CN1589126A - 角膜上皮样片材及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了移植用材料(角膜上皮样片材)，其适用于需要进行角膜上皮移植的眼表面疾病。将口腔粘膜上皮细胞播种于羊膜上，在支持细胞的共存下进行培养。口腔粘膜上皮细胞复层化后，使其最表层接触空气，诱导分化。于是，得到羊膜上形成有口腔粘膜上皮细胞层的角膜上皮样片材。
Description
技术领域
本发明涉及角膜上皮样片材、角膜上皮移植用片材、及它们的制造方法。本发明可用于需要进行角膜上皮移植的疾病(眼表面疾病)的治疗。特别是对于双眼性角膜性疾病，将提供有效的治疗手段。
技术背景
角膜因被结膜上皮包覆而会产生混浊，作为这种眼表面疾病的外科治疗手段，现在使用的是角膜上皮移植术，但是，对于伴有重度炎症的难治性角结膜疾病(Stevens-Johnson综合征与眼类天疱疮、角膜腐蚀等)，其预后极其不良。最主要的原因就是具有强抗原性的异系(allo)角膜上皮被宿主的免疫系统识别，并产生排斥。而且，为了预防排斥反应，术后要在全身及局部给与大量的免疫抑制剂，由此引起的合并症也是预后不良的重要原因之一。另一方面，在利用异系角膜上皮的情况下，还有供体不足的问题。因此，不用异系角膜上皮，而移植自体角膜上皮组织可认为是理想的。对于单眼性疾病(角膜腐蚀等)，过去有过将健康眼睛的角膜上皮移植到病眼并取得了良好效果的报告，但实际上，多数难治性角膜疾病为双眼性，无法使用这种方法。
发明的公开
在上述背景下，本发明的课题为，提供作为可适用于眼表面疾病的移植用材料的角膜上皮样片材、角膜上皮移植用片材、及它们的制造方法。特别是其目的在于，提供可用于治疗难于获得自体角膜干细胞患者的移植材料。
本发明的发明人们，对上述课题进行了锐意探讨。首先，由于双眼性疾病的患者无法获得自体角膜细胞，考虑到可以利用其他健康部位的自体粘膜组织是理想的，从而选择了口腔粘膜上皮组织作为细胞源。这是由于受到了口腔粘膜上皮中存在着局部粘膜组织中的干细胞的启发，而且，与作为其他上皮组织的皮肤表皮相比，其为低分化且分裂能力高，比较容易得到。另一方面，采用羊膜作为培养口腔粘膜上皮细胞的基质。
首先，采取家兔的口腔粘膜上皮，通过酶处理除去上皮的皮下组织，配制含有干细胞的细胞悬浮液。然后，在经酶处理刮除了上皮的羊膜上播种细胞悬浮液，与支持细胞(喂养细胞)共培养，进行向上皮细胞的分化诱导。结果，成功地得到了口腔粘膜上皮细胞复层化了的角膜上皮样细胞层(角膜上皮样片材)。观察得到的细胞层的形态，可见羊膜上层积了5～6层的细胞，而且，可见最上层有扁平状的细胞，此外，可见具有高透明性、具有与角膜上皮极其类似的构造。另一方面，将角膜上皮样的细胞层与作为基质的羊膜一起自体移植于家兔的眼睛，观察了其存活情况。结果发现移植片存活、伸展于眼表面，维持了术后透明性。由此可见，利用口腔粘膜上皮作为细胞源，同时利用羊膜作为基质，可以形成口腔粘膜上皮细胞复层化了的角膜上皮样细胞层(角膜上皮样片材)，另外，该角膜上皮样的层可适用于代替角膜上皮。基于该研究结果完成了本发明，它包括以下部分。
[1]角膜上皮样片材，其特征在于，包括源于口腔粘膜上皮细胞的细胞复层化了的细胞层。
[2][1]所记载的角膜上皮样片材，其中，最表层的细胞未角化。
[3][1]或[2]所记载的角膜上皮样片材，其中，最表层的细胞为扁平状。
[4][1]～[3]中任何一项所记载的角膜上皮样片材，其中，角膜上皮样片材具有屏障机能。
[5]角膜上皮移植用片材，其特征在于，在胶原层上形成了源于口腔粘膜上皮细胞的细胞复层化了的细胞层。
[6][5]所记载的角膜上皮移植用片材，其中，前述细胞层的最表层细胞未角化。
[7][5]或[6]所记载的角膜上皮移植用片材，其中，前述细胞层的最表层细胞为扁平状。
[8][5]～[7]的任何一项所记载的角膜上皮移植用片材，其中，前述胶原层来源于羊膜。
[9][5]～[7]的任何一项所记载的角膜上皮移植用片材，其中，前述胶原层由除去了上皮的羊膜组成。
[10][5]～[9]的任何一项所记载的角膜上皮移植用片材，其中，角膜上皮移植用片材具有屏障机能。
[11]角膜上皮样片材的制造方法，其中，包括
a)在胶原层上培养口腔粘膜上皮细胞的步骤，与
b)口腔粘膜上皮细胞增殖、复层化后，使最表层接触空气的步骤。
[12][11]所记载的角膜上皮样片材的制造方法，其中，在支持细胞的共存下实施前述步骤a)。
[13][11]所记载的角膜上皮样片材的制造方法，其中，在支持细胞的共存下、及在支持细胞与前述胶原层间存在不能通过支持细胞孔径的隔离膜的状态下实施前述步骤a)。
[14][11]～[13]的任何一项所记载的角膜上皮样片材的制造方法，其中，前述胶原层来源于羊膜。
[15][11]～[13]的任何一项所记载的角膜上皮样片材的制造方法，其中，前述胶原层由除去了上皮的羊膜组成。
[16]角膜上皮样片材的制造方法，其中，包括以下步骤：
在第1容器内播种支持细胞，使之形成支持细胞层；
在第1容器内设置具有由孔径不能使前述支持细胞通过的隔离膜形成的底面的第2容器，以使底面位于培养液中；
在前述第2容器的前述底面上形成胶原层；
在前述胶原层上播种口腔粘膜上皮细胞；
培养、并使口腔粘膜上皮细胞复层化；
使复层化了的口腔粘膜上皮细胞的最表层接触空气。
[17][16]所记载的角膜上皮样片材的制造方法，其中，前述胶原层来源于羊膜。
[18][16]所记载的角膜上皮样片材的制造方法，其中，前述胶原层由除去了上皮的羊膜组成。
需要注意的是，本说明书中使用的“角膜上皮样片材”是指，具有与角膜上皮相类似的特征，并可代替角膜上皮而供移植的细胞层。
同样地，“角膜上皮移植用片材”是指，具备具有与角膜上皮相类似的特征的细胞层并为再造角膜而可供移植的组合物。
附图简要说明
图1为扫描电镜下的羊膜图像。A为正常状态(未进行上皮处理的状态)下羊膜表面的图像，B为经上皮刮除处理(0.02％EDTA溶液)后的羊膜表面的图像。A中可观察到多角形的羊膜上皮。另一方面，B中观察不到羊膜上皮，可确认上皮已被完全除去。
图2为一模式图的横截面，表示了在羊膜上培养口腔粘膜上皮细胞时，器具等的状态。将培养插件(culture insert)2静置于培养皿1内，在培养皿1底面可形成3T3细胞层5。另外，显示了将羊膜3静置于培养插件2的底面上，在上面培养口腔粘膜上皮细胞4的状态。符号6为培养基。
图3为融合状态下的口腔粘膜上皮层的光学显微镜图像。
图4为羊膜上形成的口腔粘膜上皮细胞层的HE(苏木素-嗜红)染色图像。可观察到形成了具有5～6层类似于角膜上皮的细胞所形成的层。
图5为用角蛋白3(K3)及角蛋白12(K12)的抗体对羊膜上的口腔粘膜上皮细胞层(口腔粘膜上皮片材)进行染色后的图像。其中，可观察到对角蛋白3有染色性，而对角蛋白12无染色性。需要注意的是，染色了的部分用空白来表示。
图6为用角蛋白4(K4)及角蛋白13(K13)的抗体对羊膜上的口腔粘膜上皮细胞层(口腔粘膜上皮片材)进行染色后的图像。其中，可观察到对角蛋白4及13有染色性。需要注意的是，染色了的部分用空白来表示。
图7为用角蛋白1及角蛋白10的抗体对羊膜上的口腔粘膜上皮细胞层(口腔粘膜上皮片材)进行染色后的图像。其中，可观察到对角蛋白1及10均无染色性。
图8为除去了角膜及结膜上皮的家兔眼表面的荧光素染色图像。荧光素染色了的部分用空白来表示。其中，可观察到整个眼表面均被荧光素所染色，因此，可知上皮已被完全除去。
图9为除去了角膜及结膜上皮4周后的家兔眼表面图像。其中，可观察到由于结膜侵入，且周围伴有瘢痕组织，眼表面失去了透明性。
图10为移植角膜上皮移植用片材后的眼表面状态图像。其中，可见眼表面(移植部)显示了透明性。
图11为移植角膜上皮移植用片材后48小时的荧光素染色图像。荧光素染色了的部分用空白来表示。其中，可观察到眼表面(移植部)没有被荧光素染色，由此，可知移植片存活于眼表面。另外，可观察到移植片的四周均被荧光素所染色。
图12为移植角膜上皮移植用片材后10天时的荧光素染色图像。荧光素染色了的部分用空白来表示。其中，可观察到未显示染色性的区域扩大了，表明移植片残留在眼表面，而且比移植后48小时时更向周围伸展。
图13为化学外伤急性期的迁延性上皮缺损患者的术前(左栏)及术后5个月(右栏)的眼表面状态图像。
图14为化学外伤慢性期患者的术前(左栏)(瘢痕性角结膜上皮症)及术后2个月(右栏)的眼表面状态图像。
图15为眼类天疱疮患者的术前(左栏)及术后1个月(右栏)的眼表面状态图像。
实施发明的最佳方式
本发明涉及的第一个方面为角膜上皮样片材，它包含源于口腔粘膜上皮的细胞复层化了的细胞层。
这里，所谓的源于口腔粘膜上皮的细胞复层化了的细胞层是指，以口腔粘膜上皮部的细胞为出发原料，通过对其培养来进行增殖，至少一部分分化、及复层化、所形成的细胞层。形成该细胞层的细胞的来源为口腔内缘粘膜上皮部细胞、口唇部细胞、腭部细胞、颊部细胞等口腔粘膜上皮细胞。可以以口腔粘膜上皮细胞特异性角蛋白4、或角蛋白13在形成细胞层的细胞中的表达为指标，来确认它们的细胞来源。或者，也可以以角蛋白3的表达为指标。作为一种角膜特异性角蛋白，这种角蛋白3为人所知，但现已确认也会在口腔粘膜上皮细胞中表达。另外，在角蛋白3这种角膜特异性角蛋白的表达这一点上，优选口腔粘膜上皮细胞作为制造角膜上皮移植用的组合物的材料。
另一方面，也可以通过考察口腔粘膜上皮细胞特异性遗传因子的表达，来确认形成细胞层的细胞来源于口腔粘膜上皮细胞。
优选的本发明的角膜上皮样片材具有以下的性状或特性中的几种性状或特性。特别优选的则具有以下所有的性状或特性。
(1)最上层的细胞未角化。这是角膜上皮所具有的特征之一。通过确认该特征，可期待本发明的角膜上皮样片材与角膜上皮类似，并将发挥与角膜上皮同样的机能。另外，所谓角化，别名也叫做角质化，即细胞核内产生角蛋白、核等细胞内小器官消失的现象。可以以例如细胞的扁平化或核的有无为指标判断细胞是否角化。
(2)最上层细胞为扁平状。即，在由大致圆柱形的细胞所形成的层上，形成了扁平状细胞形成的层，从而构成了口腔粘膜上皮细胞层。由于扁平状细胞覆于最上层，可认为细胞间的气密性高并产生了下面的屏障机能。角膜上皮中的最上层细胞也是扁平状的。通过确认该特征，可期待本发明的角膜上皮样片材与角膜上皮相类似，并将发挥与角膜上皮同样的机能。
(3)具有屏障机能。所谓屏障机能是指防止来自表层的液体、气体等的浸润，或通过表层防止液体的发散等机能。由于具有这种屏障机能，可以保持移植后其表面的水分(泪)，而且可以防止多于必要量的水分的发散。角膜由于具有屏障机能，可以保持其表面的水分，由此才能发挥耐眨眼的机能。因此，具有屏障机能为角膜用移植材料所需的重要特性之一。通过确认该特征，可期待本发明的角膜上皮样片材类似于角膜上皮，并将发挥与角膜上皮相同的机能。可通过含有例如辣根过氧化物酶等标识物的溶液的浸润程度来判断是否具有屏障机能。
这种角膜上皮样片材可作为角膜损伤、缺损等患者的移植材料(代替角膜上皮)使用。移植时，优选用手术用缝合线将移植片与周围的组织固定，以促进存活。另外，移植后优选用治疗用隐形眼镜临时包裹移植部表面进行保护。
本发明的第二个方面为提供具有下面结构的角膜上皮移植用片材。即，提供角膜上皮移植用片材，其特征在于，在胶原层上形成细胞复层化的细胞层，其中，该细胞源于口腔粘膜上皮细胞。换句话说，这种角膜上皮移植用片材的特征在于，在胶原层上形成了上述角膜上皮样片材。这里，胶原层优选源于羊膜的胶原层，更优选源于经刮除处理除去了上皮的羊膜的胶原层。可通过考察胶原层中不含羊膜上皮层细胞来确认胶原层是以这种除去了上皮的羊膜为原材料的。另外，羊膜特别优选人羊膜。
这种角膜上皮移植用片材可作为角膜损伤、缺损等患者的移植材料(代替角膜上皮)使用。这时，将其被移植至角膜上皮缺失部以使胶原层位于眼球侧。移植时，优选用手术用缝合线将移植片与周围的组织固定，以促进存活。另外，移植后优选用治疗用隐形眼镜临时包裹移植部表面进行保护。
以上的角膜上皮样片材，及角膜上皮移植用片材可用以下方法制造。
本发明的第三个方面涉及角膜上皮样片材的制造方法，它具有下列步骤。
a)在胶原层上培养口腔粘膜上皮细胞，
b)口腔粘膜上皮细胞增殖、复层化后，使最表层接触空气。
这里，作为胶原层原材料的胶原的种类不受限制，I型胶原、III型胶原、IV型胶原等都可使用。也可使用几种胶原的混合物质。这些胶原可以从猪、牛、羊等动物的皮肤、软骨等结缔组织，利用酸溶解法、碱溶解法、酶溶解法等进行提取、精制。另外，为了降低抗原性，优选利用胃蛋白酶和胰蛋白酶等分解酶进行处理，除去端肽，即优选利用粥样胶原(atherocollagen)。
作为胶原层，优选来源于羊膜，特别优选来源于人羊膜的胶原层。这里，所谓来源于羊膜是泛指以羊膜为出发原料得到的物质。人羊膜为包覆于子宫与胎盘最表层的膜，在富含胶原的实质组织上形成有基底膜、上皮层。人羊膜可以由分娩时产后得到的胚胎膜、胎盘等采集。具体地说，对分娩后立即得到的包含胚胎膜、胎盘及脐带的一体物进行处理、精制，可以制备人羊膜。处理、精制方法可采用特开平5-5698号所记载的方法等周知的方法。即，自分娩时得到的胚胎膜剥离羊膜，通过超声波清洗等物理处理及酶处理等方法，除去残存组织，经过适当的清洗工序可制备人羊膜。
可以冷冻保存这种制备的人羊膜至使用。比如，人羊膜的冷冻可以在-80℃、DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)与甘油等体积比混合的溶液中进行。冷冻保存不仅可以提高可操作性，而且可以期待降低抗原性。
虽然羊膜可以直接作为胶原层来使用，但是优选经刮除处理除去了上皮的羊膜。例如，解冻上述冷冻保存的人羊膜后，用EDTA或蛋白分解酶进行处理，打开细胞间的连接，然后用细胞刮等刮除上皮，即可制备除去了上皮的人羊膜。
在胶原层上培养口腔粘膜上皮细胞。这暗示着口腔粘膜上皮中存在着干细胞，并可认为容易分化诱导形成上皮样细胞层的细胞。此外，使用口腔粘膜上皮细胞有很多优点，例如，容易采集、可以采集大量的细胞、处置双眼性患者时可利用自体细胞制备移植材料等。特别是对于不能采集角膜上皮细胞的患者来说，可适用于来源于自体细胞的移植材料这一优点，被人们期待着大幅度地解决临床上极为重要的排斥反应问题。
作为口腔粘膜上皮细胞，可使用存在于齿根部的细胞(口腔内缘粘膜上皮细胞)、口唇部细胞、腭部细胞、颊部细胞等。其中，由于口腔内缘粘膜上皮细胞的增殖能力强、抗原性低，为特别优选。可通过手术刀切除或刮除目的细胞存在的位置分等方法采集口腔粘膜上皮细胞。而对于口腔内缘粘膜上皮细胞，则可以通过将附着于拔掉牙齿的口腔粘膜上皮从釉质牙骨质过渡处(エナメルセメント移行部)分离的方法进行采集。另外，为了除去结缔组织等杂质，优选分散酶或胰蛋白酶等酶处理，或过滤处理。
本发明制造的角膜上皮样片材虽然可以使用采自待移植患者以外的口腔的口腔粘膜上皮细胞，但考虑到免疫排斥反应，优选采自患者自身口腔的口腔粘膜上皮细胞，并供培养。
将这么采集到的口腔粘膜上皮细胞在胶原层上进行培养。例如，按照上述方法，配制口腔粘膜上皮细胞悬浮液，将其播种到胶原层上，在适当的培养条件下进行培养。将除去上皮的人羊膜作为胶原层使用时，优选在除去上皮、并露出表面的一侧(即基底膜侧)播种口腔粘膜上皮细胞。因为这一侧富含IV型胶原，可良好地增殖、复层化已播种的口腔粘膜上皮细胞。
可在胶原层上播种口腔粘膜上皮细胞的细胞密度例如约为1×103个/cm2或以上，优选约1×103个/cm2～约1×107个/cm2，更优选约1×104个/cm2～约1×106个/cm2。
优选在支持细胞的存在下培养口腔粘膜上皮细胞。所谓支持细胞，又叫作喂养细胞，用来供给培养液中成长因子等。在支持细胞共存下进行培养可提高口腔粘膜上皮细胞的增殖效率。作为支持细胞，可以使用例如3T3细胞等(瑞士鼠3T3细胞、鼠NIH3T3细胞、3T3J2细胞等)。其中，考虑到增殖效率、处理的难易程度等因素，优选鼠NIH3T3细胞作为支持细胞。
优选预先用丝裂霉素C使支持细胞失活。这是为了防止由于支持细胞自身的增殖而阻碍口腔粘膜上皮细胞的增殖，且为了提高口腔粘膜上皮细胞的增殖效率。可通过放射线处理等方法进行这种失活处理。
在支持细胞的共存下进行口腔粘膜上皮细胞培养的情况下，优选支持细胞与胶原层间存在支持细胞无法通过的孔径的隔离膜。利用该隔离膜培养时，可以防止支持细胞侵入胶原层一侧(即口腔粘膜上皮细胞一侧)。结果，就不必担心最终得到的角膜上皮样片材中会混有支持细胞。这就意味着制造没有支持细胞引起的免疫排斥问题的角膜上皮样片材将成为可能，在临床上极其有意义。
作为隔离膜，可以适当选择使用具有支持细胞无法通过孔径的周知的隔离膜。例如，可使用聚碳酸酯制、孔径约为0.4μm～3.0μm的膜。隔离膜的材质无特殊的限制，除聚碳酸酯之外，聚酯等均可。这种隔离膜有市售，容易得到。
下面举例说明使用隔离膜时的培养方法。首先，在平皿等容器(第1容器)中播种、培养失活了的支持细胞，使之在容器表面形成支持细胞层。然后，将用隔离膜形成底面的第2容器置于第1容器内。这时，调整第2容器的位置，使第2容器的底面位于培养液中。接下来，在第2容器的底面，即隔离膜上形成胶原层。然后，在胶原层上播种、培养口腔粘膜上皮细胞。
可预先在第2容器的底面上形成胶原层(例如，在第2容器的底面上铺上除去了上皮的羊膜。在这种状态下也可进行干燥处理。)，将该第2容器置于播种了支持细胞的第1容器内，然后在胶原层上播种、培养口腔粘膜上皮细胞。
支持细胞的细胞密度，例如可约为1×102个/cm2或以上，优选约1×102个/cm2～约1×107个/cm2，更优选约1×103个/cm2～约1×105个/cm2。与口腔粘膜上皮细胞数相比，使用的支持细胞数，例如为口腔粘膜上皮细胞数的1/103倍～1×102倍，优选1/102倍～1倍，可在这种条件下进行培养。若支持细胞数少，口腔粘膜上皮细胞的增殖率就会低下，过少时，将无法得到良好的口腔粘膜上皮细胞的复层化。另一方面，支持细胞数过多时，反而会降低口腔粘膜上皮细胞的增殖率，为非优选。
对于培养口腔粘膜上皮细胞时所用的培养液，只要能够使该细胞增殖、复层化，就没有特殊的限制。例如，可以使用上皮细胞生长常用的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)与哈姆F12培养基(Ham’s F12 medium)以一定的比例混合的、添加了FBS、生长因子、抗生素等的培养基。具体例子为：添加了FBS(10％)、胰岛素(5mg/ml)、霍乱毒素(0.1nM)、上皮细胞增殖因子(EGF)(10ng/ml)、及青霉素-链霉素(50IU/ml)的、DMEM与哈姆F12培养基的混合培养基(混合体积比为1∶1)。此外，也可使用添加了三碘甲状腺氨酸(如2nM)、谷氨酰胺(如4mM)、铁传递蛋白(如5mg/ml)、腺嘌呤(如0.18mM)、及/或氢化可的松(如0.4mg/ml)的、DMEM与哈姆F12的混合培养基。
根据步骤a)在胶原层上增殖、复层化口腔粘膜上皮细胞。然后，实施使复层化了的细胞层表层与空气接触的步骤(步骤(b))。另外，在说明书中，该步骤也叫空运(Air lifting)。该步骤(b)的目的是为了分化形成细胞层的细胞、及诱导屏障机能。
该步骤可通过如下方法实现，即用滴管、移液管临时除去一部分培养液，使培养液表面下降，这样会使口腔粘膜上皮细胞层的最表层临时露出培养液外。或者，也可以连带胶原层一起，提起口腔粘膜上皮细胞层，使其最表层临时露出培养液表面。也可以用管子等将空气送入培养液中，使口腔粘膜上皮细胞层的最上层与空气接触。考虑到操作的难易程度，优选降低培养液表面、露出口腔粘膜上皮细胞最表层的方法。
实施该步骤(b)的时间，也就是使复层化了的细胞层的最表层接触空气的时间，根据细胞的状态和培养条件等不同会有变动，例如3天～3周左右，优选5天～2周，更优选约1周。
根据以上本发明的方法，在胶原层上形成了口腔粘膜上皮细胞复层化了的角膜上皮样细胞层(角膜上皮样片材)。这种角膜上皮样片材可与作为口腔粘膜上皮细胞的培养基质的胶原层一起，作为角膜损伤、缺损等患者的移植材料(代替角膜上皮)使用。这时，将其移植至角膜上皮缺损部，使胶原层位于眼球侧。移植时，优选用手术用缝合线将移植片与周围的组织固定，以促进存活。另外，移植后优选用治疗用隐形眼镜临时包裹移植部表面进行保护。
另外，也可将除去一部分的胶原层、或除去全部胶原层的(即仅为角膜上皮样片材)作为移植片使用。可以通过适当组合使用EDTA等的化学处理、使用蛋白质分解酶等的酶处理、使用镊子等的刮除等物理处理除去该胶原层。
根据本发明的第3方面制造了口腔粘膜上皮细胞复层化了的角膜上皮样细胞层(角膜上皮样片材)，但也可以看出本发明的方法提供了在胶原层上形成了该细胞层的角膜移植用材料(角膜上皮移植用片材)。即，本发明的方法也可用于制造具有这种构造的角膜上皮移植用片材。
<实施例1>使用家兔评价角膜上皮样片材
[羊膜的采集]
对无全身合并症的、预计作剖腹产的孕妇，经与妇产科医生进行充分的知情同意(informed consent)后，剖腹产时，在手术室进行采集。操作要注意清洁，应手术操作要求洗手后，穿上专用的手术服。在分娩前准备洁净的采集羊膜用的桶与清洗用的生理盐水。分娩后，将胎盘组织转移至桶中，用手将羊膜组织从胎盘剥离。用剪刀切除羊膜与胎盘严重粘连的部分。
[羊膜的处理]
按照(1)清洗、(2)修整、(3)保存的顺序处理羊膜。最好所有的操作均在洁净的通风橱内进行，使用的容器、器具均经过灭菌处理，使用的平皿等为灭菌了的一次性平皿。用生理盐水清洗、除去附着在采集羊膜上的血液成分，再用足够的生理盐水(添加0.005％的氧氟沙星)清洗。然后将羊膜转移至平皿内的磷酸缓冲液(PBS)中，用剪刀剪成约4×3cm左右的大小。剪好后浸入数个平皿中的贮存液，从中选择状态好的羊膜。
[羊膜的保存]
在2cc的灭菌冻存管分别加入1cc的贮存液，向其中分别加入1张清洗、选出的羊膜，贴标签后，保存于-80℃冰箱中。贮存液使用的是50％灭菌的甘油-DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium：GIBCOBRL公司)。保存羊膜的使用期限为3个月，过期要进行焚烧处理。
[羊膜上皮的处理]
羊膜经上皮处理后，用于培养。首先，室温下解冻保存于-80℃的羊膜，之后，用平皿内灭过菌的磷酸缓冲液(PBS)充分进行清洗。洗净后，在37℃，于0.02％EDTA溶液(Nacalai tesque公司)中保存2小时，然后用细胞刮(Nunc公司USA)机械刮除上皮，作为培养基质使用。另外，用光学及电子显微镜(扫描电镜)确认了，经该方法处理1层羊膜上皮已完全被刮除(图1)。图1为扫描电镜下的羊膜图像。A为正常状态下(未进行上皮处理的状态)的羊膜表面图像，B为经上皮刮除处理(0.02％EDTA溶液)后的羊膜表面图像。
[口腔粘膜上皮细胞的回收]
拔掉6周龄的日本白色家兔的牙齿后，小心地从釉质牙骨质过渡处分离附着于牙齿上的口腔粘膜上皮。另外，尽可能地在灭菌条件下使用灭菌的器具进行相关操作。
室温下，在50IU/ml的含有青霉素链霉素、庆大霉素的磷酸缓冲液(PBS)中，浸泡采集到的口腔粘膜上皮30分钟，2次。之后，在37℃条件下，在含有1.2U的分散酶(Nacalai tesque公司)的磷酸缓冲液(PBS)中，浸泡组织1小时，接下来，用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液(GIBCOBRL公司)浸泡处理30分钟，分离细胞。将其浸入含有10％的牛胎儿血清(FBS)的DMEM中，使酶活性停止。之后，用60μM的细胞滤器除去多余的组织，分离出口腔粘膜上皮细胞(口腔内缘粘膜上皮细胞)。
[共培养细胞的配制]
共培养细胞(支持细胞)使用的是NIH-3T3细胞(以下简称“3T3细胞”。将事先培养的、75F烧瓶(BD Falcon公司)中的融合3T3细胞，浸渍在0.05％的丝裂霉素C溶液2小时，以抑制3T3的增殖活性。接下来，用磷酸缓冲液(PBS)清洗数次，除去丝裂霉素C后，用0.05％的胰蛋白酶-EDTA溶液处理，由此配制了3T3细胞悬浮液。
[羊膜上口腔粘膜上皮片材的形成]
以刮除了上皮的人羊膜为基质，把口腔粘膜上皮细胞与经上述处理了的3T3细胞，按照下面顺序进行共培养。培养器具使用的是6well的培养皿(Corning公司，NY)与培养插件(培养插入容器)(聚碳酸酯制，平均孔径3.0μm，Corning公司，NY)。
首先，在培养皿上播种3T3细胞悬浮液，使其细胞密度约为1×104个/cm2，在37℃，5％CO2的条件下培养。另外，在培养插件上，以刮除了上皮一侧为上，静置、贴上羊膜基质，室温下干燥10分钟。然后，在贴有羊膜的培养插件上播种含有口腔粘膜上皮细胞的细胞悬浮液，使其细胞密度约为1×105个/cm2。
进行以上操作后，按照图2所示，将培养插件置于培养皿内，在同种培养基中培养3T3细胞与口腔粘膜上皮细胞。需要注意的是，图2为表示培养中状态的模式横截面图。将培养插件2静置于培养皿1内，在培养皿1底面形成有3T3细胞层5。此外，图2还显示了在培养插件2的底面上静置有羊膜3，之上培养有口腔粘膜上皮细胞4的状态。符号6为培养基。
使用的培养基为添加了10％FBS、胰岛素(5mg/ml)、霍乱毒素(0.1nM)、青霉素-链霉素(50IU/ml)、人重组子上皮细胞增殖因子(EGF)(10ng/ml)的、DMEM与哈姆F12的混合培养基(混合体积比为1∶1)。
在上述培养基中培养2周(浸泡)。之后，为了分化诱导粘膜上皮，利用所谓的空运法培养1周。所谓空运法，就是将培养基的液面调整至于羊膜上形成的口腔粘膜上皮细胞层面，使该细胞层暴露于空气中的方法。浸泡过程中，隔天更换培养基，空运后每天更换培养基进行培养。
[羊膜上口腔粘膜上皮片材组织学特性的验证]
按照上述方法培养的口腔粘膜上皮细胞层在经过了约20天的培养之后，形成了类似于角膜上皮的5～6层多分化、复层化了的上皮层(以下也称“角膜上皮样片材”)(图3、图4)。在该上皮层的基底侧(羊膜侧)存在着相对圆柱形的类似基底细胞的细胞群。此外，可以看到最表层的细胞呈扁平型，有核，与皮肤不同，其表面未角化。由此可见，光学显微镜观察显示在羊膜上形成了类似角膜的上皮层(角膜上皮样片材)。
下面，为了探讨该角膜上皮样片材的组织学特性，进行了免疫染色。制造角膜上皮样片材后，切成适当的大小，冷冻包埋于OCTcompound。之后，用冷冻切片机切片，制造病理切片。利用免疫染色探讨了与具有代表性的细胞骨架蛋白角蛋白的关系。即，探讨了角模特异性的角蛋白3/12，粘膜特异性的角蛋白4/13，表皮特异性的角蛋白1/10。方法如下。用磷酸缓冲液(PBS)清洗切片后，用1％的牛胎儿血清(FBS)进行阻断，抑制非特异性的抗体反应。之后，在室温下反应各角蛋白的抗体(一次抗体)1小时。反应后，用含有triton-x的PBS清洗15分钟、3次，然后在室温下反应荧光标示抗体(二次抗体)。反应后，用磷酸缓冲液(PBS)清洗15分钟、3次，封入后，用共聚焦显微镜进行组织观察。
对角膜上皮样片材，各种角蛋白的抗体反应如下。首先，可以看到对角模特异性角蛋白3的染色性(图5左栏)。由于在体内的口腔粘膜上可以看到对角蛋白3的染色性，因此，可认为即使在培养条件下也可以保持其性质。同时，没有看到对角蛋白12的染色性(图5右栏)。对于粘膜特异性的角蛋白4及13，同样看到了染色性(图6)。然而，对于表皮角化型的角蛋白1/10，没有看到其染色性(图7)。由此可见，角膜上皮样片材的组织学特性并非由细胞骨架的侧面象表皮一样向角化的方向分化，而是在保持着非角化型粘膜上皮的性质的同时，还保持着角膜特异性角蛋白的一部分(角蛋白3)。
[口腔粘膜上皮片材的自体移植]
下面，利用角膜上皮样片材进行了自体移植实验。按照上述方法，自6周龄的日本白色家兔采集口腔粘膜上皮细胞，制造了在羊膜上形成了角膜上皮样片材的移植用片材(以下也称“角膜上皮移植用片材”)。同时，对采集了口腔粘膜上皮细胞的白色家兔，自距异组织边缘4mm的外侧，用弯剪刀除去100μm厚的所有角膜及结膜上皮。由于该操作除去了含有角膜上皮干细胞的上皮细胞，可认为将再现人为的眼表面干细胞缺乏症。进行该操作后，用荧光素染色确认了已经没有残留含有角膜上皮细胞的上皮(图8)。需要注意的是，荧光素染色试验是使荧光素试纸含有抗生素眼药水等水分，直接敷在眼表面上，使动物眨眼2、3次后，观察眼表面的荧光素染色性。若残存有角膜上皮，其细胞间紧密的连接结构会造成荧光素色素不浸润，将看不到荧光素染色。4周后，该家兔的眼表面被周围残存的结膜上皮所覆盖，失去了透明性(图9)。
下面，对于被结膜上皮所覆盖并失去了透明性的眼睛，除去眼表面的结膜组织后，将上述角膜上皮移植用片材由异组织边缘移植至内侧区域。移植时用10-0尼龙线缝合周围的组织。移植后，在移植片上缝上治疗用软隐形眼镜。术后，涂上抗生素及甾体眼软膏，2次/日。在移植后的时刻，眼表面显示了与移植前的角膜上皮移植用片材相同的透明性(图10)。
在移植后48小时、及10天后观察了实施了移植手术的眼表面。在移植后48小时，可确认移植的角膜上皮移植用片材维持了透明性，且可通过荧光素染色确认其完好无损地残留于眼表面(图11)。此外，由于移植片(角膜上皮移植用片材)没有显示荧光素染色性，因此，可确认本发明的角膜上皮移植用片材(角膜上皮样片材)具有与角膜上皮一样的屏障机能。进而，由于用荧光素染色看到移植片的四周有荧光素染色性，可确认移植部中存在的组织不是周围残存结膜上皮的污染物。
另外，由于角膜上皮细胞间通过紧密的连接结构结合在一起，因此，其表面不能浸润荧光素色素，荧光素染色不显示染色性。另一方面，打开细胞间的连接、剥离细胞自身引起屏障机能障碍时，将出现荧光素色素浸润，可染色组织。因此，通过考察荧光素染色的染色性，可以确认移植的角膜上皮样片材是否具有与角膜上皮相同的屏障机能。
移植后10天时，按上述方法观察眼表面。观察到移植的角膜上皮移植用片材残存于眼表面，且通过荧光素染色与移植后48小时的状态相比，观察到向周围进行了伸展(图12)。移植片未显示荧光素染色性，可确认维持了角膜上皮所必需的屏障机能。而且，还维持了透明性。
由此可见，在羊膜上培养得到的角膜上皮样片材存活、伸展于眼表面，在术后的长时间内维持了透明性。即，确认了：利用上述方法制造的角膜上皮样片材，作为角膜上皮的替代品，具有良好的机能，且包括羊膜及羊膜上形成的角膜上皮样片材的片材状组合物(角膜上皮移植用片材)，作为移植材料可良好地适用于角膜的损伤、缺损时重建眼表面。
<实施例2>人角膜上皮样片材的评价
下面，确认了将角膜上皮样片材应用于人时的效果。移植对象为(1)化学外伤急性期的迁延性上皮缺损患者、(2)化学外伤慢性期的瘢痕组织侵入引起混浊的患者、(3)眼类天疱疮患者，利用与上述实施例1相同的方法分别采集各患者的口腔粘膜上皮细胞。然后，以刮除了上皮的人羊膜为基质，将口腔粘膜上皮细胞与3T3细胞共培养，得到在人羊膜上形成了口腔粘膜上皮细胞层的角膜上皮移植用片材。需要注意的是，刮除了上皮的人羊膜的制备方法，及与3T3共培养的条件均与实施例1相同。将这样制备的各角膜上皮移植用片材，分别移植(自体移植)于采集了用于制备细胞的患者，并评价了其效果。移植方法与实施例1所记载的方法相同。但是，对眼类天疱疮患者，切除上方的瘢痕组织、解除粘连，之后，在上方的3分之1处移植角膜上皮样移植片材，同时实施白内障手术，插入了人工晶状体。
图13显示了术前(左栏)及术后5个月(右栏)化学外伤急性期的迁延性上皮缺损患者眼表面的状态。可以看到在术后5个月，良好地重建了眼表面。不进行移植手术的情况下，可以预测本患者的视力会由于瘢痕组织的侵入降低至仅能辨认手动的程度。现在视力恢复至0.5，上皮的状态也稳定。此外，自体移植不用担心会有排斥反应，与常规移植手术相比，术后的管理容易得多。
图14显示了术前(左栏)及术后2个月(右栏)化学外伤慢性期的瘢痕性角结膜上皮症患者眼表面的状态。该患者在术前为几乎看不到眼内所见的重症患者，通过移植手术解除了粘连，可透见至晶状体。视力由感光改善至辨认手指数。为了决定下面的手术方针进行了预备手术，这不仅达到了当初观察眼内的目的，也可以看到有显著的美容改善作用。
图15显示了术前(左栏)及术后1个月(右栏)眼类天疱疮患者眼表面的状态。众所周知，如果对眼类天疱疮患者实施通常的白内障手术，结膜就会趁机侵入，形成瘢痕，由此引起显著的角膜混浊。在本病例中，在上方可以看到术前眼类天疱疮引起的睑球粘连，术后1个月时，眼表面的状态已经稳定。术前视力只有0.06，但现在恢复至0.6。
以上结果证实了本发明的角膜上皮样片材(角膜上皮移植用片材)对人的有效性。
本发明并不局限于上述发明的实施方式及实施例的说明。不脱离权利要求范围的记载、在本领域技术人员容易想到的范围的种种变化形式也在本发明的范围之内。
下面公开了如下事项。
(11)角膜上皮移植用片材的制造方法，其中包括
a)在胶原层上培养口腔粘膜上皮细胞的步骤、与
b)口腔粘膜上皮细胞增殖、复层化以后，使最表层接触空气的步骤。
(12)(11)所记载的角膜上皮移植用片材的制造方法，其中，在支持细胞的共存下实施前述步骤a)。
(13)(11)所记载的角膜上皮移植用片材的制造方法，其中，在支持细胞的共存下，及在支持细胞与前述胶原层间存在不能通过支持细胞孔径的隔离膜的状态下实施前述步骤a)。
(14)(11)～(13)中任何一项所记载的角膜上皮移植用片材的制造方法，其中，前述胶原层来源于羊膜。
(15)(11)～(13)中任何一项所记载的角膜上皮移植用片材的制造方法，其中，前述胶原层由除去了上皮的羊膜组成。
(16)角膜上皮移植用片材的制造方法，其中，包括以下步骤：
在第1容器内播种支持细胞，使之形成支持细胞层；
在第1容器内设置具有由孔径不能使前述支持细胞通过的隔离膜形成的底面的第2容器，以使底面位于培养液中；
在前述第2容器的前述底面上形成胶原层；
在前述胶原层上播种口腔粘膜上皮细胞；
培养、并使口腔粘膜上皮细胞复层化；
使复层化了的口腔粘膜上皮细胞的最表层接触空气。
(17)(16)所记载的角膜上皮移植用片材的制造方法，其中，前述胶原层来源于羊膜。
(18)(16)所记载的角膜上皮移植用片材的制造方法，其中，前述胶原层由除去了上皮的羊膜组成。
工业实用性
迄今为止的眼表面重建术是采集自己(auto)或他人(allo)的角膜上皮干细胞，将其移植给患者。但是，采集自己健康眼睛的干细胞，健康眼睛将来会有患干细胞缺乏症的危险。此外，用他人的干细胞移植不仅常有排斥反应的风险，供体不足也是问题之一。如果利用本发明提供的角膜上皮样片材及角膜上皮移植用片材，作为移植材料用的细胞源，可以使用自体的口腔粘膜上皮，因此不用担心会引起干细胞缺乏症，排斥反应的风险也极小，且不用担心供体不足，本发明使具有以上优点的移植术成为可能。特别是对于采集自体角膜上皮干细胞困难或不可能的患者，即双眼性角膜疾病的患者来说，使用用自体细胞制造的移植材料进行移植术成为可能，这点是有意义的。
本发明的角膜上皮样片材(角膜上皮移植用片材)移植后的存活良好，且具有耐眨眼的黏着性。此外，在基底细胞层有一定的、且具有耐眨眼的黏着性。此外，在基底细胞层保持有一定的增殖能力，同时在垂直方向上形成了复层化、分化的上皮样细胞层，具有与角膜上皮极其相似的结构。另外，角膜上皮具有发挥其机能所必需的屏障机能，且透明度高。如上所述，本发明提供的角膜上皮样片材及角膜上皮移植用片材，作为重建角膜上皮的移植材料是极其优良的。
Claims (18)
1.角膜上皮样片材，其特征在于，具有源于口腔粘膜上皮细胞的细胞复层化了的细胞层。
2.权利要求1所记载的角膜上皮样片材，其中，最表层的细胞未角化。
3.权利要求1或2所记载的角膜上皮样片材，其中，最表层的细胞为扁平状。
4.权利要求1～3中任何一项所记载的角膜上皮样片材，其中，角膜上皮样片材具有屏障机能。
5.角膜上皮移植用片材，其特征在于，在胶原层上形成了源于口腔粘膜上皮细胞的细胞复层化了的细胞层。
6.权利要求5所记载的角膜上皮移植用片材，其中，前述细胞层的最表层细胞未角化。
7.权利要求5或6所记载的角膜上皮移植用片材，其中，前述细胞层的最表层细胞为扁平状。
8.权利要求5～7中任何一项所记载的角膜上皮移植用片材，其中，前述胶原层来源于羊膜。
9.权利要求5～7中任何一项所记载的角膜上皮移植用片材，其中，前述胶原层由除去了上皮的羊膜组成。
10.权利要求5～9中任何一项所记载的角膜上皮移植用片材，其中，角膜上皮移植用片材具有屏障机能。
11.角膜上皮样片材的制造方法，其中，包括
a)在胶原层上培养口腔粘膜上皮细胞的步骤，与
b)口腔粘膜上皮细胞增殖、复层化后，使最表层接触空气的步骤。
12.权利要求11所记载的角膜上皮样片材的制造方法，其中，在支持细胞的共存下实施前述步骤a)。
13.权利要求11所记载的角膜上皮样片材的制造方法，其中，在支持细胞的共存下、及在支持细胞与前述胶原层间存在不能通过支持细胞孔径的隔离膜的状态下实施前述步骤a)。
14.权利要求11～13中任何一项所记载的角膜上皮样片材的制造方法，其中，前述胶原层来源于羊膜。
15.权利要求11～13中任何一项所记载的角膜上皮样片材的制造方法，其中，前述胶原层由除去了上皮的羊膜组成。
16.角膜上皮样片材的制造方法，其中，包括以下步骤，
在第1容器内播种支持细胞，使之形成支持细胞层；
在第1容器内设置具有由孔径不能使前述支持细胞通过的隔离膜形成的底面的第2容器，以使底面位于培养液中；
在前述第2容器的前述底面上形成胶原层；
在前述胶原层上播种口腔粘膜上皮细胞；
培养、并使口腔粘膜上皮细胞复层化；
使复层化了的口腔粘膜上皮细胞的最表层接触空气。
17.权利要求16所记载的角膜上皮样片材的制造方法，其中，前述胶原层来源于羊膜。
18.权利要求16所记载的角膜上皮样片材的制造方法，其中，前述胶原层由除去了上皮的羊膜组成。
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