CN1889988A - 生发方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生发方法，其特征在于，是皮肤移植毛乳头或培养毛乳头细胞使毛发再生时高效率地长出头发并向接近天然毛发的状态诱导生发的方法，将含以下的成分：(a)毛乳头或毛乳头细胞、(b)表皮组织或表皮细胞、和/或(c)构成毛囊的组织或其细胞的组合物移植到表皮缺损部位。

Description

生发方法
技术领域
本申请发明涉及采用毛乳头细胞移植的生发方法和用于该方法的移植材料。
技术背景
生产毛发的毛囊组织借助称作毛乳头的特殊的间充质与表皮的相互作用形成。认为毛乳头与作为毛发生长、停止周期的毛发周期的进行关系也很密切。由于男性激素浓度或血液循环的恶化等种种的原因，该毛发周期发生变化，故产生男性型的脱毛症。在男性型脱毛症后期，由于生发治疗药等的效果低，并且毛乳头密度也变得疏松，故要求采用细胞移植增加毛囊组织数的治疗技术。
迄今的治疗技术中，报道了切除脱毛症发病部位皮肤后，将头部或侧头部有健康头发的头皮组织其本身植皮到脱毛症部位上。使脱毛症部位的面积减少的方法(非专利文献1)。还报道了从健康的头皮外科分离毛囊后移植到脱毛症发病部位的方法，提高了治疗效果(非专利文献2)。然而，任何一种方法虽然可以实现脱毛症部位的面积缩小，但毛囊数或毛发的总数不得不减少或与现状相同。这是由于只是使健康的毛囊移到脱发部位。因此治疗涉及宽范围的脱毛症的场合必须移皮形成更宽范围的正常头皮，或切除后成为毛囊供给的供体组织。所以按照所利用的正常皮肤的面积，预先在皮下组织中插入扩张器，慢慢地使皮肤伸长(非专利文献3)，或必须分几次手术等待皮肤的伸长，虽然是自体组织移植，但与肝脏或心脏移植之类的脏器移植同样地存在头皮组织供体不足的现状。此外，要求非常高的外科技术和采用手工作业进行组织的分离。
这样的外科方法伤害性非常高，对患者来讲是强迫非常大的痛苦和负担的方法。而另一方面，作为有效的唯一的根本的治疗法是利用健康性质的毛囊覆盖脱毛症发病部位，可以得到即使处于种种脱毛症发病的主要因素中也难于脱发的头发。
因此，希望实现减轻脱毛症患者的痛苦和负担、以及解决健康头发组织供体不足、并且不需要高度移植技术的移植用人造头发。作为移植用人造头发，採取将为具有生物体亲和性而加工的高分子聚合物插入皮肤内，使其和真皮组织及皮下组织亲和的方法。然而，这种方法常发生免疫排斥、感染症，美国已禁止采用此法。
鉴于这些的现状，考虑通过由极小的组织中分离患者自体细胞进行培养增殖，然后作为材料构筑毛囊，增加移植用毛囊的方法。由于毛囊由患者自己的细胞形成，故原理上不发生免疫排斥，并且由于呈现极高的生物体亲和性故也不引起异物应答，迅速地完成移植组织的修复。因此，不需要如人造毛发移植一样地经数天到数周实现人造毛发周围上皮化而使患者蒙受高感染症危害。例如专利文献1公开了将从患者自身的头皮分离出的毛乳头细胞进行培养增殖，将该培养毛乳头细胞移植给患者的方法。然而，实际情况是即使将培养增殖的毛乳头细胞移植到皮肤上生发效率也极低，并且即使长出头发，头发的状态也脆弱，难以说是天然头发的再生。
为了人工诱导毛囊，必须以胚胎学的知识为基础，应用组织工程学的方法。胚胎学上如前述那样，毛囊通过表皮细胞与作为真皮细胞的毛乳头细胞的相互作用形成。另外，报道了实现该毛囊形成的相互作用可通过将培养毛乳头细胞与来自新生儿的表皮细胞混合，移植到除去全层皮肤后的筋膜上的实验来再现(非专利文献4)。此外，由于业已报道了通过人毛乳头与动物毛囊的组合形成毛囊的方法(非专利文献5)，故已知也可应用于人的脱毛症治疗。
另外，还报道了由毛乳头或培养毛乳头细胞构成的人造毛乳头通过使用锐利的镊子或手术刀切开皮肤采用手工作业向真皮、表皮间隙移植可以在皮肤内再构筑新的毛囊(非专利文献6)。或者报道了还尝试使用注射器向皮肤内部进行移植的方法，报道了虽然是限定的结果但在毛乳头或毛乳头细胞移植部位诱导毛囊结构或毛发(专利文献1)。然而，对于利用表皮细胞与毛乳头细胞的相互作用所控制的毛囊形成，必须使表皮细胞与毛乳头细胞极其接近才能有助于相互作用。作为实现表皮细胞与毛乳头细胞极其接近的方法，考虑将毛乳头细胞移植到表皮的正下方，或者将表皮细胞与毛乳头细胞混合进行移植。
为了极其接近于表皮的正下方移植毛乳头细胞，要求以极高的精确度控制细胞的移植部位的高超技术。真皮层中，以成纤维细胞构筑的胶原为主的细胞外基体的纤维复杂地缠绕着。向皮肤内部注入微少组织、细胞、胶原珠等的药物输送载体的场合，不得不在生理盐水、培养基、血清等中悬浮后注入。此时，构成真皮的纤维由于注入时的压力而产生开裂。因此，使用注射器注入毛乳头、人造毛乳头、毛乳头细胞等的场合，移植到可期待表皮和间充质相互作用的表皮正下方是极其困难的。因此，即使是技术上可以实现而要进行数千到数万根量的细胞移植则需要庞大的时间，这便成为开发费用与治疗费相加的结果。
另外，使用镊子和手术刀切开表皮，采用手工作业移植到表皮正下方的方法，要求技能和劳力，并且对接受者皮肤的损伤大，实际上不可能诱导脱毛症患者所需的数千至数万根量的毛发。
此外，本申请的发明人通过在脚掌的表皮与真皮间移植传代毛乳头细胞，搞清了从大鼠腮须上分离培养的毛乳头细胞，通过将成纤维细胞增殖因子2(FGF2)或大鼠脚掌表皮细胞第1代培养上清添加到培养基中可以长期进行传代培养，并且该传代培养的毛乳头细胞通过数十代的传代数保持毛囊诱导能力，已申请了专利(专利文献2)。另外，本申请的发明人还发明了将一定量的毛乳头细胞等的微小生物体材料可靠且稳定地从注射器等的排出装置排出进行皮肤移植用的方法，申请了专利(专利文献3)。
如上所述，为了通过毛乳头细胞的移植生发，必须要使毛乳头或培养毛乳头细胞确实接近表皮细胞，减少接受者的负担进行移植，使从更多数移植的毛乳头细胞高效地生发。
此外，还知道毛乳头细胞经过反复10代左右传代培养，发生诱导能力减弱(非专利文献7)。而本申请的发明人，针对此发明了在长期地保持毛囊诱导能力的状态下使毛乳头细胞增殖的培养技术(专利文献3)。然而，采用该专利文献3的方法培养增殖的毛乳头细胞的场合，虽然移植后也能形成毛囊，但在随传代而减弱失去生发诱导能力方面仍没改变。因此，强烈期望在对经长期传代培养增殖的毛乳头细胞赋予充分的生发诱导能力的状态下进行移植的方法。
另一方面，真皮毛发根鞘是包围毛囊最外层的真皮性细胞构成的组织。真皮毛发根鞘在毛球部的最下端与毛乳头相连(图7，箭头)。另外，若将部分切除毛乳头和毛母的毛囊移植到肾皮膜内或皮下组织上，再构筑毛球部，从观察毛发管的伸长看，可以认为毛乳头细胞的前体细胞分布在真皮毛发根鞘上。
最近，报道了进行将男性的真皮毛发根鞘异体移植到女性的前腕部皮肤上实验的结果，诱导形成了毛囊进行生发(非专利文献8)。另外还报道了进行将第一代培养真皮毛发根鞘细胞移植到耳廓的无毛皮肤表皮正下方实验的结果，诱导形成毛囊进行生发(非专利文献9)。由这些情况可以认为真皮毛发根鞘细胞也是毛发再生用的有希望的移植材料。
然而，在真皮毛发根鞘细胞的场合，确认第一代培养细胞有毛囊诱导生发能力，但经传代培养增殖的真皮毛发根鞘细胞中都没发现显著的生发(非专利文献9)。
专利文献：
1：特开2001-302520号公报
2：特开平7-274950号公报
3：特开2003-235990号公报
非专利文献
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发明内容
本申请发明以提供皮肤移植毛乳头或培养毛乳头细胞使头发再生时，高效率地长出头发，进一步向接近天然头发的状态诱导生发的方法，和此方法用的移植材料为课题，作为解决这些课题的手段提供以下的发明。
本申请的第1发明是一种生发方法，其特征在于，将含有以下成分：
(a)毛乳头或毛乳头细胞；与
(b)表皮组织或表皮细胞的组合物移植到表皮缺损部位。
第2发明是一种生发方法，其特征在于，将含有以下成分：
(a)毛乳头或毛乳头细胞；与
(c)构成毛囊的组织或其细胞的组合物移植到表皮缺损部位。
第3发明是一种生发方法，其特征在于，将含有以下成分：
(a)毛乳头或毛乳头细胞；
(b)表皮组织或表皮细胞；与
(c)构成毛囊的组织或其细胞的组合物移植到表皮缺损部位。
前述第1～3发明中作为优选方式是使表皮全层和真皮的一部分缺损形成表皮缺损部位。
另外，将前述的各发明中的成分(a)、(b)与(c)是来自人，并且是来自人的头皮，而且成分是来自人头皮的场合，在人头皮上形成前述的表皮缺损部位作为优选方式。
此外，在前述第1～第3发明中，将成分(a)的毛乳头细胞是培养细胞作为优选方式。
前述第2或第3发明中，分别将成分(c)是真皮毛发根鞘或真皮毛发根鞘细胞；以及成分(a)的毛乳头细胞是10代或更多代的传代培养细胞，成分(c)是毛球部的真皮毛发根鞘或真皮毛发根鞘细胞作为优选方式。而且在这种方法的场合，分别将成分(c)的真皮毛发根鞘细胞是培养细胞，再具体地讲，成分(c)的真皮毛发根鞘细胞是在含有FGF2培养基中增殖的培养细胞作为优选方式。
此外，本申请提供作为前述各发明方法使用的移植材料的以下的发明。即，本申请的第4发明是含以下的成分：
(a)毛乳头或毛乳头细胞；与
(b)表皮组织或表皮细胞的组合物。
第5发明是含以下的成分：
(a)毛乳头或毛乳头细胞；与
(c)构成毛囊的组织或其细胞的组合物。
第6发明是含以下的成分：
(a)毛乳头或毛乳头细胞；
(b)表皮组织或表皮细胞；与
(c)构成毛囊的组织或其细胞的组合物。
这些发明的第4～第6发明中，将成分(a)、(b)与(c)是来自人，并且是来自人头皮作为优选方式。
另外，前述第4～第6发明中，将成分(a)的毛乳头细胞是培养细胞作为优选方式。
此外，前述第5或第6发明中，分别将成分(c)是真皮毛发根鞘或真皮毛发根鞘细胞；以及成分(a)的毛乳头细胞是10代或更多代的传代培养细胞，成分(c)是毛球部的真皮毛发根鞘或真皮毛发根鞘细胞作为优选方式。并且这种方法的场合，分别将成分(c)的真皮毛发根鞘细胞是培养细胞，再具体地讲，成分(c)的真皮毛发根鞘细胞是在含有FGF2培养基中增殖的培养细胞作为优选方式。
此外，本发明中，所谓“毛乳头”意味着从皮肤上分离的毛乳头组织，所谓“毛乳头细胞”意味着构成毛乳头的各个细胞。同样，所谓“表皮组织”是从皮肤上分离的表皮的组织，所谓“表皮细胞”指构成表皮组织的各个细胞。此外，所谓“真皮毛发根鞘”是从毛囊分离的真皮毛发根鞘其本身，所谓“真皮毛发根鞘细胞”意味着构成真皮毛发根鞘的各个的细胞。
此外，本发明中的所谓“生发”，意味着由移植后的毛乳头或毛乳头细胞形成毛囊，由该毛囊自发地长出毛发。另外，所谓“生发”如前所述意味着由毛囊长出的毛发自发地长长，但也有时称这样的头发的长长为“生发诱导”。
对于本发明的其他用语或概念，在发明的实施方式或实施例的记载中详细地进行说明。另外为实施本发明而使用的各种技术，除了特别地明确指出其出处的技术外，本领域技术人员均可根据公知文献等的记载容易且可靠地实施。
附图简单说明
图1是毛乳头细胞、表皮细胞混合移植的模式图。由健康的男性的后头部(a)分离出长着毛发的皮肤(b)。采用酶处理与使用镊子的手作业将该皮肤分离成表皮(c)和毛球部(d)。表皮经胰蛋白酶处理成为表皮细胞(e)，毛球部再分离成真皮毛发根鞘(f)和毛乳头(g)。毛乳头和真皮毛发根鞘进行胶原酶与胰蛋白酶处理成为单细胞，再进行荧光色素DiI标记，成为DiI标记毛乳头细胞(i)、真皮毛发根鞘细胞(h)。另外，毛乳头细胞的一部分播种在塑料皿中进行第一代培养(k)。该第一代培养毛乳头细胞进行3次传代培养(l)，再进行荧光色素标记，成为培养毛乳头细胞(m)。将非培养的表皮细胞(e)、真皮毛发根鞘细胞(h)、毛乳头细胞(i)混合，在前头部皮肤移植创上进行自体细胞移植。另外将培养毛乳头细胞(m)和采用上述方法新制备的表皮细胞(n)混合，同样地在前头部皮肤移植创上进行自体细胞移植(o)。
图2是毛乳头细胞、表皮细胞的混合移植创与手术后覆盖的截面模式图。移植部位选择预先不存在毛发的前头部皮肤，并且将皮肤全层除去直到深度3mm。在此注入混合细胞颗粒。
图3是非培养毛乳头细胞、真皮毛发根鞘细胞、表皮细胞的混合移植的结果。A表示移植后经3周长出的毛发(箭头)与移植部位(虚线圆)。B表示将移植部位生发的毛囊的组织切片进行苏木精曙红染色的状态。P表示毛乳头，HM表示毛母，IRS表示内毛发根鞘，ORS表示外毛发根鞘。C是B的连续切片中的DiI荧光照片。在P的位置有荧光信号。D同样是将C进行核染色的荧光照片。
图4是传代培养毛乳头细胞、非培养表皮细胞的混合移植的结果。A表示移植后经3周长出的毛发(箭头)与移植部位(虚线圆)。B表示将移植部位生发的毛囊的组织切片进行苏木精曙红染色的状态。P表示毛乳头，HM表示毛母。C是B的连续切片中的DiI荧光照片。在P的位置有荧光信号。D同样是将C进行核染色的荧光照片。
图5是可以任意地调制手术刀刃角度的手术刀柄的照片。通过使用该器具不仅可以形成如图2那样的圆形缺损，而且可形成线上的表皮缺损。
图6是通过来自含毛乳头细胞的真皮的细胞与表皮细胞混合的移植而生发状态的照片。移植后在第3周得到在直线上并列的长出的毛发。因此可再现毛发流。
图7是大鼠腮须组织的HE染色图像。真皮毛发根鞘在毛球部的最下端与毛乳头连接，包围毛囊(箭头)。DP是毛乳头，DS是真皮毛发根鞘，M是毛母，O是外毛发根鞘，I是内毛发根鞘，C是毛发皮质。
图8表示低传代数培养毛乳头细胞(6传代)的生发诱导能力与诱导的组织的组织化学。将来自传代数n＝6的大鼠腮须培养毛乳头细胞与新制备的大鼠新生仔表皮细胞混合，在裸体小鼠背部采用移植腔法进行移植。移植3周后观察到长毛发(a：箭头)。由长毛发部位制作石蜡切片。采用HE染色(b)、荧光色素DiI(c)、核染色荧光色素Hoechst(e)进行显微镜观察。对该连续切片采用特异地识别真皮毛发根鞘的SM-α-Actin抗体进行免疫染色(d)。SM-α-Actin抗体的阳性反应利用真皮毛发根鞘得以确认(d：箭头)。DP是毛乳头，DS是真皮毛发根鞘，M是毛母。
图9表示高传代数培养毛乳头细胞(39传代)的生发诱导能力与诱导的组织的组织化学。将高传代数培养毛乳头细胞(n＝39)与新制备的大鼠新生仔表皮细胞混合，采用移植腔法移植到裸体小鼠背部。移植3周后，没观察到长毛发(a：虚线部位)。由细胞移植部位制作石蜡切片，采用HE染色(b)、荧光色素DiI和核染色荧光色素Hoechst共染色(c)进行显微镜观察。观察到毛乳头内有许多DiI阳性细胞(c：虚线部位内，用小箭头表示代表例)。对该连续切片使用特异识别真皮毛发根鞘的SM-α-Actin抗体进行免疫染色(d)。但除了毛细血管(d：箭头)以外没有发现阳性细胞。DP是毛乳头，M是毛母。
图10表示培养真皮毛发根鞘细胞(1传代)的生发诱导能力和诱导的组织的组织化学。将培养真皮毛发根鞘细胞(n＝1，来自GFP大鼠)与新制备的大鼠新生仔表皮细胞混合，采用移植腔法移植到裸体小鼠背部。移植3周后观察到若干的长出的毛发(a：虚线部位)。由长毛部位制作冻结切片，采用HE染色(b)，荧光色素GFP(c)与核染色荧光色素Hoechst共染色(d)进行显微镜观察。在诱导形成的毛球部观察到GFP的荧光(c：箭头)。DP是毛乳头，DS是真皮毛发根鞘，M是毛母。
图11表示通过高传代毛乳头细胞(39传代)与培养真皮毛发根鞘细胞(1传代)的混合移植的生发能力恢复、增强与诱导组织的组织化学。将高传代数培养毛乳头细胞(n＝39)和培养真皮毛发根鞘细胞(n＝1，来自GFP大鼠)与新制备的大鼠新生仔表皮细胞混合，采用移植腔法移植到裸体小鼠背部。移植3周后观察到非常活跃地长出的毛发(a：箭头)。由细胞移植部位制作冻结切片，采用HE染色(b)、荧光色素GFP(e)、荧光色素DiI和核染色荧光色素Hoechst共染色(d)进行显微镜观察。观察到毛乳头内有许多DiI阳性细胞(d：虚线部位内)。观察到在诱导形成的毛球部的真皮毛发根鞘有GFP的荧光(e：箭头)。对该连续切片采用特异识别真皮毛发根鞘的SM-α-Actin抗体进行免疫染色(c)。利用真皮毛发根鞘确认SM-α-Actin抗体的阳性反应(c：箭头)。DP是毛乳头，DS是真皮毛发根鞘，M是毛母。
图12表示对人头皮进行培养腮须毛乳头细胞与新制备的真皮毛发根鞘细胞混合移植的结果。将传代培养人毛乳头细胞(n＝3)和新制备的培养真皮毛发根鞘细胞与表皮细胞混合。在志愿者(健康男性33岁)的前头部无毛发部位进行自体移植。移植后第2周观察到在真皮毛发根鞘细胞混合移植部位有3根黑的头发(a：白虚线内、白箭头)。而在真皮毛发根鞘细胞非混合部位，移植后第3周只观察到一根细而白的毛发(b：白虚线内，白箭头)。黑箭头表示从移植前存在的毛干与毛穴。
具体实施方式
本申请的第1发明是一种生发方法，其特征在于，将含成分(a)：毛乳头或毛乳头细胞；与成分(b)：表皮组织或表皮细胞的组合物(第4发明的组合物)移植到表皮缺损部位。
例如可以使用精密的镊子等从动物的皮肤(例如人头皮)摘出的毛囊中分离出毛乳头。另外，毛乳头细胞可以使用利用胶原酶或胰蛋白酶由摘出的毛乳头分散成各个细胞的毛乳头细胞，或者使用适当的动物细胞培养基例如实施例中记载的添加FGF2的含10％牛胎儿血清的达尔贝克改性伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)(DMEM10)，等进行适宜期间培养、再根据需要从数次到数十次传代培养增殖的毛乳头细胞。再者，优选培养细胞不是浮游液状态，尽量除去培养液等。
表皮组织或表皮细胞优选使用与摘出了毛乳头的同一个体的表皮，再优选使用尽可能距摘出的毛乳头存在的地方尽可能接近的皮肤取出的表皮组织或其细胞。例如，使用附着在为了分离毛乳头而摘出的毛囊上的表皮组织或其分散细胞。
该移植用组合物中的成分(a)与(b)的混合比例可任意地在约1∶9～约9∶1之间变动。另外，该组合物也可以含有其他的皮肤细胞(例如脚掌皮肤的成纤维细胞等)。该场合的成分(a)和成分(B)与成纤维细胞等的混合比例可以为约1∶9～9∶1。
移植移植用组合物的表皮可以使用手术刀等切除表皮全层或真皮的一部分形成。例如，切入深度1～5mm，长度1～5mm左右。对该表面缺损部位的组合物注入量，每一个部位优选为10μl或更少。该场合的细胞数是107～8个或更少的程度。
第2发明是一种生发方法，其特征在于，将含成分(a)：毛乳头或毛乳头细胞；与成分(c)构成毛囊的组织或其细胞的组合物(第5发明的组合物)移植到表面缺损部位。
该方法使用的第5发明组合物的成分(a)与前述第4发明组合物中的成分(a)相同。另一方面，成分(c)是构成毛囊的真皮毛发根鞘、外毛发根鞘、内毛发根鞘、毛乳头柄等，特优选真皮毛发根鞘或其细胞。作为成分(c)的真皮毛发根鞘，优选使用来自在分离毛乳头的同一个体上的、再优选使用从为分离毛乳头而摘出的毛囊中分离的真皮毛发根鞘。该真皮毛发根鞘可以直接与成分(a)的毛乳头或与毛乳头细胞混合成为组合物。或者分散在各个的细胞中后，使用适当的动物细胞用的培养基进行培养的培养物。此时通过在培养基中添加FGF2，可以高效地使毛发根鞘细胞增殖。
该移植用组合物中的成分(a)与(c)的混合比例可以任意地在约1∶0.1～1∶0.01之间变动。另外该组合物也可以含有其他的皮肤细胞(例如脚掌皮肤的成纤维细胞等)。
第3发明是一种生发方法，其特征在于，将含成分(a)：毛乳头或毛乳头细胞；成分(b)：表皮组织或表皮细胞；与成分(c)：构成毛囊的组织或其细胞的组合物(第6发明的组合物)移植到表皮缺损部位。
该第3发明的组合物中的成分(a)与(b)和第1发明中的组合物相同，成分(c)和第2发明的组合物相同。另外各成分的混合比例也和第1发明与第2发明相同，成分(a)∶成分(b)是约1∶9～约9∶1，成分(a)∶成分(c)是约1∶0.1～约1∶0.01。
此外，第2发明与第3发明的方法中，由于长期的传代培养(以往方法中约10代或更多，而根据本申请发明人的专利文献3的方法约15代或更多)使生发诱导能力消失或减少的毛乳头细胞为成分(a)的场合，作为成分(c)虽然使用毛囊毛球部的毛发根鞘或毛发根鞘细胞，但由于获得优异的生发诱导效果而优选。
若采用第1发明的方法，通过毛乳头或毛乳头细胞与表皮组织或表皮细胞一起进行移植，表皮细胞和毛乳头细胞自立地形成互相带来相互作用的位置与距离。表皮细胞不在皮肤内形成囊包(病理上的表皮硬块)。因此在移植层内部实现皮肤再构成与毛囊形成，促进从移植的毛乳头细胞长出头发。
另外，若采用第2发明，则通过成分(c)与毛乳头或毛乳头细胞一起进行移植，促进生发诱导，显著地促进从毛囊长出的头发的成长。因此，由于在生发部位形成毛发流，故与皮肤移植或毛囊移植相比，生出更自然的再生毛发。
进一步，若采用第3发明，由于成分(b)与(c)和毛乳头或毛乳头细胞一起进行移植，故借助成分(b)的作用促进毛囊形成与毛发的长出，再利用成分(c)的作用促进长出的毛发长长。因此与以往方法相比可以更为有效地使移植毛发再生。
实施例
以下举出实施例对本发明更详细且具体地进行说明，但本发明不限定于以下的例子。
实施例1
1方法
1-1移植用人细胞的制备
由健康的32岁和44岁的男性志愿者的后头部有毛发部位採取皮肤，在前头部无发部位进行自体细胞移植。移植使用的细胞从图1中表示的部位分离，经酶处理单细胞化后使用。以下记载细胞制备的详细内容。
在细胞移植的4周前，从后头部採取含毛球部的3cm2的头皮。使用微型剪刀将手术材料皮肤分成皮肤和皮下组织。使用含2000单位/ml分散酶的10％自体血清DMEM将皮肤组织在37℃处理1小时，将表皮与真皮分离。真皮组织切碎成1mm正方形，播种在3.5cm塑料皿中，按照通常方法进行第一代培养与3次的传代培养。从皮下组织分离出300个毛乳头和真皮毛发根鞘。其中10个正常的毛乳头播种在3.5cm塑料皿中，采用专利文献2的方法进行第一代培养与3次的传代培养。
在细胞移植当天从后头部再次採取含毛球部的3cm2的头皮，将皮肤和皮下组织分离。由皮下组织分离毛囊分离出毛发球部。从毛球部分离毛乳头，使用0.35％胶原酶、0.25％胰蛋白酶EDTA在37℃消化1小时成为单细胞，使用前在4℃的10％自体血清DMEM中保存。皮肤组织使用含2000单元/ml分散酶的10％自体血清DMEM在37℃处理1小时，由真皮分离出含毛囊的表皮。含毛囊的表皮使用0.25％胰蛋白酶EDTA在37℃消化1小时成为单细胞。毛乳头细胞和真皮毛发根鞘细胞使用DiI进行荧光染色。此外，全部过程在净化台内或无菌器具内无菌地进行。
1-2表皮与真皮缺损部位的制作和细胞移植
在前头部无毛发部位的细胞移植位置使用以70％乙醇溶解碳微粒的染料进行刺青。对该部位预先使用数字显微镜(キ一エンス制造)进行高分辨率照相摄影记录体毛的分布。使用1％利多卡因1％肾上腺素进行麻醉后，使用直径2.5mm的环锯，切除深度达到3mm的皮肤，作为移植床(图2)。将新制备的毛乳头细胞或培养毛乳头细胞、表皮细胞、成纤维细胞与真皮毛发根鞘细胞如表1中所示混合，将混合细胞进行2000rpm、5分钟离心。另外，由于必须在尽可能浓的状态下移植细胞，故离心时将透明质酸凝胶多层重叠，离心后使用微量注射器挤出的方法(专利文献3)移植到皮肤缺损部。移植部位如图2中所示那样，用テガダ一ム(Tegaderm)及ヌ一ジエル覆盖。将混合细胞移植到移植床中后，到28天后使用数字显微镜进行经过观察，对移植部位进行活组织检查。活组织检查标本使用20％甲醛水溶液固定一晚后，按照通常方法进行石蜡包埋，制成5μm厚的切片用于组织学的观察。
表1
细胞                细胞数
  移植例1   移植例2
 毛乳头细胞培养毛乳头细胞真皮毛发根鞘细胞表皮细胞   2.8×10407.0×1051.0×105   02.0×10502.0×105
 移植细胞体积(单位：μl)   2.1   2.1
2.结果
移植例1：在对前头部的毛乳头细胞移植(移植列1)中，移植部位第7天完全上皮化。其后每7天进行6周的经过观察。移植例1中移植后第3周，观察到2根细的白色毛干伸长2mm(图3-A)。移植后第6周采集生发部位，进行组织学观察时，在移植例1中观察到5根毛囊。对这些毛囊进行荧光观察时，在毛乳头中观察到预先对毛乳头细胞与真皮毛发根鞘细胞标记的红的荧光色素(图3-B、C、D)。在人皮肤中可见到同样的红的自体荧光，但因只由G激发光激发故与标记色素区别。另外，该生发部位在细胞移植前无毛发，并且到毛囊分布的深度完全切除皮肤。
移植例2：为了确认只是传代培养的人毛乳头细胞对人表皮的毛囊诱导能力与生发诱导能力，将传代培养的毛乳头细胞和从后头部皮肤新制备的表皮细胞混合后移植到前头部。
移植后到7天追寻与移植例2同样的经过，移植后第4周，观察到2根细的白色毛干分别伸长0.3mm和0.5mm(图4-A)。移植后第4周，采集生发部位，进行组织学观察时，在移植例2中观察到4根的毛囊。对这些毛囊进行荧光观察时，在毛乳头中观察到预先对毛乳头(papillae)细胞标记的红的荧光色素(图4-B、C、D)。
实施例2
1方法
1-1移植用细胞的制备
由生后2天龄的Fischer大鼠新生仔的皮肤制备有生发诱导能力的毛乳头细胞和生发分化能力的表皮细胞。采用断头处死Fischer大鼠新生仔，切除前后肢与尾部，只留躯干部分。剥离躯干部分的皮肤，使用聚乙烯基吡咯烷酮碘(Isodine)和70％乙醇灭菌后，使用生理盐水洗涤，直到使用时在4℃保存。在无菌环境下使用实体显微镜，用微型剪刀除去附着在新生儿皮肤上的皮下组织。此后的全部过程均在净化台内或无菌器具内无菌地进行。
皮肤组织切成宽3mm、长10mm左右的长方形状，使用溶解于含10％牛胎儿血清的达尔贝克改性伊格尔培养基的分散酶溶液使之为1000单元/ml在4℃处理一晚。分散酶处理后的皮肤组织使用生理盐水充分洗涤，在无菌环境下将表皮和真皮分离。
表皮和真皮使用外科用手术刀切碎，使用0.25％胰蛋白酶EDTA溶液在37℃处理10分钟形成浮游细胞悬浮液。
另外真皮使用0.35％胶原酶生理盐水溶液，在37℃处理60分钟，形成细胞浮游细胞悬浮液。为了使该真皮细胞浮游细胞悬浮液中也含形成毛囊的表皮成分，进行300rpm，2分钟离心分离，分离出只由真皮性的细胞构成的浮游级分。
各细胞悬浮液放在100μm与40μm目尺寸的无菌筛上除去多数细胞相互粘接的凝集块。
将相同细胞数的表皮细胞和真皮细胞混合，进行1500rpm，5分钟离心分离，制作细胞颗粒，从该颗粒中除去培养基在移植前在冰温下保存。
1-2可任意地调制手术刀刃角度的器具
使用外科用手术刀替换刀刃，制作可按10°～150°的任意的角度将刀尖交叉的柄(图5)。使用这种结构可任意地设定皮肤的切开角度。
1-3表皮缺损部位的制作与细胞移植
在BALB/C nu/nu小鼠(雄性，4周龄)的背部制作宽0.5mm、全长10mm的表皮缺损部分。在100μl尺寸的微量注射器上装设除去顶端部的27G注射芯，将细胞颗粒吸到注射器内，从注射器中挤出104个细胞颗粒移植到表皮缺损部位。为了防止细胞移植部位干燥，使纤维蛋白糊固化实施覆盖。
1-4通过将来自含毛乳头细胞的真皮的细胞与表皮组织混合的移植进行生发的观察
移植前进行显微镜观察，对移植部位确认有无体毛。移植后每1～2周进行显微镜观察，观察移植皮肤的变化。
2.结果
从移植第3天纤维蛋白糊在小鼠通常生活状态下脱落，移植部位治愈。然后，进行经过观察时，确认第3周长出毛发(图6)。这些长出的毛发分布在线上，与表皮缺损部分一致。
实施例3
1方法
1-1大鼠腮须毛乳头与真皮毛发根鞘的分离培养
6周龄的雄Fischer大鼠用二乙醚麻醉杀死，切除腮。切除的腮使用聚乙烯吡咯烷酮碘(明治制药)和70％乙醇灭菌后，使用生理盐水洗涤。使用精密的镊子十分谨慎地从摘出的毛囊中分离毛乳头，播种在35mm培养皿(ペクトンディッキンソン公司制)中。在添加FGF2的含有10％牛胎儿血清达尔贝克改变伊格尔培养基(DMEM10)中进行2～3周第一代培养，5天更换1次培养基。第一代培养后，每7～10天进行传代培养。移植时将传代数6，39代的细胞用于移植。
成体雄EGFP转基因Wistar大鼠(株)ヮィエス研究所)用二乙醚麻醉杀死，切除腮。同样地将切除腮灭菌后，摘出毛囊。由摘出的毛囊分离真皮毛发根鞘，播种在35mm培养皿中。用添加FGF2的DMEM10进行2～3周第一代培养，3～4天更换1次培养基。每一代培养后，每7～10天进行传代培养。移植时将传代数1代的细胞用于移植。
1-2大鼠新生仔表皮细胞的制备
由生后2日龄的Fischer大鼠新生仔的皮肤制备具有生发诱导能力的毛乳头细胞和具有生发分化能力的表皮细胞。用二乙醚麻醉杀死Fischer大鼠新生仔，切除前后肢与尾部，只留躯干部分。剥离躯干部分的皮肤，使用聚乙烯基吡咯烷酮碘和70％乙醇灭菌后，使用生理盐水洗涤，直到使用时在4℃保存。使用实体显微镜，在无菌环境下使用微型剪刀除去附着在新生仔皮肤上的皮下组织。再者，此后的全部过程在净化台内或无菌器具内无菌地进行。
皮肤组织切成宽3mm、长10mm左右的长方形状，使用溶解于DMEM10中的分散酶(三协纯药工业制)溶液使之为1000单位/ml在4℃处理一晚。分散酶处理后的皮肤组织使用生理盐水充分地洗涤，分离表皮和真皮。
表皮使用外科用手术刀切碎，使用0.25％胰蛋白酶EDTA溶液在37℃处理10分钟，成为浮游细胞悬浮液。
各细胞悬浮液通过100μm与40μm目尺寸的过滤器，除去多数细胞相互粘结的凝集块。
1-3由成体大鼠脚掌真皮制备成纤维细胞
10周龄的雄Fischer大鼠使用二乙醚麻醉杀死，切除脚掌皮肤。切除脚掌皮肢使用聚乙烯基吡咯烷酮碘和70％乙醇灭菌后，使用生理盐水洗涤。使用实体显微镜，在无菌环境下使用微型剪刀除去附着在脚掌皮肤上的皮下组织。
除去后进行4等分，使用溶解于DMEM10的分散酶溶液使之成为1000单位/ml在4℃处理一晚。分散酶处理后的皮肤组织使用生理盐水充分洗涤，将表皮与真皮分离。将该真皮切碎成1～2mm方形，外植在60mm培养皿(ペクトンディッキンソン公司制)中进行成纤维细胞的第一代培养。
第一代培养后，来自成体大鼠脚掌真皮的成纤维细胞进行传代培养，将达到传代2～4代的细胞用于移植。
1-4大鼠腮须毛乳头细胞、GFP大鼠腮须真皮毛发根鞘细胞、大鼠新生仔表皮细胞、来自成体大鼠脚掌真皮的成纤维细胞的混合移植
通过向腹腔内投给戊巴比妥钠将4周龄雄裸小鼠(日本チャ一ルズリバ一公司制)麻醉，使用聚乙烯基吡咯烷酮碘灭菌后，按直径7mm的圆形全层切除侧腹部的皮肤。使用尼龙缝合线将移植腔装在该切除部位。按表2的组合将预先用荧光色素(DiI)标记的大鼠腮须毛乳头细胞(传代数6，39)、GFP大鼠腮须真皮毛发根鞘细胞(传代数1)、大鼠新生仔表皮细胞、来自大鼠脚掌真皮的成纤维细胞混合，进行2000rpm、5分钟离心，制作细胞颗粒，从该颗粒中除去培养基后，使用微型吸液管向移植腔内注入。以上的操作无菌地进行。移植后一周间使用外科用胶带(ニチバン)保护移植部位。细胞移植1周后除去移植腔，使用聚乙烯基吡咯烷酮碘消毒移植部位，进一步边注意感染症边进行饲养2周。
1-5利用细胞移植的生发与组织观察
使用实体显微镜(ラィカ公司制)观察手术后经过3周的移植部位，对生发的样子进行照相摄影。摄影后摘出移植部位，使用稀甲醛(Miedform)10N固定一昼夜，进行石蜡包埋。薄切的切片(5μm)进行苏木精曙红(HE)染色与核的荧光染色，进行对毛乳头标记的荧光色素DiI和大鼠腮须真皮毛发根鞘细胞的GFP的确认。另外利用连续切片进行使用作为真皮毛发根鞘标记物的SM-α-Actin抗体的免疫染色。
表2
大鼠细胞                  细胞数
  移植例1   移植例2   移植例3
 新生仔表皮细胞腮须毛乳头细胞(传代数6、39)来自脚掌真皮的成纤维细胞腮须真皮毛发根鞘细胞(传代数1)腮须毛乳头细胞(传代数39)   1073×1067×106   1077×1063×106   1074×1063×1063×106
2.结果与考察
对于大鼠腮须毛乳头细胞的生毛能力，进行使用移植腔的解析。将传代数6(图8)或传代数39(图9)的培养腮须毛乳头细胞与大鼠新生仔表皮细胞和来自大鼠脚掌真皮的成纤维细胞混合进行移植。细胞移植一周后，形成来自移植细胞的皮肤。细胞移植3周后，在移植6传代的培养腮须毛乳头细胞的部位确认长出头发(图8-a)，而39传代的细胞没有观察到生发(图9-a)。但是，从两组织的HE染色图像的观察，发现了毛囊(图8-b，图9-b)，对39传代的细胞确认没有生发能力但有毛囊诱导能力。利用与其连续的切片，在毛囊的毛乳头中确认移植前标记的DiI的荧光，确认是移植的毛乳头细胞产生的生发或毛囊(图8-c，d，图9-c)。利用这些细胞诱导的毛囊形成真皮毛发根鞘，或进行使用作为真皮毛发根鞘标记物的SM-α-Actin抗体的免疫染色。结果只在利用6传代的细胞生发的毛囊中观察到阳性反应，确认形成真皮毛发根鞘(图8-d，e，箭头)，而39传代的细胞形成的毛囊中没观察到阳性反应(图9-d)。以上的结果表明大鼠腮须毛乳头细胞其生发诱导能力随传代减弱消失，真皮毛发根鞘的形式能力也失去。
以下，对通过长期传代培养失去生发诱导能力的大鼠腮须毛乳头细胞加入真皮毛发根鞘细胞，同样地进行使用移植腔的解析。单独地加培养真皮毛发根鞘细胞(1传代)的群中，观察到若干的生发(图10-a)。由HE(图10-b)与荧光染色图像(图10-c)的观察，确认毛裘的毛乳头中有GFP荧光，确认是真皮毛发根鞘细胞形成的生发囊。另外从真皮毛发根鞘中也观察到GFP的荧光的事实，确认由移植的真皮毛发根鞘细胞形成(图10-c)。相比之下，将大鼠腮须毛乳头细胞(39传代)和培养真皮毛发根鞘细胞(1传代)组合移植的群中，明显地观察到显著的生发(图11-a)。由组织的HE(图11-b)与荧光染色像(图11-c)的观察，确认毛乳头有DiI的荧光，真皮毛发根鞘有GFP的荧光。此外，使用SM-α-Actin抗体的免疫染色的结果，确认在加入培养真皮毛发根鞘细胞生发的群中形成真皮毛发根鞘(图11-e)。由以上的结果说明真皮毛发根鞘的形成对生发很重要，通过在失去生发能力的毛乳头细胞中的加入真皮毛发根鞘细胞，恢复生发能力。由该事实暗示通过在有生发诱导能力的毛乳头细胞中加入真皮毛发根鞘细胞，能进一步提高生发诱导。
实施例4
1方法
1-1移植用人细胞的制备
由健康的33岁男性志愿者的后头部有毛发部位採取皮肤，对前头部无毛发部位进行自体细胞移植。以下记载细胞制备的详细内容。
在细胞移植4周前，从后头部採取含毛球部的3cm2的头皮。使用微型剪刀将手术材料皮肤分离成皮肤和皮下组织。使用含2000单位/ml分散酶的10％自体血清DMEM将皮肤组织在37℃处理1小时，将表皮与真皮分离。真皮组织切碎成1mm方形，播种在3.5cm塑料皿中，按照通常方法进行第1代培养与3次的传代培养。由皮下组织分离300个毛乳头和真皮毛发根鞘。其中10个正常的毛乳头播种在3.5cm塑料皿中，采用专利文献2的方法进行第1代培养与3次的传代培养。
细胞移植当天从后头部再次採取含毛球部的3cm2的头皮，将皮肤与皮下组织分离。从皮下组织分离毛囊分离出毛发球部。从毛球部分离毛乳头，使用0.35％胶原酶、0.25％胰蛋白酶EDTA在37℃消化1小时成为单细胞，在使用之前在4℃的10％自体血清DMEM中保存。皮肤组织使用含2000单位/ml分散酶的10％自体血清DMEM在37℃处理1小时，由真皮分离出含毛囊的表皮。含毛囊的表皮使用0.25％胰蛋白酶EDTA在37℃消化1小时成为单细胞。毛乳头细胞和真皮毛发根鞘细胞利用DiI进行荧光染色。再者，全部过程均在净化台内或无菌器具内无菌地进行。
1-2表皮与真皮缺损部位的制作和细胞移植
在前头部无毛发部位的细胞移植位置使用70％乙醇溶解碳微粒子的染料实施刺青。对该部位预先使用数字显微镜(キ一エンス制)进行高分辨率照相摄影，记录体毛的分布。使用1％利多卡因1％肾上腺素麻醉后，使用直径2.5mm的环锯切除深度达到3mm的皮肤，成为移植床(图2)。将新制备的毛乳头细胞或培养毛乳头细胞、表皮细胞、成纤维细胞与真皮毛发根鞘细胞按照表1所示进行混合，混合细胞进行2000rpm、5分钟离心。另外由于必须在尽可能浓的状态下移植细胞，故离心时将透明质酸凝胶多层重叠，离心后，采用微量注射器挤出的方法(专利文献3)移植到皮肤缺损部。移植部位如图2所示，使用テガダ一ム和ヌ一ジェル覆盖。将混合细胞移植到移植床中后，直到28天后使用数字显微镜进行经过观察，对移植部位进行活组织检查。活组织检查标本使用20％福尔马林固定一夜后，按照通常方法进行石蜡包埋，作为5μm厚的切片用于组织学的观察。
表3
人细胞                 细胞数
  移植例1   移植例2
 表皮细胞毛乳头细胞(传代数3)真皮毛发根鞘细胞成纤维细胞   1.67×1051.0×1051.0×1050   1.67×1051.0×10501.0×105
 移植细胞体积(单位：μl)   5.1   5.1
2.结果
为了确认采用传代培养人毛乳头细胞与真皮毛发根鞘细胞混合移植提高生发能力，将传代培养的毛乳头细胞与由后头部皮肤新制备的表皮细胞和真皮毛发根鞘细胞混合移植到前头部。另外，为了使表皮细胞：真皮性细胞的比例为1∶1，与培养成纤维细胞(传代数3)进行混合。传代数3的毛乳头细胞培养6天，此期间的平均细胞倍加时间是40小时。
移植部位在第3天完全上皮化。此后每隔7天进行经过观察。由移植后的经过观察在加入真皮毛发根鞘细胞的群(移植例1)中，2周后观察到长出3根头发(图12-a)。不加入真皮毛发根鞘细胞的群(移植例2)中，在第3周确认初次长出1根头发(图12-b)。
由以上的结果说明毛乳头的移植时，通过加入真皮毛发根鞘细胞可明显地得到高的生发诱导。

Claims (22)

1.一种生发方法，其特征在于，将含有以下成分：
(a)毛乳头或毛乳头细胞；与
(b)表皮组织或表皮细胞的组合物移植到表皮缺损部位。
2.一种生发方法，其特征在于，将含有以下成分：
(a)毛乳头或毛乳头细胞；与
(c)构成毛囊的组织或其细胞的组合物移植到表皮缺损部位。
3.一种生发方法，其特征在于，将含有以下成分：
(a)毛乳头或毛乳头细胞；
(b)表皮组织或表皮细胞；与
(c)构成毛囊的组织或其细胞的组合物移植到表皮缺损部位。
4.权利要求1～3的任一项的生发方法，其中，使表皮全层和真皮的一部分缺损形成表皮缺损部位。
5.权利要求1～3的任一项的生发方法，其中，成分是来自人的成分。
6.权利要求1～3的任一项的生发方法，其中，成分是来自人头皮的成分。
7.权利要求6的生发方法，其中，表皮缺损部位在人头皮上形成。
8.权利要求1～3的任一项的生发方法，其中，成分(a)的毛乳头细胞是培养细胞。
9.权利要求2或3的生发方法，其中，成分(c)是毛发根鞘或真皮毛发根鞘细胞。
10.权利要求2或3的生发方法，其中，成分(a)的毛乳头细胞是10代或更多代的传代培养细胞，成分(c)是毛球部的真皮毛发根鞘或真皮毛发根鞘细胞。
11.权利要求9或10的生发方法，其中，成分(c)的真皮毛发根鞘细胞是培养细胞。
12.权利要求9或10的生发方法，其中，成分(c)的真皮毛发根鞘细胞是在含有FGF2培养基中增殖的培养细胞。
13.一种组合物，含有以下成分：
(a)毛乳头或毛乳头细胞；与
(b)表皮组织或表皮细胞。
14.一种组合物，含有以下成分：
(a)毛乳头或毛乳头细胞；与
(c)构成毛囊的组织或其细胞。
15.一种组合物，含有以下成分：
(a)毛乳头或毛乳头细胞；
(b)表皮组织或表皮细胞；与
(c)构成毛囊的组织或其细胞。
16.权利要求13～15的任一项的组合物，其中，成分是来自人的成分。
17.权利要求13～15的任一项的组合物，其中，成分是来自人头皮的成分。
18.权利要求13～15的任一项的组合物，其中，成分(a)的毛乳头细胞是培养细胞。
19.权利要求14或15的组合物，其中，成分(c)是真皮毛发根鞘或真皮毛发根鞘细胞。
20.权利要求14或15的组合物，其中，成分(a)的毛乳头细胞是10代或更多代的传代培养细胞，成分(c)是毛球部的真皮毛发根鞘或真皮毛发根鞘细胞。
21.权利要求19或20的组合物，其中，成分(c)的真皮毛发根鞘细胞是培养细胞。
22.权利要求19或20的组合物，其中，成分(c)的真皮毛发根鞘细胞是在含有FGF2培养基中增殖的培养细胞。
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