JP2002539176A - 眼の疾患を処置または予防するための組換え遺伝子送達ベクターの使用 - Google Patents

眼の疾患を処置または予防するための組換え遺伝子送達ベクターの使用

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Abstract

(57)【要約】 眼の疾患の処置または予防における使用のために、遺伝子送達ベクター（例えば、組換えアデノ随伴ウイルスベクター）、およびこのようなベクターを使用する方法が、提供される。詳細には、本発明は、眼の疾患を処置または予防する方法を提供し、この方法は、神経栄養因子の発現を指示する遺伝子送達ベクターを眼内投与して、その眼の疾患を処置または予防する工程を包含する。また、本発明は、神経栄養因子または抗脈管形成因子の発現を指示する、遺伝子送達ベクターを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般的に、眼の疾患を処置するための組成物および方法、そしてよ
り詳細には、眼の疾患を処置または予防するために適切な選択された遺伝子産物
の発現を指向する種々の遺伝子発現ベクターの使用に関する。
【０００２】 （発明の背景） 眼の疾患は、米国および世界中で顕著な健康問題を意味する。現在、８０００
万人を超える米国人が潜在的な失明病に罹患し、１１０万人が法定的に失明して
いる。１２００万人の個体が、ある程度の矯正され得ない視覚障害に罹患してい
る。眼の疾患の全体的な経済的インパクトもまた、非常に重要である。１９８１
年に、米国経済に対する視覚障害の見積もられた経済的インパクトは、１年あた
り１４０億であった。１９９５年までに、このインパクトは、３８４億の見積も
りに成長した（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｙｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＮＩＨ）。
【０００３】 広範な種々の眼の疾患は、視覚障害（例えば、黄斑変性、糖尿病性網膜症、遺
伝性網膜変性（例えば、色素性網膜炎、緑内障、網膜剥離、または損傷および網
膜症）を含む）（遺伝したか、手術、外傷、毒性化合物もしくは薬剤によって誘
導されたか、または光によるかに関わらず）を引き起こし得る。
【０００４】 疾患によって特に影響され得る、眼における１つの構造は、網膜である。手短
に言えば、網膜（これは、眼の後ろに見出される）は、光受容細胞（杆体および
錐体）および視覚的情報のプロセシングのための神経ネットワークに接続された
ニューロンを含む、特定化された光感受性組織である（図１０を参照のこと）。
この情報は、画像に解読するために脳に送られる。
【０００５】 網膜は、その代謝的機能の支持のために、隣接する網膜色素上皮（ＲＰＥ）の
細胞に依存する。網膜における光受容体は、おそらく、莫大なエネルギーの所要
量および高度に分化した状態のために、種々の遺伝的および環境的な攻撃に対し
て感受性である。従って、網膜は、視覚の損失または完全な失明を生じる多くの
疾患に対して感受性である。
【０００６】 色素性網膜炎（ＲＰ）（これは、光受容細胞、ＲＰＥ、および脈絡膜の破壊を
生じる）は、遺伝性網膜変性を代表する。減弱条件のこの群は、米国において、
約１００，０００の人に影響を与えている。
【０００７】 この重要な臨床的な問題に取り組む際になされる大きな進歩は、過去２０年間
にわたって、光受容体の細胞生物学、分子生物学、分子遺伝学、および生化学に
おける研究の進歩に依存してきた。遺伝性の網膜疾患の動物モデルは、ヒト網膜
疾患における異常の根底にある特定の遺伝的および生化学的欠損を解明すること
を補助する際に重要であった。現在、遺伝性不均一性と臨床的不均一性の両方が
多くの遺伝性網膜疾患の根底にあることは明らかであるようである。
【０００８】 高齢者における視力の喪失の第一の原因は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）である
。米国におけるこの疾患の社会的および経済的インパクトは増大している。この
斑は、窩を含む網膜の中心の近くの構造である。網膜のこの特定化された部分は
、読書のような活動を可能にする高解像度の視覚の原因となる。ＡＭＤにおける
中心視力の損失は破壊的である。斑に対する変性性変化（黄斑障害）は、生涯に
おいていつでも起こり得るが、年齢が進むにつれてよりいっそう蔓延する。年齢
の高い集団において成長するので、ＡＭＤは、糖尿病性網膜症および緑内障の両
方を合わせたよりも、より有力な失明の原因となっている。レーザー処理は、疾
患の「湿潤性」または新生血管形態から、広範な斑の瘢痕のリスクを減少するこ
とが示された。しかし、再発性の脈絡膜の新生血管形成に起因して、この処理の
効果は短命である。従って、ＡＭＤの大多数の患者のための臨床的使用における
有効な処置は現在存在しない。
【０００９】 眼の他の疾患（例えば、緑内障）もまた、米国において主要な公的な健康の問
題である。特に、緑内障からの失明は、社会保障の利益、税収入の喪失、および
保険医療の出費において米国政府に毎年顕著なコストを課すと考えられている。
【００１０】 手短に言えば、緑内障は、一様な疾患ではなく、むしろ視覚機能の喪失をもた
らす視覚神経の損失の特定の型を共有する障害の異種の群である。この疾患は、
進行性の視覚的なニューロパシーとして明白であり、これは、未処置で放置した
場合、失明をもたらす。３００万人程度の多くの米国人が緑内障を発症し、これ
らのうち、１２０，０００程度の多くが結果として失明すると見積もられている
。さらに、これは、アフリカ系米国人における失明の第１の原因である。その最
も一般的な形態において、一次性開放隅角緑内障は潜行性であり得る。この形態
は、通常中年において開始し、そしてゆっくりと進行するが過酷である。早期に
検出された場合、疾患の進行は、医学的処置または外科的処置を用いてしばしば
阻止または遅延され得る。
【００１１】 緑内障は、眼の前部および後部におけるいくつかの組織を含み得る。一般には
、しかし常にというわけではなく、緑内障は、眼の前部の欠損から始まる。眼の
前方部分の体液である眼房水は、栄養を運びそして種々の組織に提供する循環系
を形成する。眼房水は、毛様体上皮を介して前部チャンバーに入り（流入する）
、レンズ、虹彩、および角膜を浸す前部セグメントを通して流れ、次いで、小柱
網およびシュレム管として知られる特異化された組織を介して眼から離れて、静
脈系に流れる。眼内圧は、維持された、体液分泌と体液流出との間の向かい合っ
たバランスである。ほとんどすべての緑内障は、眼房水の流出を妨害する欠損と
関連し、従って、これは眼内圧の上昇をもたらす。従って、この流出の障害の結
果および眼内圧の上昇は、視神経機能が損なわれることである。その結果は、特
有の視神経萎縮症であり、これは、臨床的に、視神経の陥凹および杯形成によっ
て特徴付けされ、これは、視神経軸索の損失を示す。
【００１２】 一次性開放隅角緑内障は、慣例によって、流出排液チャネルまたは眼の前部の
小柱網の妨害から生じると考えられている比較的高い眼内圧によって特徴付けら
れる。しかし、別の型の一次性開放隅角緑内障、正常圧緑内障は、異常に高い眼
内圧の非存在下での、重篤な眼のニューロパシーによって特徴付けられる。正常
圧緑内障を有する患者は、しばしば高い正常な範囲にあるにも関わらず、正常な
範囲の圧力を有する。一次性開放隅角緑内障のこれらの型の両方は、臨床的には
、その疾患は最初に、中年以降にそれ自体を呈するという意味で、遅れて発症す
る疾患であると見なされる。しかし、アフリカ系米国人の間では、この疾患は、
中年よりもより初期の年齢で開始し得る。対照的に、若年の開放隅角緑内障は、
小児および若年成人に発症する一次性緑内障である。臨床的には、この緑内障の
まれな型は、そのより初期の発症によってのみならず、この疾患に関連する非常
に高い眼内圧によってもまた、一次性開放隅角緑内障と区別される。開放隅角緑
内障は、小柱網と虹彩との接触によって引き起こされる疾患の機械的な形態であ
り、眼から体液が逸脱することを可能にする排液チャネルの妨害を生じる。この
形態の緑内障は、非常に初期の段階では、レーザー手術を用いて有効に処置され
得る。小児における先天的な緑内障および他の発生学的な緑内障は、重篤な傾向
にあり、そして首尾良く処置することは非常に難しい。二次的な緑内障は、眼か
らの眼房水の流出を損なう他の眼疾患から生じ、そして色素性緑内障、偽剥脱性
緑内障、ならびに外傷および炎症性疾患から生じる緑内障を含む。新しい血管に
よる流出チャネルの妨害（血管新生緑内障）は、網膜血管疾患（特に、糖尿病性
網膜症）を有する人において起こり得る。
【００１３】 一次性開放隅角緑内障は潜行性であり得る。これは、通常中年で開始し、そし
てゆっくりと進行するが過酷である。検出された場合、疾患の進行は、医学的処
置または外科的処置を用いてしばしば阻止または遅延され得る。しかし、処置さ
れない場合、この疾患は、絶対的に回復不可能な失明を生じ得る。多くの場合に
おいて、患者が十分な処置（例えば、より低い眼内圧のための薬物）を受けた場
合でさえ、視神経変性および視力の損失は、過酷に継続する。
【００１４】 本発明は、眼の多くの疾患（例えば、網膜の疾患および変性（例えば、ＲＰお
よびＡＭＤ、ならびに血管新生疾患のような他の疾患）を含む）の処置および予
防のための組成物および方法を提供する。本発明はまた、他の関連する利点を提
供する。
【００１５】 （発明の要旨） 手短に述べると、本発明は、眼の疾患を処置、予防、または阻害するための組
成物および方法を提供する。本発明の１つの局面において、眼の疾患を処置およ
び予防するための方法が提供され、この方法は、１以上の神経栄養因子または抗
脈管形成因子の発現を指向する遺伝子送達ベクターを眼内に投与する工程を包含
し、その結果、眼の疾患が処置または予防される。本発明の関連する局面におい
て、１以上の神経栄養因子（例えば、ＦＧＦ）の発現を指向する遺伝子送達ベク
ター、ならびに１以上の抗脈管形成因子の発現を指向する遺伝子治療ベクターが
提供される。本発明の特定の実施形態において、ウイルスプロモーター（例えば
、ＣＭＶ）または誘導性プロモーター（例えば、ｔｅｔ）が、神経栄養因子の発
現を駆動するように使用される。
【００１６】 本発明における使用のために適切な遺伝子送達ベクターの代表的な例は、ウイ
ルス（例えば、レトロウイルス（例えば、ＦＩＶまたはＨＩＶ）、ヘルペスウイ
ルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびアルファウイルス）または
非ウイルスベクターから生成され得る。
【００１７】 本明細書中に提供される方法および遺伝子送達ベクターを利用することによっ
て、広範な種々の眼の疾患（例えば、緑内障、黄斑変性、糖尿病性網膜症、遺伝
性網膜変性（例えば、色素性網膜炎、網膜剥離、または傷害および網膜症）を含
む）（遺伝したか、手術、外傷、毒性化合物もしくは薬剤によって誘導されたか
、または光によるかに関わらず）が容易に処置または予防され得る。同様に、本
発明の文脈において、広範な種々の神経栄養因子（例えば、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、
ＣＮＴＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−１８、ＦＧ
Ｆ−２０、およびＦＧＦ−２１を含む）が利用され得る（単独でまたは組み合わ
せてのいずれかで）。
【００１８】 本発明の特定の実施形態において、遺伝子送達ベクターを使用して、糖尿病性
網膜症、湿潤性ＡＲＭＤ、および他の眼の新生血管疾患（例えば、ＲＯＰ）の処
置、予防、または阻害のために抗脈管形成因子を送達および発現することが好ま
しい。他の実施形態において、遺伝子送達ベクターを使用して、眼の疾患（例え
ば緑内障、色素性網膜炎、および乾性ＡＲＭＤ）を処置、予防、または阻害する
ために神経栄養増殖因子を送達および発現することが望ましい。なお他の実施形
態において、眼の疾患の処置、予防、または阻害において（例えば、糖尿病性網
膜症のために）、抗脈管形成因子および神経栄養増殖因子の両方を発現する遺伝
子送達ベクター、またはこのような因子を独立して発現する２つの別々のベクタ
ーのいずれかを利用することが所望され得る。
【００１９】 本発明のさらなる実施形態において、遺伝子送達ベクターを利用する上述の方
法は、他の方法または治療レジメン（例えば、光力学的治療（例えば、湿潤性Ａ
ＲＭＤのために）、レーザー光凝固（例えば、糖尿病性網膜症および湿潤性ＡＲ
ＭＤのために）、および眼内圧減少剤（例えば、緑内障のために）を含む）を伴
って投与され得る。
【００２０】 本発明によって、図２の配列を含む単離された核酸分子、この配列を含み、そ
して／またはこの配列を発現するベクター、およびこのようなベクターを含む宿
主細胞もまた、提供される。
【００２１】 本発明のさらなる局面において、神経栄養因子または抗脈管形成因子の発現を
指向する遺伝子送達ベクターが提供される。上記のように、神経栄養因子の代表
的な例には、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＦＧＦ−２、
ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−２０、およびＦＧＦ−２１が含まれる。抗
脈管形成因子の代表的な例には、可溶性Ｆｌｔ−１、可溶性Ｔｉｅ−２レセプタ
ー、およびＰＥＤＦが含まれる。適切な遺伝子送達ベクターの代表的な例には、
アデノウイルス、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶまたはＦＩＶに基づくベクタ
ー）、アルファウイルス、ＡＡＶベクター、および裸のＤＮＡベクターが含まれ
る。
【００２２】 本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照
することにより明白になる。さらに、特定の手順または組成物をより詳細に記載
する種々の文献が本明細書中で示され、従って、その全体が参考として援用され
る。
【００２３】 （発明の詳細な説明） （定義） 本発明を示す前に、本明細書中で以後使用される特定の用語の定義をまず示す
ことが、本発明の理解に有用であり得る。
【００２４】 「遺伝子送達ベクター」とは、宿主細胞において目的の１つ以上の遺伝子また
は配列を送達し得、そして好ましい実施形態においては、目的の１つ以上の遺伝
子または配列を発現し得る、構築物をいう。このようなベクターの代表的例とし
ては、ウイルスベクター、核酸発現ベクター、裸のＤＮＡ、および特定の真核生
物細胞（例えば、プロデューサー細胞）が、挙げられる。
【００２５】 「組換えアデノ随伴ウイルスベクター」または「ｒＡＶＶベクター」とは、ア
デノ随伴ウイルスに基づく遺伝子送達ベクターをいう。このｒＡＡＶベクターは
、アデノ随伴ウイルスの５’および３’の逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ならびに
標的細胞におけるその発現を調節する配列と作動可能に連結された目的のトラン
スジーンまたは遺伝子を含むべきである。特定の実施形態において、このトラン
スジーンは、異種プロモーター（例えば、ＣＭＶ）または誘導性プロモーター（
例えば、ｔｅｔ）と作動可能に連結され得る。さらに、このｒＡＡＶベクターは
、ポリアデニル化配列を有し得る。
【００２６】 「神経栄養因子」または「ＮＴ」とは、神経系の発達および維持を担うタンパ
ク質をいう。神経栄養因子の代表的例としては、ＮＧＦ，ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、
ＮＴ−３、ＮＴ−４、および線維芽細胞増殖因子が、挙げられる。
【００２７】 「線維芽細胞増殖因子」または「ＦＧＦ」とは、関連タンパク質のファミリー
をいい、その最初のものは、下垂体から単離された（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃ
ｚ，Ｄ．、Ｎａｔｕｒｅ，２４９：１２３〜１２７，１９９４を参照のこと）。
この最初のＦＧＦ（塩基性ＦＧＦと称する）から、関連タンパク質のファミリー
、タンパク質ムテイン、およびタンパク質アナログが、同定された（例えば、米
国特許番号４，４４４，７６０、同５，１５５，２１４、同５，３７１，２０６
、同５，４６４，７７４、同５，４６４，９４３、同５，６０４，２９３、同５
，７３１，１７０、同５，７５０，３６５、同５，８５１，９９０、同５，８５
２，１７７、同５，８５９，２０８、および同５，８７２，２２６を参照のこと
）。これらすべてが、一般的に、本発明の文脈において、線維芽細胞増殖因子と
呼ばれる。
【００２８】 「抗脈管形成因子」とは、血管の成長の増殖を阻害し得る、因子または分子を
いう。種々のアッセイが、所定の分子の抗脈管形成活性を評価するために利用さ
れ得、そのようなアッセイとしては、例えば、実施例１５に提供されるアッセイ
が挙げられ、このアッセイは、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）の増殖を測定
する。抗脈管形成因子の代表的例としては、例えば、アンギオスタチン（ａｎｇ
ｉｏｓｔａｔｉｎ）、１，２５−ジ−ヒドロキシ−ビタミンＤ3、エンドスタチ
ン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＩＧＦ−１レセプターアンタゴニスト、インター
フェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγ、インターフェロ
ンγ誘導性タンパク質ＩＰ−１０、インターロイキン１αおよびインターロイキ
ン１β、インターロイキン１２、２−メトキシエストラジオール、ＰＥＤＦ、血
小板第４因子、プロラクチン（１６ｋｂフラグメント）、プロタミン、レチノイ
ン酸、トロンボスポンジン−１およびトロンボスポンジン−２、メタロプロテイ
ナーゼ−１およびメタロプロテイナーゼ−２の組織インヒビター、トランスホー
ミング増殖因子β、可溶性Ｔｉｅ−２レセプター、可溶性Ｔｉｅ−２レセプター
、可溶性Ｆｌｔ−１ならびに腫瘍壊死因子−αが、挙げられる。
【００２９】 「眼の疾患」とは、眼の機能が、光受容体、神経節または視神経の、損傷また
は変性；または血管新生に起因して影響を受けている、広範な種類の疾患をいう
。このような疾患の代表的例としては、黄斑変性、糖尿病性網膜症、遺伝性網膜
変性（例えば、色素性網膜症）、緑内障、網膜剥離または網膜損傷、および網膜
症（遺伝性であっても、手術、外傷、毒性化合物または毒性薬剤、あるいは光に
より誘導されても）が、挙げられる。
【００３０】 上記のように、本発明は、眼の疾患を処置、予防、または阻害するための、組
成物および方法を提供し、この方法は、１つ以上の神経栄養因子の発現を指示す
る組換えアデノ随伴ウイルスベクターを眼内投与して、眼の疾患を処置または予
防する一般的工程を包含する。本発明のさらなる理解のために、より詳細な説明
が、（Ａ）遺伝子送達ベクター；（Ｂ）神経栄養因子；（Ｃ）抗脈管形成因子；
および（Ｄ）眼の疾患の処置または予防におけるｒＡＶＶの投与方法に関して、
以下に提供される。
【００３１】 （Ａ．遺伝子送達ベクター） （１．レトロウイルス遺伝子送達ベクターの構築） 本発明の１つの局面において、選択された目的の遺伝子または配列を、保有ま
たは発現するように構築されたレトロウイルス遺伝子送達ベクターが、提供され
る。簡単には、本発明のレトロウイルス遺伝子送達ベクターは、広範な種類のレ
トロウイルス（例えば、Ｂ型、Ｃ型、およびＤ型のレトロウイルス、ならびにス
プマウイルスおよびレンチウイルスを含む（ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅ
ｓ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、
１９８５を参照のこと））から容易に構築され得る。このようなレトロウイルス
は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」；Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）のような寄託機関またはコレクションから容易に入手
され得るし、あるいは市販の技術を使用して、公知の供給源から単離され得る。
【００３２】 上記の任意のレトロウイルスが、本明細書中に提供される開示および標準的組
換え技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；Ｋｕｎｋｅｌ
、ＰＮＡＳ ８２：４８８、１９８５）を考慮すると、レトロウイルス遺伝子送
達ベクターをアセンブルまたは構築するために、容易に利用され得る。さらに、
本発明の特定の実施形態において、このレトロウイルス遺伝子送達ベクターの部
分は、異なるレトロウイルスに由来し得る。例えば、本発明の１つの実施形態に
おいて、レトロウイルスＬＴＲは、マウス肉腫ウイルスに由来し得、ｔＲＮＡ結
合部位はラウス肉腫ウイルスに由来し得、パッケージングシグナルはマウス白血
病ウイルスに由来し得、ならびに第２鎖合成起点はニワトリ白血病ウイルスに由
来し得る。
【００３３】 本発明の１つの局面において、以下を含むレトロウイルス構築物が提供される
：５’ ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、１つ以上の異種
配列、第２鎖ＤＮＡ合成起点、ならびに３’ ＬＴＲ（このベクター構築物は、
ｇａｇ／ｐｏｌコード配列またはｅｎｖコード配列を欠く）。
【００３４】 他のレトロウイルス送達ベクターが、同様に、本発明の状況において利用され
得、このようなベクターとしては、例えば、以下が挙げられる：ＥＰ ０，４１
５，７３１；ＷＯ ９０／０７９３６；ＷＯ ９１／０２８５、ＷＯ ９４０３
６２２；ＷＯ ９３２５６９８；ＷＯ ９３２５２３４；米国特許番号５，２１
９，７４０；ＷＯ ９３１１２３０；ＷＯ ９３１０２１８；ＶｉｌｅおよびＨ
ａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３８６０〜３８６４、１９９３；Ｖｉｌ
ｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：９６２〜９６７、１９９３；
Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３〜８８、１９９３；Ｔａｋａｍｉ
ｙａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３〜５０３、１９９２；Ｂ
ａｂａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９〜７３５、１９９３（米国特
許番号４，７７７，１２７、ＧＢ２，２００，６５１、ＥＰ ０，３４５，２４
２およびＷＯ９１／０２８０５）。
【００３５】 上記のレトロベクター構築物との使用に適切なパッケージング細胞株が、容易
に調製され得（米国特許出願番号０８／２４０，０３０（１９９４年５月９日出
願）を参照のこと；また、米国特許出願番号０７／８００，９２１（１９９１年
１１月２７日出願）も参照のこと）、そして組換えベクター粒子の生成のための
プロデューサー細胞株（ベクター細胞株または「ＶＣＬ」とも称する）作製する
ために利用され得る。
【００３６】 （２．組換えアデノ随伴ウイルスベクター） 上記のように、種々のｒＡＡＶベクターが、所望の１つ以上の神経栄養因子の
発現を指示するために利用され得る。簡単には、そのｒＡＡＶは、順番に、アデ
ノ随伴ウイルスの５’逆方向末端反復、標的細胞においてその発現を調節する配
列に作動可能に連結された目的のトランスジーンまたは遺伝子、ならびにアデノ
随伴ウイルスの３’逆方向末端反復から、構成されるべきである。さらに、その
ｒＡＡＶベクターは、好ましくは、ポリアデニル化配列を有し得る。
【００３７】 一般的には、ｒＡＡＶベクターは、複製、パッケージング、および細胞の染色
体への有効な組み込みを可能にするために、目的のトランスジーンまたは遺伝子
の各末端に、１コピーのＡＡＶ ＩＴＲを有すべきである。そのＩＴＲは、ＡＡ
Ｖ ＤＮＡゲノムの５’末端のヌクレオチド１〜１４５、およびＡＡＶ ＤＮＡ
ゲノムの３’末端のヌクレオチド４６８１〜４５３６（すなわち、同じ配列）か
らなる。好ましくは、そのｒＡＡＶベクターはまた、そのＩＴＲの末端（すなわ
ち、「Ｄ領域」）に続いて、少なくとも１０ヌクレオチドを含み得る。
【００３８】 本発明の好ましい実施形態において、そのトランスジーン配列は、長さ約２〜
５ｋｂである（か、あるいは、そのトランスジーンはさらに、その２つのＩＴＲ
間の核酸配列の全サイズを２ｋｂと５ｋｂとの間にするための「スタッファー（
ｓｔｕｆｆｅｒ）」配列または「フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）」配列を含み得る）
。あるいは、そのトランスジーンは、同じ異種配列数回（例えば、リボソーム読
み通しにより分けられたＦＧＦ−２をコードする２つの核酸分子、またあるいは
、内部リボソーム侵入部位または「ＩＲＥＳ」により分けられたＦＧＦ−２をコ
ードする２つの核酸分子）から構成され得るか、あるいはいくつかの異なる異種
配列（例えば、リボソーム読み通しまたはＩＲＥＳにより分けられた、ＦＧＦ−
２およびＦＧＦ−５）から構成され得る。
【００３９】 本発明の組換えＡＡＶベクターは、種々のアデノ随伴ウイルス（例えば、血清
型１〜６を含む）から作製され得る。例えば、任意のＡＡＶ血清型由来のＩＴＲ
が、複製機構、組み込み機構、切り出し機構および転写機構に関して、類似の構
造および機能を有することが予期される。
【００４０】 本発明の特定の実施形態において、そのトランスジーンの発現が、個々のプロ
モーター（例えば、ウイルスプロモーター）により達成され得る。この点におい
て適切なプロモーターの代表的例としては、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモ
ーター、ＳＶ４０プロモーター、またはＭｏＭＬＶプロモーターが、挙げられる
。本発明の状況において同様に利用され得る他のプロモーターとしては、細胞特
異的プロモーターまたは組織特異的プロモーター（例えば、杆体由来プロモータ
ー、錐体由来プロモーター、または神経節由来プロモーター）、あるいは誘導性
プロモーターが、挙げられる。適切な誘導性プロモーターの代表的例としては、
テトラサイクリン応答性プロモーター（「Ｔｅｔ」、例えば、Ｇｏｓｓｅｎおよ
びＢｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：５５
４７〜５５５１、１９９２；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８、１７６
６〜１７６９、１９９５；Ｂａｒｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５
：２７２３〜２７２９、１９９７；ＢｌａｕおよびＲｏｓｓｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：７９７〜７９９、１９９９；Ｂｏｈｌ
ら、Ｂｌｏｏｄ ９２：１５１２〜１５１７、１９９８；ならびにＨａｂｅｒｍ
ａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：１６０４〜１６１１、１９９８を参照
のこと）、エクジソン系（例えば、Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ．９３：３３４６〜３３５１、１９９６を参照のこと）、ならびに
他の調節されたプロモーターまたはプロモーター系（例えば、Ｒｉｖｅｒａら、
Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１０２８〜１０３２、１９９６を参照のこと）が、挙げら
れる。
【００４１】 このｒＡＡＶベクターはまた、そのベクターに所望の機能をもたらすのを補助
するさらなる配列（例えば、アデノウイルス由来）を含み得る。このような配列
としては、例えば、アデノウイルス随伴ウイルス粒子においてそのｒＡＡＶベク
ターをパッケージングするのを補助する配列が、挙げられる。
【００４２】 アデノ随伴ウイルスベクターを作製するのに適切なパッケージング細胞株は、
容易に利用可能な技術を考慮すると、容易に達成され得る（例えば、米国特許番
号５，８７２，００５を参照のこと）。
【００４３】 ｒＡＡＶベクターを構築およびパッケージングするために特に好ましい方法は
、下記実施例１、２、３および４において、より詳細に記載される。
【００４４】 （３．アルファウイルス送達ベクター） 本発明はまた、遺伝子送達ベクターとして機能し得る、種々のアルファウイル
スベクターを提供する。例えば、シンドビスウイルスは、トガウイルス科のアル
ファウイルス属の原型メンバーである。シンドビスウイルスのセグメント化され
ていないゲノムＲＮＡ（４９Ｓ ＲＮＡ）は、長さが約１１，７０３ヌクレオチ
ドであり、５’キャップおよび３’ポリアデニル化テールを含み、そして正の極
性を示す。エンベロープに包まれた感染性シンドビスウイルスが、細胞質のウイ
ルスゲノムＲＮＡ上へのウイルスヌクレオキャプシドタンパク質のアセンブリ、
およびウイルスにコードされた糖タンパク質に囲まれた細胞膜を通っての出芽に
よって、生成される。細胞へのウイルスの侵入は、クラスリンでコートされたく
ぼみを通ってのエンドサイトーシス、エンドソームとのウイルス膜の融合、ヌク
レオキャプシドの放出、およびウイルスゲノムの脱コートによる。ウイルス複製
の間に、そのゲノムの４９Ｓ ＲＮＡは、相補的な負鎖の合成のための鋳型とし
て作用する。この負鎖は次に、ゲノムＲＮＡおよび内部で開始された２６Ｓサブ
ゲノムＲＮＡの鋳型として作用する。そのシンドビスウイルスの非構造タンパク
質はゲノムＲＮＡから翻訳されるが、構造タンパク質は、２６ＳサブゲノムＲＮ
Ａから翻訳される。ウイルス遺伝子すべては、ポリタンパク質として発現され、
そして翻訳後タンパク質分解性切断によってプロセシングされて個々のタンパク
質になる。パッケージング配列は、非構造コード領域内に存在し、従って、４９
ＳゲノムＲＮＡのみが、ビリオン中にパッケージングされる。
【００４５】 いくつかの異なるシンドビスベクター系が、本発明において構築され得そして
使用され得る。このような系の代表的例としては、米国特許番号５，０９１，３
０９および同５，２１７，８７９ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ ９５／０７９９
４に記載される系が、挙げられる。
【００４６】 （４．他のウイルス遺伝子送達ベクター） レトロウイルスベクターおよびアルファウイルスベクターに加えて、他の多数
のウイルスベクター系もまた、遺伝子送達ベクターとして利用され得る。このよ
うな遺伝子送達ベクターの代表的例としては、以下のようなウイルスが挙げられ
る：ポックスウイルス（例えば、カナリアポックスウイルスまたはワクシニアウ
イルス（Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、ＰＮＡＳ ８６：３１７〜３２１、１９
８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６〜
１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ ８：１７〜２１，１９
９０；米国特許番号４，６０３，１１２、同４，７６９，３３０および同５，０
１７，４８７；ＷＯ ８９／０１９７３））；ＳＶ４０ウイルス（Ｍｕｌｌｉｇ
ａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８〜１１４、１９７９）；インフルエンザ
ウイルス（Ｌｕｙｔｊｅｓら、Ｃｅｌｌ ５９：１１０７〜１１１３、１９８９
；ＭｃＭｉｃｈｅａｌら、Ｎ．ＥＮｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９：１３〜１７、１９
８３；ならびにＹａｐら、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：２３８〜２３９、１９７８）
；ヘルペスウイルス（Ｋｉｔ、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２１５：２
１９〜２３６、１９８９；米国特許番号５，２８８，６４１）；ＨＩＶ（Ｐｏｚ
ｎａｎｓｋｙ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５３２〜５３６、１９９１）；麻疹ウイ
ルス（ＥＰ ０ ４４０，２１９）；セムリキ森林ウイルス、およびコロナウイ
ルス、ならびに他のウイルスの系（例えば、ＥＰ ０，４４０，２１９；ＷＯ
９２／０６６９３；米国特許番号５，１６６，０５７）。さらに、ウイルスキャ
リアは、同種の、非病原性（欠損性）の、複製コンピテントウイルスであり得（
例えば、Ｏｖｅｒｂａｕｇｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：９０６〜９１０、１
９８８）、それにも関わらず、細胞性免疫応答（ＣＴＬを含む）を誘導する。
【００４７】 （５．非ウイルス性遺伝子送達ベクター） 上記のウイルスベースのベクターに加えて、多数の非ウイルス性遺伝子送達ベ
クターが、同様に、本発明の状況において利用され得る。このような遺伝子送達
ベクターの代表的例としては、以下が挙げられる：核酸発現ベクターの直接の送
達、裸のＤＮＡ単独（ＷＯ ９０／１１０９２）、殺傷されたアデノウイルスに
結合されたポリカチオン濃縮ＤＮＡまたは殺傷されたアデノウイルスに結合され
ていないポリカチオン濃縮ＤＮＡ（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒ．３：１４７〜１５４、１９９２）、上記の高い親和性の対のうちの１つを伴
うリガンドに結合されたＤＮＡリガンドまたは上記の高い親和性の対のうちの１
つを伴わないリガンドに結合されたＤＮＡリガンド（Ｗｕら、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ ２６４：１６９８５〜１６９８７、１９８９）、核酸含有リポソ
ーム（例えば、ＷＯ ９５／２４９２９およびＷＯ ９５／１２３８７）、およ
び特定の真核生物細胞（例えば、プロデューサー細胞−米国特許出願番号０８／
２４０，０３０（１９９４年５月９日出願）および米国特許出願番号０７／８０
０，９２１を参照のこと）。
【００４８】 （Ｂ．神経栄養因子） 上記のように、用語、神経栄養因子とは、神経系の発達および維持を担うタン
パク質をいう。神経栄養因子の代表的例としては、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ
、ＮＴ−３、ＮＴ−４、および線維芽細胞増殖因子が、挙げられる。
【００４９】 線維芽細胞増殖因子とは、関連するタンパク質のファミリーをいい、その最初
のものは、下垂体から単離された（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ，Ｄ．、Ｎａｔ
ｕｒｅ、２４９：１２３〜１２７、１９７４を参照のこと）。この最初のＦＧＦ
（塩基性ＦＧＦと称する）から、関連するタンパク質のファミリー、タンパク質
ムテイン、およびタンパク質アナログが同定された（例えば、米国特許番号４，
４４４，７６０、同５，１５５，２１４、同５，３７１，２０６、同５，４６４
，７７４、同５，４６４，９４３、同５，６０４，２９３、同５，７３１，１７
０、同５，７５０，３６５、同５，８５１，９９０、同５，８５２，１７７、同
５，８５９，２０８、および同５，８７２，２２６を参照のこと；一般的には、
ＢａｉｒｄおよびＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ，Ｄ．、Ａｎｎ Ｎ．Ｙ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．６３８：１、１９９１を参照のこと）。同定されたファミリーの最
初の２つのメンバーは、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ／ＦＧＦ−１）およ
び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２）であった。このＦＧＦフ
ァミリーのさらなるメンバーとしては、以下が挙げられる：ｉ−ｎｔ−２／ＦＧ
Ｆ−３（Ｓｍｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．７：１０１３、１９８８）；ＦＧＦ−４
（Ｄｅｌｉ−Ｂｏｖｉら、Ｃｅｌｌ ５０：７２９、１９８７）；ＦＧＦ−６（
Ｍａｒｉｃｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ４：３３５（１９８９））；ケラチノサイ
ト増殖因子／ＦＧＦ−７（Ｆｉｎｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７５２、１
９８９）；ＦＧＦ−８（Ｔａｎａｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８９：８９２８、１９９２）；およびＦＧＦ−９（Ｍｉｙａｍｏｔ
ｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３：４２５１、１９９３）。
【００５０】 ＦＧＦ−５は、元々オンコジーンとして単離された。Ｇｏｌｄｆａｒｂら、米
国特許番号５，１５５，２１７および同５，２３８，９１６、Ｚｈａｎら「Ｈｕ
ｍａｎ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ａ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｍ
ｅｄｉｕｍ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ａｓｓａｙ」（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １：３６９〜
３７６、１９８７）、Ｚｈａｎら「Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ＦＧＦ−５ Ｏｎｃｏ
ｇｅｎｅ Ｅｎｃｏｄｅｓ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｌａｔｅｄ
ｔｏ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ」（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：３４８７〜３
４９５、１９８８）、およびＢａｔｅｓら「Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ
Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ５」 （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：１
８４０〜１８４５、１９９１）を参照のこと。
【００５１】 他のＦＧＦとしては、以下：米国特許番号４，４４４，７６０、同５，１５５
，２１４、同５，３７１，０６、同５，４６４，７７４、同５，４６４，９４３
、同５，６０４，２９３、同５，７３１，１７０、同５，７５０，３６５、同５
，８５１，９９０、同５，８５２，１７７、同５，８５９，２０８、および同５
，８７２，２２６、同５，８５２，１７７、および同５，８７２，２２６に開示
されるもの、ならびにＦＧＦ−２０（米国仮出願番号６０／１６１，１６２）お
よびＦＧＦ−２１（米国仮出願番号６０／１６６，５４０）が挙げられる （Ｃ．抗脈管形成因子） 広範な種類の抗脈管形成因子もまた、本発明の遺伝子送達ベクターから発現さ
れ得、そのような抗脈管形成因子としては、例えば、以下が挙げられる：アンギ
オスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ ７９：３１５〜３２８、１９９４
；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：６８９〜９２、１９９６；Ｓｉｍ
ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：１３２９〜３４、１９９７）、１，２５−ジ
−ヒドロキシ−ビタミンＤ3（Ｓｈｉｂｕｙａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：５１
９〜２４、１９９０；Ｏｉｋａｗａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７
８：２４７〜５０、１９９０；および１８２：６１６、１９９０）、エンドスタ
チン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ ８８：２７７〜８５、１９９７）、イン
ターフェロンαおよびインターフェロンβ（Ｓｉｄｋｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．４７：５１５５〜６１、１９８７；Ｓｉｎｇｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：４５６２〜６、１９９５）、インターフェロン
γ（Ｆｒｉｅｓｅｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０４：６８９〜９６、１９
８７）、ＩＧＦ−１レセプターアンタゴニスト、インターフェロンγ誘導性タン
パク質ＩＰ−１０（Ａｒｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９６；１８
４：９８１〜９２；Ｓｔｒｉｅｔｅｒら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．１９９
５；５７：７５２〜６２；Ａｎｇｉｏｌｉｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８
２：１５５〜６２、１９９５）、インターロイキン１αおよびインターロイキン
１β（Ｃｏｚｚｏｌｉｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８７：６４８７〜９１、１９９０）、インターロイキン１２（Ｋｅｒｂｅｌお
よびＨａｗａｌｅｙ、Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８７：５５７〜
９、１９９５；Ｍａｊｅｗｓｋｉら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ １
０６：１１１４〜８、１９９６；Ｖｏｅｓｔら、Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｎｓｔ．８７：５８１〜６、１９９５）、２−メトキシエストラジオール（Ｆ
ｏｔｓｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：２３７〜９、１９９４）、ＰＥＤＦ、血
小板第４因子（ＴａｙｌｏｒおよびＦｏｌｋｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２９７：３
０７〜１２、１９８２；Ｇｅｎｇｒｉｎｏｖｉｔｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ ２７０：１５０５９〜６５、１９９５）、プロラクチン（１６ｋｄフラグメ
ント）（Ｃｌａｐｐら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３：１２９２〜９、
１９９３；Ｆｅｒｒａｒａ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２９：８９６〜９
００、１９９１）、プロタミン、レチノイン酸（Ｌｉｎｇｅｎら、Ｌａｂ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ ７４：４７６〜８３、１９９６）、トロンボスポンジン−１およびト
ロンボスポンジン−２（Ｌａｗｌｅｒ、Ｂｌｏｏｄ ６７：１１９７〜２０９、
１９８６；ＲａｕｇｉおよびＬｏｖｅｔｔ、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ １２９：
３６４〜７２，１９８７；Ｖｏｌｐｅｒｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ ２１７：３２６〜３２、１９９５）、メタロプロテイ
ナーゼ−１およびメタロプロテイナーゼ−２の組織インヒビター（Ｍｏｓｅｓお
よびＬａｎｇｅｒ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４７：２３０〜５，１９９
１；ＲａｙおよびＳｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ
．Ｊ．７：２０６２〜７２、１９９４）、トランスホーミング増殖因子β（Ｒａ
ｙＣｈａｕｄｈｕｒｙ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ４７：２２４〜９、１
９９１；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ
８３：４１６７〜７１、１９８６）および組織壊死因子α（Ｆｒａｔｅｒ−Ｓｃ
ｈｒｏｅｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５
２７７〜８１、１９８７；Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ ３２９：６３
０〜２、１９８７）。
【００５２】 本発明の状況において利用され得る他の抗脈管形成因子としては、可溶性Ｆｌ
ｔ−１のようなＶＥＧＦアンタゴニスト（ＫｅｎｄａｌおよびＴｈｏｍａｓ、Ｐ
ＮＡＳ ９０：１０７０５、１９９３）および可溶性Ｔｉｅ−２レセプターのよ
うなＡｎｇ−１アンタゴニスト（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６
：２５１１、１９９９；また、一般的には、Ａｉｅｌｌｏら、ＰＮＡＳ ９２：
１０４５７、１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＰＮＡＳ ９３：４８５１、１９
６；Ｓｅｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５４：１７４３、１９９９も参照の
こと）が、挙げられる。
【００５３】 所定の分子が「抗脈管形成」性である能力は、例えば、実施例１５にて提供さ
れるＨＵＶＥＣアッセイを含む、種々のアッセイを利用して容易に評価され得る
。
【００５４】 （Ｄ．眼の疾患を処置および／または予防するための方法、および薬学的組成
物） 上記のように、本発明は、概して、眼疾患の進行を処置、予防おまたは阻害す
るために、１つ以上の神経栄養性因子の眼への、または抗脈管形成因子の眼への
発現を指向する遺伝子送達ベクターを眼内に投与する工程を包含する方法を提供
する。本明細書において利用されるときには、用語「処置、予防または阻害され
る」とは、統計学的に有意な様式での疾患の経過または進行の変更をいうことが
理解されるべきである。疾患の経過が変化したかどうか判定は、種々のモデル系
において容易に判断されえ、これは以下により詳細に考察され、以下の説明では
、遺伝子送達ベクターが光受容体および他の網膜細胞を、細胞死から遅延、予防
または補充する能力を分析する。
【００５５】 （１．眼の疾患） 広汎な種々の眼の疾患は、本明細書に提供される教示により処理され得る。例
えば、本発明の１つの実施形態において、遺伝子送達ベクターが眼内に投与され
、黄斑変性が処置または予防される。手短には、高齢者の視力喪失の主な原因は
、黄斑変性（ＭＤ）であり、この疾患は、米国においてますます重要な社会的お
よび経済的影響を有している。米国における高齢者人口規模の増加につれ、加齢
性黄斑変性（ＡＭＤ）が糖尿病性網膜症および緑内障の合併症の両方よりも罹患
率の高い失明の原因となっている。レーザ処置が、疾患の「湿潤性」または新血
管形態から広汎な黄斑瘢痕の危険性を減少することが示されたが、ＭＤに罹患す
る患者の台部分に対しては有効な処置が現在存在しない。
【００５６】 別の実施形態において、遺伝子送達ベクターが患者の眼内に投与され得、遺伝
性網膜変性を処置または予防し得る。最も一般的な遺伝性網膜変性の１つは、色
素性網膜炎（ＲＰ）であり、この疾患は、光受容細胞およびＲＰＥの破壊を生じ
る。他の遺伝性状態としては、以下が挙げられる：バーデット−ビードル症候群
（常染色体劣性）；先天性黒内症（常染色体劣性）；錐体または錐体−杆体機能
不全（常染色体優性形態およびＸ伴性形態）；先天性停在夜盲症（常染色体優性
形態、常染色体劣性形態およびＸ伴性形態）；黄斑変性（常染色体優性形態およ
び常染色体劣性形態）；眼萎縮（常染色体優性形態およびＸ伴性形態）；色素性
網膜炎（常染色体優性形態、常染色体劣性形態およびＸ伴性形態）；症候性また
は全身性の網膜障害（常染色体優性形態、常染色体劣性形態およびＸ伴性形態）
；ならびにアッシャー症候群（常染色体劣性）。この群の減弱性の状態は、米国
のみでおよそ１００，０００人に罹患している。
【００５７】 上記のように、本発明の他の局面において、神経栄養性増殖因子の発現を指向
させる遺伝子送達ベクターは、患者の眼内に投与されて、緑内障を処置または予
防し得る。手短には、緑内障は、均一の疾患ではなく、むしろ、異種の群の障害
であって、異なる型の眼神経障害を共有し、これが視力機能の喪失をもたらすも
のである。この疾患は、進行性の眼神経障害として顕在し、これは、処置しない
ままである場合、失明を引き起こす。およそ３００万人の米国人が、緑内障を有
し、これらのうち、１２０万人もが結果的に失明すると見積もられる。さらに、
緑内障は、アフリカ系米国人の失明原因の第一位である。最も蔓延した形態にお
いて、一次性開放隅角緑内障は潜在性である。この形態は、通常、人生の中期に
始まり、そしてゆっくりではあるが重篤に進行する。早期に検出される場合、疾
患の進行は、しばしば、医療的または外科的処置によって停止または遅延され得
る。緑内障を処置するための本発明のベクターから発現され得る代表的な因子は
、ＦＧＦ−２，５，１８，２０，および２１のような神経栄養成長因子を包含す
る。
【００５８】 さらに他の実施形態において、遺伝子送達ベクターは、患者の眼内に投与され
て、網膜への外傷（網膜剥離、光性網膜症、手術誘導性網膜症、毒性網膜症、外
傷または眼の貫通する外傷に起因する網膜症を含む）を処置または予防し得る。
【００５９】 上記のように、本発明はまた、眼の脈管形成疾患の処置、予防または阻害する
方法を提供する。この方法は、抗脈管形成因子の発現を指向する遺伝子送達ベク
ターを患者に投与する工程を包含する。脈管形成の代表例としては、糖尿病網膜
症、ＡＲＭＤ（湿潤形態）、および未熟児網膜症が挙げられる。手短には、脈絡
膜脈管形成は、滲出性または湿潤性加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の症状であり、こ
れは、高齢者集団の失明の首位の原因である。網膜脈管形成は、糖尿病網膜症お
よび未熟児網膜症（ＲＯＰ）（若年における網膜の最も一般的な原因である）の
ような疾患において生じる。
【００６０】 眼の血管新生疾患の処置、予防または阻害のための特に好ましいベクターは、
抗脈管形成因子（例えば、可溶性ｔｉｅ−２または可溶性Ｆｌｔ−１）の発現を
指向する。
【００６１】 （２．動物モデル） 選択された遺伝子治療ベクターが新生血管形成を含む眼の疾患の処置に有効で
ある能力を評価するために、新生血管形成（脈絡膜または網膜下のいずれか）の
ための新規のモデルを、ＶＥＧＦおよび／またはアンギオポイエチンのような脈
管形成トランスジーンを含む組換えウイルス（ｒＡＶまたはｒＡＡＶ）の網膜下
注射によって作製し得る。ＶＥＧＦのような脈管形成導入を含むｒＡＡＶおよび
ｒＡＶのベクターにより誘導される新生血管形成の程度および期間は、基部写真
、フルオレセイン血管造影および組織化学を用いて決定され得る。
【００６２】 抗脈管形成分子が上記のモデルにおける新生血管形成を予防する能力を評価す
るために、Ｄ１０−ｓＦｌｔ−１ ｒＡＡＶ（または抗脈管形成因子の発現を指
向する他の遺伝子送達ベクター）は、網膜下または硝子体内のいずれかの経路の
注射によって、眼内に注射される。一般に、この遺伝子送達ベクターの網膜下注
射を利用して、脈絡膜および内部網膜血管系の両方への送達を達成し得る。硝子
体内注射を利用してミュラー細胞および網膜神経節細胞（ＲＧＣ）に感染させ得
る。これは、抗脈管形成タンパク質を、網膜血管系へと送達する。ミュラー細胞
は、網膜に遍在し、そして治療タンパク質を網膜下空間へと分泌する。
【００６３】 そのような注射は、脈管形成因子または脈管形成因子を発現する遺伝子送達ベ
クターの投与の前、同時または後のいずれかで達成され得る。適切な時間間隔の
後、新生血管形成の阻害は、底造影、フルオレセイン血管造影、および／または
組織化学を用いて判定され得る。
【００６４】 網膜新生血管形成（例えば、酸素誘導虚血網膜症）（Ａｉｅｌｌｏら、ＰＮＡ
Ｓ ９３：４８８１，１９９６．）およびＶＥＧＦトランスジェニックマウス（
Ｏｋａｍｏｔｏら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５１：２８１，１９９７）の多
くの動物モデルが存在する一方で、より少ない数のモデルの脈絡膜新生血管形成
（例えば、Ｍｕｒａｔａら、 ＩＯＶＳ ３９：２４７４，１９９８に記載され
るようなレーザ光凝固）も存在する。脈絡膜血液供給ではなく網膜からの網膜下
新生血管形成もまたＶＥＧＦトランスジェニック動物中に観察される（Ｏｋａｍ
ｏｔｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５１：２８１，１９９７）。ＶＥＧＦ発
現の低酸素刺激は、ヒト眼科疾患における新生血管形成と相関することが知られ
る。
【００６５】 緑内障視神経障害の病理的兆候は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の選択的死であ
る（Ｎｉｃｋｅｌｌｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｊ．Ｇｌａｕｃｏｍａ ５：３４５３５６．
１９９６； Ｌｅｖｉｎ，Ｌ．Ａ．およびＬｏｕｈａｂ，Ａ．，Ａｒｃｈ．Ｏｐ
ｈｔｈａｌｍｏｌ．１１４：４８８−４９１，１９９６．； Ｋｅｒｒｉｇａｎ
，Ｌ．Ａ．，Ｚａｃｋ，Ｄ．Ｊ．，Ｑｕｉｇｌｅｙ，Ｈ．Ａ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｓ
．Ｄ．およびＰｅａｓｅ，Ｍ．Ｅ．，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１５
：１０３１−１０３５，１９９７）。最近の研究によって、ＲＧＣは、眼神経（
ＯＮ）の軸索切断のような成体ＲＧＣの軸索への損傷の後、およびヒトにおいて
緑内障および前虚血眼神経症におけるアポトーシスの特徴をもって死ぬことが示
されている（Ｎｉｃｋｅｌｌｓ，１９９６）。従って、軸索切断による眼神経へ
の障害は、多くの研究者によって、成体ＲＧＣの選択的アポトーシス細胞死のモ
デルとして使用されている。
【００６６】 成体哺乳動物におけるＯＮ切断によって生じるＲＧＣの損失は、５０％から９
０％超へと、ＲＧＣを同定するに使用される技術、眼への損傷の近さ、ならびに
動物の年齢および種に依存して変動する。例えば、逆行輸送されるトレーサーを
使用してＲＧＣを脱離するアマクリン細胞から識別した成体ラットにおける研究
において（Ｖｉｌｌｅｇａｓ−Ｐｅｒｅｚ，Ｍ．Ｐ．，Ｖｉｄａｌ−Ｓａｎｚ，
Ｍ．，Ｂｒａｙ，Ｇ．Ｍ．および Ａｇｕａｙｏ，Ａ．Ｊ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓ
ｃｉ．８：２６５−２８０，１９８８）、眼に近い（０．５〜１ｍｍ）ＯＮ切断
は、２週間までに９０％を超えるＲＧＣの損失を生じる。対照的に、ＯＮが眼か
ら１０ｍｍほどで切断された成体動物において、５４％のＲＧＣが３カ月間まで
生存した（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｉｓｓａ，Ｖ．Ｍ．Ｋ．およびＳ
ｈｅｍｉｅ，Ｓ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．１１：９４９−９６６，１９８
２．）。
【００６７】 手短には、左眼の後方極および眼神経（ＯＮ）の起源が上方一過性眼内アプロ
ーチを通じて露出される。ＯＮ硬膜鞘の長手方向の切除が行われる。次いで、Ｏ
Ｎは、この鞘の背側局面から穏やかに分離され、そして眼窩盤の１ｍｍ以内で、
眼窩内で完全に切除される。眼動脈への損傷を回避するように注意が払われる。
眼動脈は、ＯＮの下内（ｉｎｆｅｒｏｍｅｄｉａｌ）硬膜鞘に位置する。
【００６８】 遺伝子送達の後のＲＧＣ生存および死もまた、以下の２つのＯＮ損傷の２つの
選択的モデルを用いて試験され得る：１）ＯＮ破損；および（２）眼内圧の上昇
。第一のモデルにおいて、ＯＮが露出され、次いで以前に記載される１つの較正
されたピンセットを用いて後方極からおよそ１ｍｍの距離でクランプされる（Ｌ
ｉら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４０：１００４
，１９９９）；第二のモデルにおいて、慢性の中程度に上昇した眼内圧は、Ｎｅ
ｕｆｅｌｄ ら、ＰＮＡＳ １７：９９４４，１９９９に記載されるような３つ
の鞏膜外の血管の腐食によって片側に作製され得る。
【００６９】 種々の動物モデルは、光受容体変性のために利用され得る。これには、ＲＣＳ
ラットモデル、Ｐ２３Ｈトランスジェニックモデル、ｒｄマウス、およびＳ３３
４ｔｅｒトランスジェニックラットモデルが含まれる。
【００７０】 手短には、Ｓ３３４ｔｅｒトランスジェニックラットモデルにおいて、変異が
起こり、ロドプシン（光色素として作用する光受容体外側セグメントに見出され
る７回膜貫通タンパク質）のＣ末端の１５アミノ酸残基の短縮を生じる。Ｓ３３
４ｔｅｒ変異は、色素性網膜炎（ＲＰ）に罹患する患者のサブセットに見出され
るロドプシン変異に類似する。ＲＰは、遺伝性の網膜性障害の異種グループであ
り、この障害では、個体は、光受容体変性に起因した種々の速度の失明を体験す
る。多くのＲＰ患者において、光受容細胞の死は失明へと進行する。トランスジ
ェニックＳ３３４ｔｅｒラットは、正常数の光受容体とともに誕生する。変異体
ロドプシン遺伝子は、そのラットにおいて誕生後５日目において発現が開始し、
そして光受容細胞死は、誕生後１０から１５日目に開始する。トランスジェニッ
ク系統Ｓ３３４ｔｅｒ−３において、およそ７０％の外側核層は、任意の治療的
介入の非存在化で６０日までに変性した。このモデルにおける網膜変性は、動物
ごとで一致しており、そして予測可能でかつ再現性のよい率で追跡される。これ
は、光受容体核層の厚さの形態学的試験および同じ個々の動物における処置され
た眼の処置されていない（反対側の）眼に対する比較によって治療的効果につい
てのアッセイを提供する。
【００７１】 Ｓ３３４ｔｅｒラットは、ＲＰについてのモデルとして以下のように利用する
。手短には、Ｓ３３４ｔｅｒトランスジェニックラットを、二酸化炭素吸入の過
剰投与によって安楽死させ、そしてすぐに混合アルデヒド（２％ホルムアルデヒ
ドおよび２．５％グルタルアルデヒド）の混合物を用いて心臓内を灌流する。眼
を取り出し、そしてエポキシ樹脂中に包埋する。そして１μｍの厚さの組織学的
切片を、腹側中線にそって作製する。組織切片をＲＯＳおよびミュラー細胞が、
内部網状層の架橋が切片の平面を通じて連続するようにプロセシングするように
整列して、その切片が斜めにならないことを確実にし、そしてＯＮＬの厚さなら
びにＲＩＳおよびＲＯＳの長さを測定する。これらの網膜の厚さ測定を、プロッ
トし、そしてその動物についての基底網膜変性速度を確立する。網膜の厚さの評
価は以下の通りである：手短には、各層または構造の５４回の測定を、網膜切片
全体の周りの設定点で行う。これらのデータを、平均化して網膜についての単純
値を提供したか、または厚さもしくは長さの網膜を横切った分布としてプロット
した。各網膜におけるＯＮＬ厚さについての最高の３連続値もまた比較して、網
膜の任意の領域（例えば、注射部位の最も近く）が比例してより高く補充される
かどうかを決定する；これらの値のほとんどは、５４の全ての値の全体の平均よ
りわずかに高いだけであったが、全体の平均よりも、コントロール値からは異な
らなかった。従って、全体の平均を、引用したデータにおいて使用した。なぜな
ら、それは、より多くの数の平均に基づいていたからであった。
【００７２】 トランスジェニックラットの１つの特に好ましい系統であるＴｇＮ（ｓ３３４
ｔｅｒ）系統４（ｓ３３４ｔｅｒ ４と省略する）を、インビボ実験について利
用し得る。手短には、このラットモデルにおいて、変異したオプシントランスジ
ーンの発現は、これらのラットにおいて生後５日目に始まる。これは、光受容体
の漸増的死をもたらす。これらのラットは、解剖学的に正常な網膜をＰ１５まで
発達させるが、ただし、トランスジェニックではないコントロールラットよりも
わずかに増加した数の核濃縮光受容体の核が、外側核層（ＯＮＬ）に見られる。
この動物モデルにおいて、光受容細胞死の速度は、Ｐ６０まではほぼ線形であり
、４０から６０％の光受容細胞の喪失が生じる。Ｐ６０後は、細胞喪失の速度は
減少し、その後、１年までに、網膜は、一列未満の光受容体の核を残すのみとな
る。
【００７３】 （３．投与方法） 本発明の遺伝子送達ベクターは、処置、予防または阻害される疾患の型、なら
びに疾患の程度に依存して、種々の位置に眼内投与され得る。適切な場所の例と
しては、網膜（例えば、網膜疾患のため）、硝子体、または眼内のまたはその付
近の他の位置が挙げられる。
【００７４】 手短には、ヒト網膜は、かなり正確なモザイクにおいて組織される。窩におい
て、そのモザイクは、錐体の六角形のパッキングである。窩の外では、桿体は錐
体の六角形パッキングへと破壊されるが、組織化された構造が、桿体の環によっ
て囲まれるかなり均一に間隔をあけた錐体を有することを可能にする。従って、
この用語は、ヒト網膜における異なる光受容体集団に関して、錐体密度は、眼窩
くぼみにおいて最高であり、そして末梢網膜に対してかなり均一な密度で眼窩の
外側に向けて迅速に下落する（以下を参照のこと：Ｏｓｔｅｒｂｅｒｇ，Ｇ．（
１９３５）Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｙｅｒ ｏｆ ｒｏｄｓ
ａｎｄ ｃｏｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｒｅｔｉｎａ．Ａｃｔａ
Ｏｐｈｔｈａｌ．補遺 ６，１−１０３；以下も参照のこと：Ｃｕｒｃｉｏ，Ｃ
．Ａ．，Ｓｌｏａｎ，Ｋ．Ｒ．，Ｐａｃｋｅｒ，Ｏ．，Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ
，Ａ．Ｅ．ａｎｄ Ｋａｌｉｎａ，Ｒ．Ｅ．（１９８７）Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｃｏｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｎｋｅｙ ｒｅｔｉ
ｎａ：ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒａｄｉａｌ
ａｓｙｍｍｅｔｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６，５７９−５８２）。
【００７５】 網膜の所望の部分への、または他の眼の部分へのあくセ氏は、当業者には容易
に達成され得る（概して以下を参照のこと：Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｕｒｇ
ｉｃａｌ Ｒｅｔｉｎａ：Ａｄｖａｎｃｅｓ，Ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓ，ａ
ｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ｈｉｌｅｌ Ｌｅｗｉｓ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｊ．
Ｒｙａｎ編、 ｍｅｄｉｃａｌ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ，Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｃ
．Ｈｅｎｇｓｔ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ：Ｍｏｓｂｙ，ｃ１９９４．ｘｉｘ，５３４
；以下もまた参照のこと：Ｒｅｔｉｎａ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｊ．Ｒｙａｎ，ｅｄ
ｉｔｏｒ ｉｎ ｃｈｉｅｆ，．２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．：
Ｍｏｓｂｙ，ｃ１９９４．３ ｖ．（ｘｘｉｘ，２５５９ ｐ．）。
【００７６】 網膜に適用される特定のウイルスベクターの量は、均一に非常に少量である。
なぜなら、眼が比較的に自制された構造であり、そしてその薬剤がそこへと直接
注射されるからである。注射されるべき必要があるベクターの量は、処置のため
に標的化されるよう選択された細胞の眼内位置によって決定される。形質導入さ
れるべき細胞型は、処置されるべき特定の疾患の実体によって判定される。
【００７７】 例えば、単に２０μｌの容量（１０13の物理的粒子力価／ｍｌのｒＡＡＶのも
の）を、網膜下注射で使用して、黄斑および眼窩を処置し得る。５０〜１００μ
ｌのより多い注射量を使用して、ｒＡＡＶを、網膜領域の網膜下部分へと送達し
得る、おそらく、その粒子の側方への核酸の程度に依存して網膜全体へと送達し
得る。
【００７８】 １００μｌの注射は、網膜下空間への数百万の活性ｒＡＡＶ粒子を提供する。
この計算は、１ｍｌあたり１０13物理的粒子の力価に基づく。この力価のうち、
１／１０００から１／１０，０００のＡＡＶ粒子が感染性であると見積もられる
。網膜解剖学は、網膜下空間（ＳＲＳ）中に可能な注射容量を制限する。１００
μｌの注射量の最大を仮定すると、これは、ＳＲＳ中で１０8から１０9のｒＡＡ
Ｖの感染性力価を提供する。これは、単純な注射を用いてｍヒト網膜全体におい
て、約１５０×１０6の光受容体のすべてに感染させる能力を有する。
【００７９】 眼窩または黄斑に局所的に適用されるより小さな注射容量を、黄斑変性または
他の領域的網膜症の場合における疾患に罹患される領域全体に適切にトランスフ
ェクトし得る。
【００８０】 あるいは、遺伝子送達ベクターは、硝子体への眼内注射によって眼へ送達され
得る。この適用において、形質導入されるべき主要な標的細胞は、網膜神経節細
胞であり、これは、緑内障に主に罹患する網膜細胞である。この適用において、
この遺伝子送達ベクターの注射容量は、実質的により大きくあり得る。なぜなら
、その容量は、網膜下空間の解剖学に制限されない。この場合における受容可能
な投薬量は、２５μｌ〜１０００μｌに及び得る。
【００８１】 （４．アッセイ） 広汎な種々のアッセイが利用されて、投与のための適切な投薬量を判定し得、
または遺伝子送達ベクターが特定の疾患を処置もしくは予防する能力を評価し得
る。これらのアッセイのうちいくつかは、以下により詳細に説明する。
【００８２】 （ａ．網膜電計分析） 網膜電計分析を利用して、網膜への遺伝子送達投与の効果を評価し得る。手短
には、ラットを、一晩暗適合させ、次いで薄暗い赤色光に暗適合させる。次いで
、キシラジン（１３ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（８７ｍｇ／ｋｇ）の筋肉注射
で麻酔される。全視野暗順応ＥＲＧは、白色光の１０μ秒のフラッシュを用いて
惹起し、そして応答を、ＵＴＡＳ−Ｅ ２０００ Ｖｉｓｕａｌ Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＫＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて記録した。ラットの角膜
を、０．５％プロパラカイン塩酸塩の一滴を用いて麻酔し、そして瞳孔を１％ア
トロピンおよび２．５％フェニレフリン塩酸塩を用いて弛緩させる。金ワイヤル
ープを有する小さなコンタクトレンズを、両方の角膜に、２．５％のメチルセル
ロースの一滴とともに配置して角膜水和を維持する。銀ワイヤ基準電極を、眼の
間の皮下に配置し、そして基底電極を後肢において皮下に配置する。刺激を、１
０秒、３０秒および１分の間隔で、それぞれ−１．１、０．９および１．９のロ
グｃｄｍ-2の強度で提示する。応答を、４，０００のゲインで増幅させ、０．３
〜５００Ｈｚの間でフィルタリングし、そして２チャンネル上で２，０００Ｈｚ
の率でデジタル化する。３つの応答を、各強度で平均化する。ａ波を、基底から
角膜の負の方向にピークへと測定し、そしてｂ波を角膜の負のピークから主要な
角膜の正のピークへと測定する。ラットの両眼の間の差異の定量比較のために、
すべての刺激の強度からの値を、所定の動物について平均化する。
【００８３】 （ｂ．網膜組織分析） 上記および下記により詳細に記載するように、網膜組織分析もまた利用して、
網膜への遺伝子送達投与の効果を評価し得る。
【００８４】 （５．薬学的組成物） 遺伝子送達ベクターを、直接投与のために適切な薬学的製品として調製し得る
。好ましい実施形態において、そのベクターを、眼内投与のために薬学的に受容
可能なキャリアとともに混合すべきである。適切なキャリアの例は、生理食塩水
またはリン酸緩衝化生理食塩水である。
【００８５】 （寄託情報） 以下の物質をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託した。
【００８６】 名称 寄託日 受託番号 ＰＫｍ２０１ｂＦＧＦ−２ ９９年３月１１日 ＃２０７１６０ ＰＤ１０−Ｋａｎ−ＦＧＦ−２−Ｓｃ 上記の物質を、Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎがアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、 １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９，電話番号７
０３−３６５−２７００に寄託した。この寄託物は、特許手続上の微生物の寄託
の国際的承認に関するブダペスト条約の条件下で維持されるこの寄託物は、本特
許の発行後３０年の期間、または本特許の執行可能期間のいずれか長い期間にわ
たり維持される。本特許の発行に際し、この寄託物は、ＡＴＣＣから制限なしに
公に利用可能となる。
【００８７】 この寄託物は、当業者の便益のためのみに提供され、そして米国特許法第１１
２条のもとで寄託が必要であることを認めるものではない。この寄託物の核酸配
列およびそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書に
おいて参考として援用され、そして本命最初において記載される配列において誤
りがあった場合には参照されるべきである。寄託された材料を作製、使用または
販売するためには実施権（ライセンス）が必要であり得、そしてそのような実施
件は本明細書によって認められるものではない。
【００８８】 以下の実施例は、例示の目的で提供され、そして限定のために提供されるわけ
ではない。
【００８９】 （実施例） （実施例１） （ＦＧＦ−２を発現するｒＡＡＶベクターの構築） ｐＫｍ２０１ＣＭＶは、ＡＡＶクローニングベクターであって、そこでは、発
現カセット（ＣＭＶ前初期プロモーター／エンハンサーおよびウシ成長ホルモン
（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位からなる）には、ＡＡＶ−２由来の逆方向末端反
復（ＩＴＲ）配列が隣接する。手短には、ｐＫｍ２０１ＣＭＶは、改変ＡＡＶベ
クタープラスミドであるｐＫｍ２０１に由来する。このプラスミドにおいて、ｐ
ＥＭＢＬ−ＡＡＶ−ＩＴＲのアンピシリン耐性遺伝子（以下を参照のこと：Ｓｒ
ｉｖａｓｔａｖａ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８６：８０７８−８０８２）がカナマイシン耐性のための遺伝子に置き換え
られていた。ｐＣＭＶ６ｃの誘導体であるｐＣＭＶｌｉｎｋからの発現カセット
（以下を参照のこと：Ｃｈａｐｍａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１９：１９３−１９８（１９９１））（ここでは、ＢＧＨポリＡ部位が、ＳＶ４
０ターミネータに置き換えられている）を、ｐＫｍ２０１のＩＴＲの間に挿入し
て、ｐＫｍ２０１ＣＭＶを作製した。
【００９０】 ｐＫｍ２０１ｂＦＧＦ−２を、以下を、その順番でｐＫｍ２０１ＣＭＶの複数
クローニング部位へとクローニングすることによって構築した：脳心筋炎ウイル
ス（ＥＭＣＶ）内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ウシ ＦＧＦ−２ ｃＤ
ＮＡ、およびヒト成長ホルモンポリアデニル化配列。ＦＧＦ−２についてのｃＤ
ＮＡは、アミノ酸１２１をセリンからスレオニンへと、およびアミノ酸１３７を
プロリンからセリンへと変化させる２つの変異を有する。ｐＫｍ２０１ｂＦＧＦ
−２のＤＮＡ配列を図２に示し、そしてそのプラスミドを、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託した。
【００９１】 ｒＡＡＶベクター粒子を、３連のトランスフェクションプロトコルによって生
成した（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５９６−６０１，１９９
６； Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５，１９９４）。手短に
は、１０層Ｎｕｎｃｌｏｎ細胞工場（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ，Ｉｎｔ．，Ｎａｐ
ｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）において５０％コンフルエンスにまで増殖させたヒト胚
性腎臓２９３細胞を、４００μｇのヘルパープラスミドｐＫＳｒｅｐ／ｃａｐ（
Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：４７７−４８５，１９９８）、４００μｇの
ベクタープラスミド、および８００μｇのアデノウイルスプラスミドｐＢＨＧｌ
Ｏ（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏ
ｎｔａｒｉｏ）とともに、リン酸カルシウム共沈方法を用いて同時トランスフェ
クトした。同時トランスフェクション後４８時間で、培地を、アデノウイルス５
型ｄ１３１２を、感染多重度（ＭＯＩ）２で含むＩＭＤＭ ＋ １０％ ＦＢＳ
に置き換えた。感染後７２時間で、細胞をＨＥＰＥＳ緩衝液中に採集および再懸
濁し（２．５ｍｌ／皿）、そして３サイクルの凍結融解によって溶解した。細胞
残渣を１２，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって除去した。パッケージン
グされたｒＡＡＶを、２回の塩化セシウム平衡密度勾配遠心分離によってアデノ
ウイルスから精製した。残渣アデノウイルス夾雑物を５６℃で４５分間加熱する
ことによって不活化した。３つのプラスミドを本実施例におけるｒＡＡＶベクタ
ーの生成において使用したが、このｒＡＡＶ構築物と、ＡＡＶヘルパー遺伝子構
築物を１つのプラスミド上で合わせることも可能である。これは、２つのプラス
ミドを用いて２９３細胞をトランスフェクトさせることによってｒＡＡＶが生成
されることを可能にする。あるいは、このプラスミドにアデノウイルスヘルパー
遺伝子を添加して、ｒＡＡＶ粒子を作製するに必要である全てを含む単一のプラ
スミドを作製し得る。
【００９２】 ｒＡＡＶ粒子の総数を見積もるために、このウイルスストックを、ＤＮアーゼ
Ｉで処理し、そして、キャプシド化ＤＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出し
た。そして、エタノールで沈澱させた。公知の標準に対するＤＮＡドットブロッ
ト分析を用いて、力価を決定した（Ｂｌｏｏｄ ７６：１９９７−２０００，１
９９０）。
【００９３】 アデノウイルス夾雑物についてアッセイするために、２９３細胞に１０μｇの
精製ｒＡＡＶストックを感染させ、そして細胞殺傷効果の任意の兆候について追
跡した。すべてのストックは、アデノウイルス夾雑物について陰性であった（１
００ＰＦＵ／ｍｌ以上の検出レベル）。
【００９４】 野生型ＡＡＶについてのアッセイのために、２９３細胞に連続希釈のｒＡＡＶ
ストックおよびアデノウイルスｄ１３１２を感染多重度２で同時感染させた。３
日後、その細胞を採集し、３サイクルの凍結融解により溶解し、そして遠心分離
して細胞残渣を除去した。その上清を熱不活化（５６℃で１０分）し、そして２
９３細胞の新鮮なプレート（６×１０6）に、アデノウイルスｄ１３１２を感染
多重度２での存在下で感染させた。感染後４８時間で、低分子量ＤＮＡを単離し
（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：３６５−３６９，１９６７）、アガロースゲル
電気泳動に供し、そしてナイロンメンブレンに移した。このメンブレンを、ＡＡ
Ｖキャプシド領域について特異的なビオチン化オリゴヌクレオチドプローブとハ
イブリダイズさせた。野生型ＡＡＶ力価をｒＡＡＶベクターストックの最高希釈
として規定すると、陽性のハイブリダイゼーションシグナルを示した。ｒＡＡＶ
調製物は１０9ｒＡＡＶゲノムあたり、１野生型ＡＡＶゲノムより少ないものを
含んでいた。
【００９５】 （実施例２） （ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ−２での細胞の感染はＦＧＦ−２の発現を生じる
） ２９３細胞を、６ウェルプレート中で５×１０5細胞／ウェルでの感染の前日
にプレートし、そして上記の実施例１に記載のように調製したｒＡＡＶ−ＣＭＶ
−ｂＦＧＦ−２ウイルスを、エトポシド（３μＭ）を含み、および含まずに、異
なる感染多重度で感染させた。エトポシドは、ｒＡＡＶベクターの形質導入効率
を増加させることが示されている、トポイソメラーゼインヒビターである（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：５７１９−５７２３，１９
９５）。感染後４８時間で、培養上清を収集し、そして細胞を、０．５ｍＬの１
×溶解緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＮＰ４０、および０．５％デオキシコレート）中で
溶解させた。上清および溶解物中のＦＧＦ−２を、ＥＬＩＳＡ（カタログ番号Ｄ
ＦＢ００、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅｒａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に
よって製造業者の説明書に従ってアッセイした。この結果を、以下の表１に示す
。
【００９６】
【表１】 （実施例３） （ｒＡＡＶベクターの構築） （Ａ．ｐＤ１０−ｂＦＧＦ−２の構築） ｐＤ１０ ＡＡＶベクターを、ｐＤ−１０（Ｗａｎｇ，Ｘら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．７１：３０７７（１９９７）を参照のこと）のＡＡＶ遺伝子コード配列を、ｐ
Ｋｍ２０１ＣＭＶ由来のＣＭＶプロモーター、マルチクローニング部位およびＢ
ＧＨポリアデニル化配列で置換することによって構築する。手短に言うと、オリ
ゴヌクレオチド
【００９７】
【化１】 を使用して、ｐＫｍ２０１ＣＭＶからＣＭＶ発現カセットを増幅させる。このＰ
ＣＲ増幅の産物を、ＳｍａＩおよびＤｒａＩで消化し、ＥｃｏＲＶで消化したｐ
Ｄ−１０にクローニングする。この新たなベクターを、ｐＤ１０−ＣＭＶと名付
ける。
【００９８】 ｐＤ１０−ｂＦＧＦ−２を構築するために、ウシＦＧＦ−２の合成遺伝子（配
列については、米国特許第５，４６４，７７４号を参照のこと）を、ＥｃｏＲＩ
およびＳａｌＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼで処理して平滑末端化し、次いで、
ｐＤ１０−ＣＭＶのＳｔｕＩ部位にクローニングする。上記の合成遺伝子は、ウ
シＦＧＦ−２の成熟な、プロセシングされた形態をコードする。
【００９９】 （Ｂ．ＦＧＦ−２−Ｓｃを発現するｒＡＡＶベクターの構築） ｐＤ１０−Ｋ−ＦＧＦ−２−Ｓｃ（図３１を参照のこと）を、Ｓｃｉｏｓから
得た、ＦＧＦ−２全長ヒト化ウシｃＤＮＡを、カナマイシン（Ｋａｎ）耐性遺伝
子を含むｐＤ１０ベクター骨格にクローニングすることによって構築した。この
ｃＤＮＡは、実施例１に記載されるアミノ酸１２１位および１３７位での変異を
有する。手短に言うと、ＦＧＦ−２−Ｓｃ ｃＤＮＡを、酵素Ｎｄｅ１で親プラ
スミドから消化し、この末端を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そして酵素Ｓｔｕ１およびＨｉｎｄＩＩＩで消化し
たｐＤ１０−ＣＭＶベクターにクローニングした。ｐＤ１０−Ｋ−ＦＧＦ−２−
Ｓｃのヌクレオチド配列を、図３２に例示する。
【０１００】 （Ｃ．ｒＡＡＶ−ＦＧＦ−２−Ｓｃでの細胞の感染は、ＦＧＦ−２の発現を生
じる） ２９３細胞を、以下の変更を伴い、実施例２のように感染させた：４×１０ｅ
５細胞／ウェルで、１２ウェルディッシュ中にプレートし、そして全てのウェル
は、３μＭのエトポシドを含んだ。３つの異なる粒子数のＦＧＦ−２ウイルス、
および陰性コントロールＣＭＶ−ｌａｃＺウイルスを用いて、細胞を感染させた
。感染後４８時間で、組織培養培地を収集し、そして細胞を、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ
１００およびＣｏｍｐｌｅｔｅTMタンパク質インヒビター反応混液（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む、１００μｌ溶解緩
衝液中で溶解させた。培地および溶解物中のＦＧＦ−２タンパク質を、ＥＬＩＳ
Ａによってアッセイした。結果を、以下の表２に示す。
【０１０１】
【表２】 （実施例４） （ＦＧＦ５およびＦＧＦ１８を発現するｒＡＡＶベクターの構築） （Ａ．ｐＤ１０−ＣＭＶ ｒＡＡＶベクターへのＦＧＦ−５のクローニング） ＦＧＦ−５コード領域（米国特許出願第０８，６０２，１４７号を参照のこと
）を、酵素ＳａｃＩＩおよびＸｍｎＩでの消化（これは、８１４ｂｐフラグメン
トを生じる）によって、ｒＡＡＶ ｐＤ１０−ＣＭＶベクターにクローニングし
た。これにより、ＦＧＦ−５コード領域の上流にあり、かつＦＧＦ−５コード領
域と重複するＯＲＦ（ＯＲＦ−１）を除去した。次いで、このＦＧＦ−５フラグ
メントの末端を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、そしてこれを、Ｓｔｕ
Ｉで直線化したｒＡＡＶ ｐＤ１０−ＣＭＶベクターにクローニングした。この
ベクターは、バクテリオファージφＸ１７４ ＨａｅＩＩＩフラグメントの１３
５３ｂｐ挿入物を含む。
【０１０２】 ｐＤ１０−ＣＭＶ−ＦＧＦ−５ベクターを、図３に概略的に例示する。要する
に、このプラスミドは、ＣＭＶ最初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ／ｅａｒｌｙ）エン
ハンサー＋プロモーター、ＣＭＶイントロンＡ、ＦＧＦ−５コード領域、ウシ成
長ホルモンポリＡ部位、およびＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む。１つのＩＴＲとＣＭ
Ｖ最初期エンハンサー＋プロモーター領域との間のＮｏｔ１部位に、クローニン
グされたφＸ１７４バクテリオファージＤＮＡの１３５３ｂｐ挿入物が存在する
。
【０１０３】 （Ｂ．ＦＧＦ−５ ｒＡＡＶのパッケージングおよび機能的分析） ｒＡＡＶウイルスを、実施例１に記載のようにトリプルトランスフェクション
方法を使用してパッケージングした。しかし、塩化セシウム平衡密度勾配遠心分
離に代えて、硫酸ヘパリンカラムクロマトグラフィーを使用する。より詳細には
、細胞ペレットを、ＴＮＭ緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2で再懸濁する。デオキシコール酸を、０．
５％にまで添加し、細胞を溶解する。５０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼを添加し、そ
してこの溶解した細胞を３７℃でインキュベートして、いずれの核酸をも消化す
る。この細胞細片をペレット化し、そして上清を、０．４５μｍフィルター、次
いで０．２２μｍフィルターを通して濾過する。次いで、ウイルスを、Ｂｉｏｃ
ａｄ ＨＰＬＣを使用して、１．５ｍｌ硫酸ヘパリンカラム上にロードする。次
いで、カラムを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌで
洗浄する。ｒＡＡＶ粒子を、漸増濃度のＮａＣｌで形成させた勾配を用いて溶出
する。ピーク下のフラクションをプールし、そして０．２２μｍフィルターを通
して濾過し、その後、８％ ＰＥＧ８０００で一晩沈殿させる。ＣａＣｌ2を、
２５ｍＭまで添加し、そしてこの精製粒子をペレット化し、次いで、ＨＢＳ＃２
：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）中に再懸濁する
。
【０１０４】 手短に言うと、得られたＦＧＦ−５ウイルスの８×１０8または８×１０9粒子
を使用して、２９３細胞に感染させ、これを、同時に３μＭエトポシドで処理し
て、ウイルス発現レベルを増強させた。感染後２４時間で、組織培養培地および
細胞溶解物を収集し、ウェスタンブロッティングによって分析した。手短に言う
と、タンパク質サンプルを、４〜２０％のトリス−グリシン勾配ゲル上で泳動し
、標準的手順によってニトロセルロースに転写した。ＰＢＳ中５％ミルクでのブ
ロッキング後、この膜を、１：１０００希釈の抗ヒトＦＧＦ−５抗体（Ｒ ａｎ
ｄ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ヤギで作製された）と共に、室温で１時間インキュベ
ートした。この膜を、ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０中で３回洗浄した
後、この膜を、ペルオキシダーゼを結合体化させた抗ヤギ二次抗体（１：５，０
００希釈）と共にインキュベートした。次いで、この膜を洗浄し、ＦＧＦ−５タ
ンパク質を、化学発光によって検出した。
【０１０５】 ウェスタンブロットの結果を、図４に示す。手短に言うと、レーン１は、５０
ｎｇの２９．５Ｋｄ組換えＦＧＦ−５タンパク質（Ｒ ａｎｄ Ｄ ｓｙｓｔｅ
ｍｓ）を表す。レーン２は、８×１０9のウイルス粒子で感染させ、そしてエト
ポシドで処理した細胞由来の培地であり、これは、ＦＧＦ−５発現を示さない。
レーン３は、未感染細胞の溶解物コントロールであり、レーン４および５は、そ
れぞれ、８×１０8または８×１０9のウイルス粒子で感染させた細胞由来の溶解
物であり、そしてレーン６および７は、８×１０8または８×１０9のウイルス粒
子で感染させ、そして３μＭエトポシドで処理した細胞由来の溶解物である。レ
ーン４〜７は全て、陽性のＦＧＦ−５発現を示す。レーン８は、未感染細胞由来
の溶解物の陰性コントロールである。
【０１０６】 要するに、ＦＧＦ−５シグナル配列は、インタクトであるが、ＦＧＦ−５タン
パク質は、細胞溶解物中でのみ検出された。
【０１０７】 （Ｃ．シグナル配列を欠失するＦＧＦ−５のｒＡＡＶ ｐＤ１０−ＣＭＶへの
クローニング） 腫瘍形成活性は、野生型ＦＧＦ−５分子に関連する（Ｚｈａｎら、１９８８；
Ｂａｔｅｓら、１９９１）。その安全性を改善するために、ＦＧＦ−５シグナル
配列の最初の２１アミノ酸のコドンを、以下のプライマーでの、上記ｐＤ１０−
ＣＭＶ−ＦＧＦ−５プラスミドのＰＣＲ増幅によって除去した：
【０１０８】
【化２】 この５’プライマーは、ＦＧＦ−５ ｍＲＮＡのＧ／Ｃリッチヘアピン構造を不
安定化させ、遺伝子発現のレベルを増加させる、点変異を含む。このＰＣＲ産物
を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化して（制限部位は、プライマーによっ
て導入された）、そして標準的な方法によって、同酵素で消化したｐＤ１０ベク
ターにクローニングした。ｐＤ１０−ＣＭＶ−ＦＧＦ−５（ｓｉｇ−）ベクター
を、図５に概略的に例示する。
【０１０９】 要するに、ｐＤ１０−ＣＭＶ−ＦＧＦ−５（ｓｉｇ−）プラスミドは、ＣＭＶ
最初期エンハンサー＋プロモーター、ＣＭＶイントロンＡ、上記実施例Ｃに記載
された改変を有するＦＧＦ−５コード領域、ウシ成長ホルモンポリＡ部位、およ
びＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む。１つのＩＴＲとＣＭＶ最初期エンハンサー＋プロ
モーター領域との間のＮｏｔ１部位に、クローニングされたφＸ１７４バクテリ
オファージＤＮＡクローンの１３５３ｂｐ挿入物が存在する。
【０１１０】 （Ｄ．ｐＤ１０−ＣＭＶ−ＦＧＦ−５（ｓｉｇ−）でトランスフェクトした２
９３細胞のウェスタン分析） ＦＧＦ−５タンパク質の発現を、標準的な方法による、プラスミドｐＤ１０−
ＣＭＶ−ＦＧＦ−５（ｓｉｇ−）での２９３細胞の一過性のトランスフェクショ
ンによって実証した。４８時間後、組織培養培地および細胞溶解物を回収した。
ウェスタン分析を、上記のように、抗ヒトＦＧＦ−５抗体（Ｒ ａｎｄ Ｄ ｓ
ｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。
【０１１１】 ウェスタン分析の結果を、以下の図６に示す。手短に言うと、レーン１は、５
０ｎｇの２９．５Ｋｄ組換えＦＧＦ−５タンパク質（Ｒ ａｎｄ Ｄ ｓｙｓｔ
ｅｍｓ）を表す。レーン２および３は、ｐＤ１０−ＣＭＶ−ＦＧＦ−５ｓｉｇ−
プラスミドの２つの異なるクローンでトランスフェクトした２９３細胞由来の細
胞溶解物であり、これらは、ＦＧＦ−５発現を示す。レーン４は、陰性コントロ
ールプラスミドＣＭＶ−Ｅｐｏでトランスフェクトした細胞由来の溶解物である
。レーン５、６および７は、それぞれ、ｐＤ１０−ＣＭＶ−ＦＧＦ−５ ｓｉｇ
−プラスミドの異なるクローン、ならびにＣＭＶ−Ｅｐｏプラスミドでトランス
フェクトした、細胞由来の培地を示す。この図から明らかなように、ＦＧＦ−５
タンパク質は、細胞溶解物でのみ検出された。
【０１１２】 （Ｅ．ＦＧＦ−５（シグナル−）ｒＡＡＶの生成） ＦＧＦ−５（ｓｉｇ−）ｒＡＡＶウイルスを、上記でより詳細に記載したトリ
プルトランスフェクション方法を使用してパッケージングした。
【０１１３】 （Ｆ．ＦＧＦ−１８のｐＤ１０−ＣＭＶ ｒＡＡＶベクターへのクローニング
） ＦＧＦ−１８およびｐＤ１０−ＣＭＶベクターのマルチクローニング部位の両
方に見出される制限部位を使用して、ＦＧＦ−１８コード領域（米国特許仮出願
番号６０／０８３，５５３を参照のこと）を、ＰｓｔＩ〜ＥｃｏＲＶフラグメン
トとしてｐＤ１０−ＣＭＶベクターにクローニングした。このベクターは、φＸ
１７４バクテリオファージＤＮＡの１３５３ｂｐ挿入物を含む（実施例Ａを参照
のこと）。
【０１１４】 ｐＤ１０−ＣＭＶ−ＦＧＦ−１８の概略図を、図７に示す。手短に言うと、こ
のプラスミドは、ＣＭＶ最初期エンハンサー＋プロモーター、ＣＭＶイントロン
Ａ、このＦＧＦコード領域、ウシ成長ホルモンポリＡ部位、およびＡＡＶ ＩＴ
Ｒ配列を含む。１つのＩＴＲとＣＭＶ最初期エンハンサー＋プロモーター領域と
の間のＮｏｔ１部位に、クローニングされたφＸ１７４バクテリオファージＤＮ
Ａの１３５３ｂｐ挿入物が存在する。
【０１１５】 （Ｇ．ｐＤ１０−ＣＭＶ−ＦＧＦ−１８プラスミドでトランスフェクトした２
９３細胞の分析） ＦＧＦ−１８タンパク質の発現を、標準的な方法を使用して、２９３細胞の一
過性のトランスフェクション、その後のウェスタン分析によって評価した。細胞
溶解物および組織培養培地を、トランスフェクション後４８時間で回収した。組
換えＦＧＦ−１８由来の選択されたポリペプチドに対して生成された、抗ペプチ
ドＦＧＦ−１８ウサギポリクローナル抗体を、室温で１時間、１；２，５００の
希釈度で使用した。二次抗体（ペルオキシダーゼに結合体化された抗ウサギＩｇ
Ｇ）を、１：２５，０００の希釈度で使用した。
【０１１６】 ウェスタン分析の結果を、図８に示す。手短に言うと、レーン１〜３は、ｐＤ
１０−ＣＭＶ−ＦＧＦ−１８プラスミドでトランスフェクトした細胞由来の、１
μｌ、２μｌおよび１０μｌの組織培養培地を示す。レーン４はブランクである
。レーン５、６および７は、このトランスフェクトされた細胞由来の２μｌ、１
０μｌおよび２０μｌの溶解物を含む。レーン８および９は、陰性コントロール
；それぞれ、未感染細胞由来の、２０μｌの組織培養培地および細胞溶解物であ
る。レーン１０は、陽性コントロール；ＦＧＦ−１８−マルトース結合タンパク
質融合体（（ＭＢＰ）；推定サイズ＝８０Ｋｄ、ＦＧＦ−１８タンパク質より大
きい）を含む。
【０１１７】 （Ｈ．ｐＤ１０ＣＭＶ−ＦＧＦ−１８プラスミドのｒＡＡＶ粒子へのパッケー
ジング） ＦＧＦ−１８ ｒＡＡＶウイルスを、トリプルトランスフェクション方法によ
って生成した。
【０１１８】 （実施例５） （網膜へのＡＡＶ−ＬａｃＺの注入） （Ａ．ｒＡＡＶの網膜下注入） 白色Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、出生後１４〜１５日（Ｐ１４〜
Ｐ１５）で注射した。動物を、ケタミン／キシラジン注射によって麻酔し、そし
て局所麻酔（塩酸プロパラカイン）を、角膜に局所的に適用した。２８ゲージ針
を用いて、眼の角膜下を通る開口を作製した。次いで、２〜３μｌのＡＡＶ−Ｃ
ＭＶ−ＬａｃＺの網膜下注入を、その開口部に平滑な３２ゲージ針を挿入し、網
膜の後ろの網膜下の空間にｒＡＡＶ懸濁物を送達することによって行った。対側
の眼には、注入しないか、ＰＢＳを網膜下注入するか、またはレポーター遺伝子
を含むコントロールｒＡＡＶを網膜下注入するかの、いずれかであった。
【０１１９】 （Ｂ．染色プロトコル） 網膜の凍結切片を、ｌａｃＺのβ−ガラクトシダーゼ反応産物について、Ｂｌ
ｕｏ−ｇａｌで染色した。試験した全ての野生型ラットにおいて（３）、陽性染
色が、全試験での眼杯（ｅｙｅ ｃｕｐ）全体の内部で明らかであった（図９を
参照のこと）。１００μｍ厚のアガロースまたは２０μｍ厚の網膜凍結切片によ
り、ほとんどのｂ−ｇａｌの陽性染色が、光受容体に局在することを示された。
少数のＬａｃＺ陽性の網膜神経節細胞が観察された。
【０１２０】 （Ｃ．抗βガラクトシダーゼ免疫細胞化学） ３匹の野生型ラットおよび２匹のトランスジェニックラット由来の切片を、β
−ガラクトシダーゼに対するポリクローナル抗体で染色した。これらの結果は、
ｂｌｕｏ−ｇａｌの結果と比較可能であり、主に、光受容体特異的染色を示した
。５匹のラットのうち２匹が、陽性染色を示さなかった。
【０１２１】 （Ｄ．結果） ２μｌのＡＡＶ−ＣＭＶ−ｌａｃＺの網膜下注入は、ラットの眼の網膜下空間
（ＳＲＳ）へのＡＡＶ−ＣＭＶ−ｌａｃＺの単回の眼内播種後に、多くの光受容
細胞および網膜色素上皮（ｒｐｅ）細胞を効果的に形質導入した。ｌａｃＺレポ
ーター遺伝子発現の側方拡大は、単回のＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺ注入後で、代
表的に網膜の拡大の１／３〜１／２であった。この知見は、ｌａｃＺ遺伝子のβ
−ガラクトシダーゼ反応産物のｂｌｕｏ−ｇａｌ染色によって、およびβ−ガラ
クトシダーゼに特異的な抗体を使用する免疫細胞化学によって確認された。ＡＡ
Ｖ−ＣＭＶ−ｌａｃＺベクターは、正常（野生型）ラット網膜および罹患した変
性（トランスジェニック）ラット網膜における、光受容細胞およびＲＰＥ細胞の
形質導入に効果的である。
【０１２２】 （実施例６） （ｒＡＡＶ−ＦＧＦ−２感染細胞 対 コントロールの網膜組織分析） （Ａ．ｒＡＡＶの網膜下注入） 白色Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙバックグラウンド（Ｃｈｒｙｓａｌｉｓ
ＤＮＸ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ
によって作製された）に対する、系統３白色トランスジェニックラット（Ｐ２３
Ｈ−３）に、Ｐ１４齢またはＰ１５齢で注入した。動物を、ケタミン／キシラジ
ン注射によって麻酔し、そして局所麻酔（塩酸プロパラカイン）を、角膜に局所
的に適用した。２８ゲージ針を用いて、眼の角膜下を通る開口を作製した。次い
で、２μｌの網膜下注入を、その開口部に平滑な３２ゲージ針を挿入し、網膜の
後ろの網膜下の空間にｒＡＡＶ懸濁物を送達することによって行った。この意図
は、後上方の半球の網膜下空間へ注入することであったが、本発明者らは、時折
、その注入部位が、視神経乳頭の直ぐ下方に位置することを、組織学的に見出し
た。対側の眼には、注入しないか、ＰＢＳを網膜下注入するか、またはニューロ
トロフィンを含まないか、または神経栄養特性を有することが公知でないタンパ
ク質を含むコントロールｒＡＡＶを網膜下注入するかの、いずれかであった。
【０１２３】 （Ｂ．組織病理学的プロトコル／網膜組織分析） ラットを、過量の二酸化炭素吸入によって安楽死させ、そして直ちに、混合ア
ルデヒド（２％ホルムアルデヒドおよび２．５％グルタルアルデヒド）の混合物
を心臓内に灌流した。眼を取り出し、エポキシ樹脂で包理し、そして１μｍ厚の
組織学的切片を、垂直方向の経線に沿って作製した。内網状層を通過するＲＯＳ
細胞およびＭｕｅｌｌｅｒ細胞突起が、切片平面にわたって連続的であり、切片
が斜めにならないことを確実にするように、組織切片を整列した。そしてＯＮＬ
の厚さならびにＲＩＳおよびＲＯＳの長さを、記載（ＬａＶａｉｌら）のように
測定した。手短に言うと、網膜切片全体周囲の設定点で、各層または構造の５４
の測定を行った。これらのデータを、平均化して網膜について単一の値を提供す
るか、網膜の厚さまたは長さの分布としてプロットするかの、いずれかを行った
。本発明者らはまた、各網膜におけるＯＮＬ厚についての最も高い３つの連続す
る値を比較して、網膜の任意の領域（例えば、注入部位に最も近接する）が、比
例的により大きいレスキューを示すか否かを決定した；これらの値の多くが、５
４の全ての値の全体の平均よりもわずかに大きいが、これらは、全体の平均より
むしろコントロール値と差異がなかった。従って、全体の平均を、引用されたデ
ータにおいて使用した。なぜなら、これは、より多数の測定に基づくからである
。
【０１２４】 （Ｃ．結果） ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ２の送達の２つの外科的方法を、硝子体内注入およ
び網膜下注入で完了した。
【０１２５】 （１．硝子体内注入） Ｐ１５日後の９匹のトランスジェニックＳ３３４ｔｅｒラットの右眼に、ｒＡ
ＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ−２を注入した（左眼には、注入しなかった）。Ｓ３３４
（４）トランスジェニック動物を使用して、硝子体内注入によって送達された場
合の、光受容細胞の変性に対するｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ−２のレスキューの
効果を評価した。ラットを、ｐ６０齢で全て屠殺し、そしてプラスチックで包理
し、そして切片化して、外側核層の厚さの保存によってアッセイされるように、
形態および治療効果を評価した。眼杯の上方領域および下方領域を、ＢｉｏＱｕ
ａｎｔ形態学測定システム（ＢｉｏＱｕａｎｔ）を使用して、ＯＮＬ厚を測定す
ることによって定量した。注入した眼を、注入していないコントロールの眼と共
に評価した。
【０１２６】 コントロール左上方 − １６．５２＋／−２．７７μｍ 注入した右上方 − １９．７１＋／−５．２７μｍ コントロール左下方 − ２２．６４＋／−２．１１μｍ 注入した右下方 − ２６．４７＋／−３．５５μｍ。
【０１２７】 これらの結果に基づいて、硝子体腔へ硝子体内送達された場合に、ＡＡＶ−Ｃ
ＭＶ−ＦＧＦ−２のレスキュー効果が存在することが明らかになった。
【０１２８】 （２．ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ−２の網膜下注入） 実験Ａ−注入部位−網膜下、７匹のラット−右眼および左眼の両方に注入、お
よび３匹のラット−（左眼＝注入しない）。注入したラットの数−１０匹のラッ
ト（全て、注入する日でｐ１５の野生型ラット）。ラットの屠殺を、２週目に開
始し、１匹ずつ毎週行った。ＦＧＦ−２の発現を、炎症または血管新生のいかな
る徴候と共に評価した。
【０１２９】 実験Ｂ−注入部位−網膜下、５匹のラット−右眼にｗ／ベクターを注入し、左
眼にＰＢＳを注入、および４匹のラット−右眼にｗ／ベクターを注入（左眼＝注
入しない）。注入したラットの数−１１匹のトランスジェニックＳ３３４（４）
ラット−全て、注入する日でｐ１５であった。ラットの屠殺を、２週目に開始し
、１匹ずつ毎週行った。ラットを、ｐ６０齢で全て屠殺し、そしてプラスチック
で包理し、そして切片化して、組織病理学および生存光受容細胞の数を評価した
。
【０１３０】 治療効果（光受容体レスキュー）の解剖学的指標を、組織学的に評価した。手
短に言うと、ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ２を注入した眼は、同じ動物の注入して
いない対側のコントロールの眼より、Ｐ６０、Ｐ７５およびＰ９０でより多くの
光受容体を有意に保持した。Ｐ１４〜１５でＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ２の網膜下
注入を受けた網膜は、正常なＯＮＬ厚の７１％を保持し、これに対して注射して
いないコントロールでは約４７％であった（図１１、１２、１３および１４を参
照のこと）。
【０１３１】 ＰＢＳ注入したコントロール眼においては、ほとんど、または全くレスキュー
が存在しなかった（全ての場合において、ｐ＞０．１６９）。これは、若齢ラッ
ト（Ｐ１４〜Ｐ１５）の網膜への針の損傷が、光受容体をレスキューしないか、
またはｂＦＧＦ ｍＲＮＡ発現を上方調節するという以前の報告と一貫する。
【０１３２】 （３．ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ２の網膜下注入） ２〜３μｌのｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ−２ベクターを、Ｐ１４またはＰ１５
で、光受容体と隣接する網膜色素上皮との間の網膜下空間に注入した。ラットを
屠殺し、そして眼をＰ６０〜Ｐ９０の間の時点で試験した。これらの齢でのＳ３
３４ｔｅｒラットの注入していないコントロール眼において、ＯＮＬ厚（これは
、光受容細胞数の指標である）は、正常の約６０％に減少した。
【０１３３】 解剖学的レスキューの証拠は、ＡＮＯＶＡ（分散統計学的測定の分析）によっ
て、コントロールＡＡＶベクターまたはＰＢＳの偽注入と比較した場合、ｒＡＡ
Ｖ−ＣＭＶ−ＦＧＦ−２によってトランスフェクトされた網膜において、ｐ＝．
００５の信頼水準までに有意であった。ＪＭＰ統計学的分析ソフトウェア（Ｃｏ
ｐｙｒｉｇｈｔ（ｃ）１９９９ ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．Ｃａｒ
ｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ）。
【０１３４】 （実施例７ ｒＡＡＶ−ＦＧＦ−２感染細胞の抗体染色） （Ａ．注射プロトコル） 白色（ａｌｂｉｎｏ）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ｐ１４またはｐ
１５の年齢）に、基本的には以下のように、ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ−２を注
射した。簡単には、野生型の動物をケタミン／キシラジン注射によって麻酔し、
そして局所麻酔薬（塩酸プロパラカイン）を角膜に局所的に適用した。開口を、
２８のゲージ針を用いて眼の下方角膜を貫いて作製した。次いで、２〜３μｌの
ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ−２の網膜下注射を、開口を介した鈍い３２ゲージ針
の挿入、およびｒＡＡＶ懸濁液の網膜の後方の網膜下領域への送達によって行っ
た。対側性の眼は、注射されないか、ＰＢＳ、野生型ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ−
ＣＭＶ−ｌａｃＺで網膜下に注射されるかのいずれかであった。
【０１３５】 （Ｂ．染色プロトコル） 固定されたアイキャップ（ｅｙｅｃｕｐ）を、ＯＣＴ内に包埋し、そして２０
μｍの厚さの切片に凍結切片化した。１０ｗｔのラット由来の切片をＦＧＦ−２
に対する抗体で染色した（第１の抗ＦＧＦ−２ １：５００（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔ
ｅｍｓより市販の抗体）（第２の抗ヤギＣｙ３共役体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ．ＭＯ））。
【０１３６】 （Ｃ．結果） 免疫組織学を使用して、眼におけるＦＧＦ−２の発現を調べた。２匹のラット
を、注射後３週間で１週間毎に染色し試験した。ＦＧＦ−２の発現について網膜
を試験し、そしてまた炎症または新生血管形成の徴候について組織病理学的に示
試験した。
【０１３７】 結果を図１５に示す。簡単には、網膜光受容細胞ならびにＲＰＥ細胞において
２〜３μｌのｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ−２での接種後３５日に、ＦＧＦ−２の
発現を見出した。網膜下領域（ＳＲＳ）への注射後の網膜双極性介在ニューロン
および網膜神経節細胞（ＲＧＣ）において、より顕著でない発現を注意した。バ
ックグラウンドより高い有意な染色を、ＰＢＳまたはｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ｌａｃ
Ｚベクターを注射した切片において観察した。
【０１３８】 （実施例８ ｒＡＡＶ−ＦＧＦ−５およびｒＡＡＶ−ＧＦＧ−１８で感染した
細胞 対 コントロール の網膜組織の分析） （Ａ．ｒＡＡＶの網膜下注射） 白Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙバックグランドについての４系統の白トラン
スジェニックラット（Ｓ３３４ｔｅｒ−４）（Ｃｈｒｙｓａｌｉｓ ＤＮＸ Ｔ
ｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪより作製さ
れる）を、ｐ１５齢で注射した。動物をケタミン／キシラジン注射で麻酔し、そ
して局所麻酔（塩酸プロパラカイン）を角膜に局所的に適用した。開口を、２８
ゲージ針を用いて眼の下方角膜を通じて作製した。次いで、２．５μｌの網膜下
注射を、鈍い３２ゲージ針を開口を通じて挿入し、そしてｒＡＡＶ懸濁液を後方
網膜の網膜下領域に送達することによって行った。対側性の眼は、注射されない
か、ＰＢＳで網膜下に注射されるか、ニューロトロフィンを含まないコントロー
ルｒＡＡＶを注射されるか、または神経栄養性の特徴を有することが公知でない
タンパク質を含むコントロールｒＡＡＶで注射されるかのいずれかである。
【０１３９】 （Ｂ．組織病理学プロトコル／網膜組織分析） ラットを過量の二酸化炭素吸入によって安楽死させ、そして混合アルデヒド（
２％ホルムアルデヒドおよび２．５％グルタルアルデヒド）の混合物で心臓内を
（ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｌｌｙ）直ちに灌流した。眼を除去し、そしてエポキ
シ樹脂内に包埋し、そして垂直の経線に沿って１μｍの厚さの組織学的切片を作
成した。組織切片を整列させ、その結果、ＲＯＳおよびＭｕｌｌｅｒ細胞（横断
および内部叢状層を有する）は切片の平面に渡って連続し、この切片が傾斜して
いないことを保証し、そしてＯＮＬの厚さを（Ｌａ Ｖａｉｌら、１９ＸＸ）に
記載されるように測定した。簡単には、各層または構造の５４の測定を全体の網
膜切片の周囲に設定された点で行った。網膜の下方領域および上方の領域からの
２７の測定を別々に平均し、各眼について２つの値を得た。網膜は、Ｓ３３４ｔ
ｅｒ−４動物モデルのこれら２つの領域において異なる割合で変性するのでこの
分離を行った。
【０１４０】 （Ｃ．結果） ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ−５およびｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ−１８の両方
の網膜下注射を行った。
【０１４１】 （１．ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ−５の網膜下注射） 実験。−注射の位置−網膜下、３匹のラット−右眼（ｗ／ベクターを注射され
た）左眼（ＰＢＳを注射された）、８匹のラット−右眼（ｗ／ベクターを注射さ
れた）左眼（ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺを注射された）、４匹のラットｓ−右
眼（ｗ／ベクターを注射された）（左眼＝注射されていない）。注射されたラッ
トの数−１５匹のトランスジェニックＳ３３４ｔｅｒ−４ラット−全ては、注射
の日にｐ１５であった。ラットをｐ６０齢で屠殺した。網膜をプラスチックに包
埋し、そして組織病理学および生存する光受容細胞の数を評価するために切片化
した。
【０１４２】 治療効果（光受容体のレスキュー）の解剖学的徴候を組織学的に評価した。ｒ
ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ−５の注射は、光受容体の有意なレスキューを生じた（
ＰＢＳを注射された眼、ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺを注射された眼、および注
射されていない眼と比較して）（図３３を参照のこと）。ＡＮＯＶＡ（Ｖａｒｉ
ａｎｃｅ統計学的測定の分析）によって、このレスキューは、ｐ＝０．５の信頼
できるレベルまで、３つの比較の全てに対して有意であった。ＪＭＰの統計学的
分析ソフトウェア（著作権（ｃ）１９９９年ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎ
ｃ．Ｃａｒｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡ）。
【０１４３】 （２．ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ−１８の網膜下注射） 実験。−注射の位置−網膜下、３匹のラット−右眼（ｗ／ベクターを注射され
た）左眼（ＰＢＳを注射された）−３匹のラット−右眼（ｗ／ベクターを注射さ
れた）左眼（ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺを注射された）、４匹のラット−右眼
（ｗ／ベクターを注射された）（左眼＝注射されていない）。注射されていない
ラットの数−１０匹のトランスジェニックＳ３３４ｔｅｒ−４ラット−全てはｐ
、注射の日にｐ１５であった。ラットをｐ６０で屠殺し、そして網膜をプラスチ
ックに包埋し、そして切片化した。
【０１４４】 ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＧＦ−１８を注射された眼は、有意に多い光受容体をｐ
６０で保持した（ＰＢＳを注射された眼、ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺを注射さ
れた眼、または注射されていないコントロール眼よりも）。ＡＮＯＶＡによる各
比較は、ｐ＝０．５の信頼できるレベルまで統計的に有意であった。
【０１４５】 （実施例９ 網膜神経節細胞（ＲＧＣ）のインビボ送達） （Ａ．ＡＡＶベクターの硝子体内注射） 全ての外科的手順は、雌性成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１８０
〜２００ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｅｒｓ）において、一般
的な麻酔下（７％抱水クロラール；０．４２ｍｇ／体重ｇ、腹腔内）で行われた
。この麻酔はＵｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ
Ｒｅｓｅｒｃｈ ａｎｄ ＭｃＧｉｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ
Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕ
ｓｅ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｉｍａｌｓに従う。
【０１４６】 簡単には、ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ｌａｃＺ（５μｌ；上記を参照のこと）を網膜
の上方（背側）の半球内の硝子体腔に、（Ｄｉ Ｐｏｌｏ、ＰＮＡＮ、１９９８
）記載されるような後のアプローチを使用して注射した。コントロール眼は、等
量Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ、ウイルスベクター）を注射した。
【０１４７】 （Ｂ．ＲＰＣの同定） ＲＧＣの可視化のために、ニューロンを、以下のように逆方向に標識した。（
Ｖｉｄａｌ−Ｓａｎｚら、１９８８）に記載されるように、分析の７日前にトレ
ーサの両方の上方の丘への適用によって、１０％ジメチルスルホキシドを含む０
．９％のＮａＣｌ中の２％の蛍光トレーサＦｌｕｏｒｏｇｏｌｄ（Ｆｌｕｏｒｏ
ｃｈｒｏｍｅ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、ＣＯ）で、標識した。次いで、麻酔したラ
ットを０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ７．４）中の４％のパラホルムアルデ
ヒドで心臓内で灌流し、そして眼を直ちに除核した。眼の腹側部分およびレンズ
を除去し、そして残りのアイカップを、同じ固定剤に２時間、４℃で漬けた。ア
イカップを段階的なショ糖溶液（ＰＢ中１０〜３０％）で、数時間、４℃で凍結
保護し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ，Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）内に包埋し、そして２−メチルブタン
／液体窒素浴中で凍結した。眼の垂直経線に沿って得た網膜の橈側の凍結切片（
１２〜１５μｍ）を、ゼラチンでコーティングしたスライド上に収集し、そして
免疫細胞組織化学に関してプロセスした。あるいは、全体の眼をＰＢＳで３回、
室温で穏やかに攪拌しながらリンス（各１５分間）し、以下に記載されるような
全体の封入の組織化学的染色のためにリンスした。
【０１４８】 （Ｃ．組織化学的分析） 網膜全体における細菌ＬａｃＺ遺伝子の発現を、ハロゲン化インドキシル（ｉ
ｎｄｏｙｌ）−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｂｌｕｏｇａｌ；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）
を使用する標準組織化学染色反応によって検出した。前側の眼の構造およびレン
ズの除去後、アイカップを一晩、５ｍＭ Ｋ−フェリシアニド、５ｍＭ Ｋ−フ
ェノシアリド、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、および０．５ｍｇ／ｍｌ Ｂｌｕｏ−ｇａ
ｌを含む染色溶液中で３７℃でインキュベートした。次いで網膜を解剖し、さら
に３０分間固定し、そして平らにマウントされた硝子体の側面をガラススライド
上に挙げた。
【０１４９】 網膜の橈側の切片におけるＡＡＶ媒介性ｌａｃＺ遺伝子産物の可視化のために
、凍結切片を０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕ
ｉｓ、ＭＯ）中１０％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）中）で、３０分間室温でインキュベートし、非特異的結合をブロックした。
ｌａｃＺ遺伝子産物に対して惹起した２つの第１抗体を、同様の結果に使用した
。ポリクローナル抗ｂｅｔａｇａｌ抗体（１：１０００に希釈；５ ｐｒｉｍｅ
→３ ｐｒｉｍｅ、Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｄｅｒ、ＣＯ）およびモノクローナル抗体
ＬａｃＺ抗体（１：５００に希釈；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。
第１抗体を、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中の２％ＮＧＳに添加し、そし
て４℃で一晩インキュベートした。引き続いて切片を、抗ウサギＣｙ３結合Ｉｇ
Ｇ（１：５００に希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅ
ｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）、または抗マウスＣｙ３結合ＩｇＧ（１：５００に希
釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｃｈ）でプロセスし、そしてマウ
ントした。コントロール切片を同じ様式で処理したが、しかし第１抗体を省略し
た。切片を蛍光顕微鏡（Ｐｏｌｙｖａｒ、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ）によっ
て可視化した。
【０１５０】 網膜における硫酸ヘパリンプロテオグリカンレセプターの発現を、モノクロー
ナル抗硫酸ヘパリン抗体を使用して試験した（ＨｅｐＳＳ−１、１：１，０００
に希釈、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａ
ｎ）。４℃で一晩のインキュベーションの後、切片をビオチン化抗マウスＦａｂ
フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、アビジン−
ビオチン−ペルオキシダーゼ試薬（ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ
ｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）でプロセスし、以下を含む溶液中で、５分間
の反応が続いた；０．０５％ジアミノベンジジンテトラハイドロクロライド（Ｄ
ＡＢ）および０．０６％過酸化水素（ＰＢ（ｐＨ７．４）中）。Ｆｌｕｏｒｏｇ
ｏｌｄ標識ニューロンおけるヘパラン硫酸の共局在化の分析のために、第１抗体
中での培養後、切片をＣｙ３結合抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏｒｅｓｅａｒｃｈ）でプロセスした。全ての場合において、第１抗体をコント
ール切片において省略した。切片をマウントし、そして光学顕微鏡または蛍光顕
微鏡によって可視化した。
【０１５１】 網膜扁平マウント（ｆｌａｔ−ｍａｏｕｎｔ）の神経節細胞層におけるＡＡＶ
形質導入細胞の定量化を、以下の２つの方法で行った：ｉ）各網膜四分円（上方
、下方、側頭および鼻側）のＢｌｕｏ−ｇａｌ陽性細胞の全体数を数えることに
よって；およびｉｉ）各四分円の３つ標準領域（視神経円板から１ｍｍ、２ｍｍ
および３ｍｍで）の細胞の数を以前に記載されたように数えることによって（Ｖ
ｉｌｌａｇａｓ−Ｐｅｒｅｚら、１９９３）。
【０１５２】 網膜橈側切片におけるＦｌｕｏｒｏｇｏｌｄ、Ｂｌｕｏ−ｇａｌまたはＨｅｐ
ＳＳ−１陽性細胞の定量化のために、標識細胞／切片の全体数を蛍光顕微鏡下で
数えた。４〜５の連続する切片／眼を従来的に数え、そして平均値／動物を得た
。続いて全体の実験群についての平均値を算出した。この実験群は、４〜５匹の
ラットからなる。結果を、学生の試験（対の群）によってＳｉｇｍａｓｔａｔプ
ログラム（Ｊａｎｄｅｌ、Ｓａｎ Ｒａｆａｅｌ Ｍａｄｅｒａ，ＣＡ）を使用
して分析した。
【０１５３】 （Ｄ．結果） ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ｌａｃＺの１度の硝子体内注射を受けた眼由来の網膜の分
析は、全体のＧＣＬの至るところに多数のＬａｃＺ陽性細胞を示した。扁平マウ
ント（図１６Ａ）および橈側切片（図１６Ｂ）の両方の組織化学的ＬａｃＺ染色
によって評価された時に示した。多くの場合において、ＡＡＶによって形質導入
されたＲＧＣは、はっきりと同定され得る。なぜなら、ＬａｃＺ反応産物は、そ
れらの軸索（視覚神経頭部のレベルで集束する）を満たされたからである。さら
に、ＬａｃＺ陽性光受容体核を観察したが、注射部位の近傍をいつも制限したわ
けではなかった（示さず）。ウイルスベクターを注射されたコントロール眼にお
いて染色は観察されなかった。ウイルスベクターに対する細胞毒性損傷または細
胞免疫応答の徴候は、試験された網膜のいずれにおいても観察されなかった。
【０１５４】 網膜扁平マウントのＧＣＬにおけるＬａｃＺ陽性細胞の定量化は、ｒＡＡＶ−
ＣＭＶ−ｌａｃＺベクターの硝子体内への注射後に、２と４週間との間で２．８
倍の増加を実証した（図１７）。例えば、本発明者らは、２７，５６９±７，６
４６細胞／網膜（平均±Ｓ．Ｄ．；ｎ＝３）および７９，０４３±１０，３２１
細胞／網膜（ｎ＝４）を見出した。これらは、それぞれベクターの眼内投与の後
、２および４週間でＬａｃＺ遺伝子産物を発現する。４週間でＡＡＶ媒介トラン
スジーンを発現する匹敵する数の細胞を、ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ｌａｃＺの注射後
、８週間（７０，２２１±１２，５００；ｎ＝３）で観察した。ＬａｃＺ陽性細
胞の大部分は、上方の半球において、ウイルスの投与後２週間で観察されたが、
これらの時点で全ての網膜四分円におけるＬａｃ−Ｚ陽性細胞密度の定量化によ
って評価されたような４および８週間によって全体の網膜に渡っての頑強なトラ
ンスジーン発現はなかった（図１７）。
【０１５５】 ＡＡＶ媒介ＬａｃＺ遺伝子産物の細胞局在化を同定するために、本発明者らは
、ＬａｃＺの免疫組織化学染色を、ＲＧＣ体の逆方向の追跡（上方の丘からのＦ
ｌｕｏｒｏｇｏｌｄバック標識を使用する）と組み合わせた。２重標識実験は、
ＬａｃＺ遺伝子産物を発現するＧＣＬにおける大多数の細胞はまた蛍光陽性であ
ったこと示した（図１８）。ＬａｃＺ遺伝子産物を発現するＧＣＬにおいてＦｌ
ｕｏｒｏｇｏｌｄ標識細胞の数の分析は、以下のことを示した。３００±２９（
平均±Ｓ．Ｄ．；ｎ＝４）が、３３０±３２ Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄ標識細胞（
平均ＲＧＣ集団／網膜橈側切片）から両方のマーカーを発現したことを示した。
これは以下のことを示す。Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄ標識によって同定されたＲＧＣ
の約９２％はまた、ＡＡＶ媒介ＬａｃＺ遺伝子産物を発現したことを示す（図１
９）。試験した全ての網膜において、本発明者らは、Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄで標
識されてなかった多くのＬａｃ−Ｚ陽性細胞を日常的に観察した（図１８および
図１９）。従って、これらの細胞がアマクリン細胞マーカーまたはＲＧＣ（逆方
向のトレーサを取り込むのに失敗した）と置換することは可能である。総合して
、これらの結果は以下のことを示す。ＲＧＣが組換えＡＡＶによって、このウイ
ルスベクターの硝子体内注射後に、優先的に形質導入されることを示す。
【０１５６】 ＡＡＶによるＲＧＣの優先的な形質導入の根底にある分子機構を研究するため
に、本発明者らは、初めにヘパラン硫酸プロテオグリカンの発現を試験した。プ
ロテオグリカンは、成体網膜におけるＡＡＶの付着および標的細胞の感染の両方
を媒介する（Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄら、１９９８）。ヘパラン硫酸（ＨｅｐＳＳ
−１）に対する特定の抗体での網膜橈側切片の免疫染色は、ＧＣＬにおける頑強
な染色を示した（図２０）。陽性免疫標識は、繊維層においてニューロン細胞体
および軸索束の両方において明瞭に可視化した。より拡散した、そして低密度な
染色を、内側の核層においていくつかの光受容体核および細胞において観察した
。染色は、第１抗体が省略されたコントロール網膜切片において観察されなかっ
た（データ示さず）。
【０１５７】 ヘパラン硫酸プロテオグリカンレセプターを発現するＧＣＬ内の細胞型を決定
するために、本発明者らは、２重標識研究を行った。この研究において、初めに
ＲＧＣは、上方の丘から逆方向に標識され、続いてＨｅｐＳＳ−１での網膜切片
の免疫染色をした。本発明者らの分析は、以下のことを示した。ＧＣＬにおける
２９９±２３（平均±Ｓ．Ｄ．；ｎ＝４）細胞が、Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄおよび
ＨｅｐＳＳ−１マーカーの両方を、３１５±３４のＦｌｕｏｒｏｇｏｌｄ標識細
胞から発現した。これは、可視化されたＲＧＣ集団／網膜橈側切片の平均を表す
。ヘパラン硫酸プロテオグリカンレセプターを発現する多数のＲＧＣ（約９５％
）は、ＡＡＶ媒介トランスジーン産物を発現するＲＧＣの数と非常に関連した（
約９２％）。総合すると、これらのデータは、以下のことを示す。組換えＡＡＶ
によって成体ＲＧＣの優先的な形質導入は、これらのニューロンで発現されたヘ
パラン硫酸プロテオグリカンレセプターによって媒介された。
【０１５８】 （実施例１０ 脈管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）１６５を発現するｒＡＡＶベク
ターの構築） ヒトＶＥＧＦ−１６５ｃＤＮＡは、ＰＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ Ｔｏｐｏ Ｖｅ
ｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からｐＤ１０−ＣＭＶベクターへ、ＥｃｏＲ
１フラグメント（ｐＤ１０−ＶＥＧＦｕｃ）としてクローン化された。ｐＤ１０
−ＶＥＧＦｕｃベクターは、図２１に概要的に図解され、そしてそのヌクレオチ
ド配列は図２２に示される。ＶＥＧＦｕｃ ｒＡＡＶウイルスを、３重のトラン
スフェクション方法を使用してパッケージングし、そしてカラムクロマトグラフ
ィーによって精製した。
【０１５９】 簡単には、細胞ペレットをＴＮＭ緩衝液に際懸濁する：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2。細胞を溶解するため
に、デオキシコール酸を０．５％まで添加する。５０μ／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａ
ｓｅを添加し、そして溶解された細胞を３７度でインキュベートし、任意の核酸
を消化する。細胞細片をペレット化し、そしてその上清を０．４５μｍのフィル
ター、次いで０．２２μｍのフィルターを通してフィルター濾過した。次いでウ
イルスを、Ｂｉｃａｄを使用するヘパリン硫酸カラムにロードした。次いでカラ
ムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄した。ｒＡ
ＡＶ粒子を、増加する濃度のＮａＣｌを用いて形成される勾配で溶出する。最高
点下の画分をプールし、０．２２μｍのフィルターを通してフィルター濾過し、
その後８％ＰＥＧ ８０００で一晩沈澱する。ＣａＣｌ2を２５ｍＭまで添加し
、そして精製された粒子をペレット化し、次いでＨＢＳ＃２（１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４）に再懸濁した。
【０１６０】 （実施例１１ Ｄ１０−ＶＥＧＦ ｒＡＡＶの２９３細胞の感染は、ＶＥＧＦ
タンパク質の発現を生じる） ウイルス粒子の機能性を、３つの異なるウイルスの感染の多重性（ＭＯＩ）を
用いた２９３細胞の感染によって評価した；１×１０ｅ７、１×１０ｅ８および
１×１０ｅ９ウイルス粒子／４×１０ｅ５ ２９３細胞、１．５μＭのエトポシ
ドの存在下。感染後４８時間に、組織培養培地（ｓｕｐｓ）および細胞溶解物を
収集した。ＶＥＧＦタンパク質のレベルをＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｈｕｍａｎ
ＶＥＧＦ ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ、図２３を参照のこと）を使用して決定した。ＶＥＧＦタンパク質の濃度
は、ｐｇ／ｍｌで与えられる。２つの最も高いＭＯＩは、ネイティブなコントロ
ールウイルスで感染された細胞よりも有意に高い値を与える。分泌されたＶＥＧ
Ｆのレベルは、溶解物のレベルよるも約４〜７倍高かった。
【０１６１】 （実施例１２ Ｄ１０−ＶＥＧＦ ｒＡＡＶを用いた網膜色素上皮（ＲＰＥ）
細胞の感染は、ＶＥＦＧタンパク質の分泌を生じる） Ｄ１０−ＶＥＧＦ １６５ ｒＡＡＶで感染された、培養された始原（または
非常に初期の継代）ヒト胎児ＲＰＥ細胞の単層におけるＶＥＧＦの発現レベルは
、内因性のレベルと比較して明確に上昇させた。細胞を０〜１×１０ｅ５／細胞
のｒＡＡＶ粒子の範囲で感染された。ＶＥＧＦ発現は容量に依存しており、時間
経過に伴い増加し、そして分泌は、先端表面よりいくらかより高いようであった
。代表的な実験において、ＲＰＥ細胞は、分泌された１×１０ｅ５ウイルス粒子
＞先端表面由来の１００ｎｇ／１×１０ｅ６細胞および基底表面由来の５０ｎｇ
／１×１０ｅ６細胞で、感染後８日に感染された。３つの異なるＭＯＩで感染さ
れたヒト胎児ＲＰＥ細胞由来のＶＥＧＦ分泌の極性は、図２４に示す。
【０１６２】 （実施例１３ ＶＥＧＦ ＲＡＶを用いた網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の感染
は、ＶＥＧＦタンパク質の分泌および減少された膜コンダクタンスを生じた） 組換えＶＥＧＦアデノウイルス（ＡＶ）と共に培養されたヒト胎児ＲＰＥ細胞
の感染は、ＲＰＥの先端および基底表面の両方由来の非常に高いレベルのＶＥＧ
Ｆの分泌を生じる。０〜１，０００または０〜１０，０００粒子／細胞のＭＯＩ
を２つの別の実験に使用した。両方の場合において、発現レベルは時間に伴い増
加し、最も高いＭＯＩで約１００〜２００μｇ／ｌ×１０ｅ６細胞で最高に達し
た（図２５を参照のこと）。さらに、ＲＰＥ単層の合計の経上皮膜抵抗性は、全
てのＭＯＩで有意に減少し、そして最も高いＭＯＩでは約４〜５倍であった（図
２６を参照のこと）。
【０１６３】 （実施例１４ 可溶性ＦＬＴ−１（ＳＦＬＴ−１）レセプターを発現するｒＡ
ＡＶベクターの構築） ｓＦｌｔ−１ ｃＤＮＡをＢｌｕｎｔ ＩＩ Ｔｏｐｏ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎ
ｖｉｔｒｅｇｅｎ）からｐＤ１０−ＣＭＶ ｒＡＡｖベクターへ、ＥｃｏＲ１フ
ラグメント（ｐＤ１０−ｓＦｌｔ−１）としてクローン化した。ｐＤ１０−ｓＦ
ｌｔ−１ベクターは、図２７に概要的に図解され、そしてそのヌクレオチド配列
は図２８に示される。ヒトｓＦｌｔ−１ ｒＡＡＶウイルスは、３重のトランス
フェクション技術を使用してパッケージングされ、そしてカラムクロマトグラフ
ィーによって精製された。
【０１６４】 （実施例１５ 抗脈管形成活性についてのインビトロアッセイ） この実施例は、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）増殖アッセイを記載する。
このアッセイを使用し、分子の抗脈管形成活性を決定し得る（一般的に、Ｇｅｒ
ｒｔｓｅｎら、１９９９．ＪＢＣ ２７４：９１１６〜９１２１を参照のこと）
。簡単には、ＨＵＶＥＣ細胞をコラーゲンでコーティングされた９６ウェルプレ
ート上に、６，０００細胞／ｃｍ2で、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ ＥＧＭ培地に播種
する。ＥＧＭ培地は、内皮細胞増殖補充、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グ
ルタミン、および抗生物質を含む。細胞は、４時間付着し得る。次いで培地を、
１×基礎培地（１％胎児ウシ血清、１×ＩＴＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０
μｇ／ｍｌのアルコルビン酸，２６．５ｍＭ ＮａＨＣＯ3、および適切な濃度
の抗生物質を補充されたＭ１９９を含む）中、４０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、４０
ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ、および８０ｎＭ ＰＭＡで置換する。細胞を、サンプル
上清またはベクターの存在下、上記の培地中で４時間培養する。サンプル上清は
、抗脈管活性について試験する分子を発現する適切なプラスミド構築物でトラン
スフェクトされた２９３細胞由来である。最終的に、５μＬ（１００μＭ）の５
−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を１００μＬ／ウェルの最終容
量に添加し、そして細胞をさらに２０時間インキュベートした。ＢｒｄＵの取り
込みを酵素連結免疫吸着アッセイキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ）によって評価した。
【０１６５】 上記より、本発明の特定の実施形態が、例示の目的のために本明細書中に記載
されたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の変更がなされ得
ることが理解される。従って、本発明は添付の特許請求の範囲を除いて限定され
ない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ｐＫｍ２０１ｂＦＧＦ−２の概略図である。
【図２】 図２は、ｐＫｍ２０１ｂＦＧＦ−２（配列番号＿＿＿）の核酸配列である。
【図３】 図３は、ｐＤ１０−ＣＭＶ−ＦＧＦ−５の概略図である。
【図４】 図４は、ＦＧＦ−５ ｒＡＡＶ感染した２９３細胞のウェスタン分析である。
【図５】 図５は、ｐＤ１０−ＣＭＶ−ＦＧＦ−５（ｓｉｇ−）の概略図である。
【図６】 図６は、ｐＤ１０−ＣＭＶ−ＦＧＦ−５（ｓｉｇ−）でトランスフェクトした
２９３細胞のウェスタン分析である。
【図７】 図７は、ｐＤ１０−ＣＭＶ−ＦＧＦ−１８の概略図である。
【図８】 図８は、ｐＤ１０−ＣＭＶ−ＦＧＦ−１８でトランスフェクトした２９３細胞
のウェスタン分析である。
【図９】 図９Ａおよび図９Ｂは、ｂｌｕｏ−ｇａｌ染色がＡＡＶ−ＣＭＶ−ｌａｃＺで
トランスフェクトした網膜の４０％を超えて見られることを示す写真である。
【図１０】 図１０は、眼内の網膜および網膜内の細胞の組織を示す概略図である。
【図１１】 図１１Ａおよび図１１Ｂは、野生型および変性Ｓ３３４ｔｅｒラット網膜の写
真である。Ｓ３３４ｔｅｒは、色素性網膜炎のラットモデルである。
【図１２】 図１２Ａ、図１２Ｂ、および図１２Ｃは、変性Ｓ３３４ｔｅｒ、ＦＧＦ−２注
入したＳ３３４ｔｅｒ、およびＰＢＳ注入したＳ３３４ｔｅｒラット網膜である
。これらの図において見られ得るように、Ｓ３３４ｔｅｒラット網膜に注入され
たＦＧＦ−２は、実質的に疾患の進行を遅くする。
【図１３】 図１３は、網膜下に注入したＦＧＦ−２、網膜下に注入したＰＢＳ、および注
入なしのコントロールについての外側核層（ＯＮＬ）の厚さをプロットするグラ
フである。
【図１４】 図１４は、ｐ６０でのＯＮＬの厚さをプロットする棒グラフである。
【図１５】 図１５Ａ、図１５Ｂ、および図１５Ｃは、抗ＦＧＦ−２抗体で染色したＦＧＦ
−２発現細胞の写真である。
【図１６】 図１６Ａおよび図１６Ｂは、ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ｌａｃＺの眼内注入後の神経
節細胞層中の細胞への遺伝子送達を示す写真である。ａ）ＡＡＶ感染したニュー
ロンを可視化するためのＢｌｕｏ−Ｇａｌ染色のために加工した網膜の平らな台
（ｆｌａｔ−ｍｏｕｎｔ）の優れた四分割。軸索の大多数は視神経頭部（星印）
に集中することに注目のこと。ｂ）神経節細胞層の細胞中のＡＡＶ媒介ＬａｃＺ
遺伝子産物を示す網膜の放射状部分。これらの細胞の大部分は、視神経頭部に突
き出る軸索における強烈なＬａｃＺ染色（星印）のため、ＲＧＣとして同定され
た。ＲＰＥ：網膜色素上皮、ＰＳ：光受容体セグメント、ＯＮＬ：外側核層、Ｏ
ＰＬ：外側網状層、ＩＮＬ：内側核層、ＩＰＬ：内側網状層、ＧＣＬ：神経節細
胞層。棒目盛：ａ）０．５ｍｍ、ｂ）５０μｍ。
【図１７】 図１７は、成体ラット網膜の神経節細胞層におけるＡＡＶ媒介トランスジーン
発現の時間経過を示すグラフである。組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ−ＣＭＶ
−ｌａｃＺ）を、成体ラットの硝子体腔に注入し、そして２、４、および８週間
後に、神経節細胞層（ＧＣＬ）中のｌａｃ−Ｚ陽性ニューロンを、網膜の平らな
台（ｆｌａｔ−ｍｏｕｎｔ）で計数した。値は、時間の点±標準偏差（ｐ＜０．
００１）の３〜４の網膜の平均である。
【図１８】 図１８Ａおよび図１８Ｂは、逆方向性に標識したＲＧＣ中でのＡＡＶ媒介Ｌａ
ｃＺ遺伝子産物の局在を示す写真である。ａ）ＡＡＶで形質導入されたＬａｃＺ
免疫陽性ＲＧＣを示す網膜の放射状部分（励起５２０〜５６０、バリア５８０、
発光５８０）；ｂ）上方の丘からＦｌｕｏｒｏｇｏｌｄで背景標識したＲＧＣを
可視化するために、異なる蛍光フィルター（励起３５５〜４２５、バリア４６０
、発光４７０）のもとで試験した同じ部分。ＬａｃＺ免疫陽性ニューロンの大部
分もまた、Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄで標識されることに注目のこと。例外として、
Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄ標識されていないＬａｃＺ陽性細胞を示し（矢印）、そし
て置換された無軸索細胞または逆方向性のトレーサーを取り込んでいないＲＧＣ
を表し得る。ＩＮＬ：内側核層、ＩＰＬ：内側網状層、ＧＣＬ：神経節細胞層。
棒目盛：１０μｍ。
【図１９】 図１９は、ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ｌａｃＺの硝子体内注入後の神経節細胞層にお
けるＦｌｕｏｒｏｇｏｌｄ陽性細胞およびＬａｃＺ陽性細胞を定量化するグラフ
である。Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄ陽性細胞（ＦＧ＋）は、Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄマ
ーカーおよびＬａｃＺマーカー（ＦＧ＋、ＬａｃＺ）の両方を発現する細胞の数
およびレポーター遺伝子（ＬａｃＺ＋）のみを発現する細胞の数と比較された。
値は、動物（ｎ＝４）あたり４〜５の網膜放射状部分±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）（
ｐ＜０．００１）を表す。
【図２０】 図２０は、インタクトなラット網膜におけるヘパラン硫酸（ＨＳ）プロテオグ
リカンレセプター（ＡＡＶの細胞内レセプター）の局在を示す写真である。網膜
の凍結切片を、ヘパラン硫酸（ＨｅｐＳＳ；１：２００希釈）に対するポリクロ
ーナル抗体、続いてビオチン化した抗ウサギＦａｂフラグメント、アビジン−ビ
オチン−ペルオキシダーゼ試薬（ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ
，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いて免疫染色した。この切片を、ＰＢ（ｐ
Ｈ ７．４）中に０．０５％ ジアミノベンジジン四塩酸（ＤＡＢ）および０．
０６％ 過酸化水素を含む溶液中で５分間反応させた。神経節細胞層（ＧＣＬ）
におけるＲＧＣ中の強力な標識に注目のこと。ＲＰＥ：網膜色素上皮、ＰＳ：光
受容体セグメント、ＯＮＬ：外側核層、ＯＰＬ：外側網状層、ＩＮＬ：内側核層
、ＩＰＬ：内側網状層。棒目盛：５０μｍ。
【図２１】 図２１は、ｐＤ１０−ＶＥＧＦUCの概略図である。
【図２２Ａ】 図２２は、ｐＤ１０−ＶＥＧＦUCのヌクレオチド配列である。
【図２２Ｂ】 図２２は、ｐＤ１０−ＶＥＧＦUCのヌクレオチド配列である。
【図２３】 図２３は、２９３細胞のｐＤ１０−ＶＥＧＦUC ｒＡＡＶウイルス感染を示す
棒グラフである。
【図２４】 図２４は、ＶＥＧＦ ＡＡＶでの感染後のｈｆＲＰＥによるＶＥＧＦ分泌を示
す三次元棒グラフである。
【図２５】 図２５は、ＶＥＧＦ ＡＶでの感染後のｈｆＲＰＥによるＶＥＧＦ分泌を示す
三次元棒グラフである。
【図２６】 図２６は、ＶＥＧＦ ＡＶでの感染後のｈｆＲＰＥの抵抗を示す三次元棒グラ
フである。
【図２７】 図２７は、ｐＤ１０−ｓＦｌｔ−１の概略図である。
【図２８Ａ】 図２８は、ｐＤ１０−ｓＦｌｔ−１のヌクレオチド配列である。
【図２８Ｂ】 図２８は、ｐＤ１０−ｓＦｌｔ−１のヌクレオチド配列である。
【図２９】 図２９は、ＦＧＦ−２０のヌクレオチド配列である。
【図３０】 図３０は、ＦＧＦ−２１のヌクレオチド配列である。
【図３１】 図３１は、ｐＤ１０Ｋ−ＦＧＦ−２Ｓｃの概略図である。
【図３２】 図３２は、ｐＤ１０Ｋ−ＦＧＦ−２Ｓｃのヌクレオチド配列である。
【図３３】 図３３は、眼への種々のベクターの注入後のＯＮＬの厚さ（ｕｍ）を比較する
棒グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 7/00 Ａ６１Ｋ 35/76 // Ａ６１Ｋ 35/76 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マニング， ウィリアム シー． ジュニ ア アメリカ合衆国 カリフォルニア 94061， レッドウッド シティー， カントリー クラブ ドライブ 3660 (72)発明者 ドワーキ， バラバニ ジェイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94502， アラメダ， オールド アラメダ ポイ ント 1177 (72)発明者 レンダール， キャサリン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94708， バークレー， グリズリー ピーク ブ ールバード 1221 (72)発明者 チョ， シャン−ツェン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94502， アラメダ， ファンディー ベイ 125 (72)発明者 マクギー， ローラ エイチ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94609， オークランド， 54ティーエイチ スト リート 652 (72)発明者 ラウ， ダナ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94610， オークランド， レノックス アベニュ ー 280， アパートメント エイ (72)発明者 フラネリー， ジョン ジー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94707， バークレー， マリン アベニュー 1728 (72)発明者 ミラー， シェルドン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94705， バークレー， ヒルクレスト ロード 186 (72)発明者 ワン， フェイ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94710， アルバニー， ９ティーエイチ ストリ ート 981 (72)発明者 ディ ポロ， アドリアーナ カナダ国 エイチ２ブイ ３ピー８ ケベ ック， アウトレモント， シャンペイナ ー アベニュー 704 Ｆターム(参考） 4B065 AA95X AA97X AB01 BA02 CA23 CA44 4C084 AA13 BA02 BA08 BA22 BA44 CA18 DB59 NA14 ZA331 ZC011 ZC351 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZA33 ZC01 ZC35

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 眼の疾患を処置または予防する方法であって、 神経栄養因子の発現を指示する遺伝子送達ベクターを眼内投与して、該眼の疾
    患を処置または予防する工程を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、前記神経栄養因子が、ＮＧ
    Ｆ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ−３、またはＮＴ−４である、方法。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の方法であって、前記神経栄養因子がＦＧＦ
    である、方法。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載の方法であって、前記ＦＧＦが、ＦＧＦ−２
    、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−２０、またはＦＧＦ−２１である、方法
    。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の方法であって、前記眼の疾患が黄斑変性で
    ある、方法。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載の方法であって、前記眼の疾患が糖尿病性網
    膜症である、方法。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載の方法であって、前記眼の疾患が遺伝性網膜
    変性である、方法。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載の方法であって、前記遺伝性網膜変性が色素
    性網膜炎である、方法。
  9. 【請求項９】 請求項１に記載の方法であって、前記眼の疾患が緑内障であ
    る、方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１に記載の方法であって、前記眼の疾患が手術誘導
    性網膜症である、方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１に記載の方法であって、前記眼の疾患が網膜剥離
    である、方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１に記載の方法であって、前記眼の疾患が光性網膜
    症である、方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１に記載の方法であって、前記眼の疾患が毒素性網
    膜症である、方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１に記載の方法であって、前記眼の疾患が外傷誘導
    性網膜症である、方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１に記載の方法であって、前記遺伝子送達ベクター
    が、ＨＩＶおよびＦＩＶからなる群より選択されるレトロウイルスである、方法
    。
  16. 【請求項１６】 請求項１に記載の方法であって、前記遺伝子送達ベクター
    が組換えアデノ随伴ウイルスベクターである、方法。
  17. 【請求項１７】 眼の血管新生疾患を阻害する方法であって、 抗脈管形成因子の発現を指示する遺伝子送達ベクターを眼内投与して、該眼の
    血管新生疾患を阻害する工程を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の方法であって、前記抗脈管形成因子が
    、可溶性Ｆｌｔ−１、ＰＥＤＦ、または可溶性Ｔｉｅ−２レセプターである、方
    法。
  19. 【請求項１９】 請求項１７に記載の方法であって、前記眼の血管新生疾患
    が、糖尿病性網膜症、湿潤性ＡＲＭＤ、または未熟児網膜症である、方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１７に記載の方法であって、前記遺伝子送達ベクタ
    ーが、ＨＩＶおよびＦＩＶからなる群より選択されるレトロウイルスである、方
    法。
  21. 【請求項２１】 請求項１７に記載の方法であって、前記遺伝子送達ベクタ
    ーが組換えアデノ随伴ウイルスベクターである、方法。
  22. 【請求項２２】 神経栄養因子または抗脈管形成因子の発現を指示する、遺
    伝子送達ベクター。
  23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の遺伝子送達ベクターであって、前記神
    経栄養因子が、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ−３、またはＮＴ−４である
    、遺伝子送達ベクター。
  24. 【請求項２４】 請求項２２に記載の遺伝子送達ベクターであって、前記神
    経栄養因子がＦＧＦである、遺伝子送達ベクター。
  25. 【請求項２５】 請求項２２に記載の遺伝子送達ベクターであって、前記Ｆ
    ＧＦが、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−２０、またはＦＧＦ
    −２１である、遺伝子送達ベクター。
  26. 【請求項２６】 請求項２２に記載の遺伝子送達ベクターであって、前記抗
    脈管形成因子が、可溶性Ｆｌｔ−１、ＰＥＤＦ、または可溶性Ｔｉｅ−２レセプ
    ターである、遺伝子送達ベクター。
  27. 【請求項２７】 請求項２２に記載の遺伝子送達ベクターであって、レトロ
    ウイルスから作製される、遺伝子送達ベクター。
  28. 【請求項２８】 請求項２７に記載の遺伝子送達ベクターであって、前記レ
    トロウイルスがＨＩＶまたはＦＩＶである、遺伝子送達ベクター。
  29. 【請求項２９】 請求項２２に記載の遺伝子送達ベクターであって、前記ベ
    クターが組換えアデノ随伴ウイルスから作製される、遺伝子送達ベクター。
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