EA034847B1 - Мутанты fgf21 и их применение - Google Patents

Мутанты fgf21 и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA034847B1
EA034847B1 EA201690946A EA201690946A EA034847B1 EA 034847 B1 EA034847 B1 EA 034847B1 EA 201690946 A EA201690946 A EA 201690946A EA 201690946 A EA201690946 A EA 201690946A EA 034847 B1 EA034847 B1 EA 034847B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
fgf21
amino acid
mutant
polypeptide
acid residues
Prior art date
Application number
EA201690946A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201690946A1 (ru
Inventor
Эдвард Джон Белуски
Мюриэль Мэри Эллисон
Агнес Ева Гамбургер
Рэнди Айра Хехт
Ю-Шенг Ли
Марк Лео Михаелс
Джеонгун Сан
Джинг Ксу
Original Assignee
Амген Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40984291&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA034847(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Амген Инк. filed Critical Амген Инк.
Publication of EA201690946A1 publication Critical patent/EA201690946A1/ru
Publication of EA034847B1 publication Critical patent/EA034847B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • C07K14/05—Epstein-Barr virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factors [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

Изобретение предлагает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие мутантные полипептиды FGF21, мутантные полипептиды FGF21, как таковые, фармацевтические композиции, включающие мутантные полипептиды FGF21, и способы лечения метаболических заболеваний с применением таких нуклеиновых кислот, полипептидов или фармацевтических композиций.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим мутантные полипептиды
FGF21, к мутантным полипептидам FGF21, к фармацевтическим композициям, содержащим мутантные полипептиды FGF21, и к способам лечения метаболических заболеваний с применением таких нуклеиновых кислот, полипептидов или фармацевтических композиций.
Предпосылки создания изобретения
FGF21 представляет собой секретируемый полипептид, принадлежащий к подсемейству факторов роста фибробластов (FGF), которые включают FGF19, FGF21 и FGF23 (Itoh et. al., 2004, Trend Genet. 20: 563-69). Полипептид FGF21 является атипичным FGF в том отношении, что он независим от гепарина и функционирует как гормон в регуляции глюкозы, липидов и энергетического метаболизма.
FGF21 был выделен из библиотеки кДНК печени как секретируемый печеночный фактор. Он высоко экспрессируется в печени и поджелудочной железе, являясь единственным членом семейства FGF, экспрессируемым, главным образом, в печени. Трансгенные мыши с избыточной экспрессией FGF21 демонстрируют метаболические фенотипы замедленных темпов роста, низкого уровня глюкозы и триглицеридов в плазме, а также отсутствие связанного с возрастом сахарного диабета 2 типа, гиперплазии островковых клеток поджелудочной железы и ожирения. Фармакологическое введение рекомбинантного белка FGF21 в моделях грызунов и приматов приводит к нормализации уровня глюкозы в плазме, к снижению уровня триглицеридов и холестерина, а также к улучшению толерантности к глюкозе и чувствительности к инсулину. В дополнение к этому FGF21 снижает вес тела и отложения телесного жира за счет увеличения потребления энергии, физической активности и скорости метаболизма. Экспериментальные исследования дают подтверждение фармакологическому введению FGF21 для лечения сахарного диабета 2 типа, ожирения, дислипидемии и других метаболических состояний или заболеваний у человека.
FGF21 человека имеет короткий период полувыведения in vivo. У мышей период полувыведения FGF21 человека составляет от 1 до 2 ч, а у обезьян cynomolgus период полувыведения составляет от 2,5 до 3 ч. При разработке белкового препарата FGF21 для применения в качестве лекарства при лечении сахарного диабета 2 типа было бы желательно увеличить период полувыведения. Белки FGF21, имеющие удлиненный период полувыведения, позволили бы реже вводить дозы лекарства пациентам, получающим такие препараты. Описание таких белков приводится в настоящем документе.
Сущность изобретения
Раскрытие сущности изобретения относится к выделенному полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, кроме того, включающему аминокислотную замену, выбранную из остатка аланина в положении 45, остатка лейцина в положении 86, остатка лейцина в положении 98, остатка аланина в положении 111, остатка аланина в положении 129, остатка глицина в положении 170, остатка пролина в положении 171, остатка серина в положении 172 или их комбинаций. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенный полипептид включает аминокислотную замену: остатка лейцина в положении 98, остатка пролина в положении 171 или как остатка лейцина в положении 98, так и остатка пролина в положении 171. В другом варианте осуществления изобретения выделенный полипептид включает аминокислотную замену как остатка лейцина в положении 98, так и остатка пролина в положении 171.
Раскрытие изобретения также представляет выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, имеющую: (а) как минимум одну аминокислотную замену, которая представляет собой: (i) остаток глутамина, изолейцина или лизина в положении 19, (ii) остаток гистидина, лейцина или фениланина в положении 20, (iii) остаток изолейцина, фениланина, тирозина или валина в положении 21, (iv) остаток изолейцина, фенилаланина или валина в положении 22, (v) остаток аланина или аргинина в положении 150, (vi) остаток аланина или валина в положении 151, (vii) остаток гистидина, лейцина, фениланина или валина в положении 152, (viii) остаток аланина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, пролина или серина в положении 170, (ix) остаток аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, лизина, серина, треонина, триптофана или тирозина в положении 171, (х) остаток лейцина или треонина в положении 172, (xi) остаток аргинина или глутаминовой кислоты в положении 173, или (b) как минимум одну аминокислотную замену, которая представляет собой: (i) остаток аргинина, глутаминовой кислоты или лизина в положении 26, (ii) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина или треонина в положении 45, (iii) остаток треонина в положении 52, (iv) остаток цистеина, глутаминовой кислоты, глицина или серина в положении 58, (v) остаток аланина, аргинина, глутаминовой кислоты или лизина в положении 60, (vi) остаток аланина, аргинина, цистеина или гистидина в положении 78, (vii) остаток цистеина или треонина в положении 86, (viii) остаток аланина, аргинина, глутаминовой кислоты, лизина или серина в положении 88, (ix) остаток аргинина, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина или треонина в положении 98, (х) остаток аргинина, аспарагиновой кислоты, цистеина или глутаминовой кислоты в положении 99, (xi) остаток лизина или треонина в положении 111, (xii) остаток аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина, гистидина или лизина в положении 129, или (xiii) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, гистидина, лизина или тирозина в положении 134, а также их комбинации. В одном из вариантов осуществ- 1 034847 ления изобретения аминокислотный остаток в положении 98 представлен аргинином, а аминокислотный остаток в положении 171 представлен пролином, а в другом варианте осуществления изобретения полипептид может включать аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, но в которой как минимум одна аминокислотная замена из (a)(i)-(xi) и (b)(i)-(xiii) далее не модифицируется.
Настоящее раскрытие изобретения далее представляет выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, имеющую как минимум одну аминокислотную замену, которая представляет собой: (а) остаток глутамина, лизина или изолейцина в положении 19, (b) остаток гистидина, лейцина или фенилаланина в положении 20, (с) остаток изолейцина, фенилаланина, тирозина или валина в положении 21, (d) остаток изолейцина, фенилаланина или валина в положении 22, (е) остаток аланина или аргинина в положении 150, (f) остаток аланина или валина в положении 151; (g) остаток гистидина, лейцина, фенилаланина или валина в положении 152, (h) остаток аланина, аспарагиновой кислоты или пролина в положении 170, (i) остаток аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, лизина, серина, треонина, триптофана или тирозина в положении 171, (j) остаток лейцина в положении 172, или (k) остаток аргинина или глутаминовой кислоты в положении 173 или их комбинации. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотный остаток в положении 171 представлен пролином, а в другом варианте осуществления изобретения полипептид может включать аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, но в которой как минимум одна аминокислотная замена из (n)-(k) далее не модифицируется.
Настоящее раскрытие изобретения дополнительно представляет выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, имеющую как минимум одну аминокислотную замену, которое представляет собой: (а) остаток аргинина, глутаминовой кислоты или лизина в положении 26, (b) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина или треонина в положении 45, (с) остаток треонина в положении 52, (d) остаток глутаминовой кислоты, глицина или серина в положении 58, (е) остаток аланина, аргинина, глутаминовой кислоты или лизина в положении 60, (f) остаток аланина, аргинина или гистидина в положении 78, (g) остаток аланина в положении 88, (h) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина или треонина в положении 98, (i) остаток аргинина, аспарагиновой кислоты, цистеина или глутаминовой кислоты в положении 99, (j) остаток лизина или треонина в положении 111, (k) остаток аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина, гистидина или лизина в положении 129 или (l) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, гистидина, лизина или тирозина в положении 134, а также их комбинации. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотный остаток в положении 98 представлен аргинином, а в другом варианте осуществления изобретения полипептид может включать аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, но в которой как минимум одна аминокислотная замена из (а)-ф далее не модифицируется.
В различных вариантах осуществления изобретения полипептиды, раскрытые в данном документе, могут дополнительно включать как минимум одну аминокислотную замену, которая представляет собой: (а) фенилаланин, пролин, аланин, серин или глицин в положении 179, (b) глутаминовую кислоту, глицин, пролин или серин в положении 180 или (с) лизин, глицин, треонин, аланин, лейцин или пролин в положении 181, а также могут дополнительно включать от 1 до 10 аминокислотных остатков слитых с Сконцом полипептида, которые могут быть представлены любой аминокислотой, например одним или более остатков, выбранных из группы, состоящей из глицина, пролина и их комбинаций.
В различных вариантах осуществления изобретения полипептиды, раскрытые в данном документе, могут включать: (а) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, (b) карбоксиконцевое усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, или (с) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего.
В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептиды, раскрытые в данном документе, могут быть ковалентно связаны с одним или более полимеров, таких как PEG. В других вариантах осуществления изобретения полипептиды по настоящему изобретению могут быть слиты с гетерологичной аминокислотной последовательностью, в необязательном порядке, через линкер, такой как GGGGGS GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23). Гетерологичная аминокислотная последовательность может представлять собой константный домен IgG или его фрагмент, такой как аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 13. Такие гибридные полипептиды, раскрытые в данном документе, также могут образовывать мультимеры.
Настоящее раскрытие изобретения также представляет фармацевтическую композицию, содержащую полипептиды, раскрытые в данном документе, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Такие фармацевтические композиции можно применять в способе лечения метаболического заболевания, а указанный способ включает введение пациенту человеку, нуждающемуся в лечении, фар- 2 034847 мацевтической композиции, соответствующей настоящему изобретению. Метаболические заболевания, которые можно лечить в соответствии с изобретением, включают сахарный диабет и ожирение.
Также предлагаются выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды, раскрытые в данном документе, а также предлагаются векторы, включающие такие молекулы нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева, включающие такие молекулы нуклеиновых кислот.
Также раскрыты усеченные формы полипептида SEQ ID NO: 4. В различных вариантах осуществления изобретения полипептид может включать: (а) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, (b) карбоксиконцевое усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, или (с) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего.
Настоящее раскрытие изобретения дополнительно предлагает выделенный гибридный белок, который может включать: (а) константный домен IgG, (b) линкер ную последовательность, слитую с константным доменом IgG, и (с) мутант FGF21, слитый с линкерной последовательностью и включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, в которой остаток аргинина был замещен остатком лейцина в положении 98, а остаток глицина был замещен остатком пролина в положении 171. В одном из вариантов осуществления изобретения линкерная последовательность может включать GGGGGSGGGS GGGGS (SEQ ID NO: 23), а в другом варианте осуществления изобретения константный домен IgG может включать SEQ ID NO: 13. Еще в одном варианте осуществления изобретения линкерная последовательность включает GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23), а константный домен IgG включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13. Еще в одном варианте осуществления изобретения Nконец линкера слит с С-концом константного домена IgG, a N-конец мутанта FGF21 слит с С-концом линкера. Раскрытый гибридный белок может образовывать мультимеры.
В различных вариантах осуществления гибридного белка мутантный компонент FGF21 может включать как минимум одну аминокислотную замену, которая представляет собой: (а) фенилаланин, пролин, аланин, серин или глицин в положении 179, (b) глутаминовую кислоту, глицин, пролин или серин в положении 180 или (с) лизин, глицин, треонин, аланин, лейцин или пролин в положении 181, а также может дополнительно включать от 1 до 10 аминокислотных остатков, слитых с С-концом мутанта FGF21, и от 1 до 10 аминокислотных остатков, которые могут быть представлены любой аминокислотой, например одним или более остатков, выбранных из группы, состоящей из глицина, пролина и их комбинаций.
В других вариантах осуществления изобретения гибридного белка мутантный компонент FGF21 может включать: (а) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, (b) карбоксиконцевое усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, или (с) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего. Еще в одном варианте осуществления мутантный компонент FGF21 гибридного белка может включать аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, но в которой остатки аргинина и лизина далее не модифицируются.
Настоящее раскрытие изобретения также представляет фармацевтическую композицию, включающую гибридный белок, раскрытый в данном документе, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Такие фармацевтические композиции можно применять в способе лечения метаболического заболевания, а указанный способ включает введение пациенту человеку, нуждающемуся в лечении, фармацевтической композиции, соответствующей настоящему изобретению. Метаболические заболевания, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, включают сахарный диабет и ожирение.
Также предлагаются выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие гибридный белок, раскрытый в данном документе, а также предлагаются векторы, включающие такие молекулы нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева, включающие такие молекулы нуклеиновых кислот.
Специфические варианты осуществления изобретения будут очевидны из последующего более подробного описания некоторых вариантов осуществления изобретения и из формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1А-1В показаны результаты анализа активности ELK-люциферазы, проведенного на усеченных мутантах FGF21 7-181 и 8-181 (фиг. 1А) и усеченных мутантах FGF21 1-172, 1-171, 1-169 и 1-164 (фиг. 1В); каждая панель показывает результаты, полученные на контрольных образцах FGF21 человека;
на фиг. 2 - результаты анализа активности ELK-люциферазы, проведенного на контрольных образцах FGF21 человека и на усеченных мутантах FGF21 3-181, 4-181, 5-181, 7-181, 8- 181, 1-180, 1-178, 1177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181 и 1-149;
на фиг. 3 - значения уровня глюкозы в крови, измеряемого у мышей, которым путем инъекции вводили PBS (закрашенный столбец), контрольный FGF21 человека (пустой столбец) или усеченные мутан- 3 034847 ты FGF21 8-181 (серый столбец) и 9-181 (столбец с шахматными клетками);
на фиг. 4 - процентное изменение уровня глюкозы в крови, измеряемого у мышей, которым путем инъекции вводили PBS (закрашенные кружки), контрольный Fc-FGF21 дикого типа (WT) (пустые кружки) или усеченные гибридные белки Fc-FGF21, включающие аминокислотные остатки 5-181 (закрашенные треугольники) или 7-181 (пустые треугольники);
на фиг. 5 - процентное изменение уровня глюкозы в крови, измеряемого у мышей, которым путем инъекции вводили PBS (закрашенные кружки), контрольный FGF21-Fc (WT) (пустые кружки), усеченный гибридный белок FGF21-Fc, включающий аминокислотные остатки 1-175 (закрашенные треугольники) или усеченный белок Fc-FGF21, включающий остатки 1-171 (пустые треугольники);
на фиг. 6Ά-6Ό - результаты анализа контрольного образца Fc(5)FGF21 человека (фиг. 6А) и образцов Fc(5)FGF21, полученных от мышей через 6 ч (образец D6, фиг. 6В), 24 ч (образец D24, фиг. 6С) и 48 ч (образец D48, фиг. 6D) после инъекции с применением комбинированного способа жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (LC-MS);
на фиг. 7A-7D - результаты анализа контрольного образца FGF21(3)Face человека (фиг. 7А) и образцов FGF21(3)Face, полученных от мышей через 6 ч (образец D6, фиг. 7В), 24 ч (образец D24, фиг. 7С) и 48 ч (образец D48, фиг. 7D) после инъекции, способом LC-MS;
на фиг. 8A-8D - результаты анализа контрольного образца Face(15)FGF21 (фиг. 8А) и образцов Face(15)FGF21, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 8В), 24 ч (фиг. 8С) и 48 ч (фиг. 8D) после инъекции, способом LC-MS;
на фиг. 9A-9D - результаты анализа контрольного образца FGF21(15)Face (фиг. 9А) и образцов FGF21(15)Face, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 9В), 24 ч (фиг. 9С) и 48 ч (фиг. 9D) после инъекции, способом LC-MS;
на фиг. 10А-10В - сайты расщепления, идентифицированные анализом LC-MS гибридных белков Face(15)FGF21 (фиг. 10А, SEQ ID N0:24) и FGF21(15)Face (фиг. 10В, SEQ ID N0:25), введенных мышам путем инъекции;
на фиг. 11 - результаты измерений уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили PBS (закрашенный столбец), Face(15)FGF21 (пустой столбец) или такие мутанты Face(15)FGF21 как Face(15)FGF21 G 170E (серый столбец), Face(15)FGF21 P171A (столбец с шахматными клетками), Face(15)FGF21 S172L (пустой столбец с диагональными полосками), Face(15)FGF21 G170E/P171A/S172L (закрашенный столбец с горизонтальными полосками) или Face(15)FGF21 G151A (пустой столбец с диагональными полосками);
на фиг. 12 - процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам измерений у мышей, которым путем инъекции вводили PBS (закрашенные кружки), Face(15)FGF21 (пустые кружки) или такие мутанты Face(15)FGF21 как Face(15)FGF21 G170E (закрашенные треугольники), Face(15)FGF21 P171A (пустые треугольники), Face(15)FGF21 S172L (закрашенные ромбы), Face(15)FGF21 G170E/P171A/S172L (пустые ромбы) или Face(15)FGF21 G151A (закрашенные квадраты);
на фиг. 13 - результаты измерений уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили PBS (закрашенный столбец), Fc(15)FGF21 (пустой столбец) или такие мутанты Fc(15)FGF21 как Fc(15)FGF21 P150A/G151A/I152V (серый столбец), Fc(15)FGF21 G170E (пустой столбец с диагональными полосками), Fc(15)FGF21 G170E/P171A (серый столбец с диагональными полосками) или Fc(15)FGF21 G170E/S172L (пустой столбец с диагональными полосками);
на фиг. 14 - процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам измерений у мышей, которым путем инъекции вводили PBS (закрашенные квадраты), Fc(15)FGF21 (пустые квадраты) или такие мутанты Fc(15)FGF21 как Fc(15)FGF21 P150A/G151A/I152V (закрашенные перевернутые треугольники), Fc(15)FGF21 G170E (пустые перевернутые треугольники), Fc(15)FGF21 G170E/P171A (закрашенные кружки) или Fc(15)FGF21 G170E/S172L (пустые кружки);
на фиг. 15 - результаты измерений уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили PBS (закрашенный столбец) или такие мутанты Fc(15)FGF21 как Fc(15)FGF21 G 170E (пустой столбец), Fc(15)FGF21 G170A (серый столбец), Fc(15)FGF21 G170C (пустой столбец с диагональными полосками), Fc(15)FGF21 G170D (серо-белый столбец), Fc(15)FGF21 G 170N (закрашенный столбец с диагональными полосками) или Fc(15)FGF21 G 170S (пустой столбец с диагональными полосками);
на фиг. 16 - процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам измерений у мышей, которым путем инъекции вводили PBS (закрашенные кружки) или такие мутанты Fc(15)FGF21 как Fc(15)FGF21 G170E (пустые кружки), Fc(15)FGF21 G170A (закрашенные треугольники), Fc(15)FGF21 G170C (пустые треугольники), Fc(15)FGF21 G170D (закрашенные ромбы), Fc(15)FGF21 G170N (пустые ромбы) или Fc(15)FGF21 G170S (перевернутые пустые треугольники);
на фиг. 17 - результаты измерений уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили PBS (закрашенный столбец) или такие мутанты Fc(15)FGF21 как Fc(15)FGF21 G 170E (пустой столбец), Fc(15)FGF21 P171E (серый столбец), Fc(15)FGF21 Р171Н (закрашенный столбец с диагональными полосками), Fc(15)FGF21 P171Q (пустой столбец с диагональными полосками), Fc(15)FGF21 P171T (столбец с шахматными клетками) или Fc(15)FGF21 P171Y (серый столбец с диагональными полосками);
- 4 034847 на фиг. 18 - процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам измерений у мышей, которым путем инъекции вводили PBS (закрашенные кружки) или такие мутанты Fc(15)FGF21 как
Fc(15)FGF21 G170E (пустые кружки), Fc(15)FGF21 P171E (закрашенные треугольники), Fc(15)FGF21
P171H (пустые треугольники), Fc(15)FGF21 P171Q (закрашенные ромбы), Fc(15)FGF21 P171T (пустые ромбы) или Fc(15)FGF21 P171Y (закрашенные квадраты);
на фиг. 19Ά-19Ό - результаты анализа контрольного образца FGF21(15)Fc (фиг. 19А) и образцов, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 19В), 24 ч (фиг. 19С) и 48 ч (фиг. 19D) после инъекции, способом LC-MS;
на фиг. 20A-20D - результаты анализа контрольного образца Fc(15)FGF21 G170E (фиг. 20А) и образцов Fc(15)FGF21 G 170E, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 20В), 24 ч (фиг. 20С) и 48 ч (фиг. 20D) после инъекции, способом LC-MS;
на фиг. 21A-21D - результаты анализа контрольного образца Fc(15)FGF21 P171A (фиг. 21А) и образцов Fc(15)FGF21 P171A , полученных от мышей через 6 ч (фиг. 21В), 24 ч (фиг. 21С) и 48 ч (фиг. 21D) после инъекции, способом LC-MS;
на фиг. 22A-22D - результаты анализа контрольного образца Fc(15)FGF21 S172L (фиг. 22А) и образцов Fc(15)FGF21 S172L, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 22В), 24 ч (фиг. 22С) и 48 ч (фиг. 22D) после инъекции, способом LC-MS;
на фиг. 23A-23D - сайты расщепления, идентифицированные анализом LC-MS гибридных белков Fc(15)FGF21 (фиг. 23 A, SEQ ID NO: 24), Fc(15)FGF21 G 170E (фиг. 23В, SEQ ID NO: 26), Fc(15)FGF21 P171A (фиг. 23С, SEQ ID NO: 27) и Fc(15)FGF21 S172L (фиг. 23D, SEQ ID NO: 28), введенных мышам путем инъекции;
на фиг. 24А-24С - результаты анализа активности ELK-люциферазы, проведенного на таких мутантах FGF21 как FGF21 L99R, FGF21 L99D и FGF21 A111T (фиг. 24А), на таких мутантах FGF21 как FGF21 A129D, FGF21 A129Q и FGF21 A134K (фиг. 24В) и на таких мутантах FGF21 как FGF21 A134Y, FGF21 А134Е и FGF21 A129K (фиг. 24С), при этом каждая панель показывает результаты, полученные на контрольных образцах FGF21 человека;
на фиг. 25A-25D - результаты анализа активности ELK-люциферазы, проведенного на таких мутантах Fc-FGF21 как Fc-FGF21 P171G, Fc-FGF21 P171S и Fc-FGF21 Р171Т (фиг. 25А), на таких мутантах FcFGF21 как Fc-FGF21 P171Y, Fc-FGF21 P171W и Fc-FGF21 Р171С (фиг. 25В), на таких мутантах Fc(15)FGF21 как Fc(15)FGF21 A45K/G170E и FGF21 A45K (фиг. 25С) и на таких мутантах Fc(15)FGF21 как Fc(15)FGF21 Р171Е и Fc(15)FGF21 A45K/G170E (фиг. 25D), при этом каждая панель показывает результаты, полученные на контрольных образцах FGF21 человека;
на фиг. 26А-26В показана агрегация, как функцию времени, для зрелого FGF21 дикого типа и для разных мутантов FGF21, фиг. 26А показывает процентное изменение агрегации для контрольного FGF21 (WT, закрашенные ромбы) и FGF21 A45K (закрашенные кружки) после инкубации 65 мг/мл белка при 4°С в течение 1, 2 и 4 дней, тогда как фиг. 26В показывает процентное изменение агрегации для контрольного FGF21 (WT) и вариантов FGF21 Р78С, P78R, L86T, L86R, L98C, L98R, A111T, A129D, A129Q, А1291<. А1341<. A134Y и А134Е (все маркированы на графике) после инкубации 65 мг/мл белка при 4°С в течение 1, 6 и 10 дней;
на фиг. 27 - результаты анализа активности ELK-люциферазы, проведенного на контрольном FGF21 человека и на таких мутантах FGF21 как FGF21 A45K, FGF21 L52T и FGF21 L58E;
на фиг. 28 А представлен график, показывающий изменение уровня агрегации для таких мутантов Fc(15)FGF21 как Fc(15)FGF21 6-181/G170E (закрашенные ромбы), Fc(15)FGF21 A45K/G170E (пустые квадраты), Fc(15)FGF21 P171E (закрашенные треугольники), Fc(15)FGF21 P171A (крестики), Fc(15)FGF21 G 170E (пустые треугольники) и для контрольного FGF21 (закрашенные кружки) после инкубации при 4°С в течение 1, 4 и 8 дней, а фиг. 28В представляет собой гистограмму, также показывающую результаты инкубации;
на фиг. 29 - результаты измерения уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили PBS (носитель) (закрашенные кружки) или такие мутанты Fc(15)FGF21 как Fc(15)FGF21 A45K/G170E (пустые кружки), Fc(15)FGF21 A45K/P171G (закрашенные треугольники) или Fc(15)FGF21 L98R/P171G (пустые треугольники);
на фиг. 30 представлен график, показывающий результаты анализа активности ELK-люциферазы, проведенного на FGF21 человека (закрашенные кружки, сплошная линия), на Fc-FGF21 (пустые кружки, сплошная линия) и на Fc-FGF21 L98R/P171G (закрашенные треугольники, пунктирная линия);
на фиг. 31 - график, показывающий процентную величину агрегатов с высоким молекулярным весом, наблюдаемых после девяти дней выдерживания при комнатной температуре (фиг. 31А) и 4°С (фиг. 31В) для FGF21 (закрашенные кружки, сплошная линия), Fc-FGF21 (пустые кружки, сплошная линия) и Fc-FGF21 L98R/P171G (закрашенные треугольники, пунктирная линия);
на фиг. 32 - серия трасс MALDI при масс-спектрометрии, показывающую наблюдаемые изменения Fc-F GF21 L98R/P171G в различных точках на протяжении 168-часового промежутка времени;
на фиг. 33 - график, показывающий процентное изменение уровня глюкозы в крови у мышей ob/ob
- 5 034847 для контрольного носителя PBS (пустые кружки), зрелого FGF21 дикого типа (закрашенные квадраты) и таких мутантов FGF21 как L98R, P171G (перевернутые закрашенные треугольники), L98R, P171G, 182Р (пустые ромбы) и L98R, P171G, 182G (закрашенные кружки);
на фиг. 34 - график, показывающий процентное изменение уровня глюкозы в крови у мышей ob/ob для контрольного носителя PBS (закрашенные кружки) и таких мутантов FGF21 как L98R, P171G (закрашенные треугольники), L98R, P171G, 182G, 183G (пустые треугольники), L98R, P171G, 182G (закрашенные ромбы) и L98R, P171G, 182Р (пустые ромбы);
на фиг. 35 - график, показывающий процентное изменение уровня глюкозы в крови у мышей ob/ob для контрольного носителя PBS (пустые кружки) и таких мутантов FGF21 как L98R, P171G (закрашенные квадраты), L98R, P171G, Y179S (пустые треугольники), L98R, P171G, Y179A (перевернутые закрашенные треугольники), L98R, P171G, 180S (пустые ромбы) и L98R, P171G, A180G (закрашенные кружки);
на фиг. 36 - график, показывающий процентное изменение уровня глюкозы в крови у мышей ob/ob для контрольного носителя PBS (закрашенные кружки) и таких мутантов FGF21 как L98R, P171G (пустые квадраты), L98R, P171G, Y179F (закрашенные треугольники) и L98R, P171G, А180Е (пустые ромбы);
на фиг. 37 - диаграмма, отображающую схему шестинедельного исследования с повышением дозы, проведенного на обезьянах резус. На указанной диаграмме полутоновые символы обозначают взятия крови натощак, а фактурные символы обозначают взятия крови после кормления;
на фиг. 38А-38П - серия графиков, отображающих рандомизацию обезьян резус по профилям OGTT, AUC (площади под кривой) OGTT и весу тела. фиг. 38А отображает базовый уровень глюкозы в OGTT1, при этом закрашенные квадраты соответствуют группе А, закрашенные кружки на сплошной линии соответствуют группе В, а пустые кружки на пунктирной линии соответствуют группе С перед распределением испытуемых соединений и носителя по группам. на фиг. 38В отображен базовый уровень глюкозы в OGTT2, при этом закрашенные квадраты соответствуют группе А, закрашенные кружки на сплошной линии соответствуют группе В, а пустые кружки на пунктирной линии соответствуют группе С распределением испытуемых соединений и носителя по группам. на фиг. 38С показан базовый уровень глюкозы в OGTT 1 и OGTT 2 в терминах AUC, при этом фактурный столбец соответствует группе А, полутоновой столбец соответствует группе В, а пустой столбец соответствует группе С. фиг. 38D показывает базовый вес тела, при этом фактурный столбец соответствует группе А, полутоновой столбец соответствует группе В, а пустой столбец соответствует группе С;
на фиг. 39 - график, показывающий влияние носителя, FGF21 и Fc-FGF21(RG) на вес тела у обезьян резус, при этом полутоновые столбцы 1 и 2 соответствуют 1- и 2-й неделям на низкой дозе, пустые столбцы 3 и 4 соответствуют 3- и 4-й неделям на средней дозе, закрашенные столбцы 5 и 6 соответствуют 5- и 6-й неделям на высокой дозе, а фактурные столбцы 7, 8 и 9 соответствуют периоду отмывания (с
7- по 9-ю неделю);
на фиг. 40 - график, показывающий процентное изменение уровня инсулина натощак по отношению к базовому уровню у обезьян резус для носителя, FGF21 и Fc-FGF21 (RG), при этом полутоновые столбцы 1 и 2 соответствуют 1- и 2-й неделям на низкой дозе, пустые столбцы 3 и 4 соответствуют 3- и 4-й неделям на средней дозе, закрашенные столбцы 5 и 6 соответствуют 5- и 6-й неделям на высокой дозе, а фактурные столбцы 7 и 8 соответствуют 7- и 8-й неделе в период отмывания;
на фиг. 41 - график, показывающий влияние носителя, FGF21 и Fc-FGF21(RG) при введении высокой дозы на уровень инсулина у обезьян резус после кормления на 5-й и 6-й неделе исследования, при этом закрашенные столбцы соответствуют 5-й неделе, а полутоновые столбцы соответствуют 6-й неделе;
на фиг. 42 - график, показывающий профили глюкозы в ходе теста OGTT5 (пероральный тест на толерантность к глюкозе), проведенного в конце двухнедельного лечения высокими дозами FcFGF21(RG), при этом закрашенные кружки на сплошной линии соответствуют носителю, пустые квадраты на пунктирной линии соответствуют FGF21, а закрашенные треугольники на сплошной линии соответствуют Fc-FGF21(RG);
на фиг. 43 - график, показывающий профили инсулина в ходе теста OGTT5, проведенного в конце двухнедельного лечения высокими дозами Fc-FGF21(RG), при этом закрашенные кружки на сплошной линии соответствуют носителю, пустые квадраты на пунктирной линии соответствуют FGF21, а закрашенные треугольники на сплошной линии соответствуют Fc-FGF21(RG);
на фиг. 44 - график, показывающий AUC 1-3 глюкозы в ходе теста OGTT, проведенном в конце каждого периода введения доз (низкой, средней и высокой дозы) обезьянам резус, при этом пустые столбцы соответствуют AUC3, рассчитанной по результатам измерений глюкозы в OGTT3, закрашенные столбцы соответствуют AUC4, рассчитанной по результатам измерений глюкозы в OGTT4, а полутоновые столбцы соответствуют AUC5, рассчитанной по результатам измерений глюкозы в OGTT5;
на фиг. 45 - график, показывающий влияние носителя, FGF21 и Fc-FGF21(RG) на процентное изменение уровня триглицеридов в плазме по сравнению с базовым уровнем в каждой группе обезьян резус, при этом полутоновые столбцы 1 и 2 соответствуют 1- и 2-й неделям на низкой дозе, пустые столбцы 3 и 4 соответствуют 3- и 4-й неделям на средней дозе, закрашенные столбцы 5 и 6 соответствуют 5- и 6-й неделям на высокой дозе, а фактурные столбцы 7, 8 и 9 соответствуют периоду отмывания (с 7- по 9-ю неделю);
- 6 034847 на фиг. 46 - график, показывающий уровень триглицеридов в плазме после кормления в каждой группе обезьян резус по результатам измерений на пятой и шестой неделях лечения носителем, FGF21 или Fc-FGF21(RG) в высокой дозе, при этом полутоновые столбцы соответствуют 5-й неделе, а закрашенные столбцы соответствуют 6-й неделе;
фиг. 47 представляет собой график, показывающий индивидуальный уровень FGF21 у обезьяны по результатам измерений перед началом введения доз, а также в 5-, 12-, 19- и 26-й день при взятии образцов приблизительно через 21 ч после каждой инъекции;
на фиг. 48 представлен график, показывающий индивидуальный уровень Fc-FGF21 (RG) у обезьяны по результатам измерений перед началом введения доз, а также в 5-, 12-, 19- и 26-й день при взятии образцов приблизительно через 5 дней после каждой инъекции;
на фиг. 49 - график, показывающий средние концентрации FGF21 и Fc-FGF21(RG) по результатам измерений в ходе трех тестов OGTT, проведенных после введения каждой дозы (низкой, средней и высокой), при этом полутоновые столбцы соответствуют OGTT3 с низкой дозой, закрашенные столбцы соответствуют OGTT4 со средней дозой, а пустые столбцы соответствуют OGTT5 с высокой дозой.
Подробное описание изобретения
Белок человека FGF21, обладающий улучшенными свойствами, в частности удлиненным периодом полувыведения и/или уменьшенной агрегацией, может быть изготовлен способами, раскрытыми в настоящем описании и стандартными способами молекулярной биологии. Необязательно можно дополнительно увеличить период полувыведения, гибридизируя антитело или его часть с N-концевым или Сконцевым участком последовательности FGF21 дикого типа. Также можно дополнительно увеличить период полувыведения или уменьшить агрегацию белка FGF21 дикого типа, вводя в этот белок аминокислотные замещения. Такие модифицированные белки упоминаются в данном документе как мутанты или мутанты FGF21 и формируют варианты осуществления настоящего изобретения.
Способы рекомбинантных нуклеиновых кислот, упоминаемые в данном описании, включая примеры, в целом представляют собой способы, сформулированные в опубликованных источниках Sambrook et. al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) или Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et. al., eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994), причем оба указанных источника включены в настоящее описание в качестве ссылки с любой целью.
1) Общие термины и определения.
Термин выделенная молекула нуклеиновой кислоты относится к молекуле нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, которая (1) была отделена как минимум приблизительно от 50% белков, липидов, углеводов или других материалов, вместе с которыми она встречается в природе, когда тотальную нуклеиновую кислоту выделяют из клеток-источников, (2) не сцеплена со всем полинуклеотидом или частью полинуклеотида, с которыми выделенная молекула нуклеиновой кислоты сцеплена в природе, (3) функционально связана с полинуклеотидом, с которым она не связана в природе, или (4) не встречается в природе как часть большей полинуклеотидной последовательности. Предпочтительно, чтобы выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению была, по существу, свободна от любых других загрязняющих молекул нуклеиновой кислоты или от других загрязнений, которые обнаруживаются в природном окружении, и которые могли бы помешать ее применению в выработке полипептида или ее терапевтическому, диагностическому, профилактическому применению или применению в научно-исследовательских целях.
Термин вектор употребляется для обозначения любой молекулы (например, нуклеиновой кислоты, плазмиды или вируса), используемой для переноса кодирующей информации в клетку-хозяина.
Термин вектор экспрессии относится к вектору, который пригоден для трансформации клеткихозяина и содержит последовательности нуклеиновой кислоты, которые направляют и/или контролируют экспрессию вставленных гетерологичных последовательностей нуклеиновой кислоты. Экспрессия включает, но не ограничиваясь ими, такие процессы как транскрипция, трансляция и сплайсинг РНК, если присутствуют интроны.
Термин функционально связанный(ая, ое) употребляется в данном документе для обозначения компоновки фланкирующих последовательностей, при этом фланкирующие последовательности, описанные таким образом, сконфигурированы или собраны так, что выполняют свою обычную функцию. Итак, фланкирующая последовательность, функционально связанная с кодирующей последовательностью, может быть способной вызывать репликацию, транскрипцию и/или трансляцию кодирующей последовательности. Например, кодирующая последовательность функционально связана с промотором, если промотор способен управлять транскрипцией этой кодирующей последовательности. Фланкирующая последовательность не обязательно должна примыкать к кодирующей последовательности до тех пор, пока она правильно функционирует. Так, например, между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью могут быть вставлены промежуточные не транслируемые, но еще транскрибируемые последовательности, при этом промоторная последовательность, по-прежнему, может считаться функционально связанной с кодирующей последовательностью.
Термин клетка-хозяин употребляется для обозначения клетки, которая была трансформирована или способна к трансформации последовательностью нуклеиновой кислоты, после чего она экспрессиру- 7 034847 ет представляющий интерес ген. Этот термин включает потомство родительской клетки независимо от того, идентично ли оно или не идентично первоначальному родителю по морфологии или генетической структуре до тех пор, пока клетка экспрессирует избранный ген.
Термин выделенный полипептид относится к полипептиду по настоящему изобретению, который (1) был отделен как минимум приблизительно, от 50% полинуклеотидов, липидов, углеводов или других материалов, вместе с которыми он встречается в природе, когда его выделяют из клеток-источников, (2) не связан (посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия) со всем полипептидом или частью полипептида, с которыми выделенный полипептид связан в природе, (3) функционально связан (посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия) с полипептидом, с которым он не связан в природе, или (4) не встречается в природе. Предпочтительно, чтобы выделенный полипептид был, по существу, свободен от любых других загрязняющих полипептидов или от других загрязнений, которые обнаруживаются в природном окружении, и которые могли бы помешать его применению в терапевтических, диагностических, профилактических или научно-исследовательских целях.
Термин встречающийся в природе применительно к таким биологическим материалам, как молекулы нуклеиновых кислот, полипептиды, клетки-хозяева и т.п., относится к материалам, которые встречаются в природе и не подвергаются манипуляциям со стороны человека. Сходным образом, термин не встречающийся в природе при использовании в данном документе относится к материалу, который не встречается в природе либо был структурно модифицирован или синтезирован человеком. При использовании по отношению к нуклеотидам термин встречающийся в природе относится к таким основаниям как аденин (А), цитозин (С), гуанин (G), тимин (Т) и урацил (U). При использовании по отношению к аминокислотам термин встречающаяся в природе относится к следующим 20 аминокислотам: аланин (А), цистеин (С), аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е), фенилаланин (F), глицин (G), гистидин (Н), изолейцин (I), лизин (K), лейцин (L), метионин (М), аспарагин (N), пролин (Р), глутамин (Q), аргинин (R), серин (S), треонин (Т), валин (V), триптофан (W) и тирозин (Y).
Термин полипептид FGF21 относится к встречающемуся в природе полипептиду дикого типа, экспрессируемому у человека. В целях этого раскрытия изобретения термин полипептид FGF21 может использоваться взаимозаменяемо любого полноразмерного полипептида FGF21, например SEQ ID NO: 2, который состоит из 209 аминокислотных остатков, и который кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1; любая зрелая форма полипептида, SEQ ID NO: 4, которая состоит из 181 аминокислотного остатка и которая кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3 и в которой 28 аминокислотных остатков на амино-конце полноразмерного полипептида FGF21 (например, составляющих сигнальный пептид) были удалены, а также их варианты.
Термины мутант полипептида FGF21 и мутант FGF21 относятся к варианту полипептида FGF21, в котором природная аминокислотная последовательность FGF21 была модифицирована. Такие модификации включают, но не ограничиваясь ими, одно или более аминокислотных замещений, включая замещения на аналоги аминокислот, не встречающиеся в природе, и усечения. Таким образом, мутанты полипептида FGF21 включают, но, не ограничиваясь ими, сайт-специфические мутанты FGF21, усеченные полипептиды FGF21, мутанты FGF21, устойчивые к протеолизу, мутанты FGF21 с пониженной агрегацией, комбинаторные мутанты FGF21 и гибридные белки FGF21, как описано в данном документе. В целях идентификации специфических усечений и аминокислотных замещений в мутантах FGF21 по настоящему изобретению нумерация усеченных или мутированных аминокислотных остатков соответствует нумерации в зрелом полипептиде FGF21, состоящем из 181 аминокислотного остатка.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения мутант полипептида FGF21 включает аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, но в которой специфические остатки, придающие мутантному полипептиду FGF21 желательные свойства, например, устойчивость к протеолизу, увеличенный период полувыведения, сниженную агрегацию или их комбинации, не были дополнительно модифицированы. Иными словами, за исключением тех остатков в мутантной последовательности FGF21, которые были модифицированы для придания полипептиду устойчивости к протеолизу, сниженной способности к агрегации или других свойств, модифицированными могут быть приблизительно 15% всех других аминокислотных остатков в мутантной последовательности FGF21. Например, в мутанте FGF21 Q173E, могут быть модифицированы до 15 процентов всех других аминокислотных остатков в дополнение к остатку глутаминовой кислоты, который был замещен на глутамин в положении 173. В других вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид FGF21 включает аминокислотную последовательность, которая как минимум приблизительно, на 90% или, приблизительно, на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, но в которой специфические остатки, придающие мутантному полипептиду FGF21 свойства устойчивости к протеолизу или пониженной способности к агрегации, не были дополнительно модифицированы. Такие мутанты полипептида FGF21 обладают как минимум одним видом активности полипептида FGF21 дикого типа.
Настоящее изобретение также охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутант полипептида FGF21, включающий аминокислотную последовательность, которая как минимум приблизительно, на 85% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, но в которой специфи- 8 034847 ческие остатки, придающие мутантному полипептиду FGF21 желательные свойства, например устойчивость к протеолизу, увеличенный период полувыведения, сниженную агрегацию или их комбинации, не были дополнительно модифицированы. Иными словами, за исключением нуклеотидов, кодирующих те остатки в мутантной последовательности FGF21, которые были модифицированы для придания полипептиду устойчивости к протеолизу, сниженной способности к агрегации или других свойств, модифицированными могут быть приблизительно 15% всех других нуклеотидов в мутантной последовательности, кодирующей FGF21. Например, в молекуле, кодирующей мутант FGF21 Q173E, могут быть модифицированы до 15% всех других нуклеотидов в дополнение к нуклеотидам, кодирующим остаток глутаминовой кислоты, который был замещен на глутамин в положении 173. Настоящее изобретение также охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутантный полипептид FGF21, включающий аминокислотную последовательность, которая как минимум приблизительно, на 90% или, приблизительно, на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, но в которой специфические остатки, придающие мутантному полипептиду FGF21 свойства устойчивости к протеолизу или пониженной способности к агрегации, не были дополнительно модифицированы. Такие мутанты FGF21 обладают как минимум одним видом активности полипептида FGF21 дикого типа.
Изобретение также охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, которая как минимум приблизительно, на 85% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3, но в которой нуклеотиды, кодирующие аминокислотные остатки, которые придают кодируемому мутантному полипептиду FGF21 устойчивость к протеолизу, пониженную способность к агрегации или другие желательные свойства, не были дополнительно модифицированы. Говоря другими словами, за исключением тех остатков в мутантной последовательности FGF21, которые были модифицированы для придания полипептиду устойчивости к протеолизу, сниженной способности к агрегации или других свойств, модифицированными могут быть приблизительно 15% всех других аминокислотных остатков в мутантной последовательности FGF21. Например, в мутанте FGF21 Q173E, могут быть модифицированы до 15% всех других аминокислотных остатков в дополнение к остатку глутаминовой кислоты, который был замещен на глутамин в положении 173. Далее, настоящее изобретение охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, которая как минимум приблизительно, на 90% или, приблизительно, на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, но в которой нуклеотиды, кодирующие аминокислотные остатки, которые придают кодируемому мутантному полипептиду FGF21 свойства устойчивости к протеолизу или пониженной способности к агрегации, не были дополнительно модифицированы. Такие молекулы нуклеиновых кислот кодируют мутанты FGF21, обладающие как минимум одним видом активности полипептида FGF21 дикого типа.
Термин биологически активный мутант полипептида FGF21 относится к любому мутантному полипептиду FGF21, описанному в данном документе, который обладает активностью полипептида FGF21 дикого типа, в частности, способностью понижать уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина в крови, уменьшать вес тела и улучшать толерантность к глюкозе, потребление энергии или чувствительность к инсулину независимо от числа модификаций, введенных в мутант полипептида FGF21. Мутантные полипептиды FGF21, обладающие в некоторой степени пониженным уровнем активности FGF21 по сравнению с полипептидом FGF21 дикого типа, могут, тем не менее, считаться биологически активными мутантами полипептида FGF21.
Каждый из терминов эффективное количество и терапевтически эффективное количество относится к мутантному полипептиду FGF21, применяемому для поддержания наблюдаемого уровня одного или более видов биологической активности полипептида FGF21 дикого типа, в частности способности понижать уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина в крови, снижать вес тела или улучшать толерантность к глюкозе, потребление энергии или чувствительность к инсулину.
Термин фармацевтически приемлемый носитель или физиологически приемлемый носитель при использовании в данном документе относится к одному или более рецептурных материалов, пригодных для осуществления или улучшения доставки мутантного полипептида FGF21.
Термин антиген относится к молекуле или части молекулы, которые способны связываться с антителом и, кроме того, их можно использовать на животных для выработки антител, которые способны связывать эпитоп антигена. Антиген может иметь один или более эпитопов.
Термин нативный Fc относится к молекуле или последовательности, включающей последовательность неантигенсвязывающего фрагмента и полученной в результате расщепления целого антитела или выработанной другими средствами, как в мономерной, так и в мультимерной форме, которая может содержать шарнирный участок. Предпочтительный первоначальный иммуноглобулиновый источник нативного Fc имеет человеческое происхождение и представляет собой любой из иммуноглобулинов, хотя более предпочтительны IgG1 и IgG2. Нативные молекулы Fc состоят из мономерных полипептидов, которые могут быть соединены в димерные или мультимерные формы посредством ковалентной (т.е. по типу дисульфидных связи) и нековалентной ассоциации. Число межмолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных молекул Fc варьируется от 1 до 4 в зависимости от класса (например, IgG, IgA и IgE) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 и IgGA2). Один из приме- 9 034847 ров нативного Fc представляет собой дисульфидно связанный димер, полученный в результате папаинового расщепления IgG (см. Ellison et. al., 1982, Nucleic. Acids. Res. 10: 4071-9). Термин нативный Fc при использовании в данном документе обобщает мономерные, димерные и мультимерные формы. Пример полипептидной последовательности Fc представлен в SEQ ID NO: 13.
Термин вариант Fc относится к молекуле или последовательности, которые модифицированы из нативного Fc, но еще включают сайт связывания для рецептора утилизации, FcRn (рецептор Fc новорожденных). Международные патентные публикации № WO 97/34631 и WO 96/32478 описывают типичные варианты Fc, а также их взаимодействие с рецептором утилизации, в связи с чем указанные публикации включены в этот документ в качестве ссылки. Таким образом, термин вариант Fc может включать молекулу или последовательность, которые гуманизированы из нативного Fc нечеловеческого происхождения. Кроме того, нативный Fc включает участки, которые можно удалить, поскольку они обеспечивают структурные признаки биологической активности, не являющиеся необходимыми для гибридных молекул мутантов FGF21, соответствующих настоящему изобретению. Таким образом, термин вариант Fc включает молекулу или последовательность, в которых один или более сайтов или остатков нативного Fc утрачены или модифицированы, что влияет на: (1) образование дисульфидных связей, (2) несовместимость с выбранной клеткой-хозяином, (3) N-концевую гетерогенность при экспрессии в выбранной клетке-хозяине, (4) гликозилирование, (5) взаимодействие с комплементом, (6) связывание с другим рецептором Fc, нежели рецептор утилизации, или (7) антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). Варианты Fc более подробно описаны в данном документе ниже.
Термин домен Fc охватывает нативный Fc, варианты Fc и их последовательности в соответствии с данными выше определениями. Как в отношении вариантов Fc, так и в отношении нативных молекул Fc термин домен Fc включает молекулы в мономерной или мультимерной форме, полученные в результате расщепления целого антитела или выработанные другими средствами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc может быть соединен с FGF21 или мутантом FGF21 (включая усеченную форму FGF21 или мутанта FGF21) посредством, например, ковалентной связи между доменом Fc и последовательностью FGF21. Такие составные белки могут образовывать мультимеры через ассоциацию доменов Fc, при этом как составные белки, так и их мультимеры являются аспектом настоящего изобретения.
2) Сайт-специфические мутанты FGF21.
Термин сайт-специфический мутант FGF21 или замещенный мутант FGF21 относится к мутантному полипептиду FGF21, имеющему аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности природного полипептида FGF21, например SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 и их вариантов. Сайт-специфические мутанты FGF21 можно создавать, вводя аминокислотные замещения, консервативные или не консервативные и используя как встречающиеся, так и не встречающиеся в природе аминокислоты в специфических положениях полипептида FGF21.
Консервативная аминокислотная замена может включать замену нативного аминокислотного остатка (т.о. остатка, обнаруживаемого в данном положении полипептидной последовательности FGF21 дикого типа) на ненативный остаток (т.н. остаток, который не обнаруживается в данном положении полипептидной последовательности FGF21 дикого типа), при этом не происходит никаких влияний, или происходят очень незначительные влияния на полярность или заряд аминокислотного остатка в данном положении. Консервативные аминокислотные замещения также охватывают не встречающиеся в природе аминокислотные остатки, которые обычно встраиваются посредством химического пептидного синтеза, а не синтеза в биологических системах. Они включают пептидомиметики и другие реверсированные или инвертированные формы аминокислотных компонентов.
Встречающиеся в природе аминокислотные остатки можно подразделить на классы, основываясь на общих свойствах боковой цепи:
(1) гидрофобные: норлейцин (norleucine), Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr;
(3) кислотные: Asp, Glu;
(4) основные: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; и (6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Консервативные замещения могут включать замену члена одного из этих классов другим членом того же класса. Неконсервативные замещения могут включать замену члена одного из этих классов другим членом другого класса.
Желательные аминокислотные замещения (как консервативные, так и неконсервативные) могут определить компетентные специалисты в данной области в то время, когда такие замены понадобятся. Типичный (но не ограничивающий) список аминокислотных замещений представлен в табл. 1.
- 10 034847
3) Усеченные полипептиды FGF21.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к усеченным формам зрелого полипептида FGF21. Этот вариант осуществления настоящего изобретения возник в связи с попыткой выявить усеченные полипептиды FGF21, которые способны обеспечивать активность, равную активности не усеченных форм зрелого полипептида FGF21, а в некоторых случаях превосходящую ее.
При использовании в настоящем описании термин усеченный полипептид FGF21 относится к полипептиду FGF21, в котором были удалены аминокислотные остатки из аминоконцевого (или Nконцевого участка) полипептида FGF21, были удалены аминокислотные остатки из карбоксиконцевого (или С-концевого) участка полипептида FGF21 или были удалены аминокислотные остатки как из аминоконцевого, так и из карбоксиконцевого участков полипептида FGF21. Различные усечения, раскрытые в настоящем документе, были подготовлены так, как это изложено в примерах 3 и 6.
Активность полипептидов FGF21, усеченных на N-конце, и полипептидов FGF21, усеченных на Сконце, можно оценивать, применяя анализ на ELK-люциферазу in vitro, как это описано в примере 4. Специфические подробности анализов in vitro, которые можно применять для исследования активности усеченных полипептидов FGF21, можно найти в примере 4.
Активность усеченных полипептидов FGF21 по настоящему изобретению также можно оценивать в анализе in vivo, таком как анализ на мышах ob/ob, описанный в примерах 5 и 7. В целом, для оценки активности усеченного полипептида FGF21 in vivo этот усеченный полипептид можно ввести животному, используемому для тестирования, внутрибрюшинно. После нужного периода инкубации (например, одного часа или более), можно взять образец крови и измерить уровень глюкозы. Специфические подробности анализов in vivo, которые можно применять для исследования активности усеченных полипептидов FGF21, можно найти в примерах 5 и 7.
a) N-концевые усечения.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения N-концевые усечения включают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислотных остатков из N-концевого участка зрелого полипептида FGF21. Как продемонстрировано в примере 5 и на фиг. 3, усеченные полипептиды FGF21, имеющие концевые усечения длиной менее 9 аминокислотных остатков, сохраняют способность зрелого полипептида FGF21 понижать уровень глюкозы в крови субъекта.
В соответствии с этим в специфических вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает усеченные формы зрелого полипептида FGF21 или мутантных полипептидов FGF21, имеющих Nконцевые усечения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислотных остатков.
b) С-концевые усечения.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения С-концевые усечения включают 1,
- 11 034847
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислотных остатков из С-концевого участка зрелого полипептида FGF21. Как продемонстрировано в примере 4 и на фиг. 1В, усеченные полипептиды FGF21, имеющие Сконцевые усечения длиной менее 13 аминокислотных остатков, демонстрируют эффективность на уровне как минимум 50% эффективности FGF21 дикого типа в анализе на ELK-люциферазу in vitro, указывающую на то, что эти мутанты FGF21 сохраняют способность зрелого полипептида FGF21 понижать уровень глюкозы в крови субъекта. В соответствии с этим в специфических вариантах осуществления изобретение охватывает усеченные формы зрелого полипептида FGF21 или мутантных полипептидов FGF21, имеющих С-концевые усечения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислотных остатков.
с) N-концевые и С-концевые усечения.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения усеченные полипептиды FGF21 могут иметь сочетанные N-концевые и С-концевые усечения. Усеченные полипептиды FGF21, имеющие сочетание N-концевых и С-концевых усечений, сохраняют активность соответствующих усеченных полипептидов FGF21, имеющих только N-концевые или С-концевые усечения. Говоря иначе, усеченные полипептиды FGF21, имеющие как N-концевые усечения длиной менее 9 аминокислотных остатков, так и С-концевые усечения длиной менее 13 аминокислотных остатков, обладают такой же или даже большей активностью по снижению уровня глюкозы в крови, чем усеченные полипептиды FGF21, имеющие только N-концевые усечения длиной менее 9 аминокислотных остатков или С-концевые усечения длиной менее 13 аминокислотных остатков. В соответствии с этим в специфических вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает усеченные формы зрелого полипептида FGF21 или мутантных полипептидов FGF21, имеющих N-концевые усечения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислотных остатков и С-концевые усечения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислотных остатков.
Как и в отношении всех мутантов FGF21 по настоящему изобретению, усеченные полипептиды FGF21 могут в необязательном порядке включать аминоконцевой остаток метионина, который можно ввести посредством направленной мутации или в результате процесса бактериальной экспрессии.
Усеченные полипептиды FGF21 по настоящему изобретению можно изготовить так, как это описано в примерах 3 и 6. Средний специалист в данной области, знакомый со стандартными методиками молекулярной биологии, сможет употребить свои знания вместе со сведениями, представленными в настоящем раскрытии изобретения, чтобы изготовлять и применять усеченные полипептиды FGF21 по настоящему изобретению. Для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, тканевой культуры и трансформации можно использовать стандартные методики (например, электропорацию, липофекцию). См., например, публикацию Sambrook et. al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, выше, которая включена в этот документ в качестве ссылки с любой целью. Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей, как это общепринято в данной области техники или описано в настоящем документе. Если не представлены специальные определения, номенклатура, используемая в данном документе применительно к лабораторным процедурам и методикам аналитической химии, синтетической органической химии, медицинской и фармацевтической химии, представлена хорошо известной и общепринятой номенклатурой в данной области. Для химического синтеза, химических анализов, изготовления фармацевтических препаратов, рецептурных составов, их доставки и для лечения пациентов можно использовать стандартные методики.
Усеченные полипептиды FGF21 по настоящему изобретению также можно соединять с другим компонентом, который способен придать усеченному полипептиду FGF21 дополнительные свойства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения усеченный полипептид FGF21 может быть соединен с последовательностью Fc. Такое слияние можно осуществить, применяя известные способы молекулярной биологии и/или руководящие указания, представленные в данном документе. Преимущества таких составных полипептидов, а также способы изготовления таких составных полипептидов будут обсуждаться в данном документе более подробно.
4) Мутанты FGF21, устойчивые к протеолизу.
Как указано в примере 8, было обнаружено, что зрелый FGF21 подвергается разрушению in vivo, которое, в конечном итоге, является результатом протеолитической атаки. Было обнаружено, что разрушение зрелого FGF21 in vivo укорачивает эффективный период его полувыведения, а это, в свою очередь, отрицательно влияет на терапевтический потенциал молекулы. В соответствии с этим было проведено целенаправленное исследование по идентификации мутантов FGF21, которые проявляют устойчивость к протеолизу. В результате этого исследования было определено, что сайты в молекуле зрелого полипептида FGF21, которые особенно чувствительны к протеолизу, включают аминокислотные остатки в положениях 4-5, 20-21, 151-152 и 171-172.
Было проведено широкое, но сфокусированное и целенаправленное исследование по идентификации специфических замещений, которые устраняют наблюдаемый протеолитический эффект, хотя при этом не влияют на активность белка в недопустимой степени. Табл. 8 и 11 представляют некоторые из полученных и протестированных мутантов. Как описано в примерах 13 и 14, не все мутанты FGF21 демонстрируют идеальный профиль: одни мутанты, приобретая устойчивость к протеолизу, утрачивали или снижали полезную активность FGF21, а другие мутанты сохраняли активность FGF21, но не приобретали устойчивости к протеолизу. Некоторые мутанты, включая, например, FGF21 P171G, сохраняли
- 12 034847 уровень активности, сходный с FGF21 дикого типа, и в то же время демонстрировали устойчивость к протеолитическому разрушению.
Один из критериев отбора при идентификации желательных мутантов FGF21, устойчивых к протеолизу, заключался в том, чтобы активность мутанта FGF21 была, по существу, такой же или даже большей по сравнению с активностью FGF21 дикого типа. Следовательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения направлен на мутанты FGF21, которые устойчивы к протеолизу, но при этом сохраняют активность, которая, по существу, не отличается от активности FGF21 дикого типа или превышает ее. Хотя в некоторых случаях это менее желательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения связан с мутантами FGF21, которые устойчивы к протеолизу, но проявляют в некоторой степени сниженную активность. В некоторых случаях может оказаться желательным поддерживать протеолиз, вследствие чего мутанты FGF21, которые допускают некоторую степень протеолиза, формируют еще один вариант осуществления настоящего изобретения.
Как и все мутанты FGF21 по настоящему изобретению, мутанты FGF21, устойчивые к протеолизу, можно изготовить так, как описано в данном документе. Специалисты в данной области, например знающие стандартные методики молекулярной биологии, смогут употребить свои знания вместе со сведениями, представленными в настоящем раскрытии изобретения, чтобы изготовлять и применять мутанты FGF21, устойчивые к протеолизу, в соответствии с настоящим изобретением. Для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, тканевой культуры и трансформации можно использовать стандартные методики (например, электропорацию, липофекцию). См., например, публикацию Sambrook et. al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, выше, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки с любой целью. Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей, как это общепринято в данной области техники или описано в настоящем документе. Если не представлены специальные определения, номенклатура, используемая в данном документе применительно к лабораторным процедурам и методикам аналитической химии, синтетической органической химии, медицинской и фармацевтической химии, представлена хорошо известной и общепринятой номенклатурой в данной области. Для химического синтеза, химических анализов, изготовления фармацевтических препаратов, рецептурных составов, их доставки и для лечения пациентов можно использовать стандартные методики.
Мутанты FGF21, устойчивые к протеолизу, можно соединять с другим компонентом, который способен придать мутанту FGF21, устойчивому к протеолизу, дополнительные свойства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения устойчивый к протеолизу мутант FGF21 можно соединить с последовательностью Fc IgG, например SEQ ID NO: 13. Такое слияние можно осуществить, применяя известные способы молекулярной биологии и/или руководящие указания, представленные в данном документе. Преимущества таких составных полипептидов, а также способы изготовления таких составных полипептидов известны и будут обсуждаться в данном документе более подробно.
5. Мутанты FGF21 с пониженной агрегацией.
Как описано в примере 15, одним из свойств полипептида FGF21 дикого типа является его склонность к агрегации. При концентрации свыше приблизительно 5 мг/мл степень агрегации высока при комнатной температуре. Как показано и описано в данном документе, степень агрегации для полипептида FGF21 дикого типа зависит как от концентрации, так и от температуры.
Агрегация может создать проблемы при работе с FGF21 дикого типа в этих концентрациях, например, в контексте составления терапевтической композиции. В соответствии с этим было проведено целенаправленное исследование по идентификации мутантов FGF21, которые проявляют пониженную склонность к агрегации. Затем выявленные мутанты FGF21 были протестированы на склонность к агрегации в различных концентрациях.
Было проведено широкое, но сфокусированное и целенаправленное исследование по идентификации специфических замещений, которые устраняют наблюдаемый эффект агрегации для FGF21 дикого типа, но при этом не влияют на активность белка в недопустимой степени. Подход к идентификации подходящих мутантов с пониженной агрегацией описан в примере 15. В табл. 16 представлены некоторые полученные и протестированные мутанты. Как показано в примере 17, не все мутанты FGF21 проявляют идеальный профиль. Одни мутанты, такие как FGF21 L58E, имели сниженную активность FGF21 и не исследовались далее, а другие мутанты, такие как FGF21 А134Е, сохраняли активность FGF21, но не приобретали свойства пониженной склонности к агрегации. В то же время некоторые мутанты, такие как FGF21 L98R, не только сохраняли активность FGF21, но и демонстрировали пониженную агрегацию. Один мутант, FGF21 А45К, неожиданно проявил повышенную активность FGF21 наряду с пониженной склонностью к агрегации.
Один из критериев отбора при идентификации желательных мутантов FGF21, не склонных к агрегации, заключался в том, чтобы активность мутанта FGF21 была, по существу, сходной или даже большей по сравнению с активностью FGF21 дикого типа. Следовательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения направлен на мутанты FGF21, имеющие пониженную склонность к агрегации, но в то же время сохраняющие активность FGF21, которая сходна с активностью FGF21 дикого типа или превышает ее. Несмотря на то что в некоторых случаях это менее желательно, еще один вариант осуще- 13 034847 ствления настоящего изобретения связан с мутантами FGF21, которые имеют пониженную склонность к агрегации, но проявляют в некоторой степени сниженную активность FGF21. В некоторых случаях может оказаться желательным поддерживать определенный уровень агрегации, вследствие чего мутанты
FGF21, которые допускают некоторую степень агрегации, формируют еще один вариант осуществления настоящего изобретения.
Как и все мутанты FGF21 по настоящему изобретению, мутанты FGF21, обладающие пониженной склонностью к агрегации, можно изготовить так, как описано в данном документе. Средние специалисты в данной области, знакомые со стандартными методиками молекулярной биологии, смогут употребить свои знания вместе со сведениями, представленными в настоящем раскрытии изобретения, чтобы изготовлять и применять мутанты FGF21 с пониженной склонностью к агрегации, соответствующие настоящему изобретению. Для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, тканевой культуры и трансформации можно использовать стандартные методики (например, электропорацию, липофекцию). См., например, Sambrook et. al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, выше, которая включена в этот документ в качестве ссылки с любой целью. Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей, как это общепринято в данной области техники или описано в настоящем документе. Если не представлены специальные определения, номенклатура, используемая в данном документе применительно к лабораторным процедурам и методикам аналитической химии, синтетической органической химии, медицинской и фармацевтической химии, представлена хорошо известной и общепринятой номенклатурой в данной области. Для химического синтеза, химических анализов, изготовления фармацевтических препаратов, рецептурных составов, их доставки и для лечения пациентов можно использовать стандартные методики. Мутанты FGF21, не склонные к агрегации, можно соединять с другим компонентом, который способен придать мутанту FGF21, не склонному к агрегации, дополнительные свойства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения не склонный к агрегации мутант FGF21 можно соединить с последовательностью Fc IgG, например SEQ ID NO: 13. Такое слияние можно осуществить, применяя известные способы молекулярной биологии и/или руководящие указания, представленные в данном документе. Преимущества таких составных полипептидов, а также способы изготовления таких составных полипептидов обсуждаются в данном документе более подробно.
6) Комбинированные мутанты FGF21.
Как описано в данном документе, последовательность FGF21 дикого типа обладает некоторыми свойствами, которые создают значительные проблемы при использовании FGF21 в качестве терапевтической молекулы. Среди этих проблем необходимо упомянуть чувствительность белка к разрушению и его склонность к агрегации в высоких концентрациях. После всесторонних попыток идентифицировать такие полипептиды FGF21, которые преодолевают каждую из этих проблем, было проведено целенаправленное исследование для определения того, можно ли скомбинировать аминокислотные замещения, придающие белку устойчивость к протеолизу, и замещения, понижающие склонность к агрегации, чтобы добиться аддитивного или синергического эффекта таких замещений в одной полипептидной последовательности, поддерживая при этом такой уровень активности, который соответствует активности FGF21 дикого типа или превосходит ее. Эта задача сложна для решения, поскольку в данной области знаний известно, что введение множественных мутаций в определенный полипептид иногда может отрицательно сказаться на экспрессии, активности и последующей выработке белка в производственных масштабах.
Неожиданно, как это продемонстрировано в примерах 19 и 20, было обнаружено, что желательные свойства нескольких мутантов FGF21, действительно, можно комбинировать аддитивным или синергическим образом, чтобы получить такой мутант FGF21, который обладает улучшенными фармацевтическими свойствами. В данном документе раскрыты мутанты FGF21, которые устойчивы к протеолизу, имеют пониженную степень агрегации, но при этом сохраняют такую активность, которая соответствует активности FGF21 дикого типа или превосходит ее.
Один из критериев отбора при идентификации желательных комбинированных мутантов FGF21 заключался в том, чтобы активность мутанта FGF21 была, по существу, сходной или даже большей по сравнению с активностью FGF21 дикого типа. Следовательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения направлен на мутанты FGF21, устойчивые к протеолизу и имеющие пониженную склонность к агрегации, но в то же время сохраняющие активность FGF21, которая сходна с активностью FGF21 дикого типа или превышает ее. Хотя в некоторых случаях это менее желательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения связан с мутантами FGF21, которые устойчивы к протеолизу и имеют пониженную склонность к агрегации, но проявляют в некоторой степени сниженную активность FGF21. В некоторых случаях может оказаться желательным поддерживать определенный уровень протеолиза и/или агрегации, вследствие чего мутанты FGF21, которые допускают некоторую степень протеолиза и/или агрегации, формируют еще один вариант осуществления настоящего изобретения.
Как и все мутанты FGF21 по настоящему изобретению, комбинированные мутанты FGF21, соответствующие этому изобретению, можно изготовить так, как описано в данном документе. Средние специалисты в данной области, знакомые со стандартными методиками молекулярной биологии, смогут употребить свои знания вместе со сведениями, представленными в настоящем раскрытии изобретения, чтобы
- 14 034847 изготовлять и применять комбинированные мутанты FGF21, соответствующие настоящему изобретению. Для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, тканевой культуры и трансформации можно использовать стандартные методики (например, электропорацию, липофекцию). См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, выше, которая включена в этот документ в качестве ссылки с любой целью. Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей, как это общепринято в данной области техники или описано в настоящем документе. Если не представлены специальные определения, номенклатура, используемая в данном документе применительно к лабораторным процедурам и методикам аналитической химии, синтетической органической химии, медицинской и фармацевтической химии, представлена хорошо известной и общепринятой номенклатурой в данной области. Для химического синтеза, химических анализов, изготовления фармацевтических препаратов, рецептурных составов, их доставки и для лечения пациентов можно использовать стандартные методики.
Комбинированные мутанты FGF21, соответствующие настоящему изобретению, можно соединять с другим компонентом, который способен придать комбинированному мутанту FGF21 дополнительные свойства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения комбинированный мутант FGF21 можно соединить с последовательностью Fc IgG, например SEQ ID NO: 13. Такое слияние можно осуществить, применяя известные способы молекулярной биологии и/или руководящие указания, представленные в данном документе. Преимущества таких составных полипептидов, а также способы изготовления таких составных полипептидов обсуждаются в данном документе более подробно.
7) Составные белки FGF21.
При использовании в данном документе термин составной полипептид FGF21 или составной белок FGF21 относится к соединению одного или более аминокислотных остатков (например, с образованием гетерологичного белка или пептида) на N-конце или С-конце любого мутантного полипептида FGF21, описанного в данном документе.
Гетерологичные пептиды и полипептиды включают, но, не ограничиваясь ими, эпитоп, позволяющий выявить и/или выделить мутантный полипептид FGF21, трансмембранный рецепторный белок или его часть, такую как внеклеточный домен или трансмембранный и внутриклеточный домен, лиганд или часть лиганда, которые связываются с трансмембранным рецепторным белком, фермент или часть фермента, которые каталитически активны, пептид или полипептид, которые стимулируют олигомеризацию, например, домен лейциновой застежки, пептид или полипептид, которые повышают стабильность, например, константный участок иммуноглобулина, функциональное или не функциональное антитело либо его тяжелая или легкая цепь, а также полипептид, который обладает активностью, в частности, терапевтической активностью, отличной от мутантных полипептидов FGF21 по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также охватывает мутантов FGF21, соединенных с сывороточным альбумином человека (HSA).
Составные белки FGF21 можно изготовить посредством соединения гетерологичных последовательностей или на N-конце, или на С-конце мутантного полипептида FGF21. Как описано в данном документе, гетерологичная последовательность может представлять собой аминокислотную последовательность или полимер, не содержащий аминокислот. Гетерологичные последовательности можно соединять с мутантным полипептидом FGF21 или напрямую, или через линкер/адаптерную молекулу. Линкер или адаптерная молекула могут представлять собой один или более аминокислотных остатков (или -меров), например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, или 9 остатков (или -меров), предпочтительно, от 10 до 50 аминокислотных остатков (или -меров), например 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 остатков (или -меров) и, более предпочтительно, от 15 до 35 аминокислотных остатков (или -меров). Линкер или адаптерную молекулу также можно сконструировать с сайтом расщепления для рестрикционной ДНК-эндонуклеазы или для протеазы, что позволяет разделять соединенные компоненты.
а) Соединения с Fc.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мутантный полипептид FGF21 соединен с одним или более доменов участка Fc иммуноглобулина IgG человека. Антитела включают две функционально независимые части, вариабельный домен, известный как Fab, который связывает антиген, и константный домен, известный как Fc, который вовлечен в такие эффекторные функции как активация комплемента и атака фагоцитарными клетками. Домен Fc имеет длинный период полувыведения из сыворотки, тогда как домен Fab является короткоживущим (Capon et al., 1989, Nature 337: 525-31). При соединении с терапевтическим белком домен Fc может обеспечить более длительный период полувыведения или встроить такие функции как связывание рецептора Fc, связывание белка А, фиксация комплемента и, возможно, даже перенос через плаценту (Capon et al., 1989).
Фармакокинетический анализ in vivo указывает на то, что FGF21 человека имеет короткий период полувыведения, который составляет у мышей приблизительно 1 ч, что связано с быстрым клиренсом и разрушением in vivo. Следовательно, для удлинения периода полувыведения FGF21 последовательность Fc присоединяли к N- или С-концевому участку полипептида FGF21. Слияние участка Fc с FGF21 дикого типа, в особенности, присоединение Fc к N-концу FGF21 дикого типа, вопреки ожиданиям, не удлиняло период полувыведения, однако это привело к исследованию протеолитического распада FGF21 in vivo и
- 15 034847 к идентификации мутантов FGF21, которые были устойчивы к такому распаду. Такие мутанты, описанные в примерах 8 и 11, проявляют больший период полувыведения по сравнению с FGF21 дикого типа.
Эти и другие составные белки FGF21 формируют варианты осуществления настоящего изобретения.
По всему тексту настоящего раскрытия изобретения обозначение Fc-FGF21 относится к составному белку, в котором последовательность Fc присоединена к N-концу FGF21. Сходным образом, обозначение Fc-FGF21 относится к составному белку, в котором последовательность Fc присоединена к С-концу FGF21.
Полученный в результате такого слияния составной белок FGF21 можно очистить, например, применяя колонку для аффинной хроматографии с белком А. Было обнаружено, что пептиды и белки, к которым присоединен участок Fc, проявляют in vivo значительно более длительный период полувыведения по сравнению с негибридизированными аналогами. К тому же слияние с участком Fc создает возможность для димеризации/мультимеризации составного полипептида. Участок Fc может представлять собой участок Fc, встречающийся в природе, но также может подвергаться изменениям для улучшения определенных качеств, таких как терапевтические качества, время циркуляции или сниженная агрегация.
Полезные модификации белковых терапевтических средств за счет слияния с доменом Fc антитела подробно обсуждаются в Международной патентной публикации № WO 00/024782, содержание которой включено в этот документ в качестве ссылки во всей полноте. Этот документ обсуждает сцепление с транспортировщиком, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ), декстран или участок Fc.
b) Линкеры составных белков.
При формировании составных белков по настоящему изобретению можно, но не обязательно, использовать линкер. Если линкер представлен, его химическая структура не принципиальна, поскольку он, в первую очередь, служит спейсером. Линкер может состоять из аминокислот, сцепленных друг с другом посредством пептидных связей. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения линкер составлен из 1-20 аминокислот, сцепленных посредством пептидных связей, при этом аминокислоты выбраны из 20 аминокислот, встречающихся в природе. В различных вариантах осуществления изобретения от 1 до 20 аминокислот выбраны из глицина, серина, аланина, пролина, аспарагина, глутамина и лизина. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер составлен из большинства аминокислот, которые не испытывают стерических затруднений, таких как глицин и аланин. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкеры представляют собой полиглицины (такие как (Gly)4 (SEQ ID NO: 29) и (Gly)5 (SEQ ID NO: 30)), полиаланины, комбинации глицина и аланина (такие как полису- Ala)) или комбинации глицина и серина (такие как TO-inIGly-Ser)). Другие подходящие линкеры включают: (Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser-(Gly)4-Ser (SEQ ID NO: 23), (Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser (SEQ ID NO: 31), (Gly)3-Lys-(Gly)4 (SEQ ID NO: 32), (Gly)3-Asn-Gly-Ser-(Gly)2 (SEQ ID NO: 33), (Gly)3-Cys-(Gly)4 (SEQ ID NO: 34), и Gly-Pro-Asn-Gly-Gly (SEQ ID NO: 35). Несмотря на то что было обнаружено, что для составных белков FGF21 особенно хорош линкер из 15 аминокислот, настоящее изобретение рассматривает линкеры любой длины или любого состава.
Линкеры, описанные в данном документе, типичны, но настоящее изобретение также рассматривает линкеры, которые намного длиннее и могут включать другие аминокислотные остатки. Непептидные линкеры также рассматриваются в настоящем изобретении.
Например, можно использовать алкильные линкеры, такие как -NH-(CH2)s-C(O)-, в котором s = от 2 до 20. Далее, такие алкильные линкеры могут быть замещены любой стерически незатрудненной группой, включая, но не ограничиваясь ими, низший алкил (например, С1-С6), низший ацил, галоген (например, Cl, Br), CN, NH2 или фенил. Типичным непептидным линкером является полиэтиленгликолевый линкер, который имеет молекулярный вес от 100 до 5000 кДа, например от 100 до 500 кДа.
8) Химически модифицированные мутанты FGF21.
Химически модифицированные формы мутантных полипептидов FGF21, описанные в данном документе, включая усеченные формы FGF21, описанные в данном документе, могут быть изготовлены квалифицированным специалистом с учетом информации, представленной в этом раскрытии изобретения. Такие химически модифицированные мутанты FGF21 изменены таким образом, что они отличаются от немодифицированных мутантов FGF21 или по типу, или по локализации молекул, естественным образом прикрепленных к мутанту FGF21. Химически модифицированные мутанты FGF21 могут включать молекулы, образующиеся посредством удаления одной или более химических групп, прикрепленных естественным образом.
В одном из вариантов осуществления изобретения мутантные полипептиды FGF21 по настоящему изобретению могут быть модифицированы посредством ковалентного присоединения одного или более полимеров. Например, в типичном случае отобранный полимер растворим в воде, поэтому белок, к которому он присоединяется, не выпадает в осадок в водной среде, такой как физиологическая среда. В сферу пригодных полимеров включены смеси полимеров. В целях терапевтического использования препарата, являющегося конечным продуктом, предпочтительно, чтобы полимер был фармацевтически приемлемым. Нерастворимые в воде полимеры, конъюгированные с мутантными полипептидами FGF21 по настоящему изобретению, также формируют один из аспектов изобретения.
Типичные полимеры могут иметь любой молекулярный вес и быть разветвленными или неразветв- 16 034847 ленными. Каждый типичный полимер имеет средний молекулярный вес приблизительно от 2 до 100 кДа (термин приблизительно указывает на то, что в препаратах водорастворимых полимеров вес некоторых молекул будет отличаться в большую или меньшую сторону от заявленного молекулярного веса). Предпочтительно, чтобы средний молекулярный вес каждого полимера составлял приблизительно от 5 до 50 кДа, более предпочтительно приблизительно от 12 до 40 кДа, наиболее предпочтительно приблизительно от 20 до 35 кДа.
Подходящие водорастворимые полимеры или их смеси включают, но не ограничиваясь ими, Nсцепленные или О-сцепленные углеводы, сахара, фосфаты, полиэтиленгликоль (ПЭГ) (включая такие формы ПЭГ, которые были использованы для получения производных белков, включая моно^-С^), алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль), монометоксиполиэтиленгликоль, декстран (такой как декстран низкого молекулярного веса, например приблизительно 6 кДа), целлюлозу или другие полимеры на углеводной основе, поли(№винилпирролидон) полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиоли (например, глицерин) и поливиниловый спирт. Настоящее изобретение также охватывает бифункциональные поперечно сшитые молекулы, которые могут быть использованы для получения ковалентно связанных мультимеров мутантных полипептидов FGF21. Настоящее изобретение также охватывает мутанты FGF21, ковалентно присоединенные к полисиаловой кислоте.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения мутант FGF21 ковалентно или химически модифицирован с присоединением одного или более водорастворимых полимеров, включая, но, не ограничиваясь ими, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиоксиэтиленгликоль или пропиленгликоль. См., например, патенты США № 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 и 4179337. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения мутант FGF21 содержит один или более полимеров, включая, но, не ограничиваясь ими, монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу, другой полимер на углеводной основе, поли(№винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимера полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиоли (например, глицерин), поливиниловый спирт или смеси таких полимеров.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения мутант FGF21 ковалентно модифицирован субъединицами ПЭГ. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или более водорастворимых полимеров связаны в одном или более специфических положений (например, на Nконце) мутанта FGF21. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или более водорастворимых полимеров в случайном порядке прикреплены к одной или более боковых цепей мутанта FGF21. В некоторых вариантах осуществления изобретения ПЭГ используется для улучшения терапевтической производительности мутанта FGF21. Некоторые из таких способов обсуждаются, например, в патенте США № 6133426, который включен в этот документ в качестве ссылки с любой целью.
В тех вариантах осуществления настоящего изобретения, где полимером является ПЭГ, группа ПЭГ может иметь любой подходящий молекулярный вес и может быть линейной или разветвленной. Предпочтительно, чтобы средний молекулярный вес группы ПЭГ варьировался в приблизительном диапазоне от 2 до 100 кДа и, более предпочтительно, приблизительно от 5 до 50 кДа, например 10, 20, 30, 40 или 50 кДа. Группы ПЭГ обычно прикрепляются к мутанту FGF21 посредством ацилирования или восстановительного алкилирования через реактивную группу на компоненте ПЭГ (например, альдегидную, амино, тиоловую или эфирную группу), взаимодействующую с реактивной группой на мутанте FGF21 (например, альдегидной, амино или эфирной группой).
ПЭГилирование (или пегилирование) полипептидов, включая мутанты FGF21 по настоящему изобретению, может специфически осуществляться с применением любых реакций пегилирования, известных в данной области знаний. Такие реакции описаны, например, в следующих ссылках: Francis et al., 1992, Focus on Growth Factors 3: 4-10, европейские патенты № 0154316 и 0401384, патент США № 4179337. Например, пегилирование можно осуществить посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования с реактивной молекулой полиэтиленгликоля (или аналогичного реактивного водорастворимого полимера), как описано в данном документе. Для реакций ацилирования выбранный полимер должен иметь одну реактивную эфирную группу. Для восстановительного алкилирования выбранный полимер должен иметь одну реактивную альдегидную группу. Реактивным альдегидом является, например, пропиональдегид полиэтиленгликоля, который стабилен в воде, либо его моно С1-С10 алкокси или арилокси производные (см., например, патент США № 5252714).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полезная стратегия присоединения группы ПЭГ к полипептиду включает комбинирование через образование конъюгатной связи в растворе между пептидом и компонентом ПЭГ, при этом каждый из них несет особую функциональность со взаимной реактивностью по отношению друг к другу. Пептиды можно легко приготовить с помощью традиционного твердофазного синтеза. Пептиды предварительно активированы, т.е. имеют соответствующую функциональную группу в специфическом сайте. Перед реакцией с компонентом ПЭГ предшественники очищают и получают их полные характеристики. Сшивание пептида с ПЭГ обычно происходит в водной фазе, и его можно легко мониторировать посредством обращенно-фазовой аналитической ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). Пегилированные пептиды можно легко очи- 17 034847 стить посредством препаративной ВЭЖХ и охарактеризовать посредством аналитической ВЭЖХ, аминокислотного анализа и лазерной десорбционной масс-спектрометрии.
Полисахаридные полимеры представляют собой еще один тип водорастворимого полимера, который можно применять для модификации белка. Следовательно, мутанты FGF21 по настоящему изобретению, соединенные с полисахаридным полимером, формируют варианты осуществления настоящего изобретения. Декстраны представляют собой полисахаридные полимеры, состоящие из отдельных субъединиц глюкозы, преимущественно соединенных альфа 1-6 связями. Декстран, как таковой, доступен в широком диапазоне молекулярного веса и легко доступен в диапазоне молекулярного веса приблизительно от 1 до 70 кДа. Декстран является подходящим водорастворимым полимером для применения в качестве носителя самостоятельно или в комбинации с другим носителем (например, Fc). См., например, Международную патентную публикацию № WO 96/11953. В ней было описано применение декстрана, конъюгированного с терапевтическими или диагностическими иммуноглобулинами. См., например, Европейскую патентную публикацию № 0315456, которая включена в этот документ в качестве ссылки. Настоящее изобретение также охватывает применение декстрана с молекулярным весом приблизительно от 1 до 20 кДа.
В целом, химическую модификацию можно проводить в любых подходящих условиях, которые способствуют реакции белка с активированной молекулой полимера. Способы приготовления химически модифицированных полипептидов обычно включают следующие этапы: (а) реакция полипептида с активированной молекулой полимера (такой как реактивное эфирное или альдегидное производное молекулы полимера) в таких условиях, при которых мутантный полипептид FGF21 прикрепляется к одной или более молекул полимера, и (b) получение продуктов реакции. Оптимальные условия реакции можно определить, основываясь на известных параметрах и желательном результате. Например, чем больше соотношение между молекулами полимера и белка, тем больше процентный показатель присоединения молекул полимера. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения химически модифицированные мутанты FGF21 могут иметь единичный компонент, представленный молекулой полимера на аминоконце (см., например, патент США № 5234784).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения мутантные полипептиды FGF21 могут быть химически соединены с биотином. Затем комплексам биотина с мутантными полипептидами FGF21 дают возможность связываться с авидином, что приводит к образованию тетравалента авидин/биотин/ мутантный полипептид FGF21.
Мутантные полипептиды FGF21 также можно ковалентно соединять с динитрофенолом (DNP) или тринитрофенолом (TNP), а полученные в результате конъюгаты, осаждаемые антителами IgM типа антиDNP или анти-TNP образуют декамерные конъюгаты с валентностью 10.
В целом, состояния, которые можно облегчить или модулировать введением химически модифицированных мутантов FGF21 по настоящему изобретению, включают те же состояния, которые описаны в данном документе для мутантных полипептидов FGF21. Однако химически модифицированные мутанты FGF21, раскрытые в данном документе, могут обладать дополнительными видами активности, усиленной или ослабленной биологической активностью или другими свойствами, такими как удлиненный или укороченный период полувыведения по сравнению с немодифицированными мутантами FGF21.
9) Терапевтические композиции мутантов FGF21 и их введение.
Терапевтические композиции, включающие мутанты FGF21, относятся к сфере настоящего изобретения и специфически рассматриваются в свете идентификации различных мутантных последовательностей FGF21, проявляющих улучшенные свойства. Такие фармацевтические композиции с мутантами FGF21 могут включать терапевтически эффективное количество мутантного полипептида FGF21 в смеси с фармацевтически или физиологически приемлемым вспомогательным веществом, подобранным в соответствии с предполагаемым способом введения.
Предпочтительно, чтобы приемлемые вспомогательные вещества были нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях.
Фармацевтическая композиция может содержать вспомогательные вещества для модификации, поддержания или сохранения, например, рН, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости разложения или высвобождения, адсорбции или пенетрации композиции. Соответствующие вспомогательные вещества включают, но, не ограничиваясь ими, аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин), противомикробные средства, антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или гидросульфит натрия), буферы (такие как бораты, бикарбонаты, трис-HCl, цитраты, фосфаты или другие органические кислоты), наполнители (такие как маннит или глицин), хелатообразующие агенты (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA)), комплексообразующие агенты (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин), заполнители, моносахариды, дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины), белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины), красящие, вкусо-ароматические или разбавляющие агенты, эмульгирующие агенты, гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон), полипептиды низкого молекулярного веса, солеобразующие противоионы (такие как натрий), консерванты (такие как бен- 18 034847 залконий хлорид, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенилэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или перекись водорода), растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль), сахарные спирты (такие как маннит или сорбит), суспендирующие агенты, сурфактанты или смачивающие агенты (такие как плюроники, ПЭГ, эфиры сорбита, полисорбаты, такие как полисорбат 20 или полисорбат 80, тритон, трометамин, лецитин, холестерин или тилоксапол), агенты, усиливающие стабильность (такие как сахароза или сорбит), агенты, усиливающие тоничность (такие как галиды щелочных металлов, предпочтительно хлорид натрия или калия, маннит, сорбит), транспортировщики для доставки, разбавители, наполнители и/или фармацевтические адъюванты (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990) и последующие издания той же книги, которые включены в этот документ в качестве ссылки с любой целью).
Оптимальную фармацевтическую композицию вполне может определить квалифицированный специалист в зависимости, например, от намеченного способа введения, формата доставки и желательной дозы (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, выше). Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость клиренса in vivo мутантного полипептида FGF21.
Основной транспортировщик или носитель в фармацевтической композиции может быть водным или не водным по своей природе. Например, подходящим транспортировщиком или носителем для инъекций может быть вода, физиологический солевой раствор или искусственная спинномозговая жидкость, возможно с добавлением других материалов, общепринятых в композициях для парентерального введения. Другими типичными транспортировщиками являются забуференный физиологический раствор или физиологический раствор, смешанный с сывороточным альбумином. Другими типичными фармацевтическими композициями являются буфер трис с приблизительным значением рН 7,0-8,5 или ацетатный буфер с приблизительным значением рН 4,0-5,5, которые дополнительно могут включать сорбит или его подходящий заменитель. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиции с мутантным полипептидом FGF21 можно приготовить для хранения, смешивая выбранную композицию, имеющую желательную степень чистоты, с необязательными вспомогательными веществами (Remington's Pharmaceutical Sciences, выше) в виде лиофилизированной таблетки или водного раствора. Кроме того, фармацевтический продукт с мутантным полипептидом FGF21 может выпускаться в виде лиофилизата с применением соответствующих наполнителей, таких как сахароза.
Фармацевтические композиции с мутантным полипептидом FGF21 могут быть подобраны для парентеральной доставки. В альтернативном варианте можно подобрать композиции для ингаляции или для доставки через пищеварительный тракт, например пероральной. Изготовление таких фармацевтически приемлемых композиций относится к квалификации специалистов, работающих в данной области.
Вспомогательные компоненты представлены в таких концентрациях, которые приемлемы в месте введения композиции. Например, буферы применяют для поддержания рН композиции на физиологическом уровне или несколько ниже, обычно в приблизительном диапазоне рН от 5 до 8.
Когда речь идет о парентеральном введении, терапевтическая композиция для применения по настоящему изобретению может представлять собой апирогенный, парентерально приемлемый водный раствор, содержащий желательный мутантный полипептид FGF21 и фармацевтически приемлемый транспортировщик. Особенно подходящим транспортировщиком для парентеральных инъекций является стерильная дистиллированная вода, в которой растворяют мутантный полипептид FGF21, получая в результате стерильный изотонический раствор, законсервированный соответствующим образом. Еще один препарат может включать лекарственный состав из желательной молекулы с таким агентом как инъекционный микросферы, биологически распадающиеся частицы, полимерные соединения (такие как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), капельки или липосомы, обеспечивающие управляемое и длительное высвобождение продукта, который модно доставлять посредством депонированных инъекций. Также можно использовать гиалуроновую кислоту, что может стимулировать длительное пребывание композиции в кровотоке. Другие подходящий средства для введения желательной молекулы включают имплантируемые приспособления для доставки лекарств.
В одном из вариантов осуществления изобретения может быть составлена фармацевтическая композиция для ингаляции. Например, мутантный полипептид FGF21 может быть оформлен в виде сухого порошка для ингаляции. Также можно приготовить ингаляционные растворы мутантного полипептида FGF21 с пропеллентом для аэрозольной доставки. Еще в одном варианте осуществления изобретения растворы можно распылять при помощи небулайзера. Пульмональное (легочное) введение более подробно описано в Международной патентной публикации № WO 94/20069, которая описывает пульмональное введение химически модифицированных белков.
Также рассматривается возможность перорального введения некоторых лекарственных составов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мутантные полипептиды FGF21, которые вводят таким способом, можно вводить в лекарственные составы вместе с носителями или без носителей, которые обычно используют при изготовлении твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы. Например, можно сконструировать капсулу для высвобождения активной части лекарственного
- 19 034847 состава в том отделе желудочно-кишечного тракта, где биологическая доступность лекарства будет максимальной, а распад до попадания в системный кровоток будет минимальным. Для того чтобы облегчить всасывание мутантного полипептида FGF21, в лекарственный состав можно включить дополнительные агенты. Можно также использовать разбавители, вкусо-ароматические вещества, воски с низкой температурой плавления, растительные масла, смазки, суспендирующие агенты, агенты для распада таблеток и связующие вещества.
Фармацевтическая композиция другого типа может включать эффективное количество мутантного полипептида FGF21 в смеси с нетоксичными наполнителями, которые удобны для производства таблеток. Растворяя таблетки в стерильной воде или другом подходящем носителе, можно приготовить растворы в стандартной дозовой форме. Подходящие наполнители включают, но не ограничиваясь ими, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактозу или фосфат кальция, связующие агенты, такие как крахмал, желатин или гуммиарабик, а также смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновую кислоту или тальк. Квалифицированным специалистам будут очевидны дополнительные варианты фармацевтических композиций с мутантными полипептидами FGF21, включая лекарственные составы с замедленным или контролируемым высвобождением мутантных полипептидов FGF21. Компетентным специалистам также должны быть известны методики составления многих других средств с замедленным или контролируемым высвобождением, таких как липосомные носители, биологически разрушаемые микрочастицы, пористый бисер и депонированные инъекции (см., например, такие ссылки как Международная патентная публикация № WO 93/15722, которая описывает контролируемое высвобождение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических композиций, Wischke & Schwendeman, 2008, Int. J. Pharm. 364: 298-327, а также Freiberg & Zhu, 2004, Int. J. Pharm. 282: 1-18, в которых обсуждается изготовление и применение микрос фер/микрочастиц).
Дополнительные примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые полимерные матрицы в виде изделий с определенной формой, например пленок или микрокапсул. Матрицы с замедленным высвобождением могут включать сложные полиэфиры, гидрогели, полилактиды (патент США № 3773919 и европейский патент № 0058481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Ь-глутамата (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-56), поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 и Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), этиленвинилацетат (Langer et. al., выше) или поли-Э(-)-3-гидроксибутировую кислоту (европейский патент № 0133988). Композиции с замедленным высвобождением также могут включать липосомы, которые можно изготовить любым из множества способов, известных в данной области техники. См., например, Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-92 и европейские патенты № 0036676, 0088046 и 0143949.
Типичная фармацевтическая композиция с мутантным полипептидом FGF21, применяемая для введения in vivo, должна быть стерильной. Этого можно достичь пропусканием через мембраны для стерильной фильтрации. При изготовлении лиофилизированной композиции стерилизацию с применением этого способа можно проводить или до лиофилизации, или после лиофилизации и восстановления. Композицию для парентерального введения можно хранить в лиофилизированном виде или в растворе. В дополнение к этому парентеральную композицию обычно помещают в контейнер, имеющий стерильный порт доступа, например в мешок для внутривенного раствора или во флакон с пробкой, которую можно проколоть иглой для подкожной инъекции.
После составления фармацевтической композиции ее можно хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества, обезвоженного или лиофилизированного порошка. Такие лекарственные составы можно хранить или в готовой для применения форме, или в такой форме, которая требует восстановления перед введением (например, в лиофилизированной).
В специфическом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на наборы для изготовления модулей разовых доз, предназначенных для введения. Такие наборы могут включать как первый контейнер с сухим белком, так и второй контейнер с водным составом. В сферу этого изобретения также входят наборы, включающие однокамерные и многокамерные предварительно заполненные шприцы (например, шприцы с жидкостью и шприцы с лиофилизатом).
Эффективное количество фармацевтической композиции с мутантным полипептидом FGF21 для терапевтического применения будет зависеть, например, от терапевтической ситуации и целевых объектов терапии. Квалифицированный специалист поймет, что подходящие уровни доз для лечения будут варьироваться, что частично зависит от вводимой молекулы, от показания для применения мутантного полипептида FGF21, от способа введения, а также от габаритов пациента (веса тела, площади поверхности тела или размера органа) и от его/ее медицинского статуса (возраста и общего состояния здоровья). В соответствии с этим клиницист, стремясь добиться оптимального терапевтического эффекта, может титровать дозу и изменять способ введения лекарства.
Типичная доза может варьироваться в приблизительном диапазоне от 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от вышеупомянутых факторов. В других вариантах осуществления изобретения доза может варьироваться в приблизительном диапазоне от 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг, от 1 мкг/кг до 100 мг/кг
- 20 034847 или от 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 мкг/кг до 100 мг/кг. В других вариантах осуществления изобретения доза может составлять 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650,
700, 750, 800, 850, 900, 950, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000,
7000, 8000, 9000 мкг/кг или 10 мг/кг.
Частота введения доз будет зависеть от фармакокинетических параметров мутантного полипептида FGF21 в применяемом лекарственном составе. В типичном случае клиницист будет вводить композицию так, чтобы была достигнута доза, позволяющая добиться желательного лечебного эффекта. Следовательно, композицию можно вводить в виде разовой дозы, а также двух или более доз, разделенных по времени (которые могут содержать одно и то же или разное количество нужной молекулы), либо посредством непрерывного вливания через имплантируемое приспособление или катетер. Дальнейшую доводку правильной дозы обычно проводит средний специалист, что находится в пределах его компетенции и входит в сферу его повседневных задач. Правильную дозу устанавливают, исходя из соответствующих данных по дозовой зависимости реакции на лечение.
Способ введения фармацевтической композиции соответствует известным способам, например перорально, через инъекцию: внутривенную, внутрибрюшинную, внутримозговую (интрапаренхиматозную или интравентрикулярную), внутримышечную, внутриглазную, внутриартериальную, интрапортальтную (в воротную вену), внутрь повреждения, а также через системы с длительным высвобождением (которые могут быть инъекционными или представлять собой имплантируемые приспособления). При желании композиции можно вводить болюсной инъекцией, непрерывным вливанием или через имплантируемое приспособление.
Альтернативно или в дополнение к этому, композицию можно вводить местно через имплантацию мембраны, губки или другого подходящего материала, который впитывает или инкапсулирует нужную молекулу. При использовании имплантируемого приспособления это приспособление можно имплантировать в любую подходящую ткань или орган, при этом доставка нужной молекулы может происходить через диффузию, рассчитанный по времени болюс или в виде непрерывного введения.
10) Возможности терапевтического применения мутантных полипептидов FGF21.
Мутантные полипептиды FGF21 можно применять для лечения, диагностики, облегчения или профилактики многих заболеваний или патологических состояний, включая нарушения обмена веществ, но, не ограничиваясь ими. В одном из вариантов осуществления изобретения нарушение обмена веществ, подлежащее лечению, представляет собой диабет, например диабет 2 типа. В другом варианте осуществления изобретения нарушением обмена веществ является ожирение. Другие варианты осуществления изобретения направлены на такие метаболические состояния или нарушения как дислипидемия, гипертония, гепатостеатоз, в частности неалкогольный стеатогепатит (NASH), сердечно-сосудистое заболевание, в частности атеросклероз, и возрастные изменения обмена веществ.
В прикладном варианте осуществления изобретения такое заболевание/патологическое состояние, как сахарный диабет или ожирение, можно лечить посредством введения пациенту, нуждающемуся с таком лечении, мутантного полипептида FGF21 в терапевтически эффективной дозе, как описано в данном документе. Введение можно осуществить в соответствии со способами, описанными в данном документе, в частности посредством внутривенной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, внутримышечной инъекции или перорально в виде таблеток или жидкого лекарственного состава. В большинстве ситуаций нужную дозу может определить клиницист, как описано в данном документе, при этом нужная доза представляет собой терапевтически эффективную дозу мутантного полипептида FGF21. Квалифицированному специалисту будет очевидно, что терапевтически эффективная доза мутантного полипептида FGF21 будет зависеть, кроме всего прочего, от графика введения, от стандартной дозы вводимого антигена, от того, вводят ли молекулу нуклеиновой кислоты или полипептида в комбинации с другими терапевтическими средствами, от иммунного статуса и общего состояния здоровья реципиента. Термин терапевтически эффективная доза при использовании в данном документе означает, что количество мутантного полипептида FGF21, вызывающее биологическую или медицинскую реакцию в тканевой системе, в организме животного или человека, которое пытается определить исследователь, лечащий врач или другой клиницист, вызывает облегчение симптомов заболевания или расстройства, подлежащего лечению.
11) Антитела.
В объеме изобретения рассматриваются антитела и фрагменты антител, которые специфично связываются с мутантными полипептидами FGF21 по настоящему изобретению, но не дают специфического связывания с полипептидами FGF21 дикого типа. Антитела могут быть поликлональными, включая специфические поликлональные, моноклональными (MAb), рекомбинантными, химерными, гуманизированными, такими как антитела с пересаженным гипервариабельным участком (CDR), антителами человека, одноцепочечными и/или биспецифическими, а также могут представлять собой их фрагменты, варианты или химически модифицированные молекулы. Фрагменты антител включают те части антитела, которые специфически связываются с эпитопом на мутантном полипептиде FGF21. Примеры таких фрагментов включают фрагменты Fab и F(ab'), полученные в результате ферментативного расщепления полноразмерных антител. Другие связывающие фрагменты включают фрагменты, полученные методи- 21 034847 ками рекомбинантных ДНК, такими как экспрессия рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные участки антитела.
Поликлональные антитела, направленные против мутантного полипептида FGF21, обычно вырабатывают у животных (например, кроликов или мышей) посредством множественных подкожных или внутрибрюшинных инъекций мутантного полипептида FGF21 и адъюванта. Может оказаться полезным конъюгировать мутантный полипептид FGF21 с белковым носителем, который является иммуногеном для иммунизированного биологического вида, таким как гемоцианин лимфы улитки, сывороточный альбумин, тиреоглобулин крупного рогатого скота или соевый ингибитор трипсина. Для усиления иммунного ответа также используют агрегирующие агенты, такие как квасцы. После иммунизации у животных берут образцы крови и проводят анализ сыворотки на титр антитела против мутантного FGF21.
Моноклональные антитела, направленные на мутантные полипептиды FGF21, можно производить любым способом, который предусматривает выработку молекул антитела непрерывной клеточной линией в культуре. Примеры подходящих способов для выработки моноклональных антител включают способы гибридомы, описанные Kohler et. al., 1975, Nature 256: 495-97 и способ гибридомы из В-клеток человека (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133: 3001; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987). Изобретение также предлагает клеточные линии, которые вырабатывают моноклональные антитела, реагирующие с мутантными полипептидами FGF21.
Моноклональные антитела по изобретению можно модифицировать для применения в качестве лекарственных средств. В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело представляет собой химерное антитело, в котором часть тяжелой (Н) и/или легкой (L) цепи идентична или гомологична соответствующей последовательности в антителах, полученных от определенного биологического вида или принадлежащих к особому классу/подклассу антител, тогда как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующей последовательности в антителах, полученных от другого биологического вида или принадлежащих к другому классу/подклассу антител. Сюда же можно включить фрагменты таких антител, которые способны проявлять нужную биологическую активность. См., например, патент США № 4816567, Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-55.
В другом варианте осуществления моноклональное антитело по изобретению представляет собой гуманизированное антитело. Способы гуманизации антител, происходящих не от человека, хорошо известны в данной области техники. См., например, патенты США № 5585089 и 5693762. Обычно гуманизированное антитело имеет один или более аминокислотных остатков, встроенных в него из источника нечеловеческого происхождения. Гуманизацию можно провести, например, применяя способы, описанные в данной области техники (см., например, Jones et. al., 1986, Nature 321: 522-25; Riechmann et al., 1998, Nature 332: 323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-36), посредством замещения как минимум части гипервариабельного участка антитела грызуна соответствующими участками из антитела человека.
Изобретение также охватывает антитела человека, которые связывают мутантные полипептиды FGF21 по настоящему изобретению. Используя трансгенных животных (например, мышей), которые способны вырабатывать набор антител человека при отсутствии эндогенной выработки иммуноглобулина, такие антитела получают, иммунизируя животных антигеном мутанта FGF21 (т.е. антигеном, имеющим как минимум 6 смежных аминокислот), необязательно соединенных с носителем. См., например, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 2551-55; Jakobovits et al., 1993, Nature 362: 255-58; Bruggermann et al., 1993, Year in Immuno, 7: 33. В одном из способов таких трансгенных животных получают, выводя из строя эндогенные локусы, кодирующие у них тяжелые и легкие цепи иммуноглобулина, и вставляя в их геном локусы, кодирующие белки тяжелых и легких цепей человека. Затем частично модифицированных животных, т.е. животных, имеющих неполный комплект модификаций, скрещивают, чтобы получить животное, имеющее все нужные модификации иммунной системы. При введении иммуногена эти трансгенные животные вырабатывают антитела с аминокислотными последовательностями человека (скорее, чем, например, с мышиными), включая вариабельные участки, которые иммуноспецифичны для этих антигенов. См., например, международные патентные публикации № WO 96/33735 и WO 94/02602. Дополнительные способы описаны в патенте США № 5545807, международных патентных публикациях № WO 91/10741 и WO 90/04036, а также в европейском патенте № 0546073. Антитела человека также можно вырабатывать посредством экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках-хозяевах или экспрессии в клетках гибридомы, как описано в данном документе.
В альтернативном варианте осуществления изобретения антитела человека также можно получать из библиотек фагового дисплея (см., например, Hoogenboom et. al., 1991, J. Mol. Biol. 227: 381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581). Эти процессы имитируют иммунный отбор через демонстрацию репертуара антител на поверхности нитевидного бактериофага и последующий отбор фага посредством его связывания с антигеном выбора. Одна из таких методик описана в международной патентной публикации № WO 99/10494, которая описывает выделение высокоаффинных и функциональных агонистических антител для MPL- и msk-рецепторов с применением такого подхода.
Химерные антитела, антитела с пересаженным CDR и гуманизированные антитела обычно получают рекомбинантными способами. Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела вводят в клетки-хозяева и экспрессируют, применяя материалы и процедуры, описанные в данном документе. В одном из вариан- 22 034847 тов осуществления изобретения антитела вырабатывают в клетках-хозяевах млекопитающего, таких как клетки СНО. Моноклональные (например, человеческие) антитела можно получать посредством экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках-хозяевах или в клетках гибридомы, как описано в документе.
Антитела против мутанта FGF21 по изобретению можно использовать в любом известном способе анализа для выявления и количественной оценки мутантных полипептидов FGF21, таком как анализы конкурентного связывания, прямые и непрямые сэндвич-анализы и анализы иммунопреципитации (см., например, публикацию Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques 147-158 (CRC Press, Inc., 1987), включенную в этот документ в качестве ссылки во всей полноте ее содержания). Антитела будут связывать мутантные полипептиды FGF21 с аффинностью, которая соответствует используемому методу анализа.
При диагностическом использовании в некоторых вариантах осуществления изобретения антитела против мутантов FGF21 можно пометить выявляемым компонентом. Выявляемый компонент может представлять собой любой компонент, который способен создавать прямым или непрямым образом поддающийся выявлению сигнал. Например, выявляемым компонентом может быть радиоизотоп, такой как 3Н, 14С, 32Р, 35S, 125I, 99Тс, 111In или 67Ga, флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение, такое как флуоресцинизотиоцианат, родамин или люциферин, а также фермент, такой как щелочная фосфатаза, βгалактозидаза или пероксидаза хрена (Bayer et. al., 1990, Meth. Enz. 184: 138-63).
Анализы с конкурентным связыванием основаны на способности меченого стандарта (например, мутантного полипептида FGF21 или его иммунологически реактивной части) конкурировать с испытуемым анализируемым продуктом (например, мутантным полипептидом FGF21) за связывание с ограниченным количеством антитела против мутанта FGF21. Количество мутантного полипептида FGF21 в испытуемом образце обратно пропорционально количеству стандарта, который вступает в связь с антителами. Для того чтобы облегчить определение количества связанного стандарта, антитела обычно инсобилизируют (переводят в нерастворимую форму) до или после конкуренции, чтобы стандарт и анализируемый продукт, связанные с антителами, было удобно отделить от стандарта и анализируемого продукта, оставшихся несвязанными.
Сэндвич-анализы обычно включают использование двух антител, каждое из которых способно связываться с самостоятельной иммуногенной частью или эпитопом белка, подлежащего выявлению или количественной оценке. В сэндвич-анализе тестируемый образец анализируемого продукта обычно связывается с первым антителом, которое иммобилизовано на твердой опоре, а затем второе антитело связывается с анализируемым продуктом, формируя таким образом комплекс из трех частей. См., например, патент США № 4376110. Второе антитело, само по себе, может быть мечено выявляемым компонентом (прямые сэндвич-анализы) или измеряться с применением антитела против иммуноглобулина, которое мечено выявляемым компонентом (непрямые сэндвич-анализы). Например, одним из типов сэндвичанализа является твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), в котором выявляемый компонент представляет собой фермент.
Антитела против мутанта FGF21 по настоящему изобретению также полезны для получения визуальных изображений in vivo. Антитело, меченое выявляемым компонентом, можно ввести животному предпочтительно в кровоток с последующей оценкой наличия и локализации меченого антитела в организме хозяина. Антитело можно пометить любым компонентом, который поддается выявлению у животного способами ядерного магнитного резонанса, радиологии или другими средствами выявления, известными в данной области техники.
Антитела к мутантам FGF21 по изобретению можно использовать как лекарственные средства. Терапевтические агенты обычно являются агонистами или антагонистами в том смысле, что они либо усиливают, либо ослабляют, соответственно как минимум одну из биологических активностей мутантного полипептида FGF21. В одном из вариантов осуществления антагонистические антитела по изобретению представляют собой антитела или их связывающие фрагменты, которые способны к специфическому связыванию с мутантным полипептидом FGF21 и которые способны подавлять или устранять функциональную активность мутантного полипептида FGF21 in vivo или in vitro. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистическое антитело будет подавлять функциональную активность мутантного полипептида FGF21 как минимум приблизительно на 50% и предпочтительно как минимум приблизительно на 80%. Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело против мутанта способно вмешиваться во взаимодействие между мутантным полипептидом FGF21 и рецептором FGF, таким образом, подавляя или устраняя активность мутантного полипептида FGF21 in vitro или in vivo. Агонистические и антагонистические антитела против мутанта FGF21 идентифицируют скринирующими анализами, который хорошо известны в данной области техники.
Изобретение также относится к набору, включающему антитела против мутанта FGF21 и другие реактивы, полезные для выявления уровня мутантного полипептида FGF21 в биологических образцах. Такие реактивы могут включать выявляемую метку, блокирующую сыворотку, положительные и отрицательные контрольные образцы, а также реактивы для выявления.
Примеры
Приведенные ниже примеры иллюстрируют специфические варианты осуществления изобретения
- 23 034847 и различные варианты его применения. Они сформулированы только в целях пояснения, и их не следует воспринимать как ограничивающие сферу действия изобретения каким-либо образом.
Пример 1. Изготовление конструкций для экспрессии FGF21.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид FGF21, получали посредством амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности, которые соответствуют 5' и 3' концам последовательности зрелого FGF21. Табл. 2 перечисляет праймеры, использованные амплификации последовательности зрелого FGF21.
Таблица 2. Праймеры ПЦР для конструкции FGF21
Праймер Последовательность SEQ ID NO:
Смысловой 5'-AGGAGGAATAACATATGCATCCAATTOOAGATTCTTCTCC-3’ 5
Антисмысло вой 5'-TAGTGAGCTCGAATTCTTAGGAAGCGTAGCTGG-3' 6
Праймеры, использованные для изготовления конструкции, экспрессирующей FGF21, включали сайты рестрикционной эндонуклеазы для направленного клонирования последовательности в подходящий вектор экспрессии (например, рЕТ30 (Novagen/EMD Biosciences; Сан-Диего, штат Калифорния) или pAMG33 (Amgen; Саузенд Оукс, штат Калифорния)). Вектор экспрессии pAMG33 содержит низкокопийную точку начала репликации R-100, модифицированный промотор lac и ген устойчивости к канамицину. Вектор экспрессии рЕТ30 содержит точку начала репликации, полученную из pBR322, индуцируемый промотор Т7 м ген устойчивости к канамицину. Было обнаружено, что экспрессия из pAMG33 выше, но рЕТ30 является более надежным вектором для клонирования. Таким образом, большинство конструкций, описанных в настоящей патентной заявке, сначала были созданы в рЕТ30, а затем скринированы на эффективность. После этого отобранные последовательности были перенесены в pAMG33 для дальнейшей амплификации.
Последовательность FGF21 была амплифицирована в реакционной смеси, содержащей 40,65 мкл dH2O, 5 мкл реакционного буфера PfuUltra II Reaction Buffer (10х), 1,25 мкл смеси dNTP (40 мМ - 4х10 мМ), 0,1 мкл матрицы (100 нг/мл), 1 мкл праймера 1 (10 мкм), 1 мкл праймера 2 (10 мкм) и 1 мкл соединяющей ДНК-полимеразы HS PfuUltra II (Stratagene, Ла-Хойя, штат Калифорния). Реакции амплификации проводили с нагреванием в течение двух минут при 95°С, сопровождающимся десятью циклами при 95°С в течение 20 с, 60°С в течение 20 с (с дополнительным вычитанием I°C на цикл) и 72°С в течение 15 с на килобазу нужного продукта, после чего проводили 20 циклов при 94°С в течение 20 с, 55°С в течение 20 с и 72°С в течение 15 с на килобазу нужного продукта, а затем 72 °С в течение 3 мин. Продукты амплификации расщепляли рестрикционными эндонуклеазами Ndel, Dpnl и EcoRI, вшивали в подходящий вектор, а затем встраивали в компетентную клетку для ее трансформации.
Пример 2. Очистка белков FGF21, полученных из бактерий.
В последующих примерах различные белки FGF21, включая полипептид FGF21 дикого типа, усеченные полипептиды FGF21, мутанты FGF21 и гибридные белки FGF21, были экспрессированы в бактериальной системе экспрессии. После экспрессии, которая описана ниже, белки FGF21 были очищены, как описано в этом примере, если специально не указано иное.
Для очистки полипептида FGF21 дикого типа, усеченных полипептидов FGF21 и мутантов FGF21 от бактериальных телец включений дважды отмытые тельца включений (DWIB) солюбилизировали в солюбилизационном буфере, содержащем гуанидина гидрохлорид и DTT в буфере Tris при рН 8,5, затем перемешивали в течение одного часа при комнатной температуре, и солюбилизированную смесь добавляли к буферу для рефолдинга, содержащему мочевину, аргинин, цистеин и цистамина гидрохлорид при рН 9,5, а затем перемешивали 24 ч при 5°С (см., например, Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-63; Mannall et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 97: 1523-34; Rudolph et al., 1997, Folding proteins, Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., New York, IRL Press) 57-99; and Ishibashi et al., 2005 , Protein Expr. Purif 42: 1-6).
После солюбилизации и рефолдинга смесь пропускали через фильтр с размером ячеек 0,45 мкм. Затем концентрацию пула рефолдинга увеличивали приблизительно в 10 раз, используя для этого отделяющую кассету Pall Omega с молекулярным весом 10 кДа при трансмембранном давлении (ТМР) 20 psi, а также проводили диафильтрацию с 3 объемами колонки 20 мМ Tris, рН 8,0 при ТМР 20 psi.
После этого очищенный образец подвергали анионообменной хроматографии (АЕХ) с применением смолы Q Sepharose HP. Линейный солевой градиент от 0 до 250 мМ NaCl в 20 мМ Tris прогоняли при рН 8,0 и температуре 5°С. Пиковые фракции анализировали методом SDS-PAGE и объединяли.
Затем пул элюата АЕХ подвергали хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) с применением смолы Phenyl Sepharose HP. Белок элюировали, применяя понижающийся линейный градиент от 0,7 до 0М сульфата аммония при рН 8,0 и температуре окружающей среды. Пиковые фракции анализировали методом SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) и объединяли.
Концентрацию пула HIC увеличивали до 7 мг/мл, применяя для этого отделяющую кассету Pall Omega 0,2 м2 с молекулярным весом 10 кДа при ТМР 20 psi. Проводили диафильтрацию концентрата с 5 объе- 24 034847 мами колонки 10 мМ KPO4, 5% сорбита, рН 8,0 при ТМР 20 psi, а восстановленный концентрат разбавляли до 5 мг/мл. Наконец, раствор фильтровали через позидиновую мембрану Pall mini-Kleenpac 0,2 мкМ.
Для очистки составных белков FGF21 и составных мутантных белков FGF21 от бактериальных телец включений дважды отмытые тельца включений (DWIB) солюбилизировали в солюбилизационном буфере, содержащем гуанидина гидрохлорид и DTT в буфере Tris при рН 8,5, затем перемешивали в течение одного часа при комнатной температуре и солюбилизированную смесь добавляли к буферу для рефолдинга, содержащему мочевину, аргинин, цистеин и цистамина гидрохлорид при рН 9,5, а затем перемешивали 24 ч при 5°С (см., например, Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-63; Mannall et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 97: 1523-34; Rudolph et al. 1997, Folding proteins, Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., New York, IRL Press) 57-99 и Ishibashi et al., 2005, Protein Expr. Purif. 42: 1-6).
После солюбилизации и рефолдинга смесь подвергали диализу в 5 объемах 20 мМ Tris, pH 8,0 применяя диализную трубку 10 кД. Уровень рН диализированного пересвернутого материала доводили до 5,0 при помощи 50% уксусной кислоты, а затем осветляли материал центрифугированием в течение 30 мин при 4К.
После этого осветленный образец подвергали анионообменной хроматографии (АЕХ) с применением смолы Q Sepharose HP. Линейный солевой градиент от 0 до 250 мМ NaCl в 20 мМ Tris прогоняли при 8,0 и температуре 5°С. Пиковые фракции анализировали методом SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) и объединяли.
Затем пул элюата АЕХ подвергали хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) с применением смолы Phenyl Sepharose HP. Белок элюировали, применяя понижающийся линейный градиент от 0,6 до 0М сульфата аммония при рН 8,0 и температуре окружающей среды. Пиковые фракции анализировали методом SDS-PAGE и объединяли.
После этапа HIC пул подвергали диализу в 60 объемах 10 мМ Tris, 2,2% сахарозы, 3,3% сорбита при рН 8,5. Концентрацию диализированного пула увеличивали до 5 мг/мл, применяя устройство Jumbosep. Наконец, раствор фильтровали через позидиновую мембрану Pall mini-Kleenpac 0,2 мкМ.
Пример 3. Изготовление и экспрессия усеченных белков FGF21.
Конструкции, кодирующие усеченные белки FGF21 и перечисленные в табл. 3, были получены посредством амплификации в ПЦР вектора экспрессии FGF21 дикого типа, как описано ниже (конструкция вектора экспрессии FGF21 дикого типа описана в примере 1).
Таблица 3. Усечения FGF21
Аминокислотные остатки Число усеченных остатков*
С-концевые усечения
1 - 180 1
1 - 179 2
1 - 178 3
1 - 177 4
1 - 176 5
1 - 175 6
- 25 034847
1 - 174 7
1-173 8
1 - 172 9
1 - 171 10
1-169 12
1 - 168 13
1 - 167 14
1-166 15
1-165 16
1 - 164 17
1-160 21
1-156 25
1 - 152 29
1-149 32
1-113 68
N-концевые усечения
2-181 1
3-181 2
4-181 3
5 - 181 4
6-181 5
7-181 6
8-181 7
9-181 8
С- и N-концевые усечения
5 - 174 11
7-172 17
9-169 20
9-149 40
15- 169 26
15- 149 46
15- 113 82
* по отношению к зрелому полипептиду FGF21.
Усеченные белковые конструкции FGF21 были изготовлены с применением праймеров, имеющих последовательности, которые гомологичны участкам, расположенным выше и ниже кодона (или кодонов), подлежащего делеции (что приводит к усечению). Праймеры, использованные в таких реакциях амплификации, также обеспечивали приблизительно 15 нуклеотидов перекрывающейся последовательности, что позволяло рециркуляризировать амплифицированный продукт, а именно весь вектор, теперь содержащий нужный мутант.
Типичная усеченная конструкция FGF21, кодирующая белок FGF21, в котором утрачен остаток гистидина в положении 1 зрелой последовательности FGF21 (т.е. усеченный мутант 2-181), была изготовлена с применением праймеров, показанных в табл. 4.
Таблица 4. Праймеры ПЦР для изготовления типичного усеченного мутанта FGF21
Прайме]) Последовательность SEQ ID NO;
Смысловой 5’-GGAGATATACATATGCCAATTCCAGATTCTTCTCCA1TATT-3' 7
Антисмысловой 5’-CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAA-3' 8
Праймеры, показанные в табл. 4, рассчитаны на делецию остатка гистидина, как показано ниже, при этом верхняя последовательность (SEQ ID NO: 10) является частью зрелого полипептида FGF21, включающей N-концевой метионин, вторая последовательность является смысловым праймером (SEQ ID NO: 7), третья и четвертая последовательности (SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12) являются частями конст- 26 034847 рукции, экспрессирующей FGF21, а пятая последовательность является антисмысловым праймером (SEQ
ID NO: 9)
MetHisProIleProAspSerSerProLeu
5'-GGAGATATACATATG---CAATTCCAGATTCTTCTCCATTATT
TTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCATCCAATTCCAGATTCTTCTCCATTATT AAAACAAATTGAAATTCTTCCTCTATATGTATACGTAGGTTAAGGTCTAAGAAGAGGTAATAA AAAACAAATTGAAATTCTTCCTCTATATGTATAC-5 '
Усеченные конструкции белка FGF21 были изготовлены с применением, по существу, тех же условий ПЦР, что описаны в примере 1. Продукты амплификации были подвергнуты расщеплению рестрикционной эндонуклеазой Dpnl, а затем введены в компетентные клетки для их трансформации. Полученные в результате клоны были секвенированы, чтобы подтвердить отсутствие ошибок, вызванных полимеразой.
Усеченные белки FGF21 были экспрессированы посредством трансформации компетентных клеток BL21 (DE3) или BL21 Star (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния) конструкцией, кодирующей частично усеченный белок FGF21. Трансформанты выращивали в течение ночи с ограниченной аэрацией в среде ТВ с добавлением 40 мкг/мл канамицина, аэрировали на следующее утро и после короткого периода восстановления индуцировали в 0,4 мМ IPTG. Мутанты FGF21 собирали центрифугированием через 1820 ч после индукции.
Пример 4. Активность усеченных белков FGF21 in vitro.
Были проведены эксперименты по идентификации усеченных белков FGF21, которые сохраняют активность FGF21 дикого типа в анализе на ELK-люциферазу in vitro. Табл. 5 показывает в сводном виде результаты, полученные для белков FGF21, имеющих усечения на N-конце, С-конце или как на N-конце, так и на С-конце. Анализы на ELK-люциферазу проводили с использованием рекомбинантной системы почечных клеток человека 293Т, в которой клетки 293Т избыточно экспрессируют генные конструкции бета-клото и репортера люциферазы. Эти конструкции также содержат последовательности, кодирующие GAL4-ELK1 и 5/UAS-Luc. репортер люциферазы, управляемый промотором, который содержит тандемные копии сайта связывания Gal4. Бета-клото представляет собой корецептор, который востребован FGF21 для активации его FGF-рецепторов и индуцирования трансдукции внутриклеточного сигнала, который, в свою очередь, приводит к фосфорилированию Erk и ELK. Активность люциферазы регулируется уровнем фосфорилированного Erk/ELK1 и используется для непрямого мониторирования и количественной оценки активности FGF21.
Анализы на ELK-люциферазу проводили, культивируя клетки 293Т в присутствии разных концентраций полипептида FGF21 дикого типа или мутантного полипептида FGF21 в течение 6 ч, после чего проводили оценку клеточных лизатов на активность люциферазы. На фиг. 1А-1В показывают результаты анализа активности ELK-люциферазы, проведенного на усеченных мутантах FGF21 7-181 и 8-181 (фиг. 1А) и усеченных мутантах FGF21 1-172, 1-171, 1-169 и 1-164 (фиг. 1В). Люминесценция, полученная в анализах на активность ELK-люциферазы в каждом из усеченных мутантов FGF21: 3-181, 4-181, 5-181, 7-181, 8-181, 1-180, 1-178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181 и 1-149, показана на фиг. 2.
Мутантные полипептиды FGF21 сравнивали со стандартом FGF21 дикого типа, а мутанты, показывающие эффективность, составляющую как минимум 50% эффективности FGF21 дикого типа, считали не утратившими активность FGF21 (в табл. 5 они помечены символом
- 27 034847
Таблица 5. Усеченные белки FGF21: анализ in vitro
С-концевые усечения
Аминокислотные остатке Эффективность Активность (+/-)
1 - 180 93,2% +
1 - 178 95,0% +
1 - 177 112,0% +
1 - 176 104,8% +
1 - 174 104,6% +
1 - 173 96,1% +
1 - 172 97,5% +
1 - 171 113,0% +
1 - 169 84,9% +
1 - 167 20% -
1 - 166 20% -
1 - 165 10% -
N-концевые усечения
Аминокислотные остатке Эффективность Активность (+/-)
2-181 112,5% +
3 - 181 130,3% +
4- 181 117,0% +
5- 181 119,6% +
7- 181 74,2% +
8-181 24,9% -
9-181 12,5% -
Собирательный взгляд на результаты, представленные в табл. 5, указывает на то, что С-концевые делеции 14 или более аминокислотных остатков (т.е. белка FGF21 с С-концевым усечением, состоящим из аминокислотных остатков 1-167 и более коротких белков) приводят к элиминации активности FGF21. В дополнение к этому табл. 5 указывает на то, что N-концевые делеции 7 или более аминокислотных остатков (т.е. белка FGF21 с N-концевым усечением, состоящим из аминокислотных остатков 8-181 и более коротких белков) приводят к элиминации активности FGF21. Не удивительно, что усеченные белки FGF21, имеющие как N-концевые усечения от 8 до 14 остатков, так и С-концевые усечения от 12 до 32 остатков по результатам анализов на ELK-люциферазу утрачивали активность.
В соответствии с данными, представленными в табл. 5, усеченные полипептиды FGF21, имеющие N-концевые усечения менее 7 аминокислотных остатков, составляют варианты осуществления настоящего изобретения. Сходным образом, усеченные полипептиды FGF21, имеющие С-концевые усечения менее 13 аминокислотных остатков, составляют варианты осуществления настоящего изобретения.
Пример 5. Активность усеченных белков FGF21 in vivo.
Белок FGF21 обладает множеством видов биологической активности, включая способность понижать в крови уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина, уменьшать вес тела, а также улучшать толерантность к глюкозе, потребление энергии и чувствительность к инсулину. Далее усеченные полипептиды FGF21 были проанализированы на активность FGF21 in vivo посредством введения усеченных полипептидов FGF21 инсулинорезистентным мышам ob/ob и измерения способности частично усеченных полипептидов FGF21 понижать уровень глюкозы в крови. Тестируемый усеченный полипептид FGF21 впрыскивали внутрибрюшинно 8-недельным мышам ob/ob (Jackson Laboratory) и после разовой инъекции брали у животных образцы крови в разных точках времени, например через 0, 6, 24, 72, 120 и 168 ч после инъекции. Уровень глюкозы в крови измеряли глюкометром OneTouch (LifeScan, Inc. Милпитас, штат Калифорния), и результаты измерений выражали в виде процентного изменения уровня глюкозы по сравнению с начальным уровнем глюкозы в крови (т.е. в точке времени 0).
Результаты одного из экспериментов представлены на фиг. 3, которая отображает количество глюкозы в крови, выявленное у мышей, которым впрыскивали усеченные мутанты FGF21 8-181 и 9-181. Этот эксперимент продемонстрировал, что усеченные составные белки FGF21, включающие аминокислотные остатки 8-181, проявляют активность по снижению уровня глюкозы в крови in vivo, однако эта активность несколько меньше по сравнению с активностью FGF21 дикого типа через 3 и 6 ч после инъекции, но усеченные составные белки FGF21, включающие аминокислотные остатки 9-181 не проявляют
- 28 034847 такой активности. Таким образом, анализ эффектов, производимых усеченными полипептидами FGF21 in vivo, показал, что делеция до 7 аминокислот с N-конца зрелого FGF21 не аннулирует биологическую активность молекулы (в отличие от анализа in vitro, результаты которого позволяли предположить, что делеция 7 аминокислот с N-конца зрелого FGF21 аннулирует такую активность).
Различные результаты, полученные для отдельных полипептидов FGF21 с N-концевыми усечениями (например, FGF21 8-181) в анализах in vitro и in vivo, можно объяснить взаимодействием FGF21 с бета-клото и рецептором FGF при осуществлении сигнальной трансдукции. Более конкретно, FGF21 активирует двойной комплекс рецептора, включающий корецептор бета-клото и рецептор FGF (FGFR), который инициирует сигнальный каскад, включающий тирозинкиназу. Было показано, что N-конец FGF21 вовлечен в связывание и активацию FGFR, тогда как С-конец FGF21 необходим для взаимодействия с бета-клото (Yie et al., 2009 FEBS Lett. 583:19-24). Анализ на ELK-люциферазу in vitro был проведен с почечными клетками 293, в которых избыточно экспрессируется корецептор бета-клото, a FGFR экспрессируется на нормальном уровне. Количество FGFR по сравнению с количеством бета-клото относительно мало, следовательно, соотношение между бета-клото и FGFR в клетках 293 не является физиологическим, что может повлиять на формирование рецепторного комплекса, и, в конечном итоге, на связывание лиганда и активацию FGFR. Клеточная система 293 in vitro, по-видимому, более уязвима к полипептидам FGF21 с N-концевыми усечениями, следовательно, она могла давать потерю результатов при анализе активности нескольких протестированных мутантов с N-концевыми усечениями, в частности FGF21 8-181. Таким образом, при определении того, сохраняет ли определенный мутант FGF21 с Nконцевым усечением активность FGF21 дикого типа, активность этого мутанта FGF21 в анализе in vivo, рассматривалась как диспозитивная (допускающая выбор из нескольких вариантов). В соответствии с этим усеченные полипептиды FGF21, имеющие N-концевые усечения менее 8 аминокислотных остатков, охватываются изобретением.
Пример 6. Изготовление и экспрессия усеченных составных белков FGF21.
Поскольку период полувыведения белка можно увеличить, соединяя белок с последовательностью Fc, были изготовлены и проанализированы составные белки, включающие усеченные полипептиды FGF21. Усеченные составные белки FGF21, перечисленные в табл. 6, были изготовлены из амплифицированных последовательностей FGF21 посредством ПЦР типа SOE (сплайсинг генов с удлинением перекрывания).
Составные белки FGF21 были изготовлены таким образом, что участок Fc гена иммуноглобулина человека IgG1 (SEQ ID NO: 13) был присоединен или к N-концу, или к С-концу белка FGF21.
- 29 034847
Таблица 6. Усеченные составные белки FGF21
Аминокислотные остатки Расположение Fc Линкер
С-концевые усечения
1 - 178 -NHj 15
1 - 175 -nh2 14
1 - 175 -СООН 15
1 - 171 -nh2 15
1 - 171 -СООН 15
1 - 170 -СООН 15
N-концевые усечения
5- 181 -nh2 15
5 - 181 -СООН 15
7- 181 -nh2 15
7- 181 -СООН 15
С- и N-концевые усечения
5- 175 -ΝΉ2 15
5- 175 -СООН 15
5- 171 -ΝΗ2 15
5- 171 -СООН 15
6- 170 -СООН 15
7- 178 -СООН 35
7- 175 -νη2 15
7- 175 -СООН 15
7- 174 -СООН 35
7- 172 -СООН 35
7- 171 -ΝΗ2 15
7- 171 -СООН 35
7- 171 -СООН 15
В частности, конструкции составного белка FGF21 (включая конструкции, кодирующие усеченные составные белки FGF21) были изготовлены в серии из трех реакций амплификации с применением, по существу, тех же условий реакции, которые были описаны в примере 1. В первой реакции была сконструирована пара праймеров для выработки последовательности, содержащей сайт клонирования Ndel, участок Fc и линкерную последовательность. Во второй реакции была сконструирована пара праймеров для выработки последовательности, содержащей перекрывающуюся часть линкера, часть кодирующей последовательности FGF21 и сайт клонирования EcoRI. Наконец, в третьей реакции была сконструирована пара праймеров для сцепления продуктов двух первых реакций. Типичный набор праймеров для конструирования составного белка Fc-FGF21 1-181 приведен в табл. 7.
Таблица 7. Праймеры ПЦР для изготовления типичной конструкции составного белка FGF21
Праймер Последовательность SEQ ID NO:
Реакция 1
Смысловой 5’-AGGAGGAATAACATATGGACAAAACTCACACATG-3' 14
Антисмысловой 5'-GGATCCACCACCACCGCTACCAC-3' 15
Реакция 2
Смысловой 5-GGTGGTGGTGGATCCCATCCAATTCCAGATTCTTCTCCA-3 16
Антисмысловой 5’-TAGTGAGCTCGAATTCTTAGGAAGCGTAGCTGG-3’ 17
Реакция 3
Смысловой 5’-AGGAGGAATAACATATGGACAAAACTCACACATG-3' 14
Антисмысловой 5'-TAGTGAGCTCGAATTCTTAGGAAGCGTAGCTGG-3' 17
- 30 034847
Продукт последней реакции был расщеплен рестрикционными эндонуклеазами Ndel и EcoRI, вшит в вектор рЕТ30, а затем введен в компетентные клетки для их трансформации. Полученные в результате клоны были секвенированы, чтобы подтвердить отсутствие ошибок, вызванных полимеразой.
Пример 7. Активность усеченных составных белков FGF21 in vivo.
Были созданы и проанализированы на активность in vivo составные белки, включающие усеченную последовательность FGF21, соединенную с последовательностью Fc. Усеченные составные белки FGF21 были изготовлены посредством присоединения молекулы Fc IgG1 или к N-концевому, или к Сконцевому участку усеченного белка FGF21 для образования целой непрерывной последовательности. Для различения между N-концевыми и С-концевыми слияниями составные белки FGF21, в которых молекула Fc была присоединена к N-концевому участку белка FGF21, будут обозначаться Fc-FGF21, a составные белки, в которых молекула Fc была присоединена к N-концевому участку белка FGF21, будут обозначаться FGF21-Fc.
Белок FGF21 обладает множеством видов биологической активности, включая способность понижать в крови уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина, уменьшать вес тела, а также улучшать толерантность к глюкозе, потребление энергии и чувствительность к инсулину. Для оценки активности FGF21 in vivo полипептиды FGF21, мутантные полипептиды FGF21 и составные полипептиды FGF21 вводили инсулинорезистентным мышам ob/ob с последующим измерением способности определенного белка FGF21 понижать уровень глюкозы в крови. Тестируемый полипептид FGF21, мутантный полипептида FGF21 или составной полипептид FGF21 впрыскивали внутрибрюшинно 8-недельным мышам ob/ob (Jackson Laboratory) и после разовой инъекции брали у животных образцы крови в разных точках времени, например через 0, 6, 24, 72, 120 и 168 ч после инъекции. Уровень глюкозы в крови измеряли глюкометром OneTouch (LifeScan, Inc. Милпитас, штат Калифорния), и результаты измерений выражали в виде процентного изменения уровня глюкозы по сравнению с начальным уровнем глюкозы в крови (т.е. в точке времени 0).
Результаты одного из экспериментов представлены на фиг. 4, которая отображает процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у мышей, которым впрыскивали контрольный PBS, контрольный Fc-FGF21 дикого типа с аминокислотными остатками 1-181 или усеченные составные белки Fc-FGF21, включающие аминокислотные остатки 5-181 или 7-181. Этот эксперимент продемонстрировал, что усеченные составные белки Fc-FGF21, включающие аминокислотные остатки 5-181 или 7-181 проявляют такую активность по снижению глюкозы в крови, которая сходна с активностью Fc-FGF21 дикого типа через 6 ч после инъекции. Таким образом, анализ действия усеченных полипептидов FGF21 in vivo показал, что делеция до 6 аминокислот с N-конца зрелого FGF21 не влияет на биологическую активность молекулы. Однако анализ in vivo также показал, что способность усеченных полипептидов FGF21 понижать уровень глюкозы в крови снижалась, при этом содержание глюкозы в крови возвращалось к исходному уровню через 24 ч после инъекции (для FGF21 дикого типа были получены сходные результаты). Было обнаружено, что короткая активность in vivo является результатом протеолитического разрушения FGF21, как это описано в примере 8.
Результаты другого эксперимента представлены на фиг. 5, которая отображает процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у мышей, которым впрыскивали контрольный PBS, контрольный FGF21-Fc дикого типа с аминокислотными остатками 1-181, усеченный составной белок FGF21-Fc, включающий аминокислотные остатки 1-175, или усеченный белок Fc-FGF21, включающий аминокислотные остатки 1-171. Этот эксперимент продемонстрировал, что FGF21-Fc дикого типа, включающий аминокислотные остатки 1-181, обладает длительной активностью по снижению глюкозы, приводящую к снижению уровня глюкозы в крови приблизительно на 30% в промежутке времени от 24 до 120 ч после инъекции. Усеченный белок Fc-FGF21, включающий аминокислотные остатки 1-171, проявляет замедленную активность по снижению глюкозы в крови, которая очевидно проявляется только через 72 ч после инъекции. Однако наблюдаемая активность почти не отличается от активности FGF21-Fc дикого типа. Усеченный составной белок FGF21-Fc, включающий аминокислотные остатки 1-175, неактивен in vivo в отношении снижения глюкозы в крови.
При совместном рассмотрении экспериментов с усечением, описанных в данном документе, было выявлено, что усеченные составные белки FGF21, имеющие N-концевое усечение, проявляют активность по снижению глюкозы в крови, которая сходна с составным белком FGF21 дикого типа, и далее, что усеченные составные белки FGF21, в которых молекула Fc была присоединена к N-концевому участку усеченного белка FGF21, более активны, чем составные белки, в которых молекула Fc была присоединена к С-концевому участку усеченного белка FGF21.
Пример 8. Наблюдаемое разрушение FGF21 in vivo.
Разрушение FGF21, прежде всего, наблюдалось при использовании конструкций для составного белка FGF21 Fc, как это описано в примере 7. Фармакокинетический анализ in vivo показал, что FGF21 человека имеет короткий период полувыведения у мышей, составляющий приблизительно 1 ч, что является следствием быстрого клиренса и разрушения in vivo. Следовательно, для удлинения периода полувыведения FGF21 к N- или С-концевому участку полипептида FGF21 присоединяли последовательность Fc. Однако присоединение участка Fc не полностью разрешает проблему полувыведения, поскольку со- 31 034847 ставные белки FGF21, к N- или C-концу которых присоединена последовательность Fc (и в особенности слияния Fc-FGF21, т.е. такие структуры, в которых последовательность Fc присоединена к N-концу зрелого FGF21), не проявляют ожидаемой эффективности in vivo, a вместо этого, согласно имеющимся данным, сохраняют активность по снижению глюкозы в крови у мышей ob/ob не более 24 ч. Как показано на фиг. 4, составные белки Fc-FGF21 снижали уровень глюкозы в крови приблизительно на 30-40% через 6 ч после инъекции, но через 24 ч содержание глюкозы в крови возвращалось к исходному уровню.
Впоследствии изучали протеолитическое разрушение FGF21 дикого типа, при этом было обнаружено, что быстрая потеря активности составных белков Fc-FGF21 in vivo происходит в результате разрушения FGF21 in vivo. Протеолитическое разрушение приводит к снижению биологической активности молекулы in vivo, т.е. укорачивает эффективный период полувыведения, следовательно, такое разрушение отрицательно влияет на терапевтическое применение этой молекулы. В соответствии с этим наблюдаемое разрушение составных белков FGF21 Fc привело к изучению протеолитического разрушения FGF21 in vivo и к поиску таких мутантов FGF21, которые были бы устойчивы к подобному разрушению.
Для того чтобы определить сайты разрушения, были проведены анализ LC-MS и секвенирование по Эдману на FGF21 человека дикого типа и составных белках FGF21, наблюдаемых в разных точках времени после инъекции самцам мышей С57В6. Секвенирование по Эдману помогало подтвердить, подвергался ли N-концевой участок или С-концевой участок белка разрушению. Было обнаружено, что при слиянии последовательности Fc с N-концом FGF21 человека разрушение в пептиде происходило между аминокислотными остатками 151 и 152 и между аминокислотными остатками 171 и 172 человеческой части составной молекулы FGF21 (приведенная выше нумерация остатков основана на зрелой последовательности FGF21 и не включает участок Fc составного белка). Было обнаружено, что в первую очередь происходит разрушение в сайте 171-172, вслед за которым происходит разрушение в сайте 151-152. Разрушение в сайте 171-172, по-видимому, является стадией, которая определяет скорость процесса, т.е. играет роль в темпах полувыведения молекулы. Кроме того, было обнаружено, что, если последовательность Fc была присоединена к С-концу FGF21, разрушение в пептиде происходило в связке между аминокислотными остатками 4 и 5 и между аминокислотными остатками 20 и 21. В результате этих экспериментов было определено, что последовательность Fc, по-видимому, защищает от разрушения ту часть последовательности FGF21, которая примыкает к Fc. Далее анализ разрушения FGF21 дикого типа и составных белков Fc-FGF21 in vivo был проведен на обезьянах cynomolgus. Эти исследования подтвердили, что сайт расщепления FGF21 в аминокислотных остатках 171-172 является мажорным сайтом разрушения у обезьян, причем этот сайт разрушения законсервирован между мышиными и приматами.
Пример 9. Идентификация мутантов FGF21, устойчивых к протеолизу.
Подходящие мутанты FGF21 были идентифицированы посредством определения в экспериментах тех положений в последовательности FGF21 дикого типа, которые являются сайтами мажорной протеолитической активности, после чего в эти сайты были внесены специфические аминокислотные замещения. Аминокислотные замещения были основаны на консервации последовательности FGF21 с другими биологическими видами (как это описано в примере 8) и биохимической консервации с другими аминокислотными остатками. Перечень аминокислотных замещений, которые были введены или могут быть внесены в белок FGF21 дикого типа, представлен в табл. 8, хотя табл. 8 является только примером, то есть, вполне возможны и другие замещения. Номера положений, представленные в табл. 8, соответствуют положениям остатков в зрелом белке FGF21, который состоит из 181 аминокислотного остатка.
Таблица 8. Мутированные аминокислотные остатки в FGF21
Положение аминокислоты Нативный остаток Мутации
19 Arg Gin, He, Lys
20 Туг His, Leu, Phe
21 Leu lie, Phe, Tyr, Vai
22 Туг lie, Phe, Vai
150 Pro Ala, Arg
151 Gly Ala, Vai
152 Не His, Leu, Phe, Vai
170 Gly Ala, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Pro, Ser
171 Pro Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gin, Gly, His, Lys, Ser, Thr, Trp, Tyr
172 Ser Leu, Thr
173 Gin Arg, Glu
- 32 034847
Пример 10. Анализ разрушения Fc-FGF21 и FGF21-Fc in vivo.
Стабильность составных белков FGF21 Fc in vivo определяли посредством впрыскивания мышам составного белка, взятия у этих мышей проб крови в разных точках времени и анализа сыворотки методом жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии (LC-MS). Более конкретно, мышам внутрибрюшинно впрыскивали 10 мг/кг Fc(5)FGF21 (экспрессированного в B.coli и очищенного, как описано в примере 2) или FGF21(3)Fc (экспрессированного в клетках млекопитающего и очищенного в соответствии со стандартными процедурами). Образцы крови от мышей получали через 6, 24 и 48 ч после инъекции (табл. 9) и собирали в пробирки с EDTA, предварительно обработанные коктейлями с ингибиторами протеаз (Roche Diagnostics). Плазму отделяли центрифугированием образцов на скорости 12000 g в течение 10 мин. Белки FGF21 аффинно очищали от крови с использованием агарозной смолы против Fc человека.
Таблица 9. Образцы FGF21
Образец Введенный белок Взятие крови
D6 FC-FGF21 6 часов
D24 FC-FGF21 24 часа
D48 FC-FGF21 48 часов
Е6 FGF21-FC 6 часов
Е24 FGF21 -Fc 24 часа
Е48 FGF21-Fc 48 часов
Перед анализом аффинно очищенных образцов способом LC-MS в качестве эталона анализировали стандарты белков Fc-FGF21 и FGF21-Fc. Белковые стандарты либо были редуцированы трис[2карбоксиэтил] фосфином (ТСВР), либо не были редуцированы. Редуцированные и не редуцированные стандарты анализировали методом LC-MS, используя колонку АСВ циано 0,3 мм х 30 см с распылением элюата в масс-спектрометрическую ионную ловушку LCQ Classic. Поскольку развернутые спектры редуцированных образцов были чище, перед анализом LC-MS аффинно очищенные образцы были редуци рованы.
Наблюдаемые массы редуцированного стандарта Fc(5)FGF21 и образцов D6, D24 и D48 показаны На фиг. 6A-6D. Наблюдаемые массы редуцированного стандарта FGF21(3)Fc и образцов В6, В24 и В48 показаны На фиг. 7A-7D. Некоторые элюаты стандартов и образцов были подвергнуты секвенированию по Эдману для подтверждения N-конца белков и фрагментов в соответствии с определением в анализе LC-MS. Результаты анализа стандартов и образцов методом LC-MS показаны в табл. 10.
Таблица 10. Результаты анализа LC-MS и предсказанные фрагменты
Образец FGF21 Основные наблюдаемые массы Фрагмент Интактный Nконец?
Стандарт Fc(5)FGF21 45,339 Da 1-414 Да
D6 45,338 Da 44,317 Da 1-414 1-404 Да
D24 44,321 Da 1-404 Да
D48 44,327 Da 42,356 Da 1-404 7 Да
Стандарт FGF21(3)Fc 46,408 Da (гликозилированный, GOF 44,964 Da (не гликозилированный) 1-410 1-410 Да
Е6 45,963 Da (гликозилированный, GOFJ 5-410 Нет
44,516 Da (не гликозилированный) 5-410
Е24 45,963 Da (гликозилированный, GOF} 44,526 Da (не гликозилированный) 44,130 Da (glycosylated, GOF) 5-410 5-410 21-410 Нет
Е48 45,984 Da 44,130 Da 44,022 Da 5-410? 21-410 ? Нет
Как показано в табл. 10, все аффинно очищенные образцы демонстрировали некоторую степень разрушения только через 6 ч циркуляции. После 24-часовой циркуляции основной продукт Fc-FGF21 представлял собой фрагмент, состоящий из аминокислотных остатков 1-404, что наблюдалось как в об- 33 034847 разцах D, так и в образцах Е. Однако в образцах Е основной продукт FGF21-Fc представлял собой фрагмент, состоящий из аминокислотных остатков 5-410. В обоих протестированных составных белках
FGF21-часть составного белка была более чувствительна к разрушению, чем Fc-часть белка.
Пример 11. Изготовление и экспрессия мутантов и составных белков FGF21, устойчивых к протеолизу.
Конструкции, кодирующие мутанты FGF21, перечисленные в табл. 11, были получены посредством амплификации в ПЦР вектора экспрессии FGF21 дикого типа, как описано ниже (конструкция вектора экспрессии FGF21 дикого типа описана в примере 1). Цель этих экспериментов заключалась в создании мутантов FGF21, которые устойчивы к протеолизу и проявляют удлиненный период полувыведения.
Таблица 11. Мутанты FGF21, устойчивые к протеолизу
Мутация (мутации) Fc Линкер
R19I
R19I соон 15
R19K
R19K соон 15
R19Q
R19Q соон 15
R19K, Y20H
R19K, Y20H СООН 15
- 34 034847
R19K, L21I
R19K, L21I COOH 15
R19K, Y20H, L21I
R19K, Y20H, L21I COOH 15
Y20F
Y20F COOH 15
Y20H
Y20H COOH 15
Y20L
Y20L COOH 15
Y20H, L21I
Y20H, L21I COOH 15
L21I
L21I COOH 15
L21F
L21F COOH 15
L21V
L21V COOH 15
L21Y
L21Y COOH 15
Y22F
Y22F COOH 15
Y22I
Y22I COOH 15
Y22V
Y22V COOH 15
Pl 50 А
Pl 50 A NH2 15
P150R NH2 15
P150A, G151A
P150A, G151A ΝΉ2 15
P150A, I152V
P150A, Il 52V -NH2 15
- 35 034847
Р150А, G151A, I152V
Р150А, G151A, I152V -NH2 15
G151A
G151A -MI2 15
G151V
G151V -NH2 15
G151A, I152V
G151A, I152V -NH2 15
I152F
I152F -ΝΉ2 15
I152H
I152H -NH2 15
I152L
I152L -ΝΉ2 15
1152V
G170A
G170A -NH2 15
G170C
G170C -NH2 15
G170D
G170D -NH2 15
G170E
G170E -ΝΉ2 15
G170N
G170N -NH2 15
G170P
G170P -ΝΉ2 15
G170Q
G170Q -NH2 15
G170S
G170S -ΝΉ2 15
G170E, P171A
G170E, P171A -NH2 15
- 36 034847
G170E,S172L
G170E,S172L -NH2 15
G170E, P171A, S172L
G170E, P171A, S172L -NH2 15
P171A
P171A -NH2 15
P171C -NH2 15
P171D -NH2 15
P171E -NH2 15
P171G -NH2 15
P171H -NH2 15
P171K -NH2 15
P171N -NH2 15
P171Q -NH2 15
P171S -NH2 15
P171T -NH2 15
P171W -NH2 15
P171Y -NH2 15
P171A, S172L
P171A, S172L -NH2 15
S172L -NH2 15
S172T
S172T -NH2 15
Q173E
Q173E -NH2 15
Q173R
Q173R -NH2 15
Мутантные конструкции FGF21 были изготовлены с применением праймеров, имеющих последовательности, которые гомологичны участкам, расположенным выше и ниже кодона (или кодонов), подлежащего мутированию. Праймеры, использованные в таких реакциях амплификации, также обеспечивали приблизительно 15 нуклеотидов перекрывающейся последовательности, что позволяло рециркуляризировать амплифицированный продукт, а именно весь вектор, теперь содержащий нужный мутант.
Типичная мутантная конструкция FGF21, кодирующая мутант FGF21, имеющий остаток глутаминовой кислоты в положении 170 вместо нативного остатка глицина (т.е. мутант G 170E), была изготовлена с применением праймеров, показанных в табл. 12.
Таблица 12. Праймеры ПЦР для изготовления типичного мутанта FGF21
Праймер Последовател ьность SEQ ID NO:
Смысловой 5-ATGGTGGA AC СТТССС AGGGCC GA AGC-3' 18
Антисмысловог 5’-GGAAGGTTCCACCATGCTCAGAGGGTCCGA-3 19
Праймеры, показанные в табл. 12, рассчитаны на замену остатка глицина на остаток глутаминовой кислоты, как показано ниже, при этом первая последовательность представляет собой смысловой праймер (SEQ ID NO: 18), вторая и третья последовательности (SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 22) являются частями конструкции, экспрессирующей FGF21, а четвертая последовательность является антисмысловым праймером (SEQ ID NO: 21)
- 37 034847
5'-ATGGTGGAACCTTCCCAGGGCCGAAGC
CTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCA GAGGAGCCTGGGAGACTCGTACCACCCTGGAAGGGTCCCGGCTTCGGGGT AGCCTGGGAGACTCGTACCACCTTGGAAGG-S1
Конструкции мутанта FGF21 были изготовлены с применением, по существу, тех же условий ПЦР, что описаны в примере 1. Продукты амплификации были подвергнуты расщеплению рестрикционной эндонуклеазой Dpnl, а затем введены в компетентные клетки для их трансформации. Полученные в результате клоны были секвенированы, чтобы подтвердить отсутствие ошибок, вызванных полимеразой. Составные белки Fc-FGF21 и FGF21-Fc были созданы в соответствии с описанием, приведенным в данном документе, например в примере 6.
Мутанты FGF21 были экспрессированы посредством трансформации компетентных клеток BL21 (DE3) или BL21 Star (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния) конструкцией, кодирующей специфический мутант. Трансформанты выращивали в течение ночи с ограниченной аэрацией в среде ТВ с добавлением 40 мкг/мл канамицина, аэрировали на следующее утро и после короткого периода восстановления индуцировали в 0,4 мМ IPTG. Мутантные полипептиды FGF21 собирали центрифугированием через 18-20 ч после индукции.
Мутанты FGF21 также анализировали на предсказанную иммуногенность. Иммунные реакции против белков усиливаются за счет процессинга антигена и его презентации в сайте связывания главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II. Это взаимодействие необходимо для помощи Т-клеток в созревании антител, распознающих белок. После того как были охарактеризованы сайты связывания молекул МНС класса II, стало возможным предсказание того, имеют ли белки специфические последовательности, которые способны связываться с серией распространенных аллелей человека. На основе литературных ссылок и структур кристаллов МНС класса II были созданы компьютерные алгоритмы, позволяющие определить, имеет ли линейная аминокислотная последовательность пептида потенциал для разрушения иммунотолерантности. Компьютерная программа TEPITOPE была использована для определения того, могут ли точковые мутации в конкретных мутантах FGF21 увеличить количество специфических Т-клеток у большинства людей. Основываясь на результатах анализа линейной белковой последовательности каждого мутанта FGF21, нельзя было предсказать усиление иммуногенности для какоголибо мутанта.
Пример 12. Влияние линкерной последовательности на разрушение FGF21.
Для того чтобы определить, влияет ли присутствие удлиненного аминокислотного линкера между последовательностью Fc и последовательностью FGF21 на разрушение FGF21, мышам впрыскивали составные белки FGF21, в которых участок Fc был отделен от последовательности FGF21 линкером из 15 аминокислот, имеющим последовательность GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23), после чего у мышей брали кровь в разных точках времени и проводили анализ сыворотки методом LC-MS. В частности, мышам впрыскивали Fc(15)FGF21 или FGF21(15)Fc (полученные из E.coli) в дозе 23 мг/кг, образцы крови брали через 6, 24 и 48 ч, а взятую кровь аффинно очищали, используя агарозную смолу против Fc человека.
Перед анализом аффинно очищенных образцов способом LC-MS в качестве эталона анализировали стандарты белков F, Fc(15)FGF21 и FGF21(15)Fc. Стандарты белков либо были редуцированы ТСЕР, либо не были редуцированы. Как редуцированные, так и не редуцированные стандарты анализировали методом LC-MS, используя колонку АСЕ циано 0,3 мм χ 30 см с распылением элюата в масс-спектрометрическую ионную ловушку LCQ Classic. Поскольку развернутые спектры редуцированных образцов были чище, перед анализом LC-MS аффинно очищенные образцы были редуцированы.
Наблюдаемые массы редуцированного стандарта Fc(15)FGF21 и соответствующих аффинно очищенных образцов, взятых в разных точках времени, показаны на фиг. 8A-8D. Наблюдаемые массы редуцированного стандарта FGF21(15)Fc и соответствующих аффинно очищенных образцов, взятых в разных точках времени, показаны На фиг. 9A-9D. Некоторые элюаты стандартов и образцов были подвергнуты секвенированию по Эдману для подтверждения N-конца белков и помощи в предсказании идентичности фрагментов, наблюдаемых посредством LC-MS. Результаты анализа стандартов и образцов методом LCMS, а также индикация предсказанных фрагментов показаны в табл. 13.
- 38 034847
Таблица 13. Результаты анализа LC-MS и предсказанные фрагменты
Образец FGF21 Основные наблюдаемые массы Процентная доля от общей величины Фрагмент Интактный Nконец?
Стандарт Fc(15)FGF21 46002 Da 100% 1-424 Да
Fc(15)FGF21 46000 Da 65% 1-424 Да
6 часов 44978 Da 35% 1-414
Fc(15)FGF21 44978 Da 85% 1-414 Да
24 часа 43022 Da 15% 1-394
Fc(15)FGF21 44976 Da 60° о 1-414 Да
48 часов 43019 Da 40% 1-394
Стандарт FGF21(15)Fc 45999 Da 100% 1-424 Да
FGF21(15)Fc 6 часов 45870 Da 100% 1 -423 Да
FGF21(15)Fc 45869 Da 40% 1 -423 Несколько
24 часа 45301 Da 43460 Da 35% 25¾. 6-423 22-423
FGF21(15)Fc 45870 Da 15% 1 -423 Несколько
48 часов 45297 Da 43461 Da 20% 65% 6-423 22-423
Как показано в табл. 13, все аффинно очищенные образцы демонстрировали некоторую степень разрушения только через 6 ч циркуляции. После 24 ч циркуляции основными продуктами Fc(15)FGF21 были фрагменты, состоящие из аминокислотных остатков 1-414 (85% образца) и 1-394 (15% образца), а основными продуктами FGF21(15)Fc были фрагменты, состоящие из аминокислотных остатков 1-423 (40% образца), 6-423 (35% образца) и 22-423 (25% образца). Идентифицированные точки расщепления для белков Fc(15)FGF21 и FGF21(15)Fc показаны на фиг. 10А и 10В соответственно.
Пример 13. Активность устойчивых к протеолизу мутантов Fc(15)FGF21 in vivo через 1-7 дней после инъекции.
Как описано в данном документе, протеолитическое расщепление составных белков FGF21 Fc зависит от ориентации последовательности Fc, при этом окончание Fc составного белка более стабильно, чем окончание FGF21 составного белка (т.е. было обнаружено, что N-концевая часть составных белков FcFGF21 и С-концевая часть составных белков FGF21-Fc более стабильны). Например, расщепление было идентифицировано в положениях 5 и 21 белка FGF21-Fc и в положениях 151 и 171 белка Fc-FGF21.
В результате этих наблюдений было проведено исследование по идентификации мутантов FGF21, устойчивых к протеолизу. Анализ белков Fc-FGF21 методом LC-MS показывает, что протеолитическое разрушение in vivo в первую очередь происходит между аминокислотными остатками 171-172 с последующим разрушением между аминокислотными остатками 151-152. Блокируя протеолитическое разрушение в положении 171, можно предотвратить разрушение в положении 151, что эффективно увеличивает период полувыведения молекулы. Однако устойчивые к протеолизу мутанты, у которых расщепление в положении 151 предотвращено, по-прежнему могут обладать в положении 171 остатками, чувствительными к атаке протеазы, что приводит к потере молекулой 10 последних аминокислот, которые, как известно, вовлечены в связывание корецептора бета-клото, являющегося детерминантом аффинности рецептора к лиганду и мощности in vitro и in vivo. Следовательно, мутационные изменения аминокислотных остатков, окружающих положение 171 в зрелом FGF21, по-видимому, более важны для улучшения стабильности in vivo, мощности и эффективности молекулы.
Активность отдельных мутантов Fc(15)FGF21, устойчивых к протеолизу in vivo, оценивали, впрыскивая внутрибрюшинно мутант FGF21 мышам ob/ob, затем у мышей брали образцы крови через 0, 0,25, 1, 3, 5 и 7 дней после инъекции и измеряли в образцах уровень глюкозы. Результаты одного из экспериментов показаны на фиг. 11, которая отображает уровень глюкозы в крови, измеренный у мышей после инъекции контрольного PBS, контрольного Fc(15)FGF21 или таких мутантов Fc(15)FGF21 как Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 P171A, Fc(15)FGF21 S172L, Fc(15)FGF21 G170E/P171A/S172L или Fc(15)FGF21 G151A. Фиг. 12 показывает процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам этого эксперимента. Этот эксперимент демонстрирует, что мутанты Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21
- 39 034847
P171A, Fc(15)FGF21 S172L и Fc(15)FGF21 G170E/P171A/S172L проявляют длительную активность по снижению уровня глюкозы в крови (до 5 дней), которая превосходит активность Fc-FGF21 дикого типа. Мутант Fc(15)FGF21 G151A лишь немного улучшал длительность активности по снижению уровня глюкозы в крови по сравнению с составным белком Fc-FGF21 дикого типа. Неожиданно было обнаружено, что, хотя мутант Fc(15)-FGF21 S172L неустойчив к протеолизу и, следовательно, имеет сходный профиль разрушения с полипептидом Fc(15)-FGF21 дикого типа, этот мутант демонстрирует улучшенную эффективность in vivo по сравнению с полипептидом Fc(15)-FGF21 дикого типа.
Результаты другого эксперимента представлены на фиг. 13, которая отображает уровень глюкозы в крови, измеренный у мышей после инъекции контрольного PBS, контрольного Fc(15)FGF21 или таких мутантов Fc(15)FGF21, как Fc(15)FGF21 P150A/G151A/I152V, Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 G170E/P171A или Fc(15)FGF21 G170E/S172L. Фиг. 14 показывает процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам этого эксперимента. Как и в эксперименте, описанном выше, составной белок Fc-FGF21 дикого типа и мутант Fc(15)FGF21 P150A/G151A/I152V не проявляли длительной активности по снижению уровня глюкозы в крови, возможно, вследствие того, что все еще могло происходить разрушение в сайте 171, а уровень глюкозы в крови животных, которым впрыскивали эти белки, возвращался к исходному не более чем через 24 ч после инъекции. Однако мутанты Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 G170E/P171A и Fc(15)FGF21 G170E/S172L проявляли максимальную активность по снижению уровня глюкозы в крови до 5 дней после инъекции, что превосходит эффекты составного белка FcFGF21 дикого типа и мутанта Fc(15)FGF21 P150A/G151A/I152V.
Результаты еще одного эксперимента показаны на фиг. 15, которая отображает уровень глюкозы в крови, измеренный у мышей после инъекции контрольного PBS, или таких мутантов Fc(15)FGF21 как Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 G170A, Fc(15)FGF21 G170C, Fc(15)FGF21 G170D, Fc(15)FGF21 G170N или Fc(15)FGF21 G170S. Фиг. 16 показывает процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам этого эксперимента. Все мутанты FGF21, протестированные в этом эксперименте, проявляли длительную активность по снижению уровня глюкозы в крови (до 5 дней после инъекции).
Результаты еще одного эксперимента показаны на фиг. 17, которая отображает уровень глюкозы в крови, измеренный у мышей после инъекции контрольного PBS или таких мутантов Fc(15)FGF21 как Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 P171E, Fc(15)FGF21 Р171Н, Fc(15)FGF21 P171Q, Fc(15)FGF21 P171T, or Fc(15)FGF21 P171Y. Фиг. 18 показывает процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам этого эксперимента. Все мутанты FGF21, протестированные в этом эксперименте, демонстрировали улучшенную активность по снижению уровня глюкозы в крови при сопоставлении с Fc-FGF21 дикого типа.
Пример 14. Разрушение устойчивых к протеолизу мутантов Fc(15)FGF21 in vivo через 6-120 дней после инъекции.
Стабильность отобранных мутантов FGF21 in vivo анализировали, впрыскивая мышам мутант FGF21, после чего у мышей брали образцы крови в разных точках времени и проводили анализ сыворотки методом LC-MS. Более конкретно, мышам впрыскивали либо мутанты Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 P171A, либо мутант Fc(15)FGF21 S172L (полученные из B.coli, как это описано в примере 2), причем каждый мутант перед инъекцией разбавляли приблизительно в 180 мкл 10 мМ НС1, а образцы крови брали через 6, 24, 48, 72 и 120 ч. Белки FGF21 аффинно очищали от крови, используя колонку с агарозной смолой против Fc человека. Образцы элюировали из колонки, используя 10 мМ HCl. Все конструкции FGF21 включали участок Fc и линкер из 15 аминокислот в аминоконцевой области белка FGF21. Мышам также впрыскивали контрольный FGF21 дикого типа.
Перед анализом аффинно очищенных образцов способом LC-MS в качестве эталона анализировали необработанный FGF21 дикого типа и необработанные мутанты FGF21. Все стандарты и образцы по точкам времени были редуцированы ТСВР, а затем проанализированы методом LC-MS с применением колонки АСВ циано 0,3 мм χ 30 см и последующим распылением элюата в масс-спектрометрическую ионную ловушку LCQ Classic . Аффинно очищенные образцы были разбавлены ацетатом аммония, редуцированы ТСВР, а затем проанализированы методом LC-MS, как описано выше.
Наблюдаемые массы Fc(15)FGF21 дикого типа через 0, 6, 24 и 48 ч после инъекции показаны На фиг. 19A-19D соответственно. Наблюдаемые массы Fc(15)FGF21 G170E через 0, 6, 24 и 48 ч после инъекции показаны на фиг. 20A-20D соответственно. Наблюдаемые массы Fc(15)FGF21 P171A через 0, 6, 24 и 48 ч после инъекции показаны на фиг. 21A-21D соответственно. Наблюдаемые массы Fc(15)FGF21 S172L через 0, 6, 24 и 48 ч после инъекции показаны на фиг. 22A-22D соответственно.
Было обнаружено, что все образцы, взятые через 72 и 120 ч, содержат компонент фибриногена высокого молекулярного веса (>200 кДа по результатам нередуцирующего анализа SDS-PAGE), который представлен намного обильнее, чем остальной составной белок Fc(15)FGF21. Результаты анализа LC-MS для других стандартов и образцов представлены в табл. 14.
- 40 034847
Таблица 14. Результаты анализа LC-MS и предсказанные фрагменты
Образец FGF21 Основные наблюдаемые массы Процентная доля от общей величины Фрагмент Эдман
Стандарт Fc(15)FGF21 45994 Da 100% 1-424 —
Fc(15)FGF21 WT 6 часов 46001 Da 44987 Da 80% 20% 1-424 1-414 Нет
Fc(15)FGF21 WT 24 часа 44979 Da -100% 1-414 Нет
Fc(15)FGF21 WT 48 часов 44980 Da -100% 1-414 —
Стандарт Fc(15)FGF21 G170E 46068 Da 100% 1-424
Fc(15)FGF21 G170E 6 часов 46078 Da 100% 1-424 Нет
Fc(15)FGF21 G170E 24 часа 46074 Da 45761 Da 80% 20% 1-424 1- 421 Нет
Fc(15)FGF21 G170E 48 часов 46072 Da 45760 Da -60% -40% 1-424 1- 421 Нет
Стандарт Fc(15)FGF21 P171A 45970 Da 100% 1-424 —
Fc(15)FGF21 P171A 6 часов 45980 Da 100% 1-424 Нет
Fc(15)FGF21 P171A 24 часа 45973 Da 45657 Da -70% -30% 1-424 1- 421 Нет
Fc(15)FGF21 P171A 45992 Da -50% 1-424 Нет
48 часов 45673 Da -50% 1-421
Стандарт Fc(15)FGF21 S172L 46022 Da 100% 1-424 —
Fc(15)FGF21 S172L 6 часов 46027 Da 100% 1-424 Нет
Fc(15)FGF21 S172L 24 часа 44984 Da 100% 1-414 Нет
Fc(15)FGF21 S172L 48 часов 44985 Da 100% 1-414 Нет
Как показано в табл. 14, разрушение Fc(15)FGF21 дикого типа и мутанта S172L выглядят сходно в том отношении, что после 24 ч циркуляции основной продукт составного белка представлял собой фрагмент, состоящий из аминокислотных остатков 1-414. Продукты разрушения мутантов Fc(15)FGF21 G170E и Fc(15)FGF21 P171A также выглядят сходно в том отношении, что образцы, взятые через 24 ч циркуляции, содержат 70-80% интактного белка (аминокислоты 1-424) и 20-30% фрагмента, состоящего из аминокислотных остатков 1-421.
Даже спустя 48 ч мутанты Fc(15)FGF21 G170E и Fc(15)FGF21 P171A все еще сохраняли интактный
- 41 034847 белок, но в то же время демонстрировали увеличение количества фрагментов, состоящих из аминокислотных остатков 1-421. Как наблюдалось в предыдущих анализах конструкций Fc-FGF21, выявлялось разрушение компонента FGF21 составного белка, а компонент F оставался стабильным. Сайты расщепления, идентифицированные для белка дикого типа, Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 P171A и
Fc(15)FGF21 S172L, показаны на фиг. 23А-23П соответственно.
Пример 15. Идентификация мутантов FGF21 с пониженной агрегацией.
Одним из свойств FGF21 дикого типа является склонность к агрегации. Мутанты FGF21 с пониженной агрегацией были выявлены на основе двух гипотез. Первая гипотеза заключается в том, что применительно к FGF21 агрегацию (или димеризацию) запускают гидрофобные взаимодействия и ваандервальсовы взаимодействия между молекулами FGF21, вызванные гидрофобными остатками, которые подвергаются воздействию гидрофильной водоосновной среды растворителя. Вторая гипотеза заключается в том, что эти открытые гидрофобные остатки могут быть замещены для создания вариантов точковых мутаций с пониженной агрегацией без нарушения активности FGF21.
Для идентификации открытых гидрофобных остатков в FGF21 был использован системный рациональный подход белковой инженерии. Поскольку не были известны рентгеновские или ЯМР-структуры FGF21, которые можно было бы использовать для идентификации открытых гидрофобных остатков, для создания трехмерной модели гомологии FGF21 с применением компьютерной программы моделирования МОЕ (молекулярная операционная среда, Chemical Computing Group, Монреаль, Квебек, Канада) была использована рентгенокристаллическая структура FGF19 (IPWA) высокого разрешения (1,3 А), полученная из банка данных по белкам (PDB). В качестве матричного шаблона был выбран FGF 19, поскольку среди белков, депонированных в PDB, именно FGF 19 является белком, наиболее родственным FGF21 по гомологии аминокислотной последовательности. Доступность для растворителя была рассчитана следующим способом с применением программы МОЕ. Первое измерение площади поверхности (SA1) было определено как доступная площадь поверхности остатков в А2. Наряду с тем, что определенный аминокислотный остаток появляется в первичной последовательности белка много раз, каждое появление остатка может иметь разную площадь поверхности вследствие различий, среди всего прочего, в близости остатка к поверхности белка, в ориентации боковой цепи остатка и в пространственном расположении прилегающих аминокислотных остатков. Следовательно, проводят второе измерение площади поверхности (SA2), в котором представляющий интерес остаток извлечен из структуры белка наряду с его окружением, т.е. прилегающими остатками. Эти пространственно прилегающие остатки виртуально мутировали в глицины, чтобы удалить их боковые цепи, а затем вычисляли SA2 для представляющего интерес остатка, получая размер общей площади поверхности для этого остатка в его специфической конформации. Затем, вычисляя отношение SA1 к SA2 (SA1/SA2), можно получить процентный показатель возможной площади поверхности для того остатка, который фактически открыт.
Для дальнейшего анализа были отобраны несколько гидрофобных остатков, которые в значительной степени открыты для растворителя, и в этих остатках осуществлены виртуальные мутации с их заменой на другие встречающиеся в природе аминокислотные остатки. Изменения термостабильности белка, происходящие в результате различных замещений, были рассчитаны на модели FGF21 с применением интерактивной сетевой версии программы CUPSAT (Cologne University Protein Stability Analysis Tools [Инструменты кельнского университета для анализа стабильности белков]) в соответствии с инструкциями, представленными на веб-сайте CUPSAT. См. Parthiban et. al., 2006, Nucleic. Acids. Res. 34: W23942; Parthiban et. al., 2007, BMC Struct. Biol. 7:54. При конструировании вариантов точковых мутаций для снижения агрегации были исключены значительно дестабилизирующие или гидрофобные мутации. В качестве кандидатов на роль мутантов FGF21 с пониженной агрегацией рассматривались стабилизирующие (или, в редких случаях, немного дестабилизирующие) замещения, которые приводят к улучшению гидрофильных и/или ионных характеристик.
Сводка данных, полученных через этот рациональный подход белковой инженерии, представлена в табл. 15, где также перечислены типичные мутанты FGF21 с ожидаемой пониженной склонностью к белковой агрегации и улучшенной стабильностью.
- 42 034847
Таблица 15. Расчетное влияние мутантов FGF21 на стабильность
№ остатка остаток WT Мутация Стабилизация (ккал/моль)
26 А К Е R 1,25 1,54 2,016
45 А Т Q к Е R 0,66 0,71 1,8 2,34 1,59
52 L Т -0,33
58 L G S с Е 0,16 -0,15 1,0 0,08
60 Р А К Е R 1,3 1,51 0,66 1,31
78 Р А С R Н 0,14 2,48 0,08 0,13
86 L Т С 0,18 4,1
- 43 034847
88 F А S К Е 2,52 3,08 2,88 1,48
98 L Т 0,49
Q 0,17
к -0,19
С 3,08
Е 0,84
R 3,4
99 L С 7,34
Е 2,0
D 1,01
R 1,61
111 А Т 0,47
К -0,12
129 А Q 3,93
к 1,02
N 3,76
Е 3,01
D 3,76
R 1,68
Н 2,9
134 А К 5,37
Y 4,32
Е 5,13
R 6,18
Н 2,86
Пример 16. Изготовление и экспрессия мутантов и составных белков FGF21 с пониженной агрегацией.
Конструкции, кодирующие мутанты FGF21, которые перечислены в табл. 16, были получены посредством амплификации в ПЦР вектора экспрессии FGF21 дикого типа, как описано в примере 11 (конструкция вектора экспрессии FGF21 дикого типа описана в примере 1). Составные белки были изготовлены, как описано в данном документе, в частности в примере 6.
- 44 034847
Таблица 16. Мутанты FGF21 с пониженной агрегацией
Мутация (мутации) Fc Линкер
А26Е
А26К
A26R
А45Е
А45К
А45К -NT 12 15
A45R -NH2 15
A45Q -NH2 15
А45Т -NH2 15
А45К, L98R -NH2 15
52Т
L58C
L58E
L58G
L58S
Р60А
Р60Е
Р60К
P60R
Р78А
Р78С
Р78Н
P78R
L86C
L86T
F88A
F88E
F88K
- 45 034847
Агрегацию разных белков FGF21, включая FGF21 дикого типа, усеченные полипептиды FGF21, мутанты FGF21 и составные белки FGF21, оценивали посредством эксклюзионной хроматографии (SEC). Анализируемые образцы инкубировали при 4°С, комнатной температуре или 37°С в течение разного времени, а затем подвергали анализу методом SEC. Эксперименты проводили в системе FLPLC Beckman, оснащенной колонкой SEC. Для FGF21 дикого типа использовали колонку TOSOHAAS TSK-GeI G2000 SEC с 2*PBS, содержащую 2% изопропиловый спирт в мобильной фазе. Для составных белков FGF21 Fc и мутантных полипептидов FGF21 использовали колонку TOSOHAAS TSK-GeI G3000 SEC с 2*PBS в мобильной фазе.
Пример 17. Активность in vitro мутантов FGF21 с пониженной агрегацией.
Были проведены эксперименты по идентификации мутантов с пониженной агрегацией, которые сохраняют активность FGF21 дикого типа в анализе на ELK-люциферазу in vitro. Анализы на ELKлюциферазу проводили, как это описано в примере 4. На фиг. 24А-24С показаны результаты анализа на активность ELK-люциферазы, проведенного на таких мутантах FGF21 как FGF21 L99R, FGF21 L99D и FGF21 A111T (фиг. 24А), на таких мутантах FGF21 как FGF21 A129D, FGF21 A129Q и FGF21 А134K (фиг. 24В) и на таких мутантах FGF21 как FGF21 A134Y, FGF21 А134Е и FGF21 А129K (фиг. 24С). Результаты этих экспериментов демонстрируют, что некоторые из мутантов с пониженной агрегацией не проявляют отрицательного влияния на активность FGF21 по результатам анализов на ELK-люциферазу.
Пример 18. Изготовление и экспрессия комбинированных мутантов Fc(15)FGF21, демонстрирующих удлиненное полувыведение и пониженную агрегацию.
Были изготовлены и конъюгированы с молекулами Fc IgG1 многие комбинированные мутанты FGF21, демонстрирующие пониженную агрегацию и удлиненный период полувыведения за счет подрыва протеолитического разрушения. Эти мутанты FGF21 были изготовлены, по существу, как это описано в примере 11.
Пример 19. Исследования in vitro по изучению мутантов Fc(15)FGF21, демонстрирующих удлиненное полувыведение и пониженную агрегацию.
- 46 034847
Были проведены эксперименты по идентификации комбинированных мутантов FGF21, которые сохраняют активность FGF21 дикого типа в анализе на ELK-люциферазу in vitro. Анализа на ELKлюциферазу проводили, как это описано в примере 4.
На фиг. 25А-25П показаны результаты анализа активности ELK-люциферазы, проведенного на таких мутантах Fc-FGF21 как Fc-FGF21 P171G, Fc-FGF21 P171S и Fc-FGF21 Р171Т (фиг. 25А), на таких мутантах Fc-FGF21 как Fc-FGF21 P171Y, Fc-FGF21 P171W и Fc-FGF21 Р171С (фиг. 25В), на таких мутантах Fc(15)FGF21 как Fc(15)FGF21 A45K/G170E и FGF21 A45K (фиг. 25С) и на таких мутантах Fc(15)FGF21 как Fc(15)FGF21 Р171Е и Fc(15)FGF21 A45K/G170E (фиг. 25D). Результаты этих экспериментов демонстрируют, что мутации, направленные на улучшение стабильности или как стабильности, так и растворимости, не теряют активность in vitro по сравнению с Fc-FGF21 дикого типа. Интересно, что мутант FGF21 А45K продемонстрировал более высокую мощность по сравнению с Fc-FGF21 дикого типа.
На фиг. 26А показан процентное изменение агрегации для контрольного FGF21 (WT) и мутанта FGF21 А45K после инкубации 65 мг/мл белка при 4°С в течение 1, 2 и 4 дней. Данные показывают, что мутация А45K приводит к снижению агрегации мутантного белка по сравнению с белком дикого типа.
Фиг. 26В показывает процентное изменение агрегации для контрольного FGF21 (WT), а также таких мутантов FGF21 как Р78С, P78R, L86T, L86R, L98C, L98R, A111T, A129D, A129Q, A129K, A134K, A134Y и А134Е после инкубации 65 мг/мл белка при 4°С в течение 1, 6 и 10 дней. Данные показывают, что мутации L86R, L98C, L98R, A111T, A129Q и А129K приводят к снижению агрегации мутантного белка по сравнению с белком дикого типа.
Фиг. 27 показывает результаты анализа активности ELK-люциферазы, проведенного на контрольном FGF21 человека и на таких мутантах FGF21 как FGF21 A45K, FGF21 L52T и FGF21 L58E. Этот эксперимент демонстрирует, что мутант FGF21 А45K сохраняет полную эффективность FGF21 дикого типа и проявляет даже большую мощность по сравнению с FGF21 дикого типа. Однако мутанты FGF21 L52T и FGF21 L58E показывают меньшую мощность и эффективность по сравнению с FGF21 дикого типа.
На фиг. 28А-28В показано изменение уровня агрегации для таких мутантов Fc(15)FGF21 как Fc(15)FGF216-181/G170E, Fc(15)FGF21 A45K/G170E, Fc(15)FGF21 P171E, Fc(15)FGF21 P171A, Fc(15)FGF21 G170E и контрольного FGF21 после их инкубации при 4°С в течение 1, 4 и 8 дней. Этот эксперимент демонстрирует, что после 8-дневного периода мутант Fc(15)FGF21 A45K/G170E проявлял меньшую агрегацию по сравнению с мутантами Fc(15)FGF21 G 170E или Fc(15)FGF21 P171E, но все три мутанта проявляли меньшую агрегацию по сравнению с контрольным Fc(15)FGF21. Табл. 17 показывает процентную величину агрегации, полученную для контрольного Fc-FGF21 и мутанта Fc-FGF21 A45K/G170E после инкубации при 4 °С или при комнатной температуре (RT) в течение 0, 2, 3, 4 или 7 дней.
Таблица 17. Процентная величина агрегации для Fc-FGF21 и мутанта Fc-FGF21
Образец день 0 день 2 день 3 день 4 день 7
Fc-FGF21 WT 32 мг/мл 4°С 1,12 1,71 1,89 2,14 2,32
RT 1,12 6,09 7,94 9,57 12,59
FC-FGF21 A45K/G170E 33 мг/мл 4°С 0,45 0,77 0,88 1,03 1,24
RT 0,45 3,86 5,22 6,62 8,60
Пример 20. Изготовление и экспрессия комбинированных составных мутантов Fc-FGF21.
Как описано выше, стабильность и растворимость FGF21 можно модулировать при внесении специфических усечений и аминокислотных замещений. В дополнение к этому стабильность FGF21 можно дополнительно увеличить за счет соединения таких модифицированных белков FGF21 с участком Fc гена иммуноглобулина человека IgG1. Кроме того, комбинируя вышеуказанные модификации, можно создать молекулы FGF21, обладающие как улучшенной стабильностью, так и улучшенной растворимостью. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих комбинированные мутанты FGF21, перечисленные в табл. 18, были изготовлены по методикам, описанным выше.
- 47 034847
Таблица 18. Комбинированные мутанты FGF21
Аминокислотные остатки Мутация, направленная на устойчивость к протеолизу Мутация, направленная на уменьшение агрегации Fc Линкер
1-181 G170E А45К -NH2 15
1-181 G170E L98R -NH2 15
1-181 G170E А45К, L98R -NH2 15
1-181 P171G А45К -NH2 15
1-181 P171S А45К -NH2 15
1-181 P171G L98R -NH2 15
1-181 P171S L98R -NH2 15
1-181 P171G А45К, L98R -NH2 15
1-178 G170E -NH2 15
6-181 G170E -NH2 15
6-181 G170E А45К -NH2 15
6-181 G170E L98R -NH2 15
6-181 P171G -NH2 15
6-181 P171G L98R -NH2 15
7-181 G170E -NH2 15
На фиг. 29 показаны результаты измерения уровня глюкозы в крови у мышей, которым впрыскивали такие комбинированные мутанты Fc(15)FGF21, как Fc(15)FGF21 A45K/G170E, Fc(15)FGF21 A45K/ P171G или Fc(15)FGF21 L98R/P171G.
В другом эксперименте такой мутант FGF21 как Fc(15)FGF21 L98R/P171G исследовали параллельно со зрелым FGF21 и Fc-FGF21 дикого типа. В одном из экспериментов рекомбинантные клетки линии 293 Т культивировали в присутствии разных концентраций FGF21, Fc-FGF21 или Fc-FGF21L98R/P171G в течение 6 ч. Затем клеточные лизаты анализировали на активность люциферазы. Как показано на фиг. 30, Fc-FGF21 L98R/P171G имел сходную активность с Fc-FGF21, а это указывало на то, что внесение двух точковых мутаций не изменяет активность молекулы in vitro.
Еще в одном эксперименте стабильность Fc-FGF21 L98R/P171G в концентрации 65 мг/мл оценивали в течение девяти дней при двух разных температурах, а именно, при комнатной температуре и при 4°С, параллельно с FGF21 и Fc-FGF21. По окончании периода инкубации клеточные лизаты анализировали методом SEC-HPLC для определения профиля агрегации по времени при разных температурах. Данные, показанные на фиг. 31А и 31В, свидетельствуют о том, что скорость формирования агрегатов значительно снижалась для мутанта Fc-FGF21 L98R/P171G при комнатной температуре (закрашенные треугольники, пунктирная линия на фиг. 31 А) и при 4°С (закрашенные треугольники, пунктирная линия на фиг. 31В).
Пример 21. Устойчивые к протеолизу мутанты FGF21, содержащие С-концевые мутации.
Также проводили исследования стабильности комбинированных мутантов in vivo. В частности, стабильность in vivo мутанта Fc-FGF21 L98R/P171G сравнивали со стабильностью Fc-FGF21 в мышиной модели и модели cynomolgus. На обоих биологических видах были получены сходные результаты. В исследовании на обезьянах cynomolgus белки Fc-FGF21 L98R/P171G и Fc-FGF21 впрыскивали внутривенно в дозе 23,5 мг/кг, после чего собирали аликвотные пробы сыворотки и плазмы в разных точках времени до 840 ч после введения дозы. Анализировали точки времени до 168 ч. Образцы для разных точек времени аффинно очищали с применением реактивов против Fc, а затем анализировали методом масс-спектометрии MALDI. Сравнение результатов двух анализов выявило хорошую корреляцию между ними.
При анализе данных, полученных способом иммуноаффинность-MALDI, было обнаружено, что в результате мутации Р171 в P171G обрезание молекулы Fc-FGF21 L98R/P171G в сайте Р171 элиминировалось. Однако для мутанта Fc-FGF21 L98R/P171G наблюдалось минорное и медленное разрушение, приводящее к утрате до трех С-концевых остатков (фиг. 32). Минорные расщепления в трех С-концевых остатках также наблюдались для других мутантов FGF21 после того, как более чувствительный сайт расщепления между аминокислотными остатками 171 и 172 был заблокирован, как это показано на фиг. 20 и 21. Расщепление трех С-концевых остатков может представлять остановку отщепления от Сконцевого участка молекулы карбоксипептидазой последовательным (от остатка к остатку) образом или специфическую атаку протеазы в аминокислотных остатках 178 и 179 с неспецифическим расщеплением в аминокислотных остатках 179-180 и 180-181. Утрата 2-3 аминокислот на С-конце может вызывать
- 48 034847 уменьшенное связывание бета-клото и, в конечном итоге, снижение мощности и уменьшение активности молекулы in vivo. См., например, Yie et al., 2009, FEBS Lett. 583:19-24. Для адресного анализа очевидного разрушающего эффекта карбоксипептидазы на С-конце исследовали влияние добавления колпачка аминокислотного остатка к различным мутантным полипептидам FGF21. С применением методик, описанных в данном документе, были изготовлены и проанализированы многие конструкции, включая те, что представлены в табл. 19. Табл. 19 приводит сводку результатов анализа на ELK-люциферазу in vitro.
Подходящие аминокислотные колпачки могут иметь длину от 1 до 15 аминокислот, например 1, 2, 3, 4, 5, 10 или 15 аминокислот. В колпачке может быть использовано любое число аминокислот любого типа, например один остаток пролина, один остаток глицина, два остатка глицина, пять остатков глицина, а также другие комбинации. Дополнительные примеры колпачков представлены в непосредственном примере и в табл. 19.
В дополнение к этому, для адресного анализа очевидной атаки протеазы в аминокислотных остатках 178 и 179 исследовали мутации аминокислотных остатков в положениях 179, 180 и 181. И вновь с применением методик, описанных в данном документе, были изготовлены и проанализированы многие конструкции, включая те, что представлены в табл. 19. Также исследовали влияние комбинаций колпачка и мутаций в этих сайтах. Табл. 19 приводит в сводном виде типичные конструкции, которые были изготовлены и проанализированы in vitro на активность ELK-люциферазы способом, который описан в данном документе. В соответствии с терминологией, использованной в данном документе, hFc означает последовательность Fc человека (например, SEQ ID NO: 13), L15 относится к линкеру, имеющему 15 аминокислотных остатков (например, SEQ ID NO: 23).
Таблица 19. Эффективность и значения ЕС50 для полипептидов
FGF21 с С-концевыми модификациями
Конструкции Эффективность ЕС50(нМ)
huFGF21 0,4 100,0%
hFc L15.hFGF21(L98R, P171G) 2,5 76,1 %
hFc L15.hFGF21(L98R, P171G, Y179F) 2,6 78,3 %
hFc.L15.hFGF21(L98R, P171G, 1-180)
hFc.L15.hFGF21(L98R, P171G, 1-179) 7,8 77,4 %
hFc L15.hFGF21(L98R, P171G, A180E) 1,9 79,6 %
hFc L15.hFGF21(L98R, P171G, S181K) 130 87,9 %
GSGSGSGSGS hFGF21 L15 hFc
MKEDD.hFGF21L15.hFc 834 83,1 %
hFc L15.hFGF21(L98R, P171G, S181P, P182) 272 69,9%
hFc L15.hFGF21(L98R, P171G, A180G) 3,25 76,9 %
hFc.L15.hFGF21(L98R, P171G, S181G) 3,43 77,3 %
hFc L15 hFGF21(L98R, P171G, 1-182) hFGF21(L98R, P171G, G182)
hFc L15.hFGF21 (L98R, P171G, Y179P) 428 44,4 %
hFc.L15.hFGF21(L98R, P171G, Y179G) 61 82,6 %
hFc.L15hFGF21(L98R, P171G, Y179S) 25,3 74,8 %
hFc L15.hFGF21(L98R, P171G, Y179A) 43,2 79,6 %
hFc L15.hFGF21(L98R, P171G, S181T) 3,07 77,6 %
hFc.L15.hFGF21(L98R, P171G, S181A) 2,66 73,5 %
hFc.L15.hFGF2](L98R, P17IG, S181L) 3,46 72,6 %
hFc L 15.hFGF21 (L98R, PI71G, SI8IP) 33,8 79,5 %
hFc L15.hFGF21(L98R, P171G, A180P) 617 77,! %
hFc.L15.hFGF21(L98R, P171G, A180S) 2,18 84,7 %
HFGF21 (L98R, P171G, GGGGG182-6)
hFc L15.hFGF21(L98R, P171G, P182) 6,1 85,9 %
hFc L15.hFGF21(L98R, P171G, G182) 6,5 71,1 %
hFc.L15.hFGF21(l-178, L98R, P171G) 167 63,9 %
hFc.L15.hFGF21(L98R, P171G, GG182-3) 1941 84,2 %
hFc L15.hFGF21(L98R, P171G, GGGGG182-6) 4307 99,7%
- 49 034847
На фиг. 33 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у диабетических мышей db/db (фон С57В6), которым впрыскивали контрольный PBS, нативный FGF21 дикого типа, FcFGF21 (L98R, P171G) и две закрытые колпачками молекулы, к С-концевому участку которых был добавлен или остаток пролина, или остаток глицина, т.е. Fc-FGF21 (L98R, P171G, 182Р) и Fc-FGF21 (L98R, P171G, 182G). В непосредственном примере, когда остаток добавляли к С-концу полипептида FGF21 дикого типа или мутантного, остаток упоминается в том положении, которое он занимает в результирующем белке. Так, обозначение 182G указывает на то, что остаток глицина присоединен к Сконцевому остатку 181 зрелого полипептида дикого типа или мутанта. Фиг. 33 показывает, что нативный FGF21 снижал уровень глюкозы в крови в течение 6 ч, тогда как три изученных мутанта Fc-FGF21 демонстрировали длительную активность по снижению глюкозы в крови в течение как минимум 120 ч. Белок Fc-F GF21 (L98R, P171G, 182Р), молекула которого включала добавление остатка пролина на Сконце компонента FGF21 составного белка, оказался наиболее мощным и приводил к самому низкому уровню глюкозы в крови по сравнению с Fc-FGF21 (L98R, P171G) и Fc-FGF21 (L98R, P171G, 182G).
В последующем эксперименте изучали активность in vivo молекул Fc-FGF21 (L98R, P171G, 182G) и Fc-FGF21 (L98R, P171G, 182Р), сопоставляя ее с активностью in vivo закрытой колпачком молекулы, которая включала два остатка глицина, добавленных на С-конце, а именно Fc-FGF21 (L98R, P171G, 182G 183G). Фиг. 34 показывает результаты этого эксперимента. Фиг. 34 отображает процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у мышей ob/ob, которым впрыскивали контрольный PBS, FcFGF21 (L98R, P171G), Fc-FGF21 (L98R, P171G, 182G 183G), Fc-FGF21 (L98R, P171G, 182G) и Fc-FGF21 (L98R, P171G, 182Р).
Как показано на фиг. 34, все исследованные молекулы демонстрировали длительную активность по снижению глюкозы при сравнении с контрольным PBS. Этот эксперимент подтвердил предыдущие результаты (фиг. 33), свидетельствующие о том, что Fc-FGF21 (L98R, P171G, 182Р) с добавлением пролина на С-конце демонстрирует немного большую активность по снижению уровня глюкозы при сравнении с молекулой без пролинового колпачка, например Fc-FGF21 (L98R, P171G). Однако оказалось, что добавление двух остатков глицина на С-конце, например Fc-FGF21 (L98R, P171G, 182G 183G), снижает мощность молекулы in vivo и уменьшает длительность эффекта in vivo по снижению уровня глюкозы.
На фиг. 35 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у диабетических мышей db/db (фон С57В6), которым впрыскивали контрольный PBS или такие мутантные полипептиды FGF21 как Fc-FGF21 (L98R, P171G), Fc-FGF21 (L98R, P171G, Y 179S), Fc-FGF21 (L98R, P171G, Y179A), Fc-FGF21 (L98R, P171G, A180S) и Fc-FGF21 (L98R, P171G, Al 80G). Все мутанты продемонстрировали сходную активность по снижению уровня глюкозы, а также сходную длительность эффекта.
Фиг. 36 отображает процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у диабетических мышей db/db (фон С57В6), которым впрыскивали контрольный носитель, Fc-FGF21 (L98R, P171G), FcFGF21 (L98R, P171G, Y179F) и Fc-FGF21 (L98R, P171G, А180Е). По сравнению с белком Fc-FGF21 (L98R, P171G) белок Fc-FGF21 (L98R, P171G, Y 179F) был менее эффективен в понижении уровня глюкозы в крови. Однако Fc-FGF21 (L98R, P171G, A180Е), в котором было произведена мутационная замена аланина на глутаминовую кислоту в положении 180, оказался более эффективным, чем Fc-FGF21 (L98R, P171G) и вызывал дополнительное снижение уровня глюкозы на 20% по сравнению с Fc-FGF21 (L98R, P171G). Эти данные позволяют предположить, что мутация А180Е может детерминировать уменьшенное С-концевое разрушение in vivo, т.е. улучшенную мощность и эффективность молекулы in vivo.
Пример 22. Исследование на обезьянах резус.
С применением методологии, описанной в данном документе, была создана конструкция Fcлинкер-FGF21. Эта конструкция включала последовательность Fc IgG1 (SEQ ID NO: 13), соединенную на С-конце с линкерной последовательностью (Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser-(Gly)4-Ser (SEQ ID NO: 23), которая далее была присоединена на С-конце к N-концу зрелой последовательности FGF21 (SEQ ID NO: 4) с двумя внесенными в последнюю мутациями, L98R и P171G. Затем эта конструкция была экспрессирована и очищена, как описано в данном документе, и была выделена в димерной форме белка, каждый мономер которого был сцеплен через межмолекулярные дисульфидные связи между участками Fc каждого мономера. Эта молекула упоминается в непосредственном примере как Fc-FGF21(RG), имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 и кодируется последовательностью SEQ ID NO: 37. В этом примере обозначение FGF21 относится к зрелой форме FGF21, а именно, к SEQ ID NO: 4.
22.1. Схема исследования.
Конструкцию Fc-FGF21(RG) вводили хронически и подкожно (SC) самцам обезьян резус без диабета и с индексом массы тела (BMI) > 35. Две других группы обезьян (n=10 на группу) получали либо зрелый FGF21 (т.е. SEQ ID NO: 4), либо контрольный носитель.
Перед началом введения любого испытуемого соединения животные проходили акклиматизацию в течение 42 дней, а затем их делили на группы численностью по 10 особей и вводили посредством множественных SC инъекций испытуемые соединения или контрольное вещество по принципу слепого исследования, как это отображено графически на фиг. 37. Вкратце, каждому животному делали в день одну инъекцию испытуемого соединения или носителя. FGF21 вводили ежедневно, тогда как Fc-FGF21(RG) вводили еженедельно. Дозы Fc-FGF21(RG) и FGF21 повышали каждые 2 недели, как это показано на
- 50 034847 фиг. 37. По ходу всего исследования контролировали вес тела и потребление пищи. Научноисследовательская организация, работающая по контракту (CRO) не была осведомлена о проводимом лечении.
Перед началом лечения проводили два пероральных теста на толерантность к глюкозе (OGTT). Результаты OGTT1 использовали для разделения животных на три равноценные группы, основываясь на равномерном распределении по таким признакам как площадь под кривой (AUC) и вес тела.
Результаты второго OGTT (OGTT2) использовали для подтверждения сортировки по итогам первого OGTT (OGTT1). Те обезьяны, для которых профиль OGTT, полученный в первом тесте (OGTT1), отличался от профиля, полученного в следующем тесте (OGTT2), были исключены из исследования. Результаты OGTT1 и OGTT2 показаны на фиг. 38А и 38В, а результаты измерений AUC показаны на фиг. 38С. Исходный вес тела показан на фиг. 38D и в табл. 20.
OGTT 3, 4 и 5 проводили через каждые 2 недели по окончании лечения каждой из трех доз (низкой, средней и высокой). Образцы крови от животных собирали натощак еженедельно и использовали их для измерения уровней глюкозы, инсулина, триглицеридов, а также уровня испытуемого соединения. Образца крови также собирали еженедельно в течение 3-недельного периода отмывания. Начальные результаты OGTT1 и OGTT2 показали ожидаемый профиль глюкозы у здоровых животных с максимальным уровнем глюкозы в плазме через 30 мин и продемонстрировали стабильность AUC в 3 разных группах.
Исходные биохимические показатели плазмы натощак показаны в табл. 20. Биохимические измерения в плазме проводили на образцах крови, полученных перед началом лечения.
Таблица 20. Исходные показатели веса тела, уровней глюкозы, инсулина и триглицеридов в плазме натощак в трех группах обезьян резус
Носитель FGF21 Fc-FGF21(RG)
N 10 10 10
Вес тела (кг) 8,5 ±0,5 8,7 ±0,4 8,5 ± 0,4
Глюкоза в плазме (мг/дл) 91,9 ± 4,8 94,8 ± 5,3 82,2 ±3,7
Инсулин (пг/мл) 942,6 ±121,4 976,1 ± 107,7 1023,4 ±205,1
Триглицериды (мг/дл) 44,4 ±4,8 58,6 ±5,2 71,7 ±9,8
Были выбраны три разных уровня дозы: низкие дозы составляли 0,1 и 0,3 мг/кг, средние дозы - 0,3 и 1 мг/кг, а высокие дозы - 1 и 5 мг/кг для FGF21 и Fc-FGF21 (RG) соответственно. Уровни дозы были выбраны на основе наблюдаемой дозовой реакции у мышей, а схема введения доз основывалась на ожидаемой частоте инъекций для человека. Для средней и низкой доз были использованы эквимолярные дозы FGF21, а высокую дозу Fc-FGF21(RG) увеличили до 5 мг/кг (вместо 3 мг/кг, что соответствовало дозе, эквимолярной 1 мг/кг для FGF21).
22.2. Влияние испытуемых соединений на вес тела.
В этом эксперименте для оценки влияния испытуемых соединений на вес тела, измеряемый еженедельно, в трех разных группах обезьян резус еженедельно рассчитывали процентное изменение веса тела по сравнению с исходным. Вес тела также измеряли в течение трехнедельного периода отмывания. В табл. 20 указаны исходные значения веса тела для каждой группы.
Вес тела контролировали по ходу всего исследования как до, так и после выведения испытуемых соединений. Процентное изменение веса тела по сравнению с начальным у животных, получавших носитель, нарастало, тогда как у животных, получавших Fc-FGF21(RG) и FGF21, на протяжении 6-недельного периода лечения вес тела снижался с эффектом дозовой зависимости, как это показано на фиг. 39. Как ранее наблюдалось у грызунов (Xu et al., Diabetes 58(l):250-9 (2009)), лечение FGF21 снижало вес тела на уровне статистической значимости. Fc-FGF21(RG) имел большую экспозицию по сравнению с FGF21 (на фиг. 48 и 47 соответственно), и это позволяло дать полученным наблюдениям такое возможное объяснение, что Fc-FGF21(RG) демонстрировал более выраженное снижение веса тела по сравнению с FGF21.
22.3. Влияние испытуемых соединений на уровень инсулина.
Уровень инсулина измеряли в образцах крови, полученных после ночного перерыва в приеме пищи (натощак) или после дневного кормления.
Уровень инсулина в плазме у обезьян резус, получавших носитель, FGF21 или Fc-FGF21(RG), измеряли натощак еженедельно, включая 3-недельный период отмывания. Образцы крови натощак собирали приблизительно через пять дней после последней инъекции Fc-FGF21(RG) и приблизительно через 21 ч после последней инъекции FGF21.
Уровень инсулина в плазме после приема пищи у обезьян резус измеряли на пятой и шестой неделе лечения либо носителем, либо FGF21 в высокой дозе. Образцы крови после приема пищи собирали приблизительно через три дня после последней инъекции Fc-FGF21(RG) и приблизительно через 2 ч после последней инъекции FGF21. Фиг. 40 показывает влияние носителя, FGF21 и Fc-FGF21(RG) на уровень инсулина в крови натощак на протяжении всего девятинедельного исследования, тогда как Фиг. 41 отображает уровень инсулина после приема пищи, определенный в образцах, которые были получены на 5- 51 034847 и 6-й неделе.
Вкратце, в двух самых высоких дозах как FGF21, так и Fc-FGF21(RG) статистически значимо понижали уровень инсулина натощак и после приема пищи. То наблюдение, что уровень инсулина у животных, получавших FGF21 и Fc-FGF21(RG), снижался, а повышения уровня инсулина не происходило, свидетельствует о повышенной чувствительности к инсулину.
22.4. Влияние испытуемых соединений на OGTT (глюкоза и инсулин).
Три теста OGTT (OGTT 3, 4 и 5) были проведены после начала лечения. В тесте OGTT5 профили уровней глюкозы и инсулина измеряли у животных, которые в течение 6 недель получали носитель, FGF21 или Fc-FGF21(RG), в соответствии с последними двумя неделями режима повышения дозы (высокая доза). Тест OGTT5 проводили приблизительно через 7 дней после последней инъекции FcFGF21(RG) и приблизительно через 21 ч после последней инъекции FGF21. Профили глюкозы и инсулина в тесте OGTT5 показаны на фиг. 42 и 43 соответственно. Животные, получавшие Fc-FGF21(RG), демонстрировали улучшенный клиренс глюкозы, сравнимый с 5 животными, получавшими носитель, только при самой высокой дозе и в последней точке времени при проведении измерений, как это показано на фиг. 42. В конце периода введения последней дозы Fc-FGF21(RG) показал самое сильное улучшение клиренса глюкозы. FGF21 не показал улучшения клиренса глюкозы. Fc-FGF21(RG) имел большую экспозицию по сравнению с FGF21 (на фиг. 48 и 47 соответственно), и это позволяло дать полученным наблюдениям такое возможное объяснение, что Fc-FGF21(RG) демонстрировал более выраженный эффект в отношении клиренса глюкозы по сравнению с FGF21. Уровень инсулина по результатам теста OGTT5 был статистически значимо снижен в последней точке времени проведения изменений у животных, получавших Fc-FGF21(RG), по сравнению с животными, получавшими носитель.
Процентное изменение AUC глюкозы по сравнению с исходным рассчитывали для трех OGTT (OGTT 3, 4 и 5), проведенных в конце периода введения каждой дозы (низкой, средней и высокой) в трех разных группах обезьян резус, как это показано на фиг. 44. Тест OGTT5 проводили приблизительно через семь дней после последней инъекции Fc-FGF21(RG) и через 21 ч после последней инъекции FGF21, и полученные результаты показали, что Fc-FGF21(RG) статистически значимо улучшал AUC5. Исходные показатели теста OGTT для каждой группы показаны на фиг. 38С.
Уровень глюкозы в плазме натощак измеряли в те дни, когда не проводили тесты OGTT. He было выявлено каких-либо значимых статистических различий между тремя группами животных по результатам измерений уровня глюкозы натощак.
22.5. Влияние испытуемых соединений на уровень триглицеридов.
Процентное изменение уровня триглицеридов натощак в плазме у обезьян резус, получавших носитель, FGF21 или Fc-FGF21(RG), рассчитывали еженедельно, включая 3-недельный период отмывания. Образцы крови натощак собирали приблизительно через пять дней после последней инъекции FcFGF21(RG) и приблизительно через 21 ч после последней инъекции FGF21. Уровень триглицеридов измеряли каждую неделю после начала лечения, процентные изменения по сравнению с начальным уровнем показаны на фиг. 45, и исходные величины натощак показаны в табл. 20.
Как отображено на фиг. 45, животные, получавшие либо Fc-FGF21(RG), либо FGF21, демонстрировали снижение уровня триглицеридов с эффектом дозовой зависимости, причем Fc-FGF21(RG) имел более выраженный понижающий эффект по сравнению с FGF21.
На фиг. 46 показан уровень триглицеридов в плазме в образцах, полученных от обезьян резус после приема пищи на пятой и шестой неделе лечения носителем, Fc-FGF21(RG) или FGF21. Образцы крови после приема пищи собирали приблизительно через 3 дня после последней инъекции Fc-FGF21(RG) и приблизительно через 2 ч после последней инъекции FGF21. Уровень триглицеридов в плазме после приема пищи у животных, получавших FGF21 и Fc-FGF21(RG) был статистически значимо снижен по сравнению с животными, получавшими носитель (фиг. 46).
22.6. Концентрация испытуемых соединений.
Экспозицию испытуемых соединений, вводимых на приблизительно эквивалентном уровне молярной дозы, оценивали на протяжении всего исследования. Концентрацию Fc-FGF21(RG) измеряли перед введением дозы и приблизительно через 5 дней после последней инъекции. Уровень FGF21 измеряли перед введением дозы, а также через 5, 12, 19 и 26 дней. Образцы крови получали приблизительно через 21 ч после последней инъекции.
Показатели индивидуальной концентраций испытуемых соединений у каждой обезьяны отображены на фиг. 47 и 48. Как показано на фиг. 47, большинство животных в группе, получавшей FGF21, имели концентрацию ниже порога количественного определения. Фиг. 48 показывает, что животные в группе, получавшей Fc-FGF21(RG), имели определяемый уровень Fc-FGF21(RG) в каждой дозовой фазе (две еженедельных дозы одинаковой интенсивности). Средняя концентрация в каждой дозовой фазе для FcFGF21(RG) увеличивалась примерно пропорционально дозе от 0,3 до 5 мг/кг. Имеется минимальное накопление, о чем свидетельствует устойчивая концентрация после первой и второй еженедельной дозы в каждой фазе повышения дозы для обоих соединений. В фазе после лечения (период отмывания) уровень Fc-FGF21(RG) был определяемым приблизительно до 47-го дня (12 дней после последней дозы), а после этого падал ниже порога количественного определения (LLOQ).
- 52 034847
Экспозицию испытуемых соединений также мониторировали при каждом OGTT. FGF21 не поддавался определению в ходе тестов OGTT 3 и 4, после лечения FGF21 в низкой и средней дозе. Однако по результатам OGTT5, т.е. после лечения высокой дозой, наблюдался определяемый уровень. Пропорциональное дозе увеличение уровня Fc-FGF21(RG) наблюдалось от третьего до пятого OGTT при увеличении дозы, как это показано на фиг. 49.
Данные об уровнях соединений подтверждают, что животные подвергались воздействию ожидаемого количества каждого соединения, а именно FGF21 и Fc-FGF21(RG), в режиме повышения дозы. В отношении измеряемого количества FGF21 наблюдалась большая вариабельность, которая представляла собой ожидаемый результат, учитывая то, что сбор образцов проводили приблизительно через 21 ч после последней дозы, а период полувыведения FGF21 составляет приблизительно 1 ч.
22.7. Выводы.
FGF21 понижал уровень триглицеридов натощак и после приема пищи, уровень инсулина и уменьшал вес тела в самых высоких дозах. Fc-FGF21(RG) улучшал показатели тестов OGTT и понижал уровень инсулина в самой высокой дозе, а также с эффектом дозовой зависимости понижал уровень триглицеридов в плазме натощак и после приема пищи, как и вес тела. Как FGF21, так и Fc-FGF21(RG) снижали показатели по многим метаболическим параметрам у обезьян резус, не отягощенных сахарным диабетом. Уровень инсулина и триглицеридов снижался одинаково при лечении FGF21 и Fc-FGF21(RG), если уровень циркулирующих соединений находился в сходном диапазоне (в состоянии животных после приема пищи). Вследствие улучшенных характеристик Fc-FGF21(RG) превосходил FGF21 в отношении большинства измеряемых параметров, а для эффективного воздействия на метаболические параметры его можно было вводить один раз в неделю.
Хотя настоящее изобретение было описано на основе различных вариантов его осуществления, квалифицированные специалисты поймут, что вполне возможны его вариации и модификации. Таким образом, надо понимать, что прилагаемая формула изобретения охватывает все равноценные вариации, которые относятся к сфере действия настоящего изобретения, заявленного в данном документе. В дополнение к этому следует упомянуть, что заголовки разделов, использованные в данном документе, даны только в организационных целях и на должны восприниматься как ограничивающие описанный здесь предмет обсуждения.
Все источники, процитированные в этой заявке, явным образом включены в настоящий документ в качестве ссылок.

Claims (44)

1. Выделенный мутантный полипептид фактора роста фибробластов 21 (FGF21), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 и содержащий аминокислотную замену А180Е или аминокислотные замены А180Е и P171G.
2. Выделенный полипептид по п.1, способный понижать глюкозу в крови у млекопитающего и содержащий:
(a) аминоконцевое усечение не более чем 8 аминокислотных остатков;
(b) карбоксиконцевое усечение не более чем 12 аминокислотных остатков; или (c) аминоконцевое усечение не более чем 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не более чем 12 аминокислотных остатков.
3. Выделенный полипептид по п.1, ковалентно связанный с одним или более полимеров.
4. Выделенный полипептид по п.3, причем полимер представляет собой ПЭГ.
5. Выделенный мутантный полипептид фактора роста фибробластов 21 (FGF21), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, содержащую замену в положении 98, 171 и 180, причем:
(a) замена в положении 171 выбрана из группы, состоящей из аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, лизина, серина, треонина, триптофана или тирозина;
(b) замена в положении 98 выбрана из группы, состоящей из аргинина, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина или треонина; и (c) замена в положении 180 выбрана из группы, состоящей из глицина, пролина, серина или глутаминовой кислоты;
и их комбинации.
6. Выделенный полипептид по п.5, в котором остаток в положении 98 представляет собой аргинин, остаток в положении 171 представляет собой глицин и остаток в положении 180 представляет собой глутаминовую кислоту.
7. Выделенный мутантный полипептид фактора роста фибробластов 21 (FGF21), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, содержащую аминокислотные замены в положениях 180 и 98, причем:
(a) аминокислотный остаток в положении 98 представляет собой аргинин, и (b) аминокислотный остаток в положении 180 выбран из группы, состоящей из глицина, пролина,
- 53 034847 серина или глутаминовой кислоты.
8. Выделенный полипептид по п.7, в котором остаток в положении 98 представляет собой аргинин, а остаток в положении 180 представляет собой глутаминовую кислоту.
9. Выделенный полипептид по п.7, способный понижать глюкозу в крови у млекопитающего и содержащий:
(a) аминоконцевое усечение не более чем 8 аминокислотных остатков;
(b) карбоксиконцевое усечение не более чем 12 аминокислотных остатков; или (c) аминоконцевое усечение не более чем 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не более чем 12 аминокислотных остатков.
10. Выделенный полипептид по п.7, ковалентно связанный с одним или более полимеров.
11. Выделенный полипептид по п. 10, причем полимер представляет собой ПЭГ.
12. Выделенный гибридный полипептид мутантного фактора роста фибробластов 21 (FGF21), содержащий:
(a) константный домен IgG;
(b) линкерную последовательность, слитую с константным доменом IgG; и (c) мутант FGF21, слитый с линкерной последовательностью и содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, причем остаток лейцина в положении 98 заменен на остаток аргинина, а остаток пролина в положении 171 заменен на остаток глицина.
13. Выделенный гибридный полипептид по п.12, причем линкерная последовательность содержит GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23).
14. Выделенный гибридный полипептид по п.12, причем константный домен IgG содержит SEQ ID NO: 13.
15. Выделенный гибридный белок 12, причем линкерная последовательность содержит GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23) и константный домен IgG содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.
16. Выделенный гибридный полипептид 15, причем N-конец линкера слит с С-концом константного домена IgG, a N-конец мутанта FGF21 слит с С-концом линкера.
17. Выделенный гибридный полипептид по п.12, причем мутант FGF21 дополнительно содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, которая представляет собой:
(a) фенилаланин, пролин, аланин, серин или глицин в положении 179;
(b) глутаминовую кислоту, глицин, пролин или серин в положении 180; или (c) лизин, глицин, треонин, аланин, лейцин или пролин в положении 181.
18. Выделенный гибридный полипептид по п.12, причем мутант FGF21 дополнительно содержит 110 аминокислотных остатков, слитых с С-концом мутанта FGF21.
19. Выделенный гибридный полипептид по п.18, причем 1-10 аминокислотных остатков выбраны из группы, состоящей из глицина, пролина и их комбинаций.
20. Выделенный гибридный полипептид по п.12, способный понижать глюкозу в крови у млекопитающего, причем мутант FGF21 содержит:
(a) аминоконцевое усечение не более чем 8 аминокислотных остатков;
(b) карбоксиконцевое усечение не более чем 12 аминокислотных остатков; или (c) аминоконцевое усечение не более чем 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не более чем 12 аминокислотных остатков.
21. Гибридный полипептид, содержащий выделенный полипептид по любому из пп.1-11, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью.
22. Гибридный полипептид по п.21, в котором гетерологичная аминокислотная последовательность представляет собой константный домен IgG или его фрагмент.
23. Гибридный полипептид по п.22, в котором константный домен IgG содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.
24. Гибридный полипептид по п.23, в котором полипептид присоединен к константному домену IgG через линкер.
25. Гибридный полипептид по п.24, в котором линкер содержит GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 31).
26. Мультимер, содержащий два или более гибридных полипептида по любому из пп.12-20 либо два или более гидбридных полипептида по любому из пп.21-25.
27. Мультимер мутантных полипептидов FGF21, содержащий по меньшей мере первую и вторую цепь, причем первая цепь содержит:
(а.1) полипептид по п.6;
(b.l) линкерную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 31; и (с.1) домен Fc, содержащий SEQ ID NO: 13;
и вторая цепь содержит:
(а.2) полипептид по п.6;
(b.2) линкерную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 31; и
- 54 034847 (с.2) домен Fc, содержащий SEQ ID NO: 13.
28. Мультимер по п.27, представляющий собой димер.
29. Мультимер по п.28, причем полипептид (а.1) или (а.2) способен понижать глюкозу в крови у млекопитающего и содержит:
(a) аминоконцевое усечение не более чем 8 аминокислотных остатков;
(b) карбоксиконцевое усечение не более чем 12 аминокислотных остатков; или (c) аминоконцевое усечение не более чем 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не более чем 12 аминокислотных остатков.
30. Мультимер по п.28, причем полипептид ковалентно связан с одним или более полимеров.
31. Мультимер по п.28, причем полимер представляет собой ПЭГ.
32. Фармацевтическая композиция для лечения диабета, снижения уровней триглицеридов, улучшения переносимости глюкозы, снижения уровня глюкозы в крови, снижения уровня инсулина, снижения веса тела, лечения гепатостеатоза или лечения неалкогольного стеатогепатита (NASH), содержащая выделенный полипептид по любому из пп.1-11, выделенный гибридный полипептид по любому из пп.1220, гибридный полипептид по любому из пп.21-25 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
33. Фармацевтическая композиция по п.32, в которой вспомогательное вещество представляет собой гидрогель.
34. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по любому из пп. 1-11.
35. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.34.
36. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.34.
37. Способ лечения диабета, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.32.
38. Способ снижения уровней триглицеридов у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.32.
39. Способ улучшения толерантности к глюкозе у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.32.
40. Способ снижения уровня глюкозы в крови у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.32.
41. Способ снижения уровней инсулина у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.32.
42. Способ снижения массы тела у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции по п.32.
43. Способ лечения гепатостеатоза пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции по п.32.
44. Способ лечения неалкогольного стеатогепатита (NASH) пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции по п.32.
EA201690946A 2008-06-04 2009-06-03 Мутанты fgf21 и их применение EA034847B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5891908P 2008-06-04 2008-06-04
US5886108P 2008-06-04 2008-06-04
US16436409P 2009-03-27 2009-03-27
US17573609P 2009-05-05 2009-05-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201690946A1 EA201690946A1 (ru) 2017-05-31
EA034847B1 true EA034847B1 (ru) 2020-03-27

Family

ID=40984291

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201690946A EA034847B1 (ru) 2008-06-04 2009-06-03 Мутанты fgf21 и их применение
EA201001883A EA017690B1 (ru) 2008-06-04 2009-06-03 Мутанты fgf21 и их применение
EA201270758A EA024751B8 (ru) 2008-06-04 2009-06-03 Мутанты fgf21 и их применение

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201001883A EA017690B1 (ru) 2008-06-04 2009-06-03 Мутанты fgf21 и их применение
EA201270758A EA024751B8 (ru) 2008-06-04 2009-06-03 Мутанты fgf21 и их применение

Country Status (23)

Country Link
US (9) US8034770B2 (ru)
EP (1) EP2296690B1 (ru)
JP (5) JP2011523561A (ru)
KR (2) KR101787300B1 (ru)
CN (1) CN102143758B (ru)
AR (1) AR072009A1 (ru)
AU (1) AU2009256232B2 (ru)
BR (2) BRPI0911385B8 (ru)
CA (1) CA2726589C (ru)
CL (1) CL2010001346A1 (ru)
CO (1) CO6341566A2 (ru)
CR (1) CR11851A (ru)
EA (3) EA034847B1 (ru)
IL (1) IL209395A (ru)
JO (1) JOP20190083A1 (ru)
MA (1) MA33142B1 (ru)
MX (2) MX2010013333A (ru)
MY (1) MY152721A (ru)
NZ (1) NZ590050A (ru)
PE (1) PE20100253A1 (ru)
SG (1) SG193860A1 (ru)
TW (2) TWI526220B (ru)
WO (1) WO2009149171A2 (ru)

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101476472B1 (ko) 2007-03-30 2015-01-05 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
US9279013B2 (en) 2008-10-10 2016-03-08 Amgen Inc. FGF-21 mutants comprising polyethylene glycol and uses thereof
WO2010065439A1 (en) * 2008-12-05 2010-06-10 Eli Lilly And Company Variants of fibroblast growth factor 21
US20120052069A1 (en) 2009-05-05 2012-03-01 Amgen Inc Fgf21 mutants and uses thereof
CN107188950B (zh) 2009-05-05 2021-09-28 安姆根有限公司 Fgf21突变体及其用途
CA2764835A1 (en) 2009-06-17 2010-12-23 Amgen Inc. Chimeric fgf19 polypeptides and uses thereof
EP2493495A4 (en) * 2009-07-10 2013-08-21 Univ Northwestern HERZSCHÜTZENDE ROLE OF LIVER CELLS AND SEKRETORIC FACTORS FROM LIVER CELLS IN MYOCARDIAN EMERGENCE
CN101993485B (zh) * 2009-08-20 2013-04-17 重庆富进生物医药有限公司 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途
US8372952B2 (en) 2009-12-02 2013-02-12 Amgen Inc. Binding proteins that bind to human FGFR1C, human β-klotho and both human FGFR1C and human β-klotho
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
WO2011107494A1 (de) 2010-03-03 2011-09-09 Sanofi Neue aromatische glykosidderivate, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und deren verwendung
EP2558497A2 (en) 2010-04-15 2013-02-20 Amgen Inc. Human fgf receptor and beta-klotho binding proteins
CA2796459C (en) 2010-04-16 2016-05-24 Salk Institute For Biological Studies Methods for treating metabolic disorders using fgf-1
DE102010015123A1 (de) 2010-04-16 2011-10-20 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Benzylamidische Diphenylazetidinone, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und deren Verwendung
US8530413B2 (en) 2010-06-21 2013-09-10 Sanofi Heterocyclically substituted methoxyphenyl derivatives with an oxo group, processes for preparation thereof and use thereof as medicaments
TW201221505A (en) 2010-07-05 2012-06-01 Sanofi Sa Aryloxyalkylene-substituted hydroxyphenylhexynoic acids, process for preparation thereof and use thereof as a medicament
TW201215388A (en) 2010-07-05 2012-04-16 Sanofi Sa (2-aryloxyacetylamino)phenylpropionic acid derivatives, processes for preparation thereof and use thereof as medicaments
TW201215387A (en) 2010-07-05 2012-04-16 Sanofi Aventis Spirocyclically substituted 1,3-propane dioxide derivatives, processes for preparation thereof and use thereof as a medicament
AU2011293584B2 (en) 2010-08-23 2014-07-31 Amgen Inc. Sulfonylpiperazine derivatives that interact with glucokinase regulatory protein for the treatment of diabetes
BR112013011172A2 (pt) * 2010-11-05 2017-06-06 Covx Tech Ireland Ltd compostos antidiabéticos
CN102464712A (zh) * 2010-11-11 2012-05-23 重庆富进生物医药有限公司 缺失型人成纤维细胞生长因子21变异体及其偶联物
EP2694491A1 (en) 2011-04-05 2014-02-12 Amgen Inc. Benzodioxepine and benzodioxine compounds that interact with glucokinase regulatory protein for the treatment of diabetes
WO2012151349A1 (en) * 2011-05-03 2012-11-08 Liu Shu Q Neuroprotection by hepatic cells and hepatocyte secretory factors
SG10201806648TA (en) 2011-07-01 2018-09-27 Ngm Biopharmaceuticals Inc Compositions, uses and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
CA2845357A1 (en) * 2011-08-31 2013-03-07 Amgen Inc. Method of treating or ameliorating type 1 diabetes using fgf21
WO2013037390A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-styryl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
EP2567959B1 (en) 2011-09-12 2014-04-16 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-styryl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
UY34346A (es) * 2011-09-26 2013-04-30 Novartis Ag Proteínas de fusión para tratar trastornos metabólicos
EP2760862B1 (en) 2011-09-27 2015-10-21 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-alkyl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
AR087973A1 (es) 2011-10-04 2014-04-30 Lilly Co Eli Variantes del factor 21 del crecimiento de fibroblastos
CN102558358A (zh) * 2011-12-30 2012-07-11 张海涛 人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其突变体的制备与应用
WO2013123444A1 (en) 2012-02-17 2013-08-22 Amgen Inc. Sulfonyl compounds that interact with glucokinase regulatory protein
US9475856B2 (en) 2012-03-02 2016-10-25 New York University Chimeric FGF21 proteins with enhanced binding affinity for β-klotho for the treatment of type II diabetes, obesity, and related metabolic disorders
WO2013173382A1 (en) 2012-05-15 2013-11-21 Amgen Inc. Benzothiophene sulfonamides and other compounds that interact with glucokinase regulatory protein
MX349035B (es) 2012-05-17 2017-07-07 Extend Biosciences Inc Portadores para el suministro mejorado de farmaco.
US9474785B2 (en) 2012-06-07 2016-10-25 New York University Chimeric fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use
US9657075B2 (en) 2012-06-07 2017-05-23 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
US9464126B2 (en) 2012-06-07 2016-10-11 New York University Chimeric fibroblast growth factor 21 proteins and methods of use
TWI513705B (zh) * 2012-06-11 2015-12-21 Lilly Co Eli 纖維母細胞生長因子２１蛋白質
CA2871656A1 (en) * 2012-06-11 2013-12-19 Eli Lilly And Company Fibroblast growth factor 21 variants
TW201420606A (zh) * 2012-08-22 2014-06-01 Lilly Co Eli 同源二聚體蛋白
US9963494B2 (en) 2012-11-28 2018-05-08 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of using compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides for reducing glucose levels in a subject
US9290557B2 (en) 2012-11-28 2016-03-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides
CN105008548B (zh) 2012-12-27 2020-11-27 恩格姆生物制药公司 用于调节胆汁酸体内稳态以及治疗胆汁酸紊乱和疾病的方法
US9273107B2 (en) 2012-12-27 2016-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
WO2014130659A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
WO2014149699A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Eli Lilly And Company Bifunctional protein
CN103191415A (zh) * 2013-04-03 2013-07-10 哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司 成纤维细胞生长因子-21成熟肽在制备治疗高血压的药物中的应用
WO2015057908A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Novartis Ag Methods of treating diabetes and related disorders
WO2015061331A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 Salk Institute For Biological Studies Chimeric fibroblast growth factor (fgf) 2/fgf1 peptides and methods of use
EP3060238A4 (en) 2013-10-21 2017-06-07 Salk Institute for Biological Studies Mutated fibroblast growth factor (fgf) 1 and methods of use
MX2016004822A (es) 2013-10-28 2016-08-17 Ngm Biopharmaceuticals Inc Modelos de cancer y metodos asociados.
LT3097122T (lt) 2014-01-24 2020-07-27 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Antikūnai, surišantys beta kloto domeną 2, ir jų panaudojimo būdai
JP6712230B2 (ja) 2014-03-11 2020-06-17 ノバルティス アーゲー リポジストロフィーおよびインスリン産生の欠損またはインスリンシグナル伝達の欠損と関連する代謝性障害を処置する方法
US10519240B2 (en) 2014-03-25 2019-12-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-FGFR1c antibody-FGF21 fusion proteins
US10398758B2 (en) 2014-05-28 2019-09-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants of FGF19 polypeptides and uses thereof for the treatment of hyperglycemic conditions
CA2951153A1 (en) 2014-06-16 2015-12-23 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
US9585934B2 (en) 2014-10-22 2017-03-07 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin D conjugates
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
WO2016065052A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin d conjugates
IL251834B2 (en) 2014-10-23 2023-09-01 Ngm Biopharmaceuticals Inc Pharmaceutical compositions containing peptide variants and methods of using them
KR102637699B1 (ko) 2014-10-24 2024-02-19 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 변형된 fgf-21 폴리펩티드 및 그의 용도
WO2016073855A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders
RU2729011C2 (ru) 2014-12-23 2020-08-03 Ново Нордиск А/С Производные fgf21 и их применения
KR20160088656A (ko) 2015-01-16 2016-07-26 주식회사유한양행 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
US11638745B2 (en) 2015-05-20 2023-05-02 University of Pittsburgh—Of the Commonwealth Cvctom of Hierher Education Method to improve neurologic outcomes in temperature managed patients
US10800843B2 (en) 2015-07-29 2020-10-13 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Beta klotho-binding proteins
KR20170049319A (ko) * 2015-10-28 2017-05-10 주식회사유한양행 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
KR20170049320A (ko) 2015-10-28 2017-05-10 주식회사유한양행 이중 작용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
CA3002400A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Salk Institute For Biological Studies Treatment of steroid-induced hyperglycemia with fibroblast growth factor (fgf) 1 analogs
CA3003616C (en) 2015-11-09 2020-07-28 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders
TW201731867A (zh) 2015-12-02 2017-09-16 賽諾菲公司 Ｆｇｆ２１變異體
WO2017116207A1 (ko) * 2015-12-31 2017-07-06 한미약품 주식회사 Fgf21 아날로그, fgf21 결합체, 및 이의 용도
EP3442997A2 (en) 2016-04-15 2019-02-20 Indiana University Research & Technology Corporation Fgf21 c-terminal peptide optimization
JP7144402B2 (ja) 2016-08-01 2022-09-29 ホープ・メディシン（ナンジン）・カンパニー・リミテッド Ｍｇ５３突然変異体、その作製方法、およびその使用
CN106279437B (zh) 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
US11123438B2 (en) 2016-08-19 2021-09-21 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Linker peptide for constructing fusion protein
CN107759696A (zh) 2016-08-19 2018-03-06 安源医药科技（上海）有限公司 人白介素7融合蛋白及其制备方法
AU2017315459B2 (en) 2016-08-26 2023-06-29 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating fibroblast growth factor 19-mediated cancers and tumors
CN110121355B (zh) 2016-11-10 2023-09-12 株式会社柳韩洋行 用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的包含融合蛋白的药物组合物
EP3558341A1 (en) 2016-12-22 2019-10-30 Sanofi Fgf21 compound / glp-1r agonist combinations with optimized activity ratio
CN108619490A (zh) * 2017-03-22 2018-10-09 天士力医药集团股份有限公司 一种长效化突变的人源成纤维生长因子的新用途
JP7191850B2 (ja) * 2017-04-21 2022-12-19 ユーハン・コーポレイション デュアル機能タンパク質およびその誘導体を生産するための方法
CN107056925B (zh) * 2017-04-28 2022-01-14 中国科学院合肥物质科学研究院 人fgf21突变体、其制备方法及用途
WO2019010314A1 (en) 2017-07-06 2019-01-10 Yale University COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING OR PREVENTING ENDOCRINE FGF-RELATED DISEASES
MX2020002206A (es) 2017-09-08 2020-07-20 Bristol Myers Squibb Co Factor de crecimiento de fibroblastos 21 (fgf-21) modificado para usarse en metodos para tratar la esteatohepatitis no alcoholica (nash).
CN115109166A (zh) * 2017-11-24 2022-09-27 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的多结构域活性蛋白
WO2019119673A1 (zh) 2017-12-19 2019-06-27 北京吉源生物科技有限公司 一种双基因修饰的干细胞及其用途
US11679143B2 (en) 2018-02-08 2023-06-20 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. FGF21 variant, fusion protein and application thereof
PE20210632A1 (es) 2018-07-03 2021-03-23 Bristol Myers Squibb Co Formulaciones de fgf-21
US11427623B1 (en) 2019-05-28 2022-08-30 89Bio Ltd. Methods of treatment using mutant FGF-21 peptide conjugates
US11542309B2 (en) 2019-07-31 2023-01-03 Salk Institute For Biological Studies Fibroblast growth factor 1 (FGF1) mutant proteins that selectively activate FGFR1B to reduce blood glucose
BR112022013172A2 (pt) 2020-01-08 2022-09-13 Bristol Myers Squibb Co Formulações de conjugados de fgf-21
JP7392491B2 (ja) 2020-01-21 2023-12-06 トヨタ自動車株式会社 電源システム
JP2023538533A (ja) 2020-08-07 2023-09-08 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 線維症の処置のための、ｃｃｒ２／５拮抗剤と組み合わせたｆｇｆ２１
WO2022115597A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating liver diseases
GB202403250D0 (en) 2021-09-08 2024-04-17 Leto Laboratories Co Ltd Fgf21 mutant protein and use thereof
WO2023064808A1 (en) 2021-10-13 2023-04-20 Akero Therapeutics, Inc. Pharmaceutical compositions of efruxifermin
CN113980147B (zh) * 2021-11-26 2023-07-28 中国药科大学 一种聚多肽与fgf21融合蛋白突变体及其应用
WO2023173021A2 (en) * 2022-03-11 2023-09-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions for the treatment of alcohol toxicity
WO2024059507A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 Akero Therapeutics, Inc. Fgf21 mutant polypeptides

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001038357A2 (en) * 1999-11-22 2001-05-31 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Jaffa, a novel fibroblast growth factor family member and uses therefor

Family Cites Families (177)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4436366A (en) 1981-02-17 1984-03-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company End capping an optical fiber
AR230173A1 (es) 1981-06-29 1984-03-01 American Cyanamid Co Instrumento para ligaciones quirurgicas
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DE3478642D1 (en) 1983-07-29 1989-07-13 Mitsubishi Electric Corp Solid state overcurrent detector
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4615885A (en) 1983-11-01 1986-10-07 Terumo Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition containing urokinase
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
CA1310924C (en) 1986-04-24 1992-12-01 Francis P. Mccormick Infective drug delivery system
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4970154A (en) 1987-10-09 1990-11-13 Baylor College Of Medicine Method for inserting foreign genes into cells using pulsed radiofrequency
EP0315456B1 (en) 1987-11-05 1994-06-01 Hybritech Incorporated Polysaccharide-modified immunoglobulins having reduced immunogenic potential or improved pharmacokinetics
US5158881A (en) 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US5106627A (en) 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5011472A (en) 1988-09-06 1991-04-30 Brown University Research Foundation Implantable delivery system for biological factors
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
EP0401384B1 (en) 1988-12-22 1996-03-13 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5288855A (en) * 1989-01-23 1994-02-22 Farmitalia Carlo Erba Extracellular form of the human fibroblast growth factor receptor
WO1991000916A2 (en) * 1989-07-06 1991-01-24 The Regents Of The University Of California Receptors for fibroblast growth factors
US5676954A (en) 1989-11-03 1997-10-14 Vanderbilt University Method of in vivo delivery of functioning foreign genes
JP3501286B2 (ja) 1989-12-22 2004-03-02 アプライド リサーチ システムズ，エーアールエス ホールディング ナームロゼ ベノートスハップ 一定の細胞系又は微生物の内因性遺伝子の発現特徴の変性のための方法
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
WO1991010470A1 (en) 1990-01-08 1991-07-25 Brown University Research Foundation Devices and methods for enhanced delivery of active factors
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5672510A (en) 1990-01-19 1997-09-30 Genetic Therapy, Inc. Retroviral vectors
DE69133281T2 (de) 1990-07-06 2004-05-06 Gencell S.A. Rezeptoren der wachstumsfaktoren aus fibroblasten
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5217889A (en) 1990-10-19 1993-06-08 Roninson Igor B Methods and applications for efficient genetic suppressor elements
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5229501A (en) 1991-01-11 1993-07-20 Chiron Corporation Expression and use of human fibroblast growth factor receptor
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
IL100219A0 (en) 1991-12-02 1992-09-06 Yeda Res & Dev Variable region within fibroblast growth factor receptors that confers ligand specificity
US5470582A (en) 1992-02-07 1995-11-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous polymeric microparticles
US5234784A (en) 1992-04-01 1993-08-10 Eastman Kodak Company Method of making a projection viewable transparency comprising an electrostatographic toner image
US5364791A (en) 1992-05-14 1994-11-15 Elisabetta Vegeto Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations
ES2091018T3 (es) * 1992-06-18 1996-10-16 Whittier Inst Diabetes & Endoc Procedimiento para la deteccion de enfermedades neoplasicas.
CA2140638C (en) 1992-07-24 2010-05-04 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
US5474914A (en) 1992-07-29 1995-12-12 Chiron Corporation Method of producing secreted CMV glycoprotein H
US5489743A (en) 1993-01-19 1996-02-06 Amgen Inc. Transgenic animal models for thrombocytopenia
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
JPH11501201A (ja) 1993-05-07 1999-02-02 スターリング ウィンスロップ インコーポレイティド ラクトース加水分解牛乳及び味を改善し甘味を抑えた乳製品
US6664107B1 (en) 1993-05-26 2003-12-16 Ontario Cancer Institute, University Health Network CD45 disrupted nucleic acid
CA2161015A1 (en) 1993-05-26 1994-12-08 Tak Wah Mak Transgenic mammals lacking expression of particular cd45 isoforms
US5650298A (en) 1993-06-14 1997-07-22 Basf Aktiengesellschaft Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
US5589362A (en) 1993-06-14 1996-12-31 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline regulated transcriptional modulators with altered DNA binding specificities
US5654168A (en) 1994-07-01 1997-08-05 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline-inducible transcriptional activator and tetracycline-regulated transcription units
AU7568094A (en) 1993-08-12 1995-03-14 Cytotherapeutics, Inc. Improved compositions and methods for the delivery of biologically active molecules using genetically altered cells contained in biocompatible immunoisolatory capsules
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5484720A (en) 1994-09-08 1996-01-16 Genentech, Inc. Methods for calcium phosphate transfection
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JPH11506319A (ja) 1995-05-26 1999-06-08 ゼネカ・リミテッド エクジソンレセプターを含む遺伝子スイッチ
CA2222550A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
US5849303A (en) 1995-06-07 1998-12-15 American Home Products Corporation Recombinant feline Immunodeficiency virus subunit vaccines employing baculoviral-expressed envelope glycoproteins derived from isolate NCSU-1 and their use against feline immunodeficiency virus infection
WO1996041865A1 (en) 1995-06-07 1996-12-27 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Rapamcycin-based regulation of biological events
AU731826B2 (en) 1996-02-28 2001-04-05 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Synthetic Multimerizing Agents
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US5679559A (en) 1996-07-03 1997-10-21 University Of Utah Research Foundation Cationic polymer and lipoprotein-containing system for gene delivery
US6214795B1 (en) * 1996-11-12 2001-04-10 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Peptide compounds useful for modulating FGF receptor activity
EP0945506B1 (en) 1996-12-26 2007-02-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Proteine avec une activite de suppression du vieillissement
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
AU733222B2 (en) 1997-11-25 2001-05-10 Genentech Inc. Fibroblast growth factor-19
US6150098A (en) 1998-02-20 2000-11-21 Amgen Inc. Methods for identifying novel secreted mammalian polypeptides
ZA200007412B (en) 1998-05-15 2002-03-12 Imclone Systems Inc Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases.
NL1010174C1 (nl) 1998-09-24 2000-03-27 Busschers Metaalbedrijf Bv Inrichting en werkwijze voor het buigen van buisvormig en staafvormig materiaal.
US6548634B1 (en) 1998-09-30 2003-04-15 Chiron Corporation Synthetic peptides having FGF receptor affinity
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6369109B1 (en) 1998-10-28 2002-04-09 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts Betulinic acid and derivatives thereof useful for the treatment of neuroectodermal tumor
WO2000027885A1 (fr) 1998-11-05 2000-05-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Nouveau popypeptide chimerique
AU3224700A (en) 1999-02-08 2000-08-25 Chiron Corporation Fibroblast growth factor receptor-immunoglobulin fusion
WO2000054813A2 (en) 1999-03-15 2000-09-21 Chiron Corporation Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing diseases of the eye
CA2311201A1 (en) 1999-08-05 2001-02-05 Genset S.A. Ests and encoded human proteins
US7459540B1 (en) 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
US7408047B1 (en) 1999-09-07 2008-08-05 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
AU7368100A (en) 1999-09-10 2001-04-10 Curagen Corporation Fibroblast growth factor polypeptide and nucleic acids encoding same
WO2001032678A1 (en) 1999-11-05 2001-05-10 Smithkline Beecham Corporation sbgFGF-19a
US6254671B1 (en) 1999-11-15 2001-07-03 Engelhard Corporation Very green-shade yellow metallized disazo pigment
PT1232264E (pt) 1999-11-18 2009-11-26 Novartis Vaccines & Diagnostic Gene fgf-21 humano e produtos da expressão do gene
US6716626B1 (en) 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
US7108984B2 (en) 2000-01-12 2006-09-19 Mount Sinai School Of Medicine Methods of identifying modulators of the FGF receptor
US20020081663A1 (en) 2000-01-05 2002-06-27 Conklin Darrell C. Novel FGF homolog ZFGF11
WO2001049849A1 (en) 2000-01-05 2001-07-12 Zymogenetics, Inc. Novel fgf homolog zfgf11
US20020001825A1 (en) 2000-03-31 2002-01-03 Nobuyuki Itoh Fibroblast growth factor-like molecules and uses thereof
JP2002112772A (ja) 2000-07-10 2002-04-16 Takeda Chem Ind Ltd 新規ポリペプチドおよびそのｄｎａ
IL139380A0 (en) 2000-10-31 2001-11-25 Prochon Biotech Ltd Active variants of fibroblast growth factor
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20060223114A1 (en) 2001-04-26 2006-10-05 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
US20040018499A1 (en) 2001-06-06 2004-01-29 Lal Preeti G Extracellular messengers
WO2002102854A2 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Morphosys Ag Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
NZ530545A (en) 2001-07-11 2006-10-27 Maxygen Holdings Ltd Specific conjugates comprising a polypeptide exhibiting G-CSF activity and a non-polypeptide moiety
US20040259780A1 (en) 2001-07-30 2004-12-23 Glasebrook Andrew Lawrence Method for treating diabetes and obesity
US20050187150A1 (en) 2001-10-31 2005-08-25 New York University Structure-based design and synthesis of FGF inhibitors and FGF modulator compounds
AU2003201810A1 (en) 2002-01-15 2003-07-30 Eli Lilly And Company Method for reducing morbidity and mortality in critically ill patients
EP1332761A1 (en) 2002-01-31 2003-08-06 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Agonists of fibroblast growth factor receptors (FGFR)
ES2363765T3 (es) 2002-01-31 2011-08-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Agonistas de fgfr.
IL149562A0 (en) 2002-05-09 2002-11-10 Prochon Ltd Fgf variants and methods for use thereof
JP2003334088A (ja) 2002-05-22 2003-11-25 Pharma Design Inc ヒト由来の新規Ｋｌｏｔｈｏ様タンパク質及びその遺伝子
AU2003265057A1 (en) 2002-09-04 2004-03-29 Abtech Anti-idiotypic antibodies as vegf or fgf agonists for bone therapy
EP1578367A4 (en) 2002-11-01 2012-05-02 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF IMMUNE DISEASES
US20060281130A1 (en) 2002-12-20 2006-12-14 Elisabeth Bock Metod of modulation of interaction between receptor and ligand
TWI300430B (en) 2003-01-10 2008-09-01 Ritek Corp Optical recording medium dye and optical recording medium using thereof
WO2004083381A2 (en) 2003-03-13 2004-09-30 Indiana University Advanced Research & Technology Institute Fibroblast growth factor receptor-1 polynucleotides, polypeptides, and mutants
JP2006240990A (ja) 2003-05-15 2006-09-14 Kirin Brewery Co Ltd ｋｌｏｔｈｏタンパク質および抗ｋｌｏｔｈｏタンパク質抗体ならびにそれらの用途
SI1641823T1 (sl) 2003-06-12 2011-12-30 Lilly Co Eli Fuzijski proteini analogni glp-1
ES2298785T3 (es) 2003-06-12 2008-05-16 Eli Lilly And Company Proteinas de fusion.
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
JP4049723B2 (ja) 2003-09-04 2008-02-20 沖電気工業株式会社 窒化物半導体素子の製造方法及び窒化物半導体素子の製造装置
EP2229955A1 (en) 2003-10-16 2010-09-22 Imclone LLC Fibroblast growth factor receptor-1 inhibitors and methods of treatment using the same
KR20060135648A (ko) 2003-12-10 2006-12-29 일라이 릴리 앤드 캄파니 섬유모세포 성장인자 21의 뮤테인
WO2005066211A2 (en) 2003-12-19 2005-07-21 Five Prime Therapeutics, Inc. Fibroblast growth factor receptors 1, 2, 3, and 4 as targets for therapeutic intervention
WO2005072769A1 (en) 2004-01-26 2005-08-11 Eli Lilly And Company Use of fgf-21 and thiazolidinedione for treating type 2 diabetes
CA2557782A1 (en) 2004-03-17 2005-10-06 Eli Lilly And Company Glycol linked fgf-21 compounds
JP4505631B2 (ja) 2004-03-31 2010-07-21 独立行政法人産業技術総合研究所 ヘパラン硫酸糖鎖を付加したヘパリン結合性タンパク質、その製造方法及びそれを含有する医薬組成物
SI1751184T1 (sl) 2004-05-13 2010-01-29 Lilly Co Eli Fgf-21 fuzijski proteini
EP1789443A1 (en) 2004-09-02 2007-05-30 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
DE602005016946D1 (de) * 2004-09-02 2009-11-12 Lilly Co Eli Muteine des fibroblasten-wachstumsfaktors 21
EP3090753A1 (en) 2004-10-07 2016-11-09 The Regents of The University of California Analogs of shk toxin and their uses in selective inhibition of kv1.3 potassium channels
WO2006050247A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
WO2006065582A2 (en) 2004-12-14 2006-06-22 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
US20080261875A1 (en) 2005-01-21 2008-10-23 Eli Lilly And Company Method For Treating Cardiovascular Disease
US20060193299A1 (en) * 2005-02-25 2006-08-31 Cicso Technology, Inc., A California Corporation Location-based enhancements for wireless intrusion detection
JP2006246823A (ja) 2005-03-11 2006-09-21 Kyoto Univ 造血因子としてのＦｇｆ２１の使用
WO2006130527A2 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Novartis Ag Mutations and polymorphisms of fibroblast growth factor receptor 1
WO2007014123A2 (en) 2005-07-22 2007-02-01 Five Prime Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating disease with fgfr fusion proteins
CA2619577A1 (en) 2005-08-15 2007-02-22 Genentech, Inc. Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
US7395962B2 (en) 2005-10-28 2008-07-08 United Parcel Service Of America, Inc. Pick up notice and method of using same
WO2007055789A2 (en) 2005-10-31 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Expression of soluble therapeutic proteins
WO2007056789A1 (en) 2005-11-16 2007-05-24 Dier Corporation As Trustee For The Reid Family Superannuation Trust New frame assemblies for security screens
AU2007221177A1 (en) 2006-02-28 2007-09-07 Trustees Of Boston University Methods to identify factors associated with muscle growth and uses thereof
WO2007110079A2 (en) * 2006-03-29 2007-10-04 Enkam Pharmaceuticals A/S Targeted delivery of fgfr ligands into the brain
EP2046384A4 (en) 2006-06-15 2009-12-02 Fibron Ltd ANTIBODIES BLOCKING FIBROBLAST GROWTH FACTOR RECEPTOR ACTIVATION AND METHODS OF USING THE SAME
ES2516694T3 (es) 2006-07-21 2014-10-31 Ratiopharm Gmbh Glicosilación de péptidos a través de secuencias de glicosilación con unión en O
WO2008057683A2 (en) 2006-10-03 2008-05-15 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
SG177225A1 (en) 2006-12-01 2012-01-30 Agency Science Tech & Res Cancer-related protein kinases
KR101476472B1 (ko) 2007-03-30 2015-01-05 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도
AU2008275559B2 (en) 2007-04-02 2014-04-10 Genentech, Inc. Klotho-beta for use in treating cancer, liver disorders, gallstones, wasting syndrome and obesity-related diseases
US8697369B2 (en) 2007-04-06 2014-04-15 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Method for screening a test substance for activating a receptor associated with FGF 21 activity
US7537903B2 (en) 2007-04-23 2009-05-26 Board Of Regents, The University Of Texas System FGF21 upregulates expression of GLUT-1 in a βklotho-dependent manner
EP2152295B1 (en) 2007-05-08 2018-04-18 Tel HaShomer Medical Research Infrastructure and Services Ltd. Klotho protein and related compounds for the treatment of cancer
JP2010529954A (ja) 2007-05-22 2010-09-02 ノバルティス アーゲー Ｆｇｆ２１関連障害を処置、診断および検出する方法
US8481497B2 (en) 2007-05-29 2013-07-09 Sapporo Medical University Therapeutic agent for cancer, and method for treatment of cancer
US20110177029A1 (en) 2007-06-04 2011-07-21 Novo Nordisk A/S O-linked glycosylation using n-acetylglucosaminyl transferases
WO2009020802A2 (en) 2007-08-03 2009-02-12 Eli Lilly And Company Treatment for obesity
GB2464062A (en) 2007-08-08 2010-04-07 Foster Miller Inc Watercraft drogue system
US8426396B2 (en) 2008-01-08 2013-04-23 Shriners Hospitals For Children Treatment for achondroplasia
TW200936156A (en) 2008-01-28 2009-09-01 Novartis Ag Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides
WO2009117622A2 (en) 2008-03-19 2009-09-24 Ambrx, Inc. Modified fgf-23 polypeptides and their uses
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
WO2010006214A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 Ambrx, Inc. Fgf-21 neutralizing antibodies and their uses
EP2318529B1 (en) 2008-08-04 2017-10-18 Five Prime Therapeutics, Inc. Fgfr extracellular domain acidic region muteins
US9279013B2 (en) * 2008-10-10 2016-03-08 Amgen Inc. FGF-21 mutants comprising polyethylene glycol and uses thereof
CN107188950B (zh) 2009-05-05 2021-09-28 安姆根有限公司 Fgf21突变体及其用途
US20120052069A1 (en) 2009-05-05 2012-03-01 Amgen Inc Fgf21 mutants and uses thereof
CA2764835A1 (en) 2009-06-17 2010-12-23 Amgen Inc. Chimeric fgf19 polypeptides and uses thereof
RU2573896C2 (ru) 2009-10-15 2016-01-27 Дженентек, Инк. Химерные факторы роста фибробластов с измененной рецепторной специфичностью
US8372952B2 (en) 2009-12-02 2013-02-12 Amgen Inc. Binding proteins that bind to human FGFR1C, human β-klotho and both human FGFR1C and human β-klotho
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
EP2558497A2 (en) 2010-04-15 2013-02-20 Amgen Inc. Human fgf receptor and beta-klotho binding proteins
US9023791B2 (en) 2010-11-19 2015-05-05 Novartis Ag Fibroblast growth factor 21 mutations
SG10201806648TA (en) 2011-07-01 2018-09-27 Ngm Biopharmaceuticals Inc Compositions, uses and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
EP2548570A1 (en) 2011-07-19 2013-01-23 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
CA2845357A1 (en) * 2011-08-31 2013-03-07 Amgen Inc. Method of treating or ameliorating type 1 diabetes using fgf21
CN105008548B (zh) 2012-12-27 2020-11-27 恩格姆生物制药公司 用于调节胆汁酸体内稳态以及治疗胆汁酸紊乱和疾病的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001038357A2 (en) * 1999-11-22 2001-05-31 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Jaffa, a novel fibroblast growth factor family member and uses therefor

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BITONTI Alan J. et al. Pulmonary delivery of an erythropoirtin Fc fusion protein in non-human primates through an immunoglobulin transport pathway. PNAS, 2004, Vol. 101, no. 26, pp. 9763-9768 *
GOETZ Regina et al. Molecular insights into the klotho-dependent, endocrine mode of action of fibroblast growth factor 19 subfamily members. Molecular and Cellular Biology, May 2007, p. 3417-3428 *
KHARITONENKOV Alexei et al. FGF-21 as a novel metabolic regulator. The J. Clinical Investigation, 2005, Vol. 115, Number 6, June 2005, p. 1627-1635 *
SHAN Daming et al. Characterization of scFv-Ig constructs generated from the Anti-CD20 mAb 1F5 using linker peptides of varying lengths. The American Association of Immunologists, 1999, 162, pp. 6589-6595 *

Also Published As

Publication number Publication date
US11072640B2 (en) 2021-07-27
CA2726589C (en) 2017-06-13
JP6960832B2 (ja) 2021-11-05
EA201001883A1 (ru) 2011-06-30
TWI403519B (zh) 2013-08-01
US20210317176A1 (en) 2021-10-14
MA33142B1 (fr) 2012-03-01
CR11851A (es) 2011-05-13
JP2011523561A (ja) 2011-08-18
US20120093815A1 (en) 2012-04-19
TW201219052A (en) 2012-05-16
KR20110025810A (ko) 2011-03-11
EA024751B8 (ru) 2020-01-31
EP2296690A2 (en) 2011-03-23
US8361963B2 (en) 2013-01-29
CA2726589A1 (en) 2009-12-10
US20090305986A1 (en) 2009-12-10
JP7191076B2 (ja) 2022-12-16
AU2009256232B2 (en) 2011-12-22
AU2009256232A1 (en) 2009-12-10
IL209395A (en) 2014-08-31
AR072009A1 (es) 2010-07-28
US8410051B2 (en) 2013-04-02
JP2019187417A (ja) 2019-10-31
MY152721A (en) 2014-11-28
BRPI0911385B8 (pt) 2021-09-14
JP2018082699A (ja) 2018-05-31
JP6810190B2 (ja) 2021-01-06
EA017690B1 (ru) 2013-02-28
KR101787300B1 (ko) 2017-10-18
CN102143758A (zh) 2011-08-03
US20160168223A1 (en) 2016-06-16
JOP20190083A1 (ar) 2017-06-16
WO2009149171A4 (en) 2010-05-06
US20240076333A1 (en) 2024-03-07
CO6341566A2 (es) 2011-11-21
PE20100253A1 (es) 2010-04-10
US20190023757A1 (en) 2019-01-24
KR101651697B1 (ko) 2016-08-29
BRPI0911385B1 (pt) 2021-04-13
TWI526220B (zh) 2016-03-21
WO2009149171A3 (en) 2010-03-11
NZ590050A (en) 2012-08-31
BR122020010972B1 (pt) 2021-05-18
TW201010715A (en) 2010-03-16
EA201270758A1 (ru) 2013-12-30
BRPI0911385A2 (pt) 2019-03-26
MX346396B (es) 2017-03-16
US20140243503A1 (en) 2014-08-28
JP6250714B2 (ja) 2017-12-20
US20120003216A1 (en) 2012-01-05
EP2296690B1 (en) 2016-11-30
EA201690946A1 (ru) 2017-05-31
MX2010013333A (es) 2011-04-05
EA024751B1 (ru) 2016-10-31
US20120087920A1 (en) 2012-04-12
IL209395A0 (en) 2011-01-31
WO2009149171A2 (en) 2009-12-10
CN102143758B (zh) 2015-11-25
JP2021052780A (ja) 2021-04-08
KR20160046929A (ko) 2016-04-29
US11840558B2 (en) 2023-12-12
JP2016128449A (ja) 2016-07-14
SG193860A1 (en) 2013-10-30
US8642546B2 (en) 2014-02-04
US8034770B2 (en) 2011-10-11
CL2010001346A1 (es) 2011-06-03
US10011642B2 (en) 2018-07-03
US9273106B2 (en) 2016-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7191076B2 (ja) Ｆｇｆ２１突然変異体及びその使用
US8835385B2 (en) FGF21 polypeptides comprising two or more mutations and uses thereof
US20120052069A1 (en) Fgf21 mutants and uses thereof
AU2014202582A1 (en) FGF21 mutants and uses thereof