CN102083974A - 催泪蛋白的部分肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了包含催泪蛋白部分序列的多肽，其可促进细胞与细胞外基质之间的粘附。本发明还公开了包含催泪蛋白部分序列的多肽，其具有泪液分泌促进活性。本发明具体公开了包含SEQ ID NO：1(其是催泪蛋白特定部分序列)所示氨基酸序列并且具有70个以下残基的氨基酸长度的多肽。所述多肽可促进细胞与细胞外基质之间的粘附。所述多肽还可促进泪腺腺泡细胞中的泪液分泌。

Description

催泪蛋白的部分肽

技术领域

本发明涉及具有催泪蛋白(lacritin)的特定部分序列的多肽，所述催泪蛋白是泪液中的蛋白质。本发明的多肽可以促进细胞粘附、特别是细胞与细胞外基质之间的细胞粘附。而且，本发明的多肽可以促进泪液分泌。

背景技术

已知细胞与细胞外基质的粘附涉及细胞的生存、运动性等各种功能。这是控制个体的正常发育、组织的维持、或从损伤或感染中恢复的必需过程。基于这种细胞粘附的信号通路的异常有时导致发育异常、循环系统疾病、细胞的转化或转移。

另外，已报道了当细胞-细胞外基质间的粘附受到抑制时，细胞陷入被称作“失巢凋亡(anoikis)”的细胞死亡，因此，与细胞外基质的粘附对于细胞的生存是重要的(参见非专利文献1)。

催泪蛋白是被鉴定为泪液分泌促进因子或类生长因子蛋白的蛋白质(参见专利文献1和2以及非专利文献2)。关于催泪蛋白，下述1)～5)被报道：

1)催泪蛋白具有作为角膜上皮细胞和泪腺腺泡细胞的生长因子的活性；

2)催泪蛋白显示出对泪液蛋白质分泌的促进效果；

3)催泪蛋白表达于源于例如泪腺、耳下腺、小唾液腺、顎下腺、甲状腺、乳腺及角膜上皮等组织的细胞；

4)含有催泪蛋白的滴眼剂可以用于治疗例如干眼综合症、斯耶格伦氏综合症或角膜上皮创伤等眼疾；

5)利用表达催泪蛋白受体的细胞，通过催泪蛋白依赖的信号为指标，可以筛选出与催泪蛋白或催泪蛋白受体结合的化合物。

另外，已报道在³H-胸苷摄取的检测试验中，催泪蛋白或其两端的一部分缺失的肽具有促进唾液腺细胞分裂的作用(参见非专利文献3)。

然而，至今没有关于催泪蛋白或其片段(部分肽)涉及细胞-细胞外基质粘附的报道。另外，还没有关于催泪蛋白片段对来自泪腺腺泡细胞的泪液蛋白质的分泌具有促进作用的报道。

专利文献1：WO02/065943

专利文献2：WO05/119899

非专利文献1：Frisch，S.M.et al.，Journal of Cell Biology 124，pp.619-626(1994)

非专利文献2：Sanghi，S.et al.，Journal of Molecular Biology 310，pp.127-139(2001)

非专利文献3：Wang，J.et al.Journal of Cell Biology 174，pp.689-700(2006)

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的是提供能够促进细胞与细胞外基质之间特别是角膜上皮细胞与细胞外基质之间粘附的物质和/或具有促进来自泪腺腺泡细胞的泪液蛋白质分泌的作用的物质。

解决问题的方法

本发明人鉴于上述问题已进行深入研究，并发现具有催泪蛋白特定部分序列的多肽可以促进角膜上皮细胞与细胞外基质之间的粘附，并可以进一步促进来自泪腺腺泡细胞的泪液蛋白质的分泌，从而完成本发明。因此，本申请发明如下。

[1]多肽，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列并具有70个残基以下的氨基酸长度。

[2]多肽，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，其中1至3个氨基酸被缺失、置换或添加，并具有与上述[1]所述的多肽等同的活性并具有70个残基以下的氨基酸长度。

[3]如上述[1]所述的多肽，其中SEQ ID NO：1所示氨基酸序列以外的部分由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的部分序列组成。

[4]多肽，其由上述[3]所述的多肽序列组成，其中1至3个氨基酸被缺失、置换或添加，并具有与上述[3]所述的多肽等同的活性。

[5]如上述[1]所述的多肽，其由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的部分序列组成。

[6]多肽，其由上述[5]所述的多肽序列组成，其中1至3个氨基酸被缺失、置换或添加，并具有与上述[5]所述的多肽等同的活性。

[7]多肽，其由SEQ ID NO：3～5任一项所示的氨基酸序列组成。

[8]多肽，其由SEQ ID NO：3～5任一项所示的氨基酸序列组成，其中1至3个氨基酸被缺失、置换或添加，并具有与上述[7]所述的多肽等同的活性。

[9]细胞粘附促进剂，其包含上述[1]～[8]任一项所述的多肽。

[10]促进细胞粘附的方法，其包括将上述[1]～[8]任一项所述的多肽以有效浓度与细胞接触。

[11]泪液分泌促进剂，其包含上述[1]～[8]任一项所述的多肽。

发明效果

本发明可以提供一种新的多肽，所述多肽能够促进细胞与细胞外基质之间、特别是角膜上皮细胞与细胞外基质之间的粘附。本发明的多肽可通过将所述多肽加入用于制备移植用角膜上皮片的培养基中来制备防止细胞脱落而长期稳定发挥功能的角膜上皮片。并且，本发明可以提供一种新的多肽，所述多肽能够发挥对源自泪腺腺泡细胞的泪液分泌的促进作用。直接作用于泪腺并且能够发挥对泪液分泌的促进作用的物质可以是预防或治疗干眼症以及干眼症相关疾病的有用药物。

具体实施方式

本发明的多肽的一个实施方式是包含由以下SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽。

QGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA(SEQ ID NO：1)

SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列相当于由138残基组成的SEQ ID NO：2所示的源于人的全长催泪蛋白(参见GenBank/EBI数据库登录号NM_033277和ay005150(基因组))中的69～102位。

而且，本发明的多肽只要与上述多肽具有等同的活性，其可以是包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽，其中1至3个、优选地1至2个、更优选地1个氨基酸被缺失、置换或添加。

本发明的多肽的氨基酸长度通常为70个残基以下，优选为60个残基以下、特别优选为32至58个残基，最优选为34至55个残基。还优选为35至55个残基。

只要本发明多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列(或SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，其中1至3个氨基酸被缺失、置换或添加)，它的其他部分可以是任意的氨基酸序列。所述任意的氨基酸序列可以在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列(或SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，其中1至3个氨基酸被缺失、置换或添加)的N末端侧、C末端侧、或同时在N末端侧和C末端侧存在。任意的氨基酸序列的实例包括SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的部分序列(下述)。

优选地，本发明的多肽除了SEQ ID NO：1所示氨基酸序列以外，仅由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成。SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列是指SEQ ID NO：2所示氨基酸序列(催泪蛋白的氨基酸序列)中的任意部分序列，并且可以包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的一部分或全部。SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列可以被添加至SEQID NO：1所示的氨基酸序列的N末端侧、C末端侧、或N末端侧和C末端侧二者。

当SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列被添加至SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的N末端侧和C末端侧二者时，它们可以是在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中相互连续的，也可以是不连续的，或者可以部分或全部相互重叠。

此处，所获得的多肽可以具有这样的氨基酸序列，其中1至3个、优选1至2个、更优选1个氨基酸被缺失、置换或添加，只要它具有与所述多肽等同的活性，即只要它维持所述多肽的细胞粘附促进作用和/或泪液分泌促进作用。

本发明的多肽更优选地为具有70个残基以下的包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽，并且作为整体是由催泪蛋白的连续的部分肽组成。即，本发明的多肽的一个实施方式是具有70个残基以下的催泪蛋白的部分肽，其由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的33至138位部分的连续氨基酸序列组成。

此处，所获得的多肽可以具有这样的氨基酸序列，其中1至3个、优选1至2个、更优选1个氨基酸被缺失、置换或添加，只要它具有与所述多肽等同的活性，即只要它维持所述多肽的细胞粘附促进作用和/或泪液分泌促进作用。

本发明多肽的一个更优选的实施方式是由这样的氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列由下列SEQ ID NO：3-5任一项组成。

VQGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA(SEQ ID NO：3)

QGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKAGKGMHGGVPGG(SEQ ID NO：4)

QGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKAGKGMHGGVPGGKQFIENGSEF(SEQ ID NO：5)

SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列分别相当于催泪蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的68至102位、69至113位或69至123位。换言之，由SEQ ID NO：3至5所示的氨基酸序列组成的本发明的多肽为催泪蛋白的部分肽。

本发明的多肽的还另一个优选实施方式为由以下的SEQ ID NO：8组成的氨基酸序列所组成的多肽。

EISGPAEPASPPETTTTAQETSAAAVQGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA(SEQ ID NO：8)

SEQ ID NO：8所示氨基酸序列相当于催泪蛋白氨基酸序列(SEQ IDNO：2)的43至102位。换言之，由SEQ ID NO：8所示氨基酸序列组成的本发明的多肽为催泪蛋白的部分肽。

本发明的多肽是上述催泪蛋白的部分肽，可以具有这样的氨基酸序列，其中1至3个、优选1至2个、更优选1个氨基酸被缺失、置换或添加，只要它与所述多肽具有等同的活性，即，只要它维持所述多肽所具有的细胞粘附促进作用和/或泪液分泌促进作用。

本说明书中，“氨基酸”通常是指“天然的氨基酸”。但是，只要满足本发明的目的，也可以是“非天然的氨基酸”。此处，“天然的氨基酸”是指天然的氨基酸的L-异构体。天然的氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、鸟氨酸以及赖氨酸。除非明确指出，本说明书中的所有氨基酸为L型。但是，使用D型氨基酸的实施方式也在本发明的范围内。此处，“非天然的氨基酸”是指蛋白质中通常不存在的氨基酸。非天然的氨基酸的实例包括正亮氨酸、对硝基苯丙氨酸、高苯丙氨酸、对氟苯丙氨酸、3-氨基-2-苄基丙酸、高精氨酸的D型或D-苯丙氨酸。

本说明书中，“部分肽”是由SEQ ID NO：2所示催泪蛋白的氨基酸序列的一部分所组成的多肽。

本说明书中，“氨基酸的缺失”是指从氨基酸序列的任意位置去除组成氨基酸。

本说明书中，“氨基酸的置换”是指在氨基酸序列的任意位置用其他氨基酸置换组成氨基酸。作为氨基酸的置换，保守置换是优选的。保守置换是指氨基酸被具有等同性质的其他氨基酸替代的置换，原因在于肽化学领域的普通技术人员期望多肽的二级结构和亲水性质没有实质变化。关于相互间保守置换的氨基酸组，通常已知为下列：(1)甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；(2)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；(3)甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸；(4)亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；(5)谷氨酰胺和天冬酰胺；(6)谷氨酸和天冬氨酸；(7)精氨酸、赖氨酸和组氨酸；(8)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。

本说明书中，“氨基酸的添加”是指在氨基酸序列的任意位置添加任意氨基酸，并包括氨基酸的插入。

如上所述，只要具有与所述多肽具有等同的活性，本发明的多肽可以具有这样的氨基酸序列，其中1至3个、优选1至2个、更优选1个氨基酸被缺失、置换或添加，并且上述多肽也属于本发明的范围。此处，“具有等同的活性”是指具有氨基酸缺失、置换或添加前的多肽的细胞粘附促进作用的约80％以上、优选约90％以上。作为细胞粘附促进作用，促进细胞与细胞外基质之间粘附的作用可以作为实例列举。该作用可如下述实施例所述测定：将测试多肽添加在用适合的细胞外基质包覆的板上，在其上形成角膜上皮细胞层，将细胞培养预定时间并对粘附的细胞计数。可选地，“具有等同的活性”是指具有氨基酸缺失、置换或添加前的多肽的泪液分泌促进作用的约80％以上、优选约90％以上。作为泪液分泌促进作用，促进来自泪腺腺泡细胞的泪液蛋白质(例如乳铁蛋白)的分泌作用可以作为实例列举。该作用可如下述实施例所述测定：培养适合的泪腺腺泡细胞，将测试多肽添加至其培养基中，并对培养基中所分泌的泪液蛋白质进行定量。

另外，在不影响其活性的范围内，上述各多肽可以是衍生物，其中N末端氨基、C末端羧基或氨基酸侧链的官能团被化学修饰。衍生化的实例包括在氨基添加保护基(例如乙酰化、甲酰化、Boc化、Fmoc化)、羧基的酯化(乙基化等)等。当谷氨酰胺存在于N末端时，侧链可以是闭环以产生焦谷氨酸。

各多肽可以根据已知方法以盐的形式存在。作为多肽的盐，药理学上可接受的碱(例如碱金属)盐或酸盐以及药理学上可接受的酸加成盐是特别优选的。药理学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)盐、有机酸(例如醋酸、蚁酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、安息香酸、甲磺酸、苯磺酸)盐等等。

本发明的多肽可以通过常规化学合成方法、重组DNA技术等等产生。

当本发明的多肽通过化学合成方法产生时，其可以根据已知的肽合成方法产生。肽合成方法的实例包括固相合成法、液相合成法等，优选固相合成法。固相合成法的实例包括Fmoc法。Fmoc法是这样的方法：用9-芴甲氧羰基(Fmoc)基团保护α-氨基、用叔丁醇保护基保护侧链官能团，其中在用作为仲胺的哌啶对Fmoc基进行去保护的同时Fmoc氨基酸被缩聚，最后通过如三氟乙酸的弱酸去除侧链保护基。即，从要合成的肽的C末端侧反复进行选择性去除α-氨基保护基和缩聚被保护的氨基酸的一系列操作以构建被保护的肽链，并且去除侧链官能团的保护基以得到目标肽。

在固相肽合成法中，也通常采用利用自动肽合成装置的合成(例如《新生化学实验讲座1蛋白质IV》(1992)日本生化学会编，东京化学同人；“The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology”Vol.1-5，ed.by E.Gross，J.Meienhofer；Vol.6-9，ed.by S.Udenfriend，J.Meienhofer，Academic Press，New York(1979-1987))。

当通过重组DNA技术产生本发明的多肽时，例如，基于编码该多肽的cDNA碱基序列设计引物，并以适合的cDNA文库作为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)对目标序列进行扩增，由此可以产生编码多肽的cDNA。这种PCR方法是本技术领域熟知的并在例如“PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications”，Academic Press，Michael，et al.，eds.，1990中描述。然后，将编码本发明多肽的DNA并入到适合的表达载体中，然后将其引入真核生物或原核生物细胞中，并表达各链以得到所需多肽。可用于本发明多肽表达的宿主细胞的实例包括但不限于原核生物宿主例如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等和真核生物宿主例如酵母、真菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。载体是可以转染至细胞且在细胞基因组中或独立于细胞基因组而可复制的单链或双链核酸分子。表达载体包括驱动DNA表达的启动子区，并可以进一步包括转录和翻译的调节序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列、3’非编码区、增强子等。用于原核生物宿主的启动子的实例包括bla启动子、cat启动子、lacZ启动子，用于真核生物宿主的实例包括小鼠金属硫蛋白I基因序列的启动子、疱疹病毒TK启动子、SV40早期启动子、酵母糖酵解酶基因序列基因启动子等。载体的例子包括但不限于pBR322、pUC118、pUC119、λgt10、λgt11、pMAM-neo、pKRC、BPV、牛痘(vaccinia)、SV40、2-micron等。

表达载体优选含有一个或更多个标记从而可选择含有该载体的宿主细胞。作为标记，可使用那些为互补营养缺陷型宿主提供营养、提供抗生物抗性(例如氨苄青霉素、四环素、新霉素、潮霉素、遗传霉素等)或提供重金属抗性的的标记(例如铜)。

而且，可以构建这样的载体从而利用信号序列使本发明的多肽分泌并表达、或者使本发明的多肽以与不同多肽的融合多肽形式表达。通过使用融合多肽，可以改善多肽的稳定性、或者可以促进纯化。这种表达载体的构建在本技术领域是熟知的。

被构建为表达本发明多肽的载体可通过转化、转染、接合、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射等引入适合的宿主细胞。通过将含有载体的细胞在适合的培养基中生长以产生本发明的多肽，从细胞或培养基回收所需的重组多肽以及纯化多肽，可获得本发明的多肽。

本发明的多肽也可以这样产生：通过例如Kunkel法或缺口双链体法等已知方法或其类似方法，在缺失、置换或添加氨基酸的位置加入修饰以得到编码多肽的cDNA，并将基因用于与上述重组DNA技术类似的重组DNA技术中。通过例如使用基于位点特异性突变引入法的的突变引入试剂盒(例如Mutant-K(Takara Bio Inc.)，Mutant-G(Takara Bio Inc.))等或TakaraBio Inc.的LA PCR体外突变系列试剂盒，可将突变引入基因。

可以使用已知的方法对如上所述得到的本发明多肽进行分离和纯化。已知的分离和纯化方法的实例包括盐析、溶剂沉淀、透析、超滤、凝胶过滤、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、离子交换色谱、亲和层析、逆相高效液相色谱、等电聚焦等。

由此所得的本发明的多肽促进细胞与细胞外基质之间特别是角膜上皮细胞与细胞外基质之间的粘附。以下对其具体用途进行说明。

(1)含有本发明多肽的角膜上皮片制备用培养液

本发明的多肽在制备移植用角膜上皮片时，尤其可以促进角膜上皮细胞与基底的粘附，原因在于对角膜上皮细胞与细胞外基质之间粘附的促进效果。

角膜上皮片是活体角膜的代用物并且用于角膜浑浊的治疗以恢复视力等。其用于治疗例如史蒂文斯约翰逊综合症、化学创伤等难治愈的角膜上皮疾病。角膜上皮片可这样制备：例如在含有血清的培养基中将细胞例如角膜上皮细胞等加至基底例如羊膜或胶原蛋白片上，培养细胞，通过与3T3成纤维细胞共培养或气升等而分层(Ophthalmology，vol.42，No.3，pages245-250，2000)。作为角膜上皮片的制备方法，采用WO03/043542、JP-A-2004-298447、JP-A-2004-261533、JP-A-2002-331025等描述的已知方法。

在角膜上皮片的产生方法中，可使用用于产生角膜上皮片的已知基底，而且可使用源于活体生物的基底和人工制备的基底中的任一种。具体而言，对于源于活体生物的基底可以是羊膜，对于源于人工的基底可以是胶原蛋白片。羊膜覆盖子宫和胎盘最外层，并在分娩过程中与胎盘一起被排出体外。

作为用于细胞培养的培养基，可以使用用于制备角膜上皮片的已知培养基，例如EpiLife培养基(Cascade Biologics Inc.制造)、DMEM/F12培养基(Invitrogen Corporation制造)、DMEM培养基(Invitrogen Corporation制造)等，并且培养基可以含有已知血清。尽管只要上述细胞可以生长良好，培养温度不具体限制，但是通常为约15℃-45℃。尽管只要上述细胞可以生长良好，培养时间不具体限制，但是通常为约1-30天。

被添加至培养基中用于制备角膜上皮片的本发明多肽可以是用于促进角膜上皮细胞与基底之间的粘附的活性成分。培养基中的多肽浓度通常为0.0001w/v％-0.1w/v％、优选为0.001w/v％-0.01w/v％。本发明的多肽促进基底的细胞外基质与角膜上皮细胞之间的固定，并且可以进行牢固的角膜上皮片的制备，该角膜上皮片通过防止细胞脱落而长时间稳定地发挥功能。

(2)含有本发明多肽的药物

由于本发明的多肽促进细胞与细胞外基质之间的粘附，其可用作细胞粘附促进剂。本发明的粘附促进剂可以用于源于哺乳动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、鸟、绵羊、马、牛、猪、猴子、黑猩猩、人等)的细胞(例如角膜上皮细胞、角膜内皮细胞、结膜细胞等)，优选地用于源于人的角膜上皮细胞。只要能够与细胞粘附，细胞外基质不具体限制并包括(1)纤维状蛋白质例如胶原蛋白、弹性蛋白等，(2)细胞粘附糖蛋白例如纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白等，(3)复合糖例如包含肝素、透明质酸、硫酸软骨素等的糖胺聚糖等，以及由这些细胞外基质组成的基膜(例如前弹力层、后弹力层、羊膜等)。

已报道与细胞外基质的细胞粘附对于细胞存活是重要的(Frisch，S.M.et al.，J.Cell Biol.1994，124，619.，Porcu，M.，et al.，Cornea 2007，26，73.)。还报道了在角膜中，由于作为细胞外基质之一的层粘连蛋白5的消失引起的抑制细胞粘附促进了角膜上皮细胞的死亡。由于本发明的多肽促进角膜上皮细胞粘附至由细胞外基质组成的角膜上皮的基膜(前弹力层等)，它抑制了眼表层上的角膜上皮细胞的死亡。另外，已知由分裂、移动(伸展)和粘附组成的细胞运动参与角膜上皮的修复(Suzuki，K.et al.，Prog.Retin.EyeRes.2003，22，113)。本发明的多肽促进细胞运动中的粘附过程，从而促进角膜上皮损伤(即，创伤或缺损)的修复。

因此，包含本发明多肽的药物对于角膜上皮病症的治疗是有用的。作为引起角膜上皮病症的具体疾病可以是由物理或化学性刺激、过敏、细菌或真菌或病毒感染等引起的角膜炎、角膜溃疡、角膜上皮剥离(角膜糜烂)、角膜上皮浮肿、角膜热伤、化学物质等引起的角膜腐蚀、干眼症、眼球干燥症、慢性表层角膜炎、浅层点状角膜病变、角膜上皮糜烂、持续性角膜上皮缺损等。本发明的多肽对于这些疾病相关的角膜上皮病症的治疗尤其有用。

另外，本发明的多肽具有对源于泪腺腺泡细胞的泪液分泌的促进作用。泪液覆盖由角膜和结膜组成的眼球表面，保持角结膜的湿润性并防止干燥。然而，近年来，由于泪液减少相关的干燥的角结膜表面、戴隐形眼睛过程中干眼、或办公自动化设备操作过程中干眼等，越来越多的人抱怨各种症状例如疲劳感、异物感，即干眼症。干眼症有时伴随由角膜上皮细胞病症引起的角膜上皮病症或角膜上皮糜烂等，严重的情况下可发生角膜溃疡或眼部感染。为了缓解这些与干燥相关的各种症状，使用主要含有盐例如氯化钠等的人工泪液，以及含有羟乙基纤维素、硫酸软骨素或透明质酸等的滴眼剂。但是，就目前情况，还没有发展出令人满意的试剂。虽然这些症状疗法能够减轻症状，但是它不是用于根治性治疗的原因疗法。泪液由于其内在功能而被认为具有治疗干眼引起的角结膜病症的效果，因此，直接作用于泪腺以促进泪液分泌的物质被期待为对于干眼症及干眼症相关疾病有用的预防和治疗药物。

尽管含有本发明多肽的药学产物的剂量形式不具体限制，但是优选为滴眼剂、洗眼剂、眼软膏、片剂等，更优选为滴眼剂或眼软膏。这些可以通过广泛使用的技术制备。例如，滴眼剂可以通过适当地混合添加物例如等渗剂、缓冲剂、pH调节剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、保存剂等来制备。另外，稳定的滴眼剂也可通过添加pH调节剂、增稠剂、分散剂等并悬浮药物来获得。

等渗剂的实例包括甘油、丙二醇、氯化钠、氯化钾、山梨醇、甘露醇等。

缓冲剂的实例包括磷酸、磷酸盐、柠檬酸、醋酸、ε-氨基己酸、氨丁三醇等。

pH调节剂的实例包括盐酸、柠檬酸、磷酸、醋酸、氢氧化钠、氢氧化钾、硼酸、四硼酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠等。

增溶剂的实例包括聚山梨酸酯80、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚乙二醇4000等。

增稠剂和分散剂的实例包括纤维素聚合物例如羟丙基甲基纤维素、羟基丙基纤维素等、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等。另外，稳定剂的实例包括依地酸、依地酸钠等。

常规保存剂的实例包括山梨酸、山梨酸钾、苯扎氯铵、苄索氯铵、对羟基苯甲酸甲脂、对羟基苯甲酸丙脂、氯丁醇等。这些保存剂也可以组合使用。

含有本发明多肽的滴眼剂期望地具有4至8的pH以及约为1的渗透压比。

在含有本发明多肽的药学产物中，本发明多肽的浓度可以根据症状、年龄等设定而不具体限制。例如，当本发明的多肽被包含在滴眼剂、洗眼剂等时，其浓度为0.001w/v％-1w/v％，优选为0.05w/v％-0.5w/v％。例如，在滴眼剂中的剂量是每次滴注一滴至数滴，每天一次至数次。滴眼剂可以是通常的滴注液或当使用时被溶解的滴注液。

含有本发明多肽作为有效成分的药学产物可用于例如哺乳动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、鸟、绵羊、马、牛、猪、猴子、黑猩猩、人等)等。

实施例

下面通过参考实施例对本发明进行详细说明，但实施例不被解释为具有限定性。

实施例1多肽的合成

通过固相合成法合成多肽。具体地，将芴甲氧羰基(Fmoc)基引入氨基酸并用树脂支持该氨基酸。然后，使用二氯甲烷作为溶剂，2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲(HBTU)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)作为交联剂进行酰胺键形成反应。使用DMF/20％哌啶去除保护基。所得的产物通过高效液相色谱(柱：ODS、溶剂：水/乙腈/0.05％TFA)纯化。由此，获得由下列氨基酸序列组成的多肽1-3。

多肽1：VQGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA(SEQ IDNO：3)

白色粉末MALDI-TOF-MS计算值：3750.13；实际值：3752.27；纯度(HPLC A/A％)96.207％

多肽2：

QGTAKVTS SRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKAGKGMHGGVPGG(SEQID NO：4)

白色粉末MALDI-TOF-MS计算值：4588.35；实际值：4590.14；纯度(HPLC A/A％)96.88％

多肽3：

QGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKAGKGMHGGVPGGKQFIENGSEF(SEQ ID NO：5)

白色粉末MALDI-TOF-MS计算值：5768.64；实际值：5767.61；纯度(HPLC A/A％)95.15％

实施例2多肽的合成

通过固相合成法合成多肽。具体地，将芴甲氧羰基(Fmoc)基引入氨基酸并用树脂支持该氨基酸。并且，使用二氯甲烷作为溶剂以及2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲(HBTU)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)作为交联剂进行酰胺键形成反应。使用DMF/20％哌啶去除保护基。所得的产物通过高效液相色谱(柱：ODS、溶剂：水/乙腈/0.05％TFA)纯化。由此，获得由下列氨基酸序列组成的多肽6和7。

多肽6：

QGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA(SEQ ID NO：1)

白色粉末MALDI-TOF-MS计算值：3653.27；实际值：3652.28；纯度(HPLC A/A％)99.26％

多肽7：

EISGPAEPASPPETTTTAQETSAAAVQGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA(SEQ ID NO：8)

白色粉末MALDI-TOF-MS计算值：6148.92；实际值：6146.82；纯度(HPLC A/A％)87.47％

对比实施例1

以上述实施例1相同的方法，得到由下列氨基酸序列组成的多肽4和5。

多肽4：EISGPAEPASPPETTTTAQETSAAAVQGTAKVT(SEQ ID NO：6)

白色粉末MALDI-TOF-MS计算值：3197.56；实际值：3199.98；纯度(HPLC A/A％)99.53％

多肽5：QGTAKVTSSRQELNPL(SEQ ID NO：7)

白色粉末MALDI-TOF-MS计算值：1728.94；实际值：1728.82；纯度(HPLC A/A％)98.01％

实验实施例1：催泪蛋白的部分肽对人角膜上皮细胞向细胞外基质粘附的促进作用

将细胞外基质溶液(10μg/mL，胶原蛋白型IV：Becton，Dickinson and Company)加入96孔板(Iwaki Glass Company，Limited)。将溶液在37℃培养1小时以用细胞外基质包覆板。除去过量的细胞外基质溶液后，加入0.1％的BSA溶液(Sigma-Aldrich Co.)以封闭没有用细胞外基质包覆的区域。接着，去除BSA溶液并用PBS洗涤板2次，将实施例1和对比实施例1合成的多肽1-5(浓度100μg/mL)以每孔50μL添加。而且，将建立的人角膜上皮细胞(HCE-T：可通过Invest Ophthalmol Vis Sci.1995，36，614所描述的方法制备)在无血清的条件下过夜培养，并以2×10⁴个细胞/100μL DMEM/F12培养基/孔添加至板。将板在37℃温育20分钟以使细胞粘附于板。通过MTT测试(DOJINDO LABORATORIES)计算所粘附细胞的数量。以未添加多肽作为100％计算细胞粘附比率并显示于表1。

表1

从表1明确可知，含有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽1至3被确定为具有促进角膜上皮细胞与细胞外基质之间的细胞粘附的活性。

实验实施例2：催泪蛋白的部分肽对人角膜上皮细胞向细胞外基质的粘附促进作用

将细胞外基质溶液(10μg/mL，胶原蛋白型IV：Becton，Dickinson and Company)加入96孔板(Iwaki Glass Company，Limited)。将溶液在37℃培养1小时以用细胞外基质包覆板。除去过量的细胞外基质溶液后，加入0.1％BSA溶液(Sigma-Aldrich Co.)以封闭没有用细胞外基质包覆的区域。接着，去除BSA溶液并用PBS洗涤板三次，将实施例2和对比实施例1合成的多肽4、6和7悬浮在PBS中至终浓度10μM，并将悬浮液以每孔50μL添加。而且，将建立的人角膜上皮细胞(HCE-T：可通过Invest Ophthalmol Vis Sci.1995，36，614所描述的方法制备)在无血清的条件下过夜培养，并以2×10⁴个细胞/100μL DMEM/F12培养基/孔添加至板。将板在37℃温育25分钟以使细胞粘附于板。通过MTT测试(DOJINDO LABORATORIES)计算所粘附细胞的数量。以未添加多肽作为100％计算细胞粘附比率并显示于表2。

表2

实验实施例3：催泪蛋白的部分肽对源于猴泪腺腺泡细胞的泪液蛋白质分泌的促进作用

将猴泪腺在DMEM/F12培养基(Invitrogen Corporation)中切碎，并用含有0.76mg/mL EDTA(Sigma-Aldrich Co.)的HBSS(Invitrogen Co.)与含有200U/mL胶原酶A(Roche)、698U/mL透明质酸酶(Worthington Biochemical Corporation)和10U/mL DNase(Roche Diagnostics K.K.)的DMEM/F12培养基处理，将细胞分离。将1x10⁶个细胞接种在用0.01mg/cm²胶原蛋白I(Becton，Dickinson and Company)包覆的6孔板(ASAHI GLASS Co.，LTD.)上，并在CO₂培养箱中在37℃培养过夜。次日，将培养基更换为不含添加物的DMEM/F12培养基并在37℃将细胞预温育30分钟，然后在含有1μM多肽1或4的DMEM/F12培养基中在37℃温育10分钟。通过免疫印迹法检测作为培养基中分泌的泪液蛋白质的乳铁蛋白，并使用人乳铁蛋白(Sigma-Aldrich Co.)为标准进行定量。回收的培养基用2D clean upkit(Bio-rad Co.)进行纯化，溶解于NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen Co.)中，并在70℃热变性10分钟。将等量的样品在MES缓冲液(Invitrogen Co.)中的4-12％NuPAGE Bis Tris凝胶上以200V进行电泳35分钟，并使用Trans Blot Mini Cell(Bio-Rad Laboratories，Inc.)在100V在PVDF膜(Nihon Millipore K.K.)上进行60分钟印迹。膜用含有5％脱脂牛奶(Bio-rad Laboratories，Inc.)的TTBS(Bio-rad Laboratories，Inc.)在室温封闭30分钟，并与1000倍稀释的乳铁蛋白抗体(在兔中制备，Sigma-Aldrich Co.)在4℃反应过夜。用TTBS洗涤膜后，将膜在室温与稀释5000倍的抗兔HRP的第二抗体反应60分钟。然后使用ECL plus(GE healthcare)进行检测。另外，分泌的乳铁蛋白的量通过在同一膜上形成人乳铁蛋白分析曲线并比较条带密度来定量。

如表3所示，包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽1促进泪液蛋白质分泌标记之一的乳铁蛋白的分泌。

表3

制剂实施例1：角膜上皮片制备用培养基

将4毫升HCGS生长添加剂(内含物：mEGF、氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白和BPE、KURABO INDUSTRIES LTD.目录号：KC-6150)和15mg多肽1添加至EpiLife培养基(角膜上皮细胞基础培养基，Cascade Biologics，目录号：M-EPI-500-CA)以产生培养基(总量500mL)。

制剂实施例2：含有催泪蛋白部分肽的的滴注液

通过常规方法制备如下所示的滴注液。

多肽1        0.1g

磷酸二氢钠   0.1g

氯化钠       0.9g

氢氧化钠     适量

灭菌的纯化水 适量

总量         100mL(pH7)

本申请以在日本提出的专利申请号2008-071065为基础，其内容全部并入本文。

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Claims (10)

1.一种多肽，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列并具有70个残基以下的氨基酸长度。

2.一种多肽，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，其中1至3个氨基酸被缺失、置换或添加，具有与权利要求1所述的多肽等同的活性并且具有70个残基以下的氨基酸长度。

3.根据权利要求1所述的多肽，其中SEQ ID NO：1所示氨基酸序列以外的部分由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分序列组成。

4.一种多肽，其由根据权利要求3所述的多肽的氨基酸序列组成，其中1至3个氨基酸被缺失、置换或添加，并且具有与根据权利要求3所述的多肽等同的活性。

5.根据权利要求1所述的多肽，其由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的部分序列组成。

6.一种多肽，其由根据权利要求5所述的多肽的序列组成，其中1至3个氨基酸被缺失、置换或添加，并且具有与权利要求5所述的多肽等同的活性。

7.一种多肽，其由SEQ ID NO：3-5任一项所示的氨基酸序列组成。

8.一种多肽，其由SEQ ID NO：3～5任一项所示的氨基酸序列组成，其中1至3个氨基酸被缺失、置换或添加，并且具有与根据权利要求7所述的多肽等同的活性。

9.一种细胞粘附促进剂，其包含权利要求1至8任一项所述的多肽。

10.一种促进细胞粘附的方法，其包括将根据权利要求1至8任一项所述的多肽以有效浓度与细胞接触。