CN117980323A

CN117980323A - R-spondin蛋白的重组变体及其用途

Info

Publication number: CN117980323A
Application number: CN202280061453.8A
Authority: CN
Inventors: P·科隆巴; P·博蒂
Original assignee: Riviera France, University of; Diogenes Corp; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Riviera France, University of; Diogenes Corp; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2021-07-15
Filing date: 2022-07-15
Publication date: 2024-05-03

Abstract

本发明涉及R‑spondin蛋白的重组变体及其作为药物的用途，特别是用于治疗糖尿病。

Description

R-spondin蛋白的重组变体及其用途

技术领域

本公开涉及R-spondin蛋白的重组变体及其作为药物的用途，特别是用于治疗糖尿病。

背景技术

在过去的几十年中，糖尿病已经成为最普遍的代谢性疾病之一，其流行程度已影响到全球近9％的人口(WHO，2016)。到2049年，受糖尿病影响的人数预计达到6亿。糖尿病的特征在于高血糖水平，其在大多数情况下是由胰腺无法分泌足够量的胰岛素所致。1型糖尿病(T1D)是由产生胰岛素的β-细胞在自身免疫的介导下遭到破坏所致，而2型糖尿病(T2D)则是由对胰岛素作用的抵抗和随时间推移的最终β-细胞衰竭/损失所致。

目前的糖尿病的治疗无法严格地恢复正常血糖，并且在T1D的情况下，甚至表现为相当姑息性的，通过外源性胰岛素注射替代有缺陷的胰岛素分泌。因此，用新的功能性β-细胞补充胰腺和/或维持剩余β-细胞的健康代表了治疗这两种病症的关键策略。然而，迄今为止，没有预防胰腺β-细胞损失或诱导胰腺β-细胞增殖的可用治疗，尤其是在患有1型糖尿病的人患者中。

Rspo1属于富含半胱氨酸的分泌蛋白家族，也包括Rspo2、Rspo3和Rspo4。它们共享共同的结构架构，包括如图1中公开的四个结构和功能上不同的结构域。在N末端，信号肽序列确保R-spondin蛋白正确进入经典分泌途径。成熟的分泌形式含有两个氨基末端富含半胱氨酸的弗林蛋白酶样重复序列(FU1和FU2)，这对于与R-spondin特异性受体LGR(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor，含有富含亮氨酸的重复序列的G-蛋白偶联受体)4-6的相互作用至关重要(de Lau,W.B.,Snel,B.&Clevers,H.C.Genome Biol13,242,doi:10.1186/gb-2012-13-3-242(2012))。该蛋白的中心部分含有一个血小板反应蛋白1型重复结构域(thrombospondin type-1repeat domain,TSP1)，其参与与细胞外基质特定组分的相互作用，其后是C末端碱性氨基酸富集结构域，其作用还没有被阐明。据报道，R-spondin蛋白在诸如细胞增殖(Kim,K.A.et al.Science 309,1256-1259,doi:10.1126/science.1112521(2005).Da Silva,F.et al.Dev Biol 441,42-51,doi:10.1016/j.ydbio.2018.05.024(2018))、细胞特化(Vidal,V.et al.Genes Dev 30,1389-1394,doi:10.1101/gad.277756.116(2016))以及性别决定(Chassot,A.A.et al.HumMol Genet 17,1264-1277,doi:10.1093/hmg/ddn016(2008))等过程中发挥关键作用，且其还被报道作为经典Wnt信号通路(也被称为Wnt/β-连环蛋白或cWnt通路)的核心调节因子(Jin,Y.R.&Yoon,J.K.The R-spondin family of proteins:emerging regulators ofWNT signaling.Int J Biochem Cell Biol 44,2278-2287,doi:10.1016/j.biocel.2012.09.006(2012))。

尽管cWnt通路可能参与胰腺的成熟和功能而引起了人们极大的兴趣(Scheibneret al 2019,Curr Opin Cell Biol.61:48-55)，但是R-spondin蛋白在该器官中的作用和贡献还没有得到充分研究。

体外分析报道，在Rspo1的存在下，β-细胞的增殖和功能在Min6肿瘤衍生细胞系中增加(Wong,V.S.,Yeung,A.,Schultz,W.&Brubaker,P.L.R-spondin-1is a novel beta-cell growth factor and insulin secretagogue.J Biol Chem 285,21292-21302,doi:10.1074/jbc.M110.129874(2010))。然而，来自同一研究小组的更多最新研究报告了矛盾的结果：小鼠中Rspo1的缺陷与增加的β-细胞团(β-cell mass)和增强的血糖控制有关(Wong,V.S.,Oh,A.H.,Chassot,A.A.,Chaboissier,M.C.&Brubaker,P.L.Diabetologia54,1726-1734,doi:10.1007/s00125-011-2136-2(2011)and Chahal et al 201,PancreasVol 43(1)pp 93-102)。

与后一研究相反，PCT/EP2021/050289报道了重组Rspo1蛋白治疗在糖尿病小鼠模型中诱导功能性胰腺β-细胞的体内增殖，改善葡萄糖耐量，并增加葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。此外，该研究提示在接近完全的β-细胞消融后，施用Rspo1蛋白可以诱导剩余的β-细胞增殖并重建能够维持正常血糖的功能性β-细胞团。最后，该研究显示Rspo1还可以诱导人β-细胞增殖，从而为使用重组Rspo1蛋白治疗和预防人糖尿病开辟了新的意想不到的途径。

用于受体结合和生物活性的RSPO1关键残基由例如Wang et Al.GENES&DEVELOPMENT 27:1339-1344,2013；Xie et Al.EMBO reports VOL 14|NO 12|2013；Xu etAl.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL.290,NO.4,pp.2455-2465,January23,2015.等描述。用于ZNRF3和LGR4受体结合和生物活性的关键残基标出并报道于图1中。

目前仍然需要进一步改进Rspo1衍生蛋白，以优化其用作生物药的可开发特性和药理学特性。

因此，本公开的一个目的是提供R-spondin蛋白的新型重组变体，其用作药物，例如用于治疗糖尿病。

发明内容

发明详述

定义

为了更容易理解本公开，首先定义了某些术语。在整个发明详细描述中列出了额外的定义。

术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和非天然氨基酸(在本文中也称为“非天然存在的氨基酸”)，例如功能类似于天然存在的氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及随后经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，例如与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物可以具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但功能类似于天然存在的氨基酸的化学化合物。术语“氨基酸”和“氨基酸残基”在全文中可互换使用。

取代是指用另一种天然存在的氨基酸或非天然氨基酸替换天然存在的氨基酸。例如，在合成肽的化学合成过程中，天然氨基酸可以容易地被另一种天然存在的氨基酸或非天然氨基酸替换。或者，可以通过对基因编码序列进行突变，将一个密码子变为另一个密码子，编码不同的氨基酸残基，从而进行替换。通过表达突变的编码序列得到的多肽具有一个氨基酸取代(一个氨基酸被另一个不同的氨基酸取代)。

如本文所用，术语“蛋白质”是指由以一个或多个线性链(也称为“多肽链”)排列并折叠成球状形式的氨基酸构成的任何有机化合物。它包括蛋白质材料或融合蛋白。这种多肽链中的氨基酸可通过相邻氨基酸残基的羧基和氨基之间的肽键连接在一起。术语“蛋白质”进一步包括但不限于肽、单链多肽或主要由两条或更多条氨基酸链组成的任何复合蛋白质。它还包括但不限于糖蛋白或其他已知的翻译后修饰。它还包括对天然蛋白质的已知天然或人工化学修饰，例如但不限于糖工程化、PEG化、HES化、PAS化等、掺入非天然氨基酸、用于化学缀合或其他分子的氨基酸修饰等…

本文所用的术语“重组蛋白”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的蛋白质，诸如分离自宿主细胞的融合蛋白，所述宿主细胞被转化以表达相应蛋白，例如分离自转染瘤等…

如本文所用，术语“融合蛋白”是指至少包含一条多肽链的重组蛋白，其通过基因融合获得或可获得，例如通过编码不同蛋白质的不同功能域的至少两个基因片段的基因融合。因此，本公开的蛋白融合体包括如下所述的R-spondin多肽或其变体中的至少一个，以及至少一个其他部分，所述其他部分是除了R-spondin多肽或如下文所描述的其变体之外的多肽。在某些实施方案中，其它部分也可以是非蛋白质部分，例如聚乙二醇(PEG)部分或其它化学部分或缀合物。在一个优选实施方案中，第二部分可以是抗体的Fc区，因此这种融合蛋白称为“Fc融合蛋白”。

如本文所用，术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区，优选相对于天然人Fc区含有不超过5、10、15或20个氨基酸的插入、缺失或取代。天然人Fc区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA、IgD、IgE或IgM同种型中的任一种。人IgG重链Fc区通常定义为包含从C226位或P230到IgG抗体羧基末端的氨基酸残基。Fc区的残基编号是Kabat的EU索引的编号。Fc区的C末端赖氨酸(残基K447)可以例如在Fc融合蛋白的生产或纯化过程中除去。

如本文所用，考虑到空位的数目和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同一性＝相同位置的数目/位置的总数×100)，其需要被引入以实现两个序列的最佳比对。如下所述，可使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定。

可用Needleman和Wunsch算法(NEEDLEMAN和Wunsch)确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。

两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性也可用例如算法(诸如EMBOSSNeedle(配对比对；可在www.ebi.ac.uk,Rice et al2000Trends Genet 16:276-277获得)来确定。例如，EMBOSS Needle可与BLOSUM62矩阵一起使用，“空位开放罚分”为10，“空位延伸罚分”为0.5，假“末端空位罚分”，“末端空位开放罚分”为10，“末端空位延伸罚分”为0.5。通常，“百分比同一性”是匹配位置的数目除以比较位置的数目并乘以100的函数。例如，如果10个序列位置中的6个在比对后在两个比较序列间是相同的，那么同一性是60％。％同一性典型地在进行分析的查询序列的全长上确定。具有相同一级氨基酸序列或核酸序列的两个分子是相同的，与任何化学和/或生物修饰无关。

如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人的动物。术语“非人动物”优选包括哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马等。

如本文所用，术语“R-spondin蛋白”指分别由相应的Rspo1、Rspo2、Rspo3、Rspo4基因编码的天然R-spondin 1、R-spondin 2、R-spondin 3或R-spondin 4蛋白(本文也称为Rspo1、Rspo2、Rspo3、Rspo4蛋白)。

天然R-spondin典型地从其N末端至C末端包括信号肽(SP)、两个富含半胱氨酸的弗林蛋白酶样结构域(FU1和FU2)、FU2结构域和TSP结构域之间的N-糖基化位点、血小板反应蛋白(TSP1)基序(TSP)和碱性氨基酸富集(BR)结构域，包括潜在的O-糖基化位点。

图1提供了Rspo1、Rspo2、Rspo3和Rspo4氨基酸序列的比对，以及不同结构域FU1、FU2、TSP和BR的示意图。在本说明书中，当提及Rspo1的氨基酸位置或Rspo2、Rspo3和Rspo4中的“等效氨基酸位置”时，应参考图1的比对以确定“等效”氨基酸位置。类似地，Rspo1的Rspo2、Rspo3或Rspo4的“等效”(或相应)结构域可通过参考图1的比对来确定。全长人Rspo1、Rspo2、Rspo3和Rspo4氨基酸序列(及其信号肽)分别描述于SEQ ID Nos 1-4。人Rspo1的FU1、FU2、TSP和BR结构域的氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO:5-8。人Rspo2的FU1、FU2、TSP和BR结构域的氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO:9-12。人Rspo3的FU1、FU2、TSP和BR结构域的氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO:13-16。人Rspo4的FU1、FU2、TSP和BR结构域的氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO:17-20。

如本文所用，术语“嵌合蛋白”指包括特定蛋白内的一个或多个结构域被同一家族的蛋白的等效结构域取代的蛋白。例如，Rspo1的嵌合蛋白可以用Rspo2的相应FU1结构域取代Rspo1 FU1结构域，并且包含与天然Rspo1蛋白相同的其他结构域(例如FU2、TSP或BR结构域)。

如本文所用，术语“杂合结构域”指蛋白质的结构域，其中一些氨基酸残基已被突变为同一家族中另一成员的等效残基。例如，R-spondin蛋白的杂合FU1结构域可对应于Rspo2 FU1结构域，其中发生了一些突变，将一个或多个氨基酸残基替换为Rspo2 FU1结构域中的等效残基。

本公开的变体

本公开涉及天然R-spondin的重组变体，其包含以下FU1、FU2、TSP和BR结构域，其中

·FU1是与分别如SEQ ID NO:5、9、13和17所示的人Rspo1、Rspo2、Rspo3或Rspo4的任何FU1结构域具有至少80％同一性的结构域；

·FU2是与分别如SEQ ID NO：6、10、14、18分别所示的人Rspo1、Rspo2、Rspo3或Rspo4的任何FU2结构域具有至少80％同一性的结构域；

·TSP是与分别如SEQ ID NO：7、11、15、19所示的人Rspo1、Rspo2、Rspo3或Rspo4的任何TSP结构域具有至少80％同一性的结构域；和

·BR是与分别如SEQ ID NO：8、12、16、20所示的人Rspo1、Rspo2、Rspo3或Rspo4的任何BR结构域具有至少80％同一性的结构域。

上文定义的天然R-spondin蛋白的此类重组变体在下文中称为“本公开的变体”或“Rspo1变体”。

为便于阅读，下文所述的本公开的变体的序列将始终在没有任何信号肽序列的情况下进行描述。然而，本文公开的所有变体可包括或可不包括N末端信号肽(SP)序列，特别是Rspo1、Rspo2、Rspo3或Rspo4的(SP)序列之一，典型地为Rspo1蛋白的1-20位氨基酸残基。本公开的变体也可缺少其正常的信号序列，而是用不同的信号序列代替它。信号序列的选择取决于产生重组蛋白的宿主细胞的类型，不同的信号序列可以替代天然信号序列。另外，本公开的变体可在其C末端包含额外的肽序列，例如用于纯化。本文公开的所有变体也可包括C末端标签，例如SEQ ID NO:90的组氨酸标签，包括6个组氨酸残基。

在变体的具体实施方案中，每个结构域FU1、FU2、TSP和BR与SEQ ID NO:1的人Rspo1结构域中各自的FU1、FU2、TSP和BR结构域具有至少80％同一性。

在具体的实施方案中，TSP和BR结构域分别与相应的人Rspo1TSP和BR结构域具有100％同一性，并且FU1和FU2结构域氨基酸序列与人Rspo1 FU1和FU2相应的氨基酸序列至少80％相同，差异由氨基酸取代引起。

在具体实施方案中，当分别与相应的SEQ ID NO:5的人Rspo1FU1结构域和SEQ IDNO:6的Rspo1 FU2结构域比对时，本公开的变体的在每个FU1或FU2结构域中具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。

在具体实施方案中，本公开的变体是嵌合蛋白，其包含

(i)杂合Rspo2 FU1结构域，其在SEQ ID NO:9的Rspo2 FU1中具有不超过1、2、3、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代，以及

(ii)Rspo1 FU2结构域，其与SEQ ID NO:6相同，或与SEQ ID NO:6相比，在FU2结构域中包括不超过1、2、3、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。

优选地，本公开的变体或在此所述的其功能性等效物表现出以下性能中的一种或多种，其水平至少类似于SEQ ID NO:41的Rspo1蛋白：

(i)它们诱导功能性β细胞的增殖达到至少与SEQ ID NO:41的参考人Rspo1相似的水平，例如在体外Min6β细胞增殖检测中确定的水平；和/或

(ii)它们诱导功能性β细胞的增殖达到至少与SEQ ID NO:41的参考人Rspo1相似的水平，例如在体内β细胞增殖检测中确定的水平；

(iii)任选地，它们以至少与SEQ ID NO:41的参考人Rspo1相同的亲和力结合LGR4受体，如在Rspo1/LGR4结合亲和力体外检测中测量的，例如通过SPR或ELISA检测确定；

(iv)任选地，它们以至少与SEQ ID NO:41的参考人Rspo1相同的亲和力结合ZNRF3受体，如在Rspo1/ZNRF3结合亲和力体外检测中测量的，例如通过SPR或ELISA检测确定的；

(v)任选地，它们增强Wnt/β-连环蛋白通路，如体外确定的，例如通过Top Flash检测确定的。

本公开的变体可有利地用作药物，特别是用于治疗人糖尿病和/或用于在体内或体外诱导胰腺β-细胞的增殖。

A.N末端残基的氨基酸缺失

本发明人惊讶地发现，与SEQ ID NO:41的天然Rspo1蛋白相比，Rspo1蛋白残基21-31的缺失会导致Min6增殖检测中的蛋白活性更高。因此，在特定实施方案中，本公开的变体包括Rspo1的区域21-33内或Rspo2、Rspo3或Rspo4的等效区域内的前10-14个N末端氨基酸残基的缺失。典型地，本公开的变体是在Rspo1的区域21-33内缺失10-14个N末端氨基酸残基的Rspo1蛋白。

更具体而言，本公开的变体包含SEQ ID NO:24的蛋白或由SEQ ID NO:24的蛋白组成，该蛋白对应于人Rspo1，但缺失了了Rspo1的氨基酸残基21-31(参见实施例中公开的变体#009)。

B.FU1结构域中的氨基酸取代可提高β细胞增殖。

Xie等人(EMBO reports VOL 14|NO 12|2013)已经描述了Rspo1 FU1结构域中的R66A突变可降低或消除Rspo1与ZNRF3的结合。

如本文所用，ZNRF3指作为Wnt信号通路负调节因子的E3泛素-蛋白连接酶，其通过介导Wnt受体复合物成分Frizzled和LRP6的泛素化和随后的降解而发挥作用。其作用于经典和非经典的Wnt信号通路。Rspondin蛋白，特别是Rspo1已被描述为结合ZNRF3[并被描述为R-spondin信号活性所必需的(Xie et Al.EMBO reports VOL 14|NO 12|2013)。ZNRF3蛋白在Uniprot数据库中描述，登录号为Q9ULT6且NCBI Entrz基因编号为84133。

本发明人发现，Rspo1中的R66A突变不仅没有消除Rspo1在Min6增殖检测中的功能，甚至令人惊讶地提高了其活性。

在具体实施方案中，本公开的变体有利地至少包含氨基酸取代，该氨基酸取代降低或消除SEQ ID NO:5的人Rspo1 FU1结构域中的残基R66或人Rspo2、Rspo3或Rspo4 FU1结构域序列中的等效精氨酸残基的ZNRF3结合。

任何变体与ZNFR3的结合亲和力可与SEQ ID NO:41的参考人Rspo1蛋白与ZNRF3的相应结合亲和力进行比较。实施例中描述了测量与ZNRF3结合亲和力的方法，包括例如下述实施例中公开的ZNRF3结合检测。如本文所用，ZNRF3结合下降指结合亲和力相较于SEQ IDNO:41的参考Rspo1测得的相应结合亲和力显著降低，优选至少降低20％，更优选至少降低30％、40％、50％。当结合低于可检测水平或类似于非特异性结合蛋白时，结合被消除。

典型地，本公开的所述变体包含SEQ ID NO:5的Rspo1 FU1结构域，其具有降低或消除ZNRF3结合的残基R66的单个氨基酸取代，典型地为R66A。在具体的实施方案中，本公开的所述变体包含SEQ ID NO:5的Rspo1 FU1结构域，其具有降低或消除ZNRF3结合的残基R66的单个氨基酸取代，典型地为R66A，并且所述FU2、TSP和BR结构域分别与Rspo1 FU2、TSP和BR结构域95％，优选100％相同。

例如，本公开的变体包含SEQ ID NO:23或基本上由SEQ ID NO:23(对应于下文实施例中公开的变体#008)组成。

C.FU1和FU2结构域中的氨基酸取代以提高与LGR4和/或ZNRF3的结合

本公开的变体可进一步包括FU1和/或FU2结构域中的氨基酸取代，使其与LGR4和/或ZNRF3的结合亲和力相较于SEQ ID NO:41的天然Rspo1提高。

任何变体与LGR4和/或ZNFR3的结合亲和力可与SEQ ID NO:41的参考人Rspo1蛋白与ZNFR3或LGR4的相应结合亲和力进行比较。实施例中描述了测量与ZNFR3或LGR4结合亲和力的方法，包括例如下述实施例中公开的ZNRF3结合检测。如本文所用，ZNFR3或LGR4结合的增加指结合亲和力相较于SEQ ID NO:41的参考Rspo1测得的相应结合亲和力显著更高，优选高至少10％，优选高至少20％、30％、40％、50％。

与LGR4和/或ZNRF3的结合亲和力相关的氨基酸残基和可能的氨基酸突变已特别描述于Wang et Al.GENES&DEVELOPMENT 27:1339-1344,2013；Xie et Al.EMBO reportsVOL 14|NO 12|2013；Xu et Al.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL.290,NO.4,pp.2455-2465,January 23,2015中。

在具体实施方案中，本公开的所述变体包括Rspo1的H108、N109、E116、L118、P127、A128、S133、A136、G138或S143处，或Rspo2、Rspo3或Rspo4的相应残基处的一个或多个氨基酸取代，以增强与LGR4的结合亲和力。在更具体的实施方案中，本公开的所述变体包括以下一种或多种氨基酸取代：Rspo1 FU2的H108K、H108R、N109D、N109E、E116V；L118F；P127D；A128E；S133F；A136L；G138E；S143V，或Rspo1、Rspo3或Rspo4中的相应残基，优选Rspo1的相应残基。更具体地说，本公开的所述变体包括SEQ ID NO:66(对应于实施例中所述的变体#049)、SEQ ID NO:70(对应于实施例中所述的变体#054)、SEQ ID NO:72(对应于实施例中所述的变体#056)、SEQ ID NO:67(对应于实施例中所述的变体#050)、SEQ ID NO:28(对应于实施例中所述的变体#051)、SEQ ID NO:74(对应于实施例中所述的变体#068)或SEQ IDNO:75(对应于实施例中所述的变体#069)或基本上由其组成。

在具体实施方案中，本公开的所述变体包括Rspo1的E45、L46、E49、V50、N51、K55、S57、I62、L63、D68、P77、F84、D85、N88或I95处，或Rspo2、Rspo3或Rspo4的相应残基处的一个或多个氨基酸取代，以增强与ZNRF3的结合亲和力。在具体实施方案中，本公开的所述变体包括以下一种或多种氨基酸取代：Rspo1 FU1的L46S、E49K、V50D、K55R、S57Q、I62F、L63F、D68G、P77H、F84Y、D85Y、N88A或I95A，或Rspo1、Rspo3或Rspo4中的相应残基，优选Rspo1。在更具体的实施方案中，本公开的所述变体包括SEQ ID NO:65(对应于实施例中所述的变体#048)、SEQ ID NO:67(对应于实施例中所述的变体50)、SEQ ID NO:68(对应于实施例中所述的变体#052)、SEQ ID NO:69(对应于实施例中所述的变体#053)、SEQ ID NO:71(对应于实施例中所述的变体#055)、SEQ ID NO:73(对应于实施例中所述的变体#057)或基本上由其组成。

在某些实施方案中，本公开的变体包括

(i)Rspo1的E45、L46、E49、V50、N51、K55、S57、I62、L63、D68、P77、F84、D85、N88或I95处，或Rspo2、Rspo3或Rspo4的相应残基处的一个或多个氨基酸取代，以增强与ZNRF3的结合亲和力；例如以下一种或多种氨基酸取代：Rspo1 FU1的L46S、E49K、V50D、K55R、S57Q、I62F、L63F、D68G、P77H、F84Y、D85Y、N88A或I95A，或Rspo1、Rspo3或Rspo4的相应残基，优选Rspo1的相应残基，和，

(ii)Rspo1的H108、N109、E116、L118、P127、A128、S133、A136、G138或S143处，或Rspo2、Rspo3或Rspo4的相应残基处的一个或多个氨基酸取代，以增强与LGR4的结合亲和力；例如以下一种或多种氨基酸取代：Rspo1 FU2的H108K、H108R、N109D、N109E、E116V；L118F；P127D；A128E；S133F；A136L；G138E；S143V或Rspo1、Rspo3或Rspo4的相应残基，优选Rspo1的相应残基。

该等变体的示例包括变体#050(SEQ ID NO:67)、变体#057(SEQ ID NO:73)和变体#108，-#112。

D.N-糖基化位点的氨基酸缺失或取代

本公开的变体还可有利地包含氨基酸缺失或取代，以去除FU2结构域中的N-糖基化位点，使得即使在真核表达系统(例如哺乳动物细胞系，例如CHO或人细胞系)中产生，所产生的变体也不会发生N-糖基化。

优选地，本公开的所述变体包括Rspo1的残基N137或Rspo2、Rspo3或Rspo4的等效残基的氨基酸取代，以抑制该位置的N-糖基化，例如所述变体包括Rspo1的N137Q氨基酸取代，或Rspo2、Rspo3或Rspo4的等效氨基酸取代。在具体实施方案中，本公开的所述变体包括SEQ ID NO:22(对应于如下实施例中的变体#005)、SEQ ID NO:54(对应于如下实施例中的变体#030)或基本上由其组成。

E.嵌合或杂合R-spondin蛋白

本公开的变体还涵盖嵌合的R-spondin蛋白，任选地进一步包括一种或多种如前B-D部分所述的修饰(缺失或氨基酸取代)。

在具体的实施方案中，本公开的嵌合变体包含与SEQ ID NO:9的Rspo2 FU1结构域100％相同的所述FU1结构域和选自Rspo1、Rspo3、Rspo4的FU2结构域或其功能性变体，所述功能性变体具有至少保持与LGR4相同的结合亲和力的氨基酸取代(与作为参考的SEQ IDNO:41的Rspo1相比)，优选地，所述FU2结构域与SEQ ID NO:6的Rspo1 FU2结构域100％相同。

因此，在具体实施方案中，变体是将Rspo2的FU1结构域与Rspo1、Rspo3、Rspo4或其功能性等效物的其他结构域相结合的嵌合蛋白。

在具体实施方案中，变体是嵌合蛋白，其至少包含Rspo1的氨基酸残基144-263的C端区域(SEQ ID NO:49)。

典型地，该嵌合变体的一个实例是包含SEQ ID NO:9的Rspo2FU1结构域和SEQ IDNO:6的Rspo1 FU2结构域，以及任选的SEQ ID NO:7的Rspo1 TSP结构域和SEQ ID NO:8的Rspo1 BR结构域的变体，优选SEQ ID NO:25的变体(对应于实施例中公开的变体#034)或SEQ ID NO:26的变体(对应于实施例中公开的变体#035)。

该嵌合变体的另一个实例是包含Rspo1 FU1结构域和Rspo3 FU2结构域，以及任选的SEQ ID NO:7的Rspo1 TSP结构域和SEQ ID NO:8的Rspo1 BR结构域的变体，优选SEQ IDNO:50或51的变体(对应于实施例中公开的变体#026或变体#027)。

该嵌合变体的另一个实例是包含Rspo3 FU1结构域和Rspo1 FU2结构域，以及任选的SEQ ID NO:7的Rspo1 TSP结构域和SEQ ID NO:8的Rspo1 BR结构域的变体，优选SEQ IDNO:52或53的变体(对应于实施例中公开的变体#028或变体#029)，或SEQ ID NO:54的变体(对应于变体#030，进一步包含N137Q突变，以抑制N-糖基化)。

该嵌合变体的另一个实例是包含Rspo2 FU1和FU2结构域，以及SEQ ID NO:7的Rspo1 TSP结构域和SEQ ID NO:8的Rspo1 BR结构域的变体，优选SEQ ID NO:55的变体(对应于实施例中公开的变体#031)。

该嵌合变体的另一个实例是包含Rspo2 FU2结构域和来自Rspo1的R-spondin蛋白的其余部分的变体，优选SEQ ID NO:56的变体(对应于实施例中公开的变体#032)。

该嵌合变体的另一个实例是包含Rspo1 FU1结构域和Rspo2 FU2结构域，以及任选的SEQ ID NO:7的Rspo1 TSP结构域和SEQ ID NO:8的Rspo1 BR结构域的变体，优选SEQ IDNO:57的变体(对应于实施例中公开的变体#033)。

该嵌合变体的另一个实例是包含Rspo4 FU1和FU2结构域，以及SEQ ID NO:7的Rspo1 TSP结构域和SEQ ID NO:8的Rspo1 BR结构域的变体，优选SEQ ID NO:58的变体(对应于实施例中公开的变体#036)。

该嵌合变体的另一个实例是包含Rspo4 FU2结构域和来自Rspo1的R-spondin蛋白的其余部分的变体，优选SEQ ID NO:59的变体(对应于实施例中公开的变体#037)。

该嵌合变体的另一个实例是包含Rspo1 FU1结构域和Rspo4 FU2结构域，以及任选的SEQ ID NO:7的Rspo1 TSP结构域和SEQ IDNO:8的Rspo1 BR结构域的变体，优选SEQ IDNO:60的变体(对应于实施例中公开的变体#038)。

该嵌合变体的另一个实例是包含Rspo4 FU1结构域和Rspo1 FU2结构域，以及任选的SEQ ID NO:7的Rspo1 TSP结构域和SEQ ID NO:8的Rspo1 BR结构域的变体，优选SEQ IDNO:61或62的变体(对应于实施例中公开的变体#039或变体#040)。

该嵌合变体的另一个实例是包含Rspo2 FU1结构域和Rspo4 FU2结构域，以及任选的SEQ ID NO:7的Rspo1 TSP结构域和SEQ ID NO:8的Rspo1 BR结构域的变体，优选SEQ IDNO:63的变体(对应于实施例中公开的变体#042)。

除上述嵌合蛋白外，还可以在已知对Rspo1/ZNRF3结合亲和力或提高与ZNRF3的结合亲和力至关重要的位置，通过将Rspo2的FU1结构域中的一个或多个氨基酸残基替换为Rspol的相应的一个或多个氨基酸残基来优化嵌合蛋白的ZNRF3结合活性。

典型地，本公开的变体包含具有与SEQ ID NO:5相同序列的杂合FU1结构域，不同之处在于，与SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的嵌合变体相比，其在E49、V50、D68、D85处包含一个或多个氨基酸取代，以提高与ZNRF3的结合亲和力，优选地，其为SEQ ID NO:5的杂合Rspo1 FU1结构域，不同之处在于，其在位置E49、V50、D68、D85处包含一个或多个氨基酸取代，优选其包括以下氨基酸取代E49K、V50D、D68G、D85G中的一个或多个(对应于Rspo1 FU1结构域的残基)，并且进一步地，其中FU2结构域选自Rspo1、Rspo2、Rspo3、Rspo4的FU2结构域或其功能性变体，所述功能性变体具有至少保持与LGR4相同的结合亲和力的氨基酸取代，优选所述FU2结构域与SEQ ID NO:6的Rspo1 FU2结构域100％相同。

在具体的实施方案中，本公开的变体包含具有与SEQ ID NO:5(即Rspo1 FU1结构域)相同序列的杂合FU1结构域，不同之处在于，其在位置E49、V50、D68、D85处包含一个或多个氨基酸取代，优选地，其包括以下氨基酸取代49K、50D、68G、85G(对应于Rspo2 FU1结构域的残基)，并且进一步地，其中FU2结构域与SEQ ID NO:6的Rspo1 FU2结构域100％相同。例如，本公开的变体包括SEQ ID NO:27或基本上由SEQ ID NO:27(对应于实施例中公开的变体#047)组成。

在具体的实施方案中，如上所述的本公开的变体进一步包括杂合Rspo1 FU1和Rspo1 FU2结构域，其具有一个或多个选自E45L、E49K、V50D、K55R、D68G、D85G、N88A、H108K和N109D的氨基酸取代。例如，本公开的变体包括SEQ ID NO:28或基本上由SEQ ID NO:28(对应于实施例中公开的具有E45L、E49K、V50D、K55R、D68G、D85G、N88A、H108K和N109D突变的变体#051)组成。

在具体的实施方案中，本公开的变体包含SEQ ID NO:10、14或18的人Rspo2、Rspo3或Rspo4相应的FU2结构域，与例如包括在位置E49、V50、D68和D85处的一个或多个氨基酸取代(如E49K、V50D、D68G、D85G)的Rspo1 FU1结构域或杂合Rspo1 FU1结构域的组合，以增强与ZNRF3的结合。

F.BR结构域中的氨基酸取代以改善O-糖基化

与SEQ ID NO:41的Rspo1相比，本公开的变体可进一步包括BR结构域中的一个或多个氨基酸取代，以调节、优化或改善O-糖基化。

特别地，与改善O-糖基化相关的氨基酸残基可包括Rspo1中的氨基酸残基T253、T258、S259。

在具体的实施方案中，本公开的所述变体包括在Rspo1的位置G252、T253、L257、T258、S259、A260、A263处或Rspo2、Rspo3或Rspo4的相应残基处的以下氨基酸取代中的一个或多个，以改善O-糖基化。更具体地，本公开的所述变体包括Rspo1的BR结构域，其具有以下一个或多个氨基酸取代：Rspo1的G252T、T253E、L257S、T258E、S259E、A260T或A263T、S268E或Rspo2、Rspo3或Rspo4的相应残基。

相反，当变体与C末端多肽融合时，突变O-糖基化位点可以是有利的。因此，在具体的实施方案中，本公开的变体是融合蛋白，并且包括一个或多个以下氨基酸取代：T253A、T258A、S259A和S268A。

在具体的实施方案中，本公开的变体包括SEQ ID Nos 76-86或基本上由SEQ IDNos 76-86的多肽组成。

G.截短的R-spondin活性蛋白

本发明人惊讶地发现，Rspo1蛋白残基21-31和245-263的缺失在Min6增殖检测中产生了与SEQ ID NO:41的天然Rspo1蛋白类似的活性。该蛋白代表了最短的活性天然Rspo1蛋白。更具体地，本公开的变体包含SEQ ID NO:94的蛋白或由SEQ ID NO:94的蛋白组成，该蛋白对应于包含Rspo1的32至224位氨基酸残基的人Rspo1片段(参见实施例中公开的变体#116)。

H.Rspo3，其用于治疗糖尿病

本发明人进一步确定，天然蛋白Rspo3在体内将胰腺β细胞增殖激活达到至少类似于Rspo1的水平。因此，在一个方面，本公开涉及Rspo3多肽(例如包含SEQ ID NO:3)或其功能性等效物，用于治疗糖尿病(例如I型或II型糖尿病)和/或诱导胰腺β细胞在体外或体内的增殖。

本公开的优选变体

表1描述了本公开的优选变体、其氨基酸序列及其与天然R-spondin相比的主要变化。

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表1

保守修饰与功能性等效物

通过筛选候选分子并测试这些候选分子与Rspo1、Rspo3或本文所公开的任何具体变体(特别是上述表1中提及的优选变体)相比是否保持了所需的功能特性，可以进一步鉴定具有与天然R-spondin 1蛋白类似的有利特性的前述A-F部分中描述的变体的其他功能性等效物，或具有与天然R-spondin 3蛋白类似的有利特性的前述G部分中描述的Rspo3多肽的功能性等效物。

在具体实施方案中，变体的功能性等效物以至少与本文公开的优选变体之一相同的亲和力结合LGR4受体。

在具体实施方案中，本文公开的具体变体的所述功能性等效物相对于SEQ ID NO:41的Rspo1蛋白表现出至少90％、100％或以上的下列一种或多种活性：

(i)与LGR4受体的结合亲和力，例如通过SPR检测确定的；

(ii)诱导功能性β细胞的增殖，例如在体外Min6β细胞增殖检测中确定的；

(iii)诱导功能性β细胞的增殖，例如在体内β细胞增殖检测中确定的。

在具体实施方案中，本文公开的Rspo3多肽的所述功能性等效物相对于SEQ IDNO:3的Rspo3蛋白表现出至少90％、100％或以上的以下一种或多种活性：

(i)与LGR4受体的结合亲和力，例如通过SPR或ELISA检测确定的；

(ii)与ZNRF3受体的结合亲和力，例如通过SPR或ELISA检测确定的；

(iii)诱导功能性β细胞的增殖，例如在体外Min6β细胞增殖检测中确定的；

(iv)诱导功能性β细胞的增殖，例如在体内β细胞增殖检测中确定的。

用于确定活性的检测和条件的更多细节在下文实验部分中公开。

在具体实施方案中，所述具体变体的功能性等效物相对于表1中公开的相应优选变体之一表现出至少90％，更优选100％或以上的上述所需活性。

前文所述的变体的功能性等效物典型地可通过与相应变体中的非必要残基相比的氨基酸取代、缺失或插入而获得。在一个具体实施方案中，所述功能性等效物与相应的变体仅通过天然或非天然氨基酸的氨基酸取代而不同，优选仅1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸被天然氨基酸取代，特别是与表1中所描述的变体之一相比。

在其他实施方案中，所述功能性等效物是与SEQ ID NO:22-28中的至少一个具有95％同一性的多肽，并且其中所述多肽包含与SEQ ID NO:22-28中的至少一个的FU1和FU2结构域100％相同的FU1和FU2结构域。

在更具体的实施方案中，所述功能性等效物的氨基酸序列可以通过大部分保守的氨基酸取代而不同于本文所公开的变体，特别是表1中公开的变体；例如变体中至少10个，如至少9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代是保守氨基酸残基取代。

在本公开的上下文中，保守取代可以通过如下反映的氨基酸类别内的取代来定义：

脂族残基I、L、V和M

环烯基相关残基F、H、W和Y

疏水残基A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y

带负电荷的残基D和E

极性残基C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T

带正电荷的残基H、K和R

小残基A、C、D、G、N、P、S、T和V

极小残基A、G和S

依次涉及A、C、D、E、G、H、K、N、Q、R、S、P和形成T的残基

柔性残基Q、T、K、S、G、P、D、E和R

更多的保守取代分组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。与表1中的亲本变体相比，在亲水(hydropathic)/亲水(hydrophilic)特性和残基重量/大小方面的保守性也可以基本上保留在变体突变多肽中。

在具体实施方案中，变体的功能性等效物包含与SEQ ID NO:22-28(表1中的变体)中的任一个相同的多肽，除了1、2或3个氨基酸残基已经被另一种天然氨基酸，优选被如上定义的保守氨基酸取代所取代。

此外，本领域技术人员将理解，不同物种之间或Rspo家族不同成员之间的保守残基对于维持适当的结构可能是重要的，并且因此，本领域技术人员可以避免突变这些氨基酸位置。例如，Rspo1、Rspo2、Rspo3和Rspo4之间的保守残基在图1中特别示出，除非本公开中另有说明，否则优选这些保守残基不发生突变。

或者，在许多位点处，一个或两个或更多个氨基酸位置在物种变体中和/或在Rspo家族的其他成员(如Rspo2、Rpo3和Rspo4)中显示保守变化。本领域技术人员将理解，一些这种保守取代可能不会不利地影响Rspo1的功能，因此与具有这种保守变化的天然R-spondin1相比，可以是突变的。

在具体实施方案中，本公开的变体包含FU2结构域，其具有与天然R-spondin蛋白相比未发生突变的以下氨基酸残基：SEQ ID NO:1的人Rspo1中的F106、H108、F110、N109、E116、L118、P127、A128、S133、A136、G138、S143。

在具体实施方案中，本公开的变体包含BR结构域，其与天然BR结构域相比在以下一个或多个位置不具有氨基酸变化：SEQ ID NO:1的人Rspo1中的T253、L257、T258、S259、A260或A263，或在SEQ ID NO:2的人Rspo2、SEQ ID NO:3的人Rspo3或SEQ ID NO:4的人Rspo4中的相应残基处，典型地所述BR结构域与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20 100％相同。

本公开的融合蛋白

除了R-spondin 1多肽之外的多种多肽可以与如上所述的本公开的变体或其功能性等效物融合(特别是表1中的变体)，用于多种目的，例如增加蛋白质的体内半衰期、促进蛋白质的鉴定、分离和/或纯化、增加蛋白质的活性、以及促进蛋白质的寡聚化。

许多多肽可有助于鉴定和/或纯化作为其一部分的重组融合蛋白。实例包括聚精氨酸、聚组氨酸。包含聚精氨酸的多肽允许通过离子交换层析有效纯化。例如，在具体实施方案中，本公开的变体(更具体地，表1中公开的任何优选变体)包含聚组氨酸C末端标签和任选的肽接头，例如SEQ ID NO:90的多肽(GGGGSEPEAHHHHHH)。

在具体实施方案中，包含抗体的Fc区的多肽，所述抗体任选地为IgG抗体，或基本类似的蛋白质，可直接或任选地通过肽接头与本公开的变体(典型地为表1中公开的变体)或其功能性等效物融合，从而形成本公开的Fc融合蛋白。这种Fc区的实例是lgG4 Fc片段或其衍生物，典型地为SEQ ID NO:29的多肽。

在具体实施方案中，本公开还涉及Fc融合蛋白，其中Fc片段与SEQ ID NO:66的Rspo1蛋白融合(在C端或N端，任选地通过肽接头或其变体，且更具体地，Fc片段包含SEQ IDNO:29。

在另一个具体实施方案中，本公开还涉及Fc融合蛋白，其中Fc片段与SEQ ID NO:24的Rspo1蛋白融合(在C端或N端，任选地通过肽接头或其变体，且更具体地，Fc片段包含SEQ ID NO:29。

在另一个具体实施方案中，本公开还涉及Fc融合蛋白，其中Fc片段与SEQ ID NO:94的Rspo1蛋白融合(在C端或N端，任选地通过肽接头或其变体，且更具体地，Fc片段包含SEQ ID NO:29。

融合蛋白也可包含一种或多种肽接头。通常，肽接头是一段氨基酸，其用于连接多个多肽以形成多聚体并提供蛋白质连接部分的期望功能所需的柔性或刚性。典型地，肽接头的长度为约1-30个氨基酸。肽接头的实例包括但不限于-Gly-Gly-、GGGGS(SEQ ID NO:46)、(GGGGS)n(其中n为1-8，典型地为3或4)。连接部分描述于例如Fluston,J.S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-83(1988),Whitlow,M.,et al.,Protein Engineering 6:989-95(1993),Newton,D.L.,et al.,Biochemistry 35:545-53(1996),和美国专利号4,751,180和4,935,233。

在某些实施方案中，Fc融合通过本公开的变体或其功能性等效物C末端的肽接头间接融合。在其他实施方案中，Fc融合通过本公开的变体或其功能性等效物N末端的肽接头间接融合。

在具体实施方案中，本发明人表明需要优化接头以产生活性Fc融合蛋白。事实上，本发明人表明，延长接头的长度可以提高Fc融合蛋白的生物活性。

可用于Fc融合蛋白的Fc部分和R-spondin部分之间的优选肽接头包括，例如GGGGGGSGGGGSGGGGSA(SEQ ID 44)或GGGGSGGGGSGGGGGG(SEQ ID 45)的接头。

在具体实施方案中，SEQ ID NO:29的Fc多肽直接或间接通过肽接头融合在表1的优选变体之一的C末端。

本发明人令人惊讶地表明，直接或间接通过肽接头在本公开的变体的N末端融合Fc多肽可提高Fc融合蛋白的产量。因此，在优选实施方案中，SEQ ID NO:29的Fc多肽直接或间接通过肽接头融合在表1的优选变体之一的N末端，优选SEQ ID NO:24、66或94的变体。

本公开还涉及Fc融合蛋白，其中Fc片段与SEQ ID NO:1的Rspo1蛋白融合(在C端或N端，任选地通过肽接头)，且更具体地，Fc片段包含SEQ ID NO:29。在具体实施方案中，本公开的变体是SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:95的Fc融合蛋白(分别对应于变体#063、#064、#121、#155或#150)。

本公开预期的变体或其功能性等效物的另一种修饰是至少变体或等效物与血清蛋白(例如人血清白蛋白或其片段)的缀合物或蛋白融合物，以延长所得分子的半衰期。例如，Ballance等的EP 0322094中描述了这种方法。

另一种可能性是本公开的融合蛋白，包括能够结合血清蛋白的蛋白，例如结合人血清白蛋白的蛋白(即抗HSA融合蛋白)，以延长所得分子的半衰期，包括例如衍生自结合HSA的Fab或纳米抗体的抗HSA结合部分或任何其他结构域类型的结构，例如darpin、nanofitin、fynomer等。例如，这种方法在Journal of Controlled Release 301(2019)176-189；BioDrugs(2015)29:215-239；J Pharmacol Exp Ther370:703-714,September2019；Biodrugs 2009；23(2):93-109中描述。这种融合蛋白的实例包括SEQ ID NO:64、NO:87或NO:88的多肽。

在其他实施方案中，本公开的融合蛋白包括Dennis et al 2002(Journal ofBiological Chemistry,2002,Vol 277,No.38,pp35035-35043)中公开的与白蛋白结合的一种肽，特别是包含SEQ ID NO:91(DICLPRWGCLW)核心序列的肽。

这种变体的实例是SEQ ID NO:64(变体#046)的多肽或SEQ ID NO:87(变体#094)的多肽或SEQ ID NO:88(变体#095)。

本公开的重组融合蛋白可包含含有亮氨酸拉链或其它多聚化基序的多肽。已知的亮氨酸拉链序列是促进二聚化的序列和促进三聚化的序列。参见例如Landschulz et al.(1988),Science 240:1759-64。亮氨酸拉链包含重复的七残基重复序列，通常有4或5个亮氨酸残基散布在其它氨基酸中。亮氨酸拉链的使用和制备是本领域公知的。

本公开预期的本文公开的变体或功能性等效物的另一种修饰是PEG化或HES化或相关技术，如PAS化。

更一般地，变体或其功能性等效物可以与可生物降解的填充剂缀合，包括天然和半合成的多糖，包括O-和N-连接的寡糖、葡聚糖、羟乙基淀粉(HES)、聚唾液酸和透明质酸，以及非结构化的蛋白聚合物(如高氨基酸聚合物)、弹性蛋白样多肽、XTEN和PAS。

例如，本公开的变体或其功能性等效物可被PEG化以例如增加抗体的生物(例如血清)半衰期。为了聚乙二醇化，在一个或多个PEG基团连接至重组蛋白的条件下，使重组蛋白与聚乙二醇(PEG)(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。聚乙二醇化可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生化其它蛋白质的任何形式的PEG，诸如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。用于使蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的并且可以应用于本公开的蛋白质。参见例如Jevsevar et al2010Biotechnol J.5(1):113-28,或Turecek et al 2016J Pharm Sci2016 105(2):460-375。因此，在具体实施方案中，本公开的Rspo1蛋白是PEG化的

本公开预期的变体或其功能性等效物的另一种修饰是PAS化。参见例如：ProteinEngineering,Design&Selection vol.26no.8pp.489–501,2013。因此，在具体实施方案中，本公开的Rspo1蛋白是PAS化的。

Xten技术例如描述于Nature Biotechnology volume 27number 122009:1186-1192。

编码本公开的蛋白质的核酸分子

本文还公开了编码本公开的变体或其功能性等效物的核酸分子。

以下实施例中的表10和表11提供了编码本文公开的变体的某些氨基酸序列的核苷酸序列的具体实例。

核苷酸序列的实例是编码如上表1中描述的任一个实例的氨基酸序列，特别是编码SEQ ID NO:22-28、SEQ ID NO:42-43、SEQ ID NO:50-89和SEQ ID NO:92-95中任一个的那些，所述核酸序列容易地衍生自表9，并且使用遗传密码，并且任选地考虑取决于宿主细胞种类的密码子偏倚。

本公开还涉及衍生自后一序列的核酸分子，该序列已针对哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系或人HEK293细胞系)中的蛋白质表达进行了优化。

核酸可存在于完整细胞、细胞裂解物中，或可以是部分纯化或基本上纯的形式的核酸。当通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和其他本领公知的技术从其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)中纯化出来时，核酸是“分离的”或“基本上纯的”。本公开的核酸可以是，例如DNA或RNA，且可含有或可不含有内含子序列。在一个实施方案中，核酸可存在于载体(诸如噬菌体展示载体)中，或存在于重组质粒载体中。

本公开的核酸可用标准分子生物学技术获得。一旦获得编码本公开的变体的DNA片段，可通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段。在这些操作中，编码变体的DNA片段可以可操作地连接到另一种DNA分子上，或连接到编码另一种蛋白质的片段上，如抗体恒定区(Fc区)或柔性接头。核苷酸序列的实例还包括编码重组融合蛋白，特别是Fc融合蛋白的核苷酸序列，所述Fc融合蛋白包含与Fc区的编码序列可操作地连接的氨基酸序列SEQ IDNo:1或其变体中任一个的编码序列，例如SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43或SEQ DNO:92-95。

本文中使用的术语“可操作地连接”是指两个DNA片段以功能性方式连接，例如，使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内，或使得蛋白质在所需启动子的控制下表达。

产生本公开的变体或融合蛋白的转染瘤的产生

本公开的变体或其功能性等效物，和/或相关融合蛋白可使用例如本领域熟知的重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生。

例如，为表达本公开的变体或相关融合蛋白或其相应的功能性等效物，可通过标准分子生物学或生物化学技术(例如，DNA化学合成、PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长重组蛋白的DNA，且可将DNA插入表达载体中，使得基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。

在本文中，术语“可操作地连接”旨在表示将抗体基因连接至载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节重组蛋白的转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以使得与所用的表达宿主细胞相容。通过标准方法将蛋白编码基因插入至表达载体中(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或平端连接(如果不存在限制性位点))。

重组表达载体可以编码促进重组蛋白从宿主细胞分泌的信号肽。可以将变体编码基因克隆到载体中，使得信号肽与重组蛋白的氨基末端框内连接。信号肽可以是Rspo1、Rspo2、Rspo3或Rspo4的天然信号肽或异源信号肽(即，来自非Rspondin蛋白的信号肽)。

除了变体编码基因，本文公开的重组表达载体携带控制宿主细胞中重组蛋白的表达的调节序列。术语“调节序列”旨在包括控制蛋白编码基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择，所需蛋白质的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，诸如衍生自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒的启动子和/或增强子。或者，可用非病毒调节序列，诸如泛素启动子或P-珠蛋白启动子。此外，调节元件由来自不同来源的序列组成，诸如SRα启动子系统，其含有来自SV40早期启动子的序列和1型人T细胞白血病病毒的长末端重复序列。

除了变体编码基因和调节序列，本公开的重组表达载体可携带其他序列，诸如在宿主细胞中调节载体复制的序列(例如复制起点)和可选择标志基因。可选择标志基因有助于选择已引入宿主细胞的载体(参见例如Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，典型地，可选择标志基因赋予引入了载体的宿主细胞对药物(诸如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。可选择标志基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有氨甲蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。

为表达本公开的变体或相关融合蛋白，通过标准技术将一个或多个编码重组蛋白的表达载体转染至宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖常用于将外源DNA引入至原核或真核宿主细胞的各种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖转染等。理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本公开的蛋白。讨论了蛋白在真核细胞，例如哺乳动物宿主细胞、酵母或丝状真菌中的表达，因为此类真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠和功能性重组蛋白。

在一个具体实施方案中，根据本公开的克隆或表达载体包含可操作地连接至合适的启动子序列的表1中描述的变体(典型地为SEQ ID Nos 22-28或SEQ ID NO:50-89)或融合蛋白(典型地为SEQ ID NO:42、43或92-95)的编码序列之一。

用于表达本公开的重组蛋白的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)、包括与DHFR可选择标记(如Kaufman和Sharp，1982中所述)一起使用的dhfr-CHO细胞(Urlaub和Chasin，1980中所述)、CHOK1 dhfr+细胞系、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞、HEK293细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞一段足以在宿主细胞中表达重组蛋白的时间，并任选地将蛋白分泌到宿主细胞在其中生长的培养基中来生产重组蛋白。

本公开的变体或相关融合蛋白可以例如在其分泌后使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收和纯化。

在一个具体实施方案中，本公开的宿主细胞是用具有适于表达变体之一的编码序列的表达载体转染的宿主细胞，所述编码序列分别包含可操作地连接至合适的启动子序列的SEQ ID NO:22-28、SEQ ID NO:42-43、SEQ ID NO:50-89和SEQ ID NO:92-95中的任一个。

然后，可以在用于表达和产生本公开的重组变体或相关融合蛋白的合适条件下进一步培养后者宿主细胞。

药物组合物

在另一个方面，本公开提供了组合物，例如药物组合物，其含有本公开的变体或相关融合蛋白或其功能性等效物。该组合物可以包括如上所述的一种重组变体或(例如，两种或更多种不同的)重组变体的组合或相关融合蛋白。

例如，所述药物组合物包含与药学上可接受的载体一起配制的重组蛋白，所述重组蛋白包含表1中公开的任一种优选的变体，典型地包含SEQ ID NO:22-28和SEQ ID NO:50-89的任何多肽，或融合蛋白，例如SEQ ID Nos:42-43或SEQ ID NO:92-95或其功能性等效物。

本文公开的药物组合物还可以在组合疗法中施用，即与其它试剂组合。例如，组合疗法可包括本公开的变体，例如包含SEQ ID NO:22-28、SEQ ID NO:42-43、SEQ ID NO:50-89和SEQ ID NO:92-95中任一个多肽或其功能性等效物的重组蛋白，与至少一种抗炎剂或另一种抗糖尿病剂组合。可用于组合疗法的治疗剂的实例在下文关于本公开的重组变体或相关融合蛋白的用途的部分中更详细地描述。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。载体应适用于肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下、或眼内施用(例如，通过注射或输注)。

在一个实施方案中，所述载体应适用于皮下途径或静脉内注射。取决于施用途径，活性化合物(即本公开的变体)可包被在材料中以保护化合物免受酸和可能使化合物失活的其他天然条件的作用。

无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上可接受的载体的一个实例。其他合适的载体是本领域技术人员公知的(Remington和Gennaro，1995)。制剂可进一步包括一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、白蛋白以预防小瓶表面的蛋白质损失等。

药物组合物的形式、施用途径、剂量和给药方案自然取决于待治疗的病症、疾病的严重程度、患者的年龄、体重和性别等。

本公开的药物组合物可以配制用于口服、鼻内、舌下、皮下、肌内、静脉内、透皮、肠胃外或直肠施用等。本公开的变体作为活性成分，单独或与另一种活性成分组合，可以以单位施用形式，作为与常规药物载体的混合物向动物和人施用。

合适的单位施用形式包括口服途径形式如片剂、凝胶胶囊、粉末、颗粒和口服悬浮液或溶液、舌下和口腔施用形式、气雾剂、植入物、皮下、透皮、局部、腹膜内、肌内、静脉内、皮下、透皮、鞘内和鼻内施用形式和直肠施用形式。

优选地，药物组合物含有媒介，其对于能够注射的制剂是药学上可接受的。这些可特别地是等渗的、无菌的盐水溶液(磷酸钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或此类盐的混合物)，或干燥的、尤其是冻干的组合物，根据情况加入无菌水或生理盐水后，允许构建可注射溶液。

用于施用的剂量可调整为各种参数的函数，特别地作为所用的施用方式、相关病理学或所需的治疗持续时间的函数。

为制备药物组合物，可将治疗有效量的本公开变体溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。

适用于注射用的药物形式可包括无菌水溶液或分散体；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末或冻干物。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，且必须是易于注射的流体。其在生产和储存条件下必须是稳定的，且必须在防治微生物(诸如细菌和真菌)污染作用下保存。

作为游离碱或药理上可接受的盐的活性化合物的溶液可与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)在适当混合的水中制备。也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备分散体。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以预防微生物的生长。

本公开的变体或相关融合蛋白可以配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基一起形成)，并且其与无机酸(例如盐酸或磷酸)形成，或与有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。

载体还可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和植物油的溶剂或分散介质。例如，通过用包衣(诸如卵磷脂)，在分散体的情况下通过维持所需的粒度并通过用表面活性剂，可维持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现预防微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。

无菌可注射溶液通过将所需量的活性化合物(即Rspo1蛋白)与上文列举的各种其他成分(如需要)一起掺入合适的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将各种无菌的活性成分掺入至含有基础分散介质和来自上文列举的那些的所需的其他成分的无菌载体中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上任何来自此前无菌过滤的溶液的其他所需成分的粉末。

在配制时，将以与剂量制剂相容的方式和以治疗有效的量施用溶液。可容易地以各种剂量形式施用所述制剂，诸如上述可注射溶液的类型，但也可采用药物释放胶囊等。

对于在水溶液中的肠胃外施用，例如，如果必要，应当适当地缓冲溶液，且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释液等渗。这些特别的水溶液尤其适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这方面，根据本公开内容，可采用的无菌水性介质是本领域技术人员已知的。例如，可将一个剂量溶解在1ml等渗氯化钠溶液中，并加入至1000ml皮下输液中或在建议的输注位点注射(参见例如，“Remington’spharmaceutical sciences”,15th Edition,pages 1035-1038和1570-1580)。根据所治疗的受试者的病症，必然会发生剂量的一些变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定个体受试者的适合剂量。

本公开的变体或相关融合蛋白或其功能性等效物可以配制在治疗混合物中以包含约0.01mg-1000mg/kg或1mg-100mg/kg。也可以施用多个剂量。

用于输注或皮下注射重组蛋白的溶液的合适制剂已在本领域中描述，并且例如综述于Advances in Protein Chemistry and Structural Biology Volume 112,2018,Pages 1-59Therapeutic Proteins and Peptides Chapter One-Rational Design ofLiquid Formulations of Proteins:Mark C.Manning,Jun Liu,Tiansheng Li,RyanE.Holcomb。

本公开的变体或相关融合蛋白的用途和方法

本公开的变体或相关融合蛋白或其功能性等效物具有体外和体内效用。例如，可以将这些重组蛋白施用于培养的细胞，例如体外、离体或体内，或施用于受试者，例如体内，以治疗或预防多种病症。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指以下的一种或多种：(1)抑制疾病；例如，抑制正在经历或显示疾病、病症或障碍的病理学或症状学的个体中的疾病、病症或障碍(即，阻止病理学和/或症状学的进一步发展)；和(2)改善疾病；例如，改善正在经历或显示疾病、病症或障碍的病理学或症状学的个体的疾病、病症或障碍(即逆转病理学和/或症状学)，例如降低疾病的严重性或减少或减轻疾病的一种或多种症状。

特别地，关于糖尿病，更具体地为1型糖尿病的治疗，术语“治疗”可指在所述受试者中抑制胰腺β细胞损失，和/或增加胰腺β细胞，特别是功能性胰岛素分泌β-细胞的质量，和/或改进血糖控制，特别是在由于疾病(例如1型糖尿病)而具有胰腺β细胞和/或胰岛损失的患者中。

本公开的变体或相关融合蛋白或其功能性等效物可在体内诱导胰腺β细胞增殖并重建功能性胰岛素分泌胰岛，并由此可用于治疗糖尿病患者，或需要功能性胰岛素分泌β细胞的患者，或患有与高血糖症相关的病症的患者，或患有葡萄糖刺激的胰岛素分泌不足的患者。

本文所用的术语“糖尿病”通常是指导致胰岛素缺乏或对其作用有耐药性的任何病症或障碍。

糖尿病的实例包括但不限于1型、2型、妊娠期和成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)。

因此，本公开涉及用于在有需要的受试者中治疗上文公开的病症之一的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的上文公开的变体或相关融合蛋白或功能性等效物，典型地是包含SEQ ID NO:22-28、SEQ ID NO:42-43、SEQ ID NO:50-89和SEQ ID NO:92-95中任一个多肽的重组蛋白或其功能性等效物。

在某些实施方案中，所述受试者选自具有低Rspo1基因表达的患者。

用于如上公开的用途的变体或相关融合蛋白或其功能性等效物可以作为单独的活性成分施用，或与例如作为佐剂或与其它药物组合施用，所述其它药物是例如细胞因子、抗病毒剂、抗炎剂、抗糖尿病剂或降血糖剂、细胞治疗产品(例如β细胞组合物)和免疫调节药物，例如用于治疗或预防上述疾病。

例如，如上所述使用的变体或相关融合蛋白或其功能性等效物可以与细胞疗法，特别是β细胞疗法联合使用。

如本文所用，术语“细胞疗法”是指包括向有需要的受试者体内施用至少治疗有效量的细胞组合物的疗法。施用于患者的细胞可以是同种异体的或自体的。术语“β细胞疗法”是指其中细胞组合物包括作为活性成分的β细胞，特别是胰岛素分泌β细胞的细胞治疗。这样的β细胞可以使用Rspo1蛋白在如下所述的体外方法中产生。

在具体实施方案中，用于治疗糖尿病患者、需要功能性胰岛素分泌β细胞的患者、或与高血糖相关的疾病的患者、或葡萄糖刺激的胰岛素分泌不足的患者的Rspo1蛋白、变体或相关融合蛋白或其功能性等效物与β细胞组合物，特别是干细胞衍生的β细胞组合物联合施用(例如，之前、同时或之后)。

在具体实施方案中，所述β细胞是从活体供体或尸体供体中分离的。

在另一具体实施方案中，所述β细胞是干细胞衍生的β细胞。干细胞衍生的β细胞是指通过多能干细胞，特别是诱导多能干细胞或人胚胎干细胞的分化获得的胰岛素分泌β细胞。在一个实施方案中，当干细胞是人干细胞时，所述人干细胞不是人胚胎干细胞。干细胞衍生的β细胞显示至少一种指示胰腺β细胞的标记物(例如，PDX-1或NKX6.1)，表达胰岛素并在体外或体内显示内源成熟β细胞具有的葡萄糖刺激的胰岛素分泌反应(GSIS)特征。

如本文所用，术语“胰岛素分泌β细胞”指由分泌胰岛素的内分泌祖细胞或其前体分化而成的细胞。胰岛素分泌β细胞包括胰腺β细胞以及表达胰岛素的胰腺β样细胞。

如本文所用，“多能干细胞”是一种未分化的细胞，其具有自我更新(通过有丝分裂细胞分裂)和分化为衍生自三个胚层(外胚层、内胚层和中胚层)的特化细胞类型的能力，从而产生身体组织的所有细胞。在具体实施方案中，多能干细胞是诱导多能干细胞或人胚胎干细胞。

如本文所用，术语“iPS细胞”和“诱导多能干细胞”可互换使用，指从非多能细胞(典型地为成人体细胞)人工衍生(例如诱导或完全逆转)的多能干细胞，例如通过诱导一种或多种基因的强制表达。

“人胚胎干细胞”或“hESC”，在本文中指衍生自处于囊胚期的人胚胎的内细胞团的人干细胞。人类胚胎在受精后4-5天到达囊胚期，此时由50-150个细胞组成。胚胎干细胞是多能干细胞。根据本发明，人胚胎干细胞可以从已建立的细胞系中获得，也可以通过本领域技术人员已知的不同技术从胚胎中分离。在一些实施方案中，对于本文公开的方法和组合物中使用的干细胞来源，人类胚胎没有被破坏。

产生干细胞衍生的β细胞的方法是本领域众所周知的，例如但不限于DAmour,K.A.et al.(2006)；Jiang,J.et al.(2007)；and Kroon,E.et al.(2008),Rezania et al(2012,2014),Felicia W.Pagliuca et al(2014)和PCT国际申请PCT/US2014/041992中所述的方案，相关部分并入本公开中。这些指导多能干细胞分化为胰岛素分泌β细胞的方案包括将干细胞分化为祖细胞，例如可被指导分化为胰岛素分泌β细胞的胰腺祖细胞或内分泌祖细胞。

细胞治疗产品是指施用于所述患者用于治疗目的的细胞组合物。所述细胞治疗产品包括治疗有效剂量的细胞和任选的另外的赋形剂、佐剂或其它药学上可接受的载体。

合适的抗糖尿病药或降血糖药可以包括但不限于血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂、降胆固醇药、双胍、二甲双胍、噻唑烷二酮、降血糖磺酰胺、DPP-4抑制剂、α-葡糖苷酶抑制剂、胰岛素或它们的衍生物，包括短效、速效或长效胰岛素、GLP1类似物、氨基甲酰基甲基苯甲酸的衍生物；典型地，胰岛素受体、SLGT2抑制剂、GABR靶向分子和IL2R靶向分子。

根据前述内容，本公开在又进一步的方面中提供：

如上定义的方法，其包括例如同时或依次共施用治疗有效量的本公开的变体或相关融合蛋白，或其功能性变体，和至少一种第二药物物质，所述第二药物物质是细胞因子、抗病毒剂、抗炎剂、抗糖尿病剂、细胞治疗产品(例如β细胞组合物)，例如如上所述。

在用于治疗上文公开的疾病之一的方法的具体实施方案中，在有需要的受试者中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开的Rspo1蛋白或变体或相关融合蛋白或如上公开的功能性等效物，并与治疗有效量的β细胞组合物，特别是本文所公开的干细胞衍生的β细胞组合物联合施用(例如，之前、同时或之后)。

在另一具体实施方案中，所述β细胞是干细胞衍生的β细胞。干细胞衍生的β细胞是指通过干细胞，特别是诱导多能干细胞、人胚胎干细胞或间充质祖细胞的分化获得的胰岛素分泌β细胞。在一个实施方案中，当干细胞是人干细胞时，所述人干细胞不是人胚胎干细胞。

向患者移植β细胞或朗格尔汉斯岛的方法例如Shapiro,et al(2000)The NewEngland Journal of Medicine.343(4):230-238,and Shapiro et al(2017)NatureReviews Vol 13:268-277中所公开的。

在一些实施方案中，本文所述的β-细胞以分散的细胞形式或形成细胞簇的形式施用于所述患者。β细胞可被植入受试者的适当位点，例如但不限于肝脏、天然胰腺、肾被膜下间隙、网膜、腹膜、浆膜下间隙、肠、胃或皮下袋。

在具体实施方案中，所述β细胞组合物对于需要治疗的受试者是自体的，优选衍生自需要治疗的受试者的体细胞中获得的iPS。

在具体实施方案中，所述需要此类治疗的受试者为患有糖尿病的受试者，优选为1型糖尿病患者。

在另一个实施方案中，本公开的变体或相关融合蛋白或其功能性等效物可用于体外方法以诱导胰腺β细胞和/或朗格尔汉斯岛的增殖的。

因此，在一个方面，本公开进一步提供了用于体外产生β-细胞的方法，所述方法包括

(i)提供β-细胞，

(ii)在诱导所述β-细胞增殖的条件下，在有效量的所述变体或相关蛋白或其功能性等效物的存在下培养所述β-细胞。

在所述生产方法的具体实施方案中，所述β-细胞是原代细胞，优选来自需要β-细胞疗法或朗格尔汉斯岛移植的受试者。

在其它具体实施方案中，步骤(i)中提供的所述β-细胞是在将所述iPS细胞分化为β-细胞后从iPS细胞获得的。

因此，在具体实施方案中，本公开涉及用于从诱导的多能干细胞生产β-细胞的体外方法，包括以下：

(i)提供诱导的多能干细胞(iPSC)，

(ii)体外分化所述iPSC为朗格尔汉斯岛的β-细胞，和

(iii)在增殖条件下培养所述分化的β-细胞，

其中在步骤(ii)和/或步骤(iii)中添加足够量的所述变体或相关融合蛋白或其功能性等效物以分化iPS细胞和/或诱导所述β-细胞的增殖。

用于将iPSC分化成朗格尔汉斯岛的β-细胞的方法已在本领域中描述，例如Pagliuca,et al.Cell 159,428–439(2014)和Rezania et al.Nat Biotechnol.2014Nov；32(11):1121-33)，其相关部分并入本公开中。

所述公开还包括包含可通过上述方法获得的或通过上述方法获得的所述β-细胞的组合物及其作为细胞治疗产品的用途，例如在受试者中用于治疗糖尿病，优选1型糖尿病。向患者移植β-细胞或朗格尔汉斯岛的方法例如公开于Shapiro,et al(2000)The NewEngland Journal of Medicine.343(4):230–238,和Shapiro et al(2017)NatureReviews Vol 13:268-277。

由本文公开的组合物(例如，包含本公开的变体)和使用说明书组成的试剂盒也在本公开的范围内。试剂盒可以进一步至少包含一种另外的试剂，或一种或多种另外的抗体或蛋白质。试剂盒典型地包括指示试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的，或以其它方式伴随试剂盒的任何书写或记录材料。试剂盒可以进一步包括用于诊断患者是否属于将对如上定义的Rspo1治疗响应的组的工具。

另一种治疗策略是基于变体或相关融合蛋白或其功能性等效物作为扩增分离自人受试者样品的β细胞的试剂的用途。

因此，本公开涉及用于治疗有需要的受试者的方法，其包括：

(a)从受试者分离细胞，

(b)任选地将所述细胞扩增和/或重编程为诱导的多能干细胞，

(c)将所述iPS细胞分化为β细胞，和

(d)在如本公开的变体或相关融合蛋白或其功能性等效物(例如包含SEQ ID NO:22-28、SEQ ID NO:42-43、SEQ ID NO:50-89和SEQ ID NO:92-95中的任一个的重组蛋白，或其功能性等效物)和任选其他细胞的存在下，体外扩增所述β细胞，

(e)任选地，收集扩增的β细胞，和/或配制扩增的β细胞并向受试者施用治疗有效量的所述扩增的β细胞。

本公开还涉及本公开的所述变体或相关融合蛋白或其功能性等效物(例如包含SEQ ID NO:22-28、SEQ ID NO:42-43、SEQ ID NO:50-89和SEQ ID NO:92-95中的任一个的重组蛋白，或其功能性等效物)作为体外扩增β细胞的试剂的用途。

本公开还涉及本公开的变体或相关融合蛋白或其功能性等效物(例如包含SEQ IDNO:22-28、SEQ ID NO:42-43、SEQ ID NO:50-89和SEQ ID NO:92-95中的任一个的重组蛋白，或其功能性等效物)，其在体内用作诱导人，特别是患有功能性β-细胞损失的受试者，典型地是患有糖尿病的受试者中β-细胞增殖的试剂。

因此，本公开涉及治疗患有糖尿病，例如1型糖尿病或具有功能性β细胞损失的另一种病症的受试者的方法，所述方法包括：

(i)向所述受试者施用有效量的本公开的变体或相关融合蛋白或其功能性等效物，典型地为包含SEQ ID NO:22-28、SEQ ID NO:42-43、SEQ ID NO:92-95和SEQ ID NO:50-89中的任一个的重组蛋白，或其功能性等效物，和，

(ii)向所述受试者施用有效量的β细胞组合物，

其中所述有效量的所述变体或相关融合蛋白具有增加所述β细胞组合物增殖的能力。步骤(i)和(ii)可以同时或依次进行，特别地，首先将步骤(i)或步骤(ii)施用于所述受试者。

现在通过以下实施例进一步说明已经充分描述的本发明，这些实施例仅仅是说明性的并不意味着进一步限制。

实施方案

E1.R-spondin蛋白的重组变体，其包含以下FU1、FU2、TSP和BR结构域，其中

a.FU1是与分别如SEQ ID NO:5、9、13和17所示的人Rspo1、Rspo2、Rspo3或Rspo4的任何FU1结构域具有至少80％同一性的结构域，

b.FU2是与分别如SEQ ID NO:6、10、14、18所示的人Rspo1、Rspo2、Rspo3或Rspo4的任何FU2结构域具有至少80％同一性的结构域，

c.TSP是与如SEQ ID NO:7、11、15、19所示的人Rspo1、Rspo2、Rspo3或Rspo4的任何TSP结构域具有至少80％同一性的结构域，和

d.BR是与如SEQ ID NO:8、12、16、20所示的人Rspo1、Rspo2、Rspo3或Rspo4的任何BR结构域具有至少80％同一性的结构域。

E2.根据E1的重组变体，其中每个结构域FU1、FU2、TSP和BR与SEQ ID NO:1的人Rspo1结构域中各自的FU1、FU2、TSP和BR结构域具有至少80％同一性。

E3.根据E1或E2的重组变体，其中TSP和BR结构域分别与相应的人Rspo1 TSP和BR结构域具有100％同一性，并且FU1和FU2结构域的氨基酸序列与人Rspo1 FU1和FU2相应的氨基酸序列至少80％相同，差异由氨基酸取代引起。

E4.根据E1至E3中任一项的重组变体，当分别与相应的SEQ ID NO:5的人Rspo1FU1结构域和SEQ ID NO:6的Rspo1 FU2结构域比对时，其具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。

E5.根据E1-E4中任一项的重组变体，其包含在Rspo1的区域21-33内，或在Rspo2、Rspo3或Rspo4的等效区域内的前10-14个N末端氨基酸的缺失，典型地是Rspo1的残基21-31的缺失。

E6.根据E5的重组变体，其包含SEQ ID NO:24的蛋白质或由SEQ ID NO:24的蛋白质组成。

E7.根据E1-E6中任一项的重组变体，其至少包含在SEQ ID NO:5的人Rspo1 FU1结构域中R66处，或在人Rspo2、Rspo3或Rspo4 FU1结构域序列中的等效精氨酸残基处的氨基酸取代，所述氨基酸取代降低或消除ZNRF3结合。

E8.根据E7的重组变体，其包含SEQ ID NO:5的Rspo1 FU1结构域，其具有降低或消除ZNRF3结合的残基R66的单氨基酸取代，典型地为R66A。

E9.根据E7或E8的重组变体，其中所述FU2、TSP和BR结构域与Rspo1 95％，优选100％相同，例如所述重组变体包含SEQ ID NO:23或基本上由SEQ ID NO:23组成。

E10.根据E1-E9中任一项的重组变体，其中所述R-spondin的变体以比SEQ ID NO:41的人Rspo1更高的亲和力结合LGR4，如在Rspo1/LGR4结合亲和力体外检测中测量的。

E11.根据E10的重组变体，其包括Rspo1的H108、N109、E116、L118、P127、A128、S133、A136、G138或S143处，或Rspo2、Rspo3或Rspo4的相应残基处的一个或多个氨基酸取代，以与SEQ ID NO:41的嵌合Rspo1相比增强与LGR4的结合亲和力，更具体地是以下氨基酸取代中的一个或多个：H108K、N109D、E116V、L118F、P127D、A128F、S133F、A136L、G138E或S143V。

E12.根据E10的重组变体，其包括Rspo1的E45、L46、E49、V50、N51、K55、S57、I62、L63、D68、P77、F84、D85、N88或I95处，或Rspo2、Rspo3或Rspo4的相应残基处的一个或多个氨基酸取代，以与SEQ ID NO:41的Rspo1相比增强与ZNRF3的结合亲和力。

E13.根据E1-E12中任一项的重组变体，其中所述变体不包含在FU2和TSP结构域之间的N-糖基化位点。

E14.根据E13的重组变体，其包含Rspo1的残基N137或Rspo2、Rspo3、或Rspo4的等效残基处的突变，以抑制该位置处的N-糖基化。

E15.根据E14的重组变体，其包含SEQ ID NO:22或基本上由SEQ ID NO:22组成。

E16.根据E1-E15中任一项的重组变体，其中所述FU1结构域与SEQ ID NO:9的Rspo2 FU1结构域100％相同，并且所述FU2选自Rspo1、Rspo3、Rspo4的FU2结构域或其功能性变体，所述功能性变体具有至少保持与LGR4相同的结合亲和力的氨基酸取代。

E17.根据E16的重组变体，其包含SEQ ID NO:9的Rspo2 FU1结构域和SEQ ID NO:6的Rspo1 FU2结构域，以及任选地SEQ ID NO:7的Rspo1 TSP结构域和SEQ ID NO:8的Rspo1BR结构域。

E18.根据E16的重组变体，其包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26或基本上由SEQID NO:25或SEQ ID NO:26组成。

E19.根据E1-E15中任一项的重组变体，其具有与SEQ ID NO:9相同的序列，但其在E49、V50、D68和D85处包括一个或多个氨基酸取代，以与SEQ ID NO:25的蛋白相比，增加与ZNRF3的结合亲和力。

E20.根据E19的重组变体，其包括SEQ ID NO:5的Rspo1 FU1结构域，但其在E49、V50、D68和D85处包括一个或多个氨基酸取代，以与SEQ ID NO:25的蛋白相比，增加与ZNRF3的结合亲和力，优选其包括以下氨基酸取代E49K、V50D、D68G和D85G，进一步地，其中所述FU2结构域选自Rspo1、Rspo3、Rspo4的FU2结构域或其功能性变体，所述功能性变体具有至少保持与ZNRF3相同的结合亲和力的氨基酸取代。

E21.根据E19或E20的重组变体，其中所述FU2结构域与SEQ ID NO:6的Rspo1 FU2结构域100％相同。

E22.根据E19或E20的重组变体，其包含具有选自E45L、E49K、V50D、K55R、D68G、D85G、N88A和H108K、N109D中的一个或多个氨基酸取代的Rspo1 FU1和Rspo1 FU2结构域。

E23.根据E19-E22中任一项的重组变体，其包含SEQ ID NO:27或基本上由SEQ IDNO:27组成。

E24.根据E19-E22中任一项的重组变体，其包含SEQ ID NO:28或基本上由SEQ IDNO:28组成。

E25.根据E19-E22中任一项的重组变体，其包含SEQ ID NO:10、14或18的人Rspo3或Rspo4相应的FU2结构域，与Rspo2 FU1结构域或杂合Rspo1 FU1结构域联合，例如包括在E49K、V50D、D68G和D85G处的一个或多个氨基酸取代，以增强与ZNRF3的结合，如E49K、V50D、D68G、D85G。

E26.根据E1的重组变体，其是SEQ ID NO:22-28中的任一个的变体，与SEQ ID NO:22-28中的任一个相比，其具有不超过10个氨基酸取代。

E27.根据E26的重组变体，其与SEQ ID NO:22-28中的至少一个具有至少95％同一性，并且其中所述FU1和FU2结构域与SEQ ID NO:22-28中的至少一个的FU1和FU2结构域100％相同。

E28.根据E26的重组变体，其包含与SEQ ID NO:22-28中的一个相同的氨基酸序列，除了1、2或3个氨基酸残基已被另一个天然氨基酸取代，优选被保守氨基酸取代。

E29.根据E1-E28中任一项的重组变体，其中所述FU2结构域包含一个或多个以下氨基酸残基：SEQ ID NO:1的人Rspo1中的F106、H108、F110、N109、E116、L118、P127、A128、S133、A136、G138、S143或SEQ ID NO:2的人Rspo2、SEQ ID NO:3的人Rspo3或SEQ ID NO:4的人Rspo4中的相应残基。

E30.根据E1-E29中任一项的重组变体，其中所述BR结构域至少包含一个或多个下列氨基酸残基：T253、L257、T258、S259、A260或A263，典型地所述BR结构域与SEQ ID NO:8、12、16、20 100％相同。

E31.根据E1-E30中任一项的重组变体，其包含在BR结构域的氨基酸取代以改善O-糖基化，例如，其中所述变体包括Rspo1的G252、T253、L257、T258、S259、A260、A263处，或Rspo2、Rspo3或Rspo4中的相应残基处的一个或多个氨基酸取代，例如，所述变体包括Rspo1的BR结构域，其具有一个或多个以下氨基酸取代G252T、L257S、A260T或A263T。

E32.根据E1-E31中任一项的重组变体，其表现出以下性能中的一种或多种，其水平至少类似于SEQ ID NO:41的Rspo1蛋白：

(i)其以至少与SEQ ID NO:41的参考人Rspo1相同的亲和力结合LGR4受体，如在Rspo1/LGR4结合亲和力体外检测中测量的，例如通过SPR或ELISA检测确定的；

(ii)其以至少与SEQ ID NO:41的参考人Rspo1相同的亲和力结合ZNRF3受体，如通过Rspo1/ZNRF3结合亲和力体外检测测量的，例如通过SPR或ELISA检测确定的；

(iii)其激活Wnt/β-连环蛋白通路达到至少与SEQ ID NO:41的参考人Rspo1相似的水平，例如如在以下实施例中所描述的TopFlash检测确定的；

(iv)其诱导功能性β细胞的增殖达到至少与SEQ ID NO:41的参考人Rspo1相似的水平，例如如在体外Min6β细胞增殖检测中确定的；和/或

(v)其诱导功能性β细胞的增殖达到至少与SEQ ID NO:41的参考人Rspo1相似的水平，例如如在体内β细胞增殖检测中确定的。

E33.Fc融合蛋白，其包括E1-E32中任一项的重组变体，其中Fc片段直接或经由肽接头间接融合至所述重组变体，

E34.根据E33中的Fc融合蛋白，其进一步包括直接或间接融合在R-spondin蛋白N末端的Fc片段。

E35.根据E33中的Fc融合蛋白，其进一步包括直接或间接融合在R-spondin蛋白C末端的Fc片段。

E36.根据E33-35中任一项的Fc融合蛋白，其中所述肽接头包括例如GGGGGGSGGGGSGGGGSA(SEQ ID NO:44)或GGGGSGGGGSGGGGGG(SEQ ID NO:45)的接头。

E37.根据E33-36中任一项的Fc融合蛋白，其中所述Fc片段包含SEQ ID NO:29或基本上由SEQ ID NO:29组成。

E38.根据E33-E37中任一项的Fc融合蛋白，其包含选自下组的序列或基本上由其组成：SEQ ID NO:42、43或SEQ ID NO:92、93或95。

E39.E1-E38中任一项的重组变体，其用作药物，特别是用于治疗糖尿病，更优选用于治疗有需要的I型或II型糖尿病患者。

E40.E33-E39中任一项的融合蛋白，其用作药物，特别是用于治疗糖尿病，更优选用于治疗有需要的I型或II型糖尿病患者。

E41.根据E39的用于其用途的重组变体或E40用于其用途的融合蛋白，其中所述重组变体或融合蛋白与β细胞，优选干细胞衍生的β细胞，联合施用于所述患者。

E42.核酸，其编码E1-E32中任一项的重组变体。

E43.载体，其包含E42的核酸。

E44.宿主细胞，其包含E42的核酸。

E45.用于制备E1-E32中任一项的重组变体的方法，其包括(i)在用于表达所述重组变体的条件下，培养E44的宿主细胞，(ii)回收所述重组变体，(iii)任选地纯化所述重组变体。

E46.核酸，其编码E33-E38中任一项的融合蛋白。

E47.载体，其包含E46的核酸。

E48.宿主细胞，其包含E46的核酸。

E49.用于制备E33-E38中任一项的融合蛋白的方法，其包括(i)在用于表达所述融合蛋白的条件下，培养E44的宿主细胞，(ii)回收所述重组变体，(iii)任选地纯化所述重组变体。

附图说明

图1：提供了Rspo1、Rspo2、Rspo3和Rspo4氨基酸序列的比对以及不同结构域FU1、FU2、TSP和BR的示意图。

图2：用PBS(黑色为对照)或不同剂量的重组hRspo1孵育的Min6细胞的定量分析。

图3：用PBS(对照组，左侧黑色柱)或不同剂量的变体#009(灰色)孵育的Min6细胞的定量分析。右侧400nM处的条形柱对应于用野生型hRspo1进行Min6定量的结果。

图4：用PBS(对照组，左侧黑色柱)或不同剂量的变体#008(灰色)孵育的Min6细胞的定量分析。右侧400nM处的条形柱对应于用野生型hRspo1进行Min6定量的结果。

图5：用PBS(对照组，左侧黑色柱)或不同剂量的变体#005(灰色)孵育的Min6细胞的定量分析。右侧400nM处的条形柱对应于用野生型hRspo1进行Min6定量的结果。

图6：用PBS(对照组，左侧黑色柱)或不同剂量的变体#034(灰色)孵育的Min6细胞的定量分析。右侧400nM处的条形柱对应于用野生型hRspo1进行Min6定量的结果。

图7：用PBS(对照组，左侧黑色柱)或不同剂量的变体#047(灰色)孵育的Min6细胞的定量分析。右侧400nM处的条形柱对应于用野生型hRspo1进行Min6定量的结果。

图8：用PBS(对照组，左侧黑色柱)或不同剂量的变体#051(灰色)孵育的Min6细胞的定量分析。右侧400nM处的条形柱对应于用野生型hRspo1进行Min6定量的结果。

图9：用PBS(对照组，左侧黑色柱)或不同剂量的变体#063(灰色)孵育的Min6细胞的定量分析。右侧400nM处的条形柱对应于用野生型hRspo1进行Min6定量的结果。

图10：用PBS(对照组，左侧黑色柱)或不同剂量的变体#064(灰色)孵育的Min6细胞的定量分析。右侧400nM处的条形柱对应于用野生型hRspo1进行Min6定量的结果。

图11：用PBS(对照组，左侧黑色柱)或不同剂量的含有组氨酸标签的变体#049(灰色)孵育的Min6细胞的定量分析。右侧400nM处的条形柱对应于用野生型hRspo1进行Min6定量的结果。

图12：用PBS(对照组，左侧黑色柱)或不同剂量的变体#054(灰色)孵育的Min6细胞的定量分析。右侧400nM处的条形柱对应于用野生型hRspo1进行Min6定量的结果。

图13：用PBS(对照组)或无标签的变体#049在200nM和400nM下孵育24小时的Min6细胞的定量分析。

图14：用PBS(对照组)或无标签的变体#049在200nM和400nM下孵育48小时的Min6细胞的定量分析。在最初的24小时孵育后加入新鲜蛋白。

图15：用PBS(对照组)或无标签的变体#049在200nM和400nM下孵育72小时的Min6细胞的定量分析。在最初的24小时孵育后加入新鲜蛋白，48小时孵育后再次加入。

图16：用PBS(对照组，左侧黑色柱)或不同剂量的变体#056(灰色)孵育的Min6细胞的定量分析。右侧400nM处的条形柱对应于用野生型hRspo1进行Min6定量的结果。

图17：用PBS(对照组，左侧黑色柱)或不同剂量的变体#082(灰色)孵育的Min6细胞的定量分析。右侧400nM处的条形柱对应于用野生型hRspo1进行Min6定量的结果。

图18：用PBS(对照组，左侧黑色柱)或不同剂量的变体#0116(灰色)孵育的Min6细胞的定量分析。左侧400nM处的条形柱对应于用野生型hRspo1(#014)进行Min6定量的结果。

图19：培养4天和用变体#014(A)、#49(B)、#008(C)、#064(D)、#051(E)、#121(F)和GLP1(1nM)处理72小时后129/Sv小鼠朗格尔汉斯岛中BrdU阳性β-细胞的百分比。

图20：每天用变体#014(A，B)和变体#064(C，D)腹腔注射处理16周的雌性NOD小鼠的血糖监测和糖尿病发病率。

图21：每天用变体#049以0.2mg/Kg、0.4mg/Kg和0.8mg/Kg处理的雌性NOD小鼠中的糖尿病发病率。

图22：每天用变体#049以0.2mg/Kg、0.4mg/Kg和0.8mg/Kg处理的NOD小鼠的血糖监测。

图23：来自连续5天腹腔注射变体#014的小鼠的胰腺切片上的Ki67/胰岛素双阳性细胞的定量，以胰岛面积(μm²)归一化。

图24：来自连续5天腹腔注射变体#014的小鼠的胰腺切片上的BrdU/胰岛素双阳性细胞的定量，以胰岛面积(μm²)归一化。

图25：每日用变体#014腹腔注射处理的STZ诱导的高血糖小鼠的血糖监测，在STZ处理前15天开始。

图26：每日用变体#014腹腔注射处理的STZ诱导的高血糖小鼠的水摄入量，在STZ处理前15天开始。

图27：对每日用变体#014腹腔注射处理的STZ诱导的高血糖小鼠进行腹腔葡萄糖耐量试验，在STZ处理前15天开始。该试验在开始每天施用变体#014的74天后进行。

图28：每日用变体#014腹腔注射处理的STZ诱导的高血糖小鼠的血糖监测，在STZ处理后7天开始。

图29：每日用变体#014腹腔注射处理的STZ诱导的高血糖小鼠的水摄入量，在STZ处理后7天开始。

图30：对每日用变体#014腹腔注射处理的STZ诱导的高血糖小鼠进行腹腔葡萄糖耐量试验，在STZ处理后7天开始。该试验在开始每天施用变体#014的63天后进行。

图31：在移植人胰岛并每日注射PBS或0.4mg/Kg和0.8mg/Kg变体#014的动物血液中检测空腹人c-肽。

图32：使用PBS(对照组)或0.4mg/Kg和0.8mg/Kg变体#014处理28天后，对移植人胰岛的小鼠进行腹腔葡萄糖耐量试验。

图33：使用PBS(对照组)或0.4mg/Kg和0.8mg/Kg变体#014处理28天后，移植人胰岛的小鼠的基础和葡萄糖刺激的血液人c-肽水平。

图34：使用PBS(对照组)或0.4mg/Kg和0.8mg/Kg变体#014处理60天后，移植人胰岛中总胰岛素体积的定量分析。

图35：雄性129/Sv小鼠(n＝3/时间点)经皮下注射0.8mg/kg的#63-1、#63-2和#64Fc-融合蛋白的168小时动力学比较，显示相对于参考非Fc蛋白#14的半衰期延长。蛋白#14(虚线)的单剂量PK曲线供比较。

具体实施方式

实施例

1.用于表征R-spondin蛋白的功能试验

ZNRF3结合检测：ELISA(酶联免疫吸附检测)方案

ELISA是一种基于平板的检测方法，利用配体结合分子(抗体、融合分子等)和检测抗体来检测和量化液体样品中的可溶性蛋白质(配体)。

程序：

用抗原(100μl/well,1μg/ml in PBS pH 7.4,4℃过夜)处理ELISA模块(NuncMaxisorp,Thermo Scientific)。捕获抗原后，用pH值为7.4、含0.05％吐温20(PBS-吐温)的PBS洗板4次，并用含2％ BSA(Merck)的PBS-吐温封闭60分钟。然后，用含1％ BSA的PBS-吐温溶液将样品(见第二层所用分子)从4000ng/ml开始连续稀释两倍，施加到平板上(100μl/孔)，室温下摇床(300rpm)孵育60分钟。

如果需要第三层(LGR4-His结合)：用PBS-吐温洗板4次，然后加入100μl抗体(见第三层所用抗体)，用含1％ BSA的PBS-吐温稀释。在室温下，将平板放在摇床上(300rpm)孵育30分钟。

然后，用PBS-吐温洗板4次，再加入100μl的过氧化物酶偶联山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(Goat anti-mouse-IgG-HRP,1:10 000,0.1μl/mL,LabAs Estonia)，用含1％ BSA的PBS-吐温稀释。在室温下，将平板放在摇床上(300rpm)孵育30分钟。

用PBS-吐温洗板4次，然后加入100μl TMB底物溶液VII(Biopanda Diagnostics)。使反应在室温下在摇床(300rpm)上进行10分钟，然后加入50μl 0.5M硫酸终止反应。

使用ELISA酶标仪(Thermo Scientific)在450nm处测量吸光度。

所用抗原：

·RSPO-1(#120-38，Peprotech)

·RSPO-2(#3266-RS，R&D Biosystems)

·RSPO-3(#120-44，Peprotech)

·Icosagen Cell Factory生产的蛋白#007、#008、#014、#059

·第二层所用分子：

·LGR4-His(#LG4-H52H3，Acro)

·LGR4-Fc(#7750-GP，R&D Biosystems)

·ZNRF3-Fc(#7994-RF，R&D Biosystems)

·第三层所用抗体(用于LGR4-His结合)：

·小鼠单克隆抗-His抗体(1:2500,0.2μg/mL,Genscript,Cat.No.A00186)

用于测量Wnt/β-连环蛋白信号通路活性的TOP-FLASH-ASSAYSuper-TOP-FLASH萤光素酶报告基因检测可用于监测条件培养基中Wnt和R-spondin蛋白的浓度和活性。首先，准备表达Super-TOP-FLASH报告基因的HEK 293STF细胞，并于无血清DMEM中铺板至96孔板上(1-2×10⁴细胞/孔)。24小时后，将血清饥饿的报告细胞暴露于不同量的含有Wnt或R-spondin蛋白的培养基。诱导18-24小时后，测量荧光素酶活性，并将条件培养基中的生长因子含量与已知来源的蛋白质(重组标准hRSPO1)进行比较。这种基于细胞的报告基因检测可以同时检测Wnt和R-spondin配体的活性。

所需试剂和细胞系：

a.HEK-293STF细胞(ATCC)。

b.lcosagen Cell Factory生产的R-spondin蛋白和RSPO-1(#120-38,Peprotech)，RSPO-2(#3266-RS,R&D Biosystems)，RSPO-3(#120-44,Peprotech)。

d.Steady-萤光素酶检测系统(Promega,cat#E2510)

e.完全生长培养基：DMEM(Gibco)细胞培养基，含有10％ FCS(Gibco)+1x Pen/Strep

f.无血清生长培养基：DMEM(Gibco)培养基+1x Pen/Strep

g.96孔板：平底白色聚苯乙烯孔(Greiner)

制备HEK-293STF细胞用于Super-TOP-FLASH萤光素酶报告基因检测：

第0天：用2ml胰酶从10cm培养皿底部分离HEK-293-STF细胞，5分钟后加入2ml完全生长培养基。以200g离心细胞5分钟，并将细胞沉淀在无血清DMEM中重悬。计数细胞并将在总体积为100μl的无血清培养基中的HEK-293-STF报告细胞(2*105细胞/ml)接种到CELLSTAR 96孔板中。在37℃加湿细胞培养培养箱中培养细胞22-26小时。

第1天：将R-spondin蛋白稀释到DMEM培养基中并应用于预培养的HEK-293STF细胞，从而实现连续稀释(在本例中使用三倍稀释)。在37℃下用诱导物培养细胞18-24小时。

第2天：向培养孔中直接加入50μl Steady-萤光素酶检测底物，等待至少5分钟，使用Glomax Explorer Iuminometer(Promega)测定生物发光信号强度，以测量STF萤火虫活性。将结果导出至PC进行分析。

Min6细胞增殖检测

将小鼠胰岛素瘤(Min6)细胞在补充有4.5g/l葡萄糖、12.5％ FCS(胎牛血清)、0.005％碳酸氢钠、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM中培养，并保持在加湿环境(37℃；95％空气/5％CO2)中。将低传代次数(最多传代30次)的Min6细胞以80000细胞/ml的接种密度接种到12孔板中。将贴壁细胞与以不同浓度稀释到低FCS培养基(5％)中的靶分子一起孵育24小时。对于更长的孵育，每24小时向培养基中添加新鲜的蛋白质。最后分离细胞并用Thoma Chamber手动定量。

当与400nM处理的Rspo1相比，变体显示出总体更强的增殖诱导能力时，或当与相似浓度处理的hRspo1相比，能显著增加增殖的浓度较低时，则变体被认为比天然hRspo1更有效。

Wnt/β连环蛋白检测

如前段所述培养Min6细胞。将低传代细胞以250000细胞/ml的接种密度接种到6孔板中。贴壁细胞用不同剂量的hRspo1类似物在几个时间点在低-FCS培养基(5％)中处理。随后，分离细胞并重悬于PBS中。通过超声处理分离总蛋白，并根据制造商的说明书通过ELISA检测评估β-连环蛋白的浓度。BCA含量用于均一化每个蛋白质样品。

体内增殖检测

体内增殖检测在2月龄野生型129SV小鼠中进行。经过最少3天的适应期后，连续数天每天给动物腹腔或皮下注射不同浓度的目标变体。每天注射150μl无菌PBS处理的小鼠作为对照组。最后，在最后一次注射后30分钟通过颈椎脱臼处死小鼠。收集胰腺并固定在Antigenfix(多聚甲醛溶液pH 7.2-7.4；Microm Microtech France)中，用冷PBS洗涤并在0.86％生理盐水中孵育1小时。再通过一系列递增的乙醇稀释物(50％、70％、80％、90％和100％)脱水后，用异丙醇和甲苯处理胰腺并包埋在石蜡中。将石蜡块切成6μm厚的切片，并使用抗胰岛素、PC1/3、Ki67和BrdU的抗体进行免疫荧光分析。

如果变体能诱导更多的增殖性β-细胞，更大程度的β-细胞团增加，更好的葡萄糖处理能力，或者如果所需的起效/浓度低于天然hRspo1，则变体被认为比天然hRspo1更具活性。

显然，这种方法也可用于不同的糖尿病小鼠模型，包括链脲佐菌素处理小鼠、NOD动物或Rip-B7动物(King,BrJPharmacol.2012Jun；166(3):877-894and Karges et al.,Diabetes 2002Nov；51(11):3237-3244)。

结果

A.重组变体的生产

下表2列出了根据如下方案生产的重组Rspo蛋白。

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表2：本发明的实例和Rspo重组蛋白的比较例

所有上述重组蛋白均采用lcosagen开发的QMCF技术(参见US7,790,446,US8,377,653)表达，包括基于CHO或HEK293的QMCF细胞系。

表2中描述的大多数蛋白在其C末端，BR结构域之后包含短接头和C-His标签，以方便纯化，但以下除外：

·#014(天然hRspo1)，

·#46，其C末端具有短接头和对白蛋白具有高亲和力的序列，

·Fc缀合蛋白。

本领域技术人员能够制备具有用于纯化的替代接头和/或标签，或不具有此类接头和标签的类似重组蛋白。

B.在Top Flash检测中测定β-连环蛋白通路激活

对所有产生的变体测试其刺激β-连环蛋白通路的能力，并与天然hRspo1比较。

下表3显示了一些产生的变体的结果：

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表3：每个测试实例的Min6增殖活性。(-：无可检测的活性，+：活性低于天然hRspo1(#014)，++：与天然hRspo1(#014)活性相似，+++：活性高于天然hRspo1(#014))

C.使用体外Min6增殖检测测定Min增殖活性

使用小鼠胰岛素瘤(Min6)细胞系体外评估每种变体的增殖活性。重组hRspo1刺激Min6增殖，呈钟形剂量-响应曲线，其峰值在400nM(图2)。

类似于天然hRspo1，变体#009显示对Min6细胞的钟形剂量-响应有丝分裂效应，峰值在400nM(图3)。然而，在该剂量下，Min6的增殖速率显著高于原始hRspo1(图3)。

在所有测试浓度下，与变体#008孵育后，Min6细胞的数量均显著增加(图4)。有趣的是，与用hRspo1处理的Min6细胞相比，该数量在200nM和1μM剂量下也显著更高(图4)。

变体#005显示与标准hRspo1相同的钟形剂量-响应曲线，在400nM达到峰值增殖反应(图5)。然而，用变体#005孵育的Min6细胞在数量上显著低于用天然hRspo1孵育的Min6细胞的数量(图5)。

有趣的是，变体#034在所有测试浓度下均显著刺激Min6细胞增殖，在400nM浓度下与野生型hRspo1相比没有显著差异(图6)。

变体#047的增殖剂量-响应曲线为钟形，在200nM开始起效，在1μM达到峰值(图7)。在后一种浓度下，Min6细胞的有丝分裂速率与用400nM的原始hRspo1孵育的细胞相比显著增加(图7)。

重要的是，用变体#051刺激Min6细胞产生的剂量-响应曲线与用变体#047处理时观察到的剂量-响应曲线形状相似(图8)。

然而，与400nM的天然hRspo1相比，变体#051起效更早(100nM)并在400nM和1μM时均诱导显著更强的增殖(图8)。

有趣的是，在400nM的浓度下孵育时，Fc-缀合的hRspo1变体(#063)与原始蛋白质一样有效(图9)。然而，这种增殖效应不遵循钟形剂量-响应曲线，而是在较高剂量下保持稳定(图9)。

相反，N末端Fc-缀合的变体#064在400nM下对Min6细胞不显示任何显著的增殖效应，该蛋白质仅在稀释至1μM或更高浓度时才变得有效(图10)。

包含His标签的变体#049和变体#056的有丝分裂效应产生相同的钟形剂量-响应曲线，并显示与天然重组hRspo1相同的效率(图11-12)。

在Min6细胞中还测试了无标签变体#049的功效。用400nM变体#049孵育24小时后，Min6细胞数显著增加(图13)。重要的是，当相同的蛋白质孵育48小时或72小时时，该增加更强和更显著(图14和15)。

类似地，观察到变体#054在剂量增加至400nM时效率逐渐增加，在更高浓度时效率逐渐降低(图16)。然而，该类似物在其剂量-响应曲线的峰值处刺激Min6增殖的作用比原始hRspo1显著更强(图16)。

出乎意料地，变体#082在所有测试浓度下强烈刺激Min6细胞增殖，即使在较低剂量下，其显示比hRspo1显著更强的有丝分裂活性(图17)。

变体#116以钟形曲线增加Min6细胞数，在400nM下达到活性峰值(图18)。

还测试了天然人Rspo3在体内诱导β-细胞增殖的能力。进一步分析表明野生型小鼠短期暴露(5-30分钟)于人Rspo3也诱导体内β-细胞增殖。

D.NRF3结合测定

我们生产了变体#009、#047和#051，并使用如上所述的ZNRF3-Fc受体结合检测测试了它们与原始天然Rspo1相比改善与ZNRF3结合的能力。

虽然变体#009的表现与我们的对照Rspo1(无突变)相似，但变体#047和#051与对照Rspo1相比显示出对ZNRF3的优异结合亲和力。

2.分离的胰岛中β细胞的增殖

2.1方法

2.1.1动物

雄性129S2/SvPasCrl小鼠获自查尔斯河实验室(Charles River Laboratories，69210Saint-Grmain Nuelles，法国)：使用60只在10-12周龄的小鼠。所有动物实验均按照欧洲动物保护指南(2010/63/UE)及N°2796授权项目的部分内容进行。在实验开始之前，使动物适应环境1周，并将其饲养在控温(22±2℃)区域中，光-暗周期为12小时(上午7:00开灯)。所有小鼠均食用来自SAFE(科学动物食物和工程-Route de Saint Bris-89290 AUGY-法国)的正常生长日粮A04，并自由饮水。每隔一天更换一次垫料(无菌锯屑)。小鼠被分成每笼6只动物的组。笼子的尺寸为42.5×26.6×15.5cm。观察一般体征，仅无任何异常体征的动物被纳入研究。

腹腔注射戊巴比妥麻醉小鼠，用胶原酶灌注胰腺以进一步分离胰岛。在RPMI 1640中稳定过夜后，分离胰岛，并用化合物和参照物处理72小时以进一步进行细胞增殖评估。

2.1.2胰岛分离和处理

通过胶原酶消化胰腺分离129/Sv小鼠的胰岛，并在Hanks平衡盐溶液(HBSS)中洗涤，然后使用Histopaque 1077和HBSS进行密度梯度纯化。将胰岛以30个胰岛的密度手动挑选，接种于含有10mM Hepes、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％ SVF的RPMI 1640中，并于37℃下在90％空气/5％ CO2的湿润环境中培养。经过一夜的稳定期后，去除培养基，加入不含(对照组)或含有被测化合物或参照物的新鲜培养基。然后，在24小时和48小时后更新培养基和处理物。对于处理的最后24小时，向培养基中加入BrdU(10mM)。

胰岛被分为8组，每组6个皮氏培养皿，如下表4中所示：

组别	处理	胰岛数量
			1	对照组	6个皮氏培养皿中180个
2	#14 0.2μM	5个皮氏培养皿中150个
			3	#14 1μM	5个皮氏培养皿中150个
4	#14 3μM	5个皮氏培养皿中150个
			5	#64 0.2μM	5个皮氏培养皿中150个
6	#64 1μM	5个皮氏培养皿中150个
			7	#64 3μM	5个皮氏培养皿中150个
8	#51 0.2μM	5个皮氏培养皿中150个
			9	#51 1μM	5个皮氏培养皿中150个
10	#51 3μM	5个皮氏培养皿中150个
			11	#008 0.2μM	5个皮氏培养皿中150个
12	#008 1μM	5个皮氏培养皿中150个
			13	#008 3μM	5个皮氏培养皿中150个
14	#49 0.1μM	5个皮氏培养皿中150个
			15	#49 0.2μM	5个皮氏培养皿中150个
16	#49 0.4μM	5个皮氏培养皿中150个
			17	#49 1μM	5个皮氏培养皿中150个
18	#49 2μM	5个皮氏培养皿中150个
			19	#121 0.1μM	5个皮氏培养皿中150个
20	#121 0.2μM	5个皮氏培养皿中150个
			21	#121 0.4μM	5个皮氏培养皿中150个
22	#121 1μM	5个皮氏培养皿中150个
			23	#121 3μM	5个皮氏培养皿中150个
24	GLP-1-1nM	6个皮氏培养皿中180个

2.1.3用于增殖测定的分离胰岛的制备

处理72小时后，从每个条件的皮氏培养皿中收集30个胰岛并转移到1.5mlEppendorf离心管中。然后，通过离心(1000rpm，30秒，4℃)用DPBS洗涤胰岛3次，再用胰蛋白酶-EDTA 0.25％消化。加入RPMI 1640终止反应，并将消化的胰岛在细胞载玻片上进行细胞离心涂片。

然后，将胰岛用3.7％的多聚甲醛固定30分钟，再用含Triton X100-0.2％的BSA5％进行透化，然后使用pH值为6的柠檬酸盐缓冲液在100℃进行20分钟抗原修复。为了防止抗体的非特异性结合，在免疫染色之前在PBS-5％ BSA中进行封闭。

2.1.4β细胞增殖测定

使用偶联山羊抗大鼠IgG Alexa Fluor 647(ThermoFisher Scientific-ref.A-21247)的大鼠抗BrdU抗体(Abcam-Ref.ab6326)和偶联山羊抗小鼠IgG488抗体(Diagomix-ref.GtxMu-003-D488NHSX)的小鼠抗胰岛素抗体(Sigma,ref.12018)进行双重免疫染色后，通过计数切片中的BrdU阳性细胞来估计细胞增殖。细胞核用ProLongTM Gold抗猝灭封片剂(含DAPI)(Life Technologies-ref.P36935)染色。使用NDP view或caseviewer成像软件对玻片进行扫描和分析后，确定被BrdU免疫染色的细胞的数量。每批对5-6个样品进行分析。

2.2结果

本研究旨在评价暴露于6种变体(#008、#014、#049、#051、#064和#121)72小时对129/Sv小鼠朗格尔汉斯岛中的β-细胞增殖的影响。在3个浓度(0.2、1和3μM)下检测了蛋白#008、#014、#051、#064，在5个浓度(0.1、0.2、0.4、1和2μM(#049)或3μM(#121))下检测了蛋白#049和#121。细胞增殖的计算方式为将BrdU阳性细胞数除以细胞总数，并表示为％(图19)。结果以平均值±SEM表示。每个处理的观察次数为5-6次。为了分析化合物效果，当差异显著时，统计分析采用Anova后进行Dunnett's检验，或Kruskal-Wallis后进行Dunn's检验(GraphPad8)。P值＜0.05视为显著。

3.雌性NOD小鼠中的血糖变化和β-细胞团

3.1方法

3.1.1动物

雌性NOD/Mrk Tac小鼠由Taconic Biosciences(4623Ejby,Lille Skensved,丹麦)提供：55只小鼠在转移至CNRS-Universite de Paris-UMR 7592动物设施时为6-8周龄。所有动物实验均按照欧洲动物保护指南(2010/63/UE)及授权项目#20173和#31876的部分内容进行。在实验开始之前，使动物适应环境1周，并将其饲养在控温(22±2℃)区域中，光-暗周期为12小时(上午7:00开灯)。所有小鼠均食用来自ALTROMIN(AltrominSpezialfutter GmbH&Co.KG-Im Seelenkamp 20-D-32791Lage–德国)的NIH-31M日粮，并自由饮水。每隔一天更换一次垫料(无菌锯屑)。小鼠被分成每笼5只动物的组。笼子的尺寸为37.3×23.4×14.0cm。观察一般体征，仅无任何异常体征的动物被纳入研究。

3.1.2研究设计

在为期16周的研究中，在早晨给小鼠通过腹腔途径递送蛋白，变体#014每天一次，变体#064每周一次，剂量由申办者提供，注射体积为10ml/kg，如下表5中所述：

药物溶液制备方法如下：

-#064：将适当体积的溶于PBS1X pH7.4中的1mg/ml的蛋白质在PBS1X pH7.4中稀释，得到240μg/ml的溶液(2400μg/kg/10ml)。

-#014：将适当体积的溶于PBS1X pH7.4中的1mg/ml的蛋白质在PBS1X pH7.4中稀释，得到80μg/ml的溶液(800μg/kg/10ml)。

将该溶液在PBS1X pH7.4中进一步以1：2的比例稀释，得到40μg/ml溶液(400μg/kg/10ml)。根据要注射的动物数量调节要制备的体积。

在第1周和第18周之间，所有动物在早晨每天接受腹腔注射一次溶媒或化合物(#64，每周一次)。每周一次在尾静脉采血后使用Accu-Check血糖仪监测血糖直至第16周。

以0.2mg/Kg、0.4mg/Kg和0.8mg/Kg的浓度向十周龄雌性NOD小鼠每日腹腔注射无标签变体#049，持续13周。每周监测它们的血糖和体重。如果血糖水平超过250mg/dl，则认为小鼠患有糖尿病。

分析方法

葡萄糖浓度使用Horiba Medical的市售试剂盒(ref.A11A01667)测定。该方法基于两相酶反应：

(1)

(2)

(HK＝已糖激酶，G61-DH＝葡糖糖-6-磷酸脱氢酶)

通过测量由第二阶段产生的NADH所引起的吸光度，对反应进行动态监测。样品中的葡萄糖含量可以根据测量得到的吸光度变化计算。

胰岛素浓度可使用Alpco的市售试剂盒(ref.80-INSMSU-E01/E10)测定。ALPCO小鼠胰岛素超敏ELISA是夹心法免疫检测。96孔微孔板上包被有胰岛素特异性单克隆抗体。将标准品、对照和样品与缀合物一起加入微孔板孔中。然后，将微孔板在微孔板振荡器上以700-900rpm的速度孵育。第一次孵育结束后，用洗涤缓冲液清洗孔并吸干。加入TMB底物，然后在微孔板振荡器上以700-900rpm的速度第二次孵育微孔板。第二次孵育结束后，立即加入终止液，通过分光光度计在450nm处测量光密度(OD)。产生的颜色的强度与样品中胰岛素的量成正比。测量范围在0.025-6.9ng/mL之间。

3.2结果

该研究被设计为评估雌性NOD小鼠腹腔注射2种剂量的#014蛋白(400和800μg/kg)和1种剂量的#64蛋白(2400μg/kg)18周对血糖变化、糖尿病表型和β-细胞团的影响(4组)：溶媒(n＝15)、两种浓度的#014蛋白(n＝13)、一种浓度的#64蛋白(n＝14)，从10周龄起给予化合物18周。

图20中的结果以平均值±SEM表示，并附有个体观察数(n)。统计分析采用Anova，然后进行Dunnett's t检验，以比较实验组与STZ对照组。如果组间方差经Bartlett检验计算有显著差异，则采用Kruskal-Wallis检验后进行Dunn’s检验(GraphPad 8)。P值为0.05时视为显著。

为了评估变体#049在糖尿病背景下抵消β-细胞损失的能力，本发明人使用NOD小鼠作为1型糖尿病模型。有趣的是，每天腹腔注射变体#049剂量依赖性地降低糖尿病发病率(图21)。重要的是，与对照组相比，用0.8mg/Kg浓度的变体#049处理的啮齿动物显示出可忽略的基础血糖增加(图22)。

4.体内试验

4.1方法

4.1.1体内中期增殖检测

对2月龄野生型雄性129SV小鼠进行体内增殖检测。经过至少3天的适应期后，连续5天每天腹腔注射0.4mg/Kg和0.8mg/kg的#014。每天注射150μl无菌PBS的小鼠作为对照组。另外，在处死前，向所有小鼠提供在饮用水中以1mg/ml浓度稀释的胸苷类似物溴脱氧尿苷(BrdU)72小时。最后，在最后一次注射后30分钟通过颈椎脱臼处死小鼠。收集胰腺并固定在Antigenfix(多聚甲醛溶液，pH 7.2-7.4；Microm Microtech France)中，用冷PBS洗涤并在0.86％生理盐水中孵育1小时。再通过一系列递增的乙醇稀释物(50％、70％、80％、90％和100％)脱水后，用异丙醇和甲苯处理胰腺并包埋在石蜡中。将石蜡块切成6μm厚的切片，并使用抗胰岛素、Ki67和BrdU的抗体进行免疫荧光分析。

4.4.2在链脲佐菌素诱导的小鼠高血糖模型上的体内功效检测

对成年2月龄野生型雄性129SV小鼠进行这些测试。为了诱导高血糖症，向129SV雄性小鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，链脲佐菌素是一种氨基葡萄糖-亚硝基脲化合物，具有细胞毒性，导致DNA和染色体损伤。简言之，将STZ溶于0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)中，在饥饿5小时后连续3天以50mg/Kg的剂量给药。通过使用ONETOUCH血糖仪(Life Scan,Inc.,CA)监测血糖水平来评估高血糖发展。每周人工测定一次耗水量。为了评价葡萄糖耐量，进行了腹腔葡萄糖耐量试验(ip-GTT)。对于这些试验，将小鼠禁食5小时，并腹腔注射2g/kg体重的D-(+)-葡萄糖。在注射后的指定时间点用ONETOUCH血糖仪测量血糖水平。从STZ处理前15天或STZ处理后7天开始，每天以0.8mg/Kg的剂量腹腔注射PBS或变体#014(SEQ ID NO:41)。

4.4.3移植的人胰岛的体内功效检测

在本实验中，12只Rag2N12免疫缺陷小鼠移植了人胰岛(500个胰岛当量/小鼠)。在气体麻醉(异氟烷)后，进行腰椎开腹手术以进入左肾。通过导管将胰岛颗粒(500个胰岛当量)注射到每只动物肾被膜下间隙中。移植后，烧灼肾被膜以避免出血和细胞渗漏。缝合肌肉层和皮肤层。皮下注射吗啡(丁丙诺啡-0.05mg/kg)以减轻围手术期疼痛。每只小鼠饲养均在SOPF动物设施中的无菌笼中。恢复2周后，每天用PBS或0.4mg/Kg和0.8mg/Kg剂量的变体#14处理小鼠60天。每2周，在饥饿6小时后测量血液c-肽水平。变体#014处理28天后，通过ip-GTT评估葡萄糖处理能力。最后，在处死前，向动物提供在饮用水中以1mg/ml浓度稀释的BrdU一周。在实验结束时，处死小鼠，分离、固定胰岛移植物，并用抗胰岛素和BrdU的抗体通过免疫荧光进行分析。

4.2结果

4.2.1体内hRspo1增殖活性评估

为了评估hRspo1诱导成年鼠β细胞新生的能力，本发明人连续5天腹腔注射变体#014。重要的是，在所有测试剂量下，用变体#014处理的小鼠的胰腺样品中均观察到共表达胰岛素和内源核增殖标记物Ki67的细胞的增加(图23)。值得注意的是，在分离自用0.8mg/Kg变体#014处理的动物的组织中，评估到6倍的显著增加。因此，施加变体#014增强了胰腺β-细胞内的BrdU积累(图24)。同样，BrdU/胰岛素共表达细胞在注射0.8mg/Kg变体#014的小鼠胰腺切片中明显更丰富。

4.2.2变体#014在STZ诱导的高血糖小鼠模型中对血糖控制的影响

本研究被设计为评估#014蛋白(0.8mg/kg)长期治疗对多次低剂量链脲佐菌素(STZ)诱导的高血糖小鼠模型的血糖控制的影响。连续3天给药STZ(50mg/Kg)三次，以诱导高血糖。从STZ处理前15天或STZ处理后7天开始，每日腹腔注射变体#014或溶媒。

在两个实验条件下，STZ均有效地诱导了所有动物的高血糖。然而，在整个2个月的实验期间，与注射溶媒的对照组相比，注射变体#014的小鼠的血糖水平保持稳定的较低水平(图25和28)。重要的是，当变体#014在STZ介导的高血糖发展之前给药时，这一差异更加显著。因此，用变体#014处理的小鼠24h水摄入量持续减少，表明长期施用hRspo1减轻了高血糖相关的多饮(图26和29)。

在2个月的血糖监测后，ip-GTT显示，在两个实验中，与对照相比，用#14蛋白腹腔注射处理的小鼠的葡萄糖耐量均显著改善(图27和30)。这些数据表明变体#014能够改善慢性高血糖小鼠模型的血糖控制。

4.2.3变体#014对移植的人胰岛的影响

为了测试变体#014对人β-细胞增殖活性的影响，每天向肾被膜下移植了人胰岛的免疫缺陷小鼠注射该分子。有趣的是，与注射PBS的对照组相比，给予小鼠0.4mg/Kg和0.8mg/Kg变体#014导致空腹血人肽水平逐渐升高(图31)。值得注意的是，在两种剂量的变体#014处理的小鼠中，这种增加均在第45天变得显著，并且在注射0.4mg/Kg的实验组动物中，在第60天仍然保持显著(图31)。此外，在第28天，与对照相比，通过ip-GTT评估的葡萄糖耐量在变体#014处理的动物中显示出改善(图32)。因此，不仅在饥饿时，而且在用葡萄糖推注刺激15分钟后，均发现血浆人c-肽显著增加(图33)。

最后，在饮用水中向小鼠提供一周BrdU，并在第60天处死，用于胰腺组织分析。这些研究揭示，与对照组相比，注射变体#014的啮齿动物胰腺切片中BrdU-免疫标记的β-细胞和β-细胞体积均显著增加(图34)。总之，这些数据表明，长期施加变体#014可以有效地刺激人β-细胞增殖和增生。

5.药代动力学

5.1方法

对129/Sv小鼠单次皮下注射0.8mg/kg的Fc-融合变体#63-1、#63-2和#64，研究了它们的药代动力学曲线。

通过皮下途径(SC，沿背部的皮肤)给小鼠施用蛋白，施用体积为10ml/kg，如下表6所示：

如上表所详述，在给药后1h、3h、6h、24h、48h、72h、96h和168h采集血样(每只动物3个时间点+1次终末采血)，并分离血浆用于生物分析检测。

使用基于商用人R-spondin 1DuoSet ELISA试剂盒(R&DSystems)的优化的生物分析方法定量血浆中蛋白#63-1、#63-2和#64的浓度。

在Excel中生成浓度-时间图，使用Excel中的PK Solver插件评估PK数据(ZhangY,t al.Comput Methods Programs Biomed.2010Sep；99(3):306-14).

5.2结果

Fc-融合变体#64、#63-1和#63-2的药代动力学曲线示于图35和表7中。该曲线与用于比较的先前研究(研究编号：DX001-PHA-21-017)中生成的参考蛋白#14的单剂量动力学曲线重叠。

表7：#64、#63-1和#63-2的PK参数比较。单独研究中产生的蛋白#14的值用于比较(灰色)。

在129/Sv小鼠中800μg/kg皮下施用后，三种蛋白质的168h-动力学的比较显示，Cmax在给药后1h至3h之间达到(Tmax)。此后，所有3种蛋白质的血浆水平逐渐降低直至研究的最后时间点(168h)。尽管蛋白#14在SC注射后可定量长达24小时，所有3种Fc-融合蛋白在给药后168小时仍可在血浆中检测到，表明了Fc部分成功地将半衰期从约6.5小时(对于#14的估计)延长至>30小时(图35)。

6.两种Rspo1-Fc融合蛋白的生产

在CHOEBNALT-85-E9细胞中瞬时表达#063(hRspo1 21-263-接头-Fc)和#064(Fc-接头-hRspo1-21-263)变体。测定两种蛋白质的产量。变体#064的产量高于变体#063(11.25mg对4.5mg)。因此，在本公开的变体的N末端融合Fc多肽可以提高Fc融合蛋白的产量。

7.Fc融合蛋白中接头的优化

本发明人表明，要生成活性Fc融合蛋白，接头优化是必要的。实际上，不含接头的商业化Fc融合蛋白(Fc-hRspo1；Creative Biomart053H)在TopFlash检测中没有活性。与先前测试的变体#064或#063不同，Fc-hRspo1蛋白(Creative Biomart 053H)似乎不刺激胰腺β-细胞增殖。

用于实施本发明的有用序列

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表8有用的氨基酸序列

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表9：有用的氨基酸序列

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表10：用于实施本发明的有用核苷酸序列

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表11：用于实施本发明的有用核苷酸序列

Claims

1.R-spondin蛋白的重组变体，其包含以下FU1、FU2、TSP和BR结构域，其中

2.根据权利要求1所述的R-spondin蛋白的重组变体，其包含具有至少H108K和N109D氨基酸取代的Rspo1 FU1和Rspo1 FU2结构域，优选所述变体包含SEQ ID NO:66或基本上由SEQ ID NO:66组成。

3.根据权利要求1或2所述的重组变体，当分别与相应的SEQ ID NO:5的人Rspo1 FU1结构域和SEQ ID NO:6的Rspo1 FU2结构域比对时，其在每个FU1或FU2结构域中具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组变体，其包含在Rspo1的区域21-33内，或在Rspo2、Rspo3或Rspo4的等效区域内的前10-14个N末端氨基酸的缺失，典型地是Rspo1的残基21-31的缺失，优选包含SEQ ID NO:24的蛋白质或由SEQ ID NO:24的蛋白质组成。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组变体，其至少包含在SEQ ID NO:5的人Rspo1FU1结构域中R66处或在人Rspo2、Rspo3或Rspo4 FU1结构域序列中的等效精氨酸残基处的氨基酸取代，所述氨基酸取代降低或消除ZNRF3结合，典型地所述变体包含SEQ ID NO:5的Rspo1 FU1结构域，其具有降低或消除ZNRF3结合的残基R66的单氨基酸取代，典型地为R66A，例如，所述重组变体包含SEQ ID NO:23或基本上由SEQ ID NO:23组成。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组变体，其中所述变体不包含在FU2和TSP结构域之间的N-糖基化位点，例如，其包含Rspo1的N137残基或Rspo2、Rspo3、或Rspo4的等效残基中的突变，以抑制该位置处的N-糖基化，优选所述重组变体包含SEQ ID NO:22或基本上由SEQ ID NO:22组成。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组变体，其中所述FU1结构域与SEQ ID NO:9的Rspo2 FU1结构域100％相同并且所述FU2选自Rspo1、Rspo3、Rspo4的FU2结构域或其功能性变体，所述功能性变体具有至少保持与LGR4相同的结合亲和力的氨基酸取代，优选所述变体包含SEQ ID NO:9的Rspo2 FU1结构域和SEQ ID NO:6的Rspo1 FU2结构域，以及任选地SEQ ID NO:7的Rspo1 TSP结构域和SEQ ID NO:8的Rspo1 BR结构域，更优选地，所述变体包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26或基本上由SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26组成。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的重组变体，其表现出与SEQ ID NO:41的Rspo1蛋白至少相似水平的以下一种或多种特性：

(i)其以至少与SEQ ID NO:41的参考人Rspo1相同的亲和力结合LGR4受体，如在Rspo1/LGR4结合亲和力体外检测中测量的，例如通过SPR检测确定的；

(ii)其诱导功能性β-细胞增殖至至少与SEQ ID NO:41的参考人Rspo1相似的水平，例如在体外Min6β-细胞增殖检测中确定的；和/或，

(iii)其诱导功能性β-细胞增殖至至少与SEQ ID NO:41的参考人Rspo1相似的水平，例如在体内β-细胞增殖检测中确定的。

9.Fc融合蛋白，其包含权利要求1-8中任一项所述的重组变体，其中Fc片段直接或经由肽接头间接融合至所述重组变体，优选地，所述Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:42、43、92或93或基本上由SEQ ID NO:42、43、92或93组成。

10.权利要求1-8中任一项所述的重组变体或权利要求9所述的融合蛋白，其用作药物，特别是用于治疗糖尿病，更优选I型或II型糖尿病。

11.核酸，其编码权利要求1-8中任一项所述的重组变体或权利要求9所述的融合蛋白。

12.载体，其包含权利要求11所述核酸。

13.宿主细胞，其包含权利要求11所述核酸。

14.用于制备权利要求1-8中任一项所述的重组变体或权利要求9所述的融合蛋白的方法，其包括(i)在用于表达所述重组变体或融合蛋白的条件下，培养权利要求13所述的宿主细胞，(ii)回收所述重组变体或融合蛋白，(iii)任选地，纯化所述重组变体或融合蛋白。