CN117946961A - 一种分离人毛囊来源的毛乳头细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离人毛囊来源的毛乳头细胞的方法。本发明提供了一种体外分离毛囊来源的毛乳头细胞的方法，包括如下步骤：1)从毛囊组织的收取和温控运输；2)毛囊组织样本的无菌处理和检测；3)离体的毛囊组织取出毛球组织；4)再将所述单独的毛球组织用消化酶酶解，得到毛囊来源的毛乳头细胞并进行鉴定。本发明还首次运用的恒温运输箱和保存液，解决了只能现取组织分离或离体12h内进行分离的问题，有效解决了组织离体时限的问题；并且无菌分离和检测本身也是实验重要环境，快速地保证实验的无菌操作问题，监控并解决了原代分离的易发生污染的情况，这一研究对于毛囊来源的毛乳头细胞的特性培养和生物医药领域的研究有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域技术，涉及一种分离人毛囊来源的毛乳头细胞的方法。
背景技术
皮肤主要由两层组成，表皮和真皮在胚胎发育过程中由外胚层和中胚层分化而来。外胚层皮肤的顶部形成表皮在形态发生过程中，深入真皮并发育成皮肤附属物以产生可见带有皮脂的皮肤毛发纤维和汗腺。角质形成细胞是表皮和皮肤附属物的主要组成部分。毛囊(Hair Follicle)是毛囊是包围在毛发根部的囊状组织，内层是上皮组织性毛囊，外层是结缔组织性毛囊，内层与表皮相连，外层则与真皮相连；毛球组织(Hair Bulb)位于毛囊基部(下端底部)的膨大部分，中间有毛乳头；毛乳头(Dermal Papilla)是一个可诱导毛囊生长、调控毛囊发育和周期性生长的结构，由细胞外基质及成纤维细胞构成，几乎整个被毛囊下部的上皮基质包绕。毛乳头在毛囊的形态学发生和毛囊周期性生长调控中起主导作用。基于毛囊来源的毛乳头细胞在毛发再生中的重要作用,毛囊来源的毛乳头细胞的培养引起了广大学者的兴趣。
人毛囊来源的毛乳头细胞，在毛囊的生长发育、周期调控及维持毛发生长中起着主导作用。毛囊来源的毛乳头细胞可分泌IGF-l、FGF-l、SCF、HGF、KGF等多种与毛囊形成有关的因子；毛囊来源的毛乳头细胞表面还存在多种特异性标记，这些标记与毛囊的生长发育有密切关系。因此建立人毛囊来源的毛乳头细胞分离条件，来获取更多的毛囊来源的毛乳头细胞的实验材料，无疑是开展毛囊生物学研究的重要条件。但毛囊来源的毛乳头细胞在传统分离条件下，获得时间较长，且不易分离，失败的概率很大，体外培养14-30d以上的毛囊来源的毛乳头细胞才会慢慢长出，由于时间过长，限制了毛囊来源的毛乳头细胞的应用研究。同时，因分离过程一般为整根毛囊组织，造成后期分离获取毛乳头细胞的纯度也并不高，也是分离毛囊来源的毛乳头细胞的困难之一。此外，对于组织离体12h内进行的实验操作，是原代细胞分离的基本原则，对于细胞分离也有很大的限制条件；而原代细胞的处理不当，造成细胞污染，也是造成原代分离的重要限制因素。
不同毛乳头来源细胞分离方法不同，现有技术中毛乳头细胞的样本来源都是动物，而动物细胞的活性和人体中细胞的活性不同，利用分离动物毛乳头细胞的方法分离人源毛乳头细胞，细胞生长缓慢、不易贴壁，无法大规模量化生产，并且所用到部分试剂并不适用于临床科研。
因此，快速获得人毛囊来源的毛乳头细胞成为研究的方向。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种体外分离人毛囊来源的毛乳头细胞的方法。
本发明提供的方法，为如下方法A)或方法B)：
所述方法A)包括如下步骤：
A-1)从离体人毛发样本中分离出毛囊组织；
A-2)培养所述毛囊组织，得到人毛囊来源的毛乳头细胞；
所述方法B)包括如下步骤：
B-1)从离体人毛发样本中分离出毛囊组织；
B-2)再从所述毛囊组织中分别分离出毛球组织或毛乳头组织，培养所述毛球组织或所述毛乳头组织，得到人毛囊来源的毛乳头细胞。
上文中，所述毛囊组织为1单位毛囊组织或者单个毛囊组织；
所述毛球组织或所述毛乳头组织来自1单位离体毛囊组织或者来自单个离体毛囊组织。
上文分离均在体视镜下进行；
若所述毛囊组织为1单位毛囊组织，则所述A-1)中分离为离体人毛发样本中取出1单位毛囊组织，再去除毛干、结缔粘连组织和脂肪，得到去除毛干后毛囊组织；
若所述毛囊组织为单个毛囊组织，则所述A-1)中的分离为离体人毛发样本中取出1单位毛囊组织，再去除毛干、结缔粘连组织和脂肪，再从1单位去除毛干后毛囊组织中分离单个毛囊组织；
上文中来自1单位离体毛囊组织的毛球组织按照如下方法制备：将离体1单位毛囊组织剪去毛干部位，且去除结缔粘连组织和脂肪，撕出单独的毛球组织(仅含有毛球组织)，记作来自1单位离体毛囊组织的毛球组织；
上文中来自单个离体毛囊组织的毛球组织按照如下方法制备：将离体单个毛囊组织剪去毛干部位，且去除结缔粘连组织和脂肪，撕出单独的毛球组织(仅含有毛球组织)，记作来自单个离体毛囊组织的毛球组织；
上文中来自1单位离体毛囊组织的毛乳头组织按照如下方法制备：将离体1单位毛囊组织剪去毛干部位，且去除结缔粘连组织和脂肪，撕出单独的毛球组织(仅含有毛球组织)，再划开毛球组织分离出毛乳头，记作来自1单位离体毛囊组织的毛乳头组织。
上文中来自单个离体毛囊组织的毛乳头组织按照如下方法制备：将离体单个毛囊组织剪去毛干部位，且去除结缔粘连组织和脂肪，撕出单独的毛球组织(仅含有毛球组织)，再分离出毛乳头，记作来自单个离体毛囊组织的毛乳头组织。
上文，在所述A-1)和A-2)步骤之间，还包括将所述毛囊组织用消化酶酶解的步骤；
所述B-2)中，在所述分离出毛球组织和培养毛球组织的步骤之间，还包括将分离出的所述毛球组织用消化酶酶解的步骤。
上述各个方法的步骤1)前，还包括如下步骤：将采集的离体人毛发样本依次进行低温运输和无菌处理的步骤；
所述低温运输为将所述采集的离体人毛发样本放置于储存液中，再通过恒温运输箱中运输；其中，所述储存液为乳酸格林氏液(4℃)；所述恒温运输箱的温度为0-15℃。
上述运输的时间小于等于48小时。
所述无菌处理为将低温运输后的离体人毛发样本用含有递减浓度双抗的DPBS/PBS依次清洗，收集清洗前和清洗后的溶液，分别记作液体A和液体B，再将所述液体A和液体B进行无菌检测。
在本发明的实施例中，所述无菌处理具体按照如下a-c的方式处理：
a)、将低温运输后的离体人毛发样本从储存液取出后采用75％乙醇水溶液冲洗3次，将取出离体毛发样本的储存液记作液体A；
b)将经过a)处理后离体人毛发样本用含有2％双抗的DPBS/PBS清洗3次；
所述含有2％双抗的DPBS/PBS为将双抗青链霉素与DPBS/PBS混合，得到的溶液，且双抗青链霉素的体积百分含量为2％；
c)将经过b)处理后离体人毛发样本用含有1％双抗的DPBS/PBS清洗3次；
所述含有1％双抗的DPBS/PBS为将双抗青链霉素与DPBS/PBS混合，得到的溶液，且双抗青链霉素的体积百分含量为1％；
d)将经过c)处理后离体人毛发样本放入超净台处理：用无双抗的DPBS/PBS清洗一次，并将无双抗的DPBS/PBS清洗后的残存液留下并标注处理后液体B，将此次处理后的离体毛发样本记作待分离的离体毛发样本；
再将所述收集的液体A和液体B进行无菌检测。
上文无菌检测为将所述液体A和所述液体B进行平皿实验，若液体B无菌，则进行下一步分离实验，若液体B有菌，则重复所述无菌处理，直至处理后液体B无菌。
上述方法中，所述消化酶为消化酶-胶原酶I、胶原酶II、Dispase酶和/或Tryple E酶。
上述方法中，所述消化酶酶解的条件为：每1单位毛囊组织的毛球组织加入30-100uL的消化酶溶液，消化酶溶液的溶剂为水。
所述消化酶的工作浓度范围均为1-10mg/ml。
上述方法中，所述酶解的条件为37℃消化30-120min。
上文中，在酶解步骤后和培养步骤前，还包括如下步骤：向酶解后的产物中加入中和液反应，得到中和反应产物。
上述方法在延长分离毛乳头细胞所用毛囊组织的离体时限中的应用也是本发明保护的范围；
上述延长分离毛乳头细胞所用毛囊组织的离体时限为延长了新鲜毛囊组织在显微分离前的保存时间。
或上述方法在提高原代分离毛囊来源的毛乳头细胞中的应用也是本发明保护的范围。
本发明开展毛囊来源的毛乳头细胞的原代分离。本发明的实验证明，本发明将显微操作分离毛球组织，通过定点分割部位进行显微操作，同时结合酶解法进行结合分离，克服了现有技术中体外毛囊组织分离得到毛囊来源的毛乳头细胞耗时长，分离困难的问题；同时，本次实验也是首次进行单独毛囊/毛球/毛乳头组织的操作和培养，有效提高了细胞的纯净度，降低了分离得到纯净毛乳头细胞的操作难度；同时首次尝试用恒温运输箱和储存液的方式，对毛囊组织的运输和储存，运输24h依然能正常分离出毛乳头细胞，延长了保存时间，解决了只能现取组织分离或离体12h内进行分离的问题，有效解决了组织离体时限的问题。此外，无菌分离和检测本身也是实验重要环境，通过充分洗涤和处理及检测手段，最小程度损伤组织的同时，也快速地保证实验的无菌操作问题，监控并解决了原代分离的易发生污染的情况。这一研究对于毛囊来源的毛乳头细胞的特性培养和生物医药领域的研究有重要意义。
附图说明
图1为温控实时监测结果。
图2为无菌处理前后无菌检测实验结果。
图3为毛囊组织显微操作示意图。
图4为显微操作2组+消化酶3酶解组的细胞爬出情况。
图5为甲苯胺蓝染色鉴定结果。
图6为显微操作的毛囊部位实例图。
图7为单位毛囊及单根毛囊实例图。
图8为单位毛囊及单根毛囊爬出细胞实例图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中双抗DDPBS/PBS按照如下方法制备：将青链霉素(Gibico，15140122)加入DPBS/PBS中，加入比例体积是青链霉素：DPBS/PBS＝1mL：99mL。
上述DPBS/PBS为1X的DPBS/PBS缓冲液(Gibico，8121293)，也同样是实施例中的DPBS/PBS。
下述实施例中显微镜为体视显微镜(Leica-SE9)。
下述实施例中的中和液为将FBS溶于DMEM/F12(Gibico，2186796)中，得到溶液，FBS在该溶液中的体积百分含量为10％。
下述实施例中的离体人源毛囊组织均来自于人(受试者知情)，且为头皮后枕部毛囊组织。
下述实施例中的消化酶溶液，均为消化酶水溶液，为消化酶溶于水后配置得到，浓度均为1-10mg/mL。
下述实施例中的中和液由FBS(Gbico，10099141C)、青链霉素(Gibico，15140122)和DMEM-F12的基础培养基(Gibico，10565018)组成；其中，FBS在中和液中的体积百分含量为10％，青链霉素在中和液体中的体积百分含量为1％。
每100ml中和液按照如下方法制备：将10ml FBS、1ml青链霉素加入89ml DMEM-F12的基础培养基中，再用0.22um的滤器进行过滤得到中和液。
下述实施例中储存液为乳酸格林氏液，4℃储存，购自(山东捷世康，T0447)。
下述实施例中恒温运输箱(杭州多协，DX0B821)，可温度维持和监控并用的系统。
实施例1、分离毛囊来源的毛乳头细胞
一、采样及运输
1)将新鲜采集的离体人毛发样本依次用乳酸格林氏液和F12培养基(含有1％体积百分含量的双抗青链霉素)冲洗，去除头部后枕的皮肤组织样本；
2)将上述1)处理后的离体人毛发样本浸泡在4℃的储存液后，再用恒温运输箱(温度控制在0-15℃)运输。
针对运输中的恒温运输箱进行温控实时监测结果如图1所示，可以看出，采用本发明的方法可以使离体人毛发样本的运输时长达24h，温控仍然能够维持在0-15℃。
二、无菌处理
本次操作主要为了无菌的处理和操作，通过不同比例的含有双抗的DPBS/PBS清洗，以及递减浓度双抗DPBS/PBS的方式清洗，来最小程度损伤组织的同时，也更快速的达到无菌处理和操作的目的。
将上述一运输的离体人毛发样本(离体时间不超过48小时)，进行如下无菌处理和监测：
1)将毛囊组织样本从储存液取出后采用75％乙醇水溶液冲洗3次，将取出离体人毛发样本的储存液记作液体A(处理前)；
2)将经过1)处理后离体人毛发样本在含有2％双抗的DPBS/PBS清洗3次；
含有2％双抗的DPBS/PBS为将双抗青链霉素与DPBS/PBS混合，得到的溶液，且双抗青链霉素的体积百分含量为2％；
3)将经过2)处理后离体人毛发样本在含有1％双抗的DPBS/PBS清洗3次；
含有1％双抗的DPBS/PBS为将双抗青链霉素与DPBS/PBS混合，得到的溶液，且双抗青链霉素的体积百分含量为1％；
4)将经过2)处理后离体人毛发样本放入超净台处理：用无双抗的DPBS/PBS清洗一次，并将无双抗的DPBS/PBS清洗后的残存液留下并标注液体B(处理后)，将此次处理后的毛发组织样本记作待分离人毛发样本；
将上述收集的液体A(处理前)和液体B(处理前)分别无菌检测，具体为进行平皿实验(培养基为SA平皿固体培养基，购自环凯微生物，CP0201C)，放置37℃培养箱培养24h后观察平皿情况。
结果如图2所示，左图为处理前的A液，右图为处理后的B液，处理后1和处理后2分别为2个重复；对照为空白SA平皿固体培养基；处理前后的组织样本液体中的含菌量出现明显差别，处理后离体人毛发样本无菌，可以进行下一步操作。
三、分离
将上述二获得的待分离人毛发样本在显微镜下分离得到人源毛囊组织，再将毛囊组织按照如下几组进行分离：
显微操作1组：
将一单位的离体的人源毛囊组织用双抗DDPBS/PBS(Gibico，8121293)洗三遍后移至体视镜(Leica-SE9)下，在显微镜(40X放大倍数)下，剪去毛干部位，且去除结缔粘连组织和脂肪，再在普通DPBS/PBS(Gibico，8121293)溶液中清洗三次，得到去除毛干后毛囊组织；再将去除毛干后的一单位的所有毛囊组织放置于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作2组：
将一单位的离体的人源毛囊组织，用双抗DDPBS/PBS洗三遍后移至体视镜(Leica-SE9)下，在显微镜(40X放大倍数)下，剪去毛干部位，且去除结缔粘连组织和脂肪，撕出单独的毛球组织(仅含有毛球组织)，得到毛球组织(图3，图6，图7)，记作来自一单位毛囊组织的毛球组织，再将来自一单位人源毛囊组织的所有毛球组织在普通DPBS/PBS(Gibico，8121293)溶液中清洗三次；再将毛球组织放置于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作3组：
与显微操作1组基本相同，不同的仅是将一单位的去除毛干后毛囊组织分离单个毛囊组织，将单个毛囊组织放置于培养基于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作4组：
与显微操作3组基本相同，得到单个毛囊组织后，在显微镜(40X放大倍数)下，剪去毛干部位，且去除结缔粘连组织和脂肪，撕出单独的毛球组织(仅含有毛球组织)，记作来自单个毛囊组织的毛球组织，放置于培养基于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作5组：
与显微操作2组基本相同，不同的仅是将一单位的去除毛干后所有毛囊组织用显微刀片划开毛球组织分离出毛乳头组织(结果如图3，图6，图7)，记作来自一单位的毛囊组织的毛乳头组织，放置于培养基于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作6组：
与显微操作3组基本相同，不同的将单个毛囊组织再用显微刀片划开毛球组织分离出毛乳头组织，记作来自单个毛囊组织的毛乳头组织，放置于培养基于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
消化酶1酶解组：
将离体的一单位毛囊组织转移到96孔板，用50uL的消化酶-胶原酶I溶液(Gibico，2340572，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min后，再加入100uL(2倍体积的消化酶1)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
消化酶2酶解组：
将离体的一单位毛囊组织转移到96孔板，用50uL的胶原酶II溶液(Gibico，2240228，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min，再加入100uL(2倍体积的消化酶2)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
消化酶3酶解组：
将离体的一单位毛囊组织转移到96孔板，用50uL的Dispase酶溶液(Hyclone，J200016，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min，再加入100uL(2倍体积的消化酶3)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
消化酶4酶解组：
将离体的一单位毛囊组织转移到96孔板，用50uL的Tryple E溶液(Gibico，12604021，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min，再加入100uL(2倍体积的消化酶4)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作1组+消化酶1酶解法：
将一单位的离体的人源毛囊组织用双抗DDPBS/PBS(Gibico，8121293)洗三遍后移至体视镜(Leica-SE9)下，在显微镜(40X放大倍数)下，剪去毛干部位，且去除结缔粘连组织和脂肪和脂肪，再在普通DPBS/PBS(Gibico，8121293)溶液中清洗三次，得到去除毛干后毛囊组织；
将上述分离得到的去除毛干后的一单位的所有毛囊组织转移到96孔板，用50uL的消化酶-胶原酶I溶液(Gibico，2340572，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min后，再加入100uL(2倍体积的消化酶1)中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作1组+消化酶2酶解法：
将一单位的离体的人源毛囊组织用双抗DDPBS/PBS(Gibico，8121293)洗三遍后移至体视镜(Leica-SE9)下，在显微镜(40X放大倍数)下，剪去毛干部位，且去除结缔粘连组织和脂肪和脂肪，再在普通DPBS/PBS(Gibico，8121293)溶液中清洗三次，得到去除毛干后毛囊组织；
将上述分离得到的去除毛干后的一单位的所有毛囊组织转移到96孔板，用50uL的胶原酶II溶液(Gibico，2240228，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min，再加入100uL(2倍体积的消化酶2)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作1组+消化酶3酶解法：
将一单位的离体的人源毛囊组织用双抗DDPBS/PBS(Gibico，8121293)洗三遍后移至体视镜(Leica-SE9)下，在显微镜(40X放大倍数)下，剪去毛干部位，且去除结缔粘连组织和脂肪和脂肪，再在普通DPBS/PBS(Gibico，8121293)溶液中清洗三次，得到去除毛干后毛囊组织；
将上述分离得到的去除毛干后的一单位的所有毛囊组织转移到96孔板，用50uL的Dispase酶溶液(Hyclone，J200016，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min，再加入100uL(2倍体积的消化酶3)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作1组+消化酶4酶解法：
将一单位的离体的人源毛囊组织用双抗DDPBS/PBS(Gibico，8121293)洗三遍后移至体视镜(Leica-SE9)下，在显微镜(40X放大倍数)下，剪去毛干部位，且去除结缔粘连组织和脂肪和脂肪，再在普通DPBS/PBS(Gibico，8121293)溶液中清洗三次，得到去除毛干后毛囊组织；
将上述分离得到的去除毛干后的一单位的所有毛囊组织转移到96孔板，用50uL的Tryple E酶溶液(Gibico，12604021，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min，再加入100uL(2倍体积的消化酶3)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作2组+消化酶1酶解法：
将一单位的离体的人源毛囊组织用双抗DDPBS/PBS洗三遍后移至体视镜(Leica-SE9)下，在显微镜(40X放大倍数)下，剪去毛干部位，且去除结缔粘连组织和脂肪，撕出单独的毛球组织，得到毛球组织，再将来自一单位人源毛囊组织的所有毛球组织在普通DPBS/PBS(Gibico，8121293)溶液中清洗三次；
将上述清洗后的所有毛球组织转移到96孔板，用50uL的消化酶-胶原酶I(Gibico，2340572，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min后，再加入100uL(2倍体积的消化酶1)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作2组+消化酶2酶解法：
将一单位的离体的人源毛囊组织用双抗DDPBS/PBS洗三遍后移至体视镜(Leica-SE9)下，在显微镜(40X放大倍数)下，剪去毛干部位，且去除结缔粘连组织和脂肪，撕出单独的毛球组织，得到毛球组织，再在普通DPBS/PBS(Gibico，8121293)溶液中清洗三次；
将上述清洗后来自一单位人源毛囊组织的所有毛球组织转移到96孔板，用50uL的胶原酶II(Gibico，2240228，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min，再加入100uL(2倍体积的消化酶2)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作2组+消化酶3酶解法：
将一单位的离体的人源毛囊组织用双抗DDPBS/PBS洗三遍后移至体视镜(Leica-SE9)下，在显微镜(40X放大倍数)下，剪去毛干部位，且去除结缔粘连组织和脂肪，撕出单独的毛球组织，得到毛球组织，再在普通DPBS/PBS(Gibico，8121293)溶液中清洗三次；
将上述清洗后的来自一单位人源毛囊组织的所有毛球组织转移到96孔板，用50uL的Dispase酶(Hyclone，J200016，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min，再加入100uL(2倍体积的消化酶3)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，57％的CO2培养箱培养。
显微操作2组+消化酶4酶解法：
将一单位的离体的人源毛囊组织用双抗DDPBS/PBS洗三遍后移至体视镜(Leica-SE9)下，在显微镜(40X放大倍数)下，剪去毛干部位，且去除结缔粘连组织和脂肪，撕出单独的毛球组织，得到毛球组织，再在普通DPBS/PBS(Gibico，8121293)溶液中清洗三次；
将上述清洗后的来自一单位人源毛囊组织的所有毛球组织转移到96孔板，用50uL的Tryple E酶(Gibico，12604021，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min，再加入100uL(2倍体积的消化酶3)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作3组+消化酶1酶解法：
将显微操作3组得到的单个毛囊组织转移到96孔板，用50uL的消化酶-胶原酶I(Gibico，2340572，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min后，再加入100uL(2倍体积的消化酶1)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作3组+消化酶2酶解法：
将显微操作3组得到的单个毛囊组织转移到96孔板，用50uL的胶原酶II溶液(Gibico，2240228，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min，再加入100uL(2倍体积的消化酶2)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作3组+消化酶3酶解法：
将显微操作3组得到的单个毛囊组织转移到96孔板，转移到96孔板，用50uL的Dispase酶溶液(Hyclone，J200016，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min，再加入100uL(2倍体积的消化酶3)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作3组+消化酶4酶解法：
将显微操作3组得到的单个毛囊组织转移到96孔板，用50uL的Tryple E酶溶液(Gibico，12604021，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min，再加入100uL(2倍体积的消化酶3)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作4组+消化酶1酶解法：
将显微操作4组得到的单个毛球组织转移到96孔板，用50uL的消化酶-胶原酶I溶液(Gibico，2340572，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min后，再加入100uL(2倍体积的消化酶1)中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作4组+消化酶2酶解法：
将显微操作4组得到的单个毛球组织转移到96孔板，用50uL的胶原酶II溶液(Gibico，2240228，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min，再加入100uL(2倍体积的消化酶2)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。显微操作4组+消化酶3酶解法：
将显微操作4组得到的单个毛球组织转移到96孔板，用50uL的Dispase酶溶液(Hyclone，J200016，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min，再加入100uL(2倍体积的消化酶3)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
显微操作4组+消化酶4酶解法：
将显微操作4组得到的单个毛球组织转移到96孔板，用50uL的Tryple E酶溶液(Gibico，12604021，5mg/mL)进行消化，37℃培养箱消化30min，再加入100uL(2倍体积的消化酶3)的中和液中和反应2min后，再将中和反应后产物放置于于DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养。
二、检测
1、甲苯胺蓝染色鉴定毛囊来源的毛乳头细胞
将上述一中各组培养24h的细胞通过甲苯胺蓝染色鉴定其为毛囊来源的毛乳头细胞：在不同pH情况下，毛囊来源的毛乳头细胞含更多的糖蛋白和粘蛋白，出现异染情况：pH1.5为蓝色，pH6.5为紫红色情况。具体方法如下：
将购买的甲苯胺蓝(上海源叶，S19057)，分别用盐酸和磷酸氢二钠(上海源叶，S-30731)进行pH调节，最终调节成pH1.5和pH6.5两种试剂，分别用不同pH值的甲苯胺蓝对细胞进行染色。若细胞出现上述异染情况，证明其为毛囊来源的毛乳头细胞。
结果举例如下：显微操作2组+消化酶3酶解组分离得到的细胞，37℃，5％的CO2培养箱培养24h后的细胞的甲苯胺蓝染色结果如图5所示，可以看出，pH1.5为蓝色，pH6.5为紫红色情况的细胞为毛乳头细胞。
其他组的结果也均证明，分离得到毛乳头细胞。
2、细胞爬出检测
将上述各组培养不同时间的培养产物用显微镜(尼康，Ts2)观察，组织周围是否有细胞散落爬出，统计不同组的细胞爬出时间不同(以在DMEM/F12(Gibico，2186796)培养基中37℃，5％的CO2培养箱培养第一天起，记作第1天)，具体如表1所示。
结果举例如下：图4为显微操作2组+消化酶3酶解组在第7天的细胞爬出情况。
其他组也分别在不同时间爬出。
3、污染情况检测
分别取每组培养24h的培养液100uL，涂板至平皿，37℃培养箱培养24h后，观察平皿的长菌情况，其结果如表1所示。
4、比对各组毛囊来源的毛乳头细胞的分离方法
将上述各组毛囊来源的毛乳头细胞的操作时间、爬出时间、污染情况、贴壁效率、纯净度等如表1所示。
细胞爬出与否及爬出时间，按照组织周围的细胞出现情况作为节点判断。
污染情况评判标准，是培养过程有没有看到污染或染菌情况，有/无作为最终结果。
贴壁效率的评判方法，是分离后培养观测组织贴附到培养皿的情况，若1-3d时间已经贴附则判定为高的贴壁效率，3-6d的时间认为中等的贴壁效率，7d及之后的时间则认为其为低的贴壁效率。
毛囊纯净度判定，是在爬出的细胞情况里，通过观察发现爬出细胞形态多样，且留有未爬出的组织块则纯净度低；若爬出细胞形态多样，无遗留未爬出组织块则纯净度中等；若爬出细胞形态单一且无组织块遗留则纯净度高。
单一毛囊毛乳头细胞纯净度评判，是在爬出的细胞情况，若非单一毛囊，爬出细胞形态多样，留有未爬出的组织块则纯净度低；若为单一毛囊情况，爬出细胞杂乱，则认为纯净度中等；若为单一毛囊情况，爬出细胞一致性较好，则认为纯净度高。
表1为毛囊来源的毛乳头细胞的分离方法比较
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通过对不同方法的比较和改善发现，显微操作2组/4组+消化酶1/2/3/4酶解组的方法，细胞爬出时间短于其他组，经过7-10d的培养的观察，显微操作2组/4组+消化酶1/2/3/4酶解组在毛乳头部位和周围发现毛囊来源的毛乳头细胞爬出情况，比传统爬出的毛囊来源的毛乳头细胞时间上缩短7-20d，没有污染情况，且状态良好，证实了分离方法的可靠性，在操作时间正常和无污染的情况下，能更快地提高分离毛囊来源的毛乳头细胞的时间和效率，证实了显微操作2组/4组+消化酶1/2/3酶解组的方法的可靠和有效性。
同时在显微操作1组-6组的比较发现，显微操作2组/3组/4组/5组/6组的毛乳头细胞爬出的纯净度更高，这取决于是否将毛囊组织或毛球组织单独剥离的显微操作，是对于显微操作的明显优化的结果；此外，增加的将单个毛囊组织/单个毛球组织/单个毛乳头组织(图3，图6，图7)独立培养，对应于显微操作3组/4组/6组，也是本次实验的另一方面的优化，通过细胞爬出的细胞纯净度(图7，图8)比较分析，单根毛囊的爬出纯净度，要明显高于单位毛囊分离的细胞纯净度；证实了虽然是相同个体，但由于组织时空特异性的差别，对于获取单独毛乳头细胞的培养十分必要，也是第一次尝试；但对于爬出的毛乳头细胞的时间没有太大差异；但由于剥离毛乳头组织的操作难度更大，且组织受损后更易影响细胞爬出，所以显微操作5组/6组并没有达到预期的爬出效果(预期是应该比其他组更早爬出)，并没有作为最优组出现也是验证了直接剥离毛乳头分离的操作容易造成组织损伤进而影响细胞爬出情况。
本发明还将未进行储存液和恒温运输箱运输的新鲜毛囊组织样本在运输24小时后，配合显微操作2组+消化酶1/2/3/4酶解组，结果37℃，5％的CO2培养箱培养25天内细胞均未能正常爬出。
本发明还将未进行无菌处理的新鲜毛囊组织样本配合显微操作2组+消化酶1/2/3/4酶解组，结果出现细胞污染的情况。
从上述可以看出，本发明的方法采用储存液和恒温运输箱运输的方式，使毛囊组织样本的运输时长达24h，配合显微操作和酶解，均能获得毛乳头细胞的爬出，解决时限上的问题，克服了必须新鲜采样的弊端。本发明的发明人同时尝试过采用低于0度进行运输，结果由于温度太低，无法分离出毛乳头细胞。本发明的方法还采用了无菌处理并同时监控，使显微分离前的样本已经无菌，如果有菌，会停止操作，避免成本的浪费。
以上为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范畴之内。
Claims (10)
1.一种体外分离人毛囊来源的毛乳头细胞的方法，为如下方法A)或方法B)：
所述方法A)包括如下步骤：
A-1)从离体人毛发样本中分离出毛囊组织；
A-2)培养所述毛囊组织，得到人毛囊来源的毛乳头细胞；
所述方法B)包括如下步骤：
B-1)从离体人毛发样本中分离出毛囊组织；
B-2)再从所述毛囊组织中分别分离出毛球组织或毛乳头组织，培养所述毛球组织或所述毛乳头组织，得到人毛囊来源的毛乳头细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述毛囊组织为1单位毛囊组织或者单个毛囊组织；
所述毛球组织或所述毛乳头组织来自1单位离体毛囊组织或者来自单个离体毛囊组织。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
在所述A-1)和A-2)步骤之间，还包括将所述毛囊组织用消化酶酶解的步骤；
所述B-2)中，在所述分离出毛球组织和培养毛球组织的步骤之间，还包括将分离出的所述毛球组织用消化酶酶解的步骤。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于：
在各个方法中的步骤1)前，还包括如下步骤：将采集的离体人毛发样本依次进行低温运输和无菌处理的步骤；
所述低温运输为将所述采集的离体人毛发样本放置于储存液中，再通过恒温运输箱中运输；其中，所述储存液为乳酸格林氏液；所述恒温运输箱的温度为0-15℃。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述运输时间小于等于48小时。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：
所述无菌处理为将低温运输后的离体人毛发样本用含有递减浓度双抗的DPBS/PBS依次清洗，收集清洗前和清洗后的溶液，分别记作液体A和液体B，再将所述液体A和液体B进行无菌检测。
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：
所述消化酶为消化酶-胶原酶I、胶原酶II、Dispase酶和/或Tryple E酶；
所述酶的工作浓度为1-10mg/mL。
8.根据权利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于：所述酶解的条件为37℃消化30-120min。
9.权利要求1-8任一所述方法在延长分离毛乳头细胞所用毛囊组织的离体的时限中的应用。
10.权利要求1-8任一所述方法在提高原代分离毛囊来源的毛乳头细胞中的应用。
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