MX2010013333A - Mutantes fgf21 y usos de los mismos. - Google Patents

Mutantes fgf21 y usos de los mismos.

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Jing Xu
Jeonghoon Sun
Edward John Belouski
Murielle Marie Ellison
Agnes Eva Hamburger
Randy Ira Hecht
Mark Leo Michaels
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Abstract

La invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos mutantes FGF21, polipéptidos mutantes FGF21, composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos mutantes FGF21, y métodos para tratar trastornos metabólicos usando estos ácidos nucleicos, polipéptidos, o composiciones farmacéuticas.

Description

MUTANTES FGF21 Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que · codifican polipéptidos mutantes FGF21, polipéptidos mutantes FGF21, composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos mutantes FGF21 y métodos para tratar trastornos metabólicos usando estos ácidos nucleicos, polipéptidos o composiciones farmacéuticas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El FGF21 es un polipéptido secretado que pertenece a .una subfamilia de factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs) ¾ue incluye FGF19, FGF21, y FGF23 (Itoh y colaboradores, 2004, Trend Genet. 20: 563-69) . El FGF21 es un FGF atipico en que es independiente de heparina y funciona como una hormona en la regulación del metabolismo de glucosa, lipidos y energía.
El FGF21 se aisló de una biblioteca de ADNc del hígado como un factor secretado hepático. Se expresa altamente en el hígado y el páncreas y es el único miembro de la familia FGF que se expresa principalmente en el hígado. Ratones transgénicos que sobreexpresan FGF21 exhiben fenotipos metabólicos de tasa de crecimiento lento, glucosa baja en el plasma y niveles de triglicéridos , y una ausencia de diabetes tipo 2 diabetes asociada con la edad, hiperplasia de los islotes, y obesidad. La administración farmacológica de la proteina FGF21 recombinante en modelos de roedor y primate da por resultado niveles normalizados de glucosa en el, niveles de triglicéridos y colesterol reducidos, y tolerancia a la glucosa mejorada y sensibilidad a la insulina. Además, el FGF21 reduce el peso corporal y la grasa corporal al incrementar el gasto de energía, actividad física y tasa metabólica. La investigación experimental proporciona apoyo para la administración farmacológica del FGF21 para el tratamiento de la diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia y otras condiciones o trastornos metabolicos en humanos.
El FGF21 humano tiene una vida media corta in vivo. En los ratones, la vida media del FGF21 humano es de 1 a 2 horas, y en monos cynomolgus, la vida media es de 2.5 a 3 horas. En el desarrollo de una proteína FGF21 para el uso como un agente terapéutico en el tratamiento de la diabetes tipo 2, sería deseable un incremento en la vida media. Las proteínas FGF21 que tienen una vida media mejorada permitirían una dosificación menos frecuente a los pacientes que se les administra la proteína. Estas proteínas se describen en este documento.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente descripción proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, que comprende además la sustitución de cualquier aminoácido . para : el residuo de alanina en la posición 45, el residuo de leucina en la posición 86, el residuo de leucina en la posición 98, el residuo de alanina en la posición 111, el residuo de alanina en la posición 129, el residuo de glicina en la posición 170, el residuo de prolina en la posición 171. o el residuo de serina en la posición 172, y combinaciones de los mismos. En una modalidad el polipéptido aislado comprende la sustitución de cualquier aminoácido para: el residuo de leucina en la posición 98, el residuo de prolina en la posición 171 o ambos del residuo de leucina en la posición 98 y el residuo de prolina en la posición 171. En otra modalidad el polipéptido aislado comprende la sustitución de cualquier aminoácido para tanto el residuo de leucina en la posición 98 como el residuo de prolina en la posición 171.
La presente descripción también proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 que tiene: (a) por lo menos una sustitución de aminoácidos que es: (i) una glutamina, isoleucina, o residuo de lisina en la posición 19; (ii) un residuo de histidina, leucina, o fenilalanina en la posición 20; (iii) un residuo de isoleucina, fenilalanina, tirosina, o valina en la posición 21; (iv) un residuo de isoleucina, fenilalanina, o valina en la posición 22; (v) un residuo de alanina o arginina en la posición 150; (vi) un residuo de alanina o valina en la posición 151; . (vii) un residuo de histidina, leucina, fenilalanina, o valina en la posición 152; (viii) un residuo de alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, ácido glutámico, glutamina, prolina, o serina en la posición 170; (ix) un residuo de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, lisina, serina, treonina, triptófano, o tirosina en la posición 171; (x) un residuo de leucina o treonina en la posición 172; o (xi) un residuo de arginina o ácido glutámico en la posición 173; y (b) por lo menos, una sustitución de aminoácidos que es: (i) un residuo de arginina, ácido glutámico, o lisina en la posición 26; (ii) un residuo de arginina, ácido glutámico, glutamina, lisin , o treonina en la posición 45; (iii) un residuo de treonina en la posición 52; (iv) un residuo de cisteina, ácido glutámico, glicina, o serina en la posición 58; (v) un residuo de alanina, arginina, ácido glutámico, o lisina en la posición 60; (vi) un residuo de alanina, arginina, cisteina, o histidina en la posición 78; (vii) un residuo de cisteina o treonina en la posición 86; (viii) un residuo de alanina, arginina, ácido glutámico, lisina, o serina en la posición 88; · (ix) un residuo de arginina, cisteina, ácido glutámico, glutamina, lisina, o treonina en la posición 98; (x) un residuo de arginina, ácido aspártico, cisteina, o ácido glutámico en la posición 99; (xi) un residuo de lisina o treonina en la posición 111; (xii) un residuo de arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, glutamina, histidina, o lisina en la posición 129; o (xiii) un residuo de arginina, ácido glutámico, histidina, lisina, o tirosina en la posición 134; y combinaciones de los mismos. En una modalidad el residuo en la posición 98 es arginina y el residuo en la posición 171 es prolina, y en otra modalidad el polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, pero en donde la por lo menos una sustitución de aminoácidos de (a) (i)-(xi) y (b) (i) -(xiii) no se modifica adicionalmente .
La presente descripción proporciona adicionalmente un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 que tiene por lo menos una sustitución de aminoácidos que es: (a) un residuo de glutamina, lisina o isoleucina en la posición 19; (b) un residuo de histidina, leucina, o . fenilalanina en la posición 20; (c) un residuo de isoleucina, fenilalanina, tirosina, o valina en la posición 21; (d) un residuo de isoleucina, fenilalanina, o valina en la posición 22; (e) un residuo de alanina o arginina en la posición 150; (f) un residuo de alanina o valina en la posición 151; (g) un residuo de histidina, leucina, fenilalanina, o valina en la posición 152; (h) un residuo de alanina, ácido aspártico, cisteina, o prolina en la posición 170; (i) un residuo de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, lisina, serina, treonina, triptófano, o tirosina en la posición 171; (j) un residuo de leucina en la posición 172; o (k) un residuo de arginina o ácido glutámico en la posición 173;' y combinaciones de los mismos. En una modalidad del residuo en la posición 171 es prolina, y en otra modalidad el polipéptido puede comprender una secuencia de . aminoácidos que es por lo menos 85 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, pero en donde la por lo menos una sustitución de aminoácidos de (a)-(k) no se modifica adicionalmente.
La presente ' descripción proporciona además un polipéptido aislado' que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 que tiene por lo menos una sustitución de aminoácidos que es: (a) un residuo de arginina, ácido glutámico, o lisina en la posición 26; (b) un residuo de arginina, ácido glutámico, glutamina, lisina, o treonina en la posición 45; (c) un residuo de treonina en la posición 52; (d) un residuo de ácido glutámico, glicina, o serina en la posición 58; (e) un residuo de alanina, arginina, ácido glutámico, o lisina en la posición 60; (f) un residuo de alanina, arginina, o histidina en la posición 78; (g) un residuo de alanina en .la posición 88; (h) un residuo de arginina, ácido glutámico, glutamina, lisina, o treonina en la posición 98; (i) un residuo de arginina, ácido aspártico, cisteina, o ácido glutámico en la posición 99; (j) un residuo de lisina o treonina en la posición 111; (k) un residuo de arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, glutamina, histidina, o lisina en la posición 129; o (1) un residuo de arginina, ácido glutámico, histidina, lisina, o tirosina en la posición 134; y combinaciones de los mismos. En una modalidad, el residuo en la posición 98 es arginina y en otra modalidad el polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, pero en donde la por lo menos una sustitución de aminoácidos de (a)-(l) no.se modifica adicionalmente .
En varias modalidades, los polipéptidos dados a conocer en este^ documento pueden comprender además por lo menos una sustitución de aminoácidos que es: (a) un residuo de fenilalanina, prolina, alanina, serina o glicina en la posición 179; (b) un ácido glutámico, . glicina, prolina, o serina en la posición 180; o (c) una lisina, glicina, treonina, alanina, leucina, o prolina en la posición 181 y pueden comprender además de 1 a 10 residuos de aminoácido fusionados a la C-terminal del polipéptido, y pueden ser cualquier aminoácido, por ejemplo, uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de glicina, prolina y combinaciones de los mismos.
En varias modalidades, los polipéptidos dados a conocer en este documento pueden comprender (a) un truncamiento amino-terminal de no más de 8 residuos de aminoácido, en donde el polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en la sangre en un mamífero; (b) un truncamiento carboxilo-terminal de no más de 12 residuos de aminoácido, en donde el polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en la sangre en un mamífero; o (el un truncamiento amino-terminal de no más de 8 residuos de aminoácido y un truncamiento carboxilo-terminal de no más de 12 residuos de aminoácido, en donde el polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en la sangre en un mamífero.
En algunas modalidades, los polipéptidos dados a conocer en este documento se pueden enlazar covalentemente a uno o más polímero, tal como PEG.. En otras modalidades, los polipéptidos de la presente invención se pueden fusionar a una secuencia de aminoácidos heteróloga, opcionalmente por la vía de un enlazador, tal como GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23) . La secuencia de aminoácidos heteróloga puede ser un dominio constante IgG o fragmento del mismo, tal como la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. Estos polipéptidos de fusión dados a conocer en este documento también pueden formar multímeros.
La presente descripción también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos dados a conocer en este documento y un agente de formulación farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas se pueden usar en un método para tratar un trastorno metabólico, y el método comprende administrar a un paciente humano en necesidad del mismo una composición farmacéutica de . la presente invención. Trastornos metabólicos que se pueden tratar incluyen diabetes y obesidad.
También se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que^ codifican los polipéptidos dados a conocer en este documento, así como también vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico y células hospederas que comprenden estas moléculas de ácido nucleico.
Las formas truncadas del polipéptido de SEQ ID NO: también se dan a conocer. En varias modalidades el polipéptido puede comprender: (a) un truncamiento amino-terminal de no más de 8 residuos, de aminoácido, en donde el polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en la sangre en un mamífero; (b) un truncamiento carboxilo-terminal de no más de 12 residuos de aminoácido, en donde el polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en la sangre en un mamífero; o (c) un truncamiento amino-terminal de no más de 8 residuos de aminoácido y un truncamiento carboxilo-terminal de no más de 12 residuos de aminoácido, en donde el polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en la sangre en un mamífero.
La presente descripción proporciona adicionalmente una proteína de fusión aislada que puede comprender: (a) un dominio constante IgG; (b) una secuencia enlazadora fusionada al dominio constante IgG; y (c) un mutante FGF21 fusionado a la secuencia enlazadora y que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 en donde el residuo de arginina se ha sustituido por el residuo de leucina en la posición 98 y un residuo de glicina se ha sustituido por el residuo de prolina en la posición 171. En. una modalidad, la secuencia enlazadora puede comprender GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23) y en otra el dominio constante IgG puede comprender SEQ ID NO: 13. En otra modalidad, la secuencia enlazadora comprende GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23) y el dominio constante IgG comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. En aún otra modalidad la N-terminal del enlazador se fusiona a la C-terminal del dominio constante IgG y la N-terminal del mutante FGF21 se fusiona a la C-terminal del enlazador. Las proteínas de fusión dadas a conocer pueden formar multímeros.
En varias modalidades de la proteína de fusión, el componente mutante FGF21 puede comprender por lo menos una sustitución de aminoácidos que es: (a) una fenilalanina , prolina, alanina/ serina o glicina en la posición 179; (b) un ácido glutámico, ¦ glicina, prolina, o serina en la posición 180; o (c) una lisina, glicina, treonina, alanina, leucina, o prolina en la posición 181 y pueden comprender además 1 a 10 residuos de aminoácido fusionados a la C-terminal del mutante FGF21, y el 1 a 10 residuos de aminoácido, y pueden ser cualquier aminoácido, por ejemplo, uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de glicina, prolina y combinaciones de los mismos.
En aún otras modalidades de la proteína de fusión, el componente mutante FGF21 puede comprender: (a) un truncamiento amino-terminal de no más de 8 residuos de aminoácido, en donde el polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en la sangre en un mamífero; (b) un truncamiento carboxilo-terminal de no más de 12 residuos de aminoácido, en donde el polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en la sangre en un mamífero; o (c) un truncamiento amino-terminal de no más de 8 residuos de aminoácido y un truncamiento carboxilo-terminal de no más de 12 residuos de aminoácido, en donde el polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en la sangre en un mamífero. En otra modalidad, el componente mutante FGF21 de una proteína de fusión puede comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, pero en donde los residuos de arginina y glicina no se modifican adicionalmente .
La presente descripción también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína de fusión dada a conocer en este documento y un agente de formulación farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas se pueden usar en un método parar tratar un trastorno metabólico, el método que comprende administrar a un paciente humano en necesidad del mismo una composición farmacéutica de la presente invención. Trastornos metabólicos que se pueden tratar incluyen diabetes y obesidad.
También se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican la proteína de fusión dada a conocer en este documento, así como también vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico y células hospederas que comprenden estas moléculas de ácido nucleico.
Modalidades específicas de la presente invención llegarán a ser evidentes a partir de la siguiente descripción más detallada de ciertas modalidades y las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS ' Las Figuras 1A-1B muestran los resultados de un ensayo de actividad de ELK-luciferasa realizado sobre los mutantes de truncamiento FGF21 7-181 y 8-181 (Figura 1A) y los mutantes. de truncamiento FGF21 1-172, 1-171, 1-169, y 1-164 (Figura IB); cada panel muestra los resultados obtenidos para el control del FGF21 humano.
La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo de actividad de ELK-luciferása realizado sobre un control de FGF21 humano y los mutantes de truncamiento FGF21 3-181, 4-181, 5-181, 7-181, 8- 181, 1-180, 1-178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181, y 1-149.
La Figura 3 muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos' en ratones inyectados con PBS (barra sólida), control FGF21 humano (barra abierta) , o los mutantes de truncamiento FGF21 8-181 (barra gris) y 9-181 (barra punteada) .
La Figura 4 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre medido en ratones inyectados con PBS (círculos sólidos) ,. un control Fc-FGF21 (WT) (círculos abiertos), o proteínas de fusión Fc-FGF21 truncadas que comprenden los residuos de aminoácido 5-181 (triángulos sólidos) o 7-181 (triángulos abiertos).
La Figura 5 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre medido en ratones inyectados con PBS (círculos sólidos), un control FGF21-Fc (WT) (círculos abiertos), una proteína de fusión FGF21-Fc truncada que comprende los residuos 1-175 (triángulos sólidos) , o una proteína Fc-FGF21 truncada que comprende los residuos de aminoácido 1-171 (triángulos abiertos).
Las Figuras 6A-6D muestran los resultados del análisis de cromatografía liquida-espectrometría de masas (LC-MS) de una muestra de control Fc(5)FGF21 humano (Figura 6A) y muestras de Fc(5)FGF21 extraídas de ratones a 6 horas (Muestra D6; Figura 6B) , 24 horas (Muestra D24; Figura 6C) , y 48 horas (Muestra D48; Figura 6D) después de la inyección.
Las Figuras 7A-7D muestran los resultados si el análisis LC-MS de una muestra de control FGF21(3)Fc humano derivada de mamífero (Figura '7A) y muestras de FGF21(3)Fc extraídas de ratones a 6 horas (Muestra E6; Figura 7B) , 24 horas (Muestra E24; Figura 7C) , y 48 horas (Muestra E48; Figura 7D) después de la inyección.
Las Figuras 8A-8D muestran los resultados del análisis LC-MS de una muestra de . control Fc(15)FGF21 (Figura 8A) y muestras de Fc(15)FGF21 extraídas de ratones a 6 horas (Figura 8B) , 24 horas (Figura 8C) , y 48 horas (Figura 8D) después de la inyección.
Las Figuras 9A-9D muestran los resultados del análisis LC-MS de una muestra de control FGF21(15)Fc (Figura 9A) y muestras de FGF21(15)Fc extraídas de ratones a 6 horas (Figura 9B) , 24 horas (Figura 9C)., y 48 horas (Figura 9D) después de la inyección.
Las Figuras 10A-10B muestran los sitios de escisión identificados por el análisis LC-MS de las proteínas de fusión Fc(15)FGF21 (Figura 10A, SEQ ID NO: 38) y FGF21(15)Fc (Figura 10B, SEQ ID NO: 25) inyectadas en los ratones.
La Figura 11 muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con PBS (barra sólida) , Fc(15)FGF21 (barra abierta), o los mutantes Fc(15)FGF21 Fc(15)FGF21 G 170E (barra gris), Fc(15)FGF21 P171A (barra punteada), Fc(15)FGF21 S172L (barra diagonalmente sombreada abierta), Fc(15)FGF21 G170E/P171A/S172L (barra horizontalmente sombreada sólida), o Fc(15)FGF21 G151A (barra diagonalmente sombreada abierta) .
La Figura 12 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre medido en ratones inyectados con PBS (círculos sólidos), Fc(15)FGF21 (círculos abiertos), o los mutantes Fc(15)FGF21 Fc(15)FGF21 G170E (triángulos sólidos), Fc(15)FGF21 P171A (triángulos abiertos), Fc(15)FGF21 S172L (diamantes sólidos), Fc(15)FGF21 G170E/P171A/S172L (diamantes abiertos), o Fc(15)FGF21 G151A (cuadros sólidos).
La Figura 13 muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones con PBS (barra sólida), Fc(15)FG.F21 (barra abierta), o los mutantes Fc(15)FGF21 Fc(15)FGF21 P150A/G151A/I152V (barra gris), Fc(15)FGF21 G170E (barra diagonalmente sombreada abierta), Fc(15)FGF21 G170E/P171A (barra diagonalmente sombreada gris), o Fc(15)FGF21 G170E/S172L (barra diagonalmente sombreada abierta).
La Figura 14 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con PBS (cuadros sólidos), Fc(15)FGF21 (cuadros abiertos), o los mutantes Fc(15)FGF21 Fc(15)FGF21 P150A/G151A/I152V (triángulos invertidos sólidos), Fc(15)FGF21 G170E (triángulos invertidos abiertos), Fc(15)FGF21 G170E/P171A (circuios sólidos), o Fc(15)FGF21 G170E/S172L (circuios abiertos ) .
La Figura 15 muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con PBS (barra sólida) o los mutantes Fc(15)FGF21 Fc(15)FGF21 G 170E (barra abierta), Fc(15)FGF21 G170A (barra gris), Fc(15)FGF21 G170C (barra sombreada abierta), Fc(15)FGF21 G170D (barra gris y blanca), Fc(15)FGF21 G 170N (barra sombreada' sólida), o Fc(15)FGF21 G 170S (barra sombreada abierta) .
La Figura 16 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre medido en ratones inyectados con PBS (circuios sólidos) o los mutantes Fc(15)FGF21 Fc(15)FGF21 G170E (circuios abiertos), Fc(15)FGF21 G170A (triángulos sólidos), Fc(15)FGF21 G170C (triángulos abiertos), Fc(15)FGF21 G170D (diamantes sólidos) , Fe (15) FGF21 G170N (diamantes abiertos), o Fc(15)FGF21 G170S (triángulos invertidos sólidos) .
La Figura 17 muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con PBS (barra sólida) o los mutantes Fc(15)FGF21 Fc(15)_FGF21 G 170E (barra abierta), Fc(15)FGF21 P171E (barra gris), Fc(15)FGF21 P171H (barra sombreada sólida), Fc(15)FGF21 P171Q (barra sombreada abierta), Fc(15)FGF21 P171T (barra punteada), o Fc(15)FGF21 P171Y (barra sombreada gris).
La Figura 18 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre medido en ratones inyectados con PBS (circuios sólidos) o los mutantes Fc(15)FGF21 Fc(15)FGF21 G170E (circuios abiertos), Fc(15)FGF21 P171E (triángulos sólidos), Fc(15)FGF21 P171H (triángulos abiertos), Fc(15)FGF21 P171Q (diamantes sólidos), Fc(15)FGF21 P171T (diamantes abiertos), o Fc(15)FGF21 P171Y (cuadros sólidos ) .
Las Figuras 19A-19D muestran los resultados del análisis LC-MS de la muestra de control Fc(15)FGF21 (Figura 19A) y las muestras extraídas de ratones en el tiempo de 6 horas (Figura 19B) , 24 horas (Figura 19C) , y 48 horas (Figura 19D) después de la inyección.
Las Figuras 20A-20D muestran los resultados del análisis LC-MS de una muestra de control Fc(15)FGF21 G170E (Figura 20A) y muestras de Fc(15)FGF21 G 170E extraídas de ratones a 6 horas (Figura 20B) , 24 horas (Figura 20C) , y 48 horas (Figura 20D) después de la inyección.
Las Figuras 21A-21D muestran los resultados del análisis LC-MS de una muestra de control Fc(15)FGF21 P171A (Figura 21A) y muestras de Fc(15)FGF21 P171A extraídas de ratones a 6 horas (Figura 21B) , 24 (Figura 21C) , y 48 horas (Figura 21D) después de la inyección.
Las Figuras 22A-22D muestran los resultados del análisis LC-MS de una muestra de control Fc(15)FGF21 S172L (Figura 22A) y muestras de Fc(15)FGF21 S172L extraídas de ratones a 6 horas (Figura 22B) , 24 horas (Figura 22C) , y 48 horas (Figura 22D) después de la inyección.
Las Figuras 23A-23D muestran los sitios de escisión identificados por el análisis LC-MS de las proteínas de fusión Fc(15)FGF21 (Figura' 23 A, SEQ ID NO:38), Fc(15)FGF21 G 170E (Figura 23B, SEQ ID NO:39), Fc(15)FGF21 P171A (Figura 23C, SEQ ID NO:40), y Fe ( 15 ) FGF21 S172L (Figura 23D, SEQ ID N0:41) inyectadas en ratones .
Las Figuras '24A-24C muestran los resultados de un ensayo de la actividad de ELK-luciferasa realizados sobre los mutantes FGF21 FGF21 L99R, FGF21 L99D, y FGF21 Al 1 IT (Figura 24A) ; los mutantes FGF21 FGF21 A129D, FGF21 A129Q, y FGF21 A134K (Figura 24B) ;. y los mutantes FGF21 FGF21 A134Y, FGF21 A134E, y FGF21 A129K (Figura 24C) ; cada panel muestra los resultados obtenidos para un control FGF21 humano.
Las Figuras 25A-25D muestran los resultados de un ensayo de actividad de ELK-luciferasa realizado sobre los mutantes Fc-FGF21 Fc-FGF21 P171G, Fc-FGF21 P171S, y Fc-FGF21 P171T (Figura 25A) ; los mutantes Fc-FGF21 Fc-FGF21 P171Y, Fc-FGF21 P171W, y Fc-FGF21 P171C (Figura 25B) ; Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 A45K/G170E, y FGF21 A45K (Figura 25C) ; y Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 P171E, y Fc(15)FGF21 A45K/G170E (Figura 25D) ; cada panel muestra los resultados obtenidos para un control FGF21 humano.
Las Figuras 26A-26B muestran la agregación como una función de tiempo para el FGF21 maduro de tipo silvestre y varios mutantes FGF21; la Figura 26A muestra el cambio en el porcentaje de agregación para un control FGF21 (WT, diamantes sólidos) y FGF21 A45K (circuios sólidos) después de la incubación de 65 mg/mL de proteína a 4°C durante 1, 2, y 4 días, mientras que la · Figura 26B muestra el cambio en el porcentaje de agregación para un control FGF21 control (WT) y FGF21 P78C, P78R, L86T, L86R, L98C, L98R, A111T, A129D, A129Q, A129K, A134K, A134Y, y A134E (todos etiquetados en la gráfica) después de la incubación de 65 mg/mL de proteína a 4°C durante 1, 6, y 10 días.
La Figura 27 muestra los resultados de un ensayo de actividad de ELK-luciferasa realizado en un control FGF21 humano y los mutantes FGF21 FGF21 A45K, FGF21 L52T, y FGF21 L58E.
La Figura 28A- es una gráfica que muestra el cambio en los niveles de agregación para los mutantes Fc(15)FGF21 Fc(15)FGF21 6-181/G170E (diamantes sólidos), Fc(15)FGF21 A45K/G170E (cuadros abiertos), Fc(15)FGF21 P171E (triángulos sólidos), Fc(15)FGF21 P171A (cruces), Fc(15)FGF21 G 170E (triángulos abiertos), y un control FGF21 (círculos sólidos) después de la incubación a 4°C durante 1, 4, y 8 días, y la Figura 28B es una gráfica de barras que muestra también los resultados de la incubación.
La Figura 29 muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con PBS (vehículo) (círculos sólidos) o los mutantes Fc(15)FGF21 Fc(15)FGF21 A45K/G170E (círculos abiertos), Fc(15)FGF21 . A45K/P171G (triángulos sólidos), o Fc(15)FGF21 L98R/P171G (triángulos abiertos ) .
La Figura 30 es una gráfica que muestra los resultados de un ensayo de actividad de ELK-luciferasa realizado en FGF21 humano (circuios sólidos, linea sólida) , Fc-FGF21 (circuios abiertos, linea sólida) y Fc-FGF21 L98R/P171G (triángulos sólidos, linea punteada)..
La Figura 31 es una gráfica que muestra el porcentaje de agregados de peso molecular alto observados después de nueve días a temperatura ambiente (Figura 31A) y a 4°C (Figura 31B) para FGF21 (circuios sólidos, linea sólida), Fc-FGF21 (circulo abierto, linea sólida) y Fc-FGF21 L9.8R/P171G (triángulos sólidos, linea punteada) .
La . Figura 32 es una serie de „ trazas de espectrometría de masas MALDI que muestran cambios observados en Fc(15)FGF21 L98R/P171G en varios puntos durante un periodo de tiempo de 168 horas.
La Figura 33 es una gráfica que muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre en ratones ob/ob para cada^ uno de un control de vehículo PBS control (círculos abiertos), FGF21 maduro de tipo silvestre (cuadros sólidos), y los mutantes FGF21 L98R, P171G (triángulos sólidos invertidos) ; L98R, P171G, 182P (diamantes abiertos), y L98R, P171G, 182G (círculos sólidos).
La Figura 34 es una' gráfica que muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre en ratones ob/ob para cada uno de un control de vehículo PBS (círculos sólidos), y los mutantes FGF21 L98R, P171G (triángulos sólidos) ; L98R, P171G, 182G, 183G (triángulos abiertos), L98R, P171G, 182G (diamantes sólidos) y L98R, P171G, 182P (diamantes abiertos) .
La Figura 35 es una gráfica que muestra el porcentaje de cambio, en los niveles de glucosa en la sangre en ratones ob/ob para cada uno de un control de vehículo PBS (círculos abiertos), y los . mutantes FGF21 L98R, P171G (cuadros sólidos); L98R, P171G,, Y179S (triángulos abiertos), L98R, P171G, Y179A (triángulos sólidos invertidos), L98R, P171G, 180S (diamantes abiertos) y L98R, P171G, A180G (círculos sólidos) .
La Figura 3.6 es una gráfica que muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre en ratones db/db para cada uno de un control de vehículo PBS (círculos sólidos) , y los mutantes FGF21 L98R, P171G (cuadros abiertos); L98R, P171G, Y179F (triángulos sólidos), y L98R, P171G, A180E (diamantes abiertos) . .
La Figura 37 es un diagrama que representa gráficamente el diseño de estudio para un estudio de escalamiento de dosis de seis semanas realizado en monos Rhesus; en la figura los símbolos sombreados indican extracciones de sangre en el estado en ayunas y los símbolos punteados indican extracciones de sangre en el estado alimentado.
Las Figuras 38A-38D es una serie de gráficas que representan como los monos rhesus se aleatorizaron en perfiles OGTT, OGTT AUCs y peso corporal; la Figura 38A representa los niveles de glucosa de línea base en 0GTT1, el cuadro sólido corresponde al grupo A, círculo sólido, línea sólida corresponde al grupo B y círculo abierto, línea punteada corresponde al grupo C antes de que los compuestos o vehículos se asignarán a cada grupo; la Figura 38B representa los niveles de glucosa de línea base en 0GTT2, el cuadro sólido corresponde al grupo A, el círculo sólido, línea sólida corresponde al grupo B y el círculo abierto, línea, sólida corresponde al grupo C antes de que los compuestos o vehículos se asignaran a cada grupo; la Figura 38C muestra los niveles de glucosa, de línea base para los OGTTs 1 y 2 mostrados en términos de AUC, la barra punteada corresponde al grupo A, la barra sombreada corresponde al grupo B y la barra abierta corresponde al grupo C; y la Figura 38D muestra el peso corporal de línea base, la barra punteada corresponde al grupo A, la barra sombreada corresponde al B y la barra abierta corresponde al grupo C.
La Figura 39 es una gráfica que muestra los efectos del vehículo, FGF21 y Fc-FGF21 (RG) sobre el peso corporal en los monos Rhesus; las barras sombreadas 1 y 2 corresponden a las semanas 1 y 2 en la dosis' baja, las barras abiertas 3 y 4 corresponden a las semanas 3 y . 4 en la dosis media, las barras sólidas 5 y 6 corresponden a la semana 5 y 6 en la dosis alta y las barras punteadas 7, 8 y 9 corresponden a las semanas 7-9 durante el período de lavado.
La Figura 40 es una gráfica que muestra el porcentaje de cambio en la insulina en ayunas relativa con la línea base del vehículo, FGF21 y Fc-FGF21 (RG) en los niveles de insulina en ayunas en monos Rhesus; las barras sombreadas 1 y 2 corresponden a la semana 1 y 2 en la dosis baja, las barras abiertas 3 y 4 corresponden a la semana 3 y 4 en la dosis media, las barras sólidas. 5 y 6 corresponden a las semanas 5 y .6 en la dosis alta y las barras punteadas 7 y 8 corresponden a las semanas 7 y 8 durante el período de lavado .
La Figura 41 es una gráfica que muestra los efectos del vehículo, FGF21 u Fc-FGF21 ( RG) , proporcionados en las dosis alta, sobre los niveles de insulina alimentados de monos Rhesus adquiridos durante las semanas 5 y 6 del estudio; las barras sólidas corresponden a la semana 5 y las barras sombreadas corresponden a la semana 6.
La Figura 42 es una gráfica que muestra los perfiles de glucosa de. 0GTT5 realizados al final del tratamiento de dosis alta de dos semanas con Fc-FGF21 (RG) ; circulo sólido, linea sólida corresponden al vehículo, cuadro abierto, línea punteada corresponde a FGF21 y triángulo sólido, línea sólida corresponde a FC-FGF21 (RG) .
• La Figura 43 es una gráfica que muestra los perfiles de insulina de 0GTT5 realizados al final del tratamiento de dosis alta de dos semanas con Fc-FGF21 (RG) ; círculo sólido, línea sólida corresponde al vehículo, cuadro abierto, línea punteada ' corresponde a FGF21 y triángulo sólido, línea sólida corresponde a Fc-FGF21 (RG) .
La Figura 44 es una gráfica que muestra la AUC 1-3 de la glucosa OGTT determinada al final de cada período de dosis (dosis baja, media y alta) de los monos Rhesus; barras abiertas corresponden a AUC3. calculada de las mediciones de glucosa durante OGTT3, barras sólidas corresponden a AUC4 calculada de las mediciones de glucosa durante 0GTT4 y barras sombreadas corresponden a la AUC5 calculada de las mediciones de glucosa durante 0GTT5.
La Figura 45 es una gráfica que muestra los efectos del vehículo, FGF21 y Fc-FGF21(RG) en el porcentaje de cambio de la línea base de. los niveles de triglicéridos en plasma en ayunas de cada grupo de monos Rhesus; barras sombreadas 1 y 2 corresponden a las semanas 1 y 2 en la dosis baja, barras abiertas 3 y 4 corresponden a las semanas 3 y 4 en la dosis media, barra sólidas 5 y -6 corresponden a las semanas 5 y 6 en la dosis alta y barras punteadas 7, 8 y 9 corresponden a las semanas 7-9 durante el periodo de lavado.
La Figura 46 es una gráfica que muestra los niveles de triglicéridos en el plasma en estado alimentado de cada grupo de los monos Rhesus; como es medido durante la quinta y sexta semana del tratamiento con el vehículo, FGF21 o Fc-FGF21(RG) en la dosis alta; barras sombreadas corresponden a la semana 5 y barras sólidas corresponden la semana.6.
La Figura 47 es una gráfica que muestra los niveles FGF21 de mono individuales medidos en pre-dosis, y 5, 12, 19, y 26 días, con las muestras adquiridas a aproximadamente 21 horas después de cada inyección.
La Figura 48 es una gráfica que muestra los niveles de Fc-FGF21(RG) de mono individuales medidos en la pre-dosis, y 5, 12, 19, y 26 días, con muestras adquiridas de aproximadamente 5 días después de cada inyección.
La Figura 49 es una gráfica que muestra concentraciones medias de niveles FGF21 y Fc-FGF21(RG) medidos de tres OGTTs realizados después de .cada una de las dosis baja, medias y altas; barra sombreadas corresponden a 0GTT3 en la dosis baja, barras sólidas corresponden a OGTT4 en la dosis media y barras abierta corresponden a 0GTT5 en la dosis alta.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Una proteina FGF21 humana que tiene propiedades mejoradas tal como una vida media incrementada y/o agregación disminuida se puede preparar usando los métodos dados a conocer en este documento y métodos de biología molecular estándares. Opcionalmente , la vida media se puede prolongar adicionalmente al fusionar un anticuerpo, o porción del mismo, al extremo N-terminal o C-terminal de la secuencia FGF21 de tipo silvestre. También es posible prolongar adicionalmente la vida media o disminuir la agregación de la proteína FGF21 de tipo silvestre al introducir sustituciones de aminoácidos dentro de la proteína. Estas proteínas modificadas son referidas en este documento como mutantes, o mutantes FGF21 y forman¦ modalidades de la presente invención.
Los métodos de ácido nucleicos recombinantes usados en este documento, incluyendo, en los ejemplos, son generalmente aquellos expuestos por Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory ' Press, 1989) or Current Protocole in Molecular Biology (Ausubel y colaboradores, eds . , Green Publishers Inc. y Wiley y Sons 1994), ambas de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia para cualquier propósito. 1. Definiciones Generales El término "molécula de ácido nucleico aislada" se refiere a una molécula de ácido nucleico de la invención que (1) se ha separado de por lo menos aproximadamente 50 por ciento de las proteínas, lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los cuales se encuentra naturalmente cuando el ácido nucleico tal se aisla de las células de origen, (2) no se enlaza a todo o una porción de un polinucleótido al cual la "molécula de ácido nucleico aislada" se enlaza en carácter, (3) se enlaza operablemente a un polinucleótido el cual no se enlaza en carácter, o (4) no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia de polinucleótidos más grande. Preferiblemente, · la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención está sustancialmente libre de cualquiera de otras moléculas de ácido nucleico contaminantes u otros contaminantes que se encuentran en sus ambientes naturales que interferirán con su uso en la producción de polipéptido o su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de investigación.
El término "vector" se usa para referirse a cualquier molécula (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido o virus) usados para transferir la información de codificación a una célula hospedera.
El término "vector de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula hospedera y contiene secuencias de ácidos nucleicos que dirigen y/o controlan la expresión de secuencias de ácidos nucleicos heterólogas insertadas.. La expresión incluye, pero no se limita a, procesos tales como transcripción, traducción, y empalme de ARN, si están presentes los intrones .
El término "enlazado operablemente" se usa en este documento para referirse a un arreglo de secuencias de flanqueo en donde las secuencias de flanqueo descritas de esta manera están configuradas o ensambladas para realizar su función usual. De esta manera, una secuencia de flanqueo enlazada operablemente a una secuencia de codificación puede ser capaz de efectuar la replicación, transcripción y/o traducción de la secuencia, de codificación. Por ejemplo, una secuencia de codificación se enlaza operablemente a un promotor donde el promotor es capaz de dirigir la transcripción de esa secuencia de codificación. Una secuencia de flanqueo no necesita ser contigua con la secuencia de codificación, siempre y cuando funcione correctamente. De esta manera, por ejemplo, la intervención de secuencias ya transcritas no traducidas puede estar presente entre una secuencia promotora y la secuencia de codificación y la secuencia promotora aún se puede considerar "enlazada operablemente" a la secuencia de codificación.
El término "célula hospedera" se usa para referirse a una célula la cual se ha transformado, o es capaz de ser transformada con una secuencia de ácidos nucleicos y luego de expresar un gen seleccionado¦ de interés. El término incluye la progenie de la célula precursora, si la progenie es idéntica o no en morfología o en la constitución genética a la precursora original, siempre y cuando el gen seleccionado esté presente.
El término "polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido de la presente invención que (1) se ha separado de por lo menos aproximadamente 50 por ciento de pol.inucleótidos , lípidos, carbohidratos, y otros materiales con los cuales se fusionan naturalmente cuando se aisla de la célula de origen, (2) no se enlaza (mediante la interacción covalente o no covalente) a todo o una porción del polipéptido al cual el "polipéptido aislado" se enlaza en naturaleza, (3) se enlaza operablemente (mediante la interacción covalente o no covalente) a un polipéptido con el cual no se enlaza en naturaleza, o. (4) no ocurre en naturaleza. Preferiblemente, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de cualquiera de otros polipéptidos contaminantes y otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural que interferirían con su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de investigación.
El término "de origen natural" cuando se usa en relación con los materiales biológicos tales como moléculas de ácido nucleico, polipéptidos , células hospederas, y los similares, se refiere a materiales que se encuentran en naturaleza y no se manipulan por el hombre. Similarmente, "de origen no natural" como se usa en este documento, se refiere a un material que no se encuentra en la naturaleza o que se ha modificado o sintetizado estructuralmente por el hombre. Cuando se usa en relación con los nucleótidos, el término "de origen natural" se refiere a las bases de adenina (A) , citosina (C) , guanina (G) , timina (T) , y uracilo (U) . Cuando se usa en relación con los aminoácidos, el término "de origen natural" se refiere a los 20 aminoácidos alanina (A) , cisteína (C) , ácido aspártico (D) , ácido glutámico (E) , fenilalanina (F) , glicina (G) , histidina (H) , isoleucina (I), lisina (K) , leucina (L) , metionina (M) , asparagina (N) , prolina (P), glutamina (Q) , arginina (R) , serina (S), treonina (T) , valina (V), triptófano (W) , y tirosina (Y).
El término "polipéptido FGF21" se refiere a un polipéptido de tipo silvestre de origen natural expresado en humanos. Para propósitos de esta descripción, el término "polipéptido FGF21"' se puede usar intercambiablemente para referirse a cualquier polipéptido FGF21 de longitud completa, por ejemplo, SEQ ID N0:2, el cual consiste de 209 residuos de aminoácido y el cual se codifica por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1; cualquier forma madura del polipéptido, por ejemplo, SEQ ID NO: 4, el cual consiste de 181 residuos de aminoácido y el cual se codifica por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, y en el cual los 28 residuos de aminoácido en el extremo amino-terminal del polipéptido FGF21 de longitud completa (es decir, el cual constituye el péptido de señal) se ha removido, y variantes de los mismos.
Los términos "mutante' de polipéptido FGF21" y "mutante FGF21" se refieren a una variante de polipéptido FGF21 en la cual una secuencia de aminoácidos FGF21 de origen natural se ha modificado. Estas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, una o más sustituciones de aminoácidos, que incluyen sustituciones . con análogos de aminoácidos no de origen natural, y truncamientos. De esta manera, los mutantes de polipéptido FGF21 incluyen, pero no se limitan a, mutantes FGF21 dirigidos al. sitio, polipéptidos FGF21 truncados, mutantes FGF21 resistentes a la proteólisis, mutantes FGF21 reductores de agregación, mutantes de combinación FGF21 y proteínas de fusión FGF21, como se describen en este documento. Para el propósito de identificar los -truncamientos específicos y las sustituciones de aminoácidos de los mutantes FGF21 de la presente invención, la numeración de los residuos de aminoácido truncados o mutados corresponden a aquel del polipéptido FGF21 de 181 residuos maduros.
En otras modalidades de la presente invención, un mutante de polipéptido FGF21 comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 85 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, pero en donde los residuos específicos que confieren una propiedad deseable al mutante de polipéptido FGF21, por ejemplo, resistencia a la proteólisis vida media incrementada o propiedades reductoras de agregación y combinaciones de las mismas, no se. han modificado adicionalmente . En otras palabras, con la excepción de los. residuos en la secuencia de mutante FGF21 que se ha modificado a fin de conferir resistencia a la proteólisis, reducción de agregación u otras propiedades, aproximadamente 15 por ciento de todos los otros residuos de aminoácido en la secuencia de mutante FGF21 se pueden modificar. Por ejemplo, en el mutante FGF21 Q173E, hasta 15 por ciento de todos los residuos de aminoácido diferentes a residuo de ácido glutámico, el cual se sustituyó por glutamina en la posición 173, se podría modificar. En aún otras modalidades, un mutante de polipéptido FGF21 comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 90 por ciento, o aproximadamente 95, 96, 97, 98, o 99 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, pero en donde los residuos específicos que confieren las propiedades de resistencia a la proteólisis o reducción a la agregación del mutante de polipéptido FGF21 no sean modificados adicionalmente . Estos mutantes de polipéptido FGF21 poseen por lo menos una actividad del polipéptido FGF21 de tipo silvestre.
La presente invención también abarca una molécula de ácido nucleico que codifica un mutante de polipéptido FGF21 que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 85 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, pero en donde los residuos específicos que confieren una propiedad deseable al mutante de polipéptido FGF21, por ejemplo, resistencia a la proteólisis, vida media incrementada o propiedades de reducción de agregación y combinaciones de las mismas no se han modificado adicionalmente. En otras palabras, con la excepción de los nucleótidos que codifican residuos en la secuencia de mutante FGF21 que se han modificado a fin de conferir resistencia a la proteólisis, reducción a la agregación u otras propiedades, aproximadamente 15 por ciento de todos los otros nucleótidos en la secuencia de mutante FGF21 se pueden modificar. Por ejemplo, en el mutante FGF21 Q173E, hasta o 15 por ciento de todos los nucleótidos diferentes a los nucleótidos que codifican los residuos de ácido glutámico, el cual se sustituyó por glutamina en la posición 173, se podrían modificar. La presente invención abarca además una molécula de ácido nucleico que codifica un mutante de polipéptido FGF21 que comprende una secuencia de aminoácidos · que es por. lo menos aproximadamente 90 por ciento, o aproximadamente 95, 96, 97, 98, o 99 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, pero en ¦ donde los residuos específicos .que confieren las propiedades de resistencia a la proteólisis o reducción a la agregación del mutante de polipéptido FGF21 no se han modificado adicionalmente . Estos mutantes FGF21 poseen por lo menos una actividad del polipéptido FGF21 de tipo silvestre.
La presente invención también abarca una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es por lo menos aproximadamente 85 por ciento idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, pero en donde los nucleótidos que codifican los residuos de aminoácido que confieren la resistencia a la proteólisis, reducción a la agregación u otras propiedades del mutante de polipéptido FGF21 codificado no se han modificado adicionalmente. En otras palabras, con la excepción de los residuos en la secuencia de mutante FGF21 que se ha modificado a fin de conferir resistencia a la proteólisis, reducción a la agregación u otras propiedades, aproximadamente 15 por ciento de todos los otros residuos de aminoácido en la secuencia de mutante FGF21 se puede modificar. Por ejemplo, en el mutante FGF21 Q173E, hasta 15 por ciento de todos los residuos de aminoácido diferentes al residuo de ácido glutámico, el cual se sustituyó por glutamina en la posición 173, se podría modificar. La presente invención abarca además una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es por lo menos aproximadamente 90 por ciento, o aproximadamente 95, 96, 97, 98, o 99 por ciento idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, pero en donde los nucleótidos que codifican los residuos de aminoácido que confieren las propiedades . de resistencia a la protolisis o reducción a la agregación del mutante del polipéptido FGF21 codificado no se ha modificado adicionalmente . Estas moléculas de ácido nucleico codifican los polipéptidos mutantes FGF21 que proveen por lo menos una actividad del polipéptido FGF21 de tipo silvestre.
El término "mutante de polipéptido FGF21 biológicamente activo" se refiere a cualquier mutante de polipéptido FGF21 descrito en este documento que posee una actividad del polipéptido FGF21 de tipo silvestre, tal como la capacidad .para disminuir la glucosa en la sangre, insulina, triglicéridos , o el colesterol; reducir el peso corporal; y mejorar la tolerancia a la glucosa, gasto de energía, o sensibilidad a la insulina, sin considerar el tipo o número de modificaciones que se han introducido en el mutante de polipéptido FGF21. Los mutantes de polipéptido FGF21 que proveen un nivel de alguna manera disminuido de actividad FGF21 relativa con el polipéptido FGF21 de tipo silvestre no obstante se puede considerar que son mutantes de polipéptido FGF21 biológicamente activos.
Los términos "cantidad efectiva" y "cantidad terapéuticamente efectiva" cada uno se refiere a la cantidad de un mutante de polipéptido FGF21 usado para soportar un nivel observable de una o más actividades biológicas del polipéptido FGF21 de tipo silvestre, tal como la capacidad de disminuir los niveles de glucosa en la sangre, insulina, triglicéridos, o colesterol; reducir el peso corporal; o mejora la tolerancia a la glucosa, gasto de energía, o sensibilidad a la insulina.
El término "portador farmacéuticamente aceptable" o "portador fisiológicamente aceptable" como se usa en este documento, se refiere a uno o más materiales de formulación adecuados para lograr o mejorar el suministro de un mutante de polipéptido FGF21.
El término "antigeno" se refiere a una molécula o una porción de una molécula que es capaz de ser enlazada por un anticuerpo, y adicionalmente que es capaz de ser usada en un animal para producir anticuerpos que son capaces de enlazarse a un epitopo de ese antigeno. Un antigeno puede tener uno o más epitopos.
El término "Fe nativa" se refiere a la molécula o secuencia que comprende la secuencia de un fragmento de enlace no de antigeno que resulta de la digestión de un anticuerpo completo o producido por otros medios, ya sea en forma monomérica o multimérica, y puede contener la región bisagra. La fuente de inmunoglobulina original de la Fe es preferiblemente de origen humano y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas , aunque se prefieren IgGl e IgG2. Las moléculas Fe nativas están constituidas de polipéptidos monoméricos que se pueden enlazar dentro de formas diméricas o multiméricas por la asociación covalente (es decir, - enlaces de disulfuro) y no covalente. El número de enlaces de disulfuro intermoleculares entre las subunidades monoméricas de las moléculas Fe nativas varia de 1 a 4 dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA, e IgE) o subclase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, e' IgGA2) . Un ejemplo de una Fe es un dimero enlazado por disulfuro que resulta de la digestión de papaina de un IgG (véase Ellison y colaboradores., 1982, Nucleic Acids Res. 10: 4071-9) . El término "Fe nativa" como se usa en este documento es genérico a las formas monoméricas, diméricas y multiméricas . Un ejemplo de una secuencia de polipéptidos Fe se presenta en SEQ ID NO: 13.
El término "variante Fe" se refiere a una molécula o secuencia que se modifica de una Fe nativa pero aún comprende un sitio de enlace para el receptor de recuperación, FcRn (receptor Fe neonatal) . Las Publicaciones Internacionales Nos. WO' 97/34631 y O 96/32478 describen variantes Fe ejemplares, asi como también la interacción con el receptor de recuperación, y ' se incorporan por ¦ este documento a manera de referencia. De esta manera, el término "variante Fe" puede comprender una molécula o secuencia que se humaniza de una Fe nativa no humana. Adicionalmente, una Fe nativa comprende regiones que es pueden remover debido a que proporcionan características estructurales o actividad biológica que no se requieren para las molécula de fusión de los mutantes FGF21 de la presente invención. De esta manera, el término "variante Fe" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios o residuos Fe, o en los cuales uno o más sitios o residuos Fe se han modificado, que afecta o se implican en: (1) formación de enlace de disulfuro, (2) incompatibilidad con una célula hospedera seleccionada, (3) heterogeneidad N-terminal en la expresión en una célula hospedera seleccionada, (4) glicosilación, (5) interacción con el complemento, (6) enlace a un receptor Fe diferente a un receptor de recuperación, o (7) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) . Las variantes Fe se describen con detalle adicional a partir de ahora.
El término "dominio Fe" abarca Fe nativa y variantes Fe y secuencias como se definen anteriormente. Como con las variantes Fe y. las moléculas Fe nativas, el término "dominio Fe" incluye moléculas en forma monomérica o multimérica, ya sea digeridas de, un anticuerpo completo o producidas por otros medios. En algunas modalidades de la presente invención, un dominio Fe se puede fusionar a FGF21 o un mutante FGF21 (que incluye una forma truncada de FGF21 o un mutante FGF21) por la' vía, por ejemplo, de un enlace covalente entre el dominio Fe y la secuencia FGF21. Estas proteínas de fusión pueden formar multímeros por la vía de la asociación de los dominios Fe y ambas de estas proteínas de fusión y sus multímeros son un aspecto de la presente invención. 2. Mutantes FGF21 Específicos de Sitio El término "mutante FGF21 específico de sitio" o "mutantes FGF21 sustituido" se refieren a un polipéptido de mutante FGF21 que tiene una secuencia de- aminoácidos, que difiere de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de polipéptido FGF21 . de origen natural, por ejemplo, SEQ ID N0s:2 y 4 y variantes de las mismas. Los mutantes FGF21 específicos de sitio se pueden generar al introducir sustituciones de aminoácidos, ya sea conservadoras o no conservadoras y al usar aminoácidos de origen natural o no natural, en las posiciones particulares del polipéptido FGF21. "sustitución de aminoácido conservadora" puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo (es decir, un residuo encontrado en una posición proporcionada de la secuencia de polipéptido FGF21 de tipo silvestre) con un residuo no nativo (es decir, un residuo que no se encuentra en una posición proporcionada de la secuencia de polipéptido FGF21 de tipo silvestre) tal que existe poco o nada de efecto en la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esta posición. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras también abarcan residuos de aminoácido no de origen natural que se incorporan típicamente por la síntesis química de polipéptidos antes que por la síntesis en los sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos , y otras formas inversas o invertidas de porciones de aminoácidos.
Los residuos de origen natural se pueden dividir en clases con base en las propiedades de cadena lateral comunes: (1) hidrofóbica: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, He; (2) hidrofilica neutra: Cys, Ser, Thr; (3) ácida: Asp, Glu; (4) básica: Asn, Gln, His, Lys, Arg; (5) residuos que afectan la orientación de la cadena: Gly, Pro; y (6) aromática: Trp, Tyr, Phe .
Las sustituciones conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase. Las sustituciones no conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase.
Las sustituciones de aminoácidos deseadas (ya sea conservadoras o no conservadoras) se pueden determinar por aquellas personas expertas en el campo en el momento que se desean estas sustituciones. Una lista ejemplar (pero no limitante) de sustituciones de aminoácidos se expone en la Tabla 1.
Tabla 1 Tabla 1 Sustituciones de Aminoácidos 3. Polipéptidos FGF21- Truncados Una modalidad de la presente invención se dirige a formas truncadas del polipéptido FGF21 maduro. Esta modalidad de la presente invención surge a partir de un esfuerzo para identificar polipéptidos FGF21 truncados que son capaces de proporcionar una actividad que es similar, y en algunos casos superior, a formas no truncadas del polipéptido FGF21 maduro.
Como se usa en este documento, el término "polipéptido FGF21 truncado" se refiere' a un polipéptido FGF21 en el cual se han removido residuos de aminoácido del extremo amino-terminal. (o N-terminal) del Polipéptido FGF21, residuos de aminoácido que se han removido del extremo carboxilo-terminal (o C-terminal) del Polipéptido FGF21, o residuos de aminoácido que se han removido de tanto los extremos amino-terminal como carboxilo-terminal del Polipéptido FGF21. Los diversos truncamientos dados a conocer en este documento se .prepararon como se describen en los Ejemplos 3 y 6 en este documento.
La actividad de los polipéptidos FGF21 N-terminalmente truncados y polipéptidos FGF21 C-terminalmente truncados se puede someter a ensayo usando un ensayo de ELK-luciferasa in vitro como se describe en el Ejemplo 4. Los. detalles específicos de los ensayos in vitro que se pueden usar para examinar la actividad de los polipéptidos FGF21 truncados se pueden encontrar en el Ejemplo 4.
La actividad de los polipéptidos FGF21 truncados de la presente invención también se puede estimar en un ensayo in vivo, tal como ratones ob/ob como se muestra en los Ejemplos 5 y 7. Generalmente, para estimar la actividad in vivo de un polipéptido FGF21 truncado, el polipéptido FGF21 truncado se puede administrar a un animal de prueba intraperitonealmente . Después de un período de incubación deseado (por ejemplo, una hora o más) , una muestra de sangre se puede extraer, y se pueden medir los niveles de glucosa en la sangre. Detalles específicos de los ensayos in vivo que se pueden usar para examinar la actividad de los polipéptidos FGF21 truncados se pueden encontrar en los Ejemplos 5 y 7. a. Truncamientos en el N-terminal En algunas modalidades de la presente invención, los truncamientos en el N-terminal comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 residuos de aminoácido del extremo N-terminal del polipéptido FGF21 maduro. Como se demuestra, por ejemplo, en el Ejemplo 5 y la Figura 3, los polipéptidos FGF21 truncados que tiene los truncamientos en el N-terminal de menos de 9 residuos de aminoácido retienen la capacidad del polipéptido FGF21 maduro de disminuir la glucosa en la sangre en un individuo. Por consiguiente, en modalidades particulares, la presente invención abarca formas truncadas del polipéptido FGF21 o mutantes de polipéptido FGF21 que tienen truncamientos N- terminal 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 residuos de aminoácido. b. Truncamientos en el C-terminal En algunas modalidades de la presente invención, los truncamientos en el C-terminal comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 residuos- de aminoácido del extremo C-terminal del polipéptido FGF21 maduro. Como se demuestra en, por ejemplo, el Ejemplo 4 y la Figura IB, los polipéptidos FGF21 truncados que tiene truncamientos en el C-terminal de menos de 13 residuos de aminoácido exhibieron una eficacia de por lo. menos 50% de la eficacia del FGF21 de tipo silvestre en un ensayo de ELK-luciferasa in vitro, indicando que estos mutantes FGF21 retienen la capacidad del polipéptido FGF21 maduro de disminuir la glucosa en la sangre en un individuo. Por consiguiente, en modalidades particulares, la presente invención abarca formas truncadas de polipéptido FGF21 maduro o mutantes de polipéptido FGF21 que tienen truncamientos en el C-terminal de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 residuos d aminoácido. c. Truncamientos en el N-terminal y N-terminal En algunas modalidades de la presente invención, los polipéptidos FGF21 truncados pueden tener una combinación de truncamientos en el N-terminal y en el C-terminal. Los polipéptidos FGF21 truncados que tiene a combinación de truncamientos en el N-terminal y en el C-terminal comparten la actividad de los polipéptidos FGF21 truncados correspondientes que tienen ya se los truncamientos en el N-terminal o C-terminal solos. En otras palabras, los polipéptidos FGF21 truncados que tiene tanto truncamientos en el N-terminal de menos de 9. residuos de aminoácido como truncamientos en el C-terminal de menos de 13 residuos de aminoácido proveen una actividad de reducción de glucosa en la sangre similar o mayor como, los polipéptidos FGF21 truncados que tienen truncamientos en el N-terminal de menos de 9 residuos de aminoácido o polipéptidos FGF21 truncados que tienen truncamientos en el C-terminal de menos de 13 residuos de aminoácido. Por consiguiente, en modalidades particulares, la presente invención abarca formas truncadas del polipéptido FGF21 maduro o mutantes de polipéptido FGF21 que tienen tanto truncamientos en el N-terminal de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 residuos de aminoácido como truncamientos en el C-terminal de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 residuos de aminoácido.
Como con todos los mutantes FGF21 de la presente invención, los polipéptidos FGF21 truncados pueden comprenden opcionalmente un residuo de metionina amino-terminal, el cual se puede introducir mediante mutación dirigida o como un resultado de un proceso de expresión bacteriana.
Los polipéptidos FGF21 truncados de la presente invención se pueden preparar como se describe en los Ejemplos 3 y 6. Aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo, familiarizados con las técnicas de biología molecular estándares, pueden emplear ese conocimiento, acoplado con la presente descripción, para hacer y usar los polipéptidos FGF21 truncados de la presente invención. Se puede usar técnicas estándares para ADN recombinante , síntesis de oligonucleótidos, cultivo de tejidos y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra, la cual se incorpora en este documento a ¦ manera de referencia para cualquier propósito. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se pueden realizar de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como es comúnmente logrado en el campo, o como se describe en este documento. A menos que se proporcionen definiciones especificas, las nomenclaturas usadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en este documento son aquellas bien conocidas y usadas comúnmente en el campo. Las técnicas estándares se pueden usar para las síntesis químicas; análisis químicos; preparación farmacéutica, formulación, y suministro; y tratamiento de pacientes.
Los polipéptidos FGF21 truncados de la presente invención también se pueden fusionar a otra entidad, la cual puede impartir propiedades adicionales al polipéptido FGF21 truncado. En una modalidad de la presente invención, un polipéptido FGF21 truncado se puede fusionar a una secuencia Fe. Esta fusión se puede lograr usando métodos biológicos moleculares conocidos y/o la guía proporcionada en este documento. Los beneficios de estos polipéptidos de fusión, así como también métodos para hacer estos polipéptidos de fusión, se dan a conocer con más detalle en este documento. 4. Mutantes FGF21 Resistente a Proteólisis Como se describe en el Ejemplo 8, el FGF21 maduro se descubrió que se somete a la degradación in vivo, la cual se determinó finalmente que surge del ataque proteolitico. La degradación in vivo del FGF21 maduro se descubrió que conduce a una vida media efectiva más corta, lo cual puede afectar adversamente el potencial terapéutico de una molécula. Por consiguiente, se realizó un estudio dirigido para identificar mutantes FGF21 que exhiben una resistencia a la proteólisis. Como resultado de esta investigación, los sitios en el polipéptido FGF21 maduro que se determinaron por ser particularmente susceptibles a la proteólisis incluyen el enlace de péptido entre los residuos de aminoácido en. las posiciones 4-5, 20-21, 151-152, y 171-172.
Un estudio amplio pero enfocado y dirigido se realizó para identificar sustituciones particulares que eliminan el efecto proteolitico observado mientras que no afecta la actividad de la proteína a un grado inaceptable. La Tabla 8 y Tabla 11 resaltan algunos de los mutantes que se prepararon y se sometieron a prueba. Como se describe en, por ejemplo, los Ejemplos 13 y 14, no todos los mutantes FGF21 exhibieron un perfil ideal; algunos mutantes confirieron resistencia a la proteólisis pero a costa de la actividad FGF21 comprometida. Otras mutaciones retuvieron la actividad FGF21 pero no confirieron resistencia a la proteólisis. Varios mutantes, que incluyen, por ejemplo, FGF21 . P171G, retuvieron un nivel similar de actividad como el FGF21 de tipo silvestre mientras que también exhiben resistencia a la degradación proteolitica .
Un criterio de selección para identificar mutantes FGF21 resistentes a la proteólisis deseables fue que la actividad del mutante FGF2I es esencialmente el mismo como, o mayor que, la actividad del FGF21 de tipo silvestre. Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención se dirige a mutantes FGF21 que son resistentes a la proteólisis y aún retienen la actividad que es esencialmente la misma como, o mayor que, el FGF21 de tipo silvestre. Aunque menos deseable en algunos casos, los mutantes FGF21 que son resistentes a la proteólisis pero exhiben de alguna manera actividad disminuida forman otra modalidad de la presente invención. En algunos casos puede ser deseable mantener un grado de proteólisis, y consecuentemente, los mutantes FGF21 que permiten que ocurra algún grado de proteólisis también pueden formar otra modalidad de la presente invención.
Como con todos los mutantes FGF21 de la presente invención, los mutantes FGF21 resistentes a' la proteólisis de la presente invención se pueden preparar como se describe en este documento. Aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo, por ejemplo, aquellos familiarizados con las técnicas de biología molecular estándares, pueden emplear ese conocimiento, acoplado con la presente descripción, para ser y usar los mutantes FGF21 resistentes a la proteólisis de la presente invención. Se pueden usar técnicas estándares, para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos , cultivo de tejidos, y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra, la cual se incorpora en este documento a manera de referencia para cualquier propósito. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se pueden realizar de acuerdo con las especificaciones del fabricante, . como ser logra comúnmente en el campo, o como es describe en este documento. A menos que se proporcionen definiciones específicas, las nomenclaturas usadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en este documento son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en el campo. Se pueden usar técnicas estándares para la síntesis química, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, y suministro; y tratamiento de pacientes.
Los mutantes FGF21 resistentes a la proteólisis de la presente invención se pueden fusionar a otra entidad, la cual puede impartir propiedades adicionales al mutante FGF21 resistentes a proteólisis. En una modalidad de la presente invención, un mutante FGF21 resistentes a la proteólisis se puede fusionar a una secuencia IgG Fe, por ejemplo, SEQ ID NO: 13. Esta fusión se puede lograr usando métodos biológicos moleculares conocidos y/o la guia proporcionada en este documento. Los beneficios de estos polipéptidos de fusión, asi como también métodos para hacer estos polipéptidos de fusión, son conocidos y se plantean con más detalle en este documento. 5. Mutantes FGF21 de Reducción de Agregación Como se describe en el Ejemplo 15, una propiedad del polipéptido FGF21 de tipo silvestre es su propensión al agregado. En las concentraciones arriba de aproximadamente 5 mg/mL, la velocidad de agregación es alta a temperatura ambiente. Como se muestra y se describe en este documento, la velocidad de agregación para el polipéptido FGF21 de tipo silvestre es dependiente tanto de concentración como de temperatura.
La agregación puede probar que es un reto cuando se trabaja con el FGF21 de tipo silvestre en estas concentraciones, tal como en el contexto de una formulación terapéutica. Por consiguiente, se realizó un estudio dirigido para identificar mutantes FGF21 que exhiben agregación FGF21 reducida. Los mutantes FGF21 resultantes luego se sometieron a prueba para la propensión de agregarse en ' varias concentraciones .
Se ' realizó un estudio amplio pero enfocado y dirigido para identificar sustituciones particulares que eliminan o reducen el efecto de agregación observado del FGF21 de tipo . silvestre mientras que no afecta la actividad de la proteina a un grado inaceptable. El procedimiento para identificar mutantes de reducción de agregación adecuados se describen en el Ejemplo 15. La Tabla 16 resalta algunos de los mutantes que se prepararon y se sometieron a prueba. Como se describe en, por ejemplo, · el Ejemplo 17, no todos los mutantes FGF21 exhibieron un perfil ideal. Algunos mutantes, tal como FGF21 L58E tuvieron la actividad FGF21 comprometida y no se estudiaron adicionalmente . Otras mutaciones, tal como FGF21 A134E, retuvieron la actividad FGF21 pero no confirieron propiedades de agregación reducidas. Varios mutantes, tal como FGF21 L98R, retuvieron la actividad FGF21 y también exhibieron agregación reducida. Un mutante, FGF21 A45K, exhibió sorprendentemente una -actividad incrementada mientras que tampoco exhibió propiedades de agregación reducidas.
Un criterios de selección para identificar los mutantes FGF21 de reducción de agregación deseables fue que la actividad del mutante FGF21 fue esencialmente similar a, o mayor que, la actividad del FGF21 de tipo silvestre. Por lo tanto, otra modalidad de . la presente invención se dirige a mutantes FGF21 que tienen propiedades de agregación reducidas mientras que aún retienen una actividad FGF21 que es similar a, o mayor que, el FGF21 de tipo silvestre. Aunque menos deseable en algunos casos, los mutantes FGF21 que tienen propiedades · de agregación reducidas pero que exhiben de alguna manera actividad FGF21 disminuida forman otra modalidad de la presente invención. En algunos casos, puede ser deseable mantener un grado de agregación, y consecuentemente, los mutantes FGF21 que permitan que ocurra algún grado de agregación . también forman otra modalidad de la presente invención.
Como con todos los mutantes FGF21 de la presente invención, los mutantes FGF21 de reducción de agregación de la presente invención se pueden preparar como se. describe en este documento. Aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo, familiarizadas con las técnicas de biología molecular estándares pueden emplear ese conocimiento, acoplado con la presente descripción, para ser y usar los mutantes FGF21 de reducción de agregación de la presente invención. Se pueden usar técnicas estándares para ADN recombinante , síntesis de oligonucleótidos , cultivo de tejidos, y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Véase, por ejemplo', Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra, la cual se incorpora en este documento a manera de referencia para cualquier propósito. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se pueden realizar de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se logra comúnmente en el campo, o como se describe en este documento. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura usadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, la química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y. farmacéutica descrita en este documento son aquellos bien conocidos y usados comúnmente en el campo. Se pueden usar técnicas estándares para síntesis químicas; análisis químicos; preparación farmacéutica, formulación, y suministro; y tratamiento de pacientes.
Los mutantes FGF21 de reducción de agregación de la presente invención se pueden fusionar a otra entidad, la cual puede impartir propiedades adicionales al mutante FGF21 de reducción de agregación. En una modalidad de la presente invención, un mutante FGF21 de reducción de agregación se puede fusionar a una secuencia IgG Fe, por ejemplo, SEQ ID NO: 13. Esta fusión se puede lograr usando métodos biológicos moleculares conocidos y/o la guia proporcionada en este documento. Los beneficios de estos polipéptidos de fusión, asi como también métodos para hacer estos polipéptidos de fusión, se plantean con más detalle en este documento. 6. Mutantes de Combinación FGF21 Como se describe en este documento, la secuencia FGF21 de tipo silvestre posee varias propiedades que pueden plantear retos significativos cuando FGF21 se usa como una molécula terapéutica. Entre estos retos son la susceptibilidad a la degradación de la proteina y su propensión a la agregación en una alta concentración. Después de un esfuerzo exhaustivo para identificar los polipéptidos FGF21s que superan cada uno de estos retos, se realizó un estudio dirigido para determinar' si las sustituciones de aminoácido que confieren resistencia a la proteólisis y aquellas que confieren propiedades de reducción de agregación se podrían combinar en un aditivo o forma sinérgica en una secuencia de polipéptidos individual mientras que mantienen los niveles de actividad que son iguales a o mayores que la actividad del 'FGF21 de tipo .silvestre. Esto representó un reto significativo, ya que se sabe en el campo que ' la introducción de múltiples mutaciones en un polipéptido proporcionado algunas veces puede afectar adversamente la expresión, actividad, y · manufactura subsecuente de la proteina .
Sorprendentemente, como se demuestra en, por ejemplo, los Ejemplos 19 y 20, se descubrió que las propiedades deseables de varios mutantes FGF21 de hecho se podrían combinar en una forma de aditivo o sinérgica para genera un mutante FGF21 que tiene propiedades farmacéuticas mejoradas. Se dan a conocer en este documento mutantes FGF21 que son resistentes a la proteólisis, tienen una velocidad reducida de agregación, y los cuales aún retienen la actividad que es la misma como, o mayor que, el FGF21 de tipo silvestre .
Un criterio de selección para identificar mutantes de combinación FGF21 deseables fue que la actividad del mutante FGF21 es similar a, o mayor que, la actividad del FGF21 de tipo silvestre. Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención se dirige a. mutantes FGF21 que son resistentes a la proteólisis y tienen propiedades de agregación reducidas mientras que aún retienen una actividad FGF21 que es similar a, o mayor que, FGF21 de tipo silvestre. Aunque menos deseables en ' algunos casos, los mutantes FGF21 que son resistentes a la proteólisis y tienen propiedades de agregación reducidas pero exhiben de alguna manera una actividad FGF21 disminuida forman otra modalidad de la presente invención. En algunos casos, puede ser deseable mantener un grado de proteólisis y/o agregación, y consecuentemente, los mutantes FGF21 que permiten algún grado de proteólisis y/o agregación también forman otra modalidad de la presente invención.
Como con todos los mutantes FGF21 de la presente invención, los mutantes de combinación FGF21 de 'la presente invención se pueden preparar como se describe en este documento. Aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo, familiarizadas con las técnicas de biología molecular estándares, pueden emplear ese conocimiento, acoplado con la presente descripción, para hacer y usar los mutantes de combinación FGF21 de la presente invención. Se pueden usar técnicas estándares para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos , cultivo de tejidos, y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra, la cual se incorpora en este documento a manera de referencia para cualquier propósito. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se pueden realizar de acuerdo con las especificaciones del fabricante como se logra comúnmente en el campo, o como es describe en este documento. A menos que se proporcionen definiciones específicas las nomenclaturas usadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en este documento son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en el campo. Se pueden usar técnicas estándares para síntesis químicas; análisis químico; preparación farmacéutica, formulación y suministro; y tratamiento de pacientes.
Los mutantes de combinación FGF21 de la presente invención se pueden fusionar a otra entidad, la cual puede impartir propiedades adicionales al mutante de combinación. En una modalidad de la presente invención, un mutante de combinación FGF21 se puede fusionar a una secuencia IgG Fe, por ejemplo, SEQ ID NO: 13'. Esta fusión se puede lograr usando métodos biológicos moleculares conocidos y/o la guía proporcionada en este documento. Los beneficios de estos polipéptidos de fusión, así como también métodos para hacer estos polipéptidos de fusión, se plantean con más detalle en este documento. 7. Proteínas de Fusión FGF21 Como se usa en este documento, el término "polipéptido de fusión FGF21" o "proteína de fusión FGF21" se refiere a una fusión de uno o más residuos de aminoácido (tal como una proteina o péptido heterologo) en la N-terminal o C-terminal de cualquier mutante de polipéptido FGF21 descrito en este documento.
Los péptidos y polipéptidos heterólogos incluyen, pero no se limitan a, un epitopo para permitir la detección y/o aislamiento de un mutante de polipéptido FGF21; una proteina del receptor transmembrana o una porción de la misma, tal como un dominio extracelular o un dominio transmembrana e intracelular ; un ligando o una porción del mismo el cual se enlaza a una proteina del receptor transmembrana; una enzima o porción de la misma que es catalíticamente activa; un polipéptido o péptido el cual promueve la oligomerización,. tal como un dominio de cremallera de leucina; un polipéptido o péptido el cual incrementa la estabilidad, tal como una región constante de inmunoglobulina ; un anticuerpo funcional o no funcional, o una cadena pesada o ligera del mismo; y un polipéptido el cual tiene una actividad, tal como una actividad terapéutica, diferente de los mutantes del polipéptido FGF21 de la presente invención. También se abarcan por la presente invención los mutantes FGF21 fusionados a la albúmina de suero humana (HSA) .
Las proteínas de fusión FGF21 se pueden hacer al fusionar secuencias heterólogas en ya sea la N-terminal o en la C-terminal de un mutante de polipéptido FGF21. Como se describe en este documento, una secuencia heteróloga puede ser una secuencia de aminoácidos o un polímero que no contiene aminoácidos. Las secuencias heterólogas se pueden fusionar ya sea directamente al mutante del polipéptido FGF21 o por la vía de una molécula enlazadora o adaptadora. Una molécula enlazadora o adaptadora puede ser uno o más residuos de aminoácido (o -mers), por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 residuos (o -mers) , preferiblemente de 10 a 50 residuos de aminoácido (o -mers), por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 3.0, 35, 40, 45, o 50 residuos (o -mers), y más preferiblemente de 15 a 35 residuos de aminoácido (o -mers) . Una molécula enlazadora o adaptadora también se puede diseñar con un sitio de escisión para una endonucleasa de restricción de ADN o para una proteasa para permitir la separación de las porciones fusionadas. a. Fusiones Fe En una modalidad de la presente invención, un mutante de polipéptido FGF21 se fusiona a uno o más dominios de una región Fe de IgG humano. Los anticuerpos comprenden dos partes funcionalmente independientes, un dominio variable conocido como "Fab", que se enlaza a un antígeno, y un dominio constante conocido como "Fe", que se implica en las funciones efectoras tal como activación de complemento y ataque por células fagociticas. Un Fe tiene una vida media en suero larga, mientras que un Fab es de corta duración (Capón y colaboradores, 1989, Nature 337: 525-31). Cuando se unen junto con una proteina terapéutica, un dominio Fe puede proporcionar vida media más prolongada o incorporar estas funciones como el enlace del receptor Fe, enlace de proteina A, fijación de complemento, y tal vez a un transferencia placentaria (Capón y colaboradores, 1989) .
El análisis farmacocinético in vivo indicó que el FGF21 humano tiene una vida media corta de aproximadamente 1 hora en ratones debido a la rápida eliminación y degradación in vivo. Por. lo tanto, para prolongar la vida media del FGF21 se fusionó una secuencia Fe al extremo N- o C-terminal del polipéptido FGF21. La fusión de una región Fe al FGF21 de tipo silvestre, en particularmente el Fe fusionado a la N-terminal del FGF21 de tipo silvestre, no prolongó la vida media como se esperó, sin embargo, la cual condujo a una investigación de la degradación proteolitica del FGF21 in vivo y a la identificación de los mutantes FGF21 que fueron resistentes a esta degradación. Estos mutantes se describen en, por ejemplo, los Ejemplos 8 y 11, y exhiben vidas medidas más prolongadas que el FGF21 de tipo silvestre. Estas y otras proteínas de fusión FGF21 forman modalidades de la presente invención.
Por toda la descripción, Fc-FGF21 se refiere a una proteína de fusión en la cual la secuencia Fe se fusiona a la N-terminal de FGF21.. Similarmente , por toda la descripción, FGF21-FC se refiere a una proteína de fusión en la cual la secuencia Fe se fusiona a la C-term.inal de FGF21.
La proteína de fusión FGF21 resultante se puede purificar, por ejemplo, mediante el uso de una columna de afinidad de proteína A. los péptidos y proteínas fusionados a una región Fe se han descubierto que exhiben una vida media sustancialmente mayor . in vivo que la contraparte no fusionada. También, una fusión en la región Fe permite la dimerización/multimerización del polipéptido de fusión. La región Fe puede ser. una región Fe de origen natural, o se puede alterar para mejorar ciertas cualidades, tales como cualidades terapéuticas, tiempo de circulación o agregación reducida.
Modificaciones útiles de agentes terapéuticos' proteínicos por la fusión con el dominio "Fe" de un anticuerpo se plantean con detalle en la Publicación Internacional No. WO 00/024782, la cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad. Este documento plantea el enlace a . un "vehículo" tal como polietilenglicol (PEG), dextrano, o una región Fe. b. Ligaduras de Proteína de Fusión Al formar las proteínas de fusión de la presente invención, una ligadura puede, pero no necesita ser empleado.. Cuando está presente, la estructura química de la ligadura puede ser no crítica, puesto que sirve principalmente como un espaciador. La ligadura puede estar constituida de aminoácidos enlazados conjuntamente por enlaces de péptido. En algunas modalidades de la presente invención, la ligadura está constituida de 1 a 20 aminoácidos enlazados por enlaces de péptido, en donde los aminoácidos se seleccionan de los 20 aminoácidos de origen natural. En varias modalidades, se selecciona de 1 a 20 aminoácidos de los aminoácidos glicina, serina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. En algunas modalidades, una ligadura está constituida de una mayoría de aminoácidos que son estéricamente impedidos, tal como glicina y alanina. En algunas modalidades, las ligaduras son poliglicinas (tal como (Gly)4 '(SEQ ID NO:29) y (Gly)5 (SEQ ID NO:30)), polialaninas , combinaciones de glicina y alanina (tal como poli (Gly- Ala) ) , o combinaciones de glicina y serina (tal como poli (Gly-Ser ) ) . Otros ligaduras adecuados incluyen: (Gly) 5-Ser- (Gly) 3-Ser- (Gly ) 4-Ser (SEQ ID NO:23), (Gly) 4- Ser- (Gly) 4-Ser- (Gly) 4-Ser (SEQ ID NO:31), (Gly)3-LyS-(Gly)4 (SEQ ID NO: 32), (Gly) 3-Asn-Gly- Ser- (Gly) 2 (SEQ ID NO:33), (Gly) 3-CyS- (Gly) 4 ( SEQ ID NO:34), y Gly-Pro-Asn-Gly-Gly (SEQ ID NO: 35). Mientras que una ligadura de 15 residuos de aminoácido se ha descubierto que funciona particularmente bien para las proteínas de fusión FGF21, la presente invención contempla ligaduras de cualquier longitud o composición.
Las ligaduras descritas en este documento son ejemplares, y las ligaduras que son mucho más grandes y las cuales incluyen otros residuos se contemplan por la presente invención. Las ligaduras no de péptido también se contemplan por la presente invención. Por ejemplo, las ligaduras de alquilo tal como -NH- (CH2) s-C (O) -, en donde s = 2 a 20, se podrían usar. Estas ligaduras de alquilo se pueden sustituir adicionalmente por cualquier grupo no estéricamente impedido, que incluye, pero no se limita a, un alquilo inferior (por ejemplo, C1-C6) , acilo inferior, halógeno (por ejemplo, Cl, Br) , CN, NH2 o fenilo. Una ligadura no de péptido ejemplar es una ligadura de polietilenglicol , en donde la ligadura tiene un peso molecular de 100 a 5000 kD, por ejemplo, 100 a 500 kD. 8. Mutantes FGF21 Químicamente Modificados Las formas químicamente modificadas de los mutantes de polipéptido FGF21 descritos en este documento, que incluyen las formas truncadas de FGF21 descritas en este documento, se pueden preparar para una persona experta en el campo, dadas las descripciones descritas en este documento. Estos mutantes FGF21 químicamente modificados se alteran tal que el mutante FGF21 químicamente modificado es diferente del mutante FGF21 no modificado, ya sea en el tipo o ubicación de las moléculas unidas naturalmente al mutante FGF21. Los mutantes FGF21 químicamente modificados pueden incluir moléculas formadas por la supresión de uno o más grupos químicos naturalmente unidos.
En una modalidad, los mutantes de polipéptido FGF21 de la presente invención se pueden modificar por la unión covalente de. uno o más polímeros. Por ejemplo, el polímero seleccionado es típicamente soluble en agua de modo que la proteína a la cual se une no se precipita en un medio ambiente acuoso tal como un medio ambiente fisiológico. Se incluye dentro del alcance de los polímeros adecuados una mezcla de polímeros. Preferiblemente, para el uso terapéutico de la preparación del producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. Los polímeros solubles no en agua conjugados a- los mutantes de polipéptido FGF21 de la presente invención también forman un aspecto de la invención.
Cada uno de los polímeros ejemplares puede ser de cualquier pero molecular y puede ser ramificado o no ramificado. Cada uno de los polímeros tiene típicamente un peso molecular promedio de entre aproximadamente 2 kDa ' a aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que en las preparaciones de un polímero soluble en agua, algunas moléculas pesarán más y algunas menos gue el peso molecular establecido) . El pero molecular promedio de cada polímero está preferiblemente entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 50 kDa, más preferiblemente entre aproximadamente 12 kDa y aproximadamente 40 kDa, y mucho más preferiblemente entre aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 35 kDa . - Los polímeros solubles en "agua adecuados o mezclas de los mismos incluyen, pero no se limitan a, carbohidratos ligados en N u . ligados en O, azúcares, fosfatos, polietilenglicol (PEG) (incluyendo las formas de PEG que se han usado para modificar proteínas, que incluyen mono- (Ci-Cío), alcoxi-, o ariloxi-polietilenglicol ) , monometoxi-polietilenglicol , dextrano (tal como dextrano de peso molecular bajo de, por ejemplo, de aproximadamente 6 kD) , celulosa, u otros polímeros basados en carbohidratos, poli-(N-vinil-pirrolidona) · polietilenglicol , homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), y alcohol polivinílico . También se abarcan por la presente invención moléculas reticuladoras bifuncionales que se pueden usar para preparar multimeros de mutante de polipéptido FGF21 covalentemente unidos. También se abarcan por la presente invención mutantes FGF21 covalentemente unidos a ácido polisiálico .
En algunas modalidades de la presente invención, un mutante FGF21 se modifica covalente o químicamente para incluir uno o¦ más polímeros solubles en agua, que incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol , (PEG), polioxietilenglicol, o polipropilenglicol . Véase, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; y 4,179,337. En algunas modalidades de la presente invención, un mutante FGF21 comprende uno o más polímeros, que incluyen pero no se limitan a, monometoxi-polietilenglicol , dextrano, celulosa, otro polímero basado en carbohidratos, poli- (N-vinilpirrolidona ) -polietilenglicol , homopolímeros de propilenglicól , un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico, o mezclas de estos polímeros.
En algunas modalidades de la presente invención, un mutante FGF21 se modifica covalentemente con subunidades de PEG. En algunas modalidades, uno o más polímeros solubles en agua se enlazan en una o más posiciones específicas (por ejemplo, en la N-terminal) del mutante FGF21. En algunas modalidades, uno o más polímeros solubles en agua se unen aleatoriamente a una o más cadenas laterales de un mutante FGF21. En algunas modalidades, el PEG se usa para mejorar la capacidad terapéutica de un mutante FGF21 ciertos de estos métodos son planteados, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 6,133,426, la cual se incorpora por este documento a manera de referencia para cualquier propósito.
En modalidades de la presente invención en donde el polímero es PEG, el grupo PEG puede ser de cualquier peso molecular conveniente, y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular promedio del grupo PEG variará preferiblemente de aproximadamente 2 kD a aproximadamente 100 kDa, y más preferiblemente de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa, por ejemplo, 10, 20, 30, 40/ o 50 kDa. Los grupos PEG se unirán generalmente al mutante FGF21. por la vía de la acilación o alquilación reductora a través de un grupo reactivo sobre la porción PEG (por ejemplo, un grupo aldehido, amino, tiol, o éster) a un grupo reactivo sobre el mutante FGF21 (por . ejemplo, un grupo aldehido, amino, o éster) .
La PEGilación de un polipéptido, que incluye los mutantes FGF21 de la presente invención, se puede llevar a cabo específicamente usando cualquiera de las reacciones de PEGilación conocidas en el campo. Estas reacciones se describen, por ejemplo, en las siguientes referencias: Francis y colaboradores, 1992, Focus on Growth Factors 3: 4-10; Patentes Europeas Nos. 0 154 316 y 0 401 384; y la Patente de E.U.A. No. 4,179,337. Por ejemplo, la PEGilación se puede llevar a cabo por la vía de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo) como se describe en este documento. Para las reacciones de acilación, un polímero seleccionado debe tener un grupo éster reactivo individual. Para la alquilación reducida, un polímero seleccionado debe tener un grupo aldehido reactivo individual. Un aldehido reactivo es, por ejemplo, propionaldehído de polietilenglicol, el cual es estable en agua, o derivados de mono o ariloxi de 1 a 10 átomos de carbono de los mismos (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,252,714).
En algunas modalidades de la presente invención, una estrategia útil para la unión del grupo PEG a un polipéptido implica combinar, a través de la formación de un enlace conjugado en solución, un péptido y una porción de PEG, cada una lleva una funcionalidad especial que es mutuamente reactiva hacia la otra. Los péptidos se pueden preparar fácilmente con síntesis de fase sólida convencional. Los péptidos se "pre-activan" con un grupo funcional apropiado en un sitio específico. Los precursores se purifican y se caracterizan totalmente antes de reaccionar con la porción PEG. La ligación del péptido con PEG toma lugar usualmente en fase acuosa y se puede supervisar fácilmente por la HPLC analítica de fase inversa. Los péptidos PEGilados se pueden purificar fácilmente por la HPLC preparativa y se caracteriza por una HPLC analítica, análisis de aminoácidos y espectrometría de masas de desorción láser.
Los polímeros de polisacárido son otro tipo de polímero soluble en agua que se puede usar para la modificación de proteínas. Por lo tanto, los mutantes FGF21 de la presente invención fusionados a un polímero de polisacárido forman modalidades de la presente invención. Los dextranos son polímeros de polisacárido comprendido de subunidades individuales de glucosa enlazadas predominantemente por los enlaces alfa 1-6. El dextrano mismo está disponible en muchos intervalos de peso molecular, y está fácilmente disponible en pesos moleculares de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 70 kD. El dextrano es un polímero soluble en agua adecuado para el uso como un vehículo por sí mismo o en combinación con otro vehículo (por ejemplo, Fe). Véase, por ejemplo, Publicación Internacional No. WO 96/11953. Se ha reportado el uso de dextrano conjugado con inmunoglobulinas terapéuticas o de diagnóstico. Véase, or ejemplo, Publicación de Patente Europea No. 0 315 456, la cual se incorpora en este documento a manera de referencia. La presente invención también abarca el uso de dextrano de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 20 kD.
En general,, la modificación química se puede realizar bajo cualquier condición adecuada y usada para hacer reaccionar una proteína con una molécula de polímero activada. Métodos para preparar polipéptidos químicamente modificados comprenderán generalmente las etapas de: (a) hacer reaccionar el polipéptido con la molécula de polímero activada (tal como un éter reactivo o derivado de aldehido de la molécula de polímero), bajo condiciones mediante las cuales un mutante de polipéptido FGF21 llega a ser unido a una o más moléculas de polímero, y (b) obtener los productos de reacción. Las condiciones de reacción óptimas se determinarán con base en parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, mientras más grande es .la relación de las moléculas de polímero a la proteína, mayor es el porcentaje de la molécula de polímero unida. En una modalidad de la presente invención, los mutantes FGF21 químicamente modificados pueden tener una sola porción · de molécula de polímero en la amino-terminal (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.S. No. 5, 234, 784) .
En otra modalidad de la presente invención, los mutantes de polipéptido FGF21 se pueden acoplar químicamente a la biotina. Los mutantes de polipéptido biotina/FGF21 luego se dejan enlazar a la avidina, dando por resultado mutantes de polipéptido avidina/biotina/FGF21 tetravalentes. Los mutantes de polipéptido FGF21 también se pueden acoplar covalentemente al dinitrofenol (DNP) o trinitrofenol (TNP) y los conjugados resultantes precipitados con el anti-DNP o anti-TNP-IgM para formar conjugado decaméricos con una valencia de 10.
Generalmente, las condiciones que se pueden mejorar o modular por la administración de los presentes mutantes FGF21 químicamente modificados incluyen aquellos descritos en este documento para lo.s mutantes de polipéptido FGF21. Sin embargo, los mutantes FGF21 químicamente modificados dados a conocer en este documento pueden tener actividades adicionales, actividad biológica mejorada o reducida, u otras características, tal como vida media incrementada o disminuida, como es comparado con los mutantes FGF21 no modificaos. 9. Composiciones Terapéuticas de Mutantes FGF21 y Administración de las Mismas Las composiciones terapéuticas que comprenden mutantes FGF21 están .dentro del alcance de la presente invención, y se contemplan específicamente en vista de la identificación de varias secuencias FGF21 mutantes que exhiben propiedades mejoradas. Estas composiciones farmacéuticas de mutante FGF21 pueden comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de un mutante . de polipéptido FGF21 en mezcla con un agente de formulación farmacéutica o fisiológicamente aceptable seleccionado para conveniencia con el modo de administración.
Los materiales de formulación aceptables. son preferiblemente no tóxicos a los recipientes en las dosificaciones y concentraciones empleadas.
La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o preservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, absorción, o penetración de la composición. Materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tal como glicina, glutamina, asparagina, arginina, o lisina), antimicrobianos, antioxidantes (tal como ácido ascórbico, sulfito de sodio, o hidrógeno-sulfito de sodio) , soluciones amortiguadoras (tal como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos, u otros ácidos orgánicos), agentes de volumen (tal como manitol y glicina) , agentes quelantes (tal como ácido etilendiamin tetraacético (EDTA) ) , agentes de complejo (tal como cafeína, polivinilpirrolidona, beta- . ciclodextrina, o hidroxipropil-beta-ciclodextrina) , rellenadores , monosacáridos , ' disacáridos y otros ¦ carbohidratos (tal como glucosa, mañosa, o dextrinas), proteínas (tal como albúmina de ¦ suero, gelatina o inmunoglobulinas ) , agentes colorantes, saborizantes .y de dilución, agentes emulsionantes, polímeros hidrofílicos (tal como polivinilpirrolidona ) , - polipéptidos de peso molecular bajo, contraiones formadores de sal (tal como sodio) , conservadores (tal como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico., timorosal, alcohol genetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico, o peróxido de hidrógeno) , solventes (tal como glicerina, propilenglicol, o polietilenglicol ) , alcoholes de azúcar (tal como manitol o. sorbitol), agentes de suspensión, surfactantes o agentes humectantes (tal como plurónicos; PEG; ésteres de sorbitan; polisorbatos tal como polisorbato 20 o polisorbato 80; tritón; trometamina; lecitina; .colesterol o tiloxapal), . agentes mejoradores de la estabilidad (tal como sacarosa o sorbitol), agentes mejoradores de tonicidad (tal como haluros de metal alcalino - preferiblemente cloruro de sodio o potasio - o manitol sorbitol) ,· vehículos de suministro, diluyentes, excipientes y/ adyuvantes farmacéuticos (véase, por ejemplo; Remington' s Pharmaceutical Sciences (18th Ed. , A.R. Gennaro, ed. , Mack Publishing Company 1990), y ediciones subsecuentes de los mismos, incorporados en este documento a manera de referencia para cualquier propósito) .
La composición farmacéutica óptima se determinará por un técnico experto dependiendo, por ejemplo, de la vía propuesta de administración, formato de suministro, y dosificación deseada {véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) . Estas composiciones pueden afectar el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y velocidad de' eliminación in vivo del mutante de polipéptido FGF21.
El vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser ya sea acuoso o no acuoso en carácter. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado para . la inyección puede ser agua, solución salina fisiológica, o líquido cefalorraquídeo artificial, suplementado posiblemente con otros materiales comunes en las composiciones para la administración parenteral. La solución salina amortiguada neutra o solución salina mezclada con albúmina de suero son vehículos ejemplares adicionales. Otras composiciones farmacéuticas ejemplares comprenden solución amortiguadora Tris de aproximadamente pH 7.0-8.5, o sol-ución amortiguadora de acetato de aproximadamente pH 4.0-5.5, las cuales pueden incluir además sorbitol o un substituto adecuado. En una modalidad de- la presente invención, las composiciones mutantes de polipéptido. FGF21 se pueden preparar para •almacenamiento al mezclar la composición seleccionada que tiene el grado deseado ' de pureza con agentes de formulación opcionales (Remington ' s Pharmaceutical Sciences, supra) en la forma de una torta liofilizada o una solución acuosa/ Además, el producto de mutante de polipéptido .FGF21 se puede formular como un liofilizado usando excipientes apropiados tal como sacarosa.
Las composiciones farmacéuticas de mutante de polipéptido FGF21 se pueden seleccionar para el suministro parenteral. Alternativamente, las composiciones se pueden seleccionar para la inhalación o para el suministro .a través del tracto digestivo, tal como oralmente. La preparación . de estas composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la experiencia del campo.
Los componentes de formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Por ejemplo, las soluciones amortiguadoras se usan para mantener la composición en pH fisiológico o en un pH ligeramente más bajo, típicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente .8.
Cuando la administración parenteral se contempla, las composiciones terapéuticas para el uso en esta invención pueden estar en la forma de una solución acuosa, parenteralmente aceptable,- sin . pirógeno que comprende el mutante de polipéptido FGF21 deseado en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para la inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual un mutante de polipéptido FGF21 se formula como una solución isotónica, estéril apropiadamente conservada. Todavía otra preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables , compuestos poliméricos (tal- como' ácido poliláctico o ácido poliglicólico) , perlas, o liposomas, que proporciona la liberación controlada o sostenida del producto el cual luego se puede administrar por la vía de una inyección de depósito. El ácido hialurónico también se puede usar, y este puede tener el efecto de promover una duración sostenida en la circulación. Otro medio adecuado para la introducción de la molécula deseada incluye dispositivos de suministro de fármaco implantables .
En una modalidad, una composición' farmacéutica se puede formular para inhalación. Por ejemplo, un mutante de polipéptido FGF21 se puede formular como un polvo seco para inhalación. Las soluciones de inhalación de mutante de. polipéptido FGF21 también se pueden formular con un propelente para el suministro en aerosol. En todavía otra modalidad, las soluciones se pueden nebulizar. La administración pulmonar se describe adicionalmente en. la Publicación Internacional No. O 94/20069, la cual describe el suministro pulmonar de proteínas químicamente modificadas.
También se contempla que ciertas formulaciones se pueden administrar oralmente. En una modalidad de la presente invención, los mutantes de polipéptido FGF21 que se administran en esta forma se pueden formular con o sin esos portadores usados acostumbradamente en la composición de formas de dosificación sólidas tales como tabletas y cápsulas. Por ejemplo, ¦ una cápsula se puede diseñar para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal cuando la biodisponibilidad se maximiza y la degradación pre-sistémica se minimiza. Agentes adicionales se pueden incluir para facilitar la absorción del mutante de polipéptido FGF21. Diluyentes, saborizantes , ceras de punto de fusión bajo,' aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes desintegrantes de tabletas, y aglutinantes también -se pueden emplear.
Otra composición farmacéutica puede implicar una cantidad efectiva de mutantes de polipéptido FGF21 en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la manufactura de tabletas. Al disolver las tabletas en agua estéril, u otro vehículo apropiado, las soluciones se pueden preparar en forma de dosificación unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tal como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa, o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes tal como almidón, gelatina, o acacia; o agentes lubricantes tal como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.
La's composiciones farmacéuticas de mutante de polipéptido FGF21 adicionales serán evidentes para aquellas personas expertas en el campo, que incluyen formulaciones que implican mutantes de polipéptido FGF21 en formulaciones de suministro sostenido o controlado. Técnica para formular una variedad de otros medios de suministro sostenido o controlado, tal como portadores de liposomas, microparticulas bioerosionables o perlas porosas e inyecciones .de depósito, también son conocidos por aquellas personas expertas en el campo {véase, por ejemplo, Publicación International No. O 93/15722, la cual describe la liberación controlada de 'microparticulas poliméricas porosas para el suministro de composiciones farmacéuticas, y. ischke & Schwendeman, 2008, Int. J. Pharm. 364: 298-327, and Freiberg & Zhu, 2004, Int. J. Pharm.. 282: 1-18, las cuales plantean la preparación y uso de microesferas/microparticulas ) .
Ejemplos adicionales de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímero semipermeables en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas o microcápsulas . Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilacturos (Patente de E.U.A. No. 3,773,919 y Patente Europea No. 0 . 058 481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman y colaboradores, 1983, Biopolymers 22: 547-56), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer y colaboradores, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), etilen-acetato de vinilo (Langer y colaboradores, supra) o ácido poli-D ( - ) -3-hidroxibutírico (Patente Europea No. 0 133. 988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, las cuales se pueden preparar mediante cualquiera de varios ¦ métodos conocidos en el campo. Véase,-, por ejemplo, Epstein y colaboradores, 1985, Proc . Nati. Acad. Sci. U.E.A. 82: 3688- 92; y Patentes Europeas Nos. 0 036 676, 0 088 046,. y 0 143 949.
La composición farmacéutica de mutante de polipéptido FGF21 que se usa ' para la administración in vivo debe ser típicamente estéril. Esto se puede lograr mediante la filtración a través de' membranas de filtración estériles. Donde la composición se liofiliza, la esterilización que usa este método se puede conducir ya sea antes de, o después, de la liofilización y. reconstitución; La composición para la administración parenteral. se puede almacenar en forma liofilizada o en una solución. Además, las composiciones parenterales se colocan generalmente dentro de un contenedor que tiene un orificio de acceso estéril,- por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o frasquito que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
Una vez que la composición farmacéutica se ha formulado, se puede almacenar en frasquitos estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o como un polvo deshidratado o liofilizado. Estas formulaciones se pueden almacenar ya sea en una forma lista para usar o en una forma (por . ejemplo, liofilizada) que requiere reconstitución antes de la administración.
En una modalidad especifica, la presente invención se dirige a kits para producir una unidad de administración de dosis individual. Los kits pueden contener cada uno tanto un primer contenedor que tiene una proteina seca y como un segundo contenedor que tiene una formulación acuosa. También se incluyen dentro del alcance de esta invención kits que contienen jeringas pre-llenadas de una y múltiples cámaras (por ejemplo, jeringas de liquido y lioj eringas) .
La cantidad efectiva de una composición farmacéutica de mutante de polipéptido FGF21 qué se emplea dependerá típicamente, por. ejemplo, .en el contexto y objetivos terapéuticos. Una persona experta en el campo apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento variarán de esta manera dependiendo, en parte, en la molécula suministrada, · la indicación por la cual el mutante de polipéptido FGF21 está siendo usado, la vía de administración, y el . tamaño (pero corporal, superficie corporal, o tamaño de órgano) y condición (la edad y salud general) del paciente. Por consiguiente, el médico puede titular la dosificación y modificar la vía de administración para obtener el. efecto terapéutico óptimo. Una dosificación típica puede variar de aproximadamente 0.1 pg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En otras modalidades, la dosificación puede variar .de 0.1 'pg/kg hasta a aproximadamente 100 mg/kg; o de 1 pg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 5 pg/kg, 10 pg/kg, 15 pg/kg, 20 pg/kg, 25 pg/kg, 30 pg/-kg, 35 pg/kg, 40 pg/kg, 45 pg/kg, 50 ug/kg, 55 pg/kg, 60 pg/kg, 65 pg/kg, 70 pg/kg, 75 pg/kg, hasta aproximadamente 100 mg/kg. En todavía otras modalidades, la dosificación puede ser 50 pg/kg, 100 pg/kg, 150 pg/kg, 200 pg/kg, 250 pg/kg,' 300 pg/kg, 350 pg/kg, 400 pg/kg, 450 pg/kg, 500 pg/kg, 550 pg/kg, 600 pg/kg, 650 pg/kg,' 700 pg/kg, 750 pg/kg, 800 pg/kg, 850 pg/kg, 900 pg/kg, 950 pg/kg, 100 pg/kg, 200 pg/kg, 300 pg/kg, 400 pg/kg, 500 pg/kg, 600 pg/kg, 700 pg/kg, 800 yg/kg, 900 yg/kg, 1000 yg/kg, 2000 yg/kg, 3000 yg/kg, 4000 yg/kg, 5000 yg/kg, 6000 yg/kg, 7000 yg/kg, 8000 yg/kg, 9000 yg/kg o 10 mg/kg.
La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos del mutante de polipéptido FGF21 en la formulación que se usa. Típicamente, un médico tendrá que administrar la composición hasta que se alcance una dosificación que logre el efecto deseado. La composición por lo tanto se puede administrar como una sola dosis, como dos o más dosis (las cuales pueden..o no contener la misma cantidad de la molécula, deseada) a través del tiempo, o como una infusión continua por la vía de un dispositivo de implantación o catéter. El refinamiento adicional de la dosis apropiada se hace rutinariamente por aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo' y está dentro del ámbito de las tareas realizadas rutinariamente por ellos. Las dosificaciones apropiadas se pueden cerciorar a través del uso de datos de dosis-respuesta apropiados.
La vía de administración de la composición farmacéutica está de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo, oralmente; a través de la inyección por vías intravenosas, intraperitoneales , intracerebrales (intraparénquimal) , intracerebroventricula , intramuscular, intraocular, intraarterial , intraportal , o intralesional ; por sistemas de liberación sostenida (los cuales también se pueden inyectar); o mediante dispositivos de implantación. Donde se desean, las composiciones se pueden administrar por inyección de bolo o continuamente por infusión o por un dispositivo de implantación.
Alternativa o ádicionalmente, la composición se puede administrar localmente por la vía de la implantación de una membrana, esponja, u otro material apropiado sobre el cual la molécula deseada se ha absorbido o encapsulado. Donde se usa un dispositivo- de implantación, el dispositivo se puede implantar dentro de cualquier tejido u órgano adecuado, y el suministro de la molécula deseada puede ser por la vía de infusión, bolo de- liberación cronometrada o administración continua. 10. Usos Terapéuticos de los Mutan-tes de Polipéptido FGF21 Los mutantes de ' polipéptido FGF21 se pueden usar para tratar,- diagnosticar, mejorar o prevenir una variedad de enfermedades, trastornos,, o condiciones, que incluyen, pero no se limitan a trastornos metabólicos. En una modalidad, el trastorno metabólico que se trata es diabetes, por ejemplo, diabetes tipo 2. En otra modalidad, el trastorno metabólico es obesidad. Otras modalidades incluyen condiciones o trastornos metabólicos tal como dislipidemia; hipertensión; -hepatosteaotosis , tal como esteatohepatitis no alcohólica (NASH) ; enfermedad cardiovascular, tal como aterosclerosis; y envejecimiento.
En la aplicación, un trastorno o condición tal como diabetes u obesidad se pueden tratar al administrar un mutante de polipéptido FGF21 como se describe en este documento a un paciente en necesidad del mismo en la cantidad de una dosis terapéuticamente . efectiva . La administración se puede realizar como se describe en este documento, tal como mediante inyección IV, inyección intraperitoneal , inyección intramuscular, u oralmente en la forma de una tableta o formación liquida. En la mayoría de situaciones, una dosificación deseada se puede determinar por un médico, como se describe en este documento, y puede representar una dosis terapéuticamente efectiva del polipéptido de mutante FGF21. Será evidente para aquellas personas de experiencia en el campo que una dosis terapéuticamente efectiva del polipéptido mutante FGF21 dependerá, ínter alia, en él programa de administración, la dosis unitaria de antigéno administrado, si la molécula o polipéptido de ácido nucleico se administra en combinación con otros agentes terapéuticos, el estado inmune y la salud del recipiente. El término "dosis terapéuticamente efectiva"., como se usa en este documento, propone que la cantidad de polipéptido de mutante FGF21 que induce la respuesta biológica o medicinal en un sistema de tejidos, animal, o humano que es buscado por un investigador, doctor en medicina u otro médico, el cual incluye el mejoramiento de los síntomas de la enfermedad o trastorno que se trata. 11. Anticuerpos . .
Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que se enlazan específicamente a los polipéptidos mutantes FGF21 de la 'pr sente invención pero no se enlazan específicamente á los polipéptidos FGF21 de tipo silvestre s contemplan y están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser policlonales , incluyendo policlonal monoespecí fico; ' monoclonal (MAbs) ; recombinante; quiméricos; humanizados, tal como injertados en la región de determinación de complementariedad (CDR) ; humanos; de cadena individual; y/o biespecífieos ; así como también fragmentos; variantes; o moléculas químicamente modificadas de " los mismos. Los fragmentos de anticuerpo incluyen aquellas porciones del anticuerpo que se enlaza específicamente a un epítopo sobre un polipéptido mutante FGF21. Ejemplos de estos fragmentos incluyen fragmentos Fab y F(áb') generados por la escisión enzimática de los anticuerpos de longitud completa. Otros fragmentos de enlace incluyen- aquellos generados por técnicas de ADN recombinante, tal ,como la expresión de plásmidos recombinantes que contienen secuencias de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de anticuerpos.
Los anticuerpos policlonales dirigidos hacia ' un polipéptido mutante FGF21 se producen generalmente en animales (por ejemplo, conejos o ratones) por medio de múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales del polipéptido mutante FGF21 y un adyuvante. Puede' ser útil conjugar un polipéptido mutante FGF21 a una proteina portadora que es . inmunogénica en la especie que se inmuniza tal como hemocianina de lapa californiana, suero, albúmina, tiroglobulina de bovino, o inhibidor de tripsina de soya. También, agentes de agregación tal como alumbre se usan para mejorar la respuesta inmune. Después de la . inmunización, a los animales se les extrae sangre y el suero se somete a ensayo para el titulo del anticuerpo mutante anti-FGF21.
Anticuerpos monoclonales dirigidos hacia los polipéptidos mutantes FGF21 . se pueden producir usando cualquier método que ' proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por las lineas de células continuas en el cultivo. Ejemplos de métodos adecuados para preparar anticuerpos1 monoclonales incluyen los métodos de hibridoma de Kohler y colaboradores .,' 1975 , Nature 256: 495-97 y el método de hibridoma de células B humanas (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133: 3001; Brodeur y colaboradores, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987). También se proporcionan por la invención lineas de células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales reactivos con los polipéptidos mutantes FGF21.
Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden modificar para el uso como agentes terapéuticos. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo "quimérico" en el cual una porción de la cadena pesada (H) y/o ligera (L) es idéntica con u homologa a una secuencia correspondiente en¦ los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es/son idénticas con u homologas a una secuencia correspondiente en los' anticuerpos derivados de otra especie que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo. También se incluyen fragmentos de estos anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada. Véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 4,816,567; Morrison y colaboradores, 1985, Proc.. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 81: 6851-55.
En otra modalidad, un anticuerpo monoclonal de la invención es un anticuerpo "humanizado". Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en el campo. Véase, por ejemplo, las Patentes, de E.U.A Nos. 5,585,089 y 5,693,762. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos dentro de una fuente que no es humana. La humanización se puede realizar, por ejemplo, usando métodos descritos en el campo (véase, por ejemplo, Jones y colaboradores, 1986,' Nature 321: 522-25; Riechmann y colaboradores, 1998, Nature 332: 323-27; Verhoeyen y colaboradores. , 1988, Science 239: 1534-36),- al sustituir por lo menos una porción de una región determinante de complementariedad de roedor para las regiones correspondientes de un anticuerpo humano.
También se abarcan por la' invención anticuerpos humanos que enlazan los polipéptidos mutantes FGF21 de la presente invención. El uso de animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces de producir .un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena estos anticuerpos se producen mediante inmunización con un antigeno mutante FGF21 (es decir, que tiene por lo menos 6 aminoácidos contiguos), conjugados opciohalmente a un portador. Véase, por ejemplo, Jakobovits y colaboradores. , 1993, Proc. Nati. ñcad. Sci. E.U.A. 90: 2551-55; Jakobovits y colaboradores, 1993, Nature 362: 255-58; Bruggerm'ann y colaboradores, 1993, Year in Immuno. 7: 33. En un método, estos animales transgénicos se producen al incapacitar los sitios endógenos que codifican las cadenas de inmunoglobulina pesadas y ligeras en los mismos, y al invertir los sitios que codifican las proteínas de cadena pesada y ligera humana dentro del genoma de los mismos. Los animales parcialmente modificados, es decir, animales que tienen menos, del complemento total de las modificaciones, entonces se reproducen en forma cruzada para obtener un animal que todas las modificaciones del sistema inmune deseadas. Cuando se administra un inmunógeno, estos animales transgénico producen anticuerpos con secuencia de aminoácidos humanas (en lugar de, por ejemplo, de murino) , que incluyen regiones variables que son inmunoespecificas para estos antigenos. Véase, por ejemplo, Publicación Internacional Nos. WO 96/33735 y O 94/02602. Se describen métodos adicionales en la Patente de E.U.A. No. 5,545,807, Publicaciones Internacionales Nos. WO 91/10741 y WO 90/04036, y en la Patente Europea No. 0 546 073. Los anticuerpos humanos también se pueden producir mediante la expresión de ADN recombinante en las células hospederas o . mediante la expresión en las células de hibridoma · como se describe en este documento. ..
En una modalidad alternativa, los anticuerpos humanos : también se pueden producir de bibliotecas de despliegue de fagos (véase, por ejemplo, Hoogenboom y colaboradores, 1991, J. Mol Biol. 227: 381; Marks y colaboradores, 1991, J. Mol Biol. 222: 581). Estos procesos imitan la selección inmune a través de la . expresión de repertorios de anticuerpos sobre la . superficie del bacteriófago filamentoso, y selección subsecuente del fago por su enlace a un antigeno de selección. Una técnica tal se describe en la Publicación Internacional No. WO 99/10494, la cual describe el aislamiento de la alta afinidad y anticuerpos agonistas funcionales para los receptores MPL- y msk- usando este procedimiento.
Los anticuerpos quiméricos, injertados con. CDR y humanizados se producen típicamente mediante métodos recombinantes . Los ácidos, nucleicos que codifican los anticuerpos se introducen en la células hospederas y se expresan usando materiales y procedimientos descritos en este documento. En una modalidad, los anticuerpos, se producen en células hospederas de mamífero, tales como células CHO. Los anticuerpos monoclonales (por ejemplo, humanos) se pueden producir por la expresión de ADN recombinante en las células hospederas o por la expresión en las células de hibridoma como se describe en este documento.
Los anticuerpos mutantes anti-FGF21 de la invención se pueden emplear en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de enlace competitivos, ensayos de intercalado directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación, (véase, por ejemplo, Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Technjques 147-158 (CRC Press, Inc., 1987), incorporados en este documento a manera de referencia en¦ su totalidad) para la detección y cuantificación de los polipéptidos mutantes FGF21. Los anticuerpos se enlazaran a los polipéptidos mutantes FGF21 con una afinidad que es apropiada para el método de ensayo que se emplea.
Para aplicaciones ' de diagnóstico, en ciertas modalidades, los anticuerpos mutantes anti-FGF21 se pueden etiquetar con una porción detectable. La porción detectable puede ser cualquiera que sea capaz de producir, ya sea directa o indirectamente, un señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H, C, P, S, I, Te, In, o Ga; un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato fluoresceina, rodamina, o luciferina; o un enzima, tal como fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, o peroxidasa de rábano picante (Bayer y colaboradores, 1-990, Meth. Enz. 184: 138- 63) .
Los ensayos de enlace competitivos dependen de la ¦capacidad de un estándar etiquetado (por ejemplo, ¦ un polipéptido mutante FGF21, o una porción inmunológicamente reactiva del mismo) para competir con el analito de muestra de prueba (por ejemplo, un polipéptido mutante FGF21) para enlazarse con una porción limitada del anticuerpo mutante anti-FGF21. La cantidad de un polipéptido mutante FGF21 en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad el estándar que se enlaza a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad .de estándar que se enlaza, los anticuerpos se solubilizan típicamente antes o después de la . competición, de modo que el estándar y el analitos que se enlazan a los anticuerpos se puede separar convenientemente del estándar y el analito que permanece no enlazado.
Los ensayos de intercalado implican típicamente el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de enlazarse a una porción inmunogénica diferente, o epítopo, de la proteína que se' detecta y/o se cuantifica. En un ensayo de intercalado, el analito de muestra de prueba se enlaza típicamente por un primer anticuerpo que se inmoviliza sobre un soporte sólido, y después un segundo anticuerpo se enlaza al analito, formando de esta manera un complejo de tres partes insoluble. Véase, por ejemplo, Patente de E.U.A No. 4,376,110. El segundo anticuerpo por si mismo se etiqueta con una porción detectable (ensayos de intercalado directos) o se puede medir usando un anticuerpo de anti-inmunoglobulina que se etiqueta con una porción detectable (ensayo de intercalado indirectos). Por ejemplo, un tipo de ensayo de intercalado es un ensayo inmunoabsorbente enlazado en enzimas (ELISA), en cuyo caso la porción detectable es una enzima.
Los anticuerpos mutantes anti-FGF21 de la presente invención también son útiles para 'la formación de imágenes in vivo. Un' anticuerpo etiquetado con una porción detectable se puede administrar a un animal, preferiblemente dentro de torrente sanguíneo, y la presencia y ubicación del anticuerpo etiquetado en el hospedero sometido a ensayo. El anticuerpo se puede etiquetar con cualquier porción que sea detectable en un animal, ya sea por resonancia magnética nuclear,' radiología, u otro medio de detección conocido en el. campo.
Los anticuerpos mutantes FGF21 de' la invención se pueden usar como agentes terapéuticos. Estos agentes terapéuticos son generalmente agonistas o antagonistas, en que ya sea mejoran o reducen, respectivamente, por lo menos una de las actividades biológicas de un polipéptido mutante FGF21. En una modalidad, los anticuerpos antagonistas de la invención son anticuerpos o fragmentos . de enlace de los mismos - los cuales son capaces de enlazarse específicamente a un polipéptido mutante FGF21 y los cuales son capaces de inhibir o eliminar la actividad funcional de un polipéptido mutante FGF21 in vivo o. in vitro. En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista .inhibirá la actividad funcional de un polipéptido mutante FGF21 mediante por lo menos aproximadamente 50%, y preferiblemente por lo menos aproximadamente 80%.·. En otra modalidad, el anticuerpo mutante anti-FGF21 es capaz de. interferir con la interacción entre un polipéptido mutante FGF21 y un receptor FGF21 inhibiendo o eliminando en consecuencia la actividad del polipéptido mutante FGF21 in vitro o in vivo. Los anticuerpos mutantes anti-FGF21 agonistas o -antagonistas se identifican mediante ensayos de clasificación que son bien conocidos en el campo.
La invención también se refiere a un k'it que comprende anticuerpos mutantes FGF21 y otros reactivos útiles para detectar niveles de polipéptido mutante FGF21 en muestras biológicas. Estos reactivos pueden incluir una etiqueta detectable, suero de bloqueo, muestras de control positivas y negativas, y reactivos de detección.
EJEMPLOS Los Ejemplos 'que siguen son ilustrativos de las modalidades especificas de la invención, y varios usos de los mismos. Se exponen para propósitos explicativos únicamente, y no se deben considerar de ninguna manera como limitantes del alcance de la invención.
EJEMPLO 1 Preparación de Constructos de Expresión FGF21 Una secuencia de ácidos nucleicos que¦ codifican el polipéptido FGF21 maduro se obtuvo mediante la amplificación de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores que tienen secuencias de nucleótidos que corresponden a los extremos 5' y 3' de la secuencia FGF21 madura. La Tabla lista los cebadores que se usaron para amplificar secuencia FGF21 madura.
Tabla 2 Cebadores de PCR para Preparar el Constructo FGF21 Los cebadores usados para preparar el constructo de expresión FGF21 incorporaron sitios de endonucleasa de restricción para la clonación direccional de la secuencia dentro de un vector de expresión adecuado (por ejemplo, pET30 (Novagen/EMD Biosciences ; San Diego, CA) o pAMG33 (Amgen; Thousand Oaks, CA) ) . El vector de expresión pAMG33 contiene un origen R-100 del número de copias bajo de replicación un promotor lac modificado, y un gen de resistencia a la canamicina. El vector de expresión pET30 contiene un origen -derivado de pBR322 de replicación, un promotor T7 inducible, y gen de resistencia a ' la canamicina. Mientras que la expresión de pAMG33 se descubrió que es más alta, el pET30 se descubrió que es un vector de clonación más confiable. De esta manera, la mayoría de los constructos descritos en la presente solicitud primero se generaron en pET30 y luego se clasificaron por eficacia. Las secuencias seleccionadas luego se transfirieron al pAMG33 para amplificación adicional.
La secuencia FGF21' se amplificó en una mezcla de reacción que contiene 40.65 yL de dH20,' 5yL de Solución Amortiguadora de Reacción PfuUltra II (???), 1..25 L de mezcla de dNTP (40 mM - 4 x lOmM) , 0.1 yL de Plantilla (100 ng/mL) , 1 i de cebadorl (10 µ?) , 1 pL de cebador2 (10 µ?) , y 1 \ de ADN polimerasa HS de fusión PfuUltra II ( Stratagene ; La Jolla, CA) . Las reacciones de amplificación se realizaron por calentamiento durante 2 minutos a 95°C; seguido por 10 diez ciclos a 95°C durante 20 segundos, . 60°C durante 20 segundos (con 1°C adicional restado por ciclos) , y 72°C durante 15 segundos/kilo base de producto deseado; seguido por 20 ciclos a 94°C durante 20 segundos; 55°C durante 20 segundos, 72.°C durante 15 segundos/kilo base de producto deseado; seguido por 72°C durante 3 minutos. Los productos de amplificación se digirieron con las endonucleasas de restricción Ndél, Dpnl, y EcpRI; ligadas sobre un vector adecuado, y luego transformadas en células competentes.
EJEMPLO 2 Purificación de Proteínas FGF21 de Bacterias En los Ejemplos que. siguen, varias proteínas FGF21 que incluyen el polipéptido FGF21 de tipo silvestre, polipéptidos FGF21 truncados, mutantes ,FGF21 y proteínas de fusión FGF21, se expresaron en un sistema de expresión bacteriano. Después de la expresión, la cual se describe posteriormente, las proteínas FGF21 se purificaron como se describe en este Ejemplo, a menos que se indique de otra manera.
Para purificar el poíipéptido FGF21 de ¦ tipo silvestre, polipéptidos FGF21 truncados y mutantes FGF21 de cuerpos de inclusión bacterianos, los cuerpos de inclusión doble lavados (DWIBs) se solubilizaron en una solución amortiguadora de solubilización que contiene clorhidrato de guanidina y DTT en solución reguladora Tris en pH 8.5 y luego se mezclaron durante una hora a temperatura ambiente, y la mezcla de solubilización se agregó a una solución amortiguadora replegada que contiene urea, arginina, cisteína-, y clorhidrato de cistamina en pH 9.5, y luego, se mezclaron durante 24 horas a 5°C (véase, por ejemplo, Clarke, 1998, Curr. Ópin. Biotechnol . 9: 157-63; Mannall y colaboradores, 2007, Biotechnol. Bioeng. 97: 1523-34; Rudolph y colaboradores, 1997, "Folding proteins," Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., Nueva York, IRL Press) 57-99; and Ishibashi y colaboradores, 2005, Protein Expr. Purif. 42 : .1 -6) ..
Después de la solubilización y replegado, la mezcla se filtró a través de un filtro de 0.45 mieras. La í o o¦ acumulación replegada luego se concentró aproximadamente 10 veces . con un cásete Pall Omega de peso molecular de 10 KD cortado en .una presión de transmembrana (TMP) de 20 psi, y se diafiltró con 3 volúmenes de columna de Tris 20 mM, pH 8.0 en TMP de 20 psi (1.41 kg/cm2) .
La .muestra clarificada luego se sometió a cromatografía de intercambio aniónico (AEX) usando una resina Q Sepharose HP. Un gradiente de sal lineal de NaCl 0 a 250 mM en Tris 20 mM se corrió en pH 5.0 a 5°C. Las fracciones pico se analizaron por el SDS- PAGE y se acumularon.
El acumulado de eluido AEX luego se sometió a cromatografía de interacción hidrofóbica (HIG) usando una resina Fenil ' Sefarosa HP. La proteína se eluyó usando un gradiente lineal de. creciente de sulfato de amonio de 0.7 M a 0 M en pH 8.0 y. a temperatura ambiente. Las fracciones pico se analizaron por el SDS-PAGE (Laemmli-, 1970, Nature 227: 680-85) y. se cumularon.
La acumulación HIC se concentró con un cásete de 0.2 'm2 Pall Omega de peso molecular de 10kD cortado a 7 mg/mL en una TMP de 20 psi (1.41 kg/cm2). El concentrado' se diafiltró con 5 volúmenes de columna de KP04 10 mM, sorbitol al 5%, pH 8.0 en una TMP de 20 psi (.1.41 kg/cm2), y el concentrado recuperado .se diluyó a 5 mg/mL. Finalmente, la solución se filtró a través de una membrana de Posidina 0.2 µ? Pall mini-Kleenpac .
Para purificar las proteínas de fusión FGF21 y las proteínas mutantes de fusión FGF21 de los anticuerpos de inclusión bacterianos, los anticuerpos de inclusión doble lavados (DWIBs) se solubilizaron en una solución amortiguadora de solubili zación que contiene clorhidrato de guanidina y DTT en solución amortiguadora Tris en pH 8.5 y luego se mezclaron durante una hora a temperatura ambiente, y a mezcla . de solubilización se agregó a una solución amortiguadora . replegada . que' contiene' urea, arginina, cisteína, y clorhidrato de cistamina en pH 9.5 1, y luego se mezclaron durante.24- horas a 5°C {véase, por ejemplo, Clarke, 1998, Curr: Opin. Biotechnol. 9: 157-63; Mannall y colaboradores, 20Ó7, Biotechnol. Bioeng. 97: 1523-34; Rudolph y colaboradores, 1997, "Folding proteins," Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., Nueva York, IRL Press) 57-99; e Ishibashi y colaboradores, 2005, Protein Expr. Purif. 42: 1-6.) .
Después de la solubilización y replegado, la mezcla se dializó nuevamente 5 volúmenes de Tris de 20 mM, pH 8.0 usando una tubería de diálisis de 10 kD. El pH del replegado dializado se .-ajustó a 5.0 con ácido acético al 50%, y luego se clarificó mediante centrifugación durante 30 minutos a 4K.
La muestra clarificada luego se sometió a cromatografía de intercambio aniónico (AEX) usando una resina Sefarosa HPQ. Un gradiente de sal lineal.de NaCl 0 a 250 mM en Tris 20 mM luego se corrió en pH 8.0 a 5°C. Las fracciones pico se analizaron por el SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) y se acumularon. ' La acumulación de material eluído AEX luego se sometió a cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) usando una resina Fenil Sepharose HP. La proteína se eluyó usando un gradiente lineal de creciente de sulfato amonio 0.6 M a 0 M en pH 8.0 a temperatura ambiente. Las fracciones pico se analizaron por el SDS-PAGE y se cumularon.
Después de la etapa de HIC, la acumulación luego se dializó 60 volúmenes de Tris 10 mM, sacarosa al 2.2%, sorbitol al 3.3%, pH 8.5. La acumulación dializada se concentró a 5 mg/mL usando un jumbosep. Finalmente, la solución se filtró a través de una membrana de Posidina- 0.2 µ? Pall mini-Kleenpac .
EJEMPLO 3 Preparación y Expresión de Proteínas FGF21 Truncadas Los constructos . que codifican las proteínas FGF21 truncadas listadas en la Tabla 3 se prepararon mediante amplificación PCR del vector de expresión FGF21 de tipo silvestre como se describe posteriormente (la . construcción del vector de expresión FGF21 de tipo silvestre se describe emplo 1 ) .
Residuos de aminoácido Número de Residuos Truncados* Truncamientos en C terminal 1-180 . 1 1-179 2 1-178 3 1-177 4 1-176 5 1-175·. 6 1-174 7 1-173 8 1-172 9 1-171 10 1-169 12 "1-168 13 1-167 14 1-166 15 1-165 16 1-164 17 1-160 21 1-156 25 1-152 29 1-149 32 1-113 68 Truncamientos en N terminal 2-181 1 3-181 2 4-181 3 5-181 4 . 6-181 5 7-181 6 8-181 7 9-181 8 Truncamientos en C y N terminales 5-174 11 7-172 17 9-169 20 9-149 40 . 15-169 ¦ 26 15-149 46 15-113 82 *relativo al polipéptido FGF21 maduro Los constructos de proteina FGF21 truncada ' se prepararon usando cebadores que tienen secuencias que son homologas a las regiones cadena arriba y corriente debajo de un codón (o codones) que se suprimen (dando por resultado el truncamiento) . Los cebadores usados en estas reacciones de amplificación también proporcionaron aproximadamente 15 nucleótidos de secuencia de solapamiento para permitir la recirculación del producto .amplificado, principalmente el vector completo que ahora tiene el mutante deseado.
Un constructo FGF21 truncado ejemplar, que codifica una proteina FGF21 que carece del' residuo de histidina en la posición 1 de la secuencia FGF21 madura (es decir, el mutante de truncamiento 2-181), se preparó usando los cebadores mostrados en la Tabla 4.
Tabla 4 Cebadores PCR para Preparar El Mutante PGF21 de Truncamiento Ejemplar Los cebadores mostrados en la Tabla 4 permiten supresión del residuo de histidina como se muestra continuación, en donde la secuencia superior (SEQ ID NO: 10) es una porción de un polipéptido FGF21 maduro que comprende una metionina N-terminal, la segunda secuencia es el cebador de sentido (SEQ ID NO: 7), la tercera y cuarta secuencias (SEQ ID NOs : 11 y 12) son posiciones de un constructo de 'expresión FGF21, y la quinta secuencia es el cebador antisentido (SEQ ID NO: 9) : MetHisProlleProAspSerSerProLeu 5' -GGAGATATACATATG CCAATTCCAGATTCTTCTCCATTATT TTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCATCCAATTGCAGATTCTTCTCCATT ATTAAAACAAATTGAAATTCTTCCTCTATATGTATACGTAGGTTAAGGTCTAAGAAGAGGT AATAAAAAACAAATTGAAATTCTTCCTCTATATGTATAC-5' Se prepararon constructos de proteina FGF21 truncada usando esencialmente las condiciones PCR descritas en el Ejemplo 1. Los productos de amplificación se digirieron con la endonucleasa de restricción Dpnl, y luego - se transformaron en células competentes. Los clones resultantes se secuenciaron para confirmar la ausencia de errores generados por la polimerasa.
Las proteínas FGF21 truncadas se expresaron al transformar las células BL21 ' (DE3) o BL21 Star (Invitrogen; Carlsbad, CA) con el constructo. que codifica una proteina FGF21 truncada particular. Los transformantes se desarrollaron durante toda la noche con aireación limita en un medio TB suplementado con 40 pg/mL de canamicina, se airearon la siguiente mañana, y después de un corto periodo de recuperación,, se indujeron en IPTG 0.4 mM. Los mutantes FGF21 se cosecharon mediante centrifugación 18-20 horas después de la inducción.
EJEMPLO 4 Actividad in vitro de las Proteínas FGF21 Truncadas Se realizaron experimentos para identificar proteínas FGF21 ' truncadas que retienen una actividad FGF21 de tipo silvestre en un ensayo in vitro de ELK-luciferasa . La Tabla 5 resume los resultados obtenidos para las proteínas FGF21 que tienen truncamientos en la N-terminal, la C-terminal, o en tanto la N-terminal como la C-terminal. Los ensayos de ELK-luciferasa se realizaron usando un sistema de células .de riñon 293T humanas recombinantes, en las cuales las células 293T sobre expresan los constructos reporteros beta-klotho y luciferasa. Estos constructos también contienen secuencias que codifican GAL-ELK1 y SxUAS-Luc, un reportero de luciferasa conducido por un promotor que contiene cinco copias en tándem del sitio de enlace Gal4. El beta-klotho es un co-receptor que es requerido . por FGF21 para la activación de sus receptores FGF y la .inducción de la transducción de señal intracelular , la cual a su vez conduce a la fosforilación Erk y ELK. La actividad de la luciferasa se regula por el nivel de Erk/ELKl fosforilado, y se induce para supervisar y cuantificar indirectamente la actividad FGF21.
Los ensayos de ELK-luciferasa se realizaron al cultivar las. células 293T · en presencia de. diferentes concentraciones del polipéptido FGF21 de tipo silvestre o mutante FGF21 durante 6 horas, y. luego al someter a ensayo los lisados celulares para la actividad de la luciferasa. La Figuras 1A-1B muestran los resultados de un ensayo dé actividad de la ELK-luciferasa revisado sobre los mutantes de truncamiento FGF21 7-181 y 8-181 (Figura 1A) y los mutantes de truncamiento FGF21 1-172, 1-171, 1-169, y 1-164 (Figura IB) . La luminiscencia obtenida en los ensayos de ELK-luciferasa para, cada uno de los mutantes de truncamiento FGF21 3-181, 4-181, 5-181, 7-181, 8-181, 1- 180, 1-178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172, 9- 181, y 1-149 se muestra en la Figura 2..
Los polipéptidos de mutantes FGF21 se compararon con un estándar FGF21 de tipo silvestre y los mutantes muestras una eficacia de por lo. menos 50% de la eficacia del FGF21 de tipo silvestre se consideraron por no tener una pérdida de actividad FGF21 y se asignaron un "+" en la. Tabla 5.
Tabla 5 Proteínas FGF21 Truncadas: Ensayo in vitro Truncamientos en C terminal Residuos de Eficacia Actividad (+/-) aminoácidos 1 - 180 93.2% + 1 - 178 95.0% + 1 - 177 112.0% +¦ . 1 - 176 104.8% + 1 - 174 10 .6% + 1 - 173 96.1% + 1 - 172 97.5% + 1 - 171 113.0% + 1 - .169 ¦84.9% + 1 - 167 •20% — 1 - 166 20% — 1 - 165 10% — Truncamientos en N terminal Residuos de Residuos de Residuos de aminoácidos aminoácidos aminoácidos 2 - 181 112.5% + 3 - 181 130.3% + 4 - 181 11 .0% + 5 - 181 . 119.6% + . 7 - 181 74.2% + 8 - 181 24.9% — 9 - 181 12.5% — Colectivamente, los resultados presentados en la Tabla 5 indican que las supresiones C-terminal de 14 o más residuos de aminoácido (es decir, una proteina FGF21 C-terminalmente truncada que consiste de 1-167 residuos de aminoácido y proteínas más cortas) eliminan la actividad de FGF21. Además, la. Tabla 5 ind-ica las supresiones en N terminal de 7 o más residuos de aminoácido (es decir, una proteína N-terminalmente truncada que consiste de. 8-181 residuos de aminoácido y proteínas más cortas) eliminan la actividad de FGF21. No sorprendentemente, las proteínas FGF21 truncadas que poseen tanto un truncamiento en N terminal de 8 a 14 residuos y un truncamiento en C terminal de 12 o 32 residuos se descubrieron que carecen de actividad en ' los ensayos de ELK-luciferasa .
Consistentes con los datos presentados en la Tabla 5, los polipéptidos FGF21 truncados que tienen truncamientos en el N terminal de menos de 7 residuos de aminoácido constituyen modalidades de la presente invención. Similarmente, los polipéptidos FGF21 truncados que tienen truncamientos en el C-terminal de menos de 13 residuos de aminoácido constituyen modalidades de la presente invención.
EJEMPLO 5 Actividad ín vivo de las Proteínas FGF21 Truncadas El FGF21 una variedad de actividades biológicas, que incluyen la capacidad de disminuir los niveles de glucosa en la sangre, insulina, triglicéridos o colesterol; reducen el peso corporal; o mejoran la tolerancia a la glucosa, gasto de energía o' sensibilidad a la insulina. Los polipéptidos. FGF21 truncados se analizaron adicionalmente para la actividad FGF21 in vivo, al introducir los polipéptidos FGF21 truncados dentro de ratones ob/ob resistentes a la insulina, y al .medir la capacidad de un polipéptido FGF21 truncado particular para disminuir la glucosa en la sangre. El * polipéptido FGF21 truncado que se somete a prueba se inyectó intra-peritonealmente en un ratón ob/ob de 8 semanas de edad (Jackson Laboratory) , y las muestras de sangre se obtuvieron en varios puntos de tiempo después de una sola inyección, por ejemplo, 0, 6, 24, 72, 120, y 168 horas después de la inyección. Los niveles de glucosa en la sangre se midieron con un Glucómetro OneTouch (LifeScan, Inc. Milpitas, CA) , y los resultados se expresaron como un porcentaje del- cambio de la glucosa en la sangre relativo con el nivel de línea base en la glucosa en la sangre (es decir,¦ en el tiempo 0) Los resultados de un experimento se proporcionan en la Figura 3, el cual muestra la cantidad de glucosa en la sangre detectada en ratones inyectados con los mutantes de truncamiento FGF21 8-181 y 9-181. Este experimento demostró que las proteínas de fusión FGF21 truncadas que comprenden 8-181 residuos de aminoácido exhiben actividad, de disminución de glucosa en la sangre in vivo sin embargo la actividad es ligeramente menor que la actividad de FGF21 de tipo silvestre a 3 y 6 horas después de la inyección, pero estas proteínas de fusión FGF21 truncadas que comprenden 9-181 residuos de aminoácido no exhiben esta- actividad. De esta manera, el análisis in vivo de los polipéptidos FGF21 truncados indicaron que la supresión de hasta 7 aminoácidos de la N-terminal del FGF21 maduro, no eliminan la actividad biológica de la molécula (en contraste con el análisis in vitro, lo cual sugirió que la supresión de los 7 aminoácidos de la N-terminal del FGF21 maduro eliminará la actividad) .
Los diferentes resultados obtenidos , con los polipéptidos FGF21 N-terminalmente truncados particulares {por ejemplo, FGF21 8-181) en los ensayos in vitro e in vivo se puede explicar por la interacción del FGF21 con 'el beta-klotho y el receptor FGF al efectuar la transducción de señal. En particular, el FGF21 activa un complejo de receptor doble que comprende el co-receptor beta-klotho y el receptor FGF (FGFR), el cual inicia una cascada de señalización que implica la tirosina cinasa. La N-terminal del FGF21 se ha mostrado que se implicó en el enlace y activación del FGF21 mientras que la' C-terminal del FGF21 es requerida para la interacción del beta-klotho (Yie y colaboradores. , 2009 FEBS Lett. 583:19-24).. El ensayo iri vitro de ELK-luciferasa se realiza en 293 células ' de riñon en la cuales el co-receptor beta-klotho se sobre expresa y el FGFR se expresa en niveles normales. La cantidad de FGFR es baja en relación con la aquélla de beta-klotho y la relación de beta-klotho a FGFR en 293 células por lo tanto no es fisiológica, lo cual puede afectar la formación del complejo receptor · y ligar finalmente el enlace .y activación del FGFR. El sistema ín vitro 293 parece que es más vulnerable a los polipéptidos FGF21 N- terminalmente truncados y por lo tanto puede haber producido • menos de los resultados de actividad para pocos de los mutantes N-terminalmente truncados sometidos a prueba, tal como FGF21 8-181. De esta manera, al determinar si un mutante FGF21 N-terminalmente truncado particular retuvo la actividad FGF21 de tipo silvestre, la actividad del mutante FGF21' en el ensayo, in vivo se consideró que es dispositivo. Por consiguiente, los polipéptidos FGF21 truncados' que tienen truncamientos en el N-terminal de menos de 8 residuos de aminoácido se abarcan por la invención.
EJEMPLO 6 Preparación y Expresión de las Proteínas de Fusión FGF21 Truncadas Debido a que la vida media de una proteína se puede incrementar al. fusionar la proteína a una secuencia Fe, las proteínas de fusión que comprenden los polipéptidos FGF21 truncados se prepararon y se analizaron. Las proteínas de fusión FGF21 truncadas listadas en la Tabla 6 se prepararon a partir de secuencias FGF21 amplificadas por la PCR Boeing (empalme de genes por la extensión de solapamiénto) , se prepararon las proteínas de fusión FGF21 tal que la porción Fe del gen IgGl de inmunoglobulina humana (SEQ ID NO: 13) se fusionó a ya sea la N-terminal o la C terminal de la proteína FGF21.
Tabla 6 Proteínas de Fusión FGF21 Truncadas Residuos de Posición Fe Ligadura aminoácidos Truncamientos en C terminal 1 - 178 -NH2 15 1 - 175 -NH2 14 1-175 -COOH !5 1 - 171 -NH2 .15 . 1-171 -COOH 15 1-170 ¦ -COOH 15 Truncamientos en N terminal 5-181. -NH2 15 5-181 -COOH 15 . 7-181 -NH2 15 7-181 -COOH 15 5 - 175 -NH2 15 ¦ 5-175 -COOH 15 5 - 171 -NH2 15 5-171 -COOH¦ 15 6-170 -COOH 15 7-178 -COOH 35 7-175 -NH2 15 . 7-175 -COOH .. 15 7-174 -COOH 35 .7-172 -COOH 35 7-171 -NH2 15 7-171 -COOH' 35 7-171 -COOH 15 En particular, los constructos de la proteina de fusión FGF21 (que incluyen aquellos que codifican las proteínas de fusión FGF21 truncadas) se prepararon en una serie' de tres ' ' reacciones de amplificación usando esencialmente las condiciones de reacción descritas en el Ejemplo 1. En la primera reacción, un par de cebadores se diseñaron para producir una secuencia que contiene un sitio de clonación Ndel, región Fe y secuencia de ligadura. En la segunda reacción, un par de cebadores se diseñaron para producir una secuencia que contiene una porción de traslape de la ligadura, una porción de la secuencia de codificación FGF21, iy el. sitio de clonación EcoRI . Finalmente, en la tercera reacción, un par de cebadores se diseñaron para el propósito de enlazar los productos de las primeras dos reacciones. Un conjunto ejemplar de cebadores para la construcción de Fc-FGF21 1-181 se lista en la Tabla 7.
Tabla 7 Cebadores PCR para Preparar un Constructo de Proteina de Fusión FGF21 Ejemplar El producto de la reacción final se digirió con las endonucleasas de restricción Ndel y EcoRI, se ligó en el vector pET30, y luego se transformó en células competentes. Los clones resultantes se secuenciaron para confirmar la ausencia de errores generados por la polimerasa.
EJEMPLO 7 Actividad in vivo de las Proteínas de Fusión FGF21 Truncadas Las proteínas de fusión que comprenden una secuencia FGF21 truncada fusionada a una secuencia Fe se generaron y se sometieron a ensayo para la actividad in vivo. Las proteínas de fusión FGF21 truncadas se prepararon al fusionar una molécula IgGl Fe ya sea al extremo N-terminal o C-terminal de una proteína FGF21 truncada para formar una secuencia contigua individual. Para distinguir entra las fusiones N-terminal y C-terminal, las proteínas de fusión FGF21 en las cuales la molécula Fe se fusionó al extremo N-terminal de la proteína FGF21 se designan como FGF21-FC, y las proteínas de fusión en la cual la molécula Fe se fusionó al extremo C-terminal de la proteína FGF21 se designan como FGF21-Fc.
El FGF21 posee una variedad de. actividades biológicas, que incluyen la capacidad de disminuir los niveles de glucosa' en 'la sangre, insulina, triglicéridos , colesterol, reducir el peso corporal; o mejorar la tolerancia en la glucosa, gasto de energía o sensibilidad a la insulina. Para · estimar la actividad FGF21 in vivo, .los polipéptidos FGF21, polipéptidos mutantes FGF21, y polipéptidos de fusión FGF21 se introdujeron en ratones ob/ob resistentes a la insulina, .y se midió la capacidad de una proteína FGF21 particular ara disminuir los niveles de glucosa en la sangre. El polipéptido FGF21, polipéptido mutante FGF21, o polipéptido de fusión FGF21 que se somete a prueba se inyectó intraperitonealmente en ratones ob/ob de 8 semanas de edad (Jackson Laboratory)., y se obtuvieron, muestras de sangre en varios puntos de tiempo después de una sola inyección, por ejemplo, 0, 6, 24, 72, 120, y 168 horas después de la inyección. Los niveles de glucosa en la sangre se midieron con un Glucómetro OneTouch (LifeScan, Inc. Milpitas, CA) , y los resultados ' se expresaron como un porcentaje de cambio de la glucosa en la sangre relativa con el nivel de línea base de la glucosa en la sangre (es decir, en el tiempo 0) .
Los resultados de un experimento se proporcionan en la Figura 4, la cual muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre observados en ratones inyectados .con un control .PBS, un control Fc-FGF21 que comprende 1-181 residuos de aminoácido o proteínas de fusión Fc-FGF21. truncadas que comprenden los residuos de aminoácido 5-181 o 7-181. Este experimento demostró que las proteínas de fusión Fc-FGF21 truncadas que comprenden los residuos de aminoácido 5-181 o 7-181 exhiben actividad de disminución en la sangre que es similar a la . actividad de Fc-FGF21 de tipo silvestre a 6 horas después de la inyección. De esta manera, el ' análisis in vivo de los polipéptidos Fc-FGF21 truncados indicó que la supresión de hasta 6 aminoácidos de la N-terminal del FGF21 maduro no afecta la actividad biológica de la molécula. Los análisis in vivo indicaron, sin embargo, que l capacidad de los. polipéptidos FGF21 truncados de disminuir la glucosa en la sangre se redujo y que los niveles de glucosa en la sangre regresaron a la línea base a 24 horas después de la inyección (los resultados similares se obtuvieron con el FGF21 del tipo silvestre) . La actividad in vivo corta se descubrió que es un resultado de la degradación proteolitica del FGF21, como .se describe en el Ejemplo 8.
Los resultados de- Otro experimento se proporcionan en la Figura 5, la cual muestra .el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre observados en ratones inyectados con un control PBS, . un control FGF21-Fc de tipo silvestre que comprende los residuos de aminoácido 1-181, una proteina de fusión FGF21-Fc truncada que comprende los residuos 1-175, o una proteina Fc-FGF21 truncada que comprende los residuos de aminoácido 1-171. Este experimento demuestra que el FGF21-Fc de tipo silvestre que comprende los residuos de aminoácido 1-181 · tiene una actividad de disminución de glucosa sostenida que da por resultado una reducción de' los niveles- de glucosa en la sangre de aproximadamente 30% durante el periodo de tiempo de 24 horas a 120 horas después de la inyección. La proteina Fc-FGF21 que comprende los residuos de aminoácido 1-171 exhibe una actividad de disminución de glucosa en la sangre retardada evidente únicamente. Sin embargo, la actividad observada es la misma como la actividad de FGF21-Fc de tipo silvestre. La proteina de fusión FGF21-Fc truncada que comprenden los residuos 1-175 no es activa in vivo en la disminución de la glucosa en la sangre.
Colectivamente, los experimentos de truncamiento descritos en este documento demuestran que las proteínas de fusión FGF21 truncadas que tienen un truncamiento N-terminal exhiben una actividad de glucosa en la sangre que es similar a aquella de la proteina de fusión FGF21 de tipo silvestre, y además, estas proteínas de ..fusión FGF21 truncadas en las cuales la molécula Fe se ha fusionado al extremo N-terminal de la proteína FGF21 truncada exhiben más actividad que las proteínas de fusión en las cuales la molécula Fe se · ha fusionado al extremo C-terminal de la proteína FGF21 truncada, EJEMPLO 8 Degradación Observada in vivo del FGF21 La degradación FGF21 primero se observó con los constructos de proteína de fusión FGF21 Fe como se describe en el Ejemplo 7. El análisis, farmacocinético in vivo indicó que el FGF21 humano tiene una vida media ¦ corta de aproximadamente 1 hora en ratones debido, a la rápida eliminación y a la degradación in vivo. Por lo tanto, para prolongar la vida media del FGF21 se fusionó una secuencia Fe al extremo N- o C-terminal del polipéptido FGF21. Sin embargo, la fusión de una región Fe no resolvió completamente el problema de vida media puesto que las proteínas de fusión en las cuales una secuencia Fe se fusionó al extremo N- o C-terminal del , polipéptido FGF21 y (y en particular las fusiones FGF21 es decir, en · las cuales la secuencia Fe se fusiona a la N-terninal del FGF21 maduro) , no exhibieron la eficacia in vivo esperada, y en lugar se descubrió que mantienen la actividad de disminución de glucosa en la sangre por no más de 24 horas en los ratones ob/ob. Como se describe en la Figura 4, las proteínas de fusión Fc-FGF21 redujeron los niveles de glucosa en la sangre por aproximadamente 30-40% a 6 horas después de la inyección, mientras que los niveles de glucosa en la sangre regresaron a los niveles de línea base a -24 horas.
La degradación proteolítica del FGF21 de tipo silvestre se investigó subsecuentemente, y la pérdida rápida de' la actividad in vivo con. las proteínas de fusión¦ Fc-FGF21 se descubrió que es el resultado de la degradación in vivo de FGF21. La degradación proteolítica conduce a una actividad biológica disminuida de la molécula in vivo y de esta manera una vida media efectiva más corta, y tal degradación impacta adversamente el uso terapéutico de la molécula. Por consiguiente, la degradación observada de la propinas de fusión FGF21 Fe condujo a la investigación de la degradación proteolítica de FGF21 in vivo y para identificar los imitantes FGF21 que fueron resistentes a. esta degradación.
Para determinar, los sitios de degradación, el análisis LC-MS y la secuenciación Edman se realizaron en las proteínas de fusión FGF21 humana y FGF21 Fe de fusión, obtenidas en varios puntos' de tiempo después de la inyección en ratones C57B6 machos. La secuenciación de Edman ayudó a confirmar si el extremo N-terminal o C-terminal de la proteína se sometió a la degradación.. Cuando una secuencia Fe se fusionó a la N-terminal del humano FGF21, la degradación se descubrió que ocurre en el péptido enlazado entre los residuos de aminoácido 151 y 152 y entre los residuos de aminoácido 171 y 172 .de la porción FGF21 humana de la molécula de fusión (la numeración de residuos anterior se basa en la secuencia FGF21 madura y en la porción. Fe de la proteína de fusión) . La degradación en 171 y 172 se descubrió que ocurre primero, y se sigue por la degradación en 151-152. La degradación en 171 y 172 parece que es la misma etapa del límite de velocidad y desempeña una función en la vida media ¦ de la molécula. Cuando' una secuencia Fe se fusionó a la C- terminal del FGF21, se descubrió que la degradación ocurre en el enlace, de péptido entre los residuos de aminoácido 4 y 5 y entre los residuos de aminoácido 20 y 21. Como resultado de estos experimentos, se determinó que la secuencia Fe parece que protege ¦ la porción de la secuencia FGF21 que . esta adyacente a la secuencia Fe de la degradación. Un análisis de la degradación in vivo de la FGF21 de tipo silvestre y las • proteínas de fusión Fc-FGF21 se condujeron adicionalmente en monos cynomolgus. Estos estudios confirmaron que el sito de decisión de FGF21 en los residuos de aminoácido 171-172 en el sitio principal de degradación de los monos y que este sitio de degradación se conserva entre el murino y los primates.
EJEMPLO 9 Identificación de los Mutantes Resistentes a la Proteólisis FGF21 Los mutantes .FGF21 adecuados se identificaron para determinar experimentalmente las posiciones de la secuencia FGF21 de tipo silvestre que son los sitios de actividad proteolitica principal, y las sustituciones de aminoácidos específicos se introdujeron en estos sitios. Las sustituciones de aminoácidos se basaron en la conservación de secuencia FGF21 con otra especia (como se describe en el Ejemplo 8) y la conservación bioquímica con otros residuos de -.aminoácido. Una lista de sustituciones de aminoácidos que ¦ fueron o se pueden introducir en las proteínas FGF21 de tipo silvestre se proporciona en la Tabla 8, aunque . la Tabla 8 es únicamente ejemplar y se pueden hacer otras sustituciones. Los números de las posiciones proporcionadas en la Tabla 8 responden - a la posición de residuos en la proteína FGF21 madura, la cual consiste de 181 residuos de aminoácido Tabla 8 Residuos Mutados FGF21 EJEMPLO 10 Análisis in vivo de la Degradación del Fc-FGF21 y FGF21-Fc Se determinó la estabilidad de las proteínas de fusión FGF21 Fe in vivo al inyectar ratones con una proteína de fusión, extrayendo la sangré de los ratones en varios puntos de tiempo y al analizar el suero por cromatografía liquida-espectrometría de masas (LC-MS) . En particular, los ratones se inyectaron intraperitoneal'mente con 10 mg/kg de Fc(5)FGF21 (expresado en E. coli y purificado, como se describe en el Ejemplo 2) o FGF21(3)Fc (expresada en células de mamífero y purificada de acuerdo con los procedimientos estándares. La sangre, se extrajo de los ratones a 6, 24, y 48 horas después de la inyección (Tabla 9) y se recolectó en tubos EDTA pre-tratados con cócteles . inhibidores de proteasa (Roche Diagnostics) . El plasma se separó al centrifugar las muestras a 12,000 g durante 10 minutos. Las proteínas FGF21 se purificaron por afinidad de la sangre usando una resina de agarosa Fe anti-humana.
Tabla 9 Muestra FGF21 Antes de analizar' las muestras purificadas por afinidad por el LC-MS, los estándares de proteína Fc-FGF21 y FGF21-Fc se analizaron como una referencia. Los estándares de proteínas se redujeron ya sea con tris [2-carboxi-etil ] fosfina (TCEP) o no, se redujeron. Los estándares reducidos y no reducidos se analizaron por el LC-MS usando una columna de 0.3 mm x 30 cm ACE ciano con la pulverización de efluente de columna en un espectrómetro de masas de trampa de iones LCQ Classic. Puesto que los espectrómetros desconvulucionados de las muestras reducidas fueron más limpios, las muestras purificadas por .afinidad se redujeron antes del análisis LC-MS.
Las masas observadas para el estándar Fc(5)FGF21 reducido y las muestras D6, D24,- y D48 se muestran en la Figura 6A-Figura 6D. Las masas observadas para el estándar FGF21(3)Fc reducido y las muestras E6, E24, y E48 se muestran en la Figura. 7A-Figura 7D. Algunos de los materiales eluidos estándares y de muestra se- sometieron a la secuenciación Edman a fin de confirmar la N-terminal de las proteina y los fragmentos como se determina por el LC-MS. Los resultados- del análisis LC-MS de los estándares y las muestras se proporcionan en la Tabla 10..
Tabla 10 Resultados del Análisis LC-MS y Fragmentos Predichos Como se indica en la Tabla 10, todas las muestras purificadas por afinidad mostraron algún grado de degradación después de únicamente 6 horas de circulación. Después de 24 horas de circulación, el producto' principal de Fc-FGF21 fue un fragmento que consiste de residuos de aminoácido 1-404, el cual se observó en tanto las muestras D como E muestras. En las muestras E sin embargo el producto principal del FGF21-Fc fue un fragmento que consiste de los residuos de aminoácido 5-410. Para ambas proteínas de fusión sometidas a prueba, la-porción FGF21 de la proteína de fusión fue más susceptible a la degradación que la porción Fe de la proteina.
EJEMPLO 11 Preparación y Expresión dé los Mutantes FGF21 Resistentes a la Proteólisis y las Proteínas de Fusión Los constructos que codifican los mutantes FGF21 listados en la Tabla 11 se prepararon por la amplificación PCR del vector de expresión FGF21 de tipo silvestre como se describe posteriormente (la construcción del vector de expresión FGF21 de tipo silvestre se describe en el Ejemplo 1). La meta de estos experimentos fue generar mutantes FGF21 que .sean resistentes, a la proteólisis y exhiben vidas medias más prolongadas." Tabla 11 Mutantes FGF21 Resistentes a la Proteólisis Mutación (s) Fe Ligadura R191 R191 -COOH 15 R19K R19K -COOH 15 R19Q R19Q -COOH 15 R19K, Y20H R19K, Y20H -COOH 15 R19K, L211 R19K, L211 -COOH. 15 R19 , Y20H, L211 R19K, Y20H, L211 -COOH 15 Y20F Y20F -COOH 15 Y20H Y20H -COOH 15 Y20L Y20L -COOH 15 Y20H, L211 Y20H, L211 -COOH 15 L2 11 L211 -COOH 15 L2 1 F L21F -COOH 15 L2 IV L21V -COOH 15 L2 1 Y L21Y -COOH 15 Y22F Y22F -COOH 15 .
Y221 . Y221 -COOH 15 Y22V Y22V ¦ -COOH 15 P150A P150A -NH2 ¦ 15 P150R -NH2 15 P150A,. G151A . P150A, G151A -NH2 15 P150A, 1152V P150A, 1152V -NH2 15- P150A, G151A, 1152V.
P150A, G151A, 1152V -NH2 15 G151A G151A -NH2 15 G151V G1S1V -NH2 15 G151A, 1152V G151A, 1152V -NH2 15 11 52F 1152F -NH2 15 11 52H 1152H -NH2 ¦ 15 11 52L 1152L -NH2 15 1152V G170A G170A - H2 15 G170C G170C- · -NH2 15 G170D . G170D -NH2 15 G170E G170E -NH2 15 G170 G170N. -NH2 15 G170P G170P -NH2 15 G170Q G170Q -NH2 15 G170S G170S -NH2. 15 G170E, P171A G170E, P171A -NH2 15 G170E, S172L G170E,S172L -NH2 15 ¦ G170E, P171A, S172L G170E, P171A, S172L -NH2 15 P171A P171A. -NH2 15 P171C -NH2 . 15 P171D -NH2 15 P171E -NH2 15¦ P171G -NH2 15 P171H -NH2 15 P171K -NH2 ' 15 P171N -NH2 15 P171Q -NH2 ' 15 P171S -NH2 15 P171T -NH2 15 P171W -NH2 15 P171Y -NK2 15 P171A, S172L P171A,S172L -NH2 · 15 S172L -NH2 15 S172T S172T -NH2 15 Q173E Q173E -NK2 15 Q173R Q173R -NH2 ' 15 Los constructos mutantes FGF21 se prepararon usando cebadores que tienen secuencias que son homologas a las regiones cadena arriba y cadena abajo de un codón (o codones) que son mutados . Los cebadores usados en estas reacciones de amplificación también proporcionaron aproximadamente 15 nucleótidos de secuencia de solapamiento para permitir la recirculación del producto amplificado, principalmente el vector completo que ahora tiene el mutante deseado.
Un constructo mutante FGF21 ejemplar, ' que codifica un mutante FGF21 que tiene un residuo de ácido glutámico en la posición 170 en lugar del residuo de glicina nativo (es decir, el mutante G170E) se preparó usando los cebadores mostrados en la Tabla 12.
Tabla 12 Cebadores de PCR para Preparar el Mutante FGF21 Ejemplar Cebador Secuencia SEQ ID NO: Sentido 5' -ATGGTGGAACCTTCCCAGGGCCGAAGC-3' 18 Antisentido 5' -GGAAGGTTCCACCATGCTCAGAGGGTCCGA-3' 19 Los cebadores mostrados en la Tabla 12 permiten la sustitución del residuo de lisina con un residuo de ácido glutámico como se muestra posteriormente, en- donde la secuencia superior es el cebador de sentido (SEQ ID NO: 18), la segunda y tercera secuencias (SEQ ID NOs : 20 y 22) son porciones de un ccnstructo de expresión FGF21 y la cuarta secuencia es el cebador antisentido (SEQ ID NO: 21) : 5' -ATGGTGGAACCTTCCCAGGGCCGAAGC CTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCA GAGGAGCCTGGGAGACTCGTACCACCCTGGAAGGGTCCCGGCTTCGGGGT AGCCTGGGAGACTCGTACCACCTTGGAAGG-5 ' Los constructos mutantes FGF21 se prepararon usando esencialmente las condiciones de PCR descritas en el Ejemplo 1. Los productos de amplificación . se digirieron con la endonucleasa de restricción Dpnl, y luego se transformaron en células competentes. Los clones resultantes se secuenciaron para confirmar la ausencia de errores generados por la polimerasa. Las proteínas de fusión 'Fc-FGF21 y FGF21-Fc se generaron como se describe en este documento, por ejemplo, en el Ejemplo 6.
Los mutantes FGF21 se expresaron al transformar las células BL21 (DE3) o BL21 Star ( Invitrogen; Carlsbad, CA) con el constructo que codifica un mutante particular. Los transformantes se desarrollaron durante toda la noche con aireación limitada en el medio TB suplementado con 40 pg/mL de canamicina, se airearon la siguiente mañana después de un corto periodo de recuperación, se indujeron en IPTG 0.4 mM. Los polipéptidos mutantes FGF21 se cosecharon mediante centrifugación 18-20 horas después de la inducción.
Los mutantes FGF21 también se analizaron para la inmunogenicidad predicha. Las respuestas inmunitarias contra las proteínas se mejoraron mediante el procesamiento de antígenos y la presentación en el sitio de enlace clase II de complejo de histocompatibilidad principal (MHC) . Esta interacción es requerida para ayudar a' las células T en la maduración de los anticuerpos que reconocen la proteína. Puesto que los sitios de enlace de las moléculas clase II MHC-se han caracterizado, es posible predecir si las proteínas tienen secuencias específicas que se pueden enlazar a una serie de alelos humanos comunes. Se han creado algoritmos informáticos con base en las referencias de literatura y las estructuras de cristal clase II MHC para determinar si las secuencias de péptidos de aminoácido lineales tienen el potencial de romper la tolerancia inmune. El programa de computadora TEPITOPE se usó para determinar si las mutaciones puntuales en los mutantes FGF21 particulares incrementarían las células T específicas de antígeno en una mayoría de humanos. Con base en un análisis de la secuencia de proteínas lineal de cada mutante FGF21, ninguno de los mutantes se predijo para mejorar la inmunogenicidad.
EJEMPLO 12 Impacto de la Secuencia Ligadura sobre la Degradación FGF21 Para determinar si la presencia de una ligadura de aminoácidos más grande entre la secuencia Fe y la secuencia FGF21 afecta la degradación FGF21, se inyectaron ratones con proteínas de fusión FGF21 en. las cuales la región Fe se separó de la secuencia FGF21 por una ligadura de 15 aminoácidos que tiene ' la secuencia GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23), se extrajo sangre de los ratones en varios puntos de tiempo, y el suero se analizó por LC-MS. En particular, los ratones se inyectaron con Fc(15)FGF21 o FGF21(15)Fc (obtenidos de £.. coli) a 23 mg/kg, se extrajo sangre a 6, 24, y 48 horas, y la sangre extraída se purificó por afinidad usando una resina de agarosa Fe anti-humana.
Antes de analizar las muestras purificadas por el LC-MS, los estándares de proteínas Fc(15)FGF21 y FGF21(15)Fc se analizaron como una referencia. Los estándares de proteínas se redujeron ya sea con TCEP o no se redujeron. Ambos estándares reducidos y no reducidos se analizaron por LC-MS usando una columna de 0.3 mm x 30 cm de ACE ciano con la pulverización de efluente de columna en un espectrómetro de masas de trampa de iones LCQ Classic. Puesto que los espectros desconvolucionados de las muestras reducidas fueron más limpios, las muestras purificadas por afinidad se redujeron antes del análisis LC-MS.
Las masas observadas, para el estándar Fc(15)FGF21 reducido y las muestras purificadas por afinidad correspondientes retiradas en varios puntos de tiempo se muestran en la Figura 8A-Figura 8D. Las masas observadas para el estándar FGF21(15)Fc reducido y las muestras purificadas por afinidad correspondientes retiradas en varios puntos de tiempo se muestran en la Figura 9A-Figura 9D. Algunos de los materiales eluidos estándares y de muestra se sometieron a la secuenciación de . Edman a fin de confirmar la N-terminal de las proteínas y asistir en predecir la identidad de los fragmentos observados por LC-MS. Los resultados del análisis LC-MS de los estándares y las muestras y una indicación de los fragmentos predichos se proporcionan en la Tabla 13.
Tabla 13 Resultado del Análisis LC-MS y los Fragmentos Predichos Muestra FGF21 Masas Porcentai e Fragmento ¿N- observadas del total terminal principales intacta? Estándar Fc(15)FGF21 46,002 Da 100% 1-424 Si Fc(15) FGF21 6 horas 46, 000 65%35% 1-4241- Si Da44 , 978Da 414 Fc(15)FGF21 24 horas' 44, 978 85%15% 1-4 141- Si Da43,022 Da 394 Fe (15) FGF21 48 hora 44, 976 60%40% 1-4 141- Si Da43, 019 Da 394 Estándar FGF21(15)Fc ¦45,999 Da 100%. 1-424 Si FGF21 (15) Fe 6 horas 45,870 Da 100% 1-423 Si FGF21 (15) e 24 horas 45, 869 40%35%25% 1-4236- Algunas Da45, 301 42322-423 veces Da43,460 Da FGF21 (15) Fe 48 horas 45,870 15%20%65% 1-4236- Algunas Da45,297 42322-423 veces Da43,461 Da Como se indica en la Tabla 13, todas las muestras purificadas por afinidad mostraron algún grado de degradación después de únicamente 6 horas de circulación. Después de 24 horas de circulación, los productos principales de Fc(15)FGF21 fueron fragmentos que consisten de residuos de aminoácido 1-414 (85% de la muestra) y 1-394 (15% de la muestra), y los productos principales de FGF21(15)Fc fueron fragmentos que consisten de los residuos de aminoácido 1-423 (40% de la muestra), 6-423 (35% de la muestra), y 22-423 (25% de la muestra) . Los puntos de escisión identificados para las proteinas Fc(15)FGF21 y FGF21(15)Fc se muestran en la Figuras 10A y Figura 10B, respectivamente.
EJEMPLO 13 Actividad in vivo de los Mutantes Fc(15)FGF21 Resistentes a la Proteólisis a 1-7 Dias Después de la Inyección Como se describe en este documento, la escisión proteolítica de · las proteínas de fusión FGF21 Fe. depende de la orientación de la secuencia Fe, con el extremo Fe de la proteína de fusión que es más estable que el extremo FGF21 de la proteína de fusión (es decir, la porción N-terminal de las proteínas de fusión Fc-.F GF21 y la porción C-terminal de las proteínas de fusión FGF21-FC se descubrieron que son más estables). Por ejemplo, la escisión se identificó en las posiciones 5 y 21 de FGF21-Fc y las posiciones 151 y 171 de FC-FGF21.
Como resultado de estas observaciones, se realizó una investigación para identificar mutantes FGF21 resistentes a la proteólisis. El análisis LC-MS de Fc-F GF21 demuestra que la degradación proteolítica in vivo ocurre primero entre los residuos de aminoácido 171-172, seguido · por la degradación entre los ¦ residuos de aminoácido 151-152. Al bloquear la degradación proteolítica en la posición 171, la escisión en la posición 151 se puede evitar, prolongando efectivamente la vida media de la molécula. Sin embargo, los mutantes resistentes a la proteólisis en la cual la escisión se evita en la posición 151 aún puede poseer residuos en la posición 171 que · son susceptibles al ataque de la proteasa, dando por resultado en consecuencia una molécula que pierde los últimos 10 aminoácidos, los cuales se sabe que se implican en el enlace del co-receptor beta-klotho, el cual es un- determinante de la afinidad del receptor de ligando y la potencia in vitro e in vivo. Por lo tanto, la mutagénesis de los residuos de aminoácido que circundan la posición 171 en el FGF21 maduro parece que es más critica para mejorar la estabilidad in vivo, potencia y eficacia de la molécula.
La actividad in vivo de los mutantes Fc(15)FGF21. resistentes a la proteólisis particulares se sometió a ensayo al inyectar intraperitonealmente ratones ob/ob con un mutante FGF21, . al extraer las muestras de sangre de los ratones inyectados a 0, 0.25, 1, 3, 5, y 7 días después de la inyección, y luego al medir los niveles de glucosa en la sangre en las muestras. Los resultados de un experimento se proporcionan en la Figura 11, la cual muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con un control. PBS, un control Fc(15)FGF21, o los mutantes Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 P171A, Fc(15)FGF21 S172L, · Fe ( 15 ) FGF21 G170E/P171A/S172L, o Fc(15)FGF21 G151A. La Figura 12 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de sangre en la glucosa como se determina en este experimento. Este experimento demuestra que los mutantes Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 P171A, Fc(15)FGF21 S172L, y Fc(15)FGF21 G170E/P171A/S172L exhiben una actividad de disminución de glucosa en la sangre sostenida por . hasta 5 días, los cual es superior a la actividad del Fc-FGF21 de tipo silvestre. El mutante Fc(15)FGF21 G151A solo mejoró parcialmente la duración de la actividad de disminución de glucosa en la sangre como es comparada con la proteina de fusión Fc-F GF21 de tipo silvestre. Sorprendentemente, aunque el mutante Fe (15) -FGF21 S172L no es un mutante resistente a la proteólisis, y por lo tanto tiene un perfil de degradación similar como el polipéptido Fe (15) FGF21 de tipo silvestre, este mutante se descubrió que exhibe una . eficacia in vivo mejorada como es comparado con el polipéptido Fe (15) FGF21 de tipo silvestre.
Los resultados de otro experimento se proporcionan en la Figura 13, la cual muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con un control PBS, un control Fc(15)FGF21, o los mutantes Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 P150A/G151A/I152V, Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 G170E/P171A, o Fc(15)FGF21 G170E/S172L. La Figura 14 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre como se determina' en este experimento. Como en el experimento descrito anteriormente, la proteina de fusión Fc-FGF21 de tipo silvestre y el mutante Fc(15)FGF21 P150A/G151A/I152V no exhiben una actividad de disminución de glucosa en la sangre sostenida, posiblemente debido a que la degradación en el sitio 171 aún podría ocurrir^ y los niveles de glucosa en la sangre en animales inyectados con estas proteínas regresaron en la linea base 24 horas después de la inyección. Sin embargo, el Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 G170E/P171A, o Fc(15)FGF21 G170E/S172L exhibieron una actividad de disminución de glucosa en la sangre máxima hasta 5 dias después de la inyección, lo cual es superior a la proteína de fusión FC-FGF21 de tipo silvestre y el mutante Fc(15)FGF21 P150A/G151A/I152V.
' Los resultados de otro experimento, se proporcionan en la Figura 15, la cual muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones^ inyectados con un control PBS o los mutantes c(15)FGF21 Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 .G170A, Fc(15)FGF21 G170C, Fc(15)FGF21 G170D, Fc(15)FGF21 G170N, o Fc(15)FGF21 G170S. La Figura 16 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa ¦ en la sangre como se determina en este experimento. Todos los mutantes FGF21 sometidos a prueba en este experimento exhibieron una actividad de disminución, de glucosa en la sangre sostenida por hasta 5 días después de la inyección.
Los resultados de otro experimento se proporcionan en la Figura 17, la cual muestra los niveles de glucosa en la sangre . medidos en ratones inyectados con PBS o los mutantes Fc(15)FGF21 Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 P17-1E," Fc( 5)FGF21 P171H, Fc(15.)FGF21 P171Q, Fc(15)FGF21 P171T, o Fc(15)FGF21 P171Y. La Figura 18 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre, como se determina en este experimento. Todos los mutantes FGF21 sometidos a prueba en este experimento exhibieron una actividad de disminución de glucosa en la sangre mejorada cuando se . compara con el Fe-' FGF21 de tipo silvestre.
EJEMPLO 14 Degradación In vivo de los Mutantes Fc(15)FGF21 Resistentes a la Proteólisis de 6 a 120 Horas Después de la Inyección La -estabilidad in vivo de los mutantes FGF21 seleccionados se analizó al inyectar ratones con un mutante FGF21, al extraer la sangre de los ratones en varios puntos de tiempo y al analizar el suero por LC-MS. En particular, los ratones se inyectaron con ya sea los mutantes Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 P171A, o Fc(15)FGF21 S172L (obtenidos de E. coli como se describen en el Ejemplo 2), cada uno de los cuales se diluyó en aproximadamente' 180 pL de HCl 10 mM para inyección, y la sangre se extrajo a 6, 24, 48, 72, y 120 horas. Las proteínas FGF21 se purificaron por afinidad de la sangre extraída usando una columna de resina de agarosa Fe anti-humana. Las muestras se eluyeron de la columna usando HCl 10 mM. Todos los constructos ¦ FGF21 comprenden una región Fe y una ligadura' de 15 .aminoácidos en el extremo amino-terminal de la proteína FGF21. Los ratones también se inyectaron con un control FGF21 de tipo silvestre.
Antes - de analizar las muestras purificadas por afinidad por el LC-MS, los matantes FGF21 de tipo ' silvestre no procesados y FGF21 no procesados se analizaron como una referencia. Todos, los estándares y las muestras de punto de tiempo se redujeron con el TCEP, y luego se analizaron por el LC-MS usando una columna de 0.3 mm x 30 cm de ACE ciano con la pulverización de efluente de columna dentro de un espectro de masas de trampa de 'iones LCQ Classic. Las muestras purificadas por afinidad se disminuyeron con acetato de amonio, se redujeron con TCEP, y luego se ' analizaron por el LC-MS como se describe anteriormente.
Las masas observadas para el Fc(15)FGF21 de tipo silvestre a 0, 6, 24 y 48 horas después de la inyección se muestran en la Figura 19A-Figura Í9D, respectivamente. Las masas observadas para Fc(15)FGF21 G170E a 0, 6, 24 y 48 horas después de la inyección se muestran en la Figura 20A-Figura 20D, respectivamente. Las masas observadas para Fc(15)FGF21 P171A a 0, 6, 24 y 48 horas después de la inyección se muestran en las Figura 21A-Figura 21D, respectivamente. Las masas observadas para Fc(15)FGF21 S172L a 0, 6, 24 y 48 horas • después de la inyección se muestran en la Figura 22A-Figura 22D, respectivamente.
; Todas las muestras extraídas a 72 y 120 horas se descubrieron que contienen un componente de peso molecular alto (>200 kDa por ¦ el SDS-PAGE no de reducción) de fibrinógeno que es mucho más abundante que la proteína de fusión Fc(15)FGF21 réstante. Los resultados del análisis LC-MS de los otros ' estándares y las muestras se proporcionan en la Tabla 14.
Tabla 14 Resultados del Análisis LC-MS y los Fragmentos Predichos Muestra FGF21 Masas observadas Porcentaje Fragmento Edman principales del total Estándar 45,994 Da 100% 1-424 Fc(15)FGF21 WT Fc(15)FGF21 WT 6 46,001 Da 44,987 80% 20% 1-4241- No horas Da 414 : Fc(15)FGF21 WT 24 44, 979 Da 100% 1-414 No horas Fc(15)FGF21 WT 48 44, 980 Da 100% 1-414 horas Estándar 46, 068 Da 100% 1-424 Fc(15)FGF21 G170 Fc(15)FGF21 G170E 6 46,078 Da 100% 1-424 No horas Fc(15)FGF21 G170E 46,074 Da 45,761 80% 20% 1-4241- No 24 horas Da 421 Fc(15)FGF21 G170E 46,072 Da 45,760 60% 40% 1-4241-42 No 48 horas Da 1 Estándar 45, 970 Da 100% 1-424 Fc(15)FGF21 P171A Fc(15)FGF21 P171A 6 45, 98.0 Da 100% 1-424 No horas Fc(15)FGF21 P171A 45,973 Da 45,657 .70% 30% 1-4241- No 24 horas Da 421 Fc(15)FGF21 P171A 45', 992 Da ¦ 50% 1-424 No 48 horas 45, 673 Da ¦ 50% 1-42 1 Estándar 46,022 Da 100% . 1-424 Fc(15)FGF21 S172L Fe (15) FGF21 S172L 6 46,027 Da 100% 1-424 No horas Fc(15)FGF21 ¦ S172L 44,984 Da 100% 1-414 No 24 horas Fc(15)FGF21 S172L 44, 985 Da 100% 1-414 No 48 horas Como se indica en la Tabla 14, la degradación ,del Fc(15)FGF21 de tipo silvestre y el mutante S172L se ven similares, en que después de 24 horas de circulación, el producto principal de la proteina de fusión, fue un fragmento que consiste de los residuos de aminoácido 1-414. Los productos de degradación de los mutantes Fe (15) FGF21. G170E y Fc(15)FGF21 P171A también se ven similares en que las muestras extraídas después e 24 horas de circulación contienen 70-80% de proteina intacta (aminoácidos 1-424) y 20-30% de un fragmento que consiste de los residuos de aminoácido 1-421. Aún después de 48 horas, los mutantes Fc(15)FGF21 G170E y Fc(15)FGF21 P171A aún retienen la proteína intacta mientras que muestran un incremento en la cantidad del fragmento que consiste de los residuos de aminoácido 1-421. Como se observa en el análisis anterior de los constructos Fc-FGF21, se detectó la degradación de la porción FGF21 de proteína de fusión y la porción Fe se descubrió que permanece .estable. Los sitios de escisión identificados por el Fe (15) FGF21 ' G170E, Fc(15)FGF21 P171A, y Fc(15)FGF21 S172L de tipo silvestre se muestran en la Figura 23A-Figura 23D, respectivamente.
EJEMPLO 15 Identificación de los Mutantes FGF21 de Reducción de Agregación Una propiedad del FGF21 de tipo silvestre es su propensión a agregarse. Los mutantes FGF21 de reducción de agregación se identificaron sobre la base de dos hipótesis. La primera .hipótesis es que, con respecto a FGF21, la agregación (o dimerización) se desencadena por interacciones hidrofóbicas e interacciones van der Waals . entre las moléculas FGF21 causadas por los residuos hidrofóbicos que se exponen al medio ambiente de . solvente basado en agua hidrofilico. La segunda hipótesis es que estos residuos hidrofóbicos expuestos se pueden sustituir para .crear variantes de mutación puntual de reducción de agregación si comprometer la actividad FGF21.
Se usó un procedimiento' de ingeniería de proteínas racional sistemático para identificar residuos hidrofóbicos expuestos en FGF21. Ya que no se conocían las estructuras de rayos X o RN de FGF21 que se' podrían usar para cuantificar los residuos hidrofóbicos expuestos, una estructura de cristal de rayos X (1.3 A) de' alta resolución de FGF19 (IPWA) obtenida de Banco de Datos de Proteina (PDB) se usó para crear un modelo de homología 3D del FGF21 usando un software de modelación MOE (Molecular Operating Environment ; Chemical Computing Group; Montreal, Quebec, Canadá). El FGF19 se seleccionó como una plantilla, puesto que entre las proteínas depositadas en el ¦ PDB, el FGF19 es la proteína más estrechamente relacionada con el FGF21 en términos de la homología de secuencia de aminoácidos.
La accesibilidad del solvente se calculó por el siguiente método usando MOE. Una primera medición del área superficial (SAI) se define como el área de la superficie accesible del residuo en. A2. Mientras que un residuo de aminoácido particular se presenta en una secuencia primaria · de la proteína muchas veces, cada ocurrencia en el residuo puede tener un ^área superficial diferente debido a las diferencias en, ínter alia, la proximidad del residuo a la superficie de la proteína. La orientación de la cadena lateral del residuo, y la posición espacial de los residuos de aminoácido adyacentes. Por lo tanto, una segunda medición del área superficial (SA2) se hace . en donde el residuo de interés se extrae de la estructura de la proteína junto con ese vecino del residuo, o residuos adyacentes. Estos residuos espacialmente adyacentes son mutados in silico a glicinas para remover sus cadenas laterales, y luego, se calcula la SA2 para el residuo de interés, proporcionando una medida del área superficial posible total para ese residuo en su conformación particular. Una relación de SAI a SA2 (SA1/SA2) entonces puede proporcionar una medición del porcentaje del área .superficial posible para ese residuo que. se expone actualmente .
Varios residuos hidrofóbicos que se exponen altamente al solvente se seleccionaron para el análisis adicional, y las . mutaciones puntuales in silico se hicieron para estos residuos 'para reemplazar el residuo seleccionado con los otros residuos de aminoácido de origen natural. Los cambios en la estabilidad térmica en la proteina que resultan de diferentes sustituciones se calcularon usando el modelo FGF21 y el programa basado en la red interactivo CUPSAT (Cologne University Protein Stability Analysis Tools) de acuerdo con las. instrucciones proporcionadas en el sitio de la red CUPSAT. Véase Parthiban y colaboradores, 2006, Nucleic Acids Res. 34: W239-42; Parthiban y colaboradores, 2007, BMC Struct. Biol. 7:54. Significativamente las mutaciones de desestabilizacion o hidrofóbicas se excluyeron en el diseño de las variantes de · mutación puntual de reducción de agregación. Las sustituciones de estabilización (o, en casos raros, ligeramente de desestabilización) que introducen características hidrofílicas y/o iónicas mejoradas se consideraron como candidatos para los mutantes FGF21 de reducción de agregación.
Un resumen de los datos generados a través de este procedimiento de ingeniería de proteínas racional se proporciona en la Tabla 15, la cual también lista mutantes FGF21 ejemplares esperados que tengan una agregación de proteínas reducida y estabilidad mejorada.
Tabla 15 Efecto Calculado de los Mutantes FGF21 Sobre la Estabilidad Residuo # Residuo WT Mutación Estabilización (Kcal/mol) 26 A K 1.25 E 1.54 R 2.016 45 A T 0.66 Q 0.71 K 1.8 E 2.34 R 1.59 52 L 'T -0.33 58 L G 0.16 ¦ S -0.15 C 1.0 E 0.08 60 P A 1.3 K . 1.51 E 0.66 R 1.31 EJEMPLO 16 Preparación y Expresión de Mutantes FGF21 de Reducción de Agregación y Proteínas de Fusión Los constructos que codifican los mutantes FGF21. listados en la Tabla 16. se prepararon por la amplificación de PCR del vector de expresión FGF21 de tipo silvestre como se describe en el Ejemplo 11 (la construcción del vector de expresión FGF21 de tipo silvestre se describe en el Ejemplo 1). Las proteínas de fusión se generaron como se describe en este documento, por ejemplo, en el Ejemplo 6.
Tabla 16 Mutantes FGF21 de Reducción de Agregación Mutación (es) Fe ligadura A26E A26K A26R A45E A45K A45K -NH2 15 A45R -NH2 15 A45Q -NH2 15 A45T -ÑH2 15 A45K, L98R -NH2 15 L52T L58C L58E A129E -ÑH2 15 A129H -NH2 15 A129K A129N -NH2 15 A129R -NH2 15 ' A129Q A134E A134H -NH2 ¦15 A134K A134Y La agregación de varias proteínas FGF21, que incluyen FGF21 de tipo silvestre, polipéptido FGF21 truncados, mutantes FGF21, y proteínas de fusión FGF21 se sometieron a ensayo por la ' cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) . Las muestras que se analizan se .incubaron a 4°C, a temperatura ambiente, o 37 °C por varios puntos de tiempo, y luego se sometieron al análisis SEC. Los experimentos se ' realizaron sobre un sistema HPLC Beckman equipado con una columna SEC. Para el FGF21 de tipo silvestre, se usó una columna TOSOHAAS TSK-Gel G2000 SEC con 2x de PBS que contiene alcohol isopropílico al 2% como la fase móvil. Para las proteínas de fusión FGF21 Fe y los polipéptidos mutantes FGF21, se usó una' columna TOSOHAAS TSK- Gel G3000 SEC con 2x de- PBS como la fase móvil.
EJEMPLO 17 Actividad In vitro de los Mutantes FGF21 de Reducción de Agregación Se realizaron experimentos para identificar mutantes de reducción de agregación que retienen la actividad FGF21 de tipo silvestre en una ensayo ' in vitro de ELK-luciferasa. Los ensayos de ELK-luci ferasa se realizaron como se describe en ..el Ejemplo 4. La Figura 24A-Figura 24C muestran los resultados de un ensayo de actividad de ELK-l.uciferasa realizado sobre los mutantes FGF21 FGF21 L99R, FGF21 L99D, y FGF21 A111T (Figura 24A-) ; los mutantes FGF21 FGF21 A129D, FGF21 A129Q, y FGF21 A134K (Figura 24B) ; y los mutantes FGF21 FGF21 A134Y, FGF21 A134E, y. FGF21 A129K (Figura 24C) . Los resultados de estos experimentos demostraron que algunas de las mutaciones de reducción de agregación no impactaron adversamente la actividad FGF21 como se sometió a ensayo en los ensayos de ELK-luciferasa .
EJEMPLO 18 Preparación y Expresión de los Mutantes de Combinación Fc(15)FGF21 que Muestran Vida Media Más Prolongada y Niveles Más Bajos de Agregación Una variedad de mutantes de combinación FGF21, que contiene mutaciones mostradas .para reducir la agregación así como también para incrementar la vida media al interrumpir la degradación proteol itica., se prepararon y se conjugaron a las moléculas IgGl Fe. Estos mutantes FGF21 se prepararon esencialmente como se describe en el Ejemplo 11.
EJEMPLO 19 Estudios In vitro de Mutantes Fc(15)FGF21 que Muestran Vida Media Más Prolongada y Niveles Más Bajos de Agregación Se realizaron experimentos para identificar los mutantes de combinación FGF21 que. retienen la actividad FGF21 de tipo¦ silvestre en un ensayo in vitro de ELK-luciferasa . Se , realizaron ensayos de ELK-luciferasa como se describe en el Ejemplo 4.
Las Figuras 25A-25D muestran los resultados de un .ensayo de actividad de ELK-luciferasa realizados sobre los mutantes. FC-FGF21 FC-FGF21 P171G, Fc-FGF21 P171S, y FC-FGF21 P171T (Figura 25A) ; los mutantes Fc-FGF21 " Fc-FGF21 P171Y, Fc- FGF21 P171W, y Fe- FGF21 P171C (Figura 25B) ; Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 A45K/G170E y FGF21 A45K (Figura. 25C) ; y Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 P171E,¦ y Fc(15)FGF21 A45K/G170E (Figura 25D) . Los resultados de estos experimentos demuestran que las mutaciones dirigidas a mejorar la estabilidad, o tanto la estabilidad como la solubilidad, · no comprometieron la actividad in vitro como es comparado con el Fc-FGF21 de tipo silvestre. Interesantemente, el mutante FGF21 A45K mostró una potencia mejorada relativa con el Fc-F GF21 de tipo, silvestre.
La Figura 26A muestra el cambio en el porcentaje de agregación para un control FGF21 (WT) y FGF21 A45K "después de la incubación de 65 mg/mL de proteína a 4°C durante 1, 2, y 4 días. Los- datos indicaron que la mutación A45K conduce a una disminución en la agregación de la proteína, comparada con la proteína de tipo silvestre. La Figura 26B muestra el cambio en el porcentaje de agregación para un control FGF21 (WT) y FGF21 P78C, P78R, L86T, L86R, L98C, L98R, A111T, A129D, A129Q, A129K, A134K, A134Y, y A134E después de la incubación de 65 mg/mL de proteínas a 4°C durante 1, 6, y 10 días. Los datos indicaron que el L86R, L98C, L98R, A111T, A129Q, y A129K condujo a una disminución a la agregación de la proteína, comparada con la proteína de tipo silvestre.
La Figura 27 muestra los resultados de un ensayo de actividad de ELK-luciferasa realizados sobre un control FGF2L humano y los mutantes FGF21 FGF21 A45K, FGF21 L52T, y FGF21 L58E. Este experimento demuestra que el mutante FGF21 A45K retiene la eficacia total del FGF21 de tipo silvestre y exhibe una potencia que es aún mayor que el FGF21 de tipo silvestre. Sin embargo, los mutantes FGF21 L52T, y FGF21 L58E muestran una potencia y eficacia reducidas como es comparado con el FGF21 de tipo silvestre.
Las Figuras 28A-28B muestran el cambio en los niveles de agregación para -loa ' mutantes Fc(15)FGF21 Fc(15)FGF21 6-181/G170E, Fc(.15)FGF21 A45K/G170E, Fc(15)FGF21 P171E, Fc(15)FGF21 P171A, Fc(15)FGF21 G170E, y un. control FGF21 después de la incubación a 4°C durante 1, 4, y 8 días. Este experimento demuestra que durante el período de 8 días', el mutante Fc(15)FGF21 A45K/G170E mostró menos agregación que los mutantes Fe ( 15 ) FGF21G 170É o Fc(15)FGF21 PI71E, pero los tres mutantes mostraron menos agregación que el control Fe ( 15 ) FGF21. La Tabla 17 muestra el porcentaje de agregación obtenido para un control Fc-FGF21 y el mutante' Fc-FGF21 A45K/G170E después de la incubación a 4°C. o a temperatura ambiente durante 0, 2, 3, 4, o 7 días.
Tabla 17 Porcentaje de Agregación para el Mutante Fc-FGFH y Fc-FGFH EJEMPLO 20 Preparación y Expresión de los Mutantes de Combinación de Fusión FGF21 Como se describe anteriormente, la estabilidad y solubilidad del FGF21 se puede modular a través de la introducción de truncamientos específicos y sustituciones de aminoácidos. Además, la estabilidad FGF21 se puede mejorar-adicionalmente al fusionar estas proteínas FGF21 modificadas con la porción Fe del gen IgGl de de inmunoglobulina humano. Por otra parte, al introducir combinaciones de las modificaciones anteriores-, se pueden generar moléculas FGF21 que tienen tanto estabilidad como solubilidad mejoradas. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los mutántes de combinación FGF21 listados en la Tabla 18 es prepararon usando las técnicas descritas anteriormente.
Tabla 18 Mutan es de Combinación FGF21 Residuos de Mutación , de Mutación de Fe ligadura aminoácido Proteólisis agregación 1-181 G170E A45K -NH2 15 1-181 G170E L98R -NH2 15 1-181 G170E A45K,L98R -NH2 15 1-181 P171G A45K -NH2 15 1-181 P171S A45K -NH2 15 1-181 P171G L98.R -NH2 15 1-181 .P171S L98R -NH2 15 1-181 P171G A45K, L98R -NH2 15 1-178 G170E -NH2 15 6-181 G170E -NH2 15 6-181 G170E A45K -NH2 15 6-181 G170E L98R -NH2 15 6-181 P171G -NH2 15 6-181 P171G L98R -NH2 15 7-181 G170E -NH2 15 La Figura. 29 muestra - los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con los mutantes de combinación Fc(15)FGF21 Fc(15)FGF21 A45K/G170E, Fc(15)FGF21 A45K/P171G, o Fc(15)FGF21 L98R/P171G.
En otro experimento el mutante FGF21 Fc(15)FGF21 L98R/P171G se estudió en paralelo con el FGF21 de tipo silvestre y el Fc-FGF21. En un experimento, una linea de células 293T recombinantes se cultivó, en presencia de diferentes concentraciones de FGF21, Fc-FGF21, o Fc(15)FGF21 L98R/P171G durante 6 horas. Los lisados celulares luego se sometieron a ensayo, para la actividad de luciferasa. Como se muestra en la Figura- 30, el Fc(15)FGF21 L98R/P171G tuvo actividad similar al Fc-FGF21, indicando que la introducción de las dos mutaciones puntuales no alteraron la actividad in vitro de la molécula.
En todavía otro experimento, la -estabilidad del Fc"(15)FGF21 L98R/P171G a 65 mg/mL se evaluó durante nueve días a dos temperaturas diferentes, principalmente a temperatura ambiente y a 4°C, en paralelo con el FGF21 y Fc-FGF21. Después del período de incubación los lisados celulares se analizaron con SEC-HPLC para determinar un perfil de agregación contra tiempo en varias temperaturas. Los datos mostrados en la Figura 31A y Figura 31B indican que la velocidad de la formación de agregación se redujo significativamente en el Fc(15)FGF21 L98R/P171G a temperatura ambiente (triángulos sólidos, . linea punteada en la Figura 31A) y a 4°C (triángulos sólidos, linea punteada en la Figura 31B) .
EJEMPLO 21 Mutantes FGF21 Resistentes a la Proteolisis que Comprenden Mutaciones C-terminales También se estudió la estabilidad in vivo de los mutantes de combinación. Específicamente, la estabilidad in vivo del Fc(15)FGF21 L98R/P171G sé comparó con la estabilidad de Fc(15)FGF21 en modelos de murino y cynomolgus . Los resultados se encontraron que son similares en ambas especies. En el estudio de cynomolgus, el Fc(15)FGF21 L98R/P171G y Fc(15)FGF21 se inyectaron IV en 23.5 mg/kg y las alícuotas del suero y plasma se recolectaron en los puntos de tiempo a 840 horas, después de la dosis. Se analizaron los puntos de tiempo de las 168 horas. Las muestras de punto de tiempo se purificaron por afinidad usando reactivos anti-Fc, luego se analizaron usando la espectrometría de masas MALDI . Los resultados se correlacionaron bien entre los dos análisis .
El análisis de · los datos generados usando la • inmunoafinidad-MALDI , que recorta, el sitio P171 se observó que se elimina en la molécula Fc(15)FGF21 L98R/P171G como resultado de la mutación de P171 a P171 G. Sin embargo, una degradación menor y lenta que' da por resultado una pérdida de hasta 3 residuos C-termináles se observó para Fc(15)FGF21 L98R/P171G (Figura 32) . Las escisiones menores en los tres residuos · C-terminales también se- observaron con otros 'mutantes FGF21 después de que el sitio' de escisión más susceptible entre los residuos de aminoácido 171 y 172 sé bloqueó como se muestra en la 20 y Figura 21. La escisión de 3 residuos C-terminales puede representar el cese de la escisión del extremo C-terminal de la molécula por una carboxipeptidasa en una forma secuencia, residuo a residuo o un ataque de pr.oteasa . especifica en -los residuos de aminoácido 178 y 179 con el · recorte no especifico en los residuos de aminoácido · 179-180 y 180-181. La pérdida de los 2-3 aminoácidos en la C-terminal o podría causar el enlace reducido del beta-klotho y la potencia finalmente disminuida y la actividad in vivo de la molécula Véase, por ejemplo, Yie y colaboradores, 2009, FEBS Lett. 583:19-24. Para tratar la degradación del carboxipeptidasa evidente de la C-terminal, se estudió el impacto de agregar un residuo de aminoácido "tapa" a varios polipéptidos mutantes FGF21. Una variedad de constructos, que incluyen . aquellos representados en la Tabla 19, se hicieron y se sometieron a ensayo usando las técnicas descritas en este documento. La Tabla 19 resume los resultados del ensayo de ELK-luciferasa in vitro.
Las terminaciones de aminoácidos adecuadas pueden ser de entre 1 y 15 aminoácidos en longitud, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 10 o 15 aminoácidos en longitud. Cualquier número y tipo de aminoácido ( s ) se puede emplear como una tapa, por ejemplo, un residuo de prolina individual, y un residuo de glicina individual, dos residuos de glicina, cinco residuos de glicina, asi como también otras combinaciones. Ejemplos adicionales de terminaciones se proporcionan en el presente Ejemplo y en la Tabla 19.
Adicionalmente, para tratar el ataque de proteasa evidente en los residuos de aminoácido 178 y 179, se estudió la mutación de los residuos de aminoácido en la posiciones 179, 180 y 181. Nuevamente, una variedad de constructos, que incluyen aquellos presentados en la Tabla 19, se hicieron y se sometieron a ensayo usando las técnicas descritas en este documento. ?G impacto de las combinaciones de la terminación y las mutaciones en estos sitios también se exploró. La Tabla 19 resume los constructos ejemplares que se hicieron y se estudiaron en el ensayo de ELK-luciferasa in vitro, el cual se realizó como se describe en este documento. Consistente con la terminología usada en este documento, hFc significa una secuencia Fe humana (es decir, SEQ ID NO: 13) , L15 se refiere a una ligadura que tiene que tiene 15 residuos (es decir, SEQ ID NO: 2-3) Tabla 19 Eficacia y Valores RC50 para los Polipéptidos FGF21 que Comprenden Modificaciones C-terminales Constructos Eficacia EC50 (nm) huFGF21 0.4 100.0% hFc.L15.hFGF21 (L98R, P171G) 2.5 76.1% hFc.L15.hFGF21 (L98R, P171G, Y179F) 2.6 78.3% hFc.L15.hFGF21 (L98R, P171G, 1-180) hFc.L15.hFGF21 (L98R, P171G, 1-179) 7.8 77.4% hFc.L15.hFGF21 (L98R, P171G, A180E) 1.9 79.6% hFc.L15.hFGF21 (L98R, P171G, S181K) 130 87.9% GSGSGSGSGS . hFGF21. L15. hFc MKEDD. hFGF21. L15. hFc 834 83.1% hFc.L15.hFGF21 (L98R, P171G, S181P, P182) 272 69.9% hFc.L15.hFGF21 (L98R, P171G, A180G) 3-25 76-9% hFc.L15.hFGF21 (L98R, P171G, S181G) 3-43 77-3% hFc.L15.hFGF21 (L98R, P171G, L182) hFGF21 ( L98R, P171G, G182) hFc. L15. hFGF21 (L98R, P171G, Y179P) 428 44.4% hFc.L15.hFGF21 (L98R, P171G, Y179G) 61¦' 8.2.6% hFc . L15hFGF21 ( 98 R, P171G, Y179S) 25.3 .74.8% hFc. L15hFGF21 ¡98R, P171G, Y179A) 43.2 79.6% hFc . L15hFGF21 (98R, P171G,S181T) 3.07 77.6% hFc.L15hFGF21(98R,P1 1G,S181A) 2.66 7.3.5% h c . L15hFGF21 ( 98R, P171G, S181G) 3.46 72.61 hFc. L15hFGF21 ( 98R, P1 1G, S181 ) 33.8 79.5% hFc . L15hFGF21 ( 98R, P171G, A180P) 617 77.1% hFc.L15hFGF21 (98R, P171G, 180S) 2, 18 84.7% hFGF21 (L98R, P171G, GGGGG182-6) hFc . L15. hFGF21 (L98R, P171G, P182) 6.1 85.9% hFc.L15.hFGF21 (L9.8R, P171G, G182) 6.5 71.1% hFc.L15.hFGF21 ( 1-178, L98T, P171G) 167 63.9% hFc.L15.hFGF21 ( L98R, P171G, GG182-3 ) 1941 84.2% hFc.L15.hFGF21 (L98R, P171G, GGGGG182-6 ) 4307 99.7%v La Figura 33 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre observados en ratones db/db diabéticos (fondo C57B6) inyectados con un control PBS nativo de tipo silvestre FGF21, Fc(15)FGF21 (L98R, P171G) y dos moléculas terminadas a las cuales se agregaron ya sea. un residuos de prolina o glicina en el extremo C-terminal, es decir Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, 182P) y Fc(15)FGF21 (L98R, P171G,- 182G) . En el presente Ejemplo, cuando un residuo se agregó a la C-terminal de un polipéptido FGF21 de tipo silvestre o mutante, el residuo es referido por su posición en la proteína resultante. De esta manera, "182G" indica que un residuo de glicina se agregó a la C-términal de la proteína de tipo silvestre o mutante de 181 residuos maduros. la Figura 33 muestra que el FGF21 nativo disminuyó los niveles de glucosa en la sangre durante 6 horas mientras que tres mutante Fc(15)FGF21 estudiados mostraron una actividad de disminución de glucosa en la sangre durante por lo menos 120 horas. La molécula Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, 182P) , que comprende la adición de un residuo de prolina en la C-terminal del componente FGF21 de la molécula de fusión, pareció más potente y .dio por resultado niveles de glucosa en la sangre más bajos comparados con Fc(15)FGF21 (L98R, P171G) y Fc(15)FGF21 (L98R, P171 G, 182 G) .
En un experimento subsecuente, la actividad in vivo de (L98R, P171G, 182G) y Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, 182P) se estudió y se comparo con la actividad in vivo de una molécula terminada que comprende una adición de dos glicinas en. la C-terminal, principa Ime'nte Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, .182G 183G) . La Figura 34 muestra los resultados de ese experimento. La Figura 34¦ muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre observados en los ratones ob/ob inyectados con el control PBS,, Fc(15)FGF21 (L98R, P171G), Fc(15)FGF2Í (L98R, P171G, 182G 183G), Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, 182G) y Fc(15).FGF21 (L98R, P171G, 182P) .
Como se muestra- en la Figura 34, todas las moléculas estudiadas mostraron una actividad de disminución de glucosa sostenida comparada con el control PBS. El ¦ experimento confirmó¦ los resultados previos (Figura 33) de que Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, 182P) con una adición de prolina en la C-terminal mostraron una eficacia de disminución de glucosa ligeramente mejorada comparada con la molécula sin una terminación de proliná, por ejemplo Fc(15)FGF21 (L98R, P171G) . Sin embargo, la adición de dos residuos de glicina en la C-terminal, por ejemplo Fc(15)FGF21 (L98R, P171G,' 182G 183G), pa'reció que reducen la potencia in vivo de la molécula y acortan la duración del efecto de disminución de glucosa in vivo.
La ¦ Figura 35 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre observados en ratones db/db diabéticos (fondo C57B6) inyectados con el- control PBS o los polipéptidos mutantes FGF21 Fc(15)FGF21 (L98R, P171G), Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, Y179S), Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, Y179A), Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, A180S), y Fc(15)FGF21 (L98R, 1 P171G, A180G) . Todos los mutantes mostraron una disminución de glucosa similar con duración de acción similar.
La Figura 36 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre observados en ratones db/db diabéticos (fondo C57B6) inyectados con el control de vehículo, Fc(15)FGF21 (L98R, P171G), Fc(15)FGF21 (L98R P171G, Y179F), y Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, A180E). Comparados con los Fc(15)FGF21 (L98R, P171G) , ' Fe ( 15 ) FGF21 (L98R, P171G, Y 179F) fue menos eficaz en disminuir la glucosa en la sangre. Sin embargo, el Fc(15)FGF21. (L98R, P171G, A180E) , en el cual la alanina en la posición de aminoácidos de 180 se mutó al ácido glutámico, fue- más eficaz que el Fc(15)FGF21 (L98R, P171G) y causó una reducción del 20% adicional de los niveles de glucosa en la sangre comparado con el Fe ( 15 ) FGF21 (L98R, P171G). Estos datos sugieren que la mutación A180E puede haber reducido la¦ degradación C-terminal in .vivo y mejoró en consecuencia la potencia in vivo y la eficacia de la molécula.
EJEMPLO 22 Estudio de Monos Rhesus · Un ' constructo Fc-Linker-FGF21 se generó usando la ' metodología descrita en este documento. El constructo comprendió una secuencia IgGl Fe (SEQ. ID NO: 13) fusionada a la C-terminal a una secuencia de ligadura (Gly)5-Ser- (Gly) 3-Ser- (Gly) «-Ser (SEQ ID NO:23) la cual luego se fusionó en la C-terminal a la N-terminal de una secuencia FGF21 madura (SEQ ID NO: ), dentro de la cual dos mutaciones, L98R y P171G, se había introducido. Esto constructo luego se expresó. y se purificó como se describe en este documento, y se aisló como una forma dimérica de la proteína, cada monómero del cual se enlazó por la vía ¦ de enlaces de disulfuro intermoleculares entre la región Fe de cada monómero. Esta molécula es referida en el presente Ejemplo como "Fc-FGF21 (RG) " y tiene la secuencia de aminoácidos de la proteína . codificada por SEQ ID ??:37·. En este Ejemplo, FGF21 se refiere a la forma madura de FGF21, principalmente SEQ ID NO: . 22.1 Diseño del Estudio El constructo Fe- FGF21 ( RG ) se administró crónicamente y subcutáneamente ("SC") en monos Rhesus macho no diabéticos con un BMI > 35. Los otros dos grupos de monos (n=10 por grupo) se trataron con ya sea FGF21 (es decir, S'EQ ID NO: 4) o un control de vehículo.
Los animales se aclimataron durante 42 días antes de la administración de cualquier compuesto de prueba y luego se dividieron en grupos de 10 y se les administró múltiples inyecciones SC de los compuestos de prueba el artículo de control en una forma ciega, como se representa gráficamente en la Figura 37.' En breve, cada animal se. inyectó una vez al día con el compuesto vehícülo. El FGF21 se administró diariamente, mientras que el Fc-FGF21(RG) se administró semanalmente . Las dosis de Fc-FGF21(RG) y FGF21 se escalaron cada dos días, como se muestra en la Figura 37. El peso corporal y la captación de alimentos se supervisó por todo el .estudio. La CRO.fue ciega al tratamiento.
Se realizaron dos pruebas de tolerancia a la glucosa orales (OGTTs) antes del inicio del tratamiento. La OGTT1 se usó para clasificar los animales en tres grupos equivalentes que .tiene una distribución similar de animales con base 'en el área bajo la curva (AUC) y el pese corporal. Los resultados del segundo OGTT (OGTT2) se usó para confirmar la clasificación del primer OGTT (0GTT1) . Los monos con perfiles OGTT que fueron inconsistentes de una prueba (0GTT1) a la siguiente ¦ ( 0GTT2 ) se excluyeron. Los resultados de los OGTTs 1 y 2 se muestran en la Figura 38A y Figura 38B,. con> las mediciones AUC que mostradas en la Figura 38C. El peso corporal de línea base se muestra en la Figura 38D y la Tabla 20.
Los OGTTs 3, 4, y 5 se realizaron cada 2 semanas al final de cada tratamiento de dosis de dosis baja, media y alta. Las muestras de sangre se recolectaron de animales en ayunas semanalmente y se usaron para medir los niveles de glucosa, insulina, triglicéridos ,. así como también los niveles del compuesto de prueba.. Las muestras de sangre también se recolectaron semanalmente durante el período de lavado de 3 semanas.
Los OGTT1 y 0GTT2 de línea base mostraron un perfil de glucosa esperado como se observa en los animales normales, con una glucosa plasmática máxima obtenida a 30 minutos, y demostró AUCs estables para los 3 grupos diferentes.
Los valores de la línea base en ayunas para la química del plasma se muestran en la Tabla 20. Las mediciones de la química del plasma se realizaron en muestras de sangre recolectadas antes del inicio del tratamiento.
Tabla 20 Valores de la Línea Base para el Peso Corporal, Niveles de Glucosa en el Plasma en Ayunas , Insulina y Triglicéridos de los Tres Grupos de Monos Rhesus Se seleccionaron tres niveles de dosis diferentes, y la. dosis baja fue 0.1 y 0.3'mg/kg, la dosis media fue 0.3 y 1 mg/kg y la dosis alta fue 1 y 5 mg/kg para FGF21 y Fc-FGF21 (PvG), respectivamente. Los niveles de dosis se seleccionaron con base en la dosis-respuesta observa en los ratones con un régimen de dosificación con base en la frecuencia anticipada de la inyección en humanos. Las dosis equimolares de FGF21 se usaron para las dosis bajas y medias, y la dosis alta de Fc-FGF21 (RG) se elevó a 5 mg/kg (es decir, en lugar de 3 mg/kg, lo cual habría sido equimolar a . la dosis de 1 mg/kg FGF21) . 22.2 Efecto de los Compuestos de Prueba en el Peso Corporal En este experimento, a fin de medir el efecto de los compuestos de . prueba en el peso corporal medido semanalmente , el porcentaje dé cambio del peso corporal de la linea base se calculó semanalmente en los tres grupos diferentes de mono Rhesus. El peso corporal también . se midió durante las tres semanas del período- de lavado. Los valores del peso corporal de la linea base para cada grupo que incluyen en la Tabla 20.
El peso corporal se siguió por todo el estudio, tanto antes como después de la administración de ' los compuestos de prueba. El porcentaje de cambio del peso corporal de la línea base de los animales de vehículo se incrementaron con el tiempo, mientras que el peso corporal de los animales tratados con Fc-FGF21 (RG) y FGF21 disminuyeron en una forma dependiente de dosis, durante el curso del período de tratamiento de - 6 semanas, como se muestra en la Figura 39.' Como se observó previamente en los roedores (Xu y colaboradores, Diabetes 58(l):250-9 (2009)), el tratamiento con FGF21 disminuyó de manera estadística significativamente el peso corporal. El Fc-FGF21(RG) tuvo una exposición mayor que el FGF21 (Figura 48 y Figura 47, respectivamente), que ofrece una explicación posible .para la observación de que el Fc-FGF21 (RG) mostró' una disminución del peso corporal más pronunciada que- el FGF21. 22.3. Efecto de los Compuestos de Prueba en los Niveles de Insulina Los niveles de insulina se midieron en las muestras de sangre que habían sido recolectadas después de un ayuno durante toda la noche o después de una comida.de la tarde.
Se midieron los' niveles de insulina .en el plasma en ayunas en monos Rhesus cada semana en animales tratados con ya sea vehículo, FGF21 o Fc-FGF21 (RG) y durante el período de lavado de 3 semanas. Las muestras de sangre en ayunas se extrajeron a aproximadamente cinco días después de la última inyección de Fc-FGF21 (RG) y aproximadamente 21 horas después de la última inyección de FGF21.
Los niveles de insulina en el plasma alimentados se midió en los monos Rhesus durante cinco y seis semanas de tratamiento con ya sea el vehículo o FGF21 durante el tratamiento de dosis alta. Las muestras de sangre alimentadas se extrajeron aproximadamente tres días después de la inyección de Fc-FGF21(RG) y aproximadamente 2 horas después de la última inyección de FGF21. La Figura 40 muestra el efecto del vehículo, FGF21 y Fc-FGF21 (RG) en los nieles de insulina en ayunas durante el estudio de nueve semanas total, mientras que la Figura 41 representa los niveles de insulina alimentados determinados de las muestras tomadas durante la semana 5 y 6.
En resumen, en las dos dosis más alta, tanto FGF21 como Fc-FGF21(RG) disminuyeron de manera estadística significativamente los niveles de insulina en el plasma en ayunas y alimentados. La observación de que los niveles de insulina de los . animales tratados con FGF21 y Fc-FGF21(RG) se disminuyó sin observar que los niveles de glucosa incrementados es indicativo de sensibilidad ¦ a la insulina incrementada. 22.4 Efecto de los Compuestos de Prueba en el OGTT (Glucosa e Insulina) Tres OGTTs (OGTTs 3, 4 y 5) se realizaron después de que se inició el tratamiento. Los perfiles del nivel de glucosa e insulina OGTT5 se midieron en animales tratados durante 6 semanas con el vehículo, FGF21 o Fc-FGF21 (RG) , que' corresponden a las últimas dos semanas del régimen de escalamiento de dosis alta. El GTT5 se condujo a aproximadamente 7 días después- de la última inyección de Fc- FGF21(RG),. y aproximadamente 21 horas después ' de la última inyección de FGF21. Los perfiles de glucosa e insulina de ¦ OGTT5 se muestran en la Figura 42 y la Figura 43, respectivamente. Los animales tratados con FC-FGF21 (RG) mostraron una eliminación de glucosa mejorada comparado con los animales tratados con vehículo solamente en la dosis más alta y en el mismo tiempo punto de tiempo medido, como se ¦ muestra en la Figura 42. Al final de la última dosis, el Fe-FGF21 (RG) mostró la mejora más fuerte en la eliminación de la glucosa. El FGF21 no mostró mejora en la eliminación de glucosa., El Fc-FGF21(RG) tuvo una exposición mayor que el FGF21 (Figura' 48 y Figura 47, respectivamente), ofreciendo una explicación posible- para la observación de que el Fc-FGF21 (RG) mostró un efecto más pronunciado en la eliminación de glucosa que FGF21. Los niveles de insulina durante el 0GTT5 se disminuyeron. de manera estadística significativamente en el último punto de tiempo medido- en los animales . tratados con Fc-FGF21(RG) comparado con los animales tratados con el vehículo.
El porcentaje de cambio de AUC de la glucosa de la línea base se calculó para los tres OGTT (OGTTs 3, 4 y 5) realizados al final de cada una' de las dosis baja, media y alta en los tres grupos de los diferentes grupos de monos Rhesus como se muestra en la Figura 44. El 0GTT5 se condujo aproximadamente siete días después de la última inyección Fc-FGF21 (RG) y 21 horas después de la última inyección de FGF21 y mostró que el Fc-FGF21 (RG) redujo de manera estadística significativamente la AUC5. Los valores OGTT de línea base para cada grupo se muestran en la Figura 38C.
Los niveles de glucosa en el plasma en ayunas se midieron en los días donde no se realizaron OGTTs. No hubo diferencias estadísticas significativas observadas en los niveles de glucosa en el plasma en ayunas medidos entre los ¦tres grupos de animales. 22.5 Efecto de los Compuestos de Prueba en los Niveles de Triglicéridos El porcentaje de los niveles de triglicéridos en el plasma en ayunas se calculó en los monos Rhesus cada semana en animales tratados con ya sea el vehículo, FGF21 o Fc-FGF21(RG) y durante el período de lavado de 3 semanas. Las muestras de' sangre en ayunas se retiraron aproximadamente cinco días después de la última inyección de Fc-FGF21(RG) y aproximadamente 21 horas después de la última inyección de FGF21. Los niveles de triglicéridos se midieron cada semana después de que el tratamiento se inició y el porcentaje de cambios en la línea base se muestra en la Figura 45, los valores de línea base en ayunas se muestran en la Tabla 20.
Como se representa en la Figura 45, los animales tratados con ya sea Fc-FGF21(RG) o FGF21 mostraron una disminución dependiente de dosis en los niveles de triglicéridos, .con Fc-FGF21 (RG) que tiene el efecto de disminución más grande comparado con FGF21.
La Figura 46 muestra los niveles de triglicéridos en el plasma en las muestras adquiridas de los monos Rhesus en un estado de ayuno, durante la quinta y sexta semana del tratamiento con el vehículo o Fc-FGF21 (RG) o FGF21. Las muestras de sangre alimentadas se extrajeron aproximadamente 3 días después · de la inyección de Fc-FGF21(RG) y aproximadamente 2 horas después de la última' inyección de FGF21. Los niveles de triglicéridos en el plasma alimentadnos de los animales tratados con FGF21 y Fe- FGF21 ( RG ) se redujeron de manera estadística significativamente, comparados con los niveles de triglicéridos de los animales tratados con el vehículo ( Figura 46). 22.6 Concentración de los Compuestos de Prueba La exposición de los compuestos de prueba •administrados en niveles de dosis molares aproximadamente equivalentes se estimó por todo el período de estudio. La concentración del Fc-FGF21(RG) se midió antes de la dosis, y aproximadamente 5 días después de la inyección. Los niveles de FGF21 se midió antes de la dosis, y a 5, 12, 19, y 26 días. Las muestras de sangre se extrajeron at aproximadamente 21 horas después de la última inyección.
La concentración individual de los compuestos de prueba en cada uno de los monos se muestra en la Figura 47 y la Figura 48. Como se muestra en la Figura 47, la mayoría de los animales en el grupo tratado con FGF21 tuvo concentraciones abajo del límite de cuantificación . La Figura 48 muestra que los animales en el grupo tratado con Fc- FGF21 (RG) tuvo niveles detectables .de Fc-FGF21 (RG) durante cada fase de dosificación (dos dosis a la semana en la misma potencia de dosis). .La concentración promedio para cada fase de dosificación se incrementó a aproximadamente de manera proporcional de dosis¦ de 0.3 a 5 mg/kg para FC-FGF21 (RG) . Existe una acumulación mínima como es demostrado por las concentraciones permanentes después de la primera y segunda dosis a la semana dentro de cada fase de escalamiento de dosis para ambos compuestos. Durante la fase sin tratamiento (período de lavado) los niveles de Fc-FGF21(RG) fueron detectables hasta aproximadamente el día 47 (12 días después de la última dosis) y estuvieron abajo del límite inferior de cuantificación (LLOQ) más tarde.
La exposición de los compuestos de prueba también se supervisó durante cada OGTT. El FGF21 no fue detectable durante los OGTTs 3 y 4,. después, del tratamiento con FGF21 de dosis baja y media. Sin embargo, los niveles medibl.es se observaron durante el OGTT5, después del tratamiento con dosis alta. Un incremento proporcional de dosis en los niveles Fc-FGF21 (RG) se observó a través del tercero al quinto OGTT con niveles de dosis de escalamiento, como se muestra en la Figura 49.
Los datos de los niveles, del compuesto confirman que los animales se expusieron a la cantidad esperada de cada compuesto, principalmente FGF21 y Fc-FGF21 ( RG) , de una manera de escalamiento de dosis. Se observó una gran variabilidad en la cantidad de FGF21 · medido, lo cual fue un resultado esperado considerando que el muestreo se realizó aproximadamente 21 horas después de la última dosis y la vida media del FGF21 es.de aproximadamente 1 hora. 22.7 Conclusiones El FGF21 disminuyó los 'niveles de triglicéridos e insulina en el plasma en ayunas y alimentados y disminuyó el peso, corporal en las dosis más altas. El Fc-FGF21(RG) mejoró el OGTT y disminuyó los niveles de 'insulina en la dosis más alta, y la dosis disminuyó dependientemente los niveles de triglicéridos en el · plasma en ayunas y alimentados asi como también ¿n el peso corporal. Tanto el FGF21 como el Fc-FGF21 f'RG) disminuyeron una variedad de parámetros metabólicos en los monos Rhesüs ño diabéticos. Las disminuciones del nivel de insulina y triglicéridos fueron idénticos entre FGF21 y Fc-FGF21(RG) cuando los niveles de compuesto circulante estuvieron en un intervalo similar, en la condición alimentada. Debido a sus propiedades mejoradas, el Fc-FGF21 (RG) fue superior al FGF21 en la mayoría de los parámetros medidos y se podría administrar una vez a la semana para observar' la eficacia en los parámetros metabólicos.
Mientras que la presente invención se ha descrito en términos de varias modalidades, se entiende que ocurrirán variaciones y. modificaciones a aquellas personas expertas en el campo. Por lo tanto, se propone que las reivindicaciones adjuntas cubran, todas, e'stas variaciones equivalentes que entran en el . alcance de la ' invención como es reclamada . Además, los títulos de las secciones usados en este documento son para propósitos .de organización únicamente y no se deben considerar como limitantes del contenido descrito.
Todas las referencias' citadas en esta solicitud se incorporan expresamente a manera de referencia en este documento.

Claims (1)

  1. i 79 NOVEDAD DE LA INVENCIÓN . Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, caracterizado porque además- comprende la sustitución de cualquier aminoácido por: el residuo de alanina en la posición 45, el residuo de leucina en la posición 86, el residuo de leücina en la posición 98, el residuo de alanina en la posición 111, el residuo de alanina en la posición 129, el residuo de glicina en la posición 170, el residuo de prolina en la posición 171 o el residuo de serina en . la posición 172, y combinaciones de los mismos. 2. El polipéptido aislado, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido aislado comprende la sustitución de. cualquier aminoácido por: el residuo de leucina en la posición 98, el residuo de prolina at 171 o tanto el residuo de leucina en la posición 98 como el residuo de prolina en la posición 171. 3. El polipéptido aislado de .conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido aislado comprende la sustitución de cualquier aminoácido para tanto el residuo de leucina en la posición 98 como el residuo de prolina en la posición 171. 4. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 que tiene: (a) por lo menos una sustitución de aminoácidos que es: (i) un residuo de glutamina, isoleucina, o lisina en la posición 19; (ii) un residuo de histidina, leucina, o' fenilalanina en la posición 20; (iii) un residuo de isoleucina, fenilalanina, tirosina, o valina en la posición 21"; (iv) un residuo de isoleucina, fenilalanina, o valina en la posición 22; (v) un residuo de alanina o arginina en la posición 150; . (vi) un residuo de alanina o valina en la posición . 151; (vii) un residuo de histidina, leucina, fenilalanina, o valina en la posición 152; (viii) un residuo de alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, ácido glutámico, glutamina, prolina, o serina en la posición 170; (ix) un- residuo de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, lisina, ' serina, treonina, triptófano, o ¦ tirosina en la posición 171; (x) un residuo de leucina o treonina en la posición 172; o (xi) un residuo de arginina o ácido glutámico en la posición 173; y r lo menos una sustitución de aminoácidos que es: (i) un residuo de arginina, ácido glutámico, o . lisina en la posición 26; (ii) un residuo de arginina, ácido glutámico, glutamina, lisina, o treonina en la posición 45; (iii) un residuo de treonina en la posición 52; (iv) un residuo de cisteina, ácido glutámico, glicina, o de serina en la posición 58; (v) un residuo de alanina, arginina, ácido glutámico, o lisina en la posición 60; (vi) un residuo de alanina, arginina, .cisteina, o histidina en la posición 78; ¦ ¦ (vii) un residuo de. cisteina o treonina en la posición 86; (viii) un- residuo de alanina, arginina, ácido glutámico, lisina, o de., serina en la posición 88; (ix) un residuo de arginina, cisteina, ácido glutámico, glutamina, lisina, o treonina en la posición 98; (x) un residuo 'de arginina, ácido aspártico, cisteina, o ácido glutámico en la posición 99; (xi) un residuo de lisina o treonina en la posición 111; (xii) un residuo de arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, glutamina, histidina, o lisina en la posición 129; o (xiii) un residuo de arginina, ácido glutámico,, histidina, lisina, o tirosina en la posición 134; y combinaciones de los mismos. 5. El p'olipéptido. aislado de conformidad con la reivindicación 4', en donde el residuo en la posición 98. es arginina y el residuo en la posición 171 es prolina. 6. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, pero en donde la por lo menos una sustitución de aminoácidos de la reivindicación 4(a) (i)-(xi) y 4(b) (i)- (xiii) no se modifica adicionalmente . 7. Un polipéptido aislado, ¦ caracterizado .porque •comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 que tiene por lo menos una sustitución de aminoácidos que es: (a) un residuo de glutamina, lisina o isoleucina en la posición 19; (b) un residuo de histidina, leucina, o fenilalanina en la posición 20; (c) un residuo de isoleucina, fenilalanina, tirosina, o va-lina en la posición 21; (d) un residuo de isoleucina, fenilalanina, o valina en la posición 22; (e) un residuo de alanina o arginina en la posición 150; (f) un residuo de alanina o valina en la, posición 151; (g) un residuo de histidina, leucina, fenilalanina, .o valina en la posición 152; (h) un residuo de alanina, ácido aspártico, cisteina, o prolina en la posición 170; (i) un residuo de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, lisina, serina, treonina, triptófano, o tirosina en la posición 17.1; (j) un residuo de leucina en la posición 172; o (k) un residuo de arginina o ácido glutámico en la posición 173; y combinaciones de los mismos. 8. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el residuo en la posición 171 es prolina. 9. El. polipéptido aislado, de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque él polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85 por ciento idéntica a la¦ secuencia . de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, pero en donde la por lo menos una sustitución de aminoácidos de la reivindicación 7(a)-(k) no se modifica adicion'almente . 10. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 que tiene por lo menos una sustitución de aminoácidos que es: (a) un residuo de arginina, ácido glutámico, o lisina en la posición 26; (b) un. residuo de arginina, ácido glutámico, glutamina, lisina, o treonina en la posición 45; . (c) un residuo de treonina en la posición 52; (d) un residuo de ácido glutámico, glicina, o de serina en la posición 58; (e) un residuo de alanina, arginina, ácido glutámico, o lisina en la posición 60; (f) un residuo de alanina, arginina, o histidina en . la posición 78; (g) un residuo de alanina- en la posición 88; (h) un residuo de arginina, ácido glutámico, glutamina, lisina, o treonina en la posición 98; (i) un residuo de arginina, ácido aspártico, cisteina, o ácido glutámico en la posición 99; (j) un residuo de lisina o treonina en la posición 111; (k) un residuo de arginina, asparagina, ácido aspártico, , ácido glutámico, . glutamina, histidina., o lisina en la posición 129; o (1) un residuo de . arginina, ácido glutámico, histidina, lisina,' o tirosina en la posición 134; y combinaciones de los mismos. 11. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el residuo en la posición 98 es arginina. 12. El' polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85 por ciento idéntica a la secuencia de1 aminoácidos de SEQ ID NO: 4, pero en donde la por lo menos una sustitución de aminoácidos de la reivindicación 10 (a) -(1) , no se .modifica adicionalmente . 13. El. polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, 7 o 10, caracterizado porque además comprende por lo menos una sustitución de aminoácidos que es: (a) un residuo de fenilalanina , prolina, alanina, serina o glicina en la posición 179; (b) un residuo de ácido glutámico, glicina, prolina, o serina en la posición 180; o (c) un residuo de lisina, ' glicina, treonina, alanina, leucina, o prolina en la posición 181. 14. El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, 7 o 10, caracterizado porque además comprende 1 a 10 residuos de aminoácido fusionados al C-terminal del polipéptido. • 15. El, polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el 1 a 10 residuos de aminoácido se selecciona del grupo que consiste de glicina, prolina y combinaciones de los mismos. 16. El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, 7 o 10, caracterizado porque el polipéptido comprende: (a) un truncamiento, amino-terminal de no más de 8 residuos de aminoácido, en donde . el polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en la sangre en un mamífero; (b) un truncamiento carboxilo-terminal de no más de 12 residuos de aminoácido, en donde el polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en la sangre en un mamífero; o (c) un truncamiento amino-terminal de no más de 8 residuos de aminoácido y un truncamiento carboxilo-terminal de no más de 12 residuos de aminoácido, en donde el polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en la sangre en un mamífero. 17. El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, 7 o 10, caracterizado porque el polipéptido se enlaza covalentemente a uno o más polímeros. 18. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polímero es PEG. 19. Un polipéptido de fusión, caracterizado porque comprende el polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, 7 o 10 fusionado a una secuencia' de aminoácidos hetérologa. 20. El polipéptido de fusión de conformidad con la 19, caracterizado porque, el polipéptido se fusiona a' la secuencia de aminoácidos hetérologa por la vía de una ligadura. 21. El polipéptido de fusión de confo'rmidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la ligadura comprende GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23). 22. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado -porque las secuencia de aminoácidos hetérologa es un dominio constante IgG o fragmento del mismo. '23. El polipéptido de fusión de conformidad .con la reivindicación 22, caracterizado porque el dominio constante IgG comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. 24. Un multímero, caracterizado porque comprende dos o. más copias del polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 23. 25. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de- las reivindicaciones 1, 4, 7 o 10 y un agente de formulación farmacéuticamente aceptable. 26. Un método para tratar un trastorno metabólico, caracterizado porque comprende administrar a ' un paciente humano en necesidad del mismo la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación ' 2.5. 27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el trastorno metabólico es diabetes. 28. El método de conformidad cón la reivindicación 26,' caracterizado porque el trastorno metabólico es obesidad. 29. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, 7 o 10. 30. Un vector, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 29. 31. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 29. 32. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende la secuencia- de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, en donde el polipéptido comprende: (a) un truncamiento amino-terminal de no más de 8 residuos de aminoácido, y en . donde el polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en la sangre en un mamífero; (b) un* truncamiento carboxilo-terminal de no más de 12 residuos de aminoácido, y en donde el polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en • la sangre en un mamífero; o (c) un truncamiento, amino-terminal de no más de 8 residuos de aminoácido y un truncamiento carboxilo-terminal de no más de 12 residuos de aminoácido, y en donde el polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en la sangre en un mamífero. 33. Una proteína de. fusión aislada, caracterizada porque comprende: (a) un dominio constante IgG; (b) una secuencia de ligadura fusionada al dominio constante IgG; y (c) un mutante FGF21 fusionado a la secuencia de ligadura y que- comprende la secuencia .de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, en donde el residuo de arginina . se ha sustituido por el residuo de leucina en la posición 98 y un residuo de glicina se ha sustituido por el residuo de prolina en la posición 171. 34. La proteína- de fusión aislada de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la secuencia de ligadura comprende GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO:23). 35. La proteína de fusión aislada de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque el domino constante IgG ' comprende . SEQ ID NO: 13. 36. La proteína de fusión aislada de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la secuencia de ligadura comprende GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23) y el domino constante IgG comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. 3-7. La proteína de fusión aislada de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el N-terminal de la ligadura se fusiona al C-terminal del domino constante IgG y el N-terminal del mutante FGF21 se fusiona al C-terminal de la ligadura. ¦38. Un multímero, caracterizado porque comprende dos o más de las proteínas de fusión de conformidad con la reivindicación 33. 39. La proteína de fusión aislada de conformidad-con la reivindicación 33, caracterizada porque el mutante FGF21 comprende además por lo menos ' una sustitución de aminoácidos que es: (a) una fenilalanina , prolina, alanina, serina p glicina en la posición 179; (b) un ácido' glutámico, glicina, prolina, o serina en la posición 180; o (c) una lisina, glicina, treonina, alanina, leucina, o prolina en la posición 181.. 40. La proteina de fusión aislada de conformidad con. la reivindicación 33, caracterizada porque el mutante FGF21 comprende además 1 a 10 residuos de aminoácido fusionados a la C-terminal del mutante FGF21. 41. La proteina de fusión aislada de. conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque el 1 a 10 residuos ' de aminoácido se seleccionan del grupo que consiste de glicina, prolina y combinaciones de los mismos. 42. La proteina de fusión aislada de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque el mutante FGF21 comprende: (a) un truncamiento amino-terminal de no más de 8 residuos de aminoácido, en donde el polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en la sangre en un mamífero; (b) un truncamiento carboxilo-terminal de no más de 12 residuos de aminoácido, en donde el . polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en la sangre en un mamífero; o (c) un truncamiento amino-terminal de no más de 8 residuos de aminoácido y un truncamiento carboxilo-terminal de no más de 12 residuos de aminoácido, en' donde el polipéptido es capaz de disminuir la glucosa en la sangre en un mamífero. 43. La proteína de fusión aislada de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque el mutante FGF21 comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, pero en donde la arginina en la posición 98 y la glicina en la posición 171 no se modifican adicionalmente . 44. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la proteína de fusión aislada- de conformidad con la reivindicación 33 o reivindicación 38 y un agente de formulación farmacéuticamente aceptable. 45. Un método para tratar un trastorno metabólico, caracterizado porque comprende administrar a un paciente humano en necesidad del mismo la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 44. 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado .porque el trastorno metabólico' es diabetes. 47. El método dé conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el trastorno metabólico es obesidad. 48. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque codifica la proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 33. 49. Un vector, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 48. 50. Una . célula hospedera, caracterizada porque comprende la molécula' de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 48. 51. Un polipéptido, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. NO. 4, que además comprende las mutaciones L98R y P171G. 52. Un polipéptido, caracterizado porque comprende el polipéptido de conformidad con la reivindicación 51, enlazado a una secuencia heteróloga. 53. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la secuencia heteróloga es una secuencia Fe-. 54. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la secuencia Fe comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. 55. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 54., caracterizado . porque el polipéptido se une a la secuencia heteróloga por una ligadura. 56. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la ligadura es GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO:23). ' 57. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porqu'e la ligadura es GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N0:31). 58. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el polipéptido de fusión se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 37. .59. Un multimero, caracterizado porque comprende dos o más copias del polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 58. 60. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el polipéptido de fusión de. conformidad con la reivindicación 58 y un agente de formulación farmacéuticamente aceptable.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9493530B2 (en) 2009-05-05 2016-11-15 Amgen Inc. FGF21 mutants comprising a mutation at position 98, 171 and/or 180
US11072640B2 (en) 2008-06-04 2021-07-27 Amgen Inc. Methods of treating non-alcoholic steatohepatitis using FGF21 mutants

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140012199A (ko) 2007-03-30 2014-01-29 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도
EP2358749B1 (en) * 2008-10-10 2018-07-18 Amgen, Inc Fgf21 mutants and uses thereof
WO2010065439A1 (en) * 2008-12-05 2010-06-10 Eli Lilly And Company Variants of fibroblast growth factor 21
DK3248610T3 (da) 2009-05-05 2024-01-15 Amgen Inc Fgf21-mutanter og anvendelser deraf
EP2443145A1 (en) 2009-06-17 2012-04-25 Amgen, Inc Chimeric fgf19 polypeptides and uses thereof
EP2493495A4 (en) * 2009-07-10 2013-08-21 Univ Northwestern HERZSCHÜTZENDE ROLE OF LIVER CELLS AND SEKRETORIC FACTORS FROM LIVER CELLS IN MYOCARDIAN EMERGENCE
CN101993485B (zh) * 2009-08-20 2013-04-17 重庆富进生物医药有限公司 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途
AU2010326024A1 (en) 2009-12-02 2012-07-05 Amgen Inc. Binding proteins that bind to human FGFR1c, human beta-Klotho and both human FGFR1c and human beta-Klotho
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
WO2011107494A1 (de) 2010-03-03 2011-09-09 Sanofi Neue aromatische glykosidderivate, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und deren verwendung
EP2558497A2 (en) 2010-04-15 2013-02-20 Amgen Inc. Human fgf receptor and beta-klotho binding proteins
CA2796459C (en) 2010-04-16 2016-05-24 Salk Institute For Biological Studies Methods for treating metabolic disorders using fgf-1
DE102010015123A1 (de) 2010-04-16 2011-10-20 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Benzylamidische Diphenylazetidinone, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und deren Verwendung
US8530413B2 (en) 2010-06-21 2013-09-10 Sanofi Heterocyclically substituted methoxyphenyl derivatives with an oxo group, processes for preparation thereof and use thereof as medicaments
TW201215387A (en) 2010-07-05 2012-04-16 Sanofi Aventis Spirocyclically substituted 1,3-propane dioxide derivatives, processes for preparation thereof and use thereof as a medicament
TW201221505A (en) 2010-07-05 2012-06-01 Sanofi Sa Aryloxyalkylene-substituted hydroxyphenylhexynoic acids, process for preparation thereof and use thereof as a medicament
TW201215388A (en) 2010-07-05 2012-04-16 Sanofi Sa (2-aryloxyacetylamino)phenylpropionic acid derivatives, processes for preparation thereof and use thereof as medicaments
MX2013002208A (es) 2010-08-23 2013-05-30 Amgen Inc Derivados de sulfonilpiperazina que interactuan con la proteina reguladora de glucocinasa para el tratamiento de diabetes.
SG190082A1 (en) * 2010-11-05 2013-06-28 Covx Technologies Ireland Ltd Anti-diabetic compounds
CN102464712A (zh) * 2010-11-11 2012-05-23 重庆富进生物医药有限公司 缺失型人成纤维细胞生长因子21变异体及其偶联物
EP2694491A1 (en) 2011-04-05 2014-02-12 Amgen Inc. Benzodioxepine and benzodioxine compounds that interact with glucokinase regulatory protein for the treatment of diabetes
WO2012151349A1 (en) 2011-05-03 2012-11-08 Liu Shu Q Neuroprotection by hepatic cells and hepatocyte secretory factors
KR102077721B1 (ko) 2011-07-01 2020-02-14 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. 대사성 장애 및 질환의 치료를 위한 조성물, 용도 및 방법
AU2012301769B2 (en) * 2011-08-31 2016-05-19 Amgen Inc. FGF21 for use in treating type 1 diabetes
EP2567959B1 (en) 2011-09-12 2014-04-16 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-styryl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
WO2013037390A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-styryl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
JO3476B1 (ar) * 2011-09-26 2020-07-05 Novartis Ag بروتينات مندمجة لعلاج الاضطرابات الايضية
EP2760862B1 (en) 2011-09-27 2015-10-21 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-alkyl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
AR087973A1 (es) 2011-10-04 2014-04-30 Lilly Co Eli Variantes del factor 21 del crecimiento de fibroblastos
CN102558358A (zh) * 2011-12-30 2012-07-11 张海涛 人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其突变体的制备与应用
WO2013123444A1 (en) 2012-02-17 2013-08-22 Amgen Inc. Sulfonyl compounds that interact with glucokinase regulatory protein
WO2013131091A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 New York University Chimeric fgf21 proteins with enhanced binding affinity for beta-klotho for the treatment of type ii diabetes, obesity and related metabolic disorders
WO2013173382A1 (en) 2012-05-15 2013-11-21 Amgen Inc. Benzothiophene sulfonamides and other compounds that interact with glucokinase regulatory protein
CA3062003C (en) 2012-05-17 2022-01-11 Extend Biosciences, Inc. Vitamin d as a targeting group for therapeutic peptides
US9474785B2 (en) 2012-06-07 2016-10-25 New York University Chimeric fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use
US9657075B2 (en) 2012-06-07 2017-05-23 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
US9464126B2 (en) 2012-06-07 2016-10-11 New York University Chimeric fibroblast growth factor 21 proteins and methods of use
TWI513705B (zh) * 2012-06-11 2015-12-21 Lilly Co Eli 纖維母細胞生長因子２１蛋白質
AU2013274639A1 (en) * 2012-06-11 2014-11-06 Eli Lilly And Company Fibroblast growth factor 21 variants
AR092076A1 (es) * 2012-08-22 2015-03-18 Lilly Co Eli Proteinas homodimericas
WO2014085365A2 (en) * 2012-11-28 2014-06-05 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
US9290557B2 (en) 2012-11-28 2016-03-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides
US9273107B2 (en) 2012-12-27 2016-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
CN108888757A (zh) 2012-12-27 2018-11-27 恩格姆生物制药公司 用于调节胆汁酸体内稳态及治疗胆汁酸紊乱和疾病的方法
US9550820B2 (en) 2013-02-22 2017-01-24 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23/fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use
WO2014149699A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Eli Lilly And Company Bifunctional protein
CN103191415A (zh) * 2013-04-03 2013-07-10 哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司 成纤维细胞生长因子-21成熟肽在制备治疗高血压的药物中的应用
US20160235810A1 (en) 2013-10-18 2016-08-18 Novartis Ag Methods of treating diabetes and related disorders
WO2015061331A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 Salk Institute For Biological Studies Chimeric fibroblast growth factor (fgf) 2/fgf1 peptides and methods of use
CN105828833A (zh) 2013-10-21 2016-08-03 萨克生物研究学院 突变的成纤维细胞生长因子（fgf）1及使用方法
WO2015065897A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Cancer models and associated methods
RU2701434C2 (ru) 2014-01-24 2019-09-26 Нгм Биофармасьютикалс, Инк. Связывающие белки и способы их применения
JP6712230B2 (ja) 2014-03-11 2020-06-17 ノバルティス アーゲー リポジストロフィーおよびインスリン産生の欠損またはインスリンシグナル伝達の欠損と関連する代謝性障害を処置する方法
WO2015148708A1 (en) 2014-03-25 2015-10-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fgf21 receptor agonists and uses thereof
US10398758B2 (en) 2014-05-28 2019-09-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants of FGF19 polypeptides and uses thereof for the treatment of hyperglycemic conditions
WO2015195509A2 (en) 2014-06-16 2015-12-23 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
US9616109B2 (en) 2014-10-22 2017-04-11 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin D conjugates
EP3220961B1 (en) 2014-10-22 2023-07-05 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
EP3209681A4 (en) 2014-10-23 2018-10-31 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising peptide variants and methods of use thereof
KR20240024362A (ko) 2014-10-24 2024-02-23 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 변형된 fgf-21 폴리펩티드 및 그의 용도
WO2016073855A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders
PT3236991T (pt) * 2014-12-23 2019-09-06 Novo Nordisk As Derivados de fgf21 e usos dos mesmos
KR20160088656A (ko) 2015-01-16 2016-07-26 주식회사유한양행 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
WO2016187558A2 (en) 2015-05-20 2016-11-24 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Method to improve neurologic outcomes in temperature managed patients
WO2017019957A2 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Binding proteins and methods of use thereof
KR102668200B1 (ko) * 2015-10-28 2024-05-23 주식회사유한양행 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
KR102670157B1 (ko) 2015-10-28 2024-05-29 주식회사유한양행 이중 작용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
JP2018535964A (ja) 2015-10-30 2018-12-06 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ 線維芽細胞増殖因子（ｆｇｆ）１アナログによるステロイド誘導性高血糖の処置
US10744185B2 (en) 2015-11-09 2020-08-18 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of using variants of FGF19 polypeptides for the treatment of pruritus
TW201731867A (zh) * 2015-12-02 2017-09-16 賽諾菲公司 Ｆｇｆ２１變異體
WO2017116207A1 (ko) * 2015-12-31 2017-07-06 한미약품 주식회사 Fgf21 아날로그, fgf21 결합체, 및 이의 용도
EP3442997A2 (en) 2016-04-15 2019-02-20 Indiana University Research & Technology Corporation Fgf21 c-terminal peptide optimization
TWI781948B (zh) 2016-08-01 2022-11-01 大陸商和其瑞醫藥（南京）有限公司 Ｍｇ５３突變體及其製備方法和用途
CN106317226B (zh) 2016-08-19 2017-09-05 安源医药科技（上海）有限公司 用于构建融合蛋白的连接肽
EP3502143A4 (en) 2016-08-19 2020-07-15 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. BINDING PEPTIDE FOR THE CONSTRUCTION OF A FUSION PROTEIN
CN106279437B (zh) 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
WO2018039557A1 (en) 2016-08-26 2018-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating fibroblast growth factor 19-mediated cancers and tumors
CA3042512A1 (en) 2016-11-10 2018-05-17 Yuhan Corporation Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis, hepatic fibrosis, and hepatic cirrhosis comprising fusion proteins
RU2019122785A (ru) 2016-12-22 2021-01-22 Санофи Комбинации соединения на основе fgf21/агониста glp-1r с оптимизированным соотношением активности
CN108619490A (zh) * 2017-03-22 2018-10-09 天士力医药集团股份有限公司 一种长效化突变的人源成纤维生长因子的新用途
MX2019012331A (es) * 2017-04-21 2020-01-23 Yuhan Corp Metodo para producir proteinas de doble funcion y sus derivados.
CN107056925B (zh) * 2017-04-28 2022-01-14 中国科学院合肥物质科学研究院 人fgf21突变体、其制备方法及用途
US11365228B2 (en) 2017-07-06 2022-06-21 Yale University Mutant FGF21 polypeptide compositions
SG11202001379WA (en) 2017-09-08 2020-03-30 Bristol Myers Squibb Co Modified fibroblast growth factor 21 (fgf-21) for use in methods for treating nonalcoholic steatohepatitis (nash)
CN109836504B (zh) * 2017-11-24 2022-08-02 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的多结构域活性蛋白
CN111518770B (zh) 2017-12-19 2023-01-06 北京吉源生物科技有限公司 一种表达glp1和fgf21的干细胞及其用途
CN116098989A (zh) 2018-02-08 2023-05-12 广东东阳光药业有限公司 Fgf21变体、融合蛋白及其应用
CN114903978A (zh) 2018-07-03 2022-08-16 百时美施贵宝公司 Fgf-21配制品
CN111662373B (zh) * 2019-03-05 2024-05-14 广东东阳光药业股份有限公司 一种多肽分子及其应用
US11427623B1 (en) 2019-05-28 2022-08-30 89Bio Ltd. Methods of treatment using mutant FGF-21 peptide conjugates
US11542309B2 (en) 2019-07-31 2023-01-03 Salk Institute For Biological Studies Fibroblast growth factor 1 (FGF1) mutant proteins that selectively activate FGFR1B to reduce blood glucose
TW202140074A (zh) 2020-01-08 2021-11-01 美商必治妥美雅史谷比公司 Fgf-21結合物調配物
JP7392491B2 (ja) * 2020-01-21 2023-12-06 トヨタ自動車株式会社 電源システム
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation
WO2022032187A1 (en) 2020-08-07 2022-02-10 Bristol-Myers Squibb Company Fgf21 combined with ccr2/5 antagonists for the treatment of fibrosis
WO2022115597A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating liver diseases
GB2625224A (en) 2021-09-08 2024-06-12 Leto Laboratories Co Ltd FGF21 mutant protein and use thereof
WO2023064808A1 (en) 2021-10-13 2023-04-20 Akero Therapeutics, Inc. Pharmaceutical compositions of efruxifermin
CN113980147B (zh) * 2021-11-26 2023-07-28 中国药科大学 一种聚多肽与fgf21融合蛋白突变体及其应用
WO2023173021A2 (en) * 2022-03-11 2023-09-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions for the treatment of alcohol toxicity
WO2024059507A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 Akero Therapeutics, Inc. Fgf21 mutant polypeptides

Family Cites Families (178)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4436366A (en) 1981-02-17 1984-03-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company End capping an optical fiber
AR230173A1 (es) 1981-06-29 1984-03-01 American Cyanamid Co Instrumento para ligaciones quirurgicas
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0133968B1 (en) 1983-07-29 1989-06-07 Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha Solid state overcurrent detector
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
CA1310924C (en) 1986-04-24 1992-12-01 Francis P. Mccormick Infective drug delivery system
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4970154A (en) 1987-10-09 1990-11-13 Baylor College Of Medicine Method for inserting foreign genes into cells using pulsed radiofrequency
DE3889853D1 (de) 1987-11-05 1994-07-07 Hybritech Inc Polysaccharidmodifizierte Immunglobuline mit reduziertem immunogenem Potential oder verbesserter Pharmakokinetik.
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5158881A (en) 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US5106627A (en) 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US5011472A (en) 1988-09-06 1991-04-30 Brown University Research Foundation Implantable delivery system for biological factors
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5288855A (en) * 1989-01-23 1994-02-22 Farmitalia Carlo Erba Extracellular form of the human fibroblast growth factor receptor
JP3039802B2 (ja) * 1989-07-06 2000-05-08 ザ リージェンツ オブザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 繊維芽細胞成長因子のための受容体
US5676954A (en) 1989-11-03 1997-10-14 Vanderbilt University Method of in vivo delivery of functioning foreign genes
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
EP0779362B2 (en) 1989-12-22 2012-06-13 Laboratoires Serono SA DNA constructs for endogenous gene activation and expression modification
WO1991010470A1 (en) 1990-01-08 1991-07-25 Brown University Research Foundation Devices and methods for enhanced delivery of active factors
AU633698B2 (en) 1990-01-12 1993-02-04 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5672510A (en) 1990-01-19 1997-09-30 Genetic Therapy, Inc. Retroviral vectors
EP1403285A1 (en) 1990-07-06 2004-03-31 Gencell S.A. Fibroblast growth factor receptors
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5217889A (en) 1990-10-19 1993-06-08 Roninson Igor B Methods and applications for efficient genetic suppressor elements
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5229501A (en) * 1991-01-11 1993-07-20 Chiron Corporation Expression and use of human fibroblast growth factor receptor
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
IL100219A0 (en) 1991-12-02 1992-09-06 Yeda Res & Dev Variable region within fibroblast growth factor receptors that confers ligand specificity
WO1993015722A1 (en) 1992-02-07 1993-08-19 Syntex (Usa) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous microparticles
US5234784A (en) 1992-04-01 1993-08-10 Eastman Kodak Company Method of making a projection viewable transparency comprising an electrostatographic toner image
US5364791A (en) 1992-05-14 1994-11-15 Elisabetta Vegeto Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations
CA2136439A1 (en) * 1992-06-18 1994-01-06 Michael Philip Nova Process for detection of neoplastic disease
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
US5474914A (en) 1992-07-29 1995-12-12 Chiron Corporation Method of producing secreted CMV glycoprotein H
US5489743A (en) 1993-01-19 1996-02-06 Amgen Inc. Transgenic animal models for thrombocytopenia
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
WO1994026122A1 (en) 1993-05-07 1994-11-24 Sterling Winthrop Inc. Lactose-hydrolyzed milk and milk products with improved taste and suppressed sweetness
JPH08509870A (ja) 1993-05-26 1996-10-22 オンタリオ キャンサー インスティテュート 特定のｃｄ４５イソ型タンパク質の発現を遮断するトランスジェニック哺乳動物
US6664107B1 (en) 1993-05-26 2003-12-16 Ontario Cancer Institute, University Health Network CD45 disrupted nucleic acid
DE705334T1 (de) 1993-06-14 1999-12-30 Basf Ag Strenge kontrolle der genexpression in eukaryotischen zellen durch auf tetrazyklin ansprechende promotoren
US5589362A (en) 1993-06-14 1996-12-31 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline regulated transcriptional modulators with altered DNA binding specificities
US5654168A (en) 1994-07-01 1997-08-05 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline-inducible transcriptional activator and tetracycline-regulated transcription units
EP1179350A3 (en) 1993-08-12 2003-01-02 Cytotherapeutics, Inc. Encapsulated cell system for implantation into the human CNS
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5484720A (en) 1994-09-08 1996-01-16 Genentech, Inc. Methods for calcium phosphate transfection
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JPH11506319A (ja) 1995-05-26 1999-06-08 ゼネカ・リミテッド エクジソンレセプターを含む遺伝子スイッチ
EP0832269A1 (en) 1995-06-07 1998-04-01 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
WO1996041865A1 (en) 1995-06-07 1996-12-27 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Rapamcycin-based regulation of biological events
US5849303A (en) 1995-06-07 1998-12-15 American Home Products Corporation Recombinant feline Immunodeficiency virus subunit vaccines employing baculoviral-expressed envelope glycoproteins derived from isolate NCSU-1 and their use against feline immunodeficiency virus infection
ATE465149T1 (de) 1996-02-28 2010-05-15 Ariad Pharma Inc Synthetische rapamycinderivate als multimerisierende wirkstoffe für chimere proteine mit von immunophilin abgeleiteten domänen
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US5679559A (en) 1996-07-03 1997-10-21 University Of Utah Research Foundation Cationic polymer and lipoprotein-containing system for gene delivery
US6214795B1 (en) * 1996-11-12 2001-04-10 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Peptide compounds useful for modulating FGF receptor activity
CN1167795C (zh) 1996-12-26 2004-09-22 协和发酵工业株式会社 肽、dna及抗体
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
DE69839571D1 (de) 1997-11-25 2008-07-10 Genentech Inc Fibroblasten-wachstumsfaktor-19
US6150098A (en) 1998-02-20 2000-11-21 Amgen Inc. Methods for identifying novel secreted mammalian polypeptides
ZA200007412B (en) 1998-05-15 2002-03-12 Imclone Systems Inc Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases.
NL1010174C1 (nl) 1998-09-24 2000-03-27 Busschers Metaalbedrijf Bv Inrichting en werkwijze voor het buigen van buisvormig en staafvormig materiaal.
US6548634B1 (en) 1998-09-30 2003-04-15 Chiron Corporation Synthetic peptides having FGF receptor affinity
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6369109B1 (en) 1998-10-28 2002-04-09 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts Betulinic acid and derivatives thereof useful for the treatment of neuroectodermal tumor
WO2000027885A1 (fr) 1998-11-05 2000-05-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Nouveau popypeptide chimerique
US6656728B1 (en) 1999-02-08 2003-12-02 Chiron Corporation Fibroblast growth factor receptor-immunoglobulin fusion
JP2002539176A (ja) 1999-03-15 2002-11-19 カイロン コーポレイション 眼の疾患を処置または予防するための組換え遺伝子送達ベクターの使用
CA2311201A1 (en) 1999-08-05 2001-02-05 Genset S.A. Ests and encoded human proteins
US7459540B1 (en) * 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
US7408047B1 (en) 1999-09-07 2008-08-05 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
AU7368100A (en) 1999-09-10 2001-04-10 Curagen Corporation Fibroblast growth factor polypeptide and nucleic acids encoding same
WO2001032678A1 (en) 1999-11-05 2001-05-10 Smithkline Beecham Corporation sbgFGF-19a
US6254671B1 (en) 1999-11-15 2001-07-03 Engelhard Corporation Very green-shade yellow metallized disazo pigment
US6716626B1 (en) 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
AU1922101A (en) 1999-11-18 2001-05-30 Chiron Corporation Human fgf-21 gene and gene expression products
AU1628101A (en) * 1999-11-22 2001-06-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Jaffa, a novel fibroblast growth factor family member and uses therefor
US7108984B2 (en) 2000-01-12 2006-09-19 Mount Sinai School Of Medicine Methods of identifying modulators of the FGF receptor
US20020081663A1 (en) 2000-01-05 2002-06-27 Conklin Darrell C. Novel FGF homolog ZFGF11
WO2001049849A1 (en) 2000-01-05 2001-07-12 Zymogenetics, Inc. Novel fgf homolog zfgf11
US20020001825A1 (en) 2000-03-31 2002-01-03 Nobuyuki Itoh Fibroblast growth factor-like molecules and uses thereof
JP2002112772A (ja) 2000-07-10 2002-04-16 Takeda Chem Ind Ltd 新規ポリペプチドおよびそのｄｎａ
IL139380A0 (en) 2000-10-31 2001-11-25 Prochon Biotech Ltd Active variants of fibroblast growth factor
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20060223114A1 (en) 2001-04-26 2006-10-05 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
US20040018499A1 (en) 2001-06-06 2004-01-29 Lal Preeti G Extracellular messengers
JP2005500034A (ja) 2001-06-20 2005-01-06 プロション バイオテク リミテッド 受容体型タンパク質チロシンキナーゼ活性化を遮断する抗体、そのスクリーニング方法、及びその使用
MXPA04000231A (es) 2001-07-11 2004-05-04 Maxygen Holdings Ltd Conjugados del factor de estimulacion de colonias de granulocitos.
US20040259780A1 (en) 2001-07-30 2004-12-23 Glasebrook Andrew Lawrence Method for treating diabetes and obesity
US20050187150A1 (en) 2001-10-31 2005-08-25 New York University Structure-based design and synthesis of FGF inhibitors and FGF modulator compounds
AU2003201810A1 (en) 2002-01-15 2003-07-30 Eli Lilly And Company Method for reducing morbidity and mortality in critically ill patients
CN100531796C (zh) 2002-01-31 2009-08-26 马普科技促进协会 Fgfr激动剂
EP1332761A1 (en) 2002-01-31 2003-08-06 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Agonists of fibroblast growth factor receptors (FGFR)
IL149562A0 (en) 2002-05-09 2002-11-10 Prochon Ltd Fgf variants and methods for use thereof
JP2003334088A (ja) 2002-05-22 2003-11-25 Pharma Design Inc ヒト由来の新規Ｋｌｏｔｈｏ様タンパク質及びその遺伝子
AU2003265057A1 (en) 2002-09-04 2004-03-29 Abtech Anti-idiotypic antibodies as vegf or fgf agonists for bone therapy
JP2006515747A (ja) 2002-11-01 2006-06-08 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫関連疾患の治療のための組成物と方法
JP2007524566A (ja) 2002-12-20 2007-08-30 エンカム ファーマシューティカルズ アクティーゼルスカブ レセプターとリガンドの間の相互作用の調節の方法
TWI300430B (en) 2003-01-10 2008-09-01 Ritek Corp Optical recording medium dye and optical recording medium using thereof
WO2004083381A2 (en) 2003-03-13 2004-09-30 Indiana University Advanced Research & Technology Institute Fibroblast growth factor receptor-1 polynucleotides, polypeptides, and mutants
JP2006240990A (ja) 2003-05-15 2006-09-14 Kirin Brewery Co Ltd ｋｌｏｔｈｏタンパク質および抗ｋｌｏｔｈｏタンパク質抗体ならびにそれらの用途
AU2004251145C1 (en) 2003-06-12 2011-04-14 Eli Lilly And Company GLP-1 analog fusion proteins
SI1641483T1 (sl) 2003-06-12 2008-08-31 Lilly Co Eli Fuzijski proteini
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
JP4049723B2 (ja) 2003-09-04 2008-02-20 沖電気工業株式会社 窒化物半導体素子の製造方法及び窒化物半導体素子の製造装置
PT1680140E (pt) 2003-10-16 2011-05-31 Imclone Llc Inibidores do receptor-1 do factor de crescimento de fibroblastos e m?todos de tratamento destes
JP4477013B2 (ja) 2003-12-10 2010-06-09 イーライ リリー アンド カンパニー 線維芽細胞成長因子２１の突然変異タンパク質
US20070248605A1 (en) 2003-12-19 2007-10-25 Five Prime Therapetutics, Inc. Fibroblast Growth Factor Receptors 1,2,3, and 4 as Targets for Therapeutic Intervention
WO2005072769A1 (en) 2004-01-26 2005-08-11 Eli Lilly And Company Use of fgf-21 and thiazolidinedione for treating type 2 diabetes
WO2005091944A2 (en) 2004-03-17 2005-10-06 Eli Lilly And Company Glycol linked fgf-21 compounds
JP4505631B2 (ja) 2004-03-31 2010-07-21 独立行政法人産業技術総合研究所 ヘパラン硫酸糖鎖を付加したヘパリン結合性タンパク質、その製造方法及びそれを含有する医薬組成物
DE602005016917D1 (de) 2004-05-13 2009-11-12 Lilly Co Eli Fgf-21-fusionsproteine
WO2006028714A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
PT1789442E (pt) 2004-09-02 2009-11-11 Lilly Co Eli Muteínas do factor de crescimento de fibroblasto 21
US8080523B2 (en) 2004-10-07 2011-12-20 The Regents Of The University Of California Analogs of ShK toxin and their uses in selective inhibition of Kv1.3 potassium channels
EP1814573B1 (en) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
US7655627B2 (en) 2004-12-14 2010-02-02 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2006078463A2 (en) 2005-01-21 2006-07-27 Eli Lilly And Company Method for treating cardiovascular disease
US20060193299A1 (en) * 2005-02-25 2006-08-31 Cicso Technology, Inc., A California Corporation Location-based enhancements for wireless intrusion detection
JP2006246823A (ja) 2005-03-11 2006-09-21 Kyoto Univ 造血因子としてのＦｇｆ２１の使用
WO2006130527A2 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Novartis Ag Mutations and polymorphisms of fibroblast growth factor receptor 1
NZ565511A (en) 2005-07-22 2011-03-31 Five Prime Therapeutics Inc Compositions and methods of treating disease with FGFR fusion proteins
ZA200800970B (en) 2005-08-15 2009-10-28 Genentech Inc Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
US7395962B2 (en) 2005-10-28 2008-07-08 United Parcel Service Of America, Inc. Pick up notice and method of using same
US8043833B2 (en) 2005-10-31 2011-10-25 Novo Nordisk A/S Expression of soluble therapeutic proteins
WO2007056789A1 (en) 2005-11-16 2007-05-24 Dier Corporation As Trustee For The Reid Family Superannuation Trust New frame assemblies for security screens
EP1996216A2 (en) 2006-02-28 2008-12-03 Trustees Of Boston University Methods to identify factors associated with muscle growth and uses thereof
WO2007110079A2 (en) * 2006-03-29 2007-10-04 Enkam Pharmaceuticals A/S Targeted delivery of fgfr ligands into the brain
EP2046384A4 (en) 2006-06-15 2009-12-02 Fibron Ltd ANTIBODIES BLOCKING FIBROBLAST GROWTH FACTOR RECEPTOR ACTIVATION AND METHODS OF USING THE SAME
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
WO2008057683A2 (en) 2006-10-03 2008-05-15 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
WO2008066498A1 (en) 2006-12-01 2008-06-05 Agency For Science, Technology And Research Cancer-related protein kinases
KR20140012199A (ko) 2007-03-30 2014-01-29 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도
CA2682096A1 (en) 2007-04-02 2009-01-15 Genentech, Inc. Klotho beta
JP5187837B2 (ja) 2007-04-06 2013-04-24 独立行政法人産業技術総合研究所 補助因子による受容体の活性化方法並びにリガンド活性の利用方法
US7537903B2 (en) 2007-04-23 2009-05-26 Board Of Regents, The University Of Texas System FGF21 upregulates expression of GLUT-1 in a βklotho-dependent manner
WO2008135993A1 (en) 2007-05-08 2008-11-13 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Klotho protein and related compounds for the treatment and diagnosis of cancer
KR20100017169A (ko) 2007-05-22 2010-02-16 노파르티스 아게 Ｆｇｆ２１-관련 장애의 치료, 진단 및 검출 방법
WO2008149521A1 (ja) 2007-05-29 2008-12-11 Immuno-Biological Labolatories Co., Ltd 癌治療剤及び癌の治療方法
JP2010531135A (ja) 2007-06-04 2010-09-24 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを使用したｏ結合型グリコシル化
EP2185178B1 (en) 2007-08-03 2017-08-23 Eli Lilly And Company Use of an fgf-21 compound and a glp-1 compound for the treatment of obesity
GB2464062A (en) 2007-08-08 2010-04-07 Foster Miller Inc Watercraft drogue system
US8426396B2 (en) 2008-01-08 2013-04-23 Shriners Hospitals For Children Treatment for achondroplasia
TW200936156A (en) 2008-01-28 2009-09-01 Novartis Ag Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides
US20110015345A1 (en) 2008-03-19 2011-01-20 Ambrx, Inc. Modified FGF-23 Polypeptides and Their Uses
JOP20190083A1 (ar) * 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
WO2010006214A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 Ambrx, Inc. Fgf-21 neutralizing antibodies and their uses
CA2732449A1 (en) 2008-08-04 2010-02-11 Five Prime Therapeutics, Inc. Fgfr extracellular domain acidic region muteins
EP2358749B1 (en) * 2008-10-10 2018-07-18 Amgen, Inc Fgf21 mutants and uses thereof
AU2010246038A1 (en) * 2009-05-05 2011-12-01 Amgen Inc. FGF21 mutants and uses thereof
DK3248610T3 (da) 2009-05-05 2024-01-15 Amgen Inc Fgf21-mutanter og anvendelser deraf
EP2443145A1 (en) 2009-06-17 2012-04-25 Amgen, Inc Chimeric fgf19 polypeptides and uses thereof
CN102656266B (zh) 2009-10-15 2016-08-03 霍夫曼-拉罗奇有限公司 具有改变的受体特异性的嵌合成纤维细胞生长因子
AU2010326024A1 (en) 2009-12-02 2012-07-05 Amgen Inc. Binding proteins that bind to human FGFR1c, human beta-Klotho and both human FGFR1c and human beta-Klotho
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
EP2558497A2 (en) 2010-04-15 2013-02-20 Amgen Inc. Human fgf receptor and beta-klotho binding proteins
US9023791B2 (en) 2010-11-19 2015-05-05 Novartis Ag Fibroblast growth factor 21 mutations
KR102077721B1 (ko) 2011-07-01 2020-02-14 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. 대사성 장애 및 질환의 치료를 위한 조성물, 용도 및 방법
EP2548570A1 (en) 2011-07-19 2013-01-23 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
AU2012301769B2 (en) * 2011-08-31 2016-05-19 Amgen Inc. FGF21 for use in treating type 1 diabetes
CN108888757A (zh) 2012-12-27 2018-11-27 恩格姆生物制药公司 用于调节胆汁酸体内稳态及治疗胆汁酸紊乱和疾病的方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11072640B2 (en) 2008-06-04 2021-07-27 Amgen Inc. Methods of treating non-alcoholic steatohepatitis using FGF21 mutants
US11840558B2 (en) 2008-06-04 2023-12-12 Amgen Inc. Methods of treating non-alcoholic steatohepatitis using FGF21 mutants
US9493530B2 (en) 2009-05-05 2016-11-15 Amgen Inc. FGF21 mutants comprising a mutation at position 98, 171 and/or 180

Also Published As

Publication number Publication date
US20120003216A1 (en) 2012-01-05
CA2726589A1 (en) 2009-12-10
BRPI0911385B1 (pt) 2021-04-13
EA201270758A1 (ru) 2013-12-30
EA034847B1 (ru) 2020-03-27
JP7191076B2 (ja) 2022-12-16
KR101651697B1 (ko) 2016-08-29
EA201690946A1 (ru) 2017-05-31
US9273106B2 (en) 2016-03-01
JP2018082699A (ja) 2018-05-31
US20120087920A1 (en) 2012-04-12
KR20110025810A (ko) 2011-03-11
US20160168223A1 (en) 2016-06-16
PE20100253A1 (es) 2010-04-10
EA017690B1 (ru) 2013-02-28
AR072009A1 (es) 2010-07-28
JP2016128449A (ja) 2016-07-14
JP2019187417A (ja) 2019-10-31
EA024751B1 (ru) 2016-10-31
CL2010001346A1 (es) 2011-06-03
TW201219052A (en) 2012-05-16
US20240076333A1 (en) 2024-03-07
WO2009149171A2 (en) 2009-12-10
US8410051B2 (en) 2013-04-02
EA201001883A1 (ru) 2011-06-30
EP2296690A2 (en) 2011-03-23
EP2296690B1 (en) 2016-11-30
WO2009149171A4 (en) 2010-05-06
US11072640B2 (en) 2021-07-27
BRPI0911385B8 (pt) 2021-09-14
US8034770B2 (en) 2011-10-11
JP2021052780A (ja) 2021-04-08
JOP20190083A1 (ar) 2017-06-16
US20210317176A1 (en) 2021-10-14
CN102143758A (zh) 2011-08-03
KR20160046929A (ko) 2016-04-29
US11840558B2 (en) 2023-12-12
JP2011523561A (ja) 2011-08-18
CN102143758B (zh) 2015-11-25
US20120093815A1 (en) 2012-04-19
SG193860A1 (en) 2013-10-30
US8642546B2 (en) 2014-02-04
TWI403519B (zh) 2013-08-01
IL209395A0 (en) 2011-01-31
JP6960832B2 (ja) 2021-11-05
WO2009149171A3 (en) 2010-03-11
MX346396B (es) 2017-03-16
KR101787300B1 (ko) 2017-10-18
US8361963B2 (en) 2013-01-29
CO6341566A2 (es) 2011-11-21
US20140243503A1 (en) 2014-08-28
BR122020010972B1 (pt) 2021-05-18
EA024751B8 (ru) 2020-01-31
AU2009256232B2 (en) 2011-12-22
US20090305986A1 (en) 2009-12-10
AU2009256232A1 (en) 2009-12-10
US20190023757A1 (en) 2019-01-24
CA2726589C (en) 2017-06-13
CR11851A (es) 2011-05-13
NZ590050A (en) 2012-08-31
IL209395A (en) 2014-08-31
TWI526220B (zh) 2016-03-21
JP6810190B2 (ja) 2021-01-06
MY152721A (en) 2014-11-28
JP6250714B2 (ja) 2017-12-20
TW201010715A (en) 2010-03-16
US10011642B2 (en) 2018-07-03
BRPI0911385A2 (pt) 2019-03-26
MA33142B1 (fr) 2012-03-01

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