KR20240040088A

KR20240040088A - R-스폰딘 단백질의 재조합 변이체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20240040088A
Application number: KR1020247005290A
Authority: KR
Inventors: 파트릭 콜롬바트; 파올로 보티
Original assignee: 디오젠엑스; 상뜨르 나쇼날 드 라 러쉐르쉬 샹띠피끄; 유니베르시테 코트 다쥐르; 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔)
Priority date: 2021-07-15
Filing date: 2022-07-15
Publication date: 2024-03-27
Also published as: AU2022311529A1; IL310154A; CA3225626A1; WO2023285686A3; EP4370535A2; US20230340044A1; WO2023285686A2

Abstract

본 발명은 R-스폰딘 단백질의 재조합 변이체 및 특히 당뇨병 치료를 위한 약제로서의 그들의 용도에 관한 것이다.

Description

R-스폰딘 단백질의 재조합 변이체 및 그의 용도

본 개시내용은 특히 당뇨병 치료를 위한 R-스폰딘 단백질의 재조합 변이체 및 그의 의약으로서의 용도에 관한 것이다.

지난 수십 년 동안 당뇨병은 세계 인구의 거의 9%에 영향을 미치는 전염병 규모의 가장 널리 퍼진 대사 장애 중 하나가 되었다 (WHO, 2016). 2049년까지 당뇨병 환자의 수는 6억 명에 이를 것으로 예상된다. 당뇨병은 높은 혈당 수치를 특징으로 하며, 이는 대부분의 경우 췌장이 충분한 양의 인슐린을 분비하지 못하기 때문에 발생한다. 1형 당뇨병 (T1D)이 인슐린 생성 β-세포의 자가면역 매개 파괴에 의해 유발되는 반면, 2형 당뇨병 (T2D)은 시간 경과에 따른 인슐린 작용에 대한 내성 및 결과적인 β-세포 부전/소실에서 발생한다.

현재의 당뇨병 치료법은 정상혈당을 엄밀히 회복시키는 데 실패하고 있으며, T1D의 경우에는 외인성 인슐린 주사로 인슐린 분비 결함을 대체하는 다소 고식적인 것으로 보이기까지 한다. 따라서 췌장을 새로운 기능적 β 세포를 보충하고 및/또는 나머지 β 세포의 건강을 유지하는 것은 두 가지 병태의 치료를 위한 핵심 전략을 나타낸다. 그러나 현재까지 특히 1형 당뇨병을 앓고 있는 인간 환자에서 췌장 베타 세포의 손실을 예방하거나 그의 증식을 유도하는 유효한 치료법은 없다.

Rspo1은 시스테인-풍부 분비 단백질 패밀리에 속하며, 이 패밀리는 또한 Rspo2, Rspo3 및 Rspo4를 포함한다. 이들은 도 1에 개시되는 것과 같은 구조적으로 및 기능적으로 상이한 4개의 도메인을 포함하여 공통의 구조적 아키텍처를 공유한다. N-말단에서, 신호 펩티드 서열은 표준적인 분비 경로에서의 R-스폰딘 단백질의 정확한 진입을 보장한다. 성숙한 분비된 형태는 2개의 아미노 말단 시스테인-풍부 퓨린-유사 반복부(FU1 및 FU2)를 포함하며, 이는 R-스폰딘 특이적 수용체 LGR(류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체) 4-6과의 상호 작용에 중요하다 (de Lau, W.B., Snel, B. & Clevers, H.C. Genome Biol 13, 242, doi:10.1186/gb-2012-13-3-242 (2012)). 상기 단백질의 중앙 부분은 세포외 기질의 특정 성분과의 상호작용에 관여하는 트롬보스폰딘 유형-1 반복 도메인 (TSP1) 하나를 함유하고, 그 역할이 아직 명확하지 않은 카르복시-말단 염기성 아미노산 풍부 도메인이 그 뒤를 따른다. R-스폰딘 단백질은 세포 증식 (Kim, K. A. et al. Science 309, 1256-1259, doi:10.1126/science.1112521 (2005); Da Silva, F. et al. Dev Biol 441, 42-51, doi:10.1016/j.ydbio.2018.05.024 (2018)), 세포 선별화 (cell specification)(Vidal, V. et al. Genes Dev 30, 1389-1394, doi:10.1101/gad. (2016)) 및 성 결정(Chassot, A. A. et al. Hum Mol Genet 17, 1264-1277, doi:10.1093/hmg/ddn016 (2008))과 같은 과정에서 핵심적인 역할을 하는 것으로 보고되었고 및 이들은 표준적인 WNT 신호 전달 경로 (WNT/β-카테닌 또는 cWNT 경로로도 알려져 있음)의 중추 조절자로서 보고되었다 (Jin, Y. R. & Yoon, J. K. The R-spondin family of proteins: emerging regulators of WNT signaling. Int J Biochem Cell Biol 44, 2278-2287, doi:10.1016/j.biocel.2012.09.006 (2012)).

cWNT 경로가 췌장 성숙 및 기능에 관여할 가능성에 의해 제기된 많은 관심에도 불구하고 (Scheibner et al 2019, Curr Opin Cell Biol. 61:48-55), R-스폰딘 단백질의 역할과 기여는 이 기관에서 제대로 조사되지 않았다.

시험관 내 분석은, Rspo1의 존재하에 Min6 종양 유래 세포주에서 β-세포 증식 및 기능이 증가한다고 보고하였다 (Wong, V. S., Yeung, A., Schultz, W. & Brubaker, P. L. R-spondin-1 is a novel beta-cell growth factor and insulin secretagogue. J Biol Chem 285, 21292-21302, doi:10.1074/jbc.M110.129874 (2010)). 그러나 같은 그룹의 더 최근 연구는 상반된 진술: 마우스의 Rspo1 결핍은 β-세포 매쓰 증가 및 혈당 조절 향상과 관련되어 있음을 보고하였다 (Wong, V. S., Oh, A. H., Chassot, A. A., Chaboissier, M. C. & Brubaker, P. L. Diabetologia 54, 1726-1734, doi:10.1007/s00125-011-2136-2 (2011) and Chahal et al 201, Pancreas Vol 43(1) pp 93-102).

후자의 연구와 대조적으로, PCT/EP2021/050289는 재조합 Rspo1 단백질을 이용한 처리가, 당뇨병 마우스 모델에서 기능적 췌장 베타 세포의 생체 내 증식을 유도하고, 내당능을 개선하며 글루코오스-자극 인슐린 분비 (GSIS)를 증가시킨다는 것을 보고한다. 또한, 거의 완전한 베타 세포 제거 시 나머지 베타 세포들이 Rspo1 단백질 투여로 유도되어 정상 혈당을 유지할 수 있는 기능적 베타 세포 매쓰를 증식 및 재구성할 수 있음이 제시된다. 마지막으로, Rspo1이 인간의 베타 세포 증식을 유도하여 재조합 Rspo1 단백질을 이용하여 인간에서 당뇨병 치료 및 예방에 예상치 못한 새로운 길을 열어줄 수 있음이 보여진다.

수용체 결합 및 생물학적 활성에 대한 RSPO1 중요 잔기는 예를 들어 [Wang et Al. GENES & DEVELOPMENT 27:1339-1344, 2013]; [Xie et Al. EMBO reports VOL 14 | NO 12 | 2013]; [Xu et Al. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 290, NO. 4, pp. 2455-2465, January 23, 2015]에 개시된다. ZNRF3 및 LGR4 수용체 양자 모두의 결합 및 활성에 대한 주요 잔기가 표시되어 있으며 또한 도 1에 보고되어 있다.

생물학적 의약으로 사용하기 위한 그들의 개발 가능 특성 및 약리학적 특성을 최적화하기 위해 여전히 Rspol-유래 단백질을 더욱 개선할 필요가 있다.

따라서 본 개시내용의 목적은 예를 들어 당뇨병 치료에 있어서, 약물로서 그들의 사용을 위한 R-스폰딘 단백질의 신규한 재조합 변이체를 제공하는 것이다.

상세한 설명

정의

본 개시내용이 보다 쉽게 이해될 수 있도록 먼저 특정 용어를 정의한다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.

"아미노산"이라는 용어는 자연 발생 및 비천연 아미노산 (본원에서 "비-자연 발생 아미노산"으로도 지칭됨), 예를 들어 자연 발생 아미노산과 유사하게 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 인코딩되는 것들 뿐 아니라 나중에 변형되는 것들로, 예컨대 하이드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는 화합물을 지칭하며, 예컨대 수소에 결합된 알파 탄소, 카르복실기, 아미노기 및 R기, 예컨대 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄이다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 가질 수 있지만 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 다른 구조를 갖지만 자연 발생 아미노산과 유사하게 기능하는 화합물을 지칭한다. 용어 "아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 본원 전체에 걸쳐 상호교환적으로 사용된다.

치환은 자연 발생 아미노산을 다른 자연 발생 아미노산 또는 비천연 아미노산으로 대체하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 합성 펩티드의 화학적 합성 중에 천연 아미노산은 다른 자연 발생 아미노산 또는 비천연 아미노산으로 쉽게 대체될 수 있다. 대안적으로, 치환은, 하나의 코돈을 상이한 아미노산 잔기를 코딩하는 또 다른 코돈으로 변경시키기 위해 유전자 코딩 서열을 돌연변이시킴으로써 일어날 수 있다. 돌연변이된 코딩 서열의 발현에 의해 획득된 결과물 폴리펩티드는 하나의 아미노산 치환 (하나의 아미노산이 또 다른 상이한 아미노산으로 대체됨)을 갖는다.

본 명세서에 사용된 바, 용어 "단백질"은 하나 이상의 선형 사슬 ("폴리펩티드 사슬"로도 지칭됨)로 배열되고 구형 형태로 접힌 아미노산으로 만들어진 임의의 유기 화합물을 지칭한다. 이는, 단백질성 물질 또는 융합 단백질을 포함한다. 이러한 폴리펩티드 사슬의 아미노산은 인접한 아미노산 잔기의 카르복실기와 아미노기 사이의 펩티드 결합에 의해 함께 연결될 수 있다. 용어 "단백질"은 또한 제한없이, 펩티드, 단일 사슬 폴리펩티드 또는 주로 2개 이상의 아미노산 사슬로 구성된 임의의 복합 단백질을 포함한다. 이는, 제한없이, 당단백질 또는 기타 공지된 번역-후 변형을 포함한다. 이는 또한 제한없이, 글리코엔지니어링, 페길화, 헤실화, 파실화 등과 같은 천연 단백질의 공지된 천연 또는 인공적 화학적 변형, 비천연 아미노산의 혼입, 화학적 컨쥬게이션 또는 기타 분자 등을 위한 아미노산 변형 등을 포함한다.

본 명세서에 사용된 바 용어 "재조합 단백질"은, 상응하는 단백질을 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 형질감염종 등으로부터 단리된 융합 단백질과 같은, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 단백질을 포함한다.

본 명세서에 사용된 바 용어 "융합 단백질"은, 유전적 융합에 의해, 예를 들어 별개의 단백질의 별개의 기능적 도메인을 인코딩하는 2개 이상의 유전자 단편의 유전적 융합에 의해 수득되거나 수득가능한 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 재조합 단백질을 지칭한다. 따라서, 본 개시내용의 단백질 융합체는 하기에 기재된 바와 같은 R-스폰딘 폴리펩티드 또는 그의 변이체 중 적어도 하나, 및 적어도 하나의 다른 모이어티를 포함하며, 상기 다른 모이어티는 하기에 기재되는 바와 같은 R-스폰딘 폴리펩티드 또는 그의 변이체 이외의 폴리펩티드이다. 특정 구현예에서, 상기 다른 모이어티는 또한 예를 들어 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 모이어티 또는 다른 화학적 모이어티 또는 컨쥬게이트와 같은 비단백질 모이어티일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제2 모이어티는 항체의 Fc 영역일 수 있으며, 이러한 융합 단백질은 그러므로 ≪Fc 융합 단백질≫이라고 지칭된다.

본 명세서에 사용된 바 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용되며, 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는데, 이는 천연 인간 Fc 영역에 대하여 바람직하게는 5, 10, 15 또는 20개 이하의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 함유하는 것이다. 천연 인간 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA, IgD, IgE 또는 IgM 이소타입 중 어느 하나일 수 있다. 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 IgG 항체의 위치 C226 또는 P230에서 카르복실 말단까지의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 정의된다. Fc 영역의 잔기 번호매김은 Kabat의 EU 인덱스의 것이다. Fc 영역의 C-말단 라이신 (잔기 K447)은 예를 들어 Fc 융합 단백질의 생산 또는 정제 동안 제거될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은, 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 그 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100). 2개 서열 간의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 하기에 기술된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.

두 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성은 Needleman 및 Wunsch 알고리즘 (NEEDLEMAN 및 Wunsch)을 사용하여 결정할 수 있다.

2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성 또한 예를 들어 EMBOSS Needle과 같은 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다 (쌍 방식 정렬; www.ebi.ac.uk에서 이용 가능, Rice et al 2000 Trends Genet 16:276-277). 예를 들어, EMBOSS Needle은 BLOSUM62 매트릭스, "갭 오픈 페널티" 10, "갭 익스텐드 페널티" 0.5, 거짓 "엔드 갭 페널티", "엔드 갭 오픈 페널티" 10 및 "엔드 갭 익스텐드 페널티" 0.5로 이용될 수 있다. 일반적으로 "퍼센트 동일성"은 매칭 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나누고 100을 곱한 함수이다. 예를 들어, 정렬 후 10개의 서열 위치 중 6개의 서열 위치가 두 개의 비교되는 서열 사이에서 동일한 경우, 상기 동일성은 60%이다. % 동일성은 일반적으로, 분석이 수행되는 쿼리 서열의 전체 길이에 걸쳐 결정된다. 동일한 1차 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 갖는 2개의 분자는 임의의 화학적 및/또는 생물학적 변형에 관계없이 동일하다.

본 명세서에 사용된 바 용어 "대상체"는 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. "비인간 동물"이라는 용어는 바람직하게는 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말 등과 같은 포유동물을 포함한다.

본 명세서에 사용된 바 용어 <<R-스폰딘 단백질>>은 각각 상응하는 Rspol, Rspo2, Rspo3, Rspo4 유전자에 의해 인코딩되는 천연 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 또는 R-스폰딘 4 단백을 지칭한다 (본 명세서에서는 Rspol, Rspo2, Rspo3, Rspo4 단백질로도 지칭됨).

천연 R-스폰딘 단백질은 일반적으로, N 말단부터 C 말단까지, 신호 펩티드 (SP), 2개의 시스테인-풍부 퓨린-유사 도메인 (FU1 및 FU2), 상기 FU2 도메인 및 TSP 도메인 사이의 N-글리코실화 부위, 트롬보스폰딘 (TSP1) 모티프 (TSP), 및 잠재적인 O-글리코실화 부위를 비롯한 염기성 아미노산 풍부 (BR) 도메인을 포함한다.

도 1은 서로 다른 도메인 FU1, FU2, TSP 및 BR의 개략도와 함께 Rspol, Rspo2, Rspo3 및 Rspo4 아미노산 서열의 정렬을 제공한다. 본 발명의 설명 전반에 걸쳐, Rspol의 아미노산 위치 또는 Rspo2, Rspo3 및 Rspo4에서의 "등가 아미노산 위치"를 언급할 때, "등가" 아미노산 위치를 확인하기 위해 도 1의 정렬을 참조해야 한다. 유사하게, Rspo1의 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4 "등가" (또는 대응하는) 도메인은 도 1의 정렬을 참조하여 확인할 수 있다. 전장의 인간 Rspol, Rspo2, Rspo3 및 Rspo4 아미노산 서열 (그들의 신호 펩티드 포함)이 각각 SEQ ID NOs: 1-4에 기재되어 있다. 인간 Rspol의 FU1, FU2, TSP 및 BR 도메인의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NOs: 5-8에 기재되어 있다. 인간 Rspo2의 FU1, FU2, TSP 및 BR 도메인의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NOs: 9-12에 기재되어 있다. 인간 Rspo3의 FU1, FU2, TSP 및 BR 도메인의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NOs: 13-16에 기재되어 있다. 인간 Rspo4의 FU1, FU2, TSP 및 BR 도메인의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NOs: 17-20에 기재되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 바 용어 "키메라 단백질"은, 특정 단백질 내의 하나 이상의 도메인이 동일한 패밀리의 단백질의 등가 도메인으로 대체되는 것을 포함하는 단백질을 의미한다. 예를 들어, Rspol의 키메라 단백질은 Rspol FU1 도메인이 Rspo2의 상응하는 FU1 도메인으로 대체될 수 있으며, 천연 Rspol 단백질과 동일한 다른 도메인 (예컨대, FU2, TSP 또는 BR 도메인)을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바 용어 "하이브리드 도메인"은 일부 아미노산 잔기가 동일한 패밀리의 다른 구성원의 등가 잔기로 돌연변이된, 단백질의 도메인을 의미한다. 예를 들어, R-스폰딘 단백질의 하이브리드 FU1 도메인은, 하나 이상의 아미노산 잔기를 Rspo2 FU1 도메인 내 등가 잔기로 대체하기 위해 만들어진 일부 돌연변이를 갖는 Rspo2 FU1 도메인에 대응할 수 있다.

본 개시내용의 변이체

본 개시내용은 다음의 FU1, FU2, TSP 및 BR 도메인을 포함하는 천연 R-스폰딘 단백질의 재조합 변이체에 관한 것이며, 여기서:

- FU1은 각각 SEQ ID NO: 5, 9, 13 및 17에 표시된 인간 Rspol, Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 FU1 도메인 중 하나와 최소 80% 동일성을 갖는 도메인이고,

- FU2는 각각 SEQ ID NO: 6, 10, 14, 18에 표시된 인간 Rspol, Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 FU2 도메인 중 하나와 최소 80% 동일성을 갖는 도메인이고,

- TSP는 SEQ ID NO: 7, 11, 15, 19에 표시된 인간 Rspol, Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 TSP 도메인 중 하나와 최소 80% 동일성을 갖는 도메인이고,

- BR은 SEQ ID NO: 8, 12, 16, 20에 표시된 인간 Rspol, Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 BR 도메인 중 하나와 최소 80% 동일성을 갖는 도메인이다.

위에서 정의된 천연 R-스폰딘 단백질의 이러한 재조합 변이체는 이하 "본 개시내용의 변이체" 또는 "Rspol 변이체"로 지칭될 것이다.

용이하게 읽을 수 있도록, 이하에 기술되는 바 본 개시내용의 변이체의 서열은 항상 어떠한 신호 펩티드 서열 없이 기술될 것이다. 그러나, 본 명세서에 개시되는 모든 변이체는 N-말단 신호 펩티드 (SP) 서열, 특히 Rspol, Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 (SP) 서열 중 하나, 통상 Rspol 단백질의 아미노산 잔기 1-20을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 본 개시내용의 변이체는 일반적인 신호 서열을 결여할 수도 있으며 대신 이를 대체하는 다른 신호 서열을 갖는다. 신호 서열의 선택은 그 재조합 단백질이 생산될 숙주 세포의 유형에 따라 달라지며, 서로 다른 신호 서열이 천연 신호 서열을 대체할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 변이체는 예를 들어 정제를 위해 그들의 C-말단에 추가적인 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 모든 변이체는 또한 6개의 히스티딘 잔기를 포함하는 SEQ ID NO: 90의 폴리히스티딘 태그와 같은 C-말단 태그를 포함할 수 있다.

변이체의 특정 구현예에서, 각각의 도메인 FU1, FU2, TSP 및 BR은 SEQ ID NO:1의 인간 Rspol 도메인의 각각의 FU1, FU2, TSP 및 BR 도메인과 적어도 80% 동일성을 갖는다.

특정 구현예에서, TSP 및 BR 도메인은 각각 상응하는 인간 Rspol TSP 및 BR 도메인과 100% 동일성을 갖고, FU1 및 FU2 도메인 아미노산 서열은 인간 Rspol FU1 및 FU2 대응 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하며, 차이는 아미노산 치환으로 인한 것이다.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 변이체는 각각 상응하는 SEQ ID NO: 5의 인간 Rspol FU1 도메인 또는 SEQ ID NO: 6의 인간 Rspo1 FU2 도메인과 정렬했을 때 FU1 또는 FU2 도메인 각각에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는다.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 변이체는 다음을 포함하는 키메라 단백질이다:

(i) SEQ ID NO: 9의 Rspo2 FU1 내 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 하이브리드 Rspo2 FU1 도메인, 및

(ii) SEQ ID NO:6과 동일하거나, SEQ ID NO:6과 비교하여 FU2 도메인 내 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 Rspo1 FU2 도메인.

바람직하게는, 본 개시내용의 변이체 또는 본 명세서에 기술된 그의 기능적 등가물은 SEQ ID NO: 41의 Rspol 단백질과 적어도 유사한 수준으로 다음 특성 중 하나 이상을 나타낸다:

(i) 이들은, 예를 들어 시험관 내 Min6 베타-세포 증식 분석에서 측정되는 바, SEQ ID NO: 41의 레퍼런스 인간 Rspol과 적어도 유사한 수준으로 기능성 베타-세포의 증식을 유도한다; 및/또는

(ii) 이들은, 예를 들어 생체 내 베타-세포 증식 분석에서 측정되는 바, SEQ ID NO: 41의 레퍼런스 인간 Rspol과 적어도 유사한 수준으로 기능성 베타-세포의 증식을 유도한다;

(iii) 선택적으로, 이들은, 예를 들어 SPR 또는 ELISA 분석으로 측정되는 바, Rspo1/LGR4 결합 친화도 시험관 내 분석에서 측정 시, SEQ ID NO:41의 레퍼런스 인간 Rspol과 적어도 동일한 친화도로 LGR4 수용체에 결합한다;

(iv) 선택적으로, 이들은, 예를 들어 SPR 또는 ELISA 분석으로 측정되는 바, Rspo1/ZNRF3 결합 친화도 시험관 내 분석에서 측정 시, SEQ ID NO:41의 레퍼런스 인간 Rspol과 적어도 동일한 친화도로 ZNRF3 수용체에 결합한다;

(v) 선택적으로, 이들은, 예를 들어 Top Flash 분석으로 측정되는 바, 시험관 내 측정시, Wnt/베타-카테닌 경로를 강화한다.

본 개시내용의 변이체는, 특히 인간의 당뇨병 치료 및/또는 생체 내 또는 시험관 내에서 췌장 베타-세포의 증식을 유도하기 위한 약제로서 유리하게 사용될 수 있다.

A. N-말단 잔기의 아미노산 결실

본 발명자들은 놀랍게도 Rspol 단백질의 잔기 21-31의 결실이 SEQ ID NO: 41의 천연 Rspol 단백질과 비교할 때 Min6 증식 분석에서 더 활성인 단백질이라는 결과를 낳는다는 것을 발견했다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 개시내용의 변이체는 Rspo1의 영역 21-33 내 또는 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 등가 영역 내에서, 처음 10-14개의 N-말단 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 통상, 본 개시내용의 변이체는 Rspol의 영역 21-33 내 10-14개 N-말단 아미노산 잔기의 결실을 갖는 Rspol 단백질이다.

보다 구체적으로, 본 개시내용의 변이체는 SEQ ID NO: 24의 단백질을 포함하거나 이로 구성되며, 이 단백질은 Rspol의 아미노산 잔기 21-31이 결실된 인간 Rspol에 상응한다 (실시예에 개시된 변이체 #009 참조).

B. 베타-세포 증식을 증가시키기 위한 FU1 도메인 내 아미노산 치환.

ZNRF3에 대한 Rspol 결합을 감소시키거나 제거하는 Rspol FU1 도메인 내 돌연변이 R66A는 Xie et al. (EMBO reports VOL 14 | NO 12 | 2013)에 기술되었다.

본원에 사용되는 바, ZNRF3은 Wnt 수용체 복합체 성분인 Frizzled 및 LRP6의 유비퀴틴화 및 후속 분해를 매개함으로써 Wnt 신호전달 경로의 음성 조절인자로서 작용하는 E3 유비퀴틴-단백질 리가제를 의미한다. 이는 표준 (canonical) 및 비-표준 Wnt 신호 전달 경로 모두에 작용한다. R스폰딘 단백질, 특히 Rspol은 ZNRF3에 결합하고 R-스폰딘의 신호전달 활성에 필요한 것으로 기술되었다 (Xie et al. EMBO reports VOL 14 | NO 12 | 2013). ZNRF3 단백질은 Uniprot 데이터베이스에 등록 번호 Q9ULT6 및 NCBI Entrz 유전자 번호 84133으로 기재되어 있다.

본 발명자들은 Rspol의 돌연변이 R66A가 Min6 증식 분석에서 Rspol 기능을 제거하지 않았을 뿐만 아니라, 놀랍게도, 그 활성을 향상시켰다는 것을 발견하였다.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 변이체는 유리하게는, 적어도, SEQ ID NO: 5의 인간 Rspol FU1 도메인 내 잔기 R66의, 또는 인간 Rspo2, Rspo3, 또는 Rspo4 FU1 도메인 서열 내 등가의 아르기닌의 ZNFR3 결합을 감소시키거나 제거하는 아미노산 치환을 포함한다.

임의의 변이체의 ZNRF3에 대한 결합 친화도는 SEQ ID NO: 41의 레퍼런스 인간 Rspol 단백질의 ZNRF3에 대한 상응하는 결합 친화도와 비교될 수 있다. ZNRF3에 대한 결합 친화도를 측정하는 방법은 실시예에 기재되어 있으며, 예를 들어 하기 실시예에 개시된 ZNRF3 결합 분석을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바, ZNRF3 결합의 감소는, 결합 친화도가 SEQ ID: 41의 레퍼런스 Rspol로 측정된 상응하는 결합 친화도보다 상당히 더 낮고, 바람직하게는 적어도 20% 더 낮고, 바람직하게는 적어도 30%, 40%, 50% 더 낮다는 것을 의미한다. 결합이 검출 가능한 수준보다 낮거나 비-특이적 결합 단백질과 유사한 경우, 결합은 제거된다.

통상, 본 개시내용의 상기 변이체는 ZNRF3 결합을 감소시키거나 제거하는 잔기 R66의 단일 아미노산 치환, 통상 R66A을 갖는 SEQ ID NO:5의 Rspol FU1 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 상기 변이체는 ZNRF3 결합을 감소시키거나 제거하는 잔기 R66의 단일 아미노산 치환, 통상 R66A을 갖는 SEQ ID NO:5의 Rspol FU1 도메인을 포함하고, 상기 FU2, TSP 및 BR 도메인은 각각 Rspol FU2, TSP 및 BR 도메인과 95%, 바람직하게는 100% 동일하다.

예를 들어, 본 개시내용의 변이체는 SEQ ID NO:23 (하기 실시예에 개시된 변이체 #008에 대응함)을 포함하거나 본질적으로 이로 구성된다.

C. LGR4 및/또는 ZNRF3에 대한 결합을 증가시키기 위한 FU1 및 FU2 도메인 내 아미노산 치환

본 개시내용의 변이체는 SEQ ID NO:41의 천연 Rspol과 비교하여 LGR4 및/또는 ZNRF3에 대한 그의 결합 친화도를 증가시키기 위해 FU1 및/또는 FU2 도메인 내에 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다.

임의의 변이체의 LGR4 및/또는 ZNFR3에 대한 결합 친화도는 SEQ ID NO: 41의 레퍼런스 인간 Rspol 단백질의 ZNRF3 또는 LGR4에 대한 상응하는 결합 친화도와 비교될 수 있다. ZNRF3 또는 LGR4에 대한 결합 친화도를 측정하는 방법은 실시예에 기재되어 있으며, 예를 들어 하기 실시예에 개시된 ZNRF3 결합 분석을 포함한다. 본원에 사용된 바 ZNRF3 또는 LGR4 결합의 증가는, 결합 친화도가 SEQ ID NO:41의 레퍼런스 Rspol로 측정되는 상응하는 결합 친화도보다 상당히 더 높고, 바람직하게는 적어도 10% 더 높고, 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 더 높다는 것을 의미한다.

LGR4 및/또는 ZNRF3에 대한 결합 친화도와 관련된 아미노산 잔기 및 가능한 아미노산 돌연변이는 특히 [Wang et Al. GENES & DEVELOPMENT 27:1339-1344, 2013]; [Xie et Al. EMBO reports VOL 14 | NO 12 | 2013]; [Xu et Al. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 290, NO. 4, pp. 2455- 2465, January 23, 2015]에 기술되었다.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 상기 변이체는 LGR4에 대한 결합 친화력을 증가시키기 위해 Rspo1의 위치 H108, N109, E116, L118, P127, A128, S133, A136, G138 또는 S143 또는 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 상응하는 잔기에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 보다 구체적인 구현예에서, 본 개시내용의 상기 변이체는 Rspol FU2의 다음 아미노산 치환: H108K, H108R, N109D, N109E, E116V; L118F; P127D; A128E; S133F; A136L; G138E; S143V 중 하나 이상 또는 Rspol, Rspo3 또는 Rspo4 내 상응하는 잔기를 포함하고, 바람직하게는 Rspol의 것을 포함한다. 더 구체적으로, 본 개시내용의 상기 변이체는 SEQ ID NO:66 (실시예에 기술된 변이체 #049에 상응함), SEQ ID NO:70 (실시예에 기술된 변이체 #054에 상응함), SEQ ID NO:72 (실시예에 기술된 변이체 #056에 상응함), SEQ ID NO:67 (실시예에 기술된 변이체 #050에 상응함), SEQ ID NO:28 (실시예에 기술된 변이체 #051에 상응함), SEQ ID NO:74 (실시예에 기술된 변이체 #068에 상응함), 또는 SEQ ID NO:75 (실시예에 기술된 변이체 #069에 상응함)을 포함하거나 본질적으로 그로 구성된다.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 상기 변이체는, ZNRF3에 대한 결합 친화도를 증가시키기 위하여, Rspol의 위치 E45, L46, E49, V50, N51, K55, S57, I62, L63, D68, P77, F84, D85, N88 또는 I95에, 또는 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 상응하는 잔기에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 상기 변이체는, Rspol FU1의 다음 아미노산 치환: L46S, E49K, V50D, K55R, S57Q, I62F, L63F, D68G, P77H, F84Y, D85Y, N88A 또는 I95A 중 하나 이상 또는 Rspol, Rspo3 또는 Rspo4의 상응하는 잔기를 포함하고, 바람직하게는 Rspo1의 것을 포함한다. 보다 구체적인 구현예에서, 본 개시내용의 상기 변이체는 SEQ ID NO:65 (실시예에 기술된 변이체 #048에 상응함), SEQ ID NO:67 (실시예에 기술된 변이체 50에 상응함), SEQ ID NO:68 (실시예에 기술된 변이체 #052에 상응함), SEQ ID NO:69 (실시예에 기술된 변이체 #053에 상응함), SEQ ID NO:71 (실시예에 기술된 변이체 #055에 상응함), SEQ ID NO:73 (실시예에 기술된 변이체 #057에 상응함)을 포함하거나 본질적으로 그로 구성된다.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 변이체는 다음을 포함한다:

(i) ZNRF3에 대한 결합 친화도를 증가시키기 위하여, Rspol의 위치 E45, L46, E49, V50, N51, K55, S57, I62, L63, D68, P77, F84, D85, N88 또는 I95에서, 또는 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 상응하는 잔기에서 하나 이상의 아미노산 치환; 예를 들어 Rspol FU1의 다음 아미노산 치환: L46S, E49K, V50D, K55R, S57Q, I62F, L63F, D68G, P77H, F84Y, D85Y, N88A 또는 I95A 중 하나 이상 또는 Rspol, Rspo3 또는 Rspo4 내 상응하는 잔기, 바람직하게는 Rspol의 것,

(ii) LGR4에 대한 결합 친화도를 증가시키기 위하여, Rspol의 위치 H108, N109, E116, L118, P127, A128, S133, A136, G138 또는 S143에서, 또는 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 상응하는 잔기에서 하나 이상의 아미노산 치환; 예를 들어, Rspol FU2의 다음 아미노산 치환: H108K, H108R, N109D, N109E, E116V; L118F; P127D; A128E; S133F; A136L; G138E; S143V 중 하나 이상 또는 Rspol, Rspo3 또는 Rspo4 내 상응하는 잔기, 바람직하게는 Rspol의 것.

이러한 변이체의 예에는 변이체 #050 (SEQ ID NO: 67), 변이체 #057 (SEQ ID NO: 73) 및 변이체 #108, -#112가 포함된다.

D. N-글리코실화 부위의 아미노산 결실 또는 치환

본 개시내용의 변이체는 또한 유리하게는 FU2 도메인에서 N-글리코실화 부위를 제거하기 위한 아미노산 결실 또는 치환을 포함할 수 있으므로, 생성된 변이체가, 포유동물 세포주, 예를 들어 CHO 또는 인간 세포주와 같은 진핵 발현 시스템에서 생산되는 경우에도 N-글리코실화되지 않는다.

바람직하게는, 본 개시내용의 상기 변이체는 Rspo1의 잔기 N137 또는 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 등가 잔기에서 아미노산 치환을 포함하여, 이 위치에서 N-글리코실화를 억제하며, 예를 들어 상기 변이체는 Rspo1의 아미노산 치환 N137Q 또는 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4 내 등가 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 상기 변이체는 SEQ ID NO:22 (하기 실시예의 변이체 #005에 대응), SEQ ID NO:54 (하기 실시예의 변이체 #030에 대응)를 포함하거나 본질적으로 그로 구성된다.

E. 키메라 또는 하이브리드 R-스폰딘 단백질

본 개시내용의 변이체는 또한 선택적으로, 이전 섹션 B-D에 기재된 바와 같은 변형 (결실 또는 아미노산 치환) 중 하나 이상을 추가로 포함하는 키메라 R-스폰딘 단백질을 포함한다.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 키메라 변이체는 SEQ ID NO: 9의 Rspo2 FU1 도메인과 100% 동일한 상기 FU1 도메인, 및 (레퍼런스로서 SEQ ID NO:41의 Rspol과 비교하여) LGR4에 대해 적어도 동일한 결합 친화도를 유지하는 아미노산 치환을 가지는 Rspol, Rspo3, Rspo4의 FU2 도메인 또는 이들의 기능적 변이체 중에서 선택되는 상기 FU2 도메인을 포함하며, 바람직하게는 상기 FU2 도메인은 SEQ ID NO:6의 Rspol FU2 도메인과 100% 동일하다.

따라서, 특정 구현예에서, 변이체는 Rspo2의 FU1 도메인을 Rspol, Rspo3, Rspo4의 다른 도메인들 또는 이들의 기능적 등가물과 결합한 키메라 단백질이다.

특정 구현예에서, 변이체는 적어도 Rspol의 아미노산 잔기 144-263의 C-말단 영역 (SEQ ID NO: 49)을 포함하는 키메라 단백질이다.

통상, 이러한 키메라 변이체의 한 예는 SEQ ID NO: 9의 Rspo2 FU1 도메인 및 SEQ ID NO: 6의 Rspol FU2 도메인, 및 선택적으로 SEQ ID NO: 7의 Rspol TSP 도메인 및 SEQ ID NO: 8의 Rspol BR 도메인을 포함하는 변이체로, 바람직하게는 SEQ ID NO:25의 변이체 (실시예에 개시된 변이체 #034에 대응함) 또는 SEQ ID NO:26의 변이체 (실시예에 개시된 변이체 #035에 대응함)이다.

이러한 키메라 변이체의 또 다른 예는 Rspol FU1 도메인 및 Rspo3 FU2 도메인, 및 선택적으로 SEQ ID NO:7의 Rspol TSP 도메인 및 SEQ ID NO:8의 Rspol BR 도메인을 포함하는 변이체로, 바람직하게는 SEQ ID NO:50 또는 51의 변이체 (실시예에 개시된 변이체 #026 또는 변이체 #027에 대응함)이다.

이러한 키메라 변이체의 또 다른 예는 Rspo3 FU1 도메인 및 Rspol FU2 도메인, 및 선택적으로 SEQ ID NO:7의 Rspol TSP 도메인 및 SEQ ID NO:8의 Rspol BR 도메인을 포함하는 변이체로, 바람직하게는 SEQ ID NO:52 또는 53의 변이체 (실시예에 개시된 변이체 #028 또는 변이체 #029에 대응함), 또는 SEQ ID NO:54의 변이체 (변이체 #030에 대응함, N-글리코실화를 억제하기 위한 N137Q 돌연변이를 추가로 포함함)이다.

이러한 키메라 변이체의 또 다른 예는 Rspo2 FU1 및 FU2 도메인, 및 SEQ ID NO:7의 Rspol TSP 도메인 및 SEQ ID NO:8의 Rspol BR 도메인을 포함하는 변이체로, 바람직하게는 SEQ ID NO:55의 변이체 (실시예에 개시된 변이체 #031에 대응함)이다.

이러한 키메라 변이체의 또 다른 예는 Rspo2 FU2 도메인 및 Rspol로부터의 나머지 R-스폰딘 단백질을 포함하는 변이체로, 바람직하게는 SEQ ID NO:56의 변이체 (실시예에 개시된 변이체 #032에 대응함)이다.

이러한 키메라 변이체의 또 다른 예는 Rspol FU1 도메인 및 Rspo2 FU2 도메인, 및 선택적으로 SEQ ID NO:7의 Rspol TSP 도메인 및 SEQ ID NO:8의 Rspol BR 도메인을 포함하는 변이체로, 바람직하게는 SEQ ID NO:57의 변이체 (실시예에 개시된 변이체 #033에 대응함)이다.

이러한 키메라 변이체의 또 다른 예는 Rspo4 FU1 및 FU2 도메인, 및 SEQ ID NO: 7의 Rspol TSP 도메인 및 SEQ ID NO: 8의 Rspol BR 도메인을 포함하는 변이체로, 바람직하게는 SEQ ID NO: 58의 변이체 (실시예에 개시된 변이체 #036에 대응함)이다.

이러한 키메라 변이체의 또 다른 예는 Rspo4 FU2 도메인 및 Rspol로부터의 나머지 R-스폰딘 단백질을 포함하는 변이체로, 바람직하게는 SEQ ID NO:59의 변이체 (실시예에 개시된 변이체 #037에 대응함)이다.

이러한 키메라 변이체의 또 다른 예는 Rspol FU1 도메인 및 Rspo4 FU2 도메인, 및 선택적으로 SEQ ID NO:7의 Rspol TSP 도메인 및 SEQ ID NO:8의 Rspol BR 도메인을 포함하는 변이체로, 바람직하게는 SEQ ID NO:60의 변이체 (실시예에 개시된 변이체 #038에 대응함)이다.

이러한 키메라 변이체의 또 다른 예는 Rspo4 FU1 도메인 및 Rspol FU2 도메인, 및 선택적으로 SEQ ID NO:7의 Rspol TSP 도메인 및 SEQ ID NO:8의 Rspol BR 도메인을 포함하는 변이체로, 바람직하게는 SEQ ID NO:61 또는 62의 변이체 (실시예에 개시된 변이체 #039 또는 변이체 #040에 대응함)이다.

이러한 키메라 변이체의 또 다른 예는 Rspo2 FU1 도메인 및 Rspo4 FU2 도메인, 및 선택적으로 SEQ ID NO:7의 Rspol TSP 도메인 및 SEQ ID NO:8의 Rspol BR 도메인을 포함하는 변이체로, 바람직하게는 SEQ ID NO:63의 변이체 (실시예에 개시된 변이체 #042에 대응함)이다.

상기 키메라 단백질 외에도, Rspo2의 FU1 도메인의 하나 이상의 아미노산 잔기를, Rspo1/ZNRF3 결합 친화도에 중요하다거나 ZNRF3에 대한 결합 친화도을 높인다고 알려진 위치에서 대응하는 Rspol의 하나 이상의 아미노산 잔기로 추가로 대체함으로써, 키메라 단백질의 ZNRF3 결합 활성을 최적화하는 것 역시 가능하다.

통상, 본 개시내용의 변이체는, 위치 E49, V50, D68, D85에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하여, SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:26의 키메라 변이체와 비교하여 ZNRF3에 대한 결합 친화도를 증가시키는 것을 제외하고는 SEQ ID NO:5와 동일한 서열을 갖는 하이브리드 FU1 도메인을 포함하고, 바람직하게는, 그것이 위치 E49, V50, D68, D85에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것을 제외하고는 SEQ ID NO:5의 하이브리드 Rspol FU1 도메인이며, 바람직하게는 다음 아미노산 치환: E49K, V50D, D68G, D85G (Rspol FU1 도메인의 잔기에 대응함) 중 하나 이상을 포함하고, 추가로 FU2 도메인은 Rspol, Rspo2, Rspo3, Rspo4 또는 LGR4에 대해 적어도 동일한 결합 친화도를 유지하는 아미노산 치환을 갖는 이들의 기능적 변이체 중에서 선택되고, 바람직하게는 상기 FU2 도메인은 SEQ ID NO:6의 Rspol FU2 도메인과 100% 동일하다.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 변이체는, 그것이 위치 E49, V50, D68 및 D85에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다는 점을 제외하고는 SEQ ID NO:5 (즉, Rspol FU1 도메인)와 동일한 서열을 갖는 하이브리드 FU1 도메인을 포함하고, 바람직하게는 다음 아미노산 치환: 49K, 50D, 68G, 85G (Rspo2 FU1 도메인의 잔기에 대응함)를 포함하고, 추가로 FU2 도메인은 SEQ ID NO:6의 Rspol FU2 도메인과 100% 동일하다. 예를 들어, 본 개시내용의 변이체는 SEQ ID NO:27 (실시예에 개시된 변이체 #047에 대응함)을 포함하거나 본질적으로 이로 구성된다.

특정 구현예에서, 위에 개시된 본 개시내용의 변이체는 E45L, E49K, V50D, K55R, D68G, D85G, N88A, H108K 및 N109D 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 하이브리드 Rspol FU1 및 Rspol FU2 도메인을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 변이체는 SEQ ID NO: 28 (E45L; E49K; V50D; K55R; D68G; D85G; N88A; H108K 및 N109D 돌연변이를 갖는, 실시예에 개시된 변이체 #051에 대응함)을 포함하거나 본질적으로 이로 구성된다.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 변이체는, 예를 들어 ZNRF3에 대한 결합을 증가시키기 위한 위치 E49, V50, D68 및 D85에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 예컨대 E49K, V50D, D68G, D85G를 포함하는 Rspol FU1 도메인 또는 하이브리드 Rspol FU1 도메인과 조합하여, SEQ ID NO. 10, 14 또는 18의 인간 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4 대응 FU2 도메인을 포함한다.

F. O-글리코실화를 개선하기 위한 BR 도메인 내 아미노산 치환

본 개시내용의 변이체는 SEQ ID NO:41의 Rspol과 비교하여 O-글리코실화를 조절, 최적화 또는 개선하기 위해 BR 도메인에 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다.

O-글리코실화 개선과 관련된 아미노산 잔기에는 특히 Rspol의 아미노산 잔기 T253, T258, S259가 포함될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 상기 변이체는 O-글리코실화를 개선하기 위해 Rspol의 위치 G252, T253, L257, T258, S259, A260, A263 또는 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 상응하는 잔기들에서 다음 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다. 더욱 구체적으로, 본 개시내용의 상기 변이체는 Rspol의 다음 아미노산 치환 G252T, T253E, L257S, T258E, S259E, A260T 또는 A263T, S268E 중 하나 이상 또는 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 사응하는 잔기를 갖는 Rspo1의 BR 도메인을 포함한다.

대조적으로, 변이체가 C-말단 폴리펩티드에 융합되는 경우, O-글리코실화 부위를 돌연변이시키는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 개시내용의 변이체는 융합 단백질이고 다음 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: T253A, T258A, S259A 및 S268A.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 변이체는 SEQ ID NOs: 76-86의 폴리펩티드를 포함하거나 본질적으로 이로 구성된다.

G. 절단된 (truncated) R-스폰딘 활성 단백질.

본 발명자들은 놀랍게도, Rspol 단백질의 잔기 21-31 및 245-263의 결실이, SEQ ID NO:41의 천연 Rspol 단백질과 비교하여 Min6 증식 분석에서 유사한 활성을 결과한다는 것을 발견하였다. 이 단백질은 가장 짧은 활성인 천연 Rspol 단백질을 나타낸다. 보다 구체적으로, 본 개시내용의 변이체는 SEQ ID NO: 94의 단백질을 포함하거나 이로 구성되며, 이 단백질은 Rspol의 32 내지 224번 아미노산 잔기를 포함하는 인간 Rspol 단편에 상응한다 (실시예에 개시된 변이체 #116 참조).

H. 당뇨병 치료에 사용하기 위한 Rspo3

본 발명자들은 천연 단백질 Rspo3이 생체 내에서 췌장 베타-세포 증식을 적어도 Rspol과 유사한 수준으로 활성화한다는 것을 추가로 확인하였다. 따라서 한 측면에서, 본 개시내용은, 시험관 내 또는 생체 내에서, 당뇨병 (예컨대 당뇨병 유형 I 또는 II)을 치료하는데 사용하기 위한, 및/또는 췌장 베타-세포의 증식을 유도하기 위한, Rspo3 폴리펩티드 (예를 들어 SEQ ID NO: 3을 포함함) 또는 그의 기능적 등가물에 관한 것이다.

본 개시내용의 바람직한 변이체

표 1은 본 개시내용의 바람직한 변이체, 이들의 아미노산 서열, 및 천연 R-스폰딘 단백질과 비교한 이들의 주요 변화를 설명한다.

보존적 변형 및 기능적 등가물

천연 R-스폰딘 1 단백질의 유사한 유리한 특성을 갖는 이전 섹션 A-F에 기재된 바와 같은 변이체의 추가적인 기능적 등가물, 또는 천연 인간 R-스폰딘 3 단백질의 유사한 유리한 특성을 갖는 이전 섹션 G에 기재된 바와 같은 Rspo3 폴리펩티드의 기능적 등가물은, 후보 분자를 스크리닝하고 그러한 후보 분자가 Rspol, Rspo3 또는 본 명세서에 개시된 임의의 특정 변이체 (특히 상기 표 1에 언급된 바람직한 변이체)와 비교할 때 원하는 기능적 특성을 유지하는지 여부를 테스트함으로써 추가로 식별될 수 있다.

특정 구현예에서, 변이체의 기능적 등가물은 본 명세서에 개시된 바람직한 변이체 중 하나와 적어도 동일한 친화도로 LGR4 수용체에 결합한다.

특정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 특정 변이체의 상기 기능적 등가물은 SEQ ID NO: 41의 Rspol 단백질에 대해 다음 활성 중 하나 이상의 활성을 적어도 90%, 100% 또는 그 이상 나타낸다:

(i) 예를 들어 SPR 분석에 의해 측정된, LGR4 수용체에 대한 결합 친화도;

(ii) 예를 들어 시험관 내 Min6 베타-세포 증식 분석으로 측정된, 기능성 베타-세포의 증식 유도;

(iii) 예를 들어 생체 내 베타-세포 증식 분석으로 측정된, 기능성 베타-세포의 증식 유도.

특정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 Rspo3 폴리펩티드의 상기 기능적 등가물은 SEQ ID NO: 3의 Rspo3 단백질에 비해 다음 활성 중 하나 이상의 활성을 적어도 90%, 100% 또는 그 이상 나타낸다:

(i) 예를 들어 SPR 또는 ELISA 분석에 의해 측정된, LGR4 수용체에 대한 결합 친화도;

(ii) 예를 들어 SPR 또는 ELISA 분석에 의해 측정된, ZNRF3 수용체에 대한 결합 친화도;

(iii) 예를 들어 시험관 내 Min6 베타-세포 증식 분석으로 측정된, 기능성 베타-세포의 증식 유도;

(iv) 예를 들어 생체 내 베타-세포 증식 분석으로 측정된, 기능성 베타-세포의 증식 유도.

활성을 측정하는 데 사용하기 위한 분석 및 조건에 대한 추가 세부사항은 하기 실험 부분에 개시되어 있다.

특정 구현예에서, 특정 변이체의 상기 기능적 등가물은, 표 1에 개시된 상응하는 바람직한 변이체 중 하나에 비해 상기 원하는 활성의 적어도 90%, 및 더 바람직하게는 100% 또는 그 이상을 나타낸다.

이전 섹션에 개시된 변이체의 기능적 등가물은, 비-필수 잔기의 상응하는 변이체와 비교하여 일반적으로 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 얻어질 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 기능적 등가물은, 특히 표 1에 개시된 변이체 중 하나와 비교하여, 천연 또는 비-천연 아미노산을 이용한 아미노산 치환만을 통하여, 바람직하게는 천연 아미노산을 이용한 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환만을 통하여, 상응하는 변이체와 상이하다.

다른 구현예에서, 상기 기능적 등가물은 SEQ ID NO: 22-28 중 적어도 하나와 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드이고, 여기서 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:22-28 중 적어도 하나의 FU1 및 FU2 도메인과 100% 동일한 FU1 및 FU2 도메인을 포함한다.

보다 구체적인 구현예에서, 상기 기능적 등가물의 아미노산 서열은, 대부분 보존적 아미노산 치환을 통하여, 본원에 개시된, 특히 표 1에 개시된 변이체와 상이할 수 있으며; 예를 들어 변이체에서 치환 중 적어도 10개, 예를 들어 적어도 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개는 보존적 아미노산 잔기 치환이다.

본 개시내용의 맥락에서, 보존적 치환은 하기와 같이 반영된 아미노산 부류 내의 치환에 의해 정의될 수 있다:

지방족 잔기 I, L, V 및 M

사이클로알케닐-관련 잔기 F, H, W 및 Y

소수성 잔기 A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W 및 Y

음 전하 잔기 D 및 E

극성 잔기 C, D, E, H, K, N, Q, R, S 및 T

양 전하 잔기 H, K 및 R

작은 잔기 A, C, D, G, N, P, S, T 및 V

매우 작은 잔기 A, G 및 S

방향전환 (turn)에 관여하는 잔기 A, C, D, E, G, H, K, N, Q, R, S, P 및 형성 T

유연한 잔기 Q, T, K, S, G, P, D, E 및 R

보다 보존적인 치환 그룹에는: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이 포함된다. 수치적/친수성 (hydropathic/hydrophilic) 특성 및 잔기 중량/크기의 관점에서의 보존 또한 표 1의 모 변이체와 비교하여 변이체 돌연변이 폴리펩티드에서 실질적으로 유지될 수 있다.

특정 구현예에서, 변이체의 기능적 등가물은, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 보존적 아미노산 치환에 의해, 다른 천연 아미노산 잔기로 대체된 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기를 제외하고는 SEQ ID NO: 22-28 (표 1의 변이체) 중 어느 하나와 동일한 폴리펩티드를 포함한다.

또한, 당업자는 다양한 종 중에 또는 여러 Rspo 패밀리 구성원들 중에 보존된 잔기가 적절한 구조를 유지하는데 중요하고 따라서 당업자는 이러한 아미노산 위치를 돌연변이시키는 것이 저어될 수 있음을 이해할 것이다. 예컨대, Rspol, Rspo2, Rspo3 및 Rspo4 중 보존된 잔기는 특히 도 1에 표시되어 있으며, 본 개시내용에서 달리 명시하지 않는 한 바람직하게는 돌연변이되지 않을 수 있다.

또는, 많은 위치에서, 하나 또는 둘 이상의 아미노산 위치는 종 변이체들 간에 및/또는 Rspo2, Rpo3 및 Rspo4와 같은 Rspo 패밀리의 다른 구성원들 간에 보존적 변이를 나타낸다. 이러한 보존적 치환 중 일부는 Rspo1의 기능에 부정적인 영향을 미치지 않을 가능성이 있고 따라서 천연 R-스폰딘 1과 비교하여 이러한 보존적 변이로써 돌연변이될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 변이체는 천연 R-스폰딘 단백질과 비교하여 돌연변이되지 않은 다음 아미노산 잔기를 갖는 FU2 도메인을 포함한다: SEQ ID NO:1의 인간 Rspol의, F106, H108, F110, N109, E116, L118, P127, A128, S133, A136, G138, S143.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 변이체는, SEQ ID NO:1의 인간 Rspol 내 다음 위치: T253, L257, T258, S259, A260 또는 A263 중 하나 이상에서, 또는 SEQ ID NO:2의 인간 Rspo2, SEQ ID NO:3의 인간 Rspo3 또는 SEQ ID NO:4의 인간 Rspo4 내 대응하는 잔기에서, 천연 BR 도메인과 비교하여 아미노산 변화를 갖지 않는 BR 도메인을 포함하는데, 통상 상기 BR 도메인은 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16, 또는 SEQ ID NO:20과 100% 동일하다.

본 개시내용의 융합 단백질

R-스폰딘 1 폴리펩티드 이외의 다양한 폴리펩티드가 상기 기재된 바와 같은 본 개시내용의 변이체 또는 그들의 기능적 등가물 (특히 표 1의 변이체)와 다양한 목적을 위하여 융합할 수 있는데, 예를 들어, 단백질의 생체 내 반감기를 증가시키고, 단백질의 식별, 분리 및/또는 정제를 용이하게 하고, 단백질의 활성을 증가시키고, 단백질의 올리고머화를 촉진하기 위한 목적을 위하여 그러할 수 있다.

많은 폴리펩티드가, 그들이 일부인 재조합 융합 단백질의 식별 및/또는 정제를 용이하게 할 수 있다. 예로는 폴리아르기닌, 폴리히스티딘이 있다. 폴리아르기닌을 포함하는 폴리펩티드는 이온 교환 크로마토그래피에 의한 효과적인 정제를 가능하게 한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 개시내용의 변이체 (더 구체적으로 표 1에 개시된 임의의 바람직한 변이체)는 폴리히스티딘 C-말단 태그 및 선택적으로 펩티드 링커, 예를 들어 SEQ ID NO: 90 (GGGGSEPEAHHHHH)를 포함한다.

특정 구현예에서, 항체, 선택적으로 IgG 항체의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 또는 실질적으로 유사한 단백질은, 직접적으로, 또는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 본 개시내용의 변이체 (통상 표 1에 개시된 변이체) 또는 그의 기능적 등가물에 융합되어, 그로써 본 개시내용의 Fc 융합 단백질을 형성한다. 이러한 Fc 영역의 예는 IgG4 Fc 단편 또는 이의 유도체, 통상 SEQ ID NO: 29의 폴리펩티드이다.

특정 구현예에서, 본 개시내용은 또한, 그 Fc 단편이 (C-말단 또는 N-말단에서, 임의로 펩티드 링커 또는 그의 변이체를 통해) SEQ ID NO: 66의 Rspol 단백질에 융합되고, 보다 구체적으로 Fc 단편은 SEQ ID NO: 29를 포함하는, Fc 융합 단백질에 관한 것이다.

또 다른 특정 구현예에서, 본 개시내용은 또한, 그 Fc 단편이 (C-말단 또는 N-말단에서, 임의로 펩티드 링커 또는 그의 변이체를 통해) SEQ ID NO: 24의 Rspol 단백질에 융합되고, 보다 구체적으로 Fc 단편은 SEQ ID NO: 29를 포함하는, Fc 융합 단백질에 관한 것이다.

또 다른 특정 구현예에서, 본 개시내용은 또한, 그 Fc 단편이 (C-말단 또는 N-말단에서, 임의로 펩티드 링커 또는 그의 변이체를 통해) SEQ ID NO: 94의 Rspol 단백질에 융합되고, 보다 구체적으로 Fc 단편은 SEQ ID NO: 29를 포함하는, Fc 융합 단백질에 관한 것이다.

융합 단백질은 또한 하나 이상의 펩티드 링커를 포함할 수 있다. 일반적으로, 펩티드 링커는 복수의 폴리펩티드를 연결하여 다량체를 형성하는 역할을 하고 단백질의 연결된 부분의 원하는 기능에 필요한 유연성 또는 강성을 제공하는 아미노산의 스트레치 (stretch)이다. 일반적으로 펩티드 링커는 약 1 내지 30개 아미노산 길이이다. 펩티드 링커의 예에는 -Gly-Gly-, GGGGS (SEQ ID NO: 46), (GGGGS)n (여기서 n은 1-8 사이, 일반적으로 3 또는 4)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 연결 모이어티는 예를 들어 [Huston, J. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5879-83 (1988)], [Whitlow, M., et al., Protein Engineering 6: 989-95 (1993)], [Newton, D. L., et al., Biochemistry 35: 545-53 (1996)], 및 미국 특허 Nos. 4,751,180 및 4,935,233에 기재되어 있다.

특정 구현예에서, Fc 융합체는 본 개시내용의 변이체의 C-말단 단부에 있는 펩티드 링커 또는 그의 기능적 등가물을 통해 간접적으로 융합된다. 다른 구현예에서, Fc 융합체는 본 개시내용의 변이체의 N-말단 단부에 있는 펩티드 링커 또는 그의 기능적 등가물을 통해 간접적으로 융합된다.

특정 구현예에서, 본 발명자들은 활성인 Fc 융합 단백질을 생성하기 위해서는 링커 최적화가 필요하다는 것을 보여주었다. 실제로, 본 발명자는 링커의 길이를 신장시키면 Fc 융합 단백질 생물학적 활성이 향상된다는 것을 보여주었다.

Fc 융합 단백질의 Fc 부분과 R-스폰딘 부분 사이에 사용될 수 있는 바람직한 펩티드 링커는 예를 들어 (GGGGGGSGGGGSGGGGSA)(SEQ ID NO: 44) 또는 (GGGGSGGGGSGGGGGG)(SEQ ID NO: 45)의 링커를 포함한다.

특정 구현예에서, SEQ ID NO: 29의 Fc 폴리펩티드는 표 1의 바람직한 변이체 중 하나의 C-말단 단부의 펩티드 링커를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 융합된다.

본 발명자들은 놀랍게도 본 명세서의 변이체의 본 발명의 변이체의 N-말단의 펩티드 링커를 통한 직접적 또는 간접적 Fc 폴리펩티드의 융합이 Fc 융합이 단백질의 생산 수율을 증가시킨다는 것을 보였다. 따라서, 바람직한 구현예에서, SEQ ID NO: 29의 Fc 폴리펩티드는, 표 1의 바람직한 변이체 중 하나, 바람직하게는 SEQ ID NO: 24, 66 또는 94의 변이체의 N-말단 단부의 펩티드 링커를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 융합된다.

본 개시내용은 또한, 그 Fc 단편이 (C-말단 또는 N-말단에서, 임의로 펩티드 링커를 통해) SEQ ID NO: 1의 Rspol 단백질에 융합되고, 보다 구체적으로 Fc 단편은 SEQ ID NO: 29를 포함하는, Fc 융합 단백질에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 변이체는 SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93 또는 SEQ ID NO: 95의 Fc 융합 단백질이다 (각각 변이체 #063, #064, #121, #155 또는 #150에 대응함).

본 개시내용에 의해 고려되는 변이체 또는 그의 기능적 등가물의 또 다른 변형은, 적어도 변이체 또는 등가물의, 결과물 분자의 반감기를 증가시키는 인간 혈청 알부민 또는 그의 단편과 같은 혈청 단백질과의 컨쥬게이트 또는 단백질 융합체이다. 이러한 접근 방식은 예를 들어 Ballance et al. EP 0 322 094에 기술되어 있다.

또 다른 가능성은, 결과물 분자의 반감기를 증가시키기 위하여, 인간 혈청 알부민에 결합하는 단백질 (즉, 항-HSA 융합 단백질)과 같은, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 단백질을 포함하는 본 개시내용의 융합 단백질로서, 예컨대 HSA에 결합하는 Fab 또는 나노바디로부터 유래한 항-HSA 결합 모이어티 또는 달핀 (darpin), 나노피틴 (nanofitin), 피노머 (fynomer) 등등과 같은 임의의 다른 도메인 유형 구조를 포함한다. 이러한 접근법은 예를 들어 [Journal of Controlled Release 301 (2019) 176-189]; [BioDrugs (2015) 29:215-239]; [J Pharmacol Exp Ther 370:703-714, September 2019]; [Biodrugs 2009; 23 (2): 93-109]에 기술되어 있다. 이러한 융합 단백질의 예에는 SEQ ID NO:64, NO:87 또는 NO:88의 폴리펩티드가 포함된다.

다른 구현예에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 Dennis et al 2002 (Journal of Biological Chemistry, 2002, Vol 277, No. 38, pp 35035-35043)에 개시된 바와 같이 알부민에 결합하는 펩티드 중 하나를 포함하고, 특히 SEQ ID NO:91 (DICLPRWGCLW)의 코어 서열을 포함하는 펩티드이다.

이러한 변이체의 예는 SEQ ID NO: 64 (변이체 #046)의 폴리펩티드 또는 SEQ ID NO: 87 (변이체 #094) 또는 SEQ ID NO: 88(변이체 #095)의 폴리펩티드이다.

본 개시내용의 재조합 융합 단백질은 류신 지퍼 또는 다른 다량체화 모티프를 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 공지된 류신 지퍼 서열 중에는 이량체화를 촉진하는 서열 및 삼량체화를 촉진하는 서열이 있다. 예를 들면, Landschulz et al. (1988), Science 240: 1759-64 참조. 류신 지퍼는, 종종 다른 아미노산이 사이사이에 끼어든 4개 또는 5개의 류신 잔기가 있는 반복적인 헵타드 리피트를 포함한다. 류신 지퍼의 사용 및 제조는 당업계에 잘 알려져 있다.

본 개시내용에 의해 고려되는 본 명세서에 기재된 변이체 또는 기능적 등가물의 또 다른 변형은 페길화 또는 헤실화 또는 파실화과 같은 관련 기술이다.

보다 일반적으로, 변이체 또는 그들의 기능적 등가물은 생분해성 증량제와 컨쥬게이션될 수 있는데, 예컨대 천연 및 반-합성 폴리새커라이드, 예컨대 O- 및 N-연결 올리고새커라이드, 덱스트란, 하이드록시에틸 전분 (HES), 폴리시알산 및 히알루론산 및 구조화되지 않은 단백질 중합체, 예컨대 호모-아미노산 폴리머, 엘라스틴-유사 폴리펩티드, XTEN 및 PAS를 들 수 있다.

예컨대, 본 개시내용의 변이체 또는 그들의 기능적 등가물은 예를 들어 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 페길화될 수 있다. 페길화를 위해, 재조합 단백질은, 하나 이상의 PEG 기가 재조합 단백질에 부착되는 조건하에서 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응된다. 페길화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은, 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드와 같은, 다른 단백질을 유도체화하는데 사용되는 임의 형태의 PEG를 포함하는 것으로 의도된다. 단백질을 페길화하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며 본 개시내용의 단백질에 적용될 수 있다. 예를 들어, [Jevsevar et al 2010 Biotechnol J. 5(1): 113-28] 또는 [Turecek et al 2016 J Pharm Sci 2016 105(2): 460-375] 참조. 따라서, 특정 구현예에서, 본 개시내용의 Rspo1 단백질은 페길화된다.

본 개시내용에 의해 고려되는 변이체 또는 그들의 기능적 등가물의 또 다른 변형은 파실화이다. 예를 들면: [Protein Engineering, Design & Selection vol. 26 no. 8 pp. 489-501, 2013] 참조. 따라서, 특정 구현예에서, 본 개시내용의 Rspo1 단백질은 파실화된다.

Xten 기술은 예를 들어 [Nature Biotechnology volume 27 number 12 2009: 1186-1192]에 기재되어 있다.

본 개시내용의 단백질을 인코딩하는 핵산 분자

본 개시내용의 변이체 또는 그들의 기능적 등가물을 인코딩하는 핵산 분자가 또한 본원에 개시된다.

아래 실시예의 표 10 및 11은 본원에 개시된 변이체의 특정 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 구체적인 예시를 제공한다.

뉴클레오티드 서열의 예는, 상기 표 1에 개시된 바와 같은, 실시예 중 어느 하나의 아미노산 서열, 특히 SEQ ID NO: 22-28, SEQ ID NO: 42-43 , SEQ ID NO: 50-89 및 SEQ ID NO: 92-95 중 어느 하나를 인코딩하는 것들로서, 핵산 서열은 유전 코드를 사용하고, 선택적으로 숙주 세포 종에 따른 코돈 편향을 고려하면 표 9로부터 쉽게 유래된다.

본 개시내용은 또한 포유동물 세포, 예를 들어 포유동물 중국 햄스터 난소 (CHO) 또는 인간 HEK293 세포주에서 단백질 발현을 위해 최적화된 후자의 서열로부터 유래된 핵산 분자에 관한 것이다.

핵산은 전(全) 세포, 세포 용해물에 존재할 수 있거나, 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태의 핵산일 수 있다. 핵산은, 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 잘 알려진 기타 기술을 포함한 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 기타 오염 물질, 예를 들어 다른 세포의 핵산 또는 단백질로부터 정제되어 나올 때 "단리"되거나 "실질적으로 순수하게 제시"된다. 본 개시내용의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고 인트론 서열을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 하나의 구현예에서, 핵산은 파지 디스플레이 벡터와 같은 벡터 내에, 또는 재조합 플라스미드 벡터 내에 존재할 수 있다.

본 개시내용의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 일단 본 개시내용의 변이체를 인코딩하는 DNA 단편이 수득되면, 이러한 DNA 단편은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작될 수 있다. 이러한 조작에 있어서, 변이체-인코딩 DNA 단편은 다른 DNA 분자에, 또는 항체 불변 영역 (Fc 영역) 또는 가요성 링커와 같은 다른 단백질을 인코딩하는 단편에 작동가능하게 연결될 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 예는 또한 재조합 융합 단백질, 특히 Fc 영역의 코딩 서열과 작동적으로 연결된 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1 또는 그의 변이체의 코딩 서열을 포함하는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 예컨대 SEQ ID NO:42 ,SEQ ID NO:43 또는 SEQ D NO: 92-95이다.

본 발명의 맥락에서 사용되는 용어 "작동적으로 연결된"은 두 DNA 단편이, 예를 들어 상기 두 DNA 단편에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 프레임 내에 (in-frame) 남아 있거나, 단백질이 원하는 프로모터의 제어하에 발현되도록, 기능적 방식으로 연결되는 것을 의미하는 것으로 의도된다.

본 개시내용의 변이체 또는 융합 단백질을 생산하는 형질감염종 (transfectomas)의 생성

본 개시내용의 변이체 또는 그들의 기능적 등가물, 및/또는 관련 융합 단백질은 예를 들어 당업계에 널리 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 사용하여 숙주 세포 형질감염종에서 생산될 수 있다.

예를 들어, 본 개시내용의 변이체 또는 관련 융합 단백질, 또는 이의 상응하는 기능적 등가물을 발현하기 위해, 부분적인 또는 전장 재조합 단백질을 인코딩하는 DNA는 표준 분자 생물학 또는 생화학 기술 (예를 들어, DNA 화학적 합성, PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)에 의해 얻어질 수 있고, DNA는 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터에 삽입될 수 있다.

이러한 맥락에서, "작동적으로 연결된"이라는 용어는, 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 재조합 단백질의 전사 및 번역을 조절하는 그들의 의도된 기능을 제공하도록 항체 유전자가 벡터 내로 연결됨 (ligated)을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 호환되도록 선택된다. 단백질 암호화 유전자는 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 연결, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 블런트 (blunt) 말단 연결)에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다.

재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 재조합 단백질의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 인코딩할 수 있다. 변이체 인코딩 유전자는 신호 펩티드가 프레임 내에서 재조합 단백질의 아미노 말단에 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 Rspo1, Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 천연 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-R스폰딘 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.

변이체 인코딩 유전자에 더하여, 본원에 개시되는 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유한다. 용어 "조절 서열"은 단백질 인코딩 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소 (예컨대, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계가, 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열은 사이토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예컨대, 아데노바이러스 메이저 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래되는 프로모터 및/또는 인핸서와 같은, 포유동물 세포 내에서 고수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소를 포함한다. 대안적으로, 유비퀴틴 프로모터 또는 P-글로빈 프로모터와 같은 비-바이러스 조절 서열이 사용될 수 있다. 또한, SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 긴 말단 반복부로부터의 서열을 함유하는, SRa 프로모터 시스템과 같은, 상이한 공급원으로부터의 서열로 구성된 조절 요소가 있다.

변이체 인코딩 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기점) 및 선택가능한 마커 유전자와 같은 추가 서열을 보유할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는, 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어, 모두 Axel et al.에 의한, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 참조). 예를 들어, 통상적으로 선택가능한 마커 유전자는, 벡터가 도입된 숙주 세포에서 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 선택가능한 마커 유전자에는 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭을 이용하여 dhfr-숙주 세포에서 사용) 및 neo 유전자 (G418 선택)가 포함된다.

본 개시내용의 변이체 또는 관련 융합 단백질의 발현을 위해, 재조합 단백질을 인코딩하는 발현 벡터(들)는 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염된다. "형질감염"이라는 용어의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 도입하기 위해 일반적으로 사용되는 광범위한 기술, 예를 들어 전기천공법, 인산-칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등등을 포괄하는 것으로 의도된다. 이론적으로 원핵 또는 진핵 숙주 세포 중 어느 것에서든 본 개시내용의 단백질을 발현하는 것이 가능하다. 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 숙주 세포, 효모 또는 사상균에서의 단백질 발현이 논의되는데, 이러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 적절하게 폴딩되고 기능적인 재조합 단백질을 조립하고 분비할 가능성이 원핵 세포보다 더 높기 때문이다.

하나의 특정 구현예에서, 본 개시내용에 따른 클로닝 또는 발현 벡터는, 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된, 표 1에 기재된 변이체 (통상, SEQ ID NO: 22-28 또는 SEQ ID NO: 50-89의 것)의 코딩 서열 또는 융합 단백질 (통상, SEQ ID NO: 42, 43 또는 92-95)의 코딩 서열 중 하나를 포함한다.

본 개시내용의 재조합 단백질을 발현시키기 위한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary)(CHO 세포), 예컨대 DHFR 선택가능 마커 (Kaufman 및 Sharp, 1982에 기술된 바와 같음)와 함께 사용되는 dhfr-CHO 세포 (Urllaub 및 Chasin, 1980에 기술됨), CHOK1 dhfr+ 세포주, NSO 골수종 세포, COS 세포, HEK293 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입될 때, 재조합 단백질은 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현 및 선택적으로 숙주 세포가 자라는 배양 배지 내로 단백질의 분비에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다.

본 개시내용의 변이체 또는 관련 융합 단백질은 예를 들어 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 그의 분비 후에 배양 배지로부터 회수 및 정제될 수 있다.

한 특정 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포는, 각각 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된, SEQ ID NO:22-28, SEQ ID NO:42-43, SEQ ID NO:50-89 및 SEQ ID NO: 92-95 중 어느 하나를 포함하는 변이체 중 하나의 발현에 적합한 코딩 서열을 갖는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포이다.

후자의 숙주 세포는 이어서 본 개시내용의 재조합 변이체 또는 관련 융합 단백질의 발현 및 생산에 적합한 조건 하에 추가로 배양될 수 있다.

약학적 조성물

또 다른 측면에서, 본 개시내용은, 본 개시내용의 변이체 또는 관련 융합 단백질 또는 그의 기능적 등가물을 함유하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 전술한 바와 같이 재조합 변이체 또는 관련 융합 단백질의 하나 또는 (예를 들어, 2개 이상의 상이한) 이들의 조합을 포함할 수 있다.

예를 들어, 상기 약학적 조성물은, 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된, 통상 SEQ ID NO:22-28 및 SEQ ID NO:50-89의 임의의 폴리펩티드를 포함하는 표 1에 개시된 바람직한 변이체 중 어느 하나, 또는 예를 들어 SEQ ID NO:42-43 또는 SEQ ID NO:92-95의 융합 단백질, 또는 그의 기능적 등가물을 포함하는 재조합 단백질을 포함한다.

본 명세서에 개시된 약학적 조성물은 또한 조합 요법으로, 즉 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 적어도 하나의 항염증제, 또는 다른 항당뇨병제와 함께 조합된, 본 개시내용의 변이체, 예를 들어 SEQ ID NO:22-28, SEQ ID NO:42-43, SEQ ID NO:50-89 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 그의 기능적 등가물을 포함하는 재조합 단백질을 포함할 수 있다. 조합 요법에서 사용될 수 있는 치료제의 예는 본 개시내용의 재조합 변이체 또는 관련 융합 단백질의 용도에 관한 섹션에 보다 상세히 기재되어 있다.

본원에 사용된 "약학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 호환가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등등을 포함한다. 담체는 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 안내 투여 (예컨대, 주사 또는 주입)에 적합해야 한다.

한 구현예에서, 담체는 피하 경로 또는 정맥내 주사에 적합해야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 본 개시내용의 변이체는 그 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 기타 자연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하기 위한 물질로 코팅될 수 있다.

멸균 인산염 완충 염수가 약학적으로 허용되는 담체의 한 예이다. 다른 적합한 담체는 당업자에게 잘 알려져 있다. (Remington과 Gennaro, 1995). 제형은 하나 이상의 부형제, 방부제, 가용화제, 완충제, 바이알 표면에서 단백질 손실을 방지하기 위한 알부민 등을 추가로 포함할 수 있다.

약학적 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 요법은 자연적으로 치료할 상태, 질병의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별 등에 따라 다르다.

본 개시내용의 약학적 조성물은 경구, 비강내, 설하, 피하, 근육내, 정맥내, 경피, 비경구 또는 직장 투여 등등을 위해 제형화될 수 있다. 활성 성분으로서의 본 개시내용의 변이체는 단독으로 또는 다른 활성 성분과 조합하여, 동물 및 인간에게 통상적인 약학적 지지체와의 혼합물로서, 단위 투여 형태로 투여될 수 있다.

적합한 단위 투여 형태는, 경구 경로 형태, 예컨대 정제, 겔 캡슐, 분말, 과립 및 경구 현탁액 또는 용액, 설하 및 협측 투여 형태, 에어로졸, 임플란트, 피하, 경피, 국소, 복강 내, 근육 내, 정맥 내, 피하, 경피, 경막 내 및 비강 내 투여 형태 및 직장 투여 형태를 포함한다.

바람직하게는, 약학적 조성물은 주사될 수 있는 제형에 대해 약학적으로 허용되는, 비히클을 함유한다. 이들은 특히 등장성, 멸균, 염수 용액 (모노소듐 또는 디소듐 인산염, 소듐, 포타슘, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등등 또는 이러한 염의 혼합물), 또는 첨가 시, 주사가능한 용액의 구성을 허하는, 경우에 따라, 멸균수나 생리식염수의 건조된, 특히 동결-건조된 조성물일 수 있다.

투여에 사용되는 용량은 다양한 파라미터의 함수로서, 특히 사용된 투여 방식, 관련 병리, 또는 대안적으로 원하는 치료 기간의 함수로서 조정될 수 있다.

약학적 조성물을 제조하기 위해, 치료적으로 유효한 양의 본 개시내용의 변이체를 약학적으로 허용되는 담체 또는 수성 매질에 용해 또는 분산시킬 수 있다.

주사용으로 적합한 약학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참깨 오일, 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말 또는 동결건조물을 포함할 수 있다. 모든 경우에, 상기 형태는 멸균 상태여야 하며 용이한 주사기 이용성 (syringegablity)이 존재하도록 액체여야 한다. 제조 및 보관 조건에서 안정해야 하며 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.

유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물에서 및 오일에서 제조될 수 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건에서 이러한 제제에는 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제가 포함되어 있다.

본 개시내용의 변이체 또는 관련 융합 단백질은 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 산부가염 (단백질의 유리 아미노기로 형성됨)을 포함하며, 이는 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등등과 같은 유기산으로 형성된다. 유리 카르복실기로 형성된 염은 또한 예를 들어 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘 또는 페릭 하이드록사이드와 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.

담체는 또한 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등등에 의해 유발될 수 있다. 많은 경우에 등장화제, 예를 들어 설탕 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장 흡수는 조성물 내에서 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 유발될 수 있다.

멸균 주사 용액은 활성 화합물, 즉 Rspo1 단백질을 필요한 양만큼 적절한 용매에 위에 열거된 다양한 기타 성분과 함께 필요에 따라 혼입한 후 여과 멸균하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 위에 열거된 것들로부터 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균된 활성 성분을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 더하기 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 추가의 원하는 성분으로 이루어지는 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.

제형화 시, 용액은 투여 제형과 양립가능한 방식으로 그리고 치료적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 제형은 전술한 주사액의 종류와 같은 다양한 제형으로 용이하게 투여되지만, 약물 방출 캡슐 등등도 사용될 수 있다.

예를 들어, 수용액으로 비경구 투여하는 경우, 용액은 필요한 경우 적절하게 완충되어야 하고 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코오스로 등장성이 되어야 한다. 이러한 특정 수용액은 정맥 내, 근육 내, 피하 및 복강 내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시내용에 비추어 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 하나의 투여량은 등장성 NaCl 용액 1ml에 용해되고 피하주사액 1000 ml에 첨가되거나 제안된 주입 부위에 주사될 수 있다 (예컨대, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 및 1570-1580 참조). 투여량의 약간의 변화는 치료 대상의 상태에 따라 필연적으로 발생할 것이다. 투여 책임자는 어떤 경우에도 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.

본 개시내용의 변이체 또는 관련 융합 단백질 또는 그들의 기능적 등가물은 약 0.01 mg - 1000 mg/kg 또는 1 mg - 100 mg/kg을 포함하도록 치료 혼합물 내에서 제형화될 수 있다. 다회 용량이 투여될 수도 있다.

재조합 단백질의 주입 또는 피하 주사용 용액에 적합한 제형은 당업계에 설명되어 있으며 예를 들어 문헌 [Advances in Protein Chemistry and Structural Biology Volume 112, 2018, Pages 1-59 Therapeutic Proteins and Peptides Chapter One - Rational Design of Liquid Formulations of Proteins: Mark C.Manning, Jun Liu, Tiansheng Li, Ryan E.Holcomb]에 검토되어 있다.

본 개시내용의 변이체 또는 관련 융합 단백질의 용도 및 방법

본 개시내용의 변이체 또는 관련 융합 단백질 또는 그들의 기능적 등가물은 시험관 내 및 생체 내 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이들 재조합 단백질은 배양 중인 세포에, 예컨대 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내로, 또는 대상체에서, 예를 들어 생체 내에서 다양한 장애를 치료 또는 예방하기 위하여 투여될 수 있다.

본원에 사용되는 바 용어 "치료하다" "치료하는" 또는 "치료"는 (1) 질병을 억제하는 것; 예를 들어, 질병, 병태 또는 장애의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 개체에서 질병, 병태 또는 장애를 억제하는 것 (즉, 병리 및/또는 증상의 추가 진행을 정지시키는 것); 및 (2) 질병을 개선시키는 것; 예를 들어, 질병의 중증도를 감소시키는 것 또는 질병의 하나 이상의 증상을 감소시키거나 완화시키는 것과 같은, 질병, 병태 또는 장애의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 개체에서 질병, 병태 또는 장애를 개선시키는 것 (즉, 병리 및/또는 증상을 역전시키는 것) 중 하나 이상을 의미한다.

특히, 당뇨병, 보다 구체적으로 1형 당뇨병의 치료와 관련하여, 용어 "치료"는 췌장 베타 세포의 손실의 억제 및/또는 췌장 베타 세포, 특히 상기 대상체에서 기능적 인슐린 분비 베타 세포의 질량 증가 및/또는 특히 질병, 예를 들어 1형 당뇨병으로 인해 췌장 베타 세포 및/또는 랑게르한스 섬이 소실된 환자에서 혈당 조절의 개선을 의미할 수 있다.

본 개시내용의 변이체 또는 관련 융합 단백질 또는 그들의 기능적 등가물은 생체 내에서 췌장 베타 세포의 증식을 유도하고 기능적 인슐린-분비 랑게르한스 섬을 재구성할 수 있으며, 이에 의해 당뇨병 환자 또는 기능적 인슐린-분비 베타 세포를 필요로 하는 환자 또는 고혈당증과 관련된 장애가 있는 환자, 또는 글루코오스 자극 인슐린 분비가 결핍된 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바 용어 "당뇨병"은 일반적으로 인슐린 부족 또는 그 작용에 대한 저항성을 초래하는 모든 병태 또는 장애를 의미한다.

당뇨병의 예로는 1형, 2형, 임신성 당뇨병 및 성인의 잠복 자가면역 당뇨병 (LADA)이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.

따라서, 본 개시내용은 그를 필요로 하는 대상체에서 상기 개시된 장애 중 하나를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 대상체에게 치료학적 유효량의 상기 개시된 바와 같은 본 개시내용의 변이체 또는 관련 융합 단백질 또는 기능적 등가물, 통상 SEQ ID NO: 22-28, SEQ ID NO: 42-43, SEQ ID NO: 50-89 및 SEQ ID NO: 92-95 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 그의 기능적 등가물을 포함하는 재조합 단백질을 투여하는 것을 포함한다.

특정 구현예에서, 상기 대상체는 낮은 Rspo1 유전자 발현을 갖는 환자 중에서 선택되었다.

상기 개시된 바와 같이 사용하기 위한 변이체 또는 관련 융합 단백질 또는 그의 기능적 등가물은, 예컨대, 위에서 언급한 질병의 치료 또는 예방을 위하여, 단독 활성 성분으로서 또는 다른 약물, 예컨대 사이토카인, 항바이러스제, 항염증제, 항당뇨병제 또는 혈당강하제, 세포 치료 제품 (예컨대, 베타 세포 조성물) 및 면역 조절 약물과 결합하여, 예컨대 그에 대한 보조제로서 또는 그와 조합하여 투여될 수 있다.

예를 들어, 상기 개시된 바와 같이 사용하기 위한 변이체 또는 관련 융합 단백질 또는 그의 기능적 등가물은 세포 요법, 특히 β 세포 요법과 조합하여 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바 용어 "세포 요법"은 이를 필요로 하는 대상체에게 적어도 치료학적 유효량의 세포 조성물을 생체 내 투여하는 것을 포함하는 요법을 지칭한다. 환자에게 투여된 세포는 동종 또는 자가일 수 있다. 용어 "β 세포 요법"은 세포 조성물이 활성 성분으로서 β 세포, 특히 인슐린 분비 베타 세포를 포함하는, 세포 요법을 지칭한다. 이러한 베타 세포는 하기 기재된 바와 같이 시험관 내 방법에서 Rspo1 단백질을 사용하여 생성될 수 있다.

특정 구현예에서, 당뇨병 환자, 또는 기능성 인슐린-분비 베타-세포가 필요한 환자 또는 고혈당증과 관련된 장애가 있는 환자, 또는 결핍된 글루코오스 자극 인슐린 분비 환자를 치료하기 위하여 사용하기 위한 Rspo1 단백질, 변이체 또는 관련 융합 단백질 또는 그의 기능적 등가물은 베타-세포 조성물, 특히 줄기 세포-유래 베타-세포 조성물과 조합하여 (예를 들어, 이전, 동시에 또는 이후) 투여된다.

특정 구현예에서, 상기 베타-세포는 살아있는 기증자, 사체 기증자로부터 분리된다.

또 다른 특정 구현예에서, 상기 베타-세포는 줄기 세포-유래 베타-세포이다. 줄기 세포-유래 베타-세포란 만능 줄기 세포, 특히 유도 만능 줄기 세포 또는 인간 배아 줄기 세포를 분화시켜 얻은 인슐린 분비 베타-세포를 말한다. 한 구현예에서, 줄기 세포가 인간 줄기 세포인 경우, 상기 인간 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포가 아니다. 줄기-세포-유래 베타-세포는 췌장 베타-세포를 가리키는 하나 이상의 마커를 나타내고 (예컨대, PDX-1 또는 NKX6.1), 인슐린을 발현하며, 내인성 성숙 베타-세포의 시험관 내 또는 생체 내 특징인 글루코오스 자극 인슐린 분비 반응 (GSIS)을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "인슐린 분비 베타-세포"는 인슐린을 분비하는 내분비 전구세포 또는 그의 전구체로부터 분화된 세포를 의미한다. 인슐린 분비 베타-세포에는 췌장 베타-세포뿐만 아니라 인슐린을 발현하는 췌장 베타-유사 세포도 포함된다.

본 명세서에 사용된 바, "만능 줄기 세포"는 자가-재생 (유사 세포 분열을 통해) 및 3개 배엽층 (외배엽, 내배엽 및 중배엽)으로부터 유래된 특수 세포 유형으로의 분화를 겪고 신체 조직의 모든 세포를 생성하는 능력을 갖는 미분화 세포이다. 특정 구현예에서, 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포 또는 인간 배아 줄기 세포이다.

본원에 사용된 용어 "iPS 세포" 및 "유도 만능 줄기 세포"는 상호교환적으로 사용되며, 예를 들어, 하나 이상의 유전자의 강제 발현을 유도함으로써, 비-만능성 세포, 통상 성체 체세포로부터 인공적으로 유래된 (예를 들어, 유도되거나 완전 역전에 의함) 만능 줄기 세포를 지칭한다.

"인간 배아 줄기 세포" 또는 "hESC"는 본원에서 배반포 단계의 인간 배아의 내부 세포괴 (ICM)로부터 유래된 인간 줄기 세포를 의미한다. 인간 배아는 수정 후 4~5일에 배반포 단계에 도달하며, 이 때 그들은 50 내지 150개 세포로 구성된다. 배아 줄기 세포는 만능 줄기 세포이다. 본 발명에 따르면, 인간 배아 줄기 세포는 확립된 세포주에서 얻거나 당업자의 여러 기술을 사용하여 배아에서 분리할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용되는 줄기 세포의 공급원을 위해 인간 배아는 파괴되지 않았다.

줄기세포 유래 베타-세포를 생성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 그 관련 부분이 본 개시내용에 포함되는 D'Amour, K. A. et al. (2006); Jiang, J. et al. (2007); 및 Kroon, E. et al. (2008), Rezania et al (2012, 2014), Felicia W. Pagliuca et al (2014) 및 PCT 국제 출원 No. PCT/US2014/041992에 개시되는 프로토콜로 예시화되지만 이에 국한되는 것은 아니다. 만능 줄기 세포를 인슐린-분비 베타-세포로 분화시키기 위한 이들 프로토콜은, 줄기 세포를, 인슐린 분비 베타-세포로 분화하도록 지시할 수 있는, 췌장 전구 세포 또는 내분비 전구 세포와 같은 전구 세포로 분화시키는 것을 포함한다.

세포 치료 제품은 치료 목적으로 상기 환자에게 투여되는 세포 조성물을 의미한다. 상기 세포 치료 제품은 치료적 유효 용량의 세포 및 선택적으로 추가 부형제, 보조제 또는 기타 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

적합한 항당뇨병 또는 저혈당제는 안지오텐신-전환 효소 억제제, 안지오텐신 II 수용체 차단제, 콜레스테롤 저하 약물, 비구아니드, 메트포르민, 티아졸리딘디온, 저혈당 설파마이드, DPP-4 억제제, 알파-글루코시다아제 억제제, 인슐린 또는 이들의 유도체, 예컨대 단기-작용성, 신속-작용성 또는 장기-작용성 인슐린, GLP1 유사체, 카르바모일메틸벤조산 유도체; 통상 인슐린 수용체, SLGT2 억제제, GABR 표적 분자 및 IL2R 표적 분자를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.

전술한 바에 따르면, 본 개시내용은 또 다른 측면을 제공한다:

예를 들어 동시에 또는 순차적으로, 치료적 유효량의 본 개시내용의 변이체 또는 관련 융합 단백질, 또는 그의 기능적 등가물, 및 예컨대 전술한 바와 같은 사이토카인, 항바이러스제, 항염증제, 항당뇨병제, 세포 요법 제품 (예컨대, 베타 세포 조성물)인 적어도 하나의 제2 약물 물질의 공동 투여를 포함하는 상기 정의된 방법.

상기 개시된 장애 중 하나를 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체에서, 상기 방법은, 치료적 유효량의 베타-세포 조성물, 특히 본 명세서에 개시된 줄기 세포-유래 베타-세포 조성물과 조합하여 (예를 들어, 이전에, 동시에 또는 후에), 치료적 유효량의 Rspol 단백질 또는 상기 개시된 바와 같은 본 개시내용의 변이체 또는 관련 융합 단백질 또는 기능적 등가물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

특정 구현예에서, 상기 베타-세포는 살아있는 기증자 또는 사체 기증자로부터 분리된다.

또 다른 특정 구현예에서, 상기 베타-세포는 줄기 세포-유래 베타 세포이다. 줄기 세포-유래 베타-세포란 줄기 세포, 특히 유도 만능 줄기 세포, 인간 배아 줄기 세포 또는 중간엽 전구 세포의 분화를 통해 얻은 인슐린 분비 베타-세포를 말한다. 한 구현예에서, 줄기 세포가 인간 줄기 세포인 경우, 상기 인간 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포가 아니다.

환자에게 베타-세포 또는 랑게르한스섬을 이식하는 방법은 예를 들어 [Shapiro, et al (2000) The New England Journal of Medicine.　343　(4): 230-238], 및 [Shapiro et al (2017) Nature Reviews Vol 13　: 268-277]에 개시되어 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 베타 세포는 분산된 세포로서 상기 환자에게 투여되거나 클러스터로 형성된다. 베타-세포는 비제한적인 예시인, 간, 자연 췌장, 신장 피막하 공간, 장막, 복막, 장막하 공간, 장, 위 또는 피하 주머니와 같은 대상체의 적절한 부위에 이식될 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 베타-세포 조성물은 치료가 필요한 대상체의 자가 유래이며, 바람직하게는 치료가 필요한 대상체의 체세포로부터 얻은 iPS로부터 유래된다.

특정 구현예에서, 이러한 치료가 필요한 상기 대상체는 당뇨병, 바람직하게는 제1형 당뇨병을 앓고 있는 대상체이다.

다른 구현예에서, 본 개시내용의 변이체 또는 관련 융합 단백질, 또는 이의 기능적 등가물은 췌장 베타 세포 및/또는 랑게르한스 섬의 증식을 유도하기 위한 시험관 내 방법에서 사용될 수 있다.

따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 베타-세포를 생산하는 시험관 내 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:

(i) 베타 세포를 제공하는 단계,

(ii) 상기 베타 세포의 증식을 유도하는 조건 하에서 상기 변이체 또는 관련 융합 단백질, 또는 그의 기능적 변이체의 유효량의 존재 하에 상기 베타 세포를 배양하는 단계.

상기 생산 방법의 특정 구현예에서, 상기 베타 세포는, 바람직하게는 베타 세포 요법 또는 랑게르한스 섬의 이식이 필요한 대상체로부터의 1차 세포이다.

다른 특정 구현예에서, 단계 (i)에서 제공된 상기 베타-세포는 iPS 세포를 베타-세포로 분화시킨 후, 상기 iPS 세포로부터 수득된 것이다.

따라서, 특정 구현예에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 유도 만능 줄기 세포로부터 베타-세포의 생산을 위한 시험관 내 방법에 관한 것이다:

(i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSCc)를 제공하는 단계,

(ii) 시험관 내에서 상기 iPSC를 랑게르한스 섬의 β-세포로 분화시키는 단계, 및

(iii) 상기 분화된 베타 세포를 증식 조건 하에서 배양하는 단계,

여기서 iPS 세포를 분화시키고 및/또는 상기 β-세포의 증식을 유도하기 위해 충분한 양의 상기 변이체 또는 관련 융합 단백질 또는 그의 기능적 변이체가 단계 (ii) 및/또는 단계 (iii)에서 첨가된다.

iPSC를 랑게르한스 섬의 β-세포로 분화시키는 방법은 이미 당업계, 예를 들어 [Pagliuca, et al. Cell 159, 428-439 (2014)] 및 [Rezania et al. Nat Biotechnol. 2014 Nov;32(11):1121-33]에 기술되어 있으며, 관련 부분은 본 개시내용에 통합된다.

상기 개시내용은 또한 상기 방법에 의해 수득가능하거나 수득되는 바와 같은 상기 β-세포를 포함하는 조성물, 및 예를 들어 당뇨병, 바람직하게는 1형 당뇨병을 치료하기 위한 대상체에서의 세포 치료 제품으로서의 그들의 용도를 포함한다. 베타-세포 또는 랑게르한스 섬을 환자에게 이식하는 방법은 예를 들어 [Shapiro, et al (2000) The New England Journal of Medicine. 343 (4): 230-238] 및 [Shapiro et al (2017) Nature Reviews Vol 13 : 268-277]에 개시되어 있다.

또한 본 개시내용의 범위 내에는 본 명세서에 개시된 조성물 (예를 들어, 본 개시내용의 변이체를 포함하는 것) 및 사용 설명서로 구성된 키트가 있다. 키트는 하나 이상의 추가 시약, 또는 하나 이상의 추가 항체 또는 단백질을 더 포함할 수 있다. 키트는 통상 그 키트 내용물의 의도된 용도를 나타내는 라벨을 포함한다. 라벨이라는 용어는 키트에 또는 키트와 함께 제공되거나 달리는 키트를 동반하는 모든 기록 또는 녹음 자료를 포함한다. 키트는, 상기 정의된 바와 같이 환자가 Rspo 치료에 반응할 그룹에 속하는지 여부를 진단하기 위한 도구를 더 포함할 수 있다.

또 다른 치료 전략은 인간 대상체의 시료로부터 분리된 베타 세포를 증식시키는 제제로서 본원에 개시된 바와 같은 변이체 또는 관련 융합 단백질, 또는 그의 기능적 등가물의 사용에 기초한다.

따라서 본 개시내용은 다음 단계를 포함하는, 그를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다:

(a) 대상체로부터 세포를 분리하는 단계,

(b) 선택적으로 상기 세포를 유도 만능 줄기 세포로 증식 및/또는 리프로그래밍하는 단계,

(c) 상기 iPS 세포를 베타 세포로 분화시키는 단계, 및

(d) 본 개시내용의 변이체 또는 관련 융합 단백질, 또는 그의 기능적 등가물, 예를 들어 SEQ ID NO: 22-28, SEQ ID NO:42-43, SEQ ID NO:50-89 및 SEQ ID NO: 92-95 중 어느 하나, 또는 이의 기능적 등가물을 포함하는 재조합 단백질 및 선택적으로 다른 세포의 존재하에서, 상기 베타 세포를 시험관 내 증식시키는 단계,

(e) 선택적으로, 증식된 베타 세포를 수집하고 및/또는 증식된 베타 세포를 제형화하고 치료적으로 유효한 양의 상기 증식된 베타 세포를 대상체에게 투여하는 단계.

본 개시내용은 또한 본 개시내용의 상기 변이체 또는 관련 융합 단백질, 또는 그의 기능적 등가물 (예를 들어, SEQ ID NO: 22-28, SEQ ID NO: 42-43, SEQ ID NO: 50-89 및 SEQ ID NO:92-95 중 어느 하나를 포함하는 재조합 단백질 또는 그의 기능적 등가물)의 시험관 내에서 베타-세포를 확장시키는 제제로서의 용도에 관한 것이다.

본 개시내용은 또한, 인간, 특히 기능성 베타-세포가 손실된 대상체, 통상 당뇨병을 앓고 있는 대상체에서 베타-세포의 증식을 유도하기 위한 제제로서 생체 내에서 사용하기 위한, 본 개시내용의 변이체 또는 관련 융합 단백질, 또는 그의 기능적 등가물 (예를 들어, SEQ ID NO: 22-28, SEQ ID NO: 42-43, SEQ ID NO: 50-89 및 SEQ ID NO:92-95 중 어느 하나를 포함하는 재조합 단백질 또는 그의 기능적 등가물)에 관한 것이다. .

따라서 본 개시내용은 당뇨병, 예를 들어 제1형 당뇨병 또는 기능성 베타-세포의 손실이 있는 또 다른 장애를 앓고 있는 대상체의 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음을 포함하고:

(i) 본 개시내용의 변이체 또는 관련 융합 단백질, 또는 이의 기능적 등가물, 통상 SEQ ID NO: 22-28, SEQ ID NO: 42-43, SEQ ID NO:92-95, SEQ ID NO: 50-89 중 어느 하나를 포함하는 재조합 단백질 또는 그의 기능적 등가물의 유효량을 상기 대상체에 투여하는 단계, 및,

(ii) 상기 대상체에 유효량의 β 세포 조성물을 투여하는 단계,

여기서 상기 유효량의 상기 변이체 또는 관련 융합 단백질은 상기 β 세포 조성물의 증식을 증가시키는 능력을 갖는다. 단계 (i) 및 (ii)는 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있으며, 특히 단계 (i) 또는 단계 (ii) 중 어느 하나가 먼저 상기 대상체에게 투여된다.

충분히 설명된 본 발명은 이제 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 단지 예시적이며 추가 제한을 의미하지 않는다.

구현예

E1. 다음 FU1, FU2, TSP 및 BR 도메인을 포함하는 R-스폰딘 단백질의 재조합 변이체로서, 여기서,

a. FU1은 각각 SEQ ID NO: 5, 9, 13 및 17에 제시된 인간 Rspo1, Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 FU1 도메인 중 임의의 것에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 도메인이고,

b. FU2는 각각 SEQ ID NO: 6, 10, 14, 18에 제시된 인간 Rspol, Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 FU2 도메인 중 임의의 것에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 도메인이고,

c. TSP는 SEQ ID NO: 7, 11, 15, 19에 제시된 인간 Rspo1, Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 TSP 도메인 중 임의의 것에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 도메인이고, 및,

d. BR은 SEQ ID NO: 8, 12, 16, 20에 제시된 인간 Rspol, Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 BR 도메인 중 임의의 것에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 도메인이다.

E2. E1에 있어서, 각각의 도메인 FU1, FU2, TSP 및 BR은 SEQ ID NO:1의 인간 Rspol 도메인의 각각의 FU1, FU2, TSP 및 BR 도메인에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 것인, 재조합 변이체.

E3. E1 또는 E2에 있어서, TSP 및 BR 도메인은 각각 상응하는 인간 Rspol TSP 및 BR 도메인에 대해 100% 동일성을 갖고, FU1 및 FU2 도메인 아미노산 서열은 인간 Rspol FU1 및 FU2 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일하고, 차이는 아미노산 치환에 따른 것인, 재조합 변이체.

E4. E1 내지 E3 중 어느 하나에 있어서, 각각 상응하는 SEQ ID NO:5의 인간 Rspol FU1 또는 SEQ ID NO:6의 Rspol FU2 도메인과 정렬될 때, FU1 또는 FU2 도메인 각각에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 것인, 재조합 변이체.

E5. E1-E4 중 어느 하나에 있어서, Rspo1의 영역 21-33 내 또는 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 등가 영역 내에서 처음 10-14개의 N-말단 아미노산의 결실, 통상 Rspol의 잔기 21-31의 결실을 포함하는 것인, 재조합 변이체.

E6. E5에 있어서, SEQ ID NO: 24의 단백질을 포함하거나 이로 이루어지는 것인, 재조합 변이체.

E7. E1-E6 중 어느 하나에 있어서, 적어도 SEQ ID NO:5의 인간 Rspol FU1 도메인 내 R66의, 또는 인간 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4 FU1 도메인 서열 내 등가의 아르기닌 잔기의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 ZNRF3 결합을 감소시키거나 제거하는 것인, 재조합 변이체.

E8. E7에 있어서, ZNRF3 결합을 감소시키거나 제거하는, 잔기 R66의 단일 아미노산 치환, 통상 R66A을 갖는 SEQ ID NO:5의 Rspol FU1 도메인을 포함하는 것인, 재조합 변이체.

E9. E7 또는 E8에 있어서, 상기 FU2, TSP 및 BR 도메인은 Rspol과 95%, 바람직하게는 100% 동일한, 예를 들어 상기 재조합 변이체는 SEQ ID NO:23을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되는 것인, 재조합 변이체.

E10. E1-E9 중 어느 하나에 있어서, R-스폰딘의 상기 변이체는 시험관 내 분석에서 Rspo1/LGR4 결합 친화도로 측정되는 바 SEQ ID NO: 41의 인간 Rspol보다 더 높은 친화도로 LGR4에 결합하는 것인, 재조합 변이체.

E11. E10에 있어서, SEQ ID NO:41의 키메라 Rspol에 비해 ZNRF3에 대한 결합 친화도를 증가시키기 위하여, Rspol의 위치 H108, N109, E116, L118, P127, A128, S133, A136, G138 또는 S143 또는 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 상응하는 잔기에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 보다 구체적으로 다음 아미노산 치환: H108K, N109D, E116V, L118F, P127D, A128F, S133F, A136L, G138E 또는 S143V 중 하나 이상을 포함하는 것인, 재조합 변이체.

E12. E10에 있어서, SEQ ID NO:41의 Rspol에 비해 ZNRF3에 대한 결합 친화도를 증가시키기 위하여, Rspol의 위치 E45, L46, E49, V50, N51, K55, S57, I62, L63, D68, P77, F84, D85, N88 또는 I95 또는 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 상응하는 잔기에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인, 재조합 변이체.

E13. E1-E12 중 어느 하나에 있어서, 상기 변이체는 FU2 및 TSP 도메인 사이에 N-글리코실화 부위를 포함하지 않는 것인, 재조합 변이체.

E14. E13에 있어서, Rspol의 잔기 N137 또는 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 등가 잔기에서 돌연변이를 포함하여, 이러한 위치에서 N-글리코실화를 억제하는 것인, 재조합 변이체.

E15. E14에 있어서, SEQ ID NO:22를 포함하거나 본질적으로 이로 구성된 것인, 재조합 변이체.

E16. E1-E15 중 어느 하나에 있어서,

상기 FU1 도메인은 SEQ ID NO: 9의 Rspo2 FU1 도메인과 100% 동일하고,

상기 FU2는 Rspol, Rspo3, Rspo4의 FU2 도메인 또는 LGR4에 대해 적어도 동일한 결합 친화도를 유지하는 아미노산 치환을 갖는 그의 기능적 변이체 중에서 선택되는 것인, 재조합 변이체.

E17. E16에 있어서, SEQ ID NO:9의 Rspo2 FU1 도메인 및 SEQ ID NO:6의 Rspol FU2 도메인, 및 선택적으로 SEQ ID NO:7의 Rspol TSP 도메인 및 SEQ ID NO:8의 Rspol BR 도메인을 포함하는 것인, 재조합 변이체.

E18. E16에 있어서, SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:26을 포함하거나 본질적으로 이로 구성된 것인, 재조합 변이체.

E19. E1-E15 중 어느 하나에 있어서, 그것이 SEQ ID NO:25의 단백질에 비해 ZNRF3에 대한 결합 친화도를 증가시키기 위하여 위치 E49, V50, D68 및 D85에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다는 것을 제외하고는 SEQ ID NO:9와 동일한 서열을 갖는 것인, 재조합 변이체.

E20. E19에 있어서, 그것이 SEQ ID NO:25의 단백질에 비해 ZNRF3에 대한 결합 친화도를 증가시키기 위하여 위치 E49, V50, D68 및 D85에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다는 것, 바람직하게는 그것이 다음 아미노산 치환: E49K, V50D, D68G 및 D85G를 포함한다는 것을 제외하고는 SEQ ID NO:5의 Rspol FU1 도메인을 포함하고,

추가로, 상기 FU2 도메인은 Rspol, Rspo3, Rspo4의 FU2 도메인 또는 적어도 ZNRF3에 대한 동일한 결합 친화도를 유지하는 아미노산 치환을 갖는 그들의 기능적 변이체 중에서 선택되는 것인, 재조합 변이체.

E21. E19 또는 E20에 있어서, 상기 FU2 도메인은 SEQ ID NO:6의 Rspol FU2 도메인과 100% 동일한 것인, 재조합 변이체.

E22. E19 또는 E20에 있어서, E45L, E49K, V50D, K55R, D68G, D85G, N88A 및 H108K, N109D 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 Rspol FU1 및 Rspol FU2 도메인을 포함하는 것인, 재조합 변이체.

E23. E19-E22 중 어느 하나에 있어서, SEQ ID NO:27을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되는 것인, 재조합 변이체.

E24. E19-E22 중 어느 하나에 있어서, SEQ ID NO:28을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되는 것인, 재조합 변이체.

E25. E19-E22 중 어느 하나에 있어서, ZNRF3에 대한 결합을 증가시키기 위하여 예컨대 위치 E49K, V50D, D68G 및 D85G에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 예컨대 E49K, V50D, D68G, D85G를 포함하는, Rspo2 FU1 도메인 또는 하이브리드 Rspol FU1 도메인과 조합하여, SEQ ID NO. 10, 14 또는 18의 인간 Rspo3 또는 Rspo4 상응 FU2 도메인을 포함하는 것인, 재조합 변이체.

E26. E1에 있어서, SEQ ID NO: 22-28 중 어느 하나와 비교하여, 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO: 22-28 중 어느 하나의 변이체인 것인, 재조합 변이체.

E27. E26에 있어서, SEQ ID NO: 22-28 중 적어도 하나와 적어도 95% 동일성을 갖고, 상기 FU1 및 FU2 도메인은 SEQ ID NO: 22-28 중 적어도 하나의 FU1 및 FU2 도메인과 100% 동일한 것인, 재조합 변이체.

E28. 다른 천연 아미노산, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환에 의해 대체된 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기를 제외하고 서열번호 22-28 중 하나와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E26의 재조합 변이체 .

E29. E1-E28 중 어느 하나에 있어서, 상기 FU2 도메인은 SEQ ID NO:1의 인간 Rspo1 내 다음 아미노산 잔기: F106, H108, F110, N109, E116, L118, P127, A128, S133, A136, G138, S143, 또는 SEQ ID NO:2의 인간 Rspo2, SEQ ID NO:3의 인간 Rspo3 또는 SEQ ID NO:4의 인간 Rspo4의 상응하는 잔기 중 하나 이상을 포함하는 것인, 재조합 변이체.

E30. E1-E29 중 어느 하나에 있어서, 상기 BR 도메인은 다음 아미노산 잔기: T253, L257, T258, S259, A260 또는 A263 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 포함하고, 통상 상기 BR 도메인은 SEQ ID NO:8, 12, 16, 20과 100% 동일한 것인, 재조합 변이체.

E31. E1-E30 중 어느 하나에 있어서,

O-글리코실화를 개선하기 위하여 BR 도메인에 아미노산 치환을 포함하는,

예를 들어, 상기 변이체는 Rspol의 위치 G252, T253, L257, T258, S259, A260, A263 또는 spo2, Rspo3 또는 Rspo4의 상응하는 잔기에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는,

예를 들어 상기 변이체는 다음 아미노산 치환: G252T, L257S, A260T 또는 A263T 중 하나 이상을 갖는 Rspol의 BR 도메인을 포함하는 것인, 재조합 변이체.

E32. E1-E31 중 어느 하나에 있어서, SEQ ID NO: 41의 Rspol 단백질과 적어도 유사한 수준으로 다음 특성 중 하나 이상을 나타내는 것인, 재조합 변이체:

(i) 그것이, 예를 들어 SPR 또는 ELISA 분석으로 측정되는 바, Rspo1/LGR4 결합 친화도 시험관 내 분석에서 측정 시, SEQ ID NO:41의 레퍼런스 인간 Rspo1과 적어도 동일한 친화도로 LGR4 수용체에 대하여 결합한다;

(ii) 그것이, 예를 들어 SPR 또는 ELISA 분석으로 측정되는 바, Rspo1/ZNRF3 결합 친화도 시험관 내 분석에서 측정 시, SEQ ID NO:41의 레퍼런스 인간 Rspo1과 적어도 동일한 친화도로 ZNRF3 수용체에 대하여 결합한다;

(iii) 그것이, 예를 들어 하기 실시예에 기술되는 바와 같이 Top Flash 분석으로 측정되는 바, SEQ ID NO:41의 레퍼런스 인간 Rspo1과 적어도 유사한 수준으로 wnt/베타 카테닌 경로를 활성화한다;

(iv) 그것이, 예를 들어 시험관 내 Min6 베타-세포 증식 분석에서 측정되는 바, SEQ ID NO:41의 레퍼런스 인간 Rspo1과 적어도 유사한 수준으로 기능성 베타-세포의 증식을 유도한다; 및/또는

(v) 그것이, 예를 들어 생체 내 베타-세포 증식 분석에서 측정되는 바, SEQ ID NO: 41의 레퍼런스 인간 Rspol과 적어도 유사한 수준으로 기능성 베타-세포의 증식을 유도한다.

E33. 펩티드 링커를 통해 재조합 변이체에 직접적으로 또는 간접적으로 융합된 Fc 단편과 함께, E1-E32 중 어느 하나의 상기 재조합 변이체를 포함하는, Fc 융합 단백질.

E34. E33에 있어서, R-스폰딘 단백질의 N-말단에 직접적으로 또는 간접적으로 융합된 Fc 단편을 추가로 포함하는 것인, Fc 융합 단백질.

E35. E33에 있어서, R-스폰딘 단백질의 C-말단에 직접적으로 또는 간접적으로 융합된 Fc 단편을 추가로 포함하는 것인, Fc 융합 단백질.

E36. E33-35 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드 링커는 예를 들어 (GGGGGGSGGGGSGGGGSA)(SEQ ID NO: 44) 또는 (GGGGSGGGGSGGGGGG)(SEQ ID NO: 45)의 링커를 포함하는 것인, Fc 융합 단백질.

E37. E33-E36 중 어느 하나에 있어서, 상기 Fc 단편은 SEQ ID NO:29를 포함하거나 본질적으로 이로 구성되는 것인, Fc 융합 단백질.

E38. E33-E36 중 어느 하나에 있어서, SEQ ID NO: 42, 43, 또는 SEQ ID NO: 92, 93 또는 95로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되는 것인, Fc 융합 단백질.

E39. E1-E38 중 어느 하나에 있어서, 그를 필요로 하는 환자에서 특히 당뇨병, 더욱 바람직하게는 제1형 또는 제2형 당뇨병을 치료하기 위한 약물로서 사용하기 위한 것인, 재조합 변이체.

E40. E33-E39 중 어느 하나에 있어서, 그를 필요로 하는 환자에서 특히 당뇨병, 더욱 바람직하게는 제1형 또는 제2형 당뇨병을 치료하기 위한 약물로서 사용하기 위한 것인, 융합 단백질.

E41. E39의 용도를 위한 재조합 변이체 또는 E40의 용도를 위한 융합 단백질로서, 상기 재조합 변이체 또는 융합 단백질은, 베타-세포, 바람직하게는 줄기 세포-유래 베타-세포와 조합하여 상기 환자에게 투여되는 것인, 재조합 변이체 또는 융합 단백질.

E42. E1-E32 중 어느 하나의 재조합 변이체를 인코딩하는 핵산.

E43. E42의 핵산을 포함하는 벡터.

E44. E42의 핵산을 포함하는 숙주 세포.

E45. E1-E32 중 어느 하나의 재조합 변이체를 생산하는 방법으로서,

(i) 상기 재조합 변이체의 발현을 위한 조건 하에서 E44의 숙주 세포를 배양하는 단계,

(ii) 상기 재조합 변이체를 회수하는 단계,

(iii) 선택적으로 상기 재조합 변이체를 정제하는 단계를 포함하는 방법.

E46. E33-E38 중 어느 하나의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산.

E47. E46의 핵산을 포함하는 벡터.

E48. E46의 핵산을 포함하는 숙주 세포.

E49. E33-E38 중 어느 하나의 융합 단백질을 생산하는 방법으로서,

(i) 상기 융합 단백질의 발현을 위한 조건 하에서 E44의 숙주 세포를 배양하는 단계,

(ii) 상기 재조합 변이체를 회수하는 단계,

도 1은 여러 도메인 FU1, FU2, TSP 및 BR의 개략도와 함께 Rspol, Rspo2, Rspo3 및 Rspo4 아미노산 서열의 정렬을 제공한다.
도 2: PBS (흑색인 대조군) 또는 다양한 용량의 재조합 hRspol과 함께 배양된 Min6 세포의 정량화.
도 3: PBS (대조군, 왼쪽 흑색 막대) 또는 다양한 용량의 변이체 #009 (회색)와 함께 배양된 Min6 세포의 정량화. 400 nM의 오른쪽 막대는 야생형 hRspol을 사용한 Min6 정량 결과에 해당한다.
도 4: PBS (대조군, 왼쪽 흑색 막대) 또는 다양한 용량의 변이체 #008 (회색)과 함께 배양된 Min6 세포의 정량화. 400 nM의 오른쪽 막대는 야생형 hRspol을 사용한 Min6 정량 결과에 해당한다.
도 5: PBS (대조군, 왼쪽 흑색 막대) 또는 다양한 용량의 변이체 #005 (회색)와 함께 배양된 Min6 세포의 정량화. 400 nM의 오른쪽 막대는 야생형 hRspol을 사용한 Min6 정량 결과에 해당한다.
도 6: PBS (대조군, 왼쪽 흑색 막대) 또는 다양한 용량의 변이체 #034 (회색)와 함께 배양된 Min6 세포의 정량화. 400 nM의 오른쪽 막대는 야생형 hRspol을 사용한 Min6 정량 결과에 해당한다.
도 7: PBS (대조군, 왼쪽 흑색 막대) 또는 다양한 용량의 변이체 #047 (회색)과 함께 배양된 Min6 세포의 정량화. 400 nM의 오른쪽 막대는 야생형 hRspol을 사용한 Min6 정량 결과에 해당한다.
도 8: PBS (대조군, 왼쪽 흑색 막대) 또는 다양한 용량의 변이체 #051 (회색)과 함께 배양된 Min6 세포의 정량화. 400 nM의 오른쪽 막대는 야생형 hRspol을 사용한 Min6 정량 결과에 해당한다.
도 9: PBS (대조군, 왼쪽 흑색 막대) 또는 다양한 용량의 변이체 #063 (회색)과 함께 배양된 Min6 세포의 정량화. 400 nM의 오른쪽 막대는 야생형 hRspol을 사용한 Min6 정량 결과에 해당한다.
도 10: PBS (대조군, 왼쪽 흑색 막대) 또는 다양한 용량의 변이체 #064 (회색)와 함께 배양된 Min6 세포의 정량화. 400 nM의 오른쪽 막대는 야생형 hRspol을 사용한 Min6 정량 결과에 해당한다.
도 11: PBS (대조군, 왼쪽 흑색 막대) 또는 태그 히스티딘을 포함하는 다양한 용량의 변이체 #049 (회색)와 함께 배양된 Min6 세포의 정량화. 400 nM의 오른쪽 막대는 야생형 hRspol을 사용한 Min6 정량 결과에 해당한다.
도 12: PBS (대조군, 왼쪽 흑색 막대) 또는 다양한 용량의 변이체 #054 (회색)와 함께 배양된 Min6 세포의 정량화. 400 nM의 오른쪽 막대는 야생형 hRspol을 사용한 Min6 정량 결과에 해당한다.
도 13: PBS (대조군) 또는 200nM 및 400nM에서 24시간 동안 태그 없는 변이체 #049와 함께 배양한 Min6 세포의 정량화.
도 14: PBS (대조군) 또는 200nM 및 400nM에서 48시간 동안 태그 없는 변이체 #049와 함께 배양한 Min6 세포의 정량화. 초기 24-시간 배양 후 신선한 단백질을 첨가하였다.
도 15: PBS (대조군) 또는 200nM 및 400nM에서 72시간 동안 태그 없는 변이체 #049와 함께 배양한 Min6 세포의 정량화. 초기 24-시간 배양 후, 그리고 48 시간 후에 다시 신선한 단백질을 첨가하였다.
도 16: PBS (대조군, 왼쪽 흑색 막대) 또는 다양한 용량의 변이체 #056 (회색)과 함께 배양된 Min6 세포의 정량화. 400 nM의 오른쪽 막대는 야생형 hRspol을 사용한 Min6 정량 결과에 해당한다.
도 17: PBS (대조군, 왼쪽 흑색 막대) 또는 다양한 용량의 변이체 #082 (회색)와 함께 배양된 Min6 세포의 정량화. 400 nM의 오른쪽 막대는 야생형 hRspol을 사용한 Min6 정량 결과에 해당한다.
도 18: PBS (대조군, 왼쪽 흑색 막대) 또는 다양한 용량의 변이체 #0116 (회색)과 함께 배양된 Min6 세포의 정량화. 400 nM의 왼쪽 막대는 야생형 hRspol (#014)을 사용한 Min6 정량 결과에 해당한다.
도 19: 4 일간의 배양 및 변이체 #014 (a), #49 (b), #008 (c), #064 (d), #051 (e), #121 (f) 및 GLP1 (1nM)로 72 시간 처리 후 129/Sv 마우스 랑게르한스 섬의 BrdU 양성 베타-세포의 백분율.
도 20: 변이체 #014 (A, B) 및 변이체 #064 (C, D) 복강 내 주사로 16 주 동안 매일 처리된 암컷 NOD 마우스의 혈당증 추적 조사 및 당뇨병 발병률.
도 21: 0.2 mg/Kg, 0.4 mg/Kg 및 0.8 mg/Kg으로 변이체 #049로 매일 처리된 암컷 NOD 마우스의 당뇨병 발병률.
도 22: 0.2 mg/Kg, 0.4 mg/Kg 및 0.8 mg/Kg으로 변이체 #049로 매일 처리된 NOD 마우스의 혈당증 추적 조사.
도 23: 연속 5일 동안 변이체 #014를 복강 내 주사한 마우스의 췌장 절편에서 섬 면적 (㎛²)에 대해 표준화된 Ki67/인슐린 이중 양성 세포의 정량화.
도 24: 연속 5일 동안 변이체 #014를 복강 내 주사한 마우스의 췌장 절편에서 섬 면적 (㎛²) 에 대해 표준화된 BrdU/인슐린 이중 양성 세포의 정량화.
도 25: STZ 처리 15 일 전부터 변이체 #014 복강 내 주사로 매일 처리된 STZ-유도된 고혈당증 마우스의 혈당증 추적 조사.
도 26: STZ 처리 15 일 전부터 변이체 #014 복강 내 주사로 처리된 STZ-유도된 고혈당증 마우스의 물-섭취량.
도 27: STZ 처리 15 일 전부터 변이체 #014 복강 내 주사로 매일 처리된 STZ-유도된 고혈당증 마우스에 대해 수행된 복강내 글루코오스 내성 테스트. 이 테스트는 변이체 #014 매일 투여를 시작한 지 74 일 후에 수행되었다.
도 28: STZ 처리 7 일 후부터 변이체 #014 복 강내 주사로 매일 처리된 STZ-유도된 고혈당증 마우스의 혈당증 추적 조사.
도 29: STZ 처리 7 일 후부터 변이체 #014 복강 내 주사로 처리된 STZ-유도된 고혈당증 마우스의 물-섭취량.
도 30: STZ 처리 7 일 후부터 변이체 #014 복강 내 주사로 매일 처리된 STZ-유도된 고혈당증 마우스에 대해 수행된 복강 내 글루코오스 내성 테스트. 이 테스트는 변이체 #014 매일 투여를 시작한 지 63 일 후에 수행되었다.
도 31: 인간 섬이 이식되고, 매일 PBS 또는 변이체 #014를 0.4 mg/Kg 및 0.8 mg/Kg으로 주사받은 동물의 혈액에서 측정된 인간 c-펩티드 기아 (fasting).
도 32: PBS (대조군) 또는 변이체 #014 0.4 mg/Kg 및 0.8 mg/Kg으로 28 일 처리한 후 인간 섬이 이식된 마우스에 대해 수행된 복강 내 글루코오스 내성 테스트.
도 33: PBS (대조군) 또는 변이체 #014 0.4 mg/Kg 및 0.8 mg/Kg으로 28 일 처리한 후 인간 섬이 이식된 마우스의 기본 및 글루코오스-자극 혈액 인간 c-펩티드 수준.
도 34: PBS (대조군) 또는 변이체 #014 0.4 mg/Kg 및 0.8 mg/Kg으로 60 일 처리한 후 이식된 인간 섬에서 총 인슐린 부피의 정량화.
도 35: 레퍼런스 비-Fc 단백질 #14에 대해 반감기의 연장을 나타내는, 수컷 129/Sv 마우스에서 0.8 mg/kg으로 SC 투여 후 #63-1, #63-2 및 #64 Fc-융합 단백질의 168 시간-동역학 비교 (n=3/시점). 비교를 위해 단일-용량 PK 프로파일 단백질 #14가 표시된다 (점선).

실시예

1. R-스폰딘 단백질 특징화를 위한 기능 테스트

ZNRF3 결합 분석: ELISA (효소-결합 면역흡착 분석) 프로토콜

ELISA는, 리간드 결합 분자 (항체, 융합 분자 등)와 검출 항체를 사용하여 액체 시료에서 가용성 단백질 (리간드)을 검출하고 정량화하기 위한 플레이트-기반 분석이다.

방법:

ELISA 모듈 (Nunc Maxisorp, Thermo Scientific)을 항원 (100 ㎕/웰, pH 7.4의 PBS 중 1 ㎍/ml, 4℃에서 밤새)으로 처리한다. 항원을 포획한 후, 플레이트를 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS pH 7.4 (PBS-Tween)로 4회 세척하고 2% BSA (Merck)를 함유하는 PBS-Tween으로 60 분 동안 차단한다. 그런 다음, 시료의 연속적 2-배 희석 (제2 층에 사용된 분자 참조)을 4000 ng/ml부터 시작하여 1% BSA가 함유된 PBS-Tween에서 수행하고 플레이트에 적용하고 (100 ㎕/웰), 실온의 진탕기 (300 rpm)에서 60 분간 배양한다.

제3 층이 필요한 경우 (LGR4-His 결합): 플레이트를 PBS-Tween으로 4회 세척한 후, 100 ㎕ 항체(제3 층에 사용된 항체 참조)를 첨가하고, 1% BSA를 함유하는 PBS-Tween에 희석한다. 플레이트를 실온의 진탕기 (300 rpm)에서 30 분 동안 배양한다.

다음으로, 플레이트를 PBS-Tween으로 4회 세척한 후, 퍼옥시다제 컨쥬게이티드 고트 항-마우스 IgG 다클론 항체 (고트 항-마우스-IgG-HRP, 1:10,000, 0.1 ㎍/mL, LabAs Estonia), 1% BSA를 함유하는 PBS-Tween에 희석한다. 플레이트를 실온의 진탕기 (300 rpm)에서 30분 동안 배양한다.

플레이트를 PBS-Tween으로 4회 세척한 후, TMB 기질 용액 VII (Biopanda Diagnostics) 100 ㎕를 첨가한다. 실온의 진탕기 (300 rpm)에서 10분 동안 반응이 진행되도록 하고 50 ㎕의 0.5 M 황산을 첨가하여 종료시킨다.

흡광도는 ELISA 플레이트 판독기 (Thermo Scientific)를 사용하여 450 nm에서 측정된다.

사용된 항원:

· RSPO-1 (#120-38, Peprotech)

· RSPO-2 (#3266-RS, R&D Biosystems)

· RSPO-3 (#120-44, Peprotech)

· lcosagen Cell Factory에서 생산된, 단백질 #007, #008, #014, #059

제2 층에 사용된 분자:

· LGR4-His (#LG4-H52H3, Acro)

· LGR4-FC (#7750-GP, R&D Biosystems)

· ZNRF3-Fc (#7994-RF, R&D Biosystems)

제3 층에 사용된 항체 (LGR4-His 결합용):

· 마우스 단일클론 항-His 항체(1: 2500, 0,2 ㎍/mL, GenScript, Cat. No. A00186)

Wnt/β-카테닌 신호전달 경로 활성을 측정하기 위한 TOP-FLASH-ASSAY

Super-Top-Flash 루시퍼라제 리포터 분석은 조정 배지에서 Wnt 및 R-스폰딘 단백질 양자 모두의 농도와 활성을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 먼저 Super-TOP-Flash 리포터-발현 HEK 293 STF 세포를 준비하고 무-혈청 DMEM에서 96-웰 플레이트에 플레이팅한다 (웰당 1-2 x 10⁴ 세포). 24 시간 후, 혈청-중단된 리포터 세포는 Wnt 또는 R-스폰딘 단백질을 함유하는 여러 양의 배양 배지에 노출된다. 유도 18~24 시간 후, 루시퍼라제 활성을 측정하고 조정 배지에 존재하는 성장 인자의 양을 알려진 단백질 공급원 (재조합 표준 hRSPOI)과 비교한다. 이러한 세포-기반 리포터 분석은 Wnt 및 R-스폰딘 리간드 양자 모두의 활성을 테스트할 수 있다.

필수 시약 및 세포주:

a. HEK-293 STF 세포(ATCC).

b. lcosagen Cell Factory에서 생산된 R-스폰딘 단백질 및 RSPO-1 (#120-38, Peprotech), RSPO-2 (#3266-RS, R&D Biosystems), RSPO-3 (#120-44, Peprotech)

d. Steady-Glo® Luciferase Assay System (Promega, cat# E2510)

e. 완전 성장 배지: 10% FCS (Gibco) + 1x Pen/Strep을 함유하는, DMEM (Gibco) 세포 배양 배지

f. 무-혈청 성장 배지: DMEM (Gibco) 배양 배지 +1x Pen/Strep

g. CELLSTAR® 96 웰 플레이트: 평평한 바닥의 흰색 폴리스티렌 웰 (Greiner)

Super-Top-Flash 루시퍼라제 리포터 분석을 위한 HEK-293 STF 세포 준비:

0일차: 10 cm 배양 플레이트 바닥에서 2 ml 트립신 용액으로 HEK-293-STF 세포를 분리하고, 5 분 후 완전 성장 배지 2 ml를 추가한다. 200 g에서 5 분 동안 세포를 스핀 다운하고 무-혈청 DMEM에 세포 펠릿을 현탁한다. 세포 수를 세고 HEK-293-STF 리포터 세포 (2*10⁵ 세포/ml)를 총 부피 100 ul 무-혈청 배지에서 CELLSTAR 96-웰 플레이트에 접종한다. 가습된 세포-배양 인큐베이터에서 37℃에서 22-26 시간 동안 세포를 배양한다.

1일차: R-스폰딘 단백질을 DMEM 배양 배지로 희석하고 사전-배양된 HEK-293 STF 세포에 적용하여 연속 희석이 달성되도록 한다(이 경우 3배 희석이 사용됨). 37℃에서 18-24 시간 동안 유도제와 함께 세포를 배양한다.

2일차: Steady-Glo® Luciferase Assay 기질 50 ㎕를 배양 웰에 직접 추가하여 STF 파이어플라이 활성을 측정하고, 최소 5 분 동안 기다리고, Glomax Explorer 발광측정기 (Promega)를 사용하여 생물발광 신호 강도를 측정한다. 분석을 위해 결과를 PC로 내보낸다.

Min6 세포 증식 분석

마우스 인슐린종 (Min6) 세포를 4.5 g/l의 글루코오스, 12.5%의 FCS (송아지 태아 혈청), 0.005%의 중탄산나트륨, 100 U/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양하고, 가습된 대기 (37℃, 95% 공기/5% C02)에서 유지된다. 저-계대 (최대 P30) Min6 세포를 80000 세포/ml의 파종 밀도로 12-웰 플레이트에 플레이팅한다. 부착 세포를 저-FCS 배지 (5%)에 다양한 농도로 희석한 표적 분자와 함께 24시간 동안 배양한다. 더 긴 배양을 위해 24 시간 마다 새로운 단백질을 배양 배지에 첨가하였다. 세포는 최종적으로 분리되고 Thoma Chamber를 사용하여 수동으로 정량화된다.

변이체는, 그것이 400 nM의 Rspol에 비해 전반적으로 더 강한 증식 유도 능력을 나타내는 경우 또는 유사한 농도의 hRspol와 비교할 때 상당한 증식 증가를 허용하는 농도가 더 낮은 경우 천연 hRspol보다 더 효율적인 것으로 간주된다.

Wnt/베타 카테닌 분석

Min6 세포는 이전 단락에서 설명한 대로 배양된다. 저 계대 세포를 250,000개 세포/ml의 파종 밀도로 6-웰 플레이트에 플레이팅한다. 부착 세포는 여러 시점에서 저-FCS 배지 (5%) 내로 다양한 용량의 hRspol 유사체로 처리된다. 그 후, 세포를 분리하고 PBS에 재현탁한다. 전체 단백질 내용물을 초음파 처리로 분리하고 β-카테닌의 농도는 제조업체의 지침에 따라 ELISA 분석으로 평가된다. BCA 함량이 각 단백질 시료를 표준화하는 데 사용된다.

생체 내 증식 분석

생체 내 증식 테스트는 2 개월-령 야생형 129SV 마우스에서 수행된다. 3 일의 최소 적응 기간 후, 며칠 연속으로 동물에게 다양한 농도의 관심 변이체를 매일 복강 내 또는 피하 주사한다. 멸균 PBS 150 ul를 매일 주사하여 처리된 마우스를 대조군으로 사용하였다. 마지막으로, 마지막 주사 30분 후에 경추 탈구로 마우스가 희생된다. 췌장을 수집하여 Antigenfix (파라포름알데히드 용액 pH 7,2 - 7,4, Microm Microtech France)에 고정하고, 차가운 PBS로 세척하고 0.86% 식염수에서 1 시간 동안 배양한다. 일련의 에탄올 증가 희석을 통해 (50%, 70%, 80%, 90% 및 100%) 탈수한 후, 췌장은 이소프로판올과 톨루엔으로 처리되어 파라핀에 내장된다. 파라핀 블록을 6 ㎛ 슬라이드로 분할하고 인슐린, PC1/3, Ki67 및 BrdU에 대한 항체를 사용하여 면역형광으로 분석한다.

변이체는, 그것이 더 많은 수의 증식성 β-세포, 베타-세포 질량의 더 큰 증가, 더 우수한 글루코오스 처리를 유도한다면, 또는 필요한 작용/농도의 시작이 천연 hRspol보다 낮다면, 원래 hRspol보다 더 활성인 것으로 간주된다.

분명히, 이러한 접근법은 여러 당뇨병 마우스 모델에서 사용될 수 있는데, 예컨대 다른 것들 중에서도, 스트렙토조토신-처리된 마우스, NOD 동물 또는 Rip-B7 동물에서 그러하다 ([King, Br J Pharmacol. 2012 Jun; 166(3): 877-894] 및 [Karges et al.,Diabetes 2002 Nov; 51(11): 3237-3244]).

결과

A. 재조합 변이체의 생산

아래 표 2에는 아래 프로토콜에 따라 생산된 재조합 Rspo 단백질이 나열되어 있다.

상기 모든 재조합 단백질은, CHO 또는 HEK293 기반 QMCF 세포주를 포함하여 lcosagen이 개발한 QMCF 기술 (US7, 790,446, US8,377,653 참조)을 사용하여 발현되었다.

표 2에 설명된 대부분의 단백질은 다음을 제외하고 BR 도메인 뒤의 C 말단에 정제를 용이하게 하기 위한 짧은 링커와 C-His 태그를 포함한다:

·#014 (천연 hRspol),

·#46, 짧은 링커와 알부민에 대한 친화도가 높은 서열로 C 말단에서 기능화됨,

·Fc 컨쥬게이티드 단백질.

숙련가는, 정제를 위하여 대체 링커 및/또는 태그를 갖는 또는, 그러한 링커 및 태그를 갖지 않는 유사한 재조합 단백질을 생산할 수 있을 것이다.

B. Top Flash 분석에서 베타-카테닌 경로 자극 측정

생산된 모든 변이체는 베타-카테닌 경로를 자극하는 그들의 능력에 대해 테스트되었으며 천연 hRspol과 비교되었다.

아래 표 3은 생산된 변이체 중 일부에 대한 결과를 보여준다:

C. 시험관 내 Min6 증식 분석을 사용하여 Min 증식 활성 측정

각 변이체의 증식 활성이 마우스 인슐린종 (Min6) 세포주를 사용하여 시험관 내에서 평가되었다. 재조합 hRspol은 Min6 증식을 자극하여 종 모양의 용량-반응 곡선을 제공하며 그 피크는 400 nM이다 (도 2).

천연 hRspol과 유사하게, 변이체 #009는 Min6 세포에 대해 종 모양의 용량-반응 유사분열 효과를 나타냈으며, 피크는 400 nM이었다 (도 3). 그러나 이 용량에서 Min6의 증식률은 원래 hRspol에 비해 상당히 높았다 (도 3).

Min6 세포의 수는 테스트된 모든 농도에서 변이체 #008과 함께 배양 시 크게 증가하였다 (도 4). 흥미롭게도 이 수치는 hRspol로 처리된 Min6 세포와 비교할 때 200 nM 및 1 μM 용량에서도 상당히 높았다 (도 4).

변이체 #005는 표준 hRspol과 동일한 종 모양의 용량-반응 곡선을 나타냈으며 피크 증식 반응은 400 nM에서 나타났다 (도 5). 그럼에도 불구하고, 변이체 #005와 함께 배양된 Min6 세포는 천연 hRspol과 함께 배양된 것보다 그 수가 현저히 적었다 (도 5).

흥미롭게도 변이체 #034는 테스트된 모든 농도에서 Min6 세포 증식을 유의하게 자극했으며, 400 nM의 W.T. hRspol과 비교하여 어떠한 유의미한 차이도 없었다 (도 6).

변이체 #047의 증식성 용량-반응 곡선은 종 모양이었으며, 작용 개시는 200 nM이고 피크는 1 μM이었다 (도 7). 이러한 후자 농도에서 Min6 세포의 유사분열 속도는 400 nM의 원래 hRspol과 함께 배양된 세포에 비해 상당히 증가된 것으로 나타났다 (도 7).

중요한 것은 변이체 #051로 Min6 세포를 자극하면 변이체 #047로 처리할 때 관찰된 것과 유사한 모양의 용량-반응 곡선이 생성되었다는 점이다 (도 8). 그러나 변이체 #051은 400 nM의 천연 hRspol과 비교하여 400 nM 및 1 μM 둘 다에서 더 이른 작용 개시(100 nM)를 보여주고 훨씬 더 강한 증식을 유도하였다 (도 8).

흥미롭게도, Fc-컨쥬게이티드 hRspol 변이체 (#063)는 400 nM의 농도에서 배양했을 때 원래 단백질만큼 효율적인 것으로 밝혀졌다 (도 9). 그러나 이 증식 효과는 종 모양의 용량-반응 곡선을 따르지 않고 더 높은 용량에서 다소 안정적으로 유지되었다 (도 9).

반대로, N-말단 Fc-컨쥬게이티드 변이체 #064는 400 nM에서 Min6 세포에 대해 어떠한 유의미한 증식 효과도 나타내지 않았으며, 이 단백질은 1 μM 이상으로 희석된 경우에만 효율적이 되었다 (도 10).

태그 His를 포함하는 변이체 #049와 변이체 #056의 유사분열 효과는 동일한 종 모양의 용량-반응 곡선을 생성했으며 천연 재조합 hRspol과 동일한 효율성을 보여주었다 (도 11-12).

태그 없는 변이체 #049의 효능도 Min6 세포에서 테스트되었다. Min6 세포 수는 400 nM에서 변이체 #049를 사용하여 24-시간 배양한 후 크게 증가하였다 (도 13). 중요하게, 이러한 증가는 동일한 단백질을 48 시간 또는 72 시간 동안 배양했을 때 더 강력하고 유의미한 것으로 나타났다 (도 14 및 15).

유사하게, 변이체 #054는 최대 400 nM 투여량까지 점점 더 효율적인 것으로 관찰되었으며, 이 효율은 더 높은 농도에서는 점진적으로 감소하였다 (도 16). 그러나 이 유사체는 그의 용량-반응 곡선의 피크에서 Min6 증식을 자극하는데 있어서 원래 hRspol보다 훨씬 더 강력한 것으로 밝혀졌다 (도 16).

예기치 않게, 변이체 #082는 테스트된 모든 농도에서 Min6 세포 증식을 강력하게 자극하여 더 낮은 용량에서도 hRspol보다 훨씬 더 강력한 유사분열 활성을 나타내었다 (도 17).

변이체 #116은 400 nM에서 활성이 피크인 종 모양 방식으로 Min6 세포 수를 증가시킨다 (도 18).

천연 인간 Rspo3도 생체 내에서 베타-세포 증식을 유도하는 그들의 능력에 대해 테스트되었다. 그 후, 추가 분석은 야생형 마우스를 인간 Rspo3에 단기 노출 (5~30 분)하면 생체 내에서 베타-세포 증식이 또한 유도된다는 것을 입증하였다.

D. ZNRF3 결합의 결정

본 발명자들은 변이체 #009, #047 및 #051을 생산하고 위에서 설명한 ZNRF3-Fc 수용체 결합 분석을 사용하여 원래의 천연 Rspol과 비교하여 ZNRF3에 대한 결합을 향상시키는 그들의 능력을 테스트하였다.

변이체 #009는 대조군 Rspol (돌연변이 없음)과 유사하게 행동하는 반면, 변이체 #047 및 #051은 대조군 Rspol과 비교하여 ZNRF3에 대한 우수한 결합 친화도를 나타낸다.

2. 분리된 섬에서의 베타-세포 증식

2.1 방법

2.1.1 동물

수컷 129S2/SvPasCrl 마우스를 Charles River Laboratories (69210 Saint-Germain Nuelles, France)에서 구입하였다: 60 마리의 10~12주령 마우스를 사용하였다. 동물에 대한 모든 실험은 유럽 동물 관리 지침 (2010/63/UE) 및 승인된 프로젝트 N°2796의 일부에 따라 수행되었다. 실험 시작 전 1 주일 동안 동물을 환경에 순응시켰고 온도가 조절된 (22 ± 2℃) 구역에서 12 시간 명암 주기 (오전 7시에 점등)로 사육하였다. 모든 마우스에게 SAFE (Scientific Animal Food and Engineering - Route de Saint Bris - 89290 AUGY - France)의 정상적인 성장 식단 A04를 섭취하고 마음껏 마시도록 허용하였다. 깔짚 (멸균 톱밥)은 격일로 교체되었다. 마우스를 케이지당 6 마리의 동물 그룹으로 나누었다. 케이지의 크기는 42.5 x 26.6 x 15.5 cm였다. 일반적인 징후가 관찰되었으며, 비정상적인 징후가 없는 동물만 연구에 포함되었다.

마우스를 펜토바르비탈 복강 내 주사로 마취시키고 췌장에 콜라게나아제를 주입하여 섬을 추가로 분리하였다. RPMI 1640에서 하룻밤 안정화 기간 후, 섬을 이동시키고 (dispatched) 72 시간 동안 화합물 및 레퍼런스로 처리하여 세포 증식 평가를 추가로 진행하였다.

2.1.2 섬 분리 및 처리

129/Sv 마우스의 섬을 췌장의 콜라게나제 분해로 분리하고 Hanks Balanced Salt 용액 (HBSS)으로 세척한 후 Histopaque 1077 및 HBSS를 사용하여 밀도 구배로 정제하였다. 30 개 섬 밀도로 손으로 골라 섬을 페트리 디쉬로 이동시키고 90℃, 공기/5% C02의 습한 분위기 내 37℃에서 10 mM Hepes, 2 mM 글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 SVF 10%로 보충된 RPMI1640에 넣었다. 밤새 안정화 기간 후, 배양 배지를 제거하고 테스트 화합물 또는 레퍼런스가 없거나 (대조군) 또는 그와 함께 새로운 배양 배지를 첨가하였다. 그런 다음 배지와 처리를 24 시간 및 48 시간 후에 갱신하였다. 처리 마지막 24 시간 동안 BrdU (10 μM)를 배양 배지에 첨가하였다.

섬은 다음 표 4에 설명된 대로 그룹당 6개의 페트리 디쉬를 사용하여 8개 그룹으로 나뉘었다:

2.1.3 증식 측정을 위한 분리된 섬 준비

72 시간의 처리 후, 각 조건에 대해 페트리 디쉬에서 30 개의 섬 배치 (batch)를 수집하고 1.5 ml Eppendorf 튜브로 옮겼다. 그 후, 트립신-EDTA 0.25%로 분해하기 전에, 섬을 DPBS를 이용하여 원심분리 (1000 rpm, 30 초, 4℃)하여 3회 세척하였다. RPMI 1640을 첨가하여 반응을 중단시키고, 분해된 섬을 사이토슬라이드에서 사이토스핀 처리하였다.

그 후, 섬을 30 분 동안 파라포름알데히드 3.7%로 고정하고 Triton X100 - BSA 5% 중 0.2%로 투과화했으며 항원 검색은 100℃에서 pH 6의 시트레이트 완충액을 사용하여 20 분 동안 수행하였다. 항체의 비-특이적 결합을 방지하기 위해 면역염색 전에 PBS-5% BSA에서 차단 단계를 수행하였다.

2.1.4 베타-세포 증식의 측정

세포 증식은, 고트 항-랫트 IgG Alexa Fluor 647 (ThermoFisher Scientific - ref. A-21247)과 결합된 랫트 항-BrdU 항체 (Abcam - Ref. ab6326) 및 고트 항-마우스 IgG DyLight®488 항체 (Diagomix - ref. GtxMu-003-D488NHSX)와 결합된 마우스 항-인슐린 항체 (Sigma, ref. 12018)로 이중 면역염색 후 절편에서 BrdU 양성 세포를 측정하여 추정되었다. 세포핵은 DAPI와 함께 ProLong™ Gold Antifade Mountant (Life Technologies - ref. P36935)를 사용하여 염색되었다. BrdU 면역염색으로 염색된 세포의 수는 슬라이드 스캐닝 및 NDP 뷰 또는 케이스 뷰어 이미징 소프트웨어를 사용한 분석 후에 결정되었다. 분석은 배치당 5~6개의 시료에 대해 수행되었다.

2.2 결과

이 연구는 6 개 변이체: #008, #014, #049, #051, #064 및 #121에 대한 72 시간-노출의 129/Sv 마우스 랑게르한스 섬의 베타-세포 증식에 미치는 효과를 평가하기 위해 고안되었다. #008, #014, #051, #064 단백질은 3 가지 농도 (0.2, 1 및 3 μM)에서 테스트되었으며 #049 및 #121은 5 가지 농도 (0.1, 0.2, 0.4, 1 및 2 μM (#049) 또는 3 μM (#121))에서 테스트되었다. 세포 증식은 BrdU 양성 세포 수를 총 세포 수로 나누어 계산하고 %로 표시되었다 (도 19). 결과는 평균 ± SEM으로 표시되었다. 관찰 횟수는 처리당 5~6회였다. 화합물 효과를 분석하기 위해, 통계 분석은 Anova에 이어 Dunnett 테스트를 수행하거나 또는 분산이 크게 다를 때 Kruskal-Wallis에 이어 Dunn 테스트를 사용하여 수행되었다 (GraphPad PRISM®8). p 값 < 0.05는 유의미한 것으로 간주되었다.

3. 암컷 NOD 마우스의 혈당증 진화 및 베타-세포 질량

3.1 방법

3.1.1 동물

암컷 NOD/Mrk Tac 마우스는 Taconic Biosciences (4623 Ejby, Lille Skensved, Denmark)에서 제공받았다: 55 마리의 마우스는 CNRS - Universite de Paris - UMR 7592 동물 시설로 옮겨졌을 때 6~8주령이었다. 동물에 대한 모든 실험은 유럽 동물 관리 지침 (2010/63/UE) 및 승인된 프로젝트 #20173 및 #31876의 일부에 따라 수행되었다. 실험 전 1 주일 동안 동물을 환경에 순응시켰고 온도가 조절된 (22 ± 2℃) 구역에서 12 시간 명암 주기 (오전 7시에 점등)로 사육하였다. 모든 마우스에게 ALTROMIN (Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG- Im Seelenkamp 20-D-32791 Lage - Germany)의 NIH-31M 식단을 섭취하고 마음껏 마시도록 허용하였다. 깔짚 (멸균 톱밥)은 격일로 교체되었다. 마우스를 케이지당 5 마리의 동물 그룹으로 나누었다. 케이지의 크기는 37.3 x 23.4 x 14.0 cm였다. 일반적인 징후가 관찰되었으며, 비정상적인 징후가 없는 동물만 연구에 포함되었다.

3.1.2 연구 설계

연구 16 주 동안, 단백질은, 변이체 #014의 경우 하루에 한 번 그리고 변이체 #064의 경우 일주일에 한 번 아침에 복강 내 경로를 통해 아래 표 5에 기술된 바와 같이 10 ml/kg의 투여 부피로 스폰서가 제공한 용량으로 마우스에게 전달되었다.

약물 용액은 다음과 같이 제조되었다:

- #064: PBS 1X pH 7.4 내 1 mg/ml의 단백질의 적절한 양을 PBS 1X pH 7.4에 희석하여 240 ㎍/ml 용액 (2400 ㎍/kg/10 ml)을 얻었다.

- #014: PBS 1X pH 7.4 내 1 mg/ml의 단백질의 적절한 양을 PBS 1X pH 7.4에 희석하여 80 ㎍/ml 용액 (800 ㎍/kg/10 ml)을 얻었다.

이 용액을 PBS 1X pH 7.4에 1:2로 추가로 희석하여 40 ㎍/ml 용액 (400 ㎍/kg/10 ml)을 얻었다. 준비할 부피는 주사할 동물의 수에 맞게 조정되었다.

1 주와 18 주 사이에 모든 동물은 복강 내 경로를 통해 아침에 하루 한 번 비히클 또는 화합물을 투여받았다 (#64의 경우 일주일에 한 번). 꼬리 정맥에서 혈액 샘플링 후 Accu-Check 판독기를 사용하여 16주차까지 일주일에 한 번씩 혈당증이 모니터링되었다.

10-주-령 암컷 NOD 마우스에 태그가 없는 변이체 #049를 13주 동안 0.2 mg/Kg, 0.4 mg/Kg 및 0.8 mg/Kg의 농도로 매일 복강 내 주사하였다. 그들의 혈당증과 체중을 매주 모니터링하였다. 혈당 수치가 250 mg/dl을 초과하면 마우스를 당뇨병으로 간주하였다.

분석 방법

글루코오스 농도는 Horiba Medical에서 시판되는 키트 (ref. A11A01667)를 사용하여 측정된다. 이 과정은 2-단계 효소 반응을 기반으로 한다:

두 번째 단계에서 생성된 NADH로 인한 흡수를 측정하여 반응을 역학적으로 모니터링한다. 측정된 흡광도 변화로부터 시료의 글루코오스 함량을 계산할 수 있다.

인슐린 농도는 Alpco의 시판 키트 (ref. 80-INSMSU-E01/E10)를 사용하여 측정된다. ALPCO Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA는 샌드위치형 면역분석법이다. 96-웰 마이크로플레이트는 인슐린에 특이적인 단일클론 항체로 코팅되어 있다. 표준물질, 대조물질 및 시료를 컨쥬게이트와 함께 마이크로플레이트 웰에 첨가한다. 그 후, 마이크로플레이트를 700-900 rpm으로 마이크로플레이트 진탕기에서 배양한다. 첫 번째 배양이 완료된 후 웰을 Wash Buffer로 세척하고 블롯 건조시킨다. TMB Substrate를 첨가하고 마이크로플레이트를 마이크로플레이트 진탕기에서 700-900 rpm으로 두 번째로 배양한다. 두 번째 인큐베이션이 완료되면 Stop Solution을 추가하고 분광광도계를 사용하여 450 nm에서 광학 밀도 (OD)를 측정한다. 생성된 색의 강도는 시료의 인슐린 양에 정비례한다. 측정 범위는 0.025 - 6.9 ng/mL이다.

3.2 결과

본 연구는, 혈당증 진행 및 당뇨병 표현형 및 베타-세포 질량에 대한, 암컷 NOD 마우스 (4개 그룹)에서 2 가지 용량의 #014 단백질 (400 & 800 ㎍/kg) 및 한 가지 용량의 #64 단백질 (2400 ㎍/kg)의 복강 내 경로에 의한 18-주 처리의 효과를 평가하기 위해 설계되었다: 비히클 (n=15), 2 가지 농도의 #014 단백질 (n=13), 한 가지 농도의 #64 단백질 (n=14), 10 주령에서부터 18 주 동안 화합물 투여.

도 20의 결과는 각각의 관찰 수 (n)와 함께 평균 ± SEM으로 표시되었다. 처리된 그룹을 STZ 대조군과 비교하기 위해 Anova에 이어 Dunnett의 t 테스트를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. Bartlett 테스트 (GraphPad PRISM®8)에 의해 계산된 바 그룹 간의 분산이 크게 다른 경우 Kruskal-Wallis 테스트에 이은 Dunn 테스트가 사용되었다. 0.05의 p 값은 유의미한 것으로 간주되었다.

당뇨병 맥락에서 β-세포 손실에 대응하는 변이체 #049의 능력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 NOD 마우스를 제1형 당뇨병 모델로 사용하였다. 흥미롭게도, 변이체 #049의 매일 복강 내 투여는 용량 의존적으로 당뇨병 발생률을 감소시켰다 (도 21). 중요하게, 0.8 mg/Kg 농도의 변이체 #049로 처리된 설치류는 대조군에 비해 기본 혈당증에 있어서 무시할 정도의 증가만 나타내었다 (도 22).

4. 생체 내 테스트

4.1 방법

4.1.1 생체 내 중기 (mid-term) 증식 분석

생체 내 증식 테스트는 2 개월-령 야생형 수컷 129SV 마우스에서 수행된다. 3 일의 최소 적응 기간 후, 동물에게 0.4 mg/Kg 및 0.8 mg/kg의 #014를 연속 5일 동안 매일 복강 내 주사한다. 멸균 PBS 150 ul를 매일 주사하여 처리한 마우스를 대조군으로 사용한다. 추가적으로, 모든 마우스에게 희생 전 72 시간 동안 1 mg/ml의 농도로 식수에 희석된 티미딘 유사체 브로모데옥시우리딘 (BrdU)을 제공하였다. 마지막으로, 마지막 주사 후 30분 후에 경추 탈구로 인해 마우스가 희생된다. 췌장을 수집하여 Antigenfix (파라포름알데히드 용액 pH 7,2 - 7,4, Microm Microtech France)에 고정하고, 차가운 PBS로 세척하고 0.86% 식염수에서 1 시간 동안 배양한다. 일련의 에탄올 증가 희석을 통해 (50%, 70%, 80%, 90% 및 100%) 탈수한 후, 췌장은 이소프로판올과 톨루엔으로 처리되어 파라핀에 내장된다. 파라핀 블록을 6 ㎛ 슬라이드로 분할하고 인슐린, Ki67 및 BrdU에 대한 항체를 사용하여 면역형광으로 분석한다.

4.4.2 스트렙토조토신-유도된 마우스 고혈당증 모델에 대한 생체 내 효능 테스트

이들 테스트는 2 개월-령 성체 야생형 수컷 129SV 마우스에서 수행된다. 고혈당증을 유도하기 위해 129SV 수컷 쥐에게 DNA와 염색체 손상으로 인해 발생하는 세포 독성 효과를 나타내는 글루코사민-니트로소우레아 화합물인 스트렙토조토신 (STZ)을 복강 내 주사한다. 간단히, STZ를 0.1 M 소듐 시트레이트 완충액 (pH 4.5)에 용해시키고, 5 시간 금식 (starvation) 이후 연속 3 일에 걸쳐 이를 50 mg/Kg의 용량으로 투여한다. 고혈당증 발생은 ONETOUCH 혈당계 (Life Scan, Inc., CA)를 사용하여 혈당 수준을 모니터링하여 평가하였다. 물 소비량은 일주일에 한 번 수동으로 결정되었다. 글루코오스 내성을 평가하기 위해 복강 내 글루코오스 내성 검사 (ip-GTT)를 수행하였다. 이러한 테스트를 위해, 마우스를 5 시간 동안 금식시키고 (fasted) D-(+)-글루코오스 2 g/체중kg을 복강 내 주사하였다. 혈당 수준은 ONETOUCH 혈당계를 사용하여 주사 후 지정된 시점에 측정되었다. STZ 처리 15 일 전 또는 처리 7 일 후에 시작하여, PBS 또는 변이체 #014 (SEQ ID NO: 41)를 0.8 mg/Kg의 용량으로 복강 내 주사로 매일 투여하였다.

4.4.3 이식된 인간 섬에 대한 생체 내 효능 테스트

이 실험을 위해 12 마리의 Rag2N12 면역결핍 마우스에 인간 섬을 이식하였다 (500 개 섬과 등가치/마우스). 가스 마취 (isoflurane) 후, 왼쪽 신장에 접근하기 위해 요추 개복술을 시행하였다. 섬 펠릿 (500 개 섬과 등가치)을 카테터를 통해 각 동물 신장의 피막하 공간에 주입하였다. 이식 후, 출혈과 세포 누출을 방지하기 위해 주머니 (capsule)를 소작하였다. 봉합은 근육층과 피부층 모두에서 이루어졌다. 수술 전후 통증을 완화하기 위해 피하 모르핀 (Buprenorphine - 0.05 mg/kg)을 투여하였다. 각 마우스는 SOPF 동물 시설의 멸균 우리에서 사육되었다. 2 주 회복기 후, 마우스를 PBS 또는 변이체 #14 0.4 mg/Kg 및 0.8 mg/Kg의 용량으로 60일 동안 매일 처리하였다. 2 주마다 6 시간 동안 금식시킨 후 혈액 c-펩티드 수치를 측정하였다. 변이체 #014 처리 28 일 후, ip-GTT로 글루코오스 처리를 평가하였다. 마지막으로, 동물에게 희생 전 1 주 동안 1 mg/ml의 농도로 식수에 희석된 BrdU를 제공하였다. 실험 말기에, 마우스를 희생시키고 섬 이식편을 분리하고 고정한 다음 인슐린과 BrdU에 대한 항체를 사용하여 면역형광법으로 분석하였다.

4.2 결과

4.2.1 생체 내 hRspo 1 증식 활성 평가

성체 쥣과의 β-세포 신생을 유도하는 hRspol의 능력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 변이체 #014를 연속 5일 동안 복강 내 투여하였다. 중요하게, 테스트된 모든 용량에서 변이체 #014로 처리된 마우스의 췌장 시료에서 세포 내 인슐린과 내인성 핵 증식 마커 Ki67 공동발현 증가가 관찰되었다 (도 23). 특히, 0.8 mg/Kg의 변이체 #014로 처리된 동물로부터 분리된 조직에서 상당한 6-배 증가가 평가되었다. 따라서, 변이체 #014 투여는 췌장 β-세포 내에서 BrdU 축적을 향상시키는 것으로 나타났다 (도 24). 그러나 다시금, BrdU/인슐린 공동발현 세포는 0.8 mg/Kg의 변이체 #014를 주사한 마우스의 췌장 절편에서 훨씬 더 풍부했다.

4.2.2 STZ-유도된 고혈당증 마우스 모델에서 혈당 조절에 대한 변이체 #014의 효과

이 연구는 다중 저-용량 스트렙토조토신 (STZ)으로 유도된 고혈당 마우스 모델에서 혈당 조절에 대한 #014 단백질 (0.8 mg/kg)을 사용한 만성 치료의 효과를 평가하기 위해 고안되었다. 3 일 연속 STZ (50 mg/Kg) 3회 용량으로 고혈당증이 유도되었다. STZ 처리 15 일 전 또는 처리 7 일 후부터 시작하여 변이체 #014 또는 비히클을 매일 복강 내 주사로 투여하였다.

두 실험 환경 모두에서, STZ는 모든 동물에서 효율적으로 고혈당증을 유도하였다. 그러나, 변이체 #014를 주사한 마우스의 혈당 수준은 2 개월의 전체 실험 기간 동안 비히클-주사된 대조군과 비교하여 꾸준히 낮은 상태로 유지되었 (도 25 및 28). 중요하게, 이 차이는 STZ-매개 고혈당증 발병 전에 변이체 #014를 접종했을 때 더욱 두드러지고 유의미하였다. 따라서, 변이체 #014로 처리된 마우스에서 24 시간-물 섭취량이 지속적으로 감소했는데, 이는 hRspol의 만성 투여가 고혈당증 관련 다음증 (polydipsia)을 완화시킨다는 것을 나타낸다 (도 26 및 29).

2 개월 간의 혈당증 모니터링 후, ip-GTT는 두 실험 모두에서 대조군에 비해 #14 단백질로 IP 처리된 마우스에서 글루코오스 내성이 유의하게 개선되었음을 보여주었다 (도 27 및 30). 이러한 데이터는 변이체 #014가 만성 고혈당증 마우스 모델에서 혈당 조절을 개선할 수 있음을 나타낸다.

4.2.3 이식된 인간 섬에 대한 변이체 #014의 효과

인간 β-세포에 대한 변이체 #014의 증식 활성을 테스트하기 위해, 이 분자를 신장 주머니 아래 인간 섬이 이식된 면역결핍 마우스에 매일 주사하였다. 흥미롭게도, 마우스에게 변이체 #014를 0.4 mg/Kg 및 0.8 mg/Kg으로 투여하면 PBS-주입된 대조군과 비교하여 공복 혈액 인간 펩티드 수준이 점진적으로 증가하였다 (도 31). 주목할 만한 점은, 이 증가는 변이체 #014의 2 가지 용량으로 처리된 마우스 양자 모두에서 45 일째에 유의미해졌고, 60 일째에 0.4 mg/Kg를 주사한 동물의 실험 그룹에서는 유의미하게 유지되었다는 것이다 (도 31). 또한, 28 일에 ip-GTT로 평가한 글루코오스 내성은 대조군과 비교하여 변이체 #014-처리된 동물에서 개선된 것으로 나타났다 (도 32). 따라서, 혈장 인간 c-펩티드는 금식 시뿐만 아니라 글루코오스 볼루스로 자극한 지 15 분 후에도 유의하게 증가된 것으로 나타났다(도 33).

마지막으로, 마우스에게 일주일 동안 식수에 BrdU를 제공하고 췌장 조직 분석을 위해 60 일째에 희생시켰다. 이들 연구는 대조군과 비교하여 변이체 #014를 주사한 설치류의 췌장 절편에서 BrdU-면역표지된 β-세포 및 β-세포 부피에 있어서 강하고 유의한 증가를 밝혀내었다 (도 34). 전체적으로, 이들 데이터는 변이체 #014의 만성 투여가 인간 β-세포 증식 및 과증식을 효율적으로 자극한다는 것을 시사한다.

5. 약동학

5.1 방법

Fc 융합 변이체 #63-1, #63-2 및 #64의 약동학적 프로파일을 129/Sv 마우스에 0.8 mg/kg으로 단일 피하 주사하여 조사하였다. 단백질은 아래 표 6에 표시된 대로 10 ml/kg의 투여 부피로, 피하 경로 (SC, 등을 따라서 피부임)를 통해 마우스에 투여되었다:

상기 표에 자세히 설명된 대로 혈액 시료 (동물당 3 가지 시점 + 하나의 최종 혈액 샘플링)을 투여 후 1 시간, 3 시간, 6 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간 및 168 시간에 수집하고 생체분석 테스트를 위해 혈장을 분리하였다.

단백질 #63-1, #63-2 및 #64의 농도는, 상업용 Human R-Spondin 1 DuoSet ELISA 키트 (R&D Systems)를 기반으로 하는, 최적화된 생체분석 방법을 사용하여 혈장에서 정량화되었다.

농도 대 시간 도표는 Excel에서 생성되었으며 PK 데이터는 Excel용 PK Solver 추가 기능을 사용하여 평가되었다 (Zhang Y, t al. Comput Methods Programs Biomed. 2010 Sep;99(3):306-14).

5.2 결과

Fc-융합 변이체 #64, #63-1 및 #63-2의 약동학적 프로파일을 도 35 및 표 7에 나타내었다. 프로파일은, 비교를 위한 이전 연구 (연구 번호: DX001-PHA-21-017)에서 생성된 레퍼런스 단백질 #14의 단일 용량 프로파일과 중첩되었다.

129/Sv 마우스에 800 ㎍/kg을 피하 투여한 후 세 가지 단백질의 168h-동역학을 비교한 결과, C_max는 투여 후 1 시간에서 3 시간 사이에 (T_max) 도달한 것으로 나타났다. 이 시점 이후, 3 가지 단백질 모두의 혈장 수준은 연구 마지막 시점 (168 시간)까지 점차적으로 감소하였다. 단백질 #14는 SC 주사 후 최대 24 시간 동안 정량화할 수 있었지만, 3 가지 Fc-융합 단백질은 모두 투여 후 168 시간에도 혈장에서 검출될 수 있었으며, 이는 Fc-부분에 의해 부여된 약 6.5h에서 >30h까지 반감기의 성공적인 연장을 입증한다 (#14에 대해 추정)(도 35).

6. 2 가지 Rspo1-Fc 융합 단백질의 생산

#063 (hRspol 21-263-링커-Fc) 및 #064 (Fc-링커-hRspo1-21-263) 변이체는 CHOEBNALT-85-E9 세포에서 일시적으로 발현되었다. 생산된 두 단백질의 양이 측정된다. 변이체 #064의 생산 수율은 변이체 #063보다 높다 (11.25 mg vs 4.5 mg). 따라서, 본 발명의 변이체의 N-말단 단부에 Fc 폴리펩티드의 융합은 Fc 융합 단백질의 생산 수율을 증가되도록 한다.

7. Fc 융합 단백질 내 링커의 최적화

본 발명자들은 활성 Fc 융합 단백질을 생성하기 위해서는 링커 최적화가 필요하다는 것을 보여주었다. 실제로, 링커가 없는 상업용 Fc 융합 단백질 (Fc-hRspo1; Creative Biomart 053H)은 TopFlash 분석에서 활성이 없었다. 이전에 테스트된 변이체 #064 또는 #063과 달리, Fc-hRspo1 단백질 (Creative Biomart 053H)은 췌장 β-세포 증식을 자극하지 않는 것으로 보인다.

발명을 실시하기 위한 유용한 서열

Claims

다음 FU1, FU2, TSP 및 BR 도메인을 포함하는 R-스폰딘 단백질의 재조합 변이체로서, 여기서,
a. FU1은 각각 SEQ ID NO: 5, 9, 13 및 17에 제시된 인간 Rspo1, Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 FU1 도메인 중 임의의 것에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 도메인이고,
b. FU2는 각각 SEQ ID NO: 6, 10, 14, 18에 제시된 인간 Rspol, Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 FU2 도메인 중 임의의 것에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 도메인이고,
c. TSP는 SEQ ID NO: 7, 11, 15, 19에 제시된 인간 Rspo1, Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 TSP 도메인 중 임의의 것에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 도메인이고, 및,
d. BR은 SEQ ID NO: 8, 12, 16, 20에 제시된 인간 Rspol, Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 BR 도메인 중 임의의 것에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 도메인인,
R-스폰딘 단백질의 재조합 변이체.
제1항에 있어서,
적어도 H108K 및 N109D 아미노산 치환을 갖는 Rspol FU1 및 Rspol FU2 도메인을 포함하는,
바람직하게는 상기 변이체는 SEQ ID NO:66을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는 것인, R-스폰딘 단백질의 재조합 변이체
제1항 또는 제2항에 있어서,
각각 상응하는 SEQ ID NO:5의 인간 Rspol FU1 및 SEQ ID NO:6의 Rspol FU2 도메인과 정렬될 때, FU1 또는 FU2 도메인 각각에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 것인, 재조합 변이체.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서,
Rspo1의 영역 21-33 내 또는 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 등가 영역 내에서 처음 10-14개의 N-말단 아미노산의 결실, 통상 Rspol의 잔기 21-31의 결실을 포함하는,
바람직하게는 SEQ ID NO:24의 단백질을 포함하거나 그로 이루어지는 것인, 재조합 변이체.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서,
적어도 SEQ ID NO:5의 인간 Rspol FU1 도메인 내 R66의, 또는 인간 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4 FU1 도메인 서열 내 등가의 아르기닌 잔기의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 ZNRF3 결합을 감소시키거나 제거하는,
통상 상기 변이체는 ZNRF3 결합을 감소시키거나 제거하는 잔기 R66의 단일 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:5의 Rspo1 FU1 도메인을 포함하고,
예컨대 상기 재조합 변이체는 SEQ ID NO:23을 포함하거나 그로 이루어지는 것인, 재조합 변이체.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서,
상기 변이체는 FU2 및 TSP 도메인 사이에 N-글리코실화 부위를 포함하지 않고,
예컨대 이는 Rspol의 잔기 N137 또는 Rspo2, Rspo3 또는 Rspo4의 등가 잔기에서 돌연변이를 포함하여, 이러한 위치에서 N-글리코실화를 억제하고,
바람직하게는 상기 재조합 변이체는 SEQ ID NO:22를 포함하거나 그로 이루어지는 것인, 재조합 변이체.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서,
상기 FU1 도메인은 SEQ ID NO: 9의 Rspo2 FU1 도메인과 100% 동일하고, 상기 FU2는 Rspol, Rspo3, Rspo4의 FU2 도메인 또는 LGR4에 대해 적어도 동일한 결합 친화도를 유지하는 아미노산 치환을 갖는 그의 기능적 변이체이고,
바람직하게는 상기 변이체는 SEQ ID NO:9의 Rspo2 FU1 도메인 및 SEQ ID NO:6의 Rspol FU2 도메인, 및 선택적으로 SEQ ID NO:7의 Rspol TSP 도메인 및 SEQ ID NO:8의 Rspol BR 도메인을 포함하는,
더욱 바람직하게는 상기 변이체는 SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:26을 포함하거나 본질적으로 그로 이루어지는 것인, 재조합 변이체.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서,
SEQ ID NO: 41의 Rspol 단백질과 적어도 유사한 수준으로 다음 특성 중 하나 이상을 나타내는 것인, 재조합 변이체:
(i) 그것이, 예를 들어 SPR 분석으로 측정되는 바, Rspo1/LGR4 결합 친화도 시험관 내 분석에서 측정 시, SEQ ID NO:41의 레퍼런스 인간 Rspo1과 적어도 동일한 친화도로 LGR4 수용체에 대하여 결합한다;
(ii) 그것이, 예를 들어 시험관 내 Min6 베타-세포 증식 분석에서 측정되는 바, SEQ ID NO:41의 레퍼런스 인간 Rspo1과 적어도 유사한 수준으로 기능성 베타-세포의 증식을 유도한다; 및/또는
(iii) 그것이, 예를 들어 생체 내 베타-세포 증식 분석에서 측정되는 바, SEQ ID NO: 41의 레퍼런스 인간 Rspol과 적어도 유사한 수준으로 기능성 베타-세포의 증식을 유도한다.
Fc 융합 단백질로서,
펩티드 링커를 통해 재조합 변이체에 직접적으로 또는 간접적으로 융합된 Fc 단편과 함께, 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항의 상기 재조합 변이체를 포함하는,
바람직하게는 상기 Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:42, 43, 92 또는 93을 포함하거나 본질적으로 그로 이루어지는, Fc 융합 단백질.
특히 당뇨병, 더욱 바람직하게는 I형 또는 II형 당뇨병을 치료하기 위한 약물로서 사용하기 위한 것인, 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항의 재조합 변이체 또는 제9항의 융합 단백질.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항의 재조합 변이체 또는 제9항의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산.
제11항의 핵산을 포함하는 벡터.
제11항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항의 재조합 변이체 또는 제9항의 융합 단백질을 생산하는 방법으로서,
(i) 상기 재조합 변이체 또는 융합 단백질의 발현을 위한 조건 하에서 제13항의 숙주 세포를 배양하는 단계,
(ii) 상기 재조합 변이체 또는 융합 단백질을 회수하는 단계,
(iii) 선택적으로 상기 재조합 변이체 또는 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 방법.