CN106619505A - 一种用于生发的注射液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于生发的注射液及其制备方法，其中，该注射液由毛囊干细胞、毛乳头细胞、适量赋形剂和水组成，其中，每100ul注射液中含有1×106以上个毛囊干细胞和1×106以上个毛乳头细胞。本发明的有益之处在于：本发明的注射液能够促使毛囊新生，生长出新毛发，改善患者因毛发缺损造成的不美观问题，同时能够避免手术损伤以及毛发移植产生的副作用，给患者重塑美观。

Description

一种用于生发的注射液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种注射液及其制备方法，具体涉及一种用于生发的注射液及其制备方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
当前，毛发缺损的发病率较高，包括自然的雄激素性毛发脱失、烧伤性毛发缺损、创伤性毛发缺失、医源性毛发缺失等。
毛发缺损的修复方法很多，如头皮扩张、头皮缩减、头皮条游离移植、皮瓣法、自体毛发移植法。
自体毛发移植可以分为好多种方法，如环钻钻孔移植、激光打孔移植、狭缝移植等，移植物的形状包括圆柱形、方形、片状、椭圆形等，每个移植物含有的毛发数目4-12根不等。
上述的修复方法都可以修复毛发缺失，但是都存在这样一个问题：
毛发移植物较大，因而产生术后毛发方向和密度分布不自然、受区损伤大、存活率低、影响美观等缺点。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于生发的注射液及其制备方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种用于生发的注射液，其特征在于，由毛囊干细胞、毛乳头细胞、适量赋形剂和水组成，其中，每100ul注射液中含有1×106以上个毛囊干细胞和1×106以上个毛乳头细胞。
前述的用于生发的注射液，其特征在于，前述赋形剂选自胶原、纤维蛋白原、热逆变水凝胶、原位交联的水凝胶、化学交联的可生物吸收的聚合物、凝血酶、淀粉、透明质酸、明胶、硫酸软骨素、多糖、蛋白质、以及上述的任何衍生物共聚物或其它变体及其它药学上可接受的赋形剂。
前述的用于生发的注射液，其特征在于，前述赋形剂选自胶原和硫酸软骨素。
前述的用于生发的注射液，其特征在于，前述胶原为IV型胶原。
前述的用于生发的注射液，其特征在于，制备方法为：
一、分离毛乳头细胞和毛囊干细胞
取美容手术中多余的正常的头皮组织，用含抗生素的PBS反复冲洗，用剪刀去除头皮组织的皮下脂肪，并将毛乳头剪下放入预先铺有IV型胶原的培养皿中，将头皮组织剪成宽2-3mm的条状，将剪好的头皮组织浸泡在0.25％的中性蛋白酶中，4℃过夜，次日取出，然后用PBS冲洗，再用摄子小心将毛发从头皮组织中拔出，置于预先铺有IV型胶原、盛有DMEM但是未添加FBS的培养皿中；
二、培养毛乳头细胞
向放有毛乳头的培养皿中加入5ml 0.2％II型胶原酶，在37℃孵箱内消化1h，并不时摇动，观察到液体变浑浊、真皮鞘变软后取出，用吸管反复吹打使毛乳头游离，加入PBS进行离心，先以2000rmp离心5min，反复4遍，再以800rmp离心4min，反复3遍，离心完成后弃上清，取沉淀，向沉淀中加入含10％FBS的DMEM培养基，重悬，接种到培养瓶中，放于37℃恒温培养箱中培养，每三天换液一次，当细胞融合达到90％后，吸取培养基，再用无菌PBS清洗两遍，胰酶消化2min，完全培养基中和终止消化，离心后弃上清，将沉淀物加入到含10％FBS的DMEM培养基中，以1：3比例传代培养，培养至第5代，得到毛乳头细胞培养物；
三、培养毛囊干细胞
在解剖显微镜下去除毛囊上段与下段，收集毛囊中段，在37℃条件下用胰蛋白酶消化毛囊中段30-45min，消化结束后用10％FBS培养基中和，再400目筛网过滤，将滤液离心，弃上清，将沉淀物加入到K-SFM无血清培养基中，以5×104/cm2的密度将细胞接种在预铺有IV型胶原并且盛有DMEM但是未添加FBS的培养皿中，30min后弃上清及未贴壁的细胞，用PBS小心冲洗，重新加入到K-SFM无血清培养基中，然后放于37℃恒温培养箱中培养，每三天换液一次，当细胞融合达到90％后，吸取培养基，用无菌PBS清洗两遍，胰酶消化2min，完全培养基中和终止消化，离心后弃上清，将沉淀物加入到K-SFM无血清培养基中，以1：3比例传代培养，培养至第5代，得到毛囊干细胞培养物；
四、制成注射液
将培养至第5代的毛囊干细胞和毛乳头细胞转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，将沉淀物用完全培养基重悬，并用细胞计数板计数，将毛囊干细胞和毛乳头细胞转移至另一离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，向沉淀物中加入适量体积的悬液，使100ul注射液中含有1×106以上个毛囊干细胞和1×106以上个毛乳头细胞，前述悬液是赋形剂的水溶液。
前述的用于生发的注射液，其特征在于，前述赋形剂选自胶原、纤维蛋白原、热逆变水凝胶、原位交联的水凝胶、化学交联的可生物吸收的聚合物、凝血酶、淀粉、透明质酸、明胶、硫酸软骨素、多糖、蛋白质、以及上述的任何衍生物共聚物或其它变体及其它药学上可接受的赋形剂。
前述的用于生发的注射液，其特征在于，前述赋形剂选自IV型胶原和硫酸软骨素，将100mg的IV型胶原和100mg的硫酸软骨素溶解在100ml蒸馏水中，配制成悬液。
本发明的有益之处在于：本发明的注射液能够促使毛囊新生，生长出新毛发，改善患者因毛发缺损造成的不美观问题，同时能够避免手术损伤以及毛发移植产生的副作用，给患者重塑美观。
附图说明
图1(a)是CK15在毛囊组织来源的铺路石样细胞中的表达图；
图1(b)是毛囊组织来源的铺路石样细胞图；
图1(c)是免疫荧光和DIC的叠加图；
图2是我们分离得到的毛囊干细胞的图；
图3是裸鼠注射本发明的注射液2周后的图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、准备培养皿
用蒸馏水将冰醋酸稀释成浓度为0.25％的稀醋酸溶液，0.22um滤器过滤除菌，然后用该稀醋酸溶液将人IV型胶原稀释成浓度为1mg/ml的IV型胶原溶液，根据需要分装于无菌EP管中，-20℃保存备用。
使用前，将约0.5ml IV型胶原溶液用微量枪吹打，努力使溶液浸润整个培养皿瓶底。静置大约5min，收取培养皿中残余溶液，该残余溶液可供下次铺瓶再次使用。
将所有包被好的培养皿开盖后置于超净台中紫外线照射过夜。
将所有包被并除菌后的培养皿用封口膜密封后置于4℃冰箱中备用。
二、分离毛乳头细胞和毛囊干细胞
取美容手术中多余的正常的头皮组织，用含抗生素的PBS反复冲洗。
用剪刀去除头皮组织的皮下脂肪，并将毛乳头剪下放入预先铺有IV型胶原的培养皿中，修剪时要注意深度，以刚好分离毛乳头为佳，避免过多的损伤毛囊的根鞘。
将头皮组织剪成宽约2-3mm的条状，剪时剪刀的方向应与毛发生长方向平行，尽可能保留毛囊的完整性。
将剪好的头皮组织浸泡在0.25％的中性蛋白酶中，4℃过夜，次日取出，然后用PBS冲洗，再用摄子小心将毛发从头皮组织中拔出，置于预先铺有IV型胶原、盛有DMEM但是未添加FBS的培养皿中。
在解剖显微镜下观察，毛囊大致分为上、中、下三段：上段为皮脂腺开口以上，中段为皮脂腺开口向下约1mm处，其余为下段。
三、培养毛乳头细胞
向放有毛乳头的培养皿中加入约5ml 0.2％II型胶原酶，然后在37℃孵箱内消化1h，并不时摇动，观察到液体变浑浊、真皮鞘变软后取出，用吸管反复吹打使毛乳头游离。
加入PBS进行离心，先以2000rmp离心5min，反复4遍，再以800rmp离心4min，反复3遍。
离心完成后弃上清，取沉淀，向沉淀中加入含10％FBS的DMEM培养基，重悬，接种到培养瓶中，放于37℃恒温培养箱中培养，每三天换液一次。
当细胞融合达到90％后，吸取培养基，再用无菌PBS清洗两遍，胰酶消化2min，完全培养基中和终止消化，离心后弃上清，将沉淀物加入到含10％FBS的DMEM培养基中，以1：3比例传代培养，培养至第5代，得到毛乳头细胞培养物。
四、培养毛囊干细胞
在解剖显微镜下去除毛囊上段与下段，收集毛囊中段，然后在37℃条件下用胰蛋白酶消化毛囊中段30-45min，消化结束后用10％FBS培养基中和，再400目筛网过滤，将滤液离心，弃上清，将沉淀物加入到K-SFM无血清培养基中，以5×104/cm2的密度将细胞接种在预铺有IV型胶原并且盛有DMEM但是未添加FBS的培养皿中。
30min后弃上清及未贴壁的细胞，用PBS小心冲洗，重新加入到K-SFM无血清培养基中，然后放于37℃恒温培养箱中培养，每三天换液一次。
当细胞融合达到90％后，吸取培养基，用无菌PBS清洗两遍，胰酶消化2min，完全培养基中和终止消化，离心后弃上清，将沉淀物加入到K-SFM无血清培养基中，以1：3比例传代培养，培养至第5代，得到毛囊干细胞培养物。
五、鉴定毛囊干细胞和毛乳头细胞
1、鉴定毛囊干细胞
鉴定过程：
(1)取培养第3代的毛囊干细胞，用D-Hanks液冲洗；
(2)用4％多聚甲醛固定细胞，室温下孵育30min，然后弃去固定液，待完全干燥后，-20℃保存；
(3)蒸馏水水化20min；
(4)用0.1％Triton X-10室温下孵育10min，然后用PBS冲洗细胞5min/次×3次；
(5)用10％BSA封闭，室温下孵育20min；
(6)吸干BSA，直接加入鼠抗人CK15单克隆抗体(1：50稀释)，4℃过夜；
(7)次日，37℃孵箱孵育1h，然后用PBS冲洗细胞5min/次×3次；
(8)加入荧光素FITC标记抗体：FITC标记山羊抗鼠Ig G(1：50稀释)，37℃避光孵育30min，然后用PBS冲洗细胞5min/次×3次；
(9)弃去PBS，用PI试剂染细胞核；
(10)用激光扫描共聚焦显微镜检测。
检测结果如图1(a)、图1(b)和图1(c)所示。其中，
图1(a)：CK15在毛囊组织来源的铺路石样细胞中呈阳性表达，表现为绿色荧光；
图1(b)：毛囊组织来源的铺路石样细胞；
图1(c)免疫荧光和DIC的叠加图。
由图可知，我们所分离得到的细胞为毛囊干细胞。
2、鉴定毛乳头细胞
鉴定过程：
(1)取获得的新鲜毛乳头悬液接种于底部有盖玻片的6孔板中，置于37℃、5％CO2孵箱中培养；
(2)1天后取6孔板中的细胞爬片，于PBS中漂洗3min/次×3次，用4％多聚甲醛室温下固定30min，再用PBS漂洗5min/次×3次；
(3)用0.1％Triton室温下孵育3min，PBS漂洗3min/次×3次；
(4)用3％H2O2室温下孵育10min，PBS漂洗3min/次×3次；
(5)避光条件下于爬片上滴加一抗工作液(鼠抗人α-SMA多克隆抗体)，湿盒内4℃过夜；
(6)第二日取出爬片，PBS漂洗5min/次×3次，避光滴加荧光标记的二抗(羊抗鼠IgG-FITC1:100)，湿盒内37℃孵育30min，PBS漂洗5min/次×3次；
(7)用DAPI溶液染核5min，PBS漂洗5min/次×3次；
(8)甘油封片，荧光显微镜下观察。
观察的结果如图2所示，免疫荧光显示提取的细胞胞质中α-SMA免疫荧光呈阳性。
由此可知，我们所分离得到的细胞为毛乳头细胞。
六、制成注射液
将100mg的IV型胶原和100mg的硫酸软骨素溶解在100ml蒸馏水中，配制成混合溶液(悬液)，用0.22um滤器过滤除菌后备用。
需要说明的是，赋形剂除了可以选用上述的IV型胶原和硫酸软骨素外，还可以选用纤维蛋白原、热逆变水凝胶、原位交联的水凝胶、化学交联的可生物吸收的聚合物、凝血酶、淀粉、透明质酸、明胶、多糖、蛋白质、以及上述的任何衍生物共聚物或其它变体及其它药学上可接受的赋形剂。
将培养至第5代的毛囊干细胞和毛乳头细胞转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，将沉淀物用完全培养基重悬，并用细胞计数板计数。
每个注射位点注射毛囊干细胞和毛乳头细胞各106个，根据计数结果，计算出所需悬液体积。
将毛囊干细胞和毛乳头细胞转移至另一离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，向沉淀物中加入适量体积的悬液，使100ul注射液中含有1×106个毛囊干细胞和1×106个毛乳头细胞。
七、使用方法
将注射液吸入5ml水光针中，在头发缺失处，通过水光针进行皮下注射，注入到真皮层，每个注射位点注射1×106个毛囊干细胞和1×106个毛乳头细胞。
八、使用效果
毛囊干细胞是定位于毛囊外根鞘隆突部的一群干细胞，它们具有很强的分化能力，可以分化为毛囊内的多种细胞，对毛囊的发育、周期性循环以及皮肤创伤的修复具有非常重要的作用，是毛囊重建研究的理想种子细胞。
毛乳头细胞最重要的特征是诱导毛囊再生和支持毛发生长，体外传代培养的毛乳头细胞仍保留其诱导能力。
由于真皮成分和表皮成分间的相互作用是毛发再生的必要条件，毛囊干细胞本质上属于角质形成细胞干细胞，毛乳头细胞是一种真皮细胞，所以选择毛囊干细胞和毛乳头细胞混合，注射到皮下以后，可以促进毛发的再生。
取6周的裸鼠3只，称其体重。常规麻醉后，术野消毒。注射部位为裸鼠上背部，将注射液吸入5ml水光针中，针头向上，轻敲针管前端，排出针管内空气，手固定小鼠松紧合适，用水光针注射100ul后迅速退出针头。2周后观察毛发再生情况。
2周后，3只裸鼠的背部都长出了黑色毛发，毛发浓密与正常C57小鼠背部毛发相近，排列整齐、生长方向一致，其中1只裸鼠的背部照片如图3所示。
由此可见，本发明的注射液能够促进活体皮肤中新头发的生长，可以有效治疗毛发缺损。
此外，使用本发明的注射液来生发还具有组织创伤小、需要组织少等优点，减轻了毛发缺失给患者带来的困扰，适于临床应用。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种用于生发的注射液，其特征在于，由毛囊干细胞、毛乳头细胞、适量赋形剂和水组成，其中，每100ul注射液中含有1×106以上个毛囊干细胞和1×106以上个毛乳头细胞。
2.根据权利要求1所述的用于生发的注射液，其特征在于，所述赋形剂选自胶原、纤维蛋白原、热逆变水凝胶、原位交联的水凝胶、化学交联的可生物吸收的聚合物、凝血酶、淀粉、透明质酸、明胶、硫酸软骨素、多糖、蛋白质、以及上述的任何衍生物共聚物或其它变体及其它药学上可接受的赋形剂。
3.根据权利要求2所述的用于生发的注射液，其特征在于，所述赋形剂选自胶原和硫酸软骨素。
4.根据权利要求3所述的用于生发的注射液，其特征在于，所述胶原为IV型胶原。
5.根据权利要求1所述的用于生发的注射液，其特征在于，制备方法为：
一、分离毛乳头细胞和毛囊干细胞
取美容手术中多余的正常的头皮组织，用含抗生素的PBS反复冲洗，用剪刀去除头皮组织的皮下脂肪，并将毛乳头剪下放入预先铺有IV型胶原的培养皿中，将头皮组织剪成宽2-3mm的条状，将剪好的头皮组织浸泡在0.25％的中性蛋白酶中，4℃过夜，次日取出，然后用PBS冲洗，再用摄子小心将毛发从头皮组织中拔出，置于预先铺有IV型胶原、盛有DMEM但是未添加FBS的培养皿中；
二、培养毛乳头细胞
向放有毛乳头的培养皿中加入5ml 0.2％II型胶原酶，在37℃孵箱内消化1h，并不时摇动，观察到液体变浑浊、真皮鞘变软后取出，用吸管反复吹打使毛乳头游离，加入PBS进行离心，先以2000rmp离心5min，反复4遍，再以800rmp离心4min，反复3遍，离心完成后弃上清，取沉淀，向沉淀中加入含10％FBS的DMEM培养基，重悬，接种到培养瓶中，放于37℃恒温培养箱中培养，每三天换液一次，当细胞融合达到90％后，吸取培养基，再用无菌PBS清洗两遍，胰酶消化2min，完全培养基中和终止消化，离心后弃上清，将沉淀物加入到含10％FBS的DMEM培养基中，以1：3比例传代培养，培养至第5代，得到毛乳头细胞培养物；
三、培养毛囊干细胞
在解剖显微镜下去除毛囊上段与下段，收集毛囊中段，在37℃条件下用胰蛋白酶消化毛囊中段30-45min，消化结束后用10％FBS培养基中和，再400目筛网过滤，将滤液离心，弃上清，将沉淀物加入到K-SFM无血清培养基中，以5×104/cm2的密度将细胞接种在预铺有IV型胶原并且盛有DMEM但是未添加FBS的培养皿中，30min后弃上清及未贴壁的细胞，用PBS小心冲洗，重新加入到K-SFM无血清培养基中，然后放于37℃恒温培养箱中培养，每三天换液一次，当细胞融合达到90％后，吸取培养基，用无菌PBS清洗两遍，胰酶消化2min，完全培养基中和终止消化，离心后弃上清，将沉淀物加入到K-SFM无血清培养基中，以1：3比例传代培养，培养至第5代，得到毛囊干细胞培养物；
四、制成注射液
将培养至第5代的毛囊干细胞和毛乳头细胞转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，将沉淀物用完全培养基重悬，并用细胞计数板计数，将毛囊干细胞和毛乳头细胞转移至另一离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，向沉淀物中加入适量体积的悬液，使100ul注射液中含有1×106以上个毛囊干细胞和1×106以上个毛乳头细胞，所述悬液是赋形剂的水溶液。
6.根据权利要求5所述的用于生发的注射液，其特征在于，所述赋形剂选自胶原、纤维蛋白原、热逆变水凝胶、原位交联的水凝胶、化学交联的可生物吸收的聚合物、凝血酶、淀粉、透明质酸、明胶、硫酸软骨素、多糖、蛋白质、以及上述的任何衍生物共聚物或其它变体及其它药学上可接受的赋形剂。
7.根据权利要求6所述的用于生发的注射液，其特征在于，所述赋形剂选自IV型胶原和硫酸软骨素，将100mg的IV型胶原和100mg的硫酸软骨素溶解在100ml蒸馏水中，配制成悬液。
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