CN113061570B - 一种猪毛乳头细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪毛乳头细胞的培养方法，所述猪毛乳头细胞取自猪耳皮肤组织，采用Ⅰ型胶原酶、胰酶进行消化分离，采用胎牛血清培养基加入鼠尾胶原进行细胞培养。采用本发明提供的方法，表皮与真皮结构易于区分，毛囊结构清晰分明，易于分离，缩短了细胞传代时间13小时左右，并且贴壁更牢。本发明提供的方法可以使猪毛乳头细胞在7代以内保持毛乳头细胞特性且纯度高，因此可批量获得高纯度且传代一致性较好的猪毛乳头细胞。

Description

一种猪毛乳头细胞的培养方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪毛乳头细胞的培养方法。

背景技术

毛囊是皮肤最为重要的附属器官，其发育涉及外胚层和中胚层的相互作用。毛囊的周期性循环再生长(生长期、退化期和静止期的周期性循环)的特性导致新毛发的生长与旧毛发的脱落。当毛囊的周期性再生功能发生异常时，会导致脱发、多毛症和毛干疾病等毛囊疾病。随着社会的发展，人们对影响生活与工作的毛发越来越重视，对毛囊周期性发育的研究变得越来越重要。

目前，对于脱发问题有效的解决方法是进行毛发移植手术，由于毛发移植是对原有毛囊的重新分配和布局，并没有产生新的毛囊，所以不适于较大面积毛发缺失的治疗。如果能够诱导出新的毛囊，尤其能够在体外构建出毛囊的话，那么这一问题将迎刃而解。其中，毛乳头是毛囊的重要组成部分，在毛囊的形成、发育和毛囊周期的调控当中是不可或缺的，其分泌的多种细胞因子、生长因子可通过异种移植等手段，在体外条件下进行诱导毛囊的重建过程。因此，在体外对毛乳头细胞进行培养对研究脱发问题具有重要意义。

在人类毛囊问题的研究上，最理想的材料为人毛乳头细胞。但人毛乳头细胞来源有限，制约其进一步研究。羊和兔的毛囊发育涉及到初级毛囊和次级毛囊的发育，与人类毛囊发育存在区别，并不适用。猪的毛囊发育不涉及到次级毛囊的发育，且相较于小鼠，猪的毛囊形成阶段与人类类似，约处于妊娠周期的前三分之一时期。同时，猪的皮肤在解剖学、组织学和生理学上与人类皮肤接近，是理想的毛囊研究模式动物。相较于背部皮肤，猪耳部皮肤较薄，易于后续组织消化，耳部皮肤比较适合毛乳头细胞的分离与培养。

毛乳头细胞的体外培养是深入研究毛囊生物学、真表皮相互作用机制、毛发形成-重建过程、临床各种与毛发相关的功能代谢失调疾病的关键环节和基础。要获得毛乳头细胞，首先得分离出完整的毛囊结构。毛囊由包在毛根外的上皮组织和结缔组织鞘构成。毛乳头细胞位于毛囊的底部毛球中，被一层很厚的基底膜包绕，体积小，分离困难。由于毛乳头解剖位置特别，生物学特征明显，贴壁困难等，高纯度的毛乳头细胞较难获得，制约了毛囊生物学的研究进展。

毛乳头细胞的传统分离方法为采用显微切割的方式，但此方法劳动强度大、易使操作者疲劳、增大细菌污染几率且获得的细胞数量较少，而且分离出的毛乳头细胞被基底膜包被而难以贴壁且迁出速度慢。现在常用的酶消化法可以批量获得毛乳头细胞，但由于毛囊周期发育模式和不同部位皮肤厚度的差异等，使得在不同物种的不同部位对毛乳头细胞进行提取和培养的方法存在显著差异，而且采用不同培养条件，会影响毛乳头细胞的传代时间。目前已经建立的毛乳头细胞培养方法，主要是针对毛用动物的，而毛用动物的毛乳头与人类差异巨大，并不适用于人类毛囊科学的研究需求，而针对猪的毛乳头细胞培养方法还未真正建立，并不能批量提供高纯度的毛乳头细胞以供研究，因此，亟需提供一种适合猪耳组织进行纯度高的毛乳头细胞的提取和培养方法，为进一步分析和研究人类毛囊疾病奠定基础。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种猪毛乳头细胞的培养方法，旨在批量获得高纯度的猪毛乳头细胞。

本发明提供的一种猪毛乳头细胞的培养方法，所述猪毛乳头细胞取自猪耳皮肤组织，所述猪耳皮肤组织来自屠宰后半小时内猪只耳朵较薄部位的皮肤组织，所剪取的耳样大小要在不卷曲的情况下可置于离心管中，并用生理盐水浸没，8-10小时内完成猪毛乳头细胞分离培养操作；

有关毛乳头细胞的培养方法具体包括如下步骤：所述猪毛乳头细胞取自上述耳样，具体包括如下步骤：

S1、将耳样从生理盐水中取出，将耳样皮肤剪成1.5cm*4cm状长条，在生理盐水中清洗，刮去表面脏物，随后放到碘伏溶液中清洗2min；再放到生理盐水中清洗，然后放到75％酒精溶液中进行清洗2min；再一次将耳样放到生理盐水中清洗，然后放到PBS中进行清洗2min，最后放到生理盐水中清洗干净；

S2、将S1处理好的耳样边缘部分剪掉弃之，先去掉表皮长毛的部分，再去掉表皮层和软骨，将剩余组织剪成米粒大小的组织颗粒；

S3、将S2获得的组织颗粒置于离心管中，加入Ⅰ型胶原酶，使其浸没上述组织颗粒，37℃消化4-5h，每间隔10-15min吹打，并摇晃样品；

S4、消化4-5小时后，加入胎牛血清培养基终止消化，1200r/min离心5min，弃掉上层液体；

S5、在S4步骤获得的离心管中加入0.25％胰酶进行消化10-20min，加入胎牛血清培养基终止消化；

S6、将上述混合物转移到培养皿中，并放到显微镜下观察，挑选完整的毛乳头，放到另一新的培养皿中，新的培养皿要预先加入胎牛血清培养基；

S7、在显微镜下利用5mm针头对上述培养皿中毛乳头周围粘连部分进行清除；

S8、对S7中的毛乳头进行挑选，转移至装有DMEM培养基的新培养皿中，并用DMEM培养基对其清洗2-3次；

S9、将S8处理好的毛乳头均匀的贴附于预先铺有鼠尾胶原的6孔细胞培养板中，所述细胞培养板的培养孔内要预先加入少量胎牛血清培养基，待毛乳头贴壁再加入1mL胎牛血清培养基，所述毛乳头从贴附到贴壁需要约24小时；

S10、将上述毛乳头留置上述细胞培养板中培养一周后可进行正常传代，传代时间为49-50h。

进一步，所述Ⅰ型胶原酶浓度为1.5mg/mL，配制方法为：在37℃条件下，将Ⅰ型胶原酶溶于TESCA缓冲液中，然后分装保存于-20℃。

进一步，所述鼠尾胶原溶液浓度为1mg/mL，配制方法为：取5mL0.1mol/L的醋酸溶液加入到15mL的离心管中，加入5mg的鼠尾胶原，在室温下持续搅拌1-3小时直至溶解，配制成1mg/mL的鼠尾胶原溶液。

进一步，所述胎牛血清培养基的配制方法为：在DMEM基础培养基中加入15％胎牛血清。

1、本发明确定了适用于猪毛乳头消化分离的方式：采用酶消化法对皮肤组织进行消化时，现有技术常使用分散酶Ⅱ、I型胶原酶、胰酶、和D型胶原酶结合的方式等。分散酶Ⅱ是一种非特异性的金属蛋白酶，被用来消化细胞外基质，释放并制备原代单细胞。I型胶原酶是一种肽链内切酶，可降解天然胶原纤维，适用于上皮细胞等的制备。胰酶是一种多种酶混合物，用于组织细胞体外培养、组织细胞分散和细胞传代培养等。D型胶原酶用于分离组织和原代细胞的培养，适用于当细胞表面蛋白质的功能和完整性很重要的情况。本发明采用分散酶Ⅱ、I型胶原酶和胰酶和一定时间梯度进行预试验。使用常用的分散酶Ⅱ对耳组织进行13-15h过夜消化，发现使用该酶后，组织分层效果好，但毛囊剥离的效果差，出现不完整毛囊(图1)。因此，本发明不再使用该酶。在对剪碎后的耳样使用I型胶原酶消化1h后，碎耳样组织未出现明显变化；消化2h后，碎耳样组织变得较为松软，但整体结构无太大变化；消化3h后，耳样组织变松软，整体结构有较大变化；消化4h后，耳样组织质地粘稠，组织出现分层，有较完整毛囊出现；消化5h后，出现过度消化痕迹，毛囊结构模糊，出现较多不完整毛囊；消化6h后，毛囊结构无法区分。综上，选取4-5h为I型胶原酶适当的消化时间。仅使用胶原酶后对毛乳头进行挑取，发现较难清除毛乳头周围粘连部分，因为使用胰酶可以进一步减少粘连部分，有利于后续毛乳头的挑取，故加入胰酶进行消化；消化10min后，出现比较清晰的毛囊结构；消化20min后，表皮与真皮结构易于区分，毛囊结构清晰分明；消化30min后，毛囊结构较为模糊；消化1h后，毛囊结构无法区分；因此最终选取10-20min作为胰酶的消化时间。

2、本发明提供了适用于猪毛乳头细胞培养的特殊培养基：细胞培养的常规培养基含有100X丙酮酸钠、100X非必需氨基酸、10ng/mL bFGF、10％胎牛血清等组分，采用常规培养基进行细胞培养，传代时间较长，用于猪毛乳头细胞培养时，亦是如此。而本发明使用仅含15％胎牛血清(FBS)的培养基替代常规培养基，不仅简化原代细胞培养基的配制，还缩短细胞传代时间13小时左右，但是通过梯度试验发现(表2)，当培养基中FBS浓度大于15％后传代时间有所提升，但提升效果为仅缩短一小时。胎牛血清价格昂贵，同时在实际操作中，此提升效果不明显，可忽略不计。综合考虑，选用仅含15％FBS的培养基，简化培养条件，显著缩短培养时间。

3、本发明提供了提高猪毛乳头细胞贴壁效率的方式：本发明通过使用鼠尾胶原使猪毛乳头细胞贴壁更牢。如图2所示，毛乳头细胞为贴壁细胞，无法长期在悬浮液中生长；贴壁细胞呈圆球形，可能是因为细胞未贴壁生长导致的死亡；细胞密度过大导致底层细胞长满后，多出的细胞因无法附着在培养板底部导致细胞漂浮死亡；细胞经过胰酶消化从培养板脱落等导致的死亡等。经相同培养天数后，未使用鼠尾胶原的细胞中(图2a)，呈正常长梭形形态的细胞密度低，且有较多圆球形细胞出现，原因为细胞未能附着于培养板底部，长期漂浮于悬浮液中，缺乏支持物死亡，进而导致细胞密度较低。使用鼠尾胶原的细胞中(图2b)，呈正常长梭形形态的细胞密度合适并显著高于未使用鼠尾胶的(图2a)，仅有少数细胞呈圆球形，表明加入鼠尾胶原可以提高毛乳头细胞额贴壁效率，在培育基中添加鼠尾胶原更适合毛乳头细胞的生长。

4、本发明提供的方法可以使猪毛乳头细胞在7代以内保持毛乳头细胞特性：从图3可见，本方法培养出的猪毛乳头细胞在第一代至第六代之间未出现明显的形态差异，细胞贴壁生长，凝集性较强，且形态均一，为长梭形成纤维样，并在后续试验中证明其具有诱导毛囊生长的特性。因此利用本发明可获得大量来源于猪耳样的毛乳头细胞，对后续毛囊研究与相关疾病的治疗提供基础。

5、本发明提供的方法可批量获得高纯度且传代一致性较好的猪毛乳头细胞：图4为采用本发明提供的方法获得的方法培养传代至第三代的猪毛乳头细胞，细胞密度接近95％，体积较大，形态分明统一，呈长梭形，且具有凝集性生长现象。对其进行毛乳头细胞特异性标记物a-SMA鉴定，鉴定结果如图5。DAPI是一种与DNA强力结合的荧光染料，因细胞核富含DNA，因此通过染色呈蓝色的DAPI染料确定细胞核的位置，进而确定细胞的大致位置。α-SMA为毛乳头细胞的特异性标记物，作为一抗，其与发绿光的二抗结合，通过绿色荧光的表达间接反映α-SMA在所培养细胞中的表达。由图5可见，95％以上发蓝色荧光，也就是定位到的细胞的地方，都有绿色荧光，也就是α-SMA覆盖，说明培养的绝大部分细胞表达α-SMA这个特异标记基因，即所培养的细胞为毛乳头细胞且纯度高。

附图说明

图1：采用分散酶Ⅱ消化后的毛囊

图2：细胞贴壁比对(图2a未加鼠尾胶原，图2b加入鼠尾胶原)

图3：不同代次毛乳头细胞(4X)

图4：第3代毛乳头细胞(10X)

图5：毛乳头细胞标记物α-SMA(10X)

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。

实施例1：猪毛乳头细胞消化分离体系筛选

1.1关于酶的筛选

本发明采用分散酶Ⅱ、I型胶原酶和胰酶和一定时间梯度进行预验，样品种类及所使用的酶如表1所示：

表1不同物种提取毛乳头细胞的方法及在猪上效果比较

本发明首先使用分散酶Ⅱ对猪耳部皮肤消化，但发现毛囊结构不完整(如图1所示)，无法抽取毛乳头细胞。本发明采用I型胶原酶梯度试验，发现4-5h的消化时间毛囊剥离效果好，但仅使用胶原酶后对猪毛乳头进行挑取，发现较难清除毛乳头周围粘连部分，故本发明加入胰酶进行消化，可以进一步减少粘连部分，有利于后续毛乳头的挑取，本发明发现10-20min的消化时间可以获得清晰的毛囊结构，使得后续毛囊的挑选更为轻松，有利于提高获得单根完整毛囊的效率，因此本发明采用I型胶原酶/胰酶提取猪毛乳头细胞。

1.2关于I型胶原酶消化时间的筛选

将猪耳样品预处理(清洗、消毒)后，制成组织颗粒，置于50mL离心管中，加入Ⅰ型胶原酶，使其浸没上述耳样，在37℃条件下每间隔10-15min进行一次吹打和摇晃，每间隔1h进行一次观察，当消化时间为4-5小时时，每间隔10min在显微镜下观察样品，待看到有毛囊消化出，加入培养基终止消化。

在实验中发现，剪碎后的耳样使用I型胶原酶消化1h后，碎耳样组织未出现明显变化；消化2h后，碎耳样组织变得较为松软，但整体结构无太大变化；消化3h后，耳样组织变松软，整体结构有较大变化；消化4h后，耳样组织质地粘稠，组织出现分层，有较完整毛囊出现；消化5h后，出现过度消化痕迹，毛囊结构模糊，出现较多不完整毛囊；消化6h后，毛囊结构无法区分。综上，选取4-5h为I型胶原酶适当的消化时间。

1.3关于胰酶消化处理时间的筛选

仅使用I型胶原酶处理后对毛乳头进行挑取，发现较难清除毛乳头周围粘连部分，针对毛乳头周围粘连部分难以清除部分，对上述终止消化后的离心管进行1200r/min的5min离心，弃掉上层液体。随后在离心管中加入0.25％胰酶消化，每10min进行观察，发现消化时间为10min-20min时，得到的毛囊结构清晰，随后加入培养基终止消化。将上述混合物转移到培养皿中，并放到显微镜下观察，挑选完整的毛乳头，放到另一新的培养皿中，新的培养皿要预先加入胎牛血清培养基。在显微镜下利用5mm针头对上述培养皿中毛乳头周围粘连部分进行清除，发现粘连部分易于清除。因为使用胰酶可以进一步减少粘连部分，有利于后续毛乳头的挑取，故加入胰酶进行消化。在本实验中，当消化10min后，出现比较清晰的毛囊结构；消化20min后，表皮与真皮结构易于区分，毛囊结构清晰分明；消化30min后，毛囊结构较为模糊；消化1h后，毛囊结构无法区分；因此最终选取10-20min作为胰酶的消化时间。

1.4关于培养基的筛选

将两板长满6孔板的第3代毛乳头细胞消化下来，使其均匀分布在8个分别装有3mL在DMEM基础培养基中分别含10％FBS、含10％FBS+营养因子、含12.5％FBS、含12.5％FBS+营养因子、含15％FBS、含15％FBS+营养因子、含17.5％FBS、含17.5％FBS+营养因子培养基的15mL离心管中。将移液枪调至lmL，吸取含10％FBS培养基的细胞混合液，转移至一个新的6孔板的3个孔中，每个孔1mL。同时吸取含10％FBS+营养因子培养基的细胞混合液，分别转移至新的6孔板余下的3个孔中，每个孔1mL。吸取含12.5％FBS培养基的细胞混合液，转移至另一个新的6孔板的3个孔中，每个孔1mL。同时吸取含12.5％FBS+营养因子培养基的细胞混合液，分别转移至另一个新的6孔板余下的3个孔中，每个孔1mL。后续以此类推。待15mL离心管中细胞混合液转移至6孔板后，将6孔板呈“8”字形轻微摇晃，使毛乳头细胞均匀分布在液体中。随后将6孔板置于37℃，5％CO₂恒温培养箱内培养。统计在使用不同培养基种类进行培养后，毛乳头细胞密度达到90％左右时所需要的时间(即传代时间)。每种培养基类型有三个重复(即6孔板的3个孔，每个孔就是一个重复)，选取传代时间的最小值与最大值作为该培养基类型的传代时间，并对异常传代时间值进行剔除。结果如表2所示，综合考量试剂的价格与节约的时间，选取15％FBS为本试验所培养的毛乳头细胞的培养基类型。

表2不同培养基类型对毛乳头细胞传代时间的影响

1.5关于鼠尾胶原的筛选

将上述处理好的毛乳头均匀的铺于预先未铺有和预先铺有鼠尾胶原的6孔细胞培养板中，所述细胞培养板的培养孔内要预先加入少量胎牛血清培养基，待毛乳头贴壁再加入1mL胎牛血清培养基，并于一周后在倒置显微镜(4X)下观察。结果如图2所示，图2a为未加入鼠尾胶原的，可见呈正常长梭形形态的细胞密度低，且有较多圆球形细胞出现，原因为细胞未能附着于培养板底部，长期漂浮于悬浮液中，缺乏支持物死亡，进而导致细胞密度较低。图2b为加入鼠尾胶原的，可见呈正常长梭形形态的细胞密度合适并显著高于未使用鼠尾胶的(图2a)，仅有少数细胞呈圆球形，表明加入鼠尾胶原可以提高毛乳头细胞额贴壁效率，在培育基中添加鼠尾胶原更适合毛乳头细胞的生长。

实施例2采用本发明方法分离培养的猪毛乳头细胞传代培养实验

从屠宰后半小时内猪只耳朵较薄部位剪取皮肤组织，在不卷曲的情况下置于50mL离心管中，并用生理盐水浸没，8小时内完成分离培养；

有关毛乳头细胞的培养方法具体包括如下步骤：所述猪毛乳头细胞取自上述耳样，具体包括如下步骤：

S1、将耳样从生理盐水中取出，将耳样皮肤剪成1.5cm*4cm状长条，在生理盐水中清洗，刮去表面脏物，随后放到碘伏溶液中清洗2min；再放到生理盐水中清洗，然后放到75％酒精溶液中进行清洗2min；再一次将耳样放到生理盐水中清洗，然后放到PBS(购自Gibco20012027)中进行清洗2min，最后放到生理盐水中清洗干净备用；

S2、将S1处理好的耳样边缘部分剪掉弃之，先去掉表皮长毛的部分，再去掉表皮层和软骨，将剩余组织剪成米粒大小的组织颗粒；

S3、将S2获得的组织颗粒置于50mL离心管中，加入Ⅰ型胶原酶(购自SolarbioC8140)，使其浸没上述组织颗粒，37℃消化4-5h，每间隔10-15min吹打，并摇晃样品；

S4、每隔10min在显微镜下观察样品，待看到有毛囊消化出，加入胎牛血清培养基终止消化，1200r/min离心5min，弃掉上层液体；

S5、在S4步骤获得的离心管中加入0.25％胰酶(购自Gibco25200056)进行消化10-20min，加入胎牛血清培养基终止消化；

S6、将上述混合物转移到培养皿中，并放到显微镜下观察，挑选完整的毛乳头，放到另一新的培养皿中，新的培养皿要预先加入胎牛血清培养基；

S7、在显微镜下利用5mm针头对上述培养皿中毛乳头周围粘连部分进行清除；

S8、对S7中的毛乳头进行挑选，转移至装有DMEM培养基(购自Gibco 11965092)的新培养皿中，并用DMEM培养基对其清洗2-3次；

S9、将S8处理好的毛乳头均匀的贴附于预先铺有鼠尾胶原的6孔细胞培养板中，所述细胞培养板的培养孔内要预先加入少量胎牛血清培养基，待毛乳头贴壁再加入1mL胎牛血清培养基，所述毛乳头从贴附到贴壁需要约24小时；

S10、将上述毛乳头留置上述细胞培养板中培养一周后可进行正常传代，传代时间为49-50h。

所述Ⅰ型胶原酶浓度为1.5mg/mL，配制方法为：在37℃条件下，将Ⅰ型胶原酶溶于TESCA缓冲液中，然后分装保存于-20℃。

所述鼠尾胶原溶液浓度为1mg/mL，配制方法为：取5mL 0.1mol/L的醋酸溶液加入到15mL的离心管中，加入5mg的鼠尾胶原(购自Sigma C7661)，在室温下持续搅拌1-3小时直至溶解，配制成1mg/mL的鼠尾胶原溶液。

所述胎牛血清培养基的配制方法为：在DMEM基础培养基中加入15％胎牛血清。

当传代的培养板中细胞密度达到90％左右，将培养板置于倒置显微镜上，在4X放大倍数下通过调节粗准焦螺旋获得细胞清晰图像，图3为对F1～F6代毛乳头细胞的图像。

每次拍完照后，将培养板转移至无菌操作台进行传代操作。首先将培养板中的培养基全部吸走，然后用PBS清洗培养板内壁两次，每次1mL。吸干瓶内残留的PBS后，加入0.5mL的0.25％胰酶，于37℃消化50s，轻轻拍打培养板，待70％左右的细胞被消化下来后，用移液枪反复吹打培养板瓶底，随后及时加入0.5mL胎牛血清培养基终止消化。缓慢吹打培养板瓶底使细胞完全脱落，将瓶中液体全部转移至15mL离心管，1000r/min离心5min，弃掉上清液。随后加入2mL的PBS，用移液枪缓慢吹打细胞沉淀，待沉淀消失后，1000r/min离心5min，弃掉上清液。随后加入6mL胎牛血清培养基，用移液枪缓慢吹打细胞沉淀，待沉淀消失后，转入新的培养板，6孔板的每孔加入1mL细胞混合液。置于37℃，5％CO₂恒温培养箱内培养。经过一次上述操作，细胞代数加一代。每次传代前拍照，组合形成图3。可见经过六代传代，本方法培养的毛乳头细胞未出现明显的形态差异，细胞贴壁生长，凝集性较强，且形态均一，为长梭形成纤维样，并在后续试验中证明其具有诱导毛囊生长的特性。

图4为第三代毛乳头细胞形态观察：待第三代细胞在培养基中培养49-50小时后，将培养板转移至倒置显微镜下先用4X观察，在4X镜头下观察到细胞形态清晰时，将物镜调节至10X，并调节细准焦螺旋，直至出现细胞，并进行拍照。可见第三代毛乳头细胞大部分为长梭形成纤维样细胞。

图5为免疫荧光验证标记蛋白在分离细胞中的表达：待第三代细胞密度达到90％左右，吸取培养板中培养基，用预冷的PBS充分漂洗3次，5min/次。吸取培养板中PBS，加入4％多聚甲醛于4℃环境下固定30min，随后用预冷的PBS充分漂洗3次，5min/次。吸取培养板中PBS，加入0.2％Triton(溶剂为PBS)通透处理15min，用预冷的PBS充分漂洗3次，5min/次。吸取培养板中PBS，加入5％山羊血清(溶剂为PBS)于37℃环境下封闭30min。吸取培养板中山羊血清，加入α-SMA抗体(1/1000，Abcam ab7817)，4℃孵育过夜，随后用预冷的PBS充分漂洗3次，5min/次。吸取培养板中PBS，加入FITC标记的二抗(1/100，中杉金桥ZF-0312)，37℃孵育1h，随后用预冷的PBS充分漂洗3次，5min/次。吸取培养板中PBS，加入DAPI(博士德AR1176)，避光条件下染色5-10min。随后用预冷的PBS充分漂洗3次，5min/次。吸取培养板中PBS，加入少量抗荧光猝灭剂封片，并于荧光显微镜(10X)下观察。

如图5所示，DAPI是一种与DNA强力结合的荧光染料，因细胞核富含DNA，因此通过染色呈蓝色的DAPI染料确定细胞核的位置，进而确定细胞的大致位置(如图5b所示)。α-SMA为毛乳头细胞的特异性标记物，作为一抗，其与发绿光的二抗(山羊抗小鼠FITC)结合，通过绿色荧光的表达间接反映α-SMA在所培养细胞中的表达(如图5c所示)。由图5a可见，95％以上发蓝色荧光(也就是定位到的细胞)的地方，都有绿色荧光(也就是α-SMA)覆盖，说明培养的绝大部分细胞表达α-SMA这个特异标记基因，即所培养的细胞为毛乳头细胞且纯度高。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.一种猪毛乳头细胞的培养方法，其特征在于，所述猪毛乳头细胞取自猪耳皮肤组织，所述猪耳皮肤组织来自屠宰后半小时内猪只耳朵较薄部位的皮肤组织，在不卷曲的情况下置于离心管中，并用生理盐水浸没，8-10小时内完成猪毛乳头细胞分离培养操作；

有关毛乳头细胞的培养方法具体包括如下步骤：所述猪毛乳头细胞取自上述耳样，具体包括如下步骤：

S1、将耳样从生理盐水中取出，将耳样皮肤剪成1.5cm*4cm状长条，在生理盐水中清洗，刮去表面脏物，随后放到碘伏溶液中清洗2min；

再放到生理盐水中清洗，然后放到75%酒精溶液中进行清洗2min；

再一次将耳样放到生理盐水中清洗，然后放到PBS中进行清洗2min，最后放到生理盐水中清洗干净；

S2、将S1处理好的耳样边缘部分剪掉弃之，先去掉表皮长毛的部分，再去掉表皮层和软骨，将剩余组织剪成米粒大小的组织颗粒；

S3、将S2获得的组织颗粒置于离心管中，加入Ⅰ型胶原酶，使其浸没上述组织颗粒，37℃消化4-5h，每间隔10-15min吹打，并摇晃样品；

所述Ⅰ型胶原酶浓度为1.5mg/ml，配制方法为：在37°C条件下，将Ⅰ型胶原酶溶于TESCA缓冲液中，然后分装保存于-20°C；

S4、消化4-5小时后，加入胎牛血清培养基终止消化，1200r/min离心5min，弃掉上层液体；

S5、在S4步骤获得的离心管中加入0.25%胰酶进行消化10-20min，加入胎牛血清培养基终止消化；

S6、将上述混合物转移到培养皿中，并放到显微镜下观察，挑选完整的毛乳头，放到另一新的培养皿中，新的培养皿要预先加入胎牛血清培养基；

S7、在显微镜下利用5mm针头对上述培养皿中毛乳头周围粘连部分进行清除；

S8、对S7中的毛乳头进行挑选，转移至装有DMEM培养基的新培养皿中，并用DMEM培养基对其清洗2-3次；

S9、将S8处理好的毛乳头均匀的贴附于预先铺有鼠尾胶原的6孔细胞培养板中，所述细胞培养板的培养孔内要预先加入少量胎牛血清培养基，待毛乳头贴壁再加入1ml胎牛血清培养基，所述毛乳头从贴附到贴壁需要24小时；

S10、将上述毛乳头留置上述细胞培养板中培养一周后可进行正常传代，传代时间为49-50h。

2.根据权利要求1所述猪毛乳头细胞的培养方法，其特征在于，所述鼠尾胶原溶液浓度为1mg/mL，配制方法为：取5ml0.1mol/L的醋酸溶液加入到15ml的离心管中，加入5mg的鼠尾胶原，在室温下持续搅拌1-3小时直至溶解，配制成1mg/mL的鼠尾胶原溶液。

3.根据权利要求1所述猪毛乳头细胞的培养方法，其特征在于，所述胎牛血清培养基的配制方法为：在DMEM基础培养基中加入15%胎牛血清。

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