他一般的多能性标志物等其他标记可包括Dnmt3L；SOX15，Stat3，Grb2，SV40巨T抗原；HPV16E6；HPV16E7,β-连环素和Bmil。这种细胞还有的特征是可下调诱导iPS的未分化细胞的标记物。例如，成纤维细胞来源的iPS细胞可下调成纤维细胞标记Thy1或上调表达SSEA-1。本发明不仅限于此处列出的标记，还包括如细胞表面标志，抗原标记，其他基因产品，包括ESTs，RNA（包括小分子RNA和反义RNA），DNA（包括基因和cDNA），和其中的某些部分。那些表达标记物的细胞克隆用于进一步的治疗应用或存储备用。

增殖iPS细胞另一个可取的特点是可以分化为三个胚层的细胞：内胚层，中胚层和外胚层。iPS细胞多能性可以用SCID小鼠形成畸胎瘤，检查其三胚层的代表性组织来确认。另外，多能性也可以通过让iPS细胞非特异性分化来确定（例如，通过形成胚体），然后用免疫化学方法确定培养的细胞类型。

此处某些多能干细胞群未经分化，并且可以在所述条件下多个培养液中传代。传代过称中某些细胞可能分化（特别是低密度情况下，或者大细胞团形成）。然而，培养得到的大部分是未分化细胞，

遗传改造的多能干细胞

本发明还提供基因改造的iPS细胞的系统，无论是在瞬态和稳定的方式。细胞在未分化状态可以改造，赋予其所需的特性，使其在分化为其他细胞时具有需要的特性，或提供一个方法，积极或消极的选择，特别是未分化或分化表型分化所需的属性。

对于治疗应用，它可能是用治疗性基因改造细胞，或使其与接收者细胞组织相容性细胞。基因的改变也可用于制备排序后分化细胞。例如，iPS细胞用药物敏感基因，如单纯疱疹病毒胸苷激酶（使细胞对更昔洛韦敏感）转染，在未分化细胞特异性启动子的控制下，如OCT-4启动子或hTERT启动子。培养出现分化后，用更昔洛韦将残余的未分化细胞从群落中消除。

转染iPS细胞的合适的载体质粒包括脂质/DNA复合物，如U.S.Pat.Nos.5,578,475；6,020,202；和6,051,429。制作DNA-脂质复合物的试剂包括lipofectamine TM(Gibco/Life Technologies #11668019),FuGENE^TM(RocheDiagnostics Corp.#1814443)；LipoTAXI^TM(Invitrogen Corp.,#204110)。生产基因变异iPS细胞的稳定载体体系可依据腺病毒，逆转录病毒或慢病毒，使用商用病毒组件配制品。iPS细胞的遗传改变，不仅要求效率高，同时不引起不需要的iPS细胞分化。

基因改造和药物选择后（在抗药性滋养层和无滋养层培养），可挑选显示改变表现型的克隆，分别培养。挑选的克隆分散成25-100个细胞的小团块，并在合适的环境重新铺板生长。它有可能形成iPS培养，大部分（90%以上）未分化细胞为基因改变的细胞。

利用iPS细胞的增殖过程

本发明提供使用这种方法制备的iPS细胞和这些细胞群。重编程细胞，能够分化为许多种细胞，具有应用和治疗用途。干细胞的基本属性，即无限的自我更新能力，并能够分化成身体中的各种细胞类型，使之成为用于治疗的理想选择。

因此，一方面本发明还提供了用上述方法制备iPS细胞来进行疾病治疗和预防的方法。该方法包括从个体获取体细胞，重编程体细胞为iPS细胞，然后在适当条件下培养分化成所需的细胞类型用于疾病治疗。分化的细胞然后可以引入个体来预防或治疗疾病。

iPS细胞可以根据病人定制以避免免疫排斥。因此，它将避免当前的移植方法存在的重大问题，例如由于宿主抗移植物或移植物抗宿主排斥发生移植器官排斥反应。例如，在骨髓移植中使用iPS细胞，可避免大量使用有潜在害副作用的免疫抑制药物。

iPS细胞可以分化成不同细胞类型，用现有的公知治疗不同的疾病。例如，iPS细胞可被诱导分化成造血干细胞，肌肉细胞，心肌细胞，肝细胞，软骨细胞，上皮细胞，尿路细胞，神经细胞等等。然后分化的细胞可以回输到病人的身体，预防或治疗疾病。例如，如果需要神经细胞，iPS细胞改用含有一种或多种神经营养因子（如神经营养因子3或脑源性神经营养因子）和一个或多个有丝分裂原（如表皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，血小板衍生生长因子，胰岛素样生长因子1和促红细胞生成素）的培养液。培养细胞以是否表达如A2B5或NCAM标记为基础选择性分离。可得到神经前体细胞，可产生神经细胞（包括成熟的神经元）和胶质细胞（包括星形细胞）。另外，可得到复制神经前体细胞，可形成分化的细胞群，至少有5%的细胞表达多巴胺能神经元的标记——酪氨酸羟化酶。如果需要肝细胞系细胞，iPS细胞的培养基中加入组蛋白去乙酰酶抑制剂，如N-丁酸。同时或随后可加入与肝细胞成熟因子如表皮生长因子，胰岛素和生长因子。如果期望获得心肌细胞的表达特征标志，加入影响DNA甲基化的核苷酸类似物（如5氮杂脱氧胞苷），生长因子，骨形态发生蛋白，促进分化。这些细胞可以基于密度的细胞分离进一步富集，保存于添加肌酸，肉碱，牛磺酸的培养基中。

本发明的方法也可以用于治疗或预防神经系统疾病。这些疾病包括，例如，老年痴呆症，帕金森病，亨廷顿氏病，肌萎缩侧索硬化症（ALS），溶酶体贮积症，多发性硬化症，脊髓损伤等。本发明的方法也可用于修正单个基因突变。这些突变引起某些疾病，如囊肿性纤维化，血友病，以及BRCA1和BRCA2基因突变相关的高致病性的各种癌症如乳腺癌和卵巢癌。

本发明的方法产生的细胞可以用来再生修复病人的组织或分化的细胞系。该方法包括用本文所述的方法获得重编程细胞将其输入病人体内（例如病人患有心肌梗死，充血性心力衰竭，中风，脑缺血，周围血管疾病，酒精性肝病，肝硬化，帕金森氏症，阿尔茨海默氏病，糖尿病，癌症，关节炎，伤口，免疫缺陷，再生障碍性贫血，贫血，遗传疾病）和类似的疾病，这些疾病如果增加或更换特定细胞/组织或去分化细胞是有益的。在一个实施方式中，病人的组织或器官有损伤细胞，输入细胞，增加组织和器官内的细胞数量，可有效增强组织和器官的生物功能。在另一项实施方式中，病人患有疾病，输入细胞可有效缓解和稳定病情。在其他实施方式中，病人体内某种特定细胞类型的不足如循环血细胞，输入细胞可恢复循环血细胞。

本发明的分化细胞也可用于组织再生/重组，在病人需要的情况可下。选择合适的方式输入细胞，使之移植到预期的组织部位，重组或再生功能缺陷区域。

举例，根据所治疗疾病，神经干细胞直接移植到中枢神经系统的实质或鞘内位置。移植使用的是密度为每毫升2.5-50万的单细胞悬液或小聚合体（U.S.Pat.No.5,968,829）。神经细胞移植的疗效可用大鼠急性受伤模型进行评估（McDonald et al.Nat.Med.5:1410,1999；Kim et al Nature 418:50，2002）。成功的移植，2-5周后病灶区出现移植源性细胞，并分化为星形胶质细胞，少突胶质细胞和/或神经元，并沿线向病灶另一端迁移，并在步态，协调，体重等方面有改善。

心肌细胞的功效可以用心脏冷冻损伤模型评估，该模型可导致55％左心室壁组织，成为疤痕组织（Li et al.,Ann.Thorac.Surg.62:654,1996；Sakai etal.,Ann.Thorac.Surg.8:2074,1999,Sakai et al.,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.118:715,1999）。经过治疗可减少疤痕面积，抑制疤痕扩张，检测收缩压，舒张压和发展的压力，心脏功能改善。心脏损伤也可以左前降支动脉远端栓塞或左冠状动脉前降结扎模拟（Watanabe et al.,Cell Transplant.7:239,1998；Min et al.,J.Appl.Physiol.92:288,2002）。治疗效果可通过组织学及心脏功能评估。实施方式中，心肌细胞可制备用于治疗心肌再生和治疗心功能不足（U.S.Pat.No.5,919,449and WO 99/03973）。

肝细胞和肝细胞前体可用测试修复肝损伤能力的动物模型评估。其中一个例子是腹腔注射D乳糖造成损害（Dabeva et al.,Am.J.Pathol.143:1606,1993）。检测肝细胞标记的免疫化学染色，显微镜检查生长组织中微管结构的形成以及恢复肝特异蛋白合成，来评估治疗效果。肝细胞用于治疗可直接注射，或当病人发生暴发性肝衰竭之后进行肝组织再生时作为生物辅助装置的一部分提供临时肝功能。

用于商业销售的目的，本发明制备的细胞以药学组合物的形式提供，其中包括等渗辅料，人体注射用无菌条件下制备。对于细胞成分药用制定的一般原则，见Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,and CellularImmunotherapy,by G.Morstyn &W.Sheridan eds,Cambridge University Press,1996；and Hematopoietic Stem Cell Therapy,E.D.Ball,J.Lister &P.Law,Churchill Livingstone,2000。细胞的包装应适合销售和临床应用，保持药效学重要的代谢功能。

实施例

以下的实施例是为了更好地阐述本发明的一些实施方式。实施例不限定发明的内容，对应于所附权利要求。

实施例1制备人羊膜上皮细胞。

这个实施例描述了人羊膜上皮细胞（hAECs）的制备。人羊膜从剖腹产孕妇的胎盘上剥离下来后，刮掉下面的海绵层和成纤维细胞层，得到包含羊膜细胞和基底膜层的羊膜，从膜上分离羊膜细胞：把膜放于250ml的宽口瓶中，加入RPMI 1640培养基，用剪刀剪成碎片，加入0.25％胰酶/EDTA，消化半小时后，重新加入胰酶/EDTA消化约15分钟，离心后将得到的细胞接种于6孔板，加入DMEM培养基＋10％胎牛血清（PAA Austria）同时加入抗生素，在37°C，5％CO₂细胞培养箱培养。

实施例2成人皮肤成纤维细胞（ADSF）的分离。

这个实施例描述了成人皮肤成纤维细胞（ADSF）的制备。分离成人皮肤组织或疤痕组织，置于冷PBS中。将分离出的皮层剪碎成1mm²大小的组织块，用含0.25%胰酶，0.2mg/ml脱氧核糖核酸酶I的PBS 37℃温育30min，用含15%热灭活马血清的DMEM中和，1000rpm离心5min,收集细胞，加入DMEM培养液（含5%热灭活马血清），调节细胞浓度为1×10⁶/ml，接种六孔培养板内，放入37℃，5%CO₂培养箱培养。细胞贴壁后传代培养，使细胞增殖。

实施例3小鼠成纤维细胞(MF)的分离。

这个实施例描述小鼠成纤维细胞的分离。无菌条件下，取小鼠耳朵组织若干，用手术剪刀切成细小块（1mm³），用PBS清洗2次。在六孔板培养板中，加入0.5ml培养基培养过夜。第二天，轻轻加入2ml的培养基。继续培养细胞，等成纤维细胞达到90%覆盖率。细胞在37℃，5%CO₂条件下培养。

实施例4猪胚胎成纤维细胞的分离。

这个例子说明了猪胚胎成纤维细胞的分离。取猪胚胎，在无菌的条件下，用PBS清洗2-3次。去掉猪的头部和内脏器官。用手术剪刀将其切成细小块（1mm³），用PBS清洗2次，去其血细胞。在100mm培养皿中，加入4ml培养基。培养过夜。第二天，加入6ml培养基。继续培养。每天观察细胞，在第5天，细胞开始在培养皿上生长。直至细胞长至90%覆盖率。

实施例5制备ADSF源性多能干细胞（ADSF-iPS）。

ADSF细胞由上海国际和平妇幼保健院提供，如实施例2制备。以hAEC为滋养层，采用KO-DMEM培养基,添加10ng/ml bFGF、5%人脐血清以及12ng/ml hLIF培养ADSF细胞，培养条件37°C,5%CO₂。之后随时观察细胞生长状态。结果如图1。培养7天后，出现外观类似于ES细胞的克隆。

实施例6制备小鼠成纤维细胞衍生的多能干细胞（MF-iPS）。

如实施例2中所述制备小鼠成纤维细胞。细胞在hAEC滋养层和KO-DMEM培养液中（10ng/Ml bFGF，5％人脐带血清，12ng/mL hLIF）。培养条件37℃，5%CO2。随时观察细胞的生长情况。结果如图5。培养3天后，出现外观类似于ES细胞的克隆。

实施例7成纤维细胞的制备猪源性多能干细胞（PEF-iPS）。

如实施例2中所述制备猪胚胎成纤维细胞。细胞在hAEC滋养层和KO-DMEM培养液中（10ng/mL bFGF，5％的人脐带血清，12ng/mL hLIF）。培养条件37℃，5%CO₂,5%O₂。随时观察细胞的生长情况。结果如图7。培养5-7天后，出现外观类似于ES细胞的克隆。

实施例8免疫荧光法。

这个例子描述采用免疫荧光技术，检测iPS细胞的干细胞标记基因表达。细胞用PBS清洗3次，2%多聚甲醛室温固定15min，PBS洗3次，每次5min。0.1%TritonX-100室温穿透15min。PBS洗3次，每次5min。5%BSA室温封闭2hr。加入SSEA-4,NANOG，OCT-4的一抗4℃过夜，PBS清洗3次，每次5min。室温下用二抗荧光标记1hr，PBS清洗3次，每次10min。Hochest染色（1：1000）室温下避光孵育15min，甘油封闭观察阳性细胞。结果见图2，ADSF-iPS细胞上有阳性的干细胞标记。MF-iPS的结果见图6.

实施例9q-PCR技术进行基因表达检测。

这个实施例描述用RT-PCR技术分析iPS细胞的干细胞标记的基因表达。mRNA的提取和RT-CR方法按照制造商的说明（Promega AS-1050）。在每一个标记基因的PCR引物见表1。每组细胞的cDNA作为实时PCR（EppendorfRealPlex instrument）的模板。利用两步法进行RT-PCR根据18s rRNA的数量相对定量法计算目标片段的扩增比例。

表1检测干细胞标记的PCR引物

iPS细胞标记的基因表达分析的结果见图3和4。数据采用归一化法，表示为对照组的倍数/百分百。ADSF-iPS的NANOG，SOX,KLF4,LIN28,TERT的表达是hAEC的20多倍，比ES细胞的表达也高，但OCT-4表达较低。ADSF几乎没有干细胞标记的表达。

实施例10小鼠染色体着丝粒（chromosome centromere）鉴定

细胞准备

接种1×10⁶小鼠成纤维细胞诱导型多能干细胞于100mm培养皿中，培养2天，换液5ml新鲜培养基，培养过夜，加入70ng/ml秋水仙素，继续培养5小时.075M KCl收集中期细胞，在37度水浴10-20min，高速离心去上清。用固定液（甲醇：冰乙酸=3：1），加入用KCl处理的中期细胞，使其悬浮混匀。高速离心，弃上清，重复。

Prins步骤

将固定处理好的中期细胞，滴到载玻片上，片子老化1-4天，后用去离子甲酰胺72℃变性2min，用70%，90%，100%乙醇依次脱水。晾干，加入缓冲液20μl，甘油10μl，dNTP-dig 5μl，引物（见下列寡核苷酸序列）5μl，Taq聚合酶2μl，去离子水158μl。引物序列：

主要卫星DNA:5′-GGACCTGGAATATGGCGAGAAA-3′(SEQ ID NO:13)；次要卫星DNA:5′-TGATATACACTGTTCTACAAATCCCG-3′(SEQ IDNO:14).

经退火温度10min，再经72度延长温度12min。取出在72℃NE溶液中洗5min后取出，在4*SSC/0.5%吐温-20溶液中漂洗5min，晾干。滴加抗地高辛（Digoxin）标记物抗体，在37度湿盒中孵育30min，取出在PBS/0.2%吐温-20中漂洗5min后取出晾干。滴加DAPI，盖上玻片，显微镜下观察。

实验结果见图8.观测到的着丝粒皆位于染色体的顶端，说明为小鼠染色体，没有人羊膜细胞染色体的污染。核型分析：iPS细胞具有正常二倍体核型，共40条染色体。

实施例11畸胎瘤实验

为了测试iPS细胞的多能性，将一定数量的ADSF-iPS细胞注射到免疫缺陷小鼠（SCID）体内8周后观察其形成的畸胎瘤，图9表明，可观察到iPS细胞可分化为内胚层的腺体，中胚层的肌肉骨骼以及外胚层的表皮组织。

以上实施例的结果表明，人ADSF细胞以hAEC为滋养层在适当的培养条件下课诱导为干细胞样的克隆。这些克隆高度表达干细胞标记。hAEC诱导的ADSF克隆的出现早于常规方法生成的iPS细胞（即转染OCT-4，SOX2，c-MYC，KLF4基因，小鼠细胞需要约2周，人类细胞需3-4周）。此外，获得的细胞数量远远大于常规方法获得。因此，本方法可用于从成人身体组织产生iPS细胞。

***

除非另有规定，所有技术和科学所用词汇与本领域技术人员普遍理解的意义相同。所有提供的核苷酸序列均为5'到3'指导中列出。

此处说明性描述的本发明可以在本文没有具体公开的任何要素或者多种要素、限制或者多种限制不存在的情况下适当实施。因此，例如，应该广义地和无限制地理解术语“包括（comprising）”、“包含（including）”“含有（containing）”等，另外，本文所用的术语和表述的使用不意图于排除所示和所述特征或其部分的任何等同物，而是承认在所要求的本发明范围内可以进行各种修改。

因此，可以理解，尽管本发明已经通过优选的实施方式和任选的特征被具体公开，但是本领域技术人员可以对本文包含的发明进行修改和变化，并且认为这样的修改和变化在本发明范围内。

本文中，本发明以宽泛的和一般性的方式被描述，落入该概括性公开内容中的每一较窄的种类和亚类额形成本发明的一部分。这包括发明的这样的概括性描述，其带有附加条件或从该类中除去任何主题的负限定，不论删除的物质是否在本文中被具体描述，其他的实施方式在下面的权利要求中被阐述。

另外，本发明的特征或者方面针对马库什组进行描述时，本领域技术人员会意识到，本发明因此也针对该马库什组成员中的任何单独成员或亚组进行描述。

此处提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献是结合作为整体以供参考，其范围与每个单独作参考的相同。如果有冲突，本说明书，包括定义，可以对照。

其他实施例可从以下权利要求展开。

Claims

1.获得诱导多能干细胞的方法，包括以人羊膜上皮细胞为滋养层，采用KO-DMEM培养基培养体细胞足够长一段时间后，使体细胞重编程为多能干细胞，其中所述体细胞是成纤维细胞，其中所述KO-DMEM培养基包含10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子,5％人脐带血清和12ng/ml白血病抑制因子。

2.获得诱导多能干细胞的方法，包括以人羊膜上皮细胞为滋养层，采用KO-DMEM培养基培养体细胞足够长一段时间后，使体细胞重编程为多能干细胞，其中所述体细胞不来源于人，所述体细胞为成纤维细胞，其中所述KO-DMEM培养基包含10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子,5％人脐带血清和12ng/ml白血病抑制因子。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述人羊膜上皮细胞培养不超过6代。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述人羊膜上皮细胞培养不超过6代。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述人羊膜上皮细胞为新鲜分离的P0羊膜上皮细胞。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述人羊膜上皮细胞为新鲜分离的P0羊膜上皮细胞。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述体细胞为成人皮肤成纤维细胞或小鼠成纤维细胞。

8.根据权利要求2所述的方法，其中所述体细胞为猪胚胎成纤维细胞。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，还包括在体外诱导多能性干细胞发生分化。