JP2003522160A - 眼関連疾患の治療のための遺伝子治療 - Google Patents
眼関連疾患の治療のための遺伝子治療Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、少なくとも１つの眼関連疾患、例えば、眼血管新生又は加齢性黄斑変性のための動物の予防的処置又は治療的処置の方法に関する。本方法は、血管形成阻害剤をコードする核酸配列と、神経栄養剤をコードする同じ又は異なる核酸配列とを含む発現ベクターに、眼細胞を接触させることを含む。本方法はまた、各々が血管形成阻害剤をコードする核酸配列及び／又は神経栄養剤をコードする核酸配列を含む異なる発現ベクターに、眼細胞を接触させることを含む。更に、本発明は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）又はその治療性フラグメントをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを提供する。
Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、眼疾患の予防的処置又は治療的処置の方法、及び眼疾患を処置する
のに有用な材料に関する。
のに有用な材料に関する。
【０００２】
発明の背景
世界の人口の圧倒的多数は、一生の間にある程度の視力喪失を経験するであろ
う。視力喪失は、年齢、人種、経済的もしくは社会的状態、又は地理上の位置に
関わらず、実質的に全てのヒトに影響する。眼関連疾患は、しばしば生命を脅か
すものではないが、冒された個人の独立性を危うくするライフスタイルの変化を
必要とする。視力損傷は、糖尿病性網膜症、増殖性網膜症、網膜はく離、毒素性
網膜症、網膜血管疾患、網膜変性、血管異常、加齢性黄斑変性や他の後天性疾患
、感染性疾患、炎症性疾患、眼虚血、妊娠関連疾患、網膜腫瘍、脈絡膜腫瘍、脈
絡膜疾患、硝子体疾患、外傷、白内障合併症、ドライアイ、及び炎症性眼ニュー
ロパシーを含む殆ど全ての眼疾患から生じうる。
う。視力喪失は、年齢、人種、経済的もしくは社会的状態、又は地理上の位置に
関わらず、実質的に全てのヒトに影響する。眼関連疾患は、しばしば生命を脅か
すものではないが、冒された個人の独立性を危うくするライフスタイルの変化を
必要とする。視力損傷は、糖尿病性網膜症、増殖性網膜症、網膜はく離、毒素性
網膜症、網膜血管疾患、網膜変性、血管異常、加齢性黄斑変性や他の後天性疾患
、感染性疾患、炎症性疾患、眼虚血、妊娠関連疾患、網膜腫瘍、脈絡膜腫瘍、脈
絡膜疾患、硝子体疾患、外傷、白内障合併症、ドライアイ、及び炎症性眼ニュー
ロパシーを含む殆ど全ての眼疾患から生じうる。
【０００３】
重篤な視力喪失と失明の主要な原因は、眼の血管構造がダメージを受けるか、
又は不十分に調節される眼関連疾患である。血管新生という局面を含む眼関連疾
患は多数であり、例えば、滲出性加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症、角膜血管新
生、脈絡膜血管新生、血管新生緑内障、毛様体炎、ヒッペル−リンドー病、未熟
児網膜症、翼状片、ヒストプラスマ症、虹彩血管新生、黄斑浮腫、緑内障関連血
管新生などが挙げられる。重篤な視力喪失は、血管新生から直接的に生じるので
はなく、網膜に対する血管新生の影響から生じるらしい。網膜は、画像を受け取
るデリケートな眼の膜である。網膜の中心近くに、黄斑、即ち、視覚が最も鋭敏
な網膜組織の楕円形区域がある。網膜は、中心窩、即ち、黄斑の中心に存在する
中心の陥没において最もデリケートである。網膜のダメージ、即ち、網膜はく離
、網膜裂傷、又は網膜変性は、直接的に視力喪失と関連する。網膜はく離、網膜
裂傷、及び網膜変性の通常の原因は、種々の眼組織の異常、即ち、制御不能な血
管形成であるが、これは、常にそうとは限らない。加齢性黄斑変性、非増殖性糖
尿病性網膜症、及び炎症性眼ダメージと関連する萎縮性合併症は、血管新生とは
関連しないが、治療しなければ重篤な視力喪失を生じうる。加齢性黄斑変性や糖
尿病性網膜症などの血管新生コンポーネントと萎縮性コンポーネントの両方と関
連する疾患は、種々の合併症の出現のために治療するのが特に困難である。
又は不十分に調節される眼関連疾患である。血管新生という局面を含む眼関連疾
患は多数であり、例えば、滲出性加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症、角膜血管新
生、脈絡膜血管新生、血管新生緑内障、毛様体炎、ヒッペル−リンドー病、未熟
児網膜症、翼状片、ヒストプラスマ症、虹彩血管新生、黄斑浮腫、緑内障関連血
管新生などが挙げられる。重篤な視力喪失は、血管新生から直接的に生じるので
はなく、網膜に対する血管新生の影響から生じるらしい。網膜は、画像を受け取
るデリケートな眼の膜である。網膜の中心近くに、黄斑、即ち、視覚が最も鋭敏
な網膜組織の楕円形区域がある。網膜は、中心窩、即ち、黄斑の中心に存在する
中心の陥没において最もデリケートである。網膜のダメージ、即ち、網膜はく離
、網膜裂傷、又は網膜変性は、直接的に視力喪失と関連する。網膜はく離、網膜
裂傷、及び網膜変性の通常の原因は、種々の眼組織の異常、即ち、制御不能な血
管形成であるが、これは、常にそうとは限らない。加齢性黄斑変性、非増殖性糖
尿病性網膜症、及び炎症性眼ダメージと関連する萎縮性合併症は、血管新生とは
関連しないが、治療しなければ重篤な視力喪失を生じうる。加齢性黄斑変性や糖
尿病性網膜症などの血管新生コンポーネントと萎縮性コンポーネントの両方と関
連する疾患は、種々の合併症の出現のために治療するのが特に困難である。
【０００４】
加齢性黄斑変性は、年齢が６５歳を超える患者における失明の主要原因である
。世界の老人人口が増加するにつれ、加齢性黄斑変性の発生が劇的に増加するこ
とが予期され、２０３０年までに米国だけで推定７５０万人に到達すると予測さ
れる（Hymanら，Am.J.Epidemiol., 118,213-227(1983)）。加齢性黄斑変性（Ａ
ＭＤ）は、初期に視力喪失という結果が生じる眼の進行性の変性疾患である。加
齢性黄斑変性の進行と共に生じる合併症としては、萎縮性及び滲出性合併症が挙
げられる。萎縮性合併症は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の萎縮を生じる網膜色素上
皮細胞喪失から生じる。滲出性合併症としては、円板状瘢痕（即ち、線維状要素
を含む瘢痕化）と血管新生が挙げられる。重篤な視力喪失は、血管新生として生
じ、又は萎縮は、中心窩（foveal center）を撹乱する（Bresslerら，Ophthalmo
logy, 102, 1206-1211(1995)）。最終的には、加齢性黄斑変性からの失明は、Ｒ
ＰＥの変性及びその後の光受容体の死から生じる。
。世界の老人人口が増加するにつれ、加齢性黄斑変性の発生が劇的に増加するこ
とが予期され、２０３０年までに米国だけで推定７５０万人に到達すると予測さ
れる（Hymanら，Am.J.Epidemiol., 118,213-227(1983)）。加齢性黄斑変性（Ａ
ＭＤ）は、初期に視力喪失という結果が生じる眼の進行性の変性疾患である。加
齢性黄斑変性の進行と共に生じる合併症としては、萎縮性及び滲出性合併症が挙
げられる。萎縮性合併症は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の萎縮を生じる網膜色素上
皮細胞喪失から生じる。滲出性合併症としては、円板状瘢痕（即ち、線維状要素
を含む瘢痕化）と血管新生が挙げられる。重篤な視力喪失は、血管新生として生
じ、又は萎縮は、中心窩（foveal center）を撹乱する（Bresslerら，Ophthalmo
logy, 102, 1206-1211(1995)）。最終的には、加齢性黄斑変性からの失明は、Ｒ
ＰＥの変性及びその後の光受容体の死から生じる。
【０００５】
同様に、糖尿病性網膜症は、典型的には初めに起こる非増殖期及び増殖期に分
けられる。非増殖性糖尿病性網膜症と関連する視力喪失は、血管漏出から生じる
網膜浮腫、特に糖尿病性黄斑浮腫から生じる。局所性及び拡散性血管漏出は、微
小血管異常、網膜内微動脈瘤、毛細血管の閉塞及び網膜出血の結果として起こる
。血管漏出の期間が長引くと、最終的には、基底膜の肥厚並びに軟らかい及び硬
い滲出物の形成に至る。非増殖性糖尿病性網膜症はまた、網膜周細胞の喪失によ
っても特徴づけられる。糖尿病性網膜症の増殖期は、網膜又は視神経から網膜又
は円板の内表面にわたる、又は硝子体腔内への血管新生及び線維血管増殖（即ち
、グリア要素と線維要素を含む瘢痕化）によって特徴づけられる。網膜血管新生
は、増殖性糖尿病性網膜症と関連する視力喪失の主要原因である。
けられる。非増殖性糖尿病性網膜症と関連する視力喪失は、血管漏出から生じる
網膜浮腫、特に糖尿病性黄斑浮腫から生じる。局所性及び拡散性血管漏出は、微
小血管異常、網膜内微動脈瘤、毛細血管の閉塞及び網膜出血の結果として起こる
。血管漏出の期間が長引くと、最終的には、基底膜の肥厚並びに軟らかい及び硬
い滲出物の形成に至る。非増殖性糖尿病性網膜症はまた、網膜周細胞の喪失によ
っても特徴づけられる。糖尿病性網膜症の増殖期は、網膜又は視神経から網膜又
は円板の内表面にわたる、又は硝子体腔内への血管新生及び線維血管増殖（即ち
、グリア要素と線維要素を含む瘢痕化）によって特徴づけられる。網膜血管新生
は、増殖性糖尿病性網膜症と関連する視力喪失の主要原因である。
【０００６】
多くの眼関連疾患については、現在のところ、効果的な治療選択は利用できな
い。レーザー光凝固術は、眼の種々の区域にレーザーの焼灼を投与することを含
み、多くの血管新生関連疾患の治療に使用される。例えば、局所黄斑光凝固術が
、黄斑の血管漏出の区域を治療するために使用される（Murphy, Amer.Family Ph
ysician, 51(4), 785-796(1995)）。同様に、血管新生、特に進行性増殖性網膜
症は、散乱（scatter）又は汎網膜（panretinal）光凝固術によって通常治療さ
れる。しかし、レーザー治療は、治療した区域に対応する永久的な盲目スポット
を生じさせるかも知れない。レーザー治療はまた、持続性又は再発性の出血を引
き起こしうるか、網膜はく離のリスクを増大させうるか、又は血管新生もしくは
線維化を誘導しうる。加齢性黄斑変性に関し、多数の患者は、最終的に、治療し
たにもかかわらず、重篤な視力喪失を被る。眼関連疾患の他の治療選択としては
、温熱療法、放射線療法、手術（例えば、黄斑トランスロケーション、過剰な眼
組織の除去など）が挙げられる。しかし、殆どの場合に、全ての利用できる治療
選択は、限定された治療効果を有し、反復性で高価な方法を必要とし、及び／又
は危険性のある副作用を伴う。
い。レーザー光凝固術は、眼の種々の区域にレーザーの焼灼を投与することを含
み、多くの血管新生関連疾患の治療に使用される。例えば、局所黄斑光凝固術が
、黄斑の血管漏出の区域を治療するために使用される（Murphy, Amer.Family Ph
ysician, 51(4), 785-796(1995)）。同様に、血管新生、特に進行性増殖性網膜
症は、散乱（scatter）又は汎網膜（panretinal）光凝固術によって通常治療さ
れる。しかし、レーザー治療は、治療した区域に対応する永久的な盲目スポット
を生じさせるかも知れない。レーザー治療はまた、持続性又は再発性の出血を引
き起こしうるか、網膜はく離のリスクを増大させうるか、又は血管新生もしくは
線維化を誘導しうる。加齢性黄斑変性に関し、多数の患者は、最終的に、治療し
たにもかかわらず、重篤な視力喪失を被る。眼関連疾患の他の治療選択としては
、温熱療法、放射線療法、手術（例えば、黄斑トランスロケーション、過剰な眼
組織の除去など）が挙げられる。しかし、殆どの場合に、全ての利用できる治療
選択は、限定された治療効果を有し、反復性で高価な方法を必要とし、及び／又
は危険性のある副作用を伴う。
【０００７】
眼関連疾患の罹患率を考慮すると、眼関連疾患、特に、萎縮性と血管新生の両
方の合併症（例えば、糖尿病性網膜症や加齢性黄斑変性）と関連する眼関連疾患
の効果的な予防的処置及び治療的処置の必要性が存在する。それ故、本発明は、
非増殖性合併症と増殖性合併症の治療を含む、眼関連疾患の予防的処置及び治療
的処置の材料及び方法を提供する。本発明のこの利点及び他の利点は、本明細書
記載の詳細な説明から明らかとなろう。
方の合併症（例えば、糖尿病性網膜症や加齢性黄斑変性）と関連する眼関連疾患
の効果的な予防的処置及び治療的処置の必要性が存在する。それ故、本発明は、
非増殖性合併症と増殖性合併症の治療を含む、眼関連疾患の予防的処置及び治療
的処置の材料及び方法を提供する。本発明のこの利点及び他の利点は、本明細書
記載の詳細な説明から明らかとなろう。
【０００８】
発明の簡単な概要
本発明は、眼関連疾患の予防的処置又は治療的処置の方法を提供する。特に、
本発明は、眼血管新生や加齢性黄斑変性などの少なくとも１つの眼関連疾患のた
めに、動物を予防的に処置する、又は治療的に処置する方法を提供する。本方法
は、眼細胞を、（ａ）血管形成阻害剤をコードする核酸配列及び神経栄養剤をコ
ードする同じもしくは異なる核酸配列を含む発現ベクター、あるいは（ｂ）各々
が血管形成阻害剤及び／又は神経栄養剤をコードする核酸配列を含む、異なる発
現ベクター、と接触させることを含む。血管形成阻害剤をコードする核酸配列及
び／又は神経栄養剤をコードする核酸配列が発現され、それによって血管形成阻
害剤及び／又は神経栄養剤が産生され、眼関連疾患に関して動物を予防的に処置
する、又は治療的に処置する。好ましくは、血管形成阻害剤をコードする核酸配
列と神経栄養剤をコードする核酸配列は、同じ核酸配列である。より好ましくは
、核酸配列は、抗血管形成活性と神経栄養性活性の両方を含む因子をコードする
。最も好ましくは、因子はＰＥＤＦである。
本発明は、眼血管新生や加齢性黄斑変性などの少なくとも１つの眼関連疾患のた
めに、動物を予防的に処置する、又は治療的に処置する方法を提供する。本方法
は、眼細胞を、（ａ）血管形成阻害剤をコードする核酸配列及び神経栄養剤をコ
ードする同じもしくは異なる核酸配列を含む発現ベクター、あるいは（ｂ）各々
が血管形成阻害剤及び／又は神経栄養剤をコードする核酸配列を含む、異なる発
現ベクター、と接触させることを含む。血管形成阻害剤をコードする核酸配列及
び／又は神経栄養剤をコードする核酸配列が発現され、それによって血管形成阻
害剤及び／又は神経栄養剤が産生され、眼関連疾患に関して動物を予防的に処置
する、又は治療的に処置する。好ましくは、血管形成阻害剤をコードする核酸配
列と神経栄養剤をコードする核酸配列は、同じ核酸配列である。より好ましくは
、核酸配列は、抗血管形成活性と神経栄養性活性の両方を含む因子をコードする
。最も好ましくは、因子はＰＥＤＦである。
【０００９】
更に、本発明は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、又はその治療性フラグメン
トをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを提供する。核酸配列は、ＰＥ
ＤＦ又はその治療性フラグメントの発現に必要な制御配列と機能可能に結合して
いる。好ましくは、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター又はアデノ随
伴ウイルスベクターである。また好ましくは、ウイルスベクターは、ＰＥＤＦ又
はその治療性フラグメント以外の治療性物質をコードする１つ以上の更なる核酸
配列を更に含む。
トをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを提供する。核酸配列は、ＰＥ
ＤＦ又はその治療性フラグメントの発現に必要な制御配列と機能可能に結合して
いる。好ましくは、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター又はアデノ随
伴ウイルスベクターである。また好ましくは、ウイルスベクターは、ＰＥＤＦ又
はその治療性フラグメント以外の治療性物質をコードする１つ以上の更なる核酸
配列を更に含む。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも１つの眼関連疾患のための、動物、好ましくはヒトの予
防的処置又は治療的処置の方法に関する。本発明はまた、眼関連疾患の治療のた
めの材料を提供する。本発明の材料及び方法を用いる治療に適切な眼関連疾患と
しては、糖尿病性網膜症、増殖性網膜症、未熟児網膜症、網膜性血管疾患、血管
異常、加齢性黄斑変性と他の後天性疾患、眼内炎、感染性疾患、炎症性疾患、Ａ
ＩＤＳ関連疾患、眼虚血性症候群、妊娠関連疾患、末梢網膜変性、網膜変性、毒
素性網膜症、白内障、網膜腫瘍、角膜血管新生、脈絡膜腫瘍、脈絡膜疾患、脈絡
膜血管新生、血管新生緑内障、硝子体疾患、網膜はく離と増殖性硝子体網膜症、
毛様体炎、非貫通性外傷、貫通性外傷、白内障後合併症、ヒッペル−リンドー病
、ドライアイ、炎症性眼ニューロパシー、黄斑浮腫、翼状片、虹彩血管新生、手
術誘導性疾患などが挙げられるがそれらに限定されない。
防的処置又は治療的処置の方法に関する。本発明はまた、眼関連疾患の治療のた
めの材料を提供する。本発明の材料及び方法を用いる治療に適切な眼関連疾患と
しては、糖尿病性網膜症、増殖性網膜症、未熟児網膜症、網膜性血管疾患、血管
異常、加齢性黄斑変性と他の後天性疾患、眼内炎、感染性疾患、炎症性疾患、Ａ
ＩＤＳ関連疾患、眼虚血性症候群、妊娠関連疾患、末梢網膜変性、網膜変性、毒
素性網膜症、白内障、網膜腫瘍、角膜血管新生、脈絡膜腫瘍、脈絡膜疾患、脈絡
膜血管新生、血管新生緑内障、硝子体疾患、網膜はく離と増殖性硝子体網膜症、
毛様体炎、非貫通性外傷、貫通性外傷、白内障後合併症、ヒッペル−リンドー病
、ドライアイ、炎症性眼ニューロパシー、黄斑浮腫、翼状片、虹彩血管新生、手
術誘導性疾患などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００１１】
特に、本発明は、眼血管新生などの少なくとも１つの眼関連疾患のための、動
物の予防的処置又は治療的処置の方法を提供する。本方法は、眼細胞を、少なく
とも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養剤をコードする
核酸配列を含む発現ベクターと接触させることを含む。好ましくは、本方法は、
眼細胞を、血管形成阻害剤をコードする核酸配列、及び神経栄養剤をコードする
同じ又は異なる核酸配列を含む発現ベクターと接触させることを含む。望ましく
は、核酸配列は、少なくとも１つの血管形成阻害剤と少なくとも１つの神経栄養
剤をコードする。本発明の方法によって治療される眼血管新生は、脈絡膜の血管
新生でありうる。脈絡膜は、網膜下に存在する薄い血管性膜である。脈絡膜の異
常な血管新生は、例えば、光凝固術、前方（anterior）虚血性眼ニューロパシー
、ベスト病、脈絡膜血管腫、金属性眼内異物、脈絡膜非血流（choroidal nonper
fusion）、脈絡膜骨腫、脈絡膜裂傷、細菌性心内膜炎、コロイデレミア、慢性網
膜はく離、ドルーゼ、代謝性老廃物沈着、内因性カンジダ眼内炎、鋸状縁での血
管新生、手術用顕微鏡火傷、点状内部脈絡膜症、放射線網膜症、網膜低温傷害、
色素性網膜炎（retinitis pigmentosa）、網膜脈絡膜欠損症、風疹、網膜下液体
ドレナージ、傾斜円板（tilted disc）症候群、トキソプラズマ（Taxoplasma）
網膜脈絡膜炎、結核などから生じる。
物の予防的処置又は治療的処置の方法を提供する。本方法は、眼細胞を、少なく
とも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養剤をコードする
核酸配列を含む発現ベクターと接触させることを含む。好ましくは、本方法は、
眼細胞を、血管形成阻害剤をコードする核酸配列、及び神経栄養剤をコードする
同じ又は異なる核酸配列を含む発現ベクターと接触させることを含む。望ましく
は、核酸配列は、少なくとも１つの血管形成阻害剤と少なくとも１つの神経栄養
剤をコードする。本発明の方法によって治療される眼血管新生は、脈絡膜の血管
新生でありうる。脈絡膜は、網膜下に存在する薄い血管性膜である。脈絡膜の異
常な血管新生は、例えば、光凝固術、前方（anterior）虚血性眼ニューロパシー
、ベスト病、脈絡膜血管腫、金属性眼内異物、脈絡膜非血流（choroidal nonper
fusion）、脈絡膜骨腫、脈絡膜裂傷、細菌性心内膜炎、コロイデレミア、慢性網
膜はく離、ドルーゼ、代謝性老廃物沈着、内因性カンジダ眼内炎、鋸状縁での血
管新生、手術用顕微鏡火傷、点状内部脈絡膜症、放射線網膜症、網膜低温傷害、
色素性網膜炎（retinitis pigmentosa）、網膜脈絡膜欠損症、風疹、網膜下液体
ドレナージ、傾斜円板（tilted disc）症候群、トキソプラズマ（Taxoplasma）
網膜脈絡膜炎、結核などから生じる。
【００１２】
角膜の血管新生はまた、本発明の方法による治療のために適切である。角膜は
、眼の最外層である線維層の突出している透明部分である。角膜の最外層は結膜
と接触し、最内層は前房の内皮を含む。角膜血管新生は、例えば、眼傷害、手術
、感染、コンタクトレンズの不適切な着用、及び例えば、角膜ジストロフィーな
どの疾患により生じる。
、眼の最外層である線維層の突出している透明部分である。角膜の最外層は結膜
と接触し、最内層は前房の内皮を含む。角膜血管新生は、例えば、眼傷害、手術
、感染、コンタクトレンズの不適切な着用、及び例えば、角膜ジストロフィーな
どの疾患により生じる。
【００１３】
あるいは、眼血管新生は好ましくは、網膜の血管新生である。網膜血管新生は
、多数の眼疾患や病気（その多くは上記してある）に付随する症候である。好ま
しくは、本発明の方法によって治療される網膜の血管新生は、糖尿病性網膜症に
付随する。網膜血管新生の普通の原因としては、虚血、ウイルス感染及び網膜ダ
メージが挙げられる。網膜の血管新生は、黄斑浮腫、網膜下変色、瘢痕化などに
至りうる。網膜血管新生に付随する合併症は、新しく形成された血管の破断や漏
出から生じる。血液が硝子体腔を満たし、効果的に除去されないと視力は悪くな
る。光の通過が妨害されるばかりではなく、過剰の血液と代謝物に対する炎症性
応答が、眼組織に対する更なるダメージを引き起こしうる。更に、新しい血管は
、線維性瘢痕組織を形成し、これは、時が経つと、網膜を撹乱し、網膜裂傷や網
膜はく離を引き起こすであろう。
、多数の眼疾患や病気（その多くは上記してある）に付随する症候である。好ま
しくは、本発明の方法によって治療される網膜の血管新生は、糖尿病性網膜症に
付随する。網膜血管新生の普通の原因としては、虚血、ウイルス感染及び網膜ダ
メージが挙げられる。網膜の血管新生は、黄斑浮腫、網膜下変色、瘢痕化などに
至りうる。網膜血管新生に付随する合併症は、新しく形成された血管の破断や漏
出から生じる。血液が硝子体腔を満たし、効果的に除去されないと視力は悪くな
る。光の通過が妨害されるばかりではなく、過剰の血液と代謝物に対する炎症性
応答が、眼組織に対する更なるダメージを引き起こしうる。更に、新しい血管は
、線維性瘢痕組織を形成し、これは、時が経つと、網膜を撹乱し、網膜裂傷や網
膜はく離を引き起こすであろう。
【００１４】
本発明はまた、加齢性黄斑変性のための、動物の予防的処置又は治療的処置の
方法を提供する。本方法は、加齢性黄斑変性と関連する眼細胞を、少なくとも１
つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子をコードする核酸
配列を含む発現ベクターと接触させることを含む。望ましくは、発現ベクターは
、血管形成阻害剤をコードする核酸配列と神経栄養剤をコードする核酸配列を含
む。より望ましくは、血管形成阻害剤をコードする核酸配列と神経栄養剤をコー
ドする核酸配列は、同一の核酸配列である。好ましくは、加齢性黄斑変性は、少
なくとも１つの滲出性合併症に付随する。滲出性合併症としては、例えば、円板
状瘢痕（即ち、線維要素を含む瘢痕化）や血管新生が挙げられる。あるいは、加
齢性黄斑変性は、少なくとも１つの萎縮性合併症に付随する。萎縮性合併症とし
ては、例えば、ドルーゼや基底層沈着の形成、網膜色素産生性の異常、及びリポ
フスチン顆粒の蓄積が挙げられる。
方法を提供する。本方法は、加齢性黄斑変性と関連する眼細胞を、少なくとも１
つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子をコードする核酸
配列を含む発現ベクターと接触させることを含む。望ましくは、発現ベクターは
、血管形成阻害剤をコードする核酸配列と神経栄養剤をコードする核酸配列を含
む。より望ましくは、血管形成阻害剤をコードする核酸配列と神経栄養剤をコー
ドする核酸配列は、同一の核酸配列である。好ましくは、加齢性黄斑変性は、少
なくとも１つの滲出性合併症に付随する。滲出性合併症としては、例えば、円板
状瘢痕（即ち、線維要素を含む瘢痕化）や血管新生が挙げられる。あるいは、加
齢性黄斑変性は、少なくとも１つの萎縮性合併症に付随する。萎縮性合併症とし
ては、例えば、ドルーゼや基底層沈着の形成、網膜色素産生性の異常、及びリポ
フスチン顆粒の蓄積が挙げられる。
【００１５】
“予防的”は、眼関連疾患、特に眼血管新生又は加齢性黄斑変性に対し、全体
的又は部分的に防御することを意味する。“治療的”は、眼関連疾患それ自体の
改善、及び更なる眼関連疾患、特に眼血管新生又は加齢性黄斑変性に対し、全体
的又は部分的に防御することを意味する。当業者は、眼関連疾患からの防御、又
はそれの改善の如何なる程度も患者に利益があることを理解しよう。治療剤は、
現在使用される治療の有害な副作用無しに、冒された区域に直接的に適用できる
という点で、本発明は特に利点を有する。
的又は部分的に防御することを意味する。“治療的”は、眼関連疾患それ自体の
改善、及び更なる眼関連疾患、特に眼血管新生又は加齢性黄斑変性に対し、全体
的又は部分的に防御することを意味する。当業者は、眼関連疾患からの防御、又
はそれの改善の如何なる程度も患者に利益があることを理解しよう。治療剤は、
現在使用される治療の有害な副作用無しに、冒された区域に直接的に適用できる
という点で、本発明は特に利点を有する。
【００１６】
本発明の方法は、急性及び持続性の進行性眼疾患の両方の治療に有用である。
急性疾患の場合、少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの
神経栄養因子をコードする核酸配列を含む発現ベクターは、短期間内に、単一又
は複数の適用を用いて投与できる。加齢性黄斑変性や糖尿病性網膜症などの持続
性の眼関連疾患の場合、発現ベクターの多数の適用が、治療効果を実現するのに
必要かも知れない。
急性疾患の場合、少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの
神経栄養因子をコードする核酸配列を含む発現ベクターは、短期間内に、単一又
は複数の適用を用いて投与できる。加齢性黄斑変性や糖尿病性網膜症などの持続
性の眼関連疾患の場合、発現ベクターの多数の適用が、治療効果を実現するのに
必要かも知れない。
【００１７】
当業者は、当業界公知の幾つかの発現ベクターのいずれでも、本発明の方法で
の使用に適切であることを理解しよう。適切な発現ベクターの例としては、例え
ば、プラスミド、プラスミド−リポソーム複合体、及びウイルスベクター（例え
ば、パルボウイルスベースのベクター（即ち、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベ
ースのベクター）、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）
ベースのベクター、ＡＡＶ−アデノウイルスキメラベクター、及びアデノウイル
スベースのベクター）が挙げられる。これらの発現ベクターのいずれも、例えば
、Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, C
old Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)；及び、Ausubel e
t al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associa
tes and John Wiley & Sons, New York, N.Y.(1994)に記載の標準的組換えＤＮ
Ａ技術を用いて製造できる。
の使用に適切であることを理解しよう。適切な発現ベクターの例としては、例え
ば、プラスミド、プラスミド−リポソーム複合体、及びウイルスベクター（例え
ば、パルボウイルスベースのベクター（即ち、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベ
ースのベクター）、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）
ベースのベクター、ＡＡＶ−アデノウイルスキメラベクター、及びアデノウイル
スベースのベクター）が挙げられる。これらの発現ベクターのいずれも、例えば
、Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, C
old Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)；及び、Ausubel e
t al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associa
tes and John Wiley & Sons, New York, N.Y.(1994)に記載の標準的組換えＤＮ
Ａ技術を用いて製造できる。
【００１８】
遺伝子操作される環状の二本鎖ＤＮＡ分子であるプラスミドは、少なくとも１
つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子をコードする核酸
配列の眼細胞への送達のために、発現カセットを含むように設計されることがで
きる。プラスミドは、治療性核酸の投与のために記載された第１のベクターであ
ったけれども、他の技術と比較して、トランスフェクション効率のレベルが低い
。プラスミドをリポソームと複合することによって、遺伝子導入の効率は一般的
には改善される。プラスミド媒介遺伝子導入戦略のために使用されるリポソーム
は種々の組成を有するが、それらは典型的には、合成カチオン性脂質である。プ
ラスミド−リポソーム複合体の利点としては、治療性核酸をコードするＤＮＡの
大きな断片を導入するそれらの能力及びそれらの比較的低い免疫原性が挙げられ
る。
つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子をコードする核酸
配列の眼細胞への送達のために、発現カセットを含むように設計されることがで
きる。プラスミドは、治療性核酸の投与のために記載された第１のベクターであ
ったけれども、他の技術と比較して、トランスフェクション効率のレベルが低い
。プラスミドをリポソームと複合することによって、遺伝子導入の効率は一般的
には改善される。プラスミド媒介遺伝子導入戦略のために使用されるリポソーム
は種々の組成を有するが、それらは典型的には、合成カチオン性脂質である。プ
ラスミド−リポソーム複合体の利点としては、治療性核酸をコードするＤＮＡの
大きな断片を導入するそれらの能力及びそれらの比較的低い免疫原性が挙げられ
る。
【００１９】
プラスミドはしばしば、短期間発現のために使用される。しかし、プラスミド
構築物は、発現を延長させるために修飾できる。パルボウイルス、特にアデノ随
伴ウイルス（ＡＡＶ）の逆方向末端反復（ＩＴＲ）が、ＡＡＶとしばしば関連す
る高レベルの持続的な核酸発現を担うことが最近見出された（例えば、米国特許
第６，１６５，７５４号参照）。それ故、発現ベクターは、少なくとも１つの血
管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子の発現を延長させ、かつ
実質的なものにするために、ネイティブなパルボウイルスＩＴＲを含むプラスミ
ドでありうる。プラスミドは、本発明の方法での使用に適切ではあるが、好まし
くは発現ベクターはウイルスベクターである。
構築物は、発現を延長させるために修飾できる。パルボウイルス、特にアデノ随
伴ウイルス（ＡＡＶ）の逆方向末端反復（ＩＴＲ）が、ＡＡＶとしばしば関連す
る高レベルの持続的な核酸発現を担うことが最近見出された（例えば、米国特許
第６，１６５，７５４号参照）。それ故、発現ベクターは、少なくとも１つの血
管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子の発現を延長させ、かつ
実質的なものにするために、ネイティブなパルボウイルスＩＴＲを含むプラスミ
ドでありうる。プラスミドは、本発明の方法での使用に適切ではあるが、好まし
くは発現ベクターはウイルスベクターである。
【００２０】
ＡＡＶベクターは、遺伝子治療プロトコルでの使用のために特に興味深いウイ
ルスベクターである。ＡＡＶは、ヒト疾患を引き起こすことが知られていないＤ
ＮＡウイルスである。ＡＡＶは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス（即
ち、アデノウイルス又はヘルペスウイルス）との共感染、又はヘルパー遺伝子の
発現を必要とする。治療性核酸の投与のために使用されるＡＡＶベクターは、Ｄ
ＮＡ複製とパッケージングのための認識シグナルを含む末端反復（ＩＴＲ）のみ
が残るように、親のゲノムの約９６％を欠失させられている。これは、ウイルス
遺伝子の発現に起因する免疫原性又は毒性の副作用を除去する。更に、所望する
ならば、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質の送達は、ゲノムの特定の領域へのＡＡＶ
ＩＴＲを含むＡＡＶベクターの組み込みを可能とする。組み込まれたＡＡＶゲノ
ムを含む宿主細胞は、細胞の増殖又は形態に何の変化も示さない（例えば、米国
特許第４，７９７，３６８号参照）。効率的ではあるが、ヘルパーウイルス又は
ヘルパー遺伝子の必要性は、このベクターの広範な使用のための障害でありうる
。
ルスベクターである。ＡＡＶは、ヒト疾患を引き起こすことが知られていないＤ
ＮＡウイルスである。ＡＡＶは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス（即
ち、アデノウイルス又はヘルペスウイルス）との共感染、又はヘルパー遺伝子の
発現を必要とする。治療性核酸の投与のために使用されるＡＡＶベクターは、Ｄ
ＮＡ複製とパッケージングのための認識シグナルを含む末端反復（ＩＴＲ）のみ
が残るように、親のゲノムの約９６％を欠失させられている。これは、ウイルス
遺伝子の発現に起因する免疫原性又は毒性の副作用を除去する。更に、所望する
ならば、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質の送達は、ゲノムの特定の領域へのＡＡＶ
ＩＴＲを含むＡＡＶベクターの組み込みを可能とする。組み込まれたＡＡＶゲノ
ムを含む宿主細胞は、細胞の増殖又は形態に何の変化も示さない（例えば、米国
特許第４，７９７，３６８号参照）。効率的ではあるが、ヘルパーウイルス又は
ヘルパー遺伝子の必要性は、このベクターの広範な使用のための障害でありうる
。
【００２１】
レトロウイルスは、種々の宿主細胞に感染できるＲＮＡウイルスである。感染
に際し、レトロウイルスゲノムは、その宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主細
胞ＤＮＡと共に複製され、それによって、絶えずウイルスＲＮＡ及びレトロウイ
ルスゲノムに組み込まれた任意の核酸配列を産生する。病原性レトロウイルス、
例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はヒトＴ細胞リンホトロフィック（
lymphotrophic）ウイルス（ＨＴＬＶ）を使用するとき、毒性を除去するために
、ウイルスゲノムを変化させることに注意しなければならない。更に、レトロウ
イルスベクターは、ウイルスを複製不能にするように、操作されることができる
。それ故、レトロウイルスベクターは、インビボでの安定な遺伝子導入のために
特に有用であると考えられている。ＨＩＶベースのベクターのようなレンチウイ
ルスベクターは、遺伝子送達のために使用されるレトロウイルスベクターの代表
である。他のレトロウイルスとは異なり、ＨＩＶベースのベクターは、非分裂細
胞にパッセンジャー（passenger）遺伝子を組み込むことが知られ、それ故、眼
関連疾患の萎縮形態を治療するのに有用でありうる。
に際し、レトロウイルスゲノムは、その宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主細
胞ＤＮＡと共に複製され、それによって、絶えずウイルスＲＮＡ及びレトロウイ
ルスゲノムに組み込まれた任意の核酸配列を産生する。病原性レトロウイルス、
例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はヒトＴ細胞リンホトロフィック（
lymphotrophic）ウイルス（ＨＴＬＶ）を使用するとき、毒性を除去するために
、ウイルスゲノムを変化させることに注意しなければならない。更に、レトロウ
イルスベクターは、ウイルスを複製不能にするように、操作されることができる
。それ故、レトロウイルスベクターは、インビボでの安定な遺伝子導入のために
特に有用であると考えられている。ＨＩＶベースのベクターのようなレンチウイ
ルスベクターは、遺伝子送達のために使用されるレトロウイルスベクターの代表
である。他のレトロウイルスとは異なり、ＨＩＶベースのベクターは、非分裂細
胞にパッセンジャー（passenger）遺伝子を組み込むことが知られ、それ故、眼
関連疾患の萎縮形態を治療するのに有用でありうる。
【００２２】
ＨＳＶベースのウイルスベクターは、核酸を眼細胞に導入するために、発現ベ
クターとしての使用に適切である。成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂの線状二
本鎖ＤＮＡからなるウイルスゲノムを含むエンベロープで覆われた二十面体カプ
シドからなる。大部分の複製欠損ＨＳＶベクターは、複製を妨げるために１つ以
上の中間初期（intermediate-early）遺伝子を除去する欠失を含む。ヘルペスベ
クターの利点は、長期のＤＮＡ発現を生じうる潜在期に入るその能力、及び２５
ｋｂまでの外来ＤＮＡを収容できるその大きなウイルスＤＮＡゲノムである。も
ちろん、この能力はまた、短期の処置法に関しては不利である。本発明の方法で
の使用のために適切なＨＳＶベースのベクターの記載については、米国特許第５
，８３７，５３２号、同第５，８４６，７８２号、同第５，８４９，５７２号、
同第５，８０４，４１３号、並びに国際特許出願ＷＯ ９１／０２７８８、ＷＯ
９６／０４３９４、ＷＯ ９８／１５６３７及びＷＯ ９９／０６５８３を参照さ
れたい。
クターとしての使用に適切である。成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂの線状二
本鎖ＤＮＡからなるウイルスゲノムを含むエンベロープで覆われた二十面体カプ
シドからなる。大部分の複製欠損ＨＳＶベクターは、複製を妨げるために１つ以
上の中間初期（intermediate-early）遺伝子を除去する欠失を含む。ヘルペスベ
クターの利点は、長期のＤＮＡ発現を生じうる潜在期に入るその能力、及び２５
ｋｂまでの外来ＤＮＡを収容できるその大きなウイルスＤＮＡゲノムである。も
ちろん、この能力はまた、短期の処置法に関しては不利である。本発明の方法で
の使用のために適切なＨＳＶベースのベクターの記載については、米国特許第５
，８３７，５３２号、同第５，８４６，７８２号、同第５，８４９，５７２号、
同第５，８０４，４１３号、並びに国際特許出願ＷＯ ９１／０２７８８、ＷＯ
９６／０４３９４、ＷＯ ９８／１５６３７及びＷＯ ９９／０６５８３を参照さ
れたい。
【００２３】
アデノウイルス（Ａｄ）は、種々の異なる標的細胞型にインビボでＤＮＡを効
率的に移す３６ｋｂの二本鎖ＤＮＡウイルスである。本発明の方法での使用のた
めに、ウイルスは好ましくは、ウイルス複製のために必要な選択された遺伝子を
欠失させることによって、複製欠損にされる。不要なＥ３領域もまた、しばしば
より大きなＤＮＡ挿入体についての更なる余地を許容するために欠失される。ベ
クターは、高力価で産生でき、かつ複製細胞及び非複製細胞に効率的にＤＮＡを
移すことができる。新たに移された遺伝子情報は、染色体外に留まり、ランダム
な挿入的突然変異のリスクを除去し、標的細胞の遺伝子型の永久的な変更を除去
する。しかし、所望ならば、ＡＡＶの組み込み性質は、ＡＡＶ−Ａｄキメラベク
ターを構築することによって、アデノウイルスに付与することができる。例えば
、アデノウイルスベクターに取り込まれたＡＡＶ ＩＴＲ及びＲｅｐタンパク質
をコードする核酸は、アデノウイルスベクターが哺乳動物細胞ゲノムに組み込ま
れるのを可能とする。それ故、ＡＡＶ−Ａｄキメラベクターは、本発明の使用の
ために興味深いオプションである。
率的に移す３６ｋｂの二本鎖ＤＮＡウイルスである。本発明の方法での使用のた
めに、ウイルスは好ましくは、ウイルス複製のために必要な選択された遺伝子を
欠失させることによって、複製欠損にされる。不要なＥ３領域もまた、しばしば
より大きなＤＮＡ挿入体についての更なる余地を許容するために欠失される。ベ
クターは、高力価で産生でき、かつ複製細胞及び非複製細胞に効率的にＤＮＡを
移すことができる。新たに移された遺伝子情報は、染色体外に留まり、ランダム
な挿入的突然変異のリスクを除去し、標的細胞の遺伝子型の永久的な変更を除去
する。しかし、所望ならば、ＡＡＶの組み込み性質は、ＡＡＶ−Ａｄキメラベク
ターを構築することによって、アデノウイルスに付与することができる。例えば
、アデノウイルスベクターに取り込まれたＡＡＶ ＩＴＲ及びＲｅｐタンパク質
をコードする核酸は、アデノウイルスベクターが哺乳動物細胞ゲノムに組み込ま
れるのを可能とする。それ故、ＡＡＶ−Ａｄキメラベクターは、本発明の使用の
ために興味深いオプションである。
【００２４】
好ましくは、本発明の方法の発現ベクターは、ウイルスベクターである。より
好ましくは、発現ベクターはアデノウイルスベクターである。本発明の状況にお
いては、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスの任意の血清型から得るこ
とができる。アデノウイルス源として使用できるアデノウイルスストックは、現
在American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ，Manassas, VA）から利用でき
るアデノウイルス血清型１〜５１から、又は任意の他の源から利用できるアデノ
ウイルスの任意の他の血清型から増幅できる。例えば、アデノウイルスは、サブ
グループＡ（例えば、血清型１２，１８及び３１）、サブグループＢ（例えば、
血清型３，７，１１，１４，１６，２１，３４及び３５）、サブグループＣ（例
えば、血清型１，２，５及び６）、サブグループＤ（例えば、血清型８，９，１
０，１３，１５，１７，１９，２０，２２〜３０，３２，３３，３６〜３９及び
４２〜４７）、サブグループＥ（血清型４）、サブグループＦ（血清型４０及び
４１）、又は任意の他のアデノウイルス血清型でありうる。しかし、好ましくは
、アデノウイルスは血清型２、５又は９である。しかし、グループＣ以外のアデ
ノウイルスは、眼細胞に抗血管形成因子及び／又は神経栄養因子を送達するため
の複製欠損アデノウイルス遺伝子導入ベクターを製造するために使用できる。グ
ループＣ以外のアデノウイルス遺伝子導入ベクターの構築において使用される好
適なアデノウイルスとしては、Ａｄ１２（グループＡ）、Ａｄ７（グループＢ）
、Ａｄ３０とＡｄ３６（グループＣ）、Ａｄ４（グループＥ）、及びＡｄ４１（
グループＦ）が挙げられる。グループＣ以外のアデノウイルスベクター、グルー
プＣ以外のアデノウイルスベクターの製造方法、及びグループＣ以外のアデノウ
イルスベクターの使用方法は、例えば、米国特許第５，８０１，０３０号、同第
５，８３７，５１１号、同第５，８４９，５６１号及び国際特許出願ＷＯ ９７
／１２９８６、ＷＯ ９８／５３０８７に開示されている。
好ましくは、発現ベクターはアデノウイルスベクターである。本発明の状況にお
いては、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスの任意の血清型から得るこ
とができる。アデノウイルス源として使用できるアデノウイルスストックは、現
在American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ，Manassas, VA）から利用でき
るアデノウイルス血清型１〜５１から、又は任意の他の源から利用できるアデノ
ウイルスの任意の他の血清型から増幅できる。例えば、アデノウイルスは、サブ
グループＡ（例えば、血清型１２，１８及び３１）、サブグループＢ（例えば、
血清型３，７，１１，１４，１６，２１，３４及び３５）、サブグループＣ（例
えば、血清型１，２，５及び６）、サブグループＤ（例えば、血清型８，９，１
０，１３，１５，１７，１９，２０，２２〜３０，３２，３３，３６〜３９及び
４２〜４７）、サブグループＥ（血清型４）、サブグループＦ（血清型４０及び
４１）、又は任意の他のアデノウイルス血清型でありうる。しかし、好ましくは
、アデノウイルスは血清型２、５又は９である。しかし、グループＣ以外のアデ
ノウイルスは、眼細胞に抗血管形成因子及び／又は神経栄養因子を送達するため
の複製欠損アデノウイルス遺伝子導入ベクターを製造するために使用できる。グ
ループＣ以外のアデノウイルス遺伝子導入ベクターの構築において使用される好
適なアデノウイルスとしては、Ａｄ１２（グループＡ）、Ａｄ７（グループＢ）
、Ａｄ３０とＡｄ３６（グループＣ）、Ａｄ４（グループＥ）、及びＡｄ４１（
グループＦ）が挙げられる。グループＣ以外のアデノウイルスベクター、グルー
プＣ以外のアデノウイルスベクターの製造方法、及びグループＣ以外のアデノウ
イルスベクターの使用方法は、例えば、米国特許第５，８０１，０３０号、同第
５，８３７，５１１号、同第５，８４９，５６１号及び国際特許出願ＷＯ ９７
／１２９８６、ＷＯ ９８／５３０８７に開示されている。
【００２５】
好ましくは、アデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要な少なくとも１
つの遺伝子機能に欠損があり、それによって、“複製欠損”アデノウイルスベク
ターが生じる。好ましくは、アデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要な
アデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能に欠損があ
る。Ｅ１領域の欠損の他に、組換えアデノウイルスはまた、主要後期プロモータ
ー（ＭＬＰ）に変異を有しうる。ＭＬＰにおける変異は、国際特許出願ＷＯ ０
０／００６２８において考察されているように、それが、プロモーターの応答性
を変更させるように、ＭＬＰ制御エレメントのいずれかにおいてでありうる。よ
り好ましくは、ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能及びＥ
３領域の少なくとも一部（例えば、Ｅ３領域のＸｂａＩ欠失）において欠損があ
る。Ｅ１領域に関し、アデノウイルスベクターは、Ｅ１ａ領域の少なくとも一部
とＥ１ｂ領域の少なくとも一部に欠損がありうる。好ましくは、アデノウイルス
ベクターは、アデノウイルスベクターが、２つ以上の領域の各々でウイルス複製
に必要な１つ以上の必須遺伝子機能を欠損していることを意味する“多重欠損（
multiply deficient）”である。例えば、上記Ｅ１−欠損、又はＥ１−，Ｅ３−
欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも１つの必須遺伝子に更に
欠損がありうる。Ｅ４領域全てを欠失させたアデノウイルスベクターは、より低
い宿主免疫応答を発揮しうる。
つの遺伝子機能に欠損があり、それによって、“複製欠損”アデノウイルスベク
ターが生じる。好ましくは、アデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要な
アデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能に欠損があ
る。Ｅ１領域の欠損の他に、組換えアデノウイルスはまた、主要後期プロモータ
ー（ＭＬＰ）に変異を有しうる。ＭＬＰにおける変異は、国際特許出願ＷＯ ０
０／００６２８において考察されているように、それが、プロモーターの応答性
を変更させるように、ＭＬＰ制御エレメントのいずれかにおいてでありうる。よ
り好ましくは、ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能及びＥ
３領域の少なくとも一部（例えば、Ｅ３領域のＸｂａＩ欠失）において欠損があ
る。Ｅ１領域に関し、アデノウイルスベクターは、Ｅ１ａ領域の少なくとも一部
とＥ１ｂ領域の少なくとも一部に欠損がありうる。好ましくは、アデノウイルス
ベクターは、アデノウイルスベクターが、２つ以上の領域の各々でウイルス複製
に必要な１つ以上の必須遺伝子機能を欠損していることを意味する“多重欠損（
multiply deficient）”である。例えば、上記Ｅ１−欠損、又はＥ１−，Ｅ３−
欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも１つの必須遺伝子に更に
欠損がありうる。Ｅ４領域全てを欠失させたアデノウイルスベクターは、より低
い宿主免疫応答を発揮しうる。
【００２６】
あるいは、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の全て又は一部及びＥ２領域
の全て又は一部を欠く。しかし、Ｅ１領域の全て又は一部、Ｅ２領域の全て又は
一部及びＥ３領域の全て又は一部を欠くアデノウイルスベクターもまた、本明細
書では意図される。一実施態様では、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の全
て又は一部、Ｅ２領域の全て又は一部及びＥ４領域の全て又は一部を欠く。適切
な複製欠損アデノウイルスベクターは、米国特許第５，８５１，８０６号及び同
第５，９９４，１０６号、並びに国際特許出願ＷＯ ９５／３４６７１及びＷＯ
９７／２１８２６に開示されている。例えば、適切な複製欠損アデノウイルスベ
クターとしては、Ｅ１ａ領域の少なくとも一部の欠失、Ｅ１ｂ領域の少なくとも
一部の欠失、Ｅ２ａ領域の少なくとも一部の欠失、及びＥ３領域の少なくとも一
部の欠失を有するものが挙げられる。あるいは、複製欠損アデノウイルスベクタ
ーは、Ｅ１領域の少なくとも一部の欠失、Ｅ３領域の少なくとも一部の欠失、及
びＥ４領域の少なくとも一部の欠失を有しうる。このような多重欠損ウイルスベ
クターは、このようなベクターが外来ＤＮＡの大きな挿入体を受け入れることが
できるという点で特に有用である。実際、ウイルスゲノムのパッケージングと複
製に必要なゲノム配列のみを含む多重欠損アデノウイルスベクターの例であるア
デノウイルスアンプリコン（amplicon）は、約３６ｋｂの挿入体を受け入れるこ
とができる。
の全て又は一部を欠く。しかし、Ｅ１領域の全て又は一部、Ｅ２領域の全て又は
一部及びＥ３領域の全て又は一部を欠くアデノウイルスベクターもまた、本明細
書では意図される。一実施態様では、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の全
て又は一部、Ｅ２領域の全て又は一部及びＥ４領域の全て又は一部を欠く。適切
な複製欠損アデノウイルスベクターは、米国特許第５，８５１，８０６号及び同
第５，９９４，１０６号、並びに国際特許出願ＷＯ ９５／３４６７１及びＷＯ
９７／２１８２６に開示されている。例えば、適切な複製欠損アデノウイルスベ
クターとしては、Ｅ１ａ領域の少なくとも一部の欠失、Ｅ１ｂ領域の少なくとも
一部の欠失、Ｅ２ａ領域の少なくとも一部の欠失、及びＥ３領域の少なくとも一
部の欠失を有するものが挙げられる。あるいは、複製欠損アデノウイルスベクタ
ーは、Ｅ１領域の少なくとも一部の欠失、Ｅ３領域の少なくとも一部の欠失、及
びＥ４領域の少なくとも一部の欠失を有しうる。このような多重欠損ウイルスベ
クターは、このようなベクターが外来ＤＮＡの大きな挿入体を受け入れることが
できるという点で特に有用である。実際、ウイルスゲノムのパッケージングと複
製に必要なゲノム配列のみを含む多重欠損アデノウイルスベクターの例であるア
デノウイルスアンプリコン（amplicon）は、約３６ｋｂの挿入体を受け入れるこ
とができる。
【００２７】
それ故、好適な実施態様において、本発明の方法の発現ベクターは、Ｅ１領域
の全て又は一部、Ｅ３領域の全て又は一部、Ｅ４領域の全て又は一部、及び場合
によっては、Ｅ２領域の全て又は一部を欠く多重欠損アデノウイルスベクターで
ある。この点に関し、少なくともＥ４欠損アデノウイルスベクターは、インビボ
で限られた時間の間、高レベルで導入遺伝子（transgene）を発現すること、及
び少なくともＥ４欠損アデノウイルスベクターでの導入遺伝子の発現の持続が、
ＨＳＶ ＩＣＰ０、ＡｄｐＴＰ、ＣＭＶ−ＩＥ２、ＣＭＶ−ＩＥ８６、ＨＩＶｔ
ａｔ、ＨＴＬＶ−ｔａｘ、ＨＢＶ−Ｘ、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８、細胞因子（ＨＳＶ
ＩＣＰ０のように機能するＵ２０５骨肉腫細胞株に由来するもの）、又はとり
わけ細胞因子（神経成長因子によって誘導されるＰＣ１２細胞におけるもの）な
どのトランス作用因子の作用により制御されうることが観察された。上記の点で
、多重欠損アデノウイルスベクター（例えば、少なくともＥ４欠損アデノウイル
スベクター）は好ましくは、少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なく
とも１つの神経栄養因子をコードする核酸配列の発現の持続性を調節するトラン
ス作用因子をコードする核酸配列を更に含む。あるいは、眼細胞は、少なくとも
１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子をコードする核
酸配列の発現の持続性を調節するトランス作用因子をコードする核酸配列を含む
第２の発現ベクターと接触される。好ましくは、トランス作用因子をコードする
核酸配列は、アデノウイルスＥ４領域遺伝子産物をコードしない。アデノウイル
スベクターから発現されるか、第２の発現ベクターによって供給されるかに関わ
らず、好ましくは、トランス作用因子は、単純ヘルペス感染細胞ポリペプチド０
（ＨＳＶ ＩＣＰ０）である。
の全て又は一部、Ｅ３領域の全て又は一部、Ｅ４領域の全て又は一部、及び場合
によっては、Ｅ２領域の全て又は一部を欠く多重欠損アデノウイルスベクターで
ある。この点に関し、少なくともＥ４欠損アデノウイルスベクターは、インビボ
で限られた時間の間、高レベルで導入遺伝子（transgene）を発現すること、及
び少なくともＥ４欠損アデノウイルスベクターでの導入遺伝子の発現の持続が、
ＨＳＶ ＩＣＰ０、ＡｄｐＴＰ、ＣＭＶ−ＩＥ２、ＣＭＶ−ＩＥ８６、ＨＩＶｔ
ａｔ、ＨＴＬＶ−ｔａｘ、ＨＢＶ−Ｘ、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８、細胞因子（ＨＳＶ
ＩＣＰ０のように機能するＵ２０５骨肉腫細胞株に由来するもの）、又はとり
わけ細胞因子（神経成長因子によって誘導されるＰＣ１２細胞におけるもの）な
どのトランス作用因子の作用により制御されうることが観察された。上記の点で
、多重欠損アデノウイルスベクター（例えば、少なくともＥ４欠損アデノウイル
スベクター）は好ましくは、少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なく
とも１つの神経栄養因子をコードする核酸配列の発現の持続性を調節するトラン
ス作用因子をコードする核酸配列を更に含む。あるいは、眼細胞は、少なくとも
１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子をコードする核
酸配列の発現の持続性を調節するトランス作用因子をコードする核酸配列を含む
第２の発現ベクターと接触される。好ましくは、トランス作用因子をコードする
核酸配列は、アデノウイルスＥ４領域遺伝子産物をコードしない。アデノウイル
スベクターから発現されるか、第２の発現ベクターによって供給されるかに関わ
らず、好ましくは、トランス作用因子は、単純ヘルペス感染細胞ポリペプチド０
（ＨＳＶ ＩＣＰ０）である。
【００２８】
アデノウイルスベクターの異なる領域の欠失は、哺乳動物の免疫応答を変更さ
せうることを理解すべきである。特に、異なる領域の欠失は、アデノウイルスベ
クターによって生じる炎症応答を減少させることができる。更に、国際特許出願
ＷＯ ９８／４０５０９に記載のように、野生型コートタンパク質に対する中和
抗体によって認識されるアデノウイルスベクターの能力又は不能力を減少させる
ように、アデノウイルスベクターのコートタンパク質を修飾できる。このような
修飾は、持続的な眼疾患の長期の処置のために有用である。
せうることを理解すべきである。特に、異なる領域の欠失は、アデノウイルスベ
クターによって生じる炎症応答を減少させることができる。更に、国際特許出願
ＷＯ ９８／４０５０９に記載のように、野生型コートタンパク質に対する中和
抗体によって認識されるアデノウイルスベクターの能力又は不能力を減少させる
ように、アデノウイルスベクターのコートタンパク質を修飾できる。このような
修飾は、持続的な眼疾患の長期の処置のために有用である。
【００２９】
同様に、ウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターのコートタン
パク質は、可能性のある宿主細胞上のウイルス受容体に対するウイルスの結合特
異性又は認識を変更させるように操作できる。アデノウイルスの場合、このよう
な操作は、ファイバー、ペントン又はヘキソンの領域の欠失、コートタンパク質
の部分への種々のネイティブもしくは非ネイティブのリガンドの挿入などを含む
。コートタンパク質の操作は、ウイルスベクターによって感染する細胞の範囲を
拡張でき、又は特定の細胞型へのウイルスベクターのターゲティングを可能とす
る。例えば、一実施態様において、発現ベクターは、非ネイティブアミノ酸配列
の導入によって、好ましくは、カルボキシル基末端もしくはその近傍で、野生型
（即ち、ネイティブ）コートタンパク質とは異なるキメラコートタンパク質（例
えば、ファイバー、ヘキソンｐＩＸ、ｐＩＩＩａ、又はペントンタンパク質）を
含むウイルスベクターである。好ましくは、非ネイティブアミノ酸配列は、内部
コートタンパク質配列中に、又はその代わりに挿入される。当業者は、非ネイテ
ィブアミノ酸配列が、内部コートタンパク質配列内に、又は内部コートタンパク
質配列の末端で挿入できることを理解しよう。得られるキメラウイルスコートタ
ンパク質は、キメラウイルスコートタンパク質よりもむしろ野生型ウイルスコー
トタンパク質を含むことを除いて同一であるベクターの細胞への侵入よりも、コ
ートタンパク質を含むウイルスベクター、即ちアデノウイルスベクターの細胞へ
の、より効率的な直接的侵入を可能とすることができる。好ましくは、キメラウ
イルスコートタンパク質は、野生型コートタンパク質を含むベクターによっては
認識されない、又は僅かしか認識されない細胞表面に存在する新規な内因性結合
部位と結合する。侵入のこの効率の増大の１つの直接的な結果は、ウイルス、好
ましくはアデノウイルスが、野生型コートタンパク質を含むウイルスが典型的に
は侵入できない、又は低い効率でしか侵入できない多数の細胞型に結合又は侵入
できるということである。
パク質は、可能性のある宿主細胞上のウイルス受容体に対するウイルスの結合特
異性又は認識を変更させるように操作できる。アデノウイルスの場合、このよう
な操作は、ファイバー、ペントン又はヘキソンの領域の欠失、コートタンパク質
の部分への種々のネイティブもしくは非ネイティブのリガンドの挿入などを含む
。コートタンパク質の操作は、ウイルスベクターによって感染する細胞の範囲を
拡張でき、又は特定の細胞型へのウイルスベクターのターゲティングを可能とす
る。例えば、一実施態様において、発現ベクターは、非ネイティブアミノ酸配列
の導入によって、好ましくは、カルボキシル基末端もしくはその近傍で、野生型
（即ち、ネイティブ）コートタンパク質とは異なるキメラコートタンパク質（例
えば、ファイバー、ヘキソンｐＩＸ、ｐＩＩＩａ、又はペントンタンパク質）を
含むウイルスベクターである。好ましくは、非ネイティブアミノ酸配列は、内部
コートタンパク質配列中に、又はその代わりに挿入される。当業者は、非ネイテ
ィブアミノ酸配列が、内部コートタンパク質配列内に、又は内部コートタンパク
質配列の末端で挿入できることを理解しよう。得られるキメラウイルスコートタ
ンパク質は、キメラウイルスコートタンパク質よりもむしろ野生型ウイルスコー
トタンパク質を含むことを除いて同一であるベクターの細胞への侵入よりも、コ
ートタンパク質を含むウイルスベクター、即ちアデノウイルスベクターの細胞へ
の、より効率的な直接的侵入を可能とすることができる。好ましくは、キメラウ
イルスコートタンパク質は、野生型コートタンパク質を含むベクターによっては
認識されない、又は僅かしか認識されない細胞表面に存在する新規な内因性結合
部位と結合する。侵入のこの効率の増大の１つの直接的な結果は、ウイルス、好
ましくはアデノウイルスが、野生型コートタンパク質を含むウイルスが典型的に
は侵入できない、又は低い効率でしか侵入できない多数の細胞型に結合又は侵入
できるということである。
【００３０】
本発明の別の実施態様では、発現ベクターは、真核細胞の特定の型に選択的で
はないキメラウイルスコートタンパク質を含むウイルスベクターである。キメラ
コートタンパク質は、非ネイティブアミノ酸配列の、内部コートタンパク質配列
中への挿入、又はその代わりの挿入によって、野生型コートタンパク質とは異な
る。この実施態様において、キメラウイルスコートタンパク質は、国際特許出願
ＷＯ ９７／２００５１に記載のように、野生型ウイルスコートよりもより広範
囲の真核細胞と効率的に結合する。
はないキメラウイルスコートタンパク質を含むウイルスベクターである。キメラ
コートタンパク質は、非ネイティブアミノ酸配列の、内部コートタンパク質配列
中への挿入、又はその代わりの挿入によって、野生型コートタンパク質とは異な
る。この実施態様において、キメラウイルスコートタンパク質は、国際特許出願
ＷＯ ９７／２００５１に記載のように、野生型ウイルスコートよりもより広範
囲の真核細胞と効率的に結合する。
【００３１】
アデノウイルスのある一定の細胞への結合の特異性はまた、米国特許第５，９
６２，３１１号で考察のように、短いシャフトのアデノウイルスファイバー遺伝
子を含むアデノウイルスの使用によって調節できる。短いシャフトのアデノウイ
ルスファイバー遺伝子を含むアデノウイルスの使用は、その細胞表面受容体への
、アデノウイルスファイバー結合のレベル又は効率を減少させ、その細胞表面受
容体へのアデノウイルスペントンベース（penton base）結合を増大させ、それ
によって、アデノウイルスの、ある一定の細胞への結合の特異性を増大させる。
あるいは、短いシャフトのファイバーを含むアデノウイルスの使用は、非ネイテ
ィブアミノ酸配列の、ペントンベースもしくはファイバーノブ（fiber knob）へ
の導入によって、所望の細胞表面受容体へのアデノウイルスのターゲティングを
可能とする。
６２，３１１号で考察のように、短いシャフトのアデノウイルスファイバー遺伝
子を含むアデノウイルスの使用によって調節できる。短いシャフトのアデノウイ
ルスファイバー遺伝子を含むアデノウイルスの使用は、その細胞表面受容体への
、アデノウイルスファイバー結合のレベル又は効率を減少させ、その細胞表面受
容体へのアデノウイルスペントンベース（penton base）結合を増大させ、それ
によって、アデノウイルスの、ある一定の細胞への結合の特異性を増大させる。
あるいは、短いシャフトのファイバーを含むアデノウイルスの使用は、非ネイテ
ィブアミノ酸配列の、ペントンベースもしくはファイバーノブ（fiber knob）へ
の導入によって、所望の細胞表面受容体へのアデノウイルスのターゲティングを
可能とする。
【００３２】
もちろん、可能性のある宿主細胞を認識するウイルスベクターの能力は、コー
トタンパク質の遺伝子操作無くして調節できる。ペントンベース結合ドメインと
特定の細胞表面結合部位に選択的に結合するドメインとを有する２重特異的（bi
specific）な分子とアデノウイルスとの複合体形成は、当業者が、ベクターを特
定の細胞型にターゲティングさせることを可能とする。
トタンパク質の遺伝子操作無くして調節できる。ペントンベース結合ドメインと
特定の細胞表面結合部位に選択的に結合するドメインとを有する２重特異的（bi
specific）な分子とアデノウイルスとの複合体形成は、当業者が、ベクターを特
定の細胞型にターゲティングさせることを可能とする。
【００３３】
ウイルスベクター、特にアデノウイルスベクターへの適切な修飾は、米国特許
第５，５５９，０９９号、同第５，７３１，１９０号、同第５，７１２，１３６
号、同第５，７７０，４４２号、同第５，８４６，７８２号、同第５，９２６，
３１１号、同第５，９６５，５４１号、同第６，０５７，１５５号、同第６，１
２７，５２５号、及び同第６，１５３，４３５号、並びに国際特許出願ＷＯ ９
６／０７７３４、ＷＯ ９６／２６２８１，ＷＯ ９７／２００５１、ＷＯ ９８
／０７８６５、ＷＯ ９８／０７８７７、ＷＯ ９８／５４３４６、及びＷＯ ０
０／１５８２３に記載されている。同様に、多数の発現ベクターは市販されてい
ることが認識されよう。発現ベクターの構築は、当業界で良く理解されている。
アデノウイルスベクターは、例えば、米国特許第５，９６５，３５８号、並びに
国際特許出願ＷＯ ９８／５６９３７、ＷＯ ９９／１５６８６、及びＷＯ ９９
／５４４４１に記載の方法を用いて、構築及び／又は精製できる。アデノ随伴ウ
イルスベクターは、例えば、米国特許第４，７９７，３６８号及びLaughlin et
al., Gene, 23,65-73(1983)に記載の方法を用いて、構築及び／又は精製できる
。
第５，５５９，０９９号、同第５，７３１，１９０号、同第５，７１２，１３６
号、同第５，７７０，４４２号、同第５，８４６，７８２号、同第５，９２６，
３１１号、同第５，９６５，５４１号、同第６，０５７，１５５号、同第６，１
２７，５２５号、及び同第６，１５３，４３５号、並びに国際特許出願ＷＯ ９
６／０７７３４、ＷＯ ９６／２６２８１，ＷＯ ９７／２００５１、ＷＯ ９８
／０７８６５、ＷＯ ９８／０７８７７、ＷＯ ９８／５４３４６、及びＷＯ ０
０／１５８２３に記載されている。同様に、多数の発現ベクターは市販されてい
ることが認識されよう。発現ベクターの構築は、当業界で良く理解されている。
アデノウイルスベクターは、例えば、米国特許第５，９６５，３５８号、並びに
国際特許出願ＷＯ ９８／５６９３７、ＷＯ ９９／１５６８６、及びＷＯ ９９
／５４４４１に記載の方法を用いて、構築及び／又は精製できる。アデノ随伴ウ
イルスベクターは、例えば、米国特許第４，７９７，３６８号及びLaughlin et
al., Gene, 23,65-73(1983)に記載の方法を用いて、構築及び／又は精製できる
。
【００３４】
本発明の方法での使用のための発現ベクターの選択は、例えば、宿主、ベクタ
ーの免疫原性、タンパク質産生の所望の持続などの種々の因子によろう。発現ベ
クターの各型は異なる性質を有するので、研究者は、本発明の方法を、任意の特
定の状況に合わせる自由を有する。更に、２つ以上の型の発現ベクターが、眼細
胞に核酸配列を送達するために使用できる。このように、本発明は、少なくとも
１つの眼関連疾患のための動物の予防的処置又は治療的処置の方法であって、眼
細胞を、血管形成阻害剤をコードする核酸配列及び／又は神経栄養剤をコードす
る核酸配列を各々含む異なる発現ベクターと接触させることを含む方法を提供す
る。血管形成阻害剤をコードする核酸配列及び／又は神経栄養剤をコードする核
酸配列が発現され、それによって、血管形成阻害剤及び／又は神経栄養剤の産生
が生じ、眼関連疾患のための動物に予防的処置又は治療的処置を行う。
ーの免疫原性、タンパク質産生の所望の持続などの種々の因子によろう。発現ベ
クターの各型は異なる性質を有するので、研究者は、本発明の方法を、任意の特
定の状況に合わせる自由を有する。更に、２つ以上の型の発現ベクターが、眼細
胞に核酸配列を送達するために使用できる。このように、本発明は、少なくとも
１つの眼関連疾患のための動物の予防的処置又は治療的処置の方法であって、眼
細胞を、血管形成阻害剤をコードする核酸配列及び／又は神経栄養剤をコードす
る核酸配列を各々含む異なる発現ベクターと接触させることを含む方法を提供す
る。血管形成阻害剤をコードする核酸配列及び／又は神経栄養剤をコードする核
酸配列が発現され、それによって、血管形成阻害剤及び／又は神経栄養剤の産生
が生じ、眼関連疾患のための動物に予防的処置又は治療的処置を行う。
【００３５】
好ましくは、発現ベクターの少なくとも２つの異なる型（即ち、プラスミドと
ウイルスベクター、又は２つの異なるウイルスベクター）を眼細胞に送達する。
少なくとも１つの発現ベクターは、血管形成阻害剤をコードする核酸配列を含み
うる。同様に、少なくとも１つの発現ベクターは、神経栄養剤をコードする核酸
配列を含みうる。実際、幾つかは、血管形成阻害剤のためのコーディング配列を
含み、幾つかは、神経栄養剤のためのコーディング配列を含む発現ベクターの混
合物も投与できる。望ましくは、少なくとも１つの発現ベクターは、血管形成阻
害剤をコードする核酸配列と神経栄養剤をコードする核酸配列を含む。より好ま
しくは、血管形成阻害剤をコードする核酸配列と神経栄養剤をコードする核酸配
列は同一の核酸である。また好ましくは、血管形成阻害剤と神経栄養剤は単一因
子である。好ましくは、眼細胞は、アデノウイルスベクターとアデノ随伴ウイル
スベクターに接触される。当業者は、眼関連疾患を治療又は研究するために、長
所的性質を利用する多重送達系の能力を理解しよう。
ウイルスベクター、又は２つの異なるウイルスベクター）を眼細胞に送達する。
少なくとも１つの発現ベクターは、血管形成阻害剤をコードする核酸配列を含み
うる。同様に、少なくとも１つの発現ベクターは、神経栄養剤をコードする核酸
配列を含みうる。実際、幾つかは、血管形成阻害剤のためのコーディング配列を
含み、幾つかは、神経栄養剤のためのコーディング配列を含む発現ベクターの混
合物も投与できる。望ましくは、少なくとも１つの発現ベクターは、血管形成阻
害剤をコードする核酸配列と神経栄養剤をコードする核酸配列を含む。より好ま
しくは、血管形成阻害剤をコードする核酸配列と神経栄養剤をコードする核酸配
列は同一の核酸である。また好ましくは、血管形成阻害剤と神経栄養剤は単一因
子である。好ましくは、眼細胞は、アデノウイルスベクターとアデノ随伴ウイル
スベクターに接触される。当業者は、眼関連疾患を治療又は研究するために、長
所的性質を利用する多重送達系の能力を理解しよう。
【００３６】
本発明の一実施態様は、加齢性黄斑変性のための動物の予防的処置又は治療的
処置の方法を提供する。本方法は、加齢性黄斑変性と関連する眼細胞を、少なく
とも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子をコードす
る核酸配列を含む発現ベクターと接触させることを含む。あるいは、眼細胞は、
各々の発現ベクターが少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１
つの神経栄養因子をコードする核酸配列を含む、少なくとも２つの異なる型の発
現ベクターと接触される。加齢性黄斑変性は普通は老人がかかるので、好ましく
は、発現ベクターは、少なくとも５５歳の動物、即ち、ヒトに投与する。加齢性
黄斑変性は、多くの眼組織を冒す種々の合併症に付随する複雑な疾患である。加
齢性黄斑変性と関連した眼細胞としては、神経起源の細胞、網膜の全ての層の細
胞、特に網膜色素上皮細胞、グリア細胞及び周細胞が挙げられるがそれらに限定
されない。本発明の方法での使用のために適切な他の眼細胞としては、例えば、
内皮細胞、虹彩上皮細胞、角膜細胞、毛様体上皮細胞、ミュラー細胞、アストロ
サイト、及び線維柱網（trabecular meshwork）細胞が挙げられる。線維柱網は
、眼の外への排液のための通過と関連する。種々の眼関連疾患に関連する他の細
胞としては、例えば、線維芽細胞や血管内皮細胞が挙げられる。大部分の網膜ダ
メージは、浮腫、下に存在する膜の肥厚、及び代謝性副産物の累積の結果として
起こるという点で、好ましくは、発現ベクターは、血管漏出の区域に投与される
。
処置の方法を提供する。本方法は、加齢性黄斑変性と関連する眼細胞を、少なく
とも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子をコードす
る核酸配列を含む発現ベクターと接触させることを含む。あるいは、眼細胞は、
各々の発現ベクターが少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１
つの神経栄養因子をコードする核酸配列を含む、少なくとも２つの異なる型の発
現ベクターと接触される。加齢性黄斑変性は普通は老人がかかるので、好ましく
は、発現ベクターは、少なくとも５５歳の動物、即ち、ヒトに投与する。加齢性
黄斑変性は、多くの眼組織を冒す種々の合併症に付随する複雑な疾患である。加
齢性黄斑変性と関連した眼細胞としては、神経起源の細胞、網膜の全ての層の細
胞、特に網膜色素上皮細胞、グリア細胞及び周細胞が挙げられるがそれらに限定
されない。本発明の方法での使用のために適切な他の眼細胞としては、例えば、
内皮細胞、虹彩上皮細胞、角膜細胞、毛様体上皮細胞、ミュラー細胞、アストロ
サイト、及び線維柱網（trabecular meshwork）細胞が挙げられる。線維柱網は
、眼の外への排液のための通過と関連する。種々の眼関連疾患に関連する他の細
胞としては、例えば、線維芽細胞や血管内皮細胞が挙げられる。大部分の網膜ダ
メージは、浮腫、下に存在する膜の肥厚、及び代謝性副産物の累積の結果として
起こるという点で、好ましくは、発現ベクターは、血管漏出の区域に投与される
。
【００３７】
本発明によれば、核酸配列は、発現に必要な制御配列、即ちプロモーターに機
能可能に結合される。“プロモーター”は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指向し
、それによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列である。プロモーターが核酸配
列の転写を指向しうるとき、核酸配列は、プロモーターと“機能可能に結合”し
ている。プロモーターは、それが機能可能に結合している核酸配列に対しネイテ
ィブ又は非ネイティブでありうる。
能可能に結合される。“プロモーター”は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指向し
、それによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列である。プロモーターが核酸配
列の転写を指向しうるとき、核酸配列は、プロモーターと“機能可能に結合”し
ている。プロモーターは、それが機能可能に結合している核酸配列に対しネイテ
ィブ又は非ネイティブでありうる。
【００３８】
任意のプロモーター（即ち、天然から単離されようと、組換えＤＮＡ技術もし
くは合成技術によって産生されようと）が、核酸配列を転写させるために、本発
明に関し使用できる。好ましくは、プロモーターは、真核（望ましくは哺乳動物
）細胞での転写を指向しうる。プロモーターの機能は、ベクターに存在する１つ
以上のエンハンサー及び／又はサイレンサーの存在によって変りうる。“エンハ
ンサー”は、隣接遺伝子の転写を刺激又は阻害するＤＮＡのシス作用エレメント
である。転写を阻害するエンハンサーはまた、“サイレンサー”と言われる。エ
ンハンサーは、どちらの方向でも機能でき、かつ数キロ塩基対（ｋｂ）までの距
離にわたって、転写領域の下流位置からでさえ機能できるという点において、プ
ロモーターでのみ見出される配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質のためのＤＮＡ結
合部位（“プロモーターエレメント”とも言われる）とは異なる。
くは合成技術によって産生されようと）が、核酸配列を転写させるために、本発
明に関し使用できる。好ましくは、プロモーターは、真核（望ましくは哺乳動物
）細胞での転写を指向しうる。プロモーターの機能は、ベクターに存在する１つ
以上のエンハンサー及び／又はサイレンサーの存在によって変りうる。“エンハ
ンサー”は、隣接遺伝子の転写を刺激又は阻害するＤＮＡのシス作用エレメント
である。転写を阻害するエンハンサーはまた、“サイレンサー”と言われる。エ
ンハンサーは、どちらの方向でも機能でき、かつ数キロ塩基対（ｋｂ）までの距
離にわたって、転写領域の下流位置からでさえ機能できるという点において、プ
ロモーターでのみ見出される配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質のためのＤＮＡ結
合部位（“プロモーターエレメント”とも言われる）とは異なる。
【００３９】
真核生物で機能するプロモーター配列の比較は、保存された配列エレメントを
明らかにした。一般的に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される真核生物
プロモーターは、およそ−２５の位置に中心がある“ＴＡＴＡボックス”（転写
開始を正確に位置決めするのに必須であるようである）によって象徴される。Ｔ
ＡＴＡボックスは、哺乳動物系において約３０塩基対（ｂｐ）下流で、ＲＮＡポ
リメラーゼに転写を開始させる。ＴＡＴＡボックスは、転写開始の上流の約４０
ｂｐと１１０ｂｐに位置する少なくとも２つの他の上流配列と一緒に機能する。
典型的には、いわゆる“ＣＣＡＡＴボックス”は、２つの上流配列の１つとして
役立ち、他方はしばしばＧＣリッチセグメントである。ＣＣＡＡＴ相同性は、Ｄ
ＮＡの異なる鎖に存在しうる。上流プロモーターエレメントはまた、当業界で記
載され、遺伝子のあるサブセットを特徴付けるように思われるものの１つなどの
特殊化したシグナルでありうる。
明らかにした。一般的に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される真核生物
プロモーターは、およそ−２５の位置に中心がある“ＴＡＴＡボックス”（転写
開始を正確に位置決めするのに必須であるようである）によって象徴される。Ｔ
ＡＴＡボックスは、哺乳動物系において約３０塩基対（ｂｐ）下流で、ＲＮＡポ
リメラーゼに転写を開始させる。ＴＡＴＡボックスは、転写開始の上流の約４０
ｂｐと１１０ｂｐに位置する少なくとも２つの他の上流配列と一緒に機能する。
典型的には、いわゆる“ＣＣＡＡＴボックス”は、２つの上流配列の１つとして
役立ち、他方はしばしばＧＣリッチセグメントである。ＣＣＡＡＴ相同性は、Ｄ
ＮＡの異なる鎖に存在しうる。上流プロモーターエレメントはまた、当業界で記
載され、遺伝子のあるサブセットを特徴付けるように思われるものの１つなどの
特殊化したシグナルでありうる。
【００４０】
転写を開始させるために、ＴＡＴＡボックスと上流配列は各々、これらの部位
に結合する調節タンパク質によって認識され、ＲＮＡポリメラーゼＩＩがＤＮＡ
セグメントと結合するのを可能とすることによって転写を活性化させ、適切に転
写を開始させる。ＴＡＴＡボックスと上流配列の外側の塩基の変化は、転写のレ
ベルに殆ど影響を与えないが、これらのエレメントのいずれかにおける塩基の変
化は、実質的に転写速度を減少させる（例えば、Myers et al., Science, 229,
242-247(1985)； McKnight et al., Science, 217,316-324(1982)）。互いに対
する、及び開始位置に対する、これらのエレメントの位置及び方向は、幾つかの
（全部ではないが）コーディング配列の効率的な転写に重要である。例えば、幾
つかのプロモーターは、任意のＴＡＴＡボックスの非存在下で十分に機能する。
同様に、ＲＮＡポリメラーゼＩもしくはＩＩＩ、又は他のＲＮＡポリメラーゼに
よって認識されるプロモーターに対しては、これらの配列及び他の配列の必要性
は異なりうる。
に結合する調節タンパク質によって認識され、ＲＮＡポリメラーゼＩＩがＤＮＡ
セグメントと結合するのを可能とすることによって転写を活性化させ、適切に転
写を開始させる。ＴＡＴＡボックスと上流配列の外側の塩基の変化は、転写のレ
ベルに殆ど影響を与えないが、これらのエレメントのいずれかにおける塩基の変
化は、実質的に転写速度を減少させる（例えば、Myers et al., Science, 229,
242-247(1985)； McKnight et al., Science, 217,316-324(1982)）。互いに対
する、及び開始位置に対する、これらのエレメントの位置及び方向は、幾つかの
（全部ではないが）コーディング配列の効率的な転写に重要である。例えば、幾
つかのプロモーターは、任意のＴＡＴＡボックスの非存在下で十分に機能する。
同様に、ＲＮＡポリメラーゼＩもしくはＩＩＩ、又は他のＲＮＡポリメラーゼに
よって認識されるプロモーターに対しては、これらの配列及び他の配列の必要性
は異なりうる。
【００４１】
それ故、プロモーター領域は、長さや配列において異なり得、配列特異的ＤＮ
Ａ結合タンパク質のための１つ以上のＤＮＡ結合部位及び／又はエンハンサーも
しくはサイレンサーを更に包含しうる。エンハンサー及び／又はサイレンサーは
、同様に、それ自体、プロモーターの外側の核酸配列上に存在しうる。
Ａ結合タンパク質のための１つ以上のＤＮＡ結合部位及び／又はエンハンサーも
しくはサイレンサーを更に包含しうる。エンハンサー及び／又はサイレンサーは
、同様に、それ自体、プロモーターの外側の核酸配列上に存在しうる。
【００４２】
本発明は優先的にウイルスプロモーターを使用する。適切なウイルスプロモー
ターは、当業界公知であり、例えば、ＣＭＶ初期即時型（early immediate）プ
ロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＩＶ長末端
反復プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター、
ＲＳＶ長末端反復などのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳
房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｌａｐ２プロモーターもしくはヘル
ペスチミジンキナーゼプロモーターなどのＨＳＶプロモーター（Wagner et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci., 78,144-145(1981)）、ＳＶ４０もしくはエプスタイン-
バーウイルス由来のプロモーター、ｐ５プロモーターなどのアデノ随伴ウイルス
プロモーターなどが挙げられる。好ましくは、ウイルスプロモーターは、Ａｄ２
もしくはＡｄ５主要後期プロモーターやトリパータイトリーダー（tripartite l
eader）などのアデノウイルスプロモーター、ＣＭＶプロモーター、又はＲＳＶ
プロモーターである。
ターは、当業界公知であり、例えば、ＣＭＶ初期即時型（early immediate）プ
ロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＩＶ長末端
反復プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター、
ＲＳＶ長末端反復などのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳
房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｌａｐ２プロモーターもしくはヘル
ペスチミジンキナーゼプロモーターなどのＨＳＶプロモーター（Wagner et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci., 78,144-145(1981)）、ＳＶ４０もしくはエプスタイン-
バーウイルス由来のプロモーター、ｐ５プロモーターなどのアデノ随伴ウイルス
プロモーターなどが挙げられる。好ましくは、ウイルスプロモーターは、Ａｄ２
もしくはＡｄ５主要後期プロモーターやトリパータイトリーダー（tripartite l
eader）などのアデノウイルスプロモーター、ＣＭＶプロモーター、又はＲＳＶ
プロモーターである。
【００４３】
上記プロモーターの多くは構成型プロモーターである。構成型プロモーターの
代わりに、プロモーターは、誘導型プロモーター、即ち、適切なシグナルに応答
してアップレギュレート及び／又はダウンレギュレートされるプロモーターであ
りうる。例えば、制御配列は、眼血管新生又は加齢性黄斑変性が低酸素と関連す
るときに活性である低酸素駆動プロモーターを含みうる。適切な誘導型プロモー
ター系の他の例としては、ＩＬ−８プロモーター、メタロチオネイン誘導型プロ
モーター系、細菌ｌａｃＺＹＡ発現系、テトラサイクリン発現系、及びＴ７ポリ
メラーゼ系が挙げられるがそれらに限定されない。更に、異なる発生段階で選択
的に活性化されるプロモーター（例えば、グロビン遺伝子は、胚と成人でグロビ
ン関連プロモーターから異なって転写される）を使用できる。核酸配列の発現を
制御するプロモーター配列は、外来性薬剤による制御に応答する少なくとも１つ
の異種制御配列を含みうる。この制御配列は好ましくは、薬剤、ホルモン又は他
の遺伝子産物など（これらに限定されない）の外来性薬剤に応答する。例えば、
制御配列（例えば、プロモーター）は、好ましくは、グルココルチコイド受容体
−ホルモン複合体に応答性であり、次いで、それは、治療性ペプチド又はその治
療性フラグメントの転写のレベルを増大させる。
代わりに、プロモーターは、誘導型プロモーター、即ち、適切なシグナルに応答
してアップレギュレート及び／又はダウンレギュレートされるプロモーターであ
りうる。例えば、制御配列は、眼血管新生又は加齢性黄斑変性が低酸素と関連す
るときに活性である低酸素駆動プロモーターを含みうる。適切な誘導型プロモー
ター系の他の例としては、ＩＬ−８プロモーター、メタロチオネイン誘導型プロ
モーター系、細菌ｌａｃＺＹＡ発現系、テトラサイクリン発現系、及びＴ７ポリ
メラーゼ系が挙げられるがそれらに限定されない。更に、異なる発生段階で選択
的に活性化されるプロモーター（例えば、グロビン遺伝子は、胚と成人でグロビ
ン関連プロモーターから異なって転写される）を使用できる。核酸配列の発現を
制御するプロモーター配列は、外来性薬剤による制御に応答する少なくとも１つ
の異種制御配列を含みうる。この制御配列は好ましくは、薬剤、ホルモン又は他
の遺伝子産物など（これらに限定されない）の外来性薬剤に応答する。例えば、
制御配列（例えば、プロモーター）は、好ましくは、グルココルチコイド受容体
−ホルモン複合体に応答性であり、次いで、それは、治療性ペプチド又はその治
療性フラグメントの転写のレベルを増大させる。
【００４４】
好ましくは、制御配列は、組織特異的プロモーター、即ち、ある組織で優先的
に活性化され、活性化された組織で遺伝子産物を発現するプロモーターを含む。
典型的に使用される組織特異的プロモーターは、筋細胞特異的プロモーターであ
る。筋細胞特異的プロモーターの代表的なプロモーターは、ミオシン軽鎖１Ａプ
ロモーターである。本発明のベクターで使用される組織特異的プロモーターは、
標的組織又は細胞型に基づき、当業者によって選択されることができる。本発明
の方法で使用される好適な組織特異的プロモーターは、ロドプシンプロモーター
などのように眼組織に特異的である。ロドプシンプロモーターの例としては、Ｇ
ＮＡＴコーン−トランスデューシングαサブユニット遺伝子プロモーター又は光
受容体間（interphotoreceptor）レチノイド結合タンパク質プロモーターが挙げ
られるがそれらに限定されない。
に活性化され、活性化された組織で遺伝子産物を発現するプロモーターを含む。
典型的に使用される組織特異的プロモーターは、筋細胞特異的プロモーターであ
る。筋細胞特異的プロモーターの代表的なプロモーターは、ミオシン軽鎖１Ａプ
ロモーターである。本発明のベクターで使用される組織特異的プロモーターは、
標的組織又は細胞型に基づき、当業者によって選択されることができる。本発明
の方法で使用される好適な組織特異的プロモーターは、ロドプシンプロモーター
などのように眼組織に特異的である。ロドプシンプロモーターの例としては、Ｇ
ＮＡＴコーン−トランスデューシングαサブユニット遺伝子プロモーター又は光
受容体間（interphotoreceptor）レチノイド結合タンパク質プロモーターが挙げ
られるがそれらに限定されない。
【００４５】
当業者は、各プロモーターが転写を駆動し、それ故、産生されるタンパク質の
時間と量に関し異なるようにタンパク質発現を駆動することを理解しよう。例え
ば、ＣＭＶプロモーターは、形質導入の直後（即ち、形質導入後２４時間）にピ
ーク活性を有し、その後、迅速に減弱するものとして特徴付けられる。一方、Ｒ
ＳＶプロモーターの活性は、徐々に増加し、形質導入後数日でピークに達し、数
週間高レベルの活性を維持する。事実、ＲＳＶプロモーターによって駆動される
持続発現は、例えば、肝細胞、肺細胞、脾臓細胞、横隔膜細胞、骨格筋細胞、及
び心筋細胞を含む研究された全ての細胞型で観察された。それ故、プロモーター
は、活性のその特定のパターンを、少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は
少なくとも１つの神経栄養因子の発現の所望のパターンとレベルに合わせること
によって、本発明の方法で使用するために選択できる。あるいは、複数のプロモ
ーターの所望の局面を組み合わせるハイブリッドプロモーターを構築できる。例
えば、ＣＭＶプロモーターの活性の初期の急増とＲＳＶプロモーターの活性の高
維持レベルを組み合わせるＣＭＶ−ＲＳＶハイブリッドプロモーターは、本発明
の方法の多くの実施態様での使用のために特に好適であろう。研究者によって操
作できる発現プロフィールを有するプロモーターを選択することも可能である。
時間と量に関し異なるようにタンパク質発現を駆動することを理解しよう。例え
ば、ＣＭＶプロモーターは、形質導入の直後（即ち、形質導入後２４時間）にピ
ーク活性を有し、その後、迅速に減弱するものとして特徴付けられる。一方、Ｒ
ＳＶプロモーターの活性は、徐々に増加し、形質導入後数日でピークに達し、数
週間高レベルの活性を維持する。事実、ＲＳＶプロモーターによって駆動される
持続発現は、例えば、肝細胞、肺細胞、脾臓細胞、横隔膜細胞、骨格筋細胞、及
び心筋細胞を含む研究された全ての細胞型で観察された。それ故、プロモーター
は、活性のその特定のパターンを、少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は
少なくとも１つの神経栄養因子の発現の所望のパターンとレベルに合わせること
によって、本発明の方法で使用するために選択できる。あるいは、複数のプロモ
ーターの所望の局面を組み合わせるハイブリッドプロモーターを構築できる。例
えば、ＣＭＶプロモーターの活性の初期の急増とＲＳＶプロモーターの活性の高
維持レベルを組み合わせるＣＭＶ−ＲＳＶハイブリッドプロモーターは、本発明
の方法の多くの実施態様での使用のために特に好適であろう。研究者によって操
作できる発現プロフィールを有するプロモーターを選択することも可能である。
【００４６】
また好ましくは、発現ベクターは、核酸配列の発現を調節するシス作用因子を
コードする核酸を含む。好ましくは、シス作用因子としては、とりわけ、マトリ
ックス結合領域（matrix attachment region）（ＭＡＲ）配列（例えば、イムノ
グロブリン重鎖（Jenunwin et al., Nature, 385(16), 269(1997)）、アポリポ
タンパク質Ｂ、又は遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）配列が挙げられる。ＭＡＲ配列
は、ヌクレアーゼ消化と抽出の組み合わせ後、核マトリックスと結合するＤＮＡ
配列として特徴付けられた（Bode et al., Science, 255(5041), 195-197(1992)
）。ＭＡＲ配列は、エンハンサー型調節領域としばしば結合し、ゲノムＤＮＡに
組み込まれたとき、ＭＡＲ配列は、隣接ヌクレオチド配列の転写活性を増大させ
る。ＭＡＲ配列は、クロマチン構造のトポロジカル状態を制御するのに役割を有
し、それによって、転写的に活性な複合体の形成を容易にすることが仮定されて
いる。同様に、ＬＣＲ配列は、転写に許容的なドメインを確立及び／又は維持す
るように機能すると考えられている。多くのＬＣＲ配列は、付随する核酸配列の
組織特異的発現を生じさせる。ＭＡＲ又はＬＣＲ配列の発現ベクターへの付加は
、少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子の
発現を更に増大させることができる。
コードする核酸を含む。好ましくは、シス作用因子としては、とりわけ、マトリ
ックス結合領域（matrix attachment region）（ＭＡＲ）配列（例えば、イムノ
グロブリン重鎖（Jenunwin et al., Nature, 385(16), 269(1997)）、アポリポ
タンパク質Ｂ、又は遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）配列が挙げられる。ＭＡＲ配列
は、ヌクレアーゼ消化と抽出の組み合わせ後、核マトリックスと結合するＤＮＡ
配列として特徴付けられた（Bode et al., Science, 255(5041), 195-197(1992)
）。ＭＡＲ配列は、エンハンサー型調節領域としばしば結合し、ゲノムＤＮＡに
組み込まれたとき、ＭＡＲ配列は、隣接ヌクレオチド配列の転写活性を増大させ
る。ＭＡＲ配列は、クロマチン構造のトポロジカル状態を制御するのに役割を有
し、それによって、転写的に活性な複合体の形成を容易にすることが仮定されて
いる。同様に、ＬＣＲ配列は、転写に許容的なドメインを確立及び／又は維持す
るように機能すると考えられている。多くのＬＣＲ配列は、付随する核酸配列の
組織特異的発現を生じさせる。ＭＡＲ又はＬＣＲ配列の発現ベクターへの付加は
、少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子の
発現を更に増大させることができる。
【００４７】
本発明の発現ベクターに存在するプロモーター、核酸配列、選択可能マーカー
などに関し、このようなエレメントは、独立して又は共役して、カセットの一部
として存在しうる。本発明の状況において、“カセット”は、核酸配列のサブク
ローニングと回収を容易にする機能を有する特定の塩基配列であるか（例えば、
１つ以上の制限部位）、又は特定の核酸配列の発現を容易にする機能を有する特
定の塩基配列である（例えば、ポリアデニル化部位又はスプライス部位）。
などに関し、このようなエレメントは、独立して又は共役して、カセットの一部
として存在しうる。本発明の状況において、“カセット”は、核酸配列のサブク
ローニングと回収を容易にする機能を有する特定の塩基配列であるか（例えば、
１つ以上の制限部位）、又は特定の核酸配列の発現を容易にする機能を有する特
定の塩基配列である（例えば、ポリアデニル化部位又はスプライス部位）。
【００４８】
発現に必要な制御配列に機能可能に結合した外来核酸の構築は、十分に当業界
の技術内に存在する（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labora
tory Manual, 2d ed.(1989)参照）。本発明の核酸配列の発現に関し、当業者は
、例えば、転写、ｍＲＮＡ翻訳、及び転写後プロセシングなどの異なる遺伝子シ
グナル及びプロセシング事象が、細胞内の核酸及びタンパク質／ペプチドのレベ
ルを制御することに留意する。ＤＮＡのＲＮＡへの転写は、本明細書記載のよう
に、機能性プロモーターを必要とする。
の技術内に存在する（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labora
tory Manual, 2d ed.(1989)参照）。本発明の核酸配列の発現に関し、当業者は
、例えば、転写、ｍＲＮＡ翻訳、及び転写後プロセシングなどの異なる遺伝子シ
グナル及びプロセシング事象が、細胞内の核酸及びタンパク質／ペプチドのレベ
ルを制御することに留意する。ＤＮＡのＲＮＡへの転写は、本明細書記載のよう
に、機能性プロモーターを必要とする。
【００４９】
タンパク質発現は、ＤＮＡシグナル、及びＤＮＡ鋳型のレベルによって制御さ
れるＲＮＡ転写のレベルに依存している。同様に、ｍＲＮＡの翻訳は、まさに少
なくともＡＵＧ開始コドンを必要とする。それは、メッセージの５’末端の１０
〜１００ヌクレオチド内に通常存在する。ＡＵＧ開始コドンに隣接する配列は、
真核生物リボソームによるその認識に影響を与えることとともに、完全なKozak
コンセンサス配列への一致は、最適な翻訳を生じることが示されている（例えば
、Kozak, J.Molec.Biol., 196, 947-950(1987)）。また、細胞中での外来核酸の
成功的発現は、得られるタンパク質の翻訳後修飾を必要とする。このように、タ
ンパク質の生産は、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）がｍＲＮＡに転写される効率、ｍＲＮ
Ａがタンパク質に翻訳される効率、及び細胞が翻訳後修飾を行う能力によって影
響されうる。これらは、当業者が留意し、かつ所望の最終結果を達成するために
標準的技術を用いて操作できる全ての因子である。
れるＲＮＡ転写のレベルに依存している。同様に、ｍＲＮＡの翻訳は、まさに少
なくともＡＵＧ開始コドンを必要とする。それは、メッセージの５’末端の１０
〜１００ヌクレオチド内に通常存在する。ＡＵＧ開始コドンに隣接する配列は、
真核生物リボソームによるその認識に影響を与えることとともに、完全なKozak
コンセンサス配列への一致は、最適な翻訳を生じることが示されている（例えば
、Kozak, J.Molec.Biol., 196, 947-950(1987)）。また、細胞中での外来核酸の
成功的発現は、得られるタンパク質の翻訳後修飾を必要とする。このように、タ
ンパク質の生産は、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）がｍＲＮＡに転写される効率、ｍＲＮ
Ａがタンパク質に翻訳される効率、及び細胞が翻訳後修飾を行う能力によって影
響されうる。これらは、当業者が留意し、かつ所望の最終結果を達成するために
標準的技術を用いて操作できる全ての因子である。
【００５０】
これらの方針に沿って、タンパク質産生を最適化するために、好ましくは、核
酸配列は、核酸配列のコーディング領域後にポリアデニル化部位を更に含む。ま
た好ましくは、全ての適切な転写シグナル（及び、必要な場合には、翻訳シグナ
ル）は、その核酸配列が導入される細胞内で適切に発現されるように、正しく配
置される。所望ならば、核酸配列はまた、ｍＲＮＡ産生を容易にするように、ス
プライス部位（即ち、スプライスアクセプター部位及びスプライスドナー部位）
を組み込むことができる。更に、核酸配列が、プロセシングされるタンパク質又
は分泌タンパク質であるタンパク質もしくはペプチド、あるいは細胞内で作用す
るタンパク質もしくはペプチドをコードするならば、好ましくは、核酸配列は、
プロセシング、分泌、細胞内局在などのための適切な配列を更に含む。
酸配列は、核酸配列のコーディング領域後にポリアデニル化部位を更に含む。ま
た好ましくは、全ての適切な転写シグナル（及び、必要な場合には、翻訳シグナ
ル）は、その核酸配列が導入される細胞内で適切に発現されるように、正しく配
置される。所望ならば、核酸配列はまた、ｍＲＮＡ産生を容易にするように、ス
プライス部位（即ち、スプライスアクセプター部位及びスプライスドナー部位）
を組み込むことができる。更に、核酸配列が、プロセシングされるタンパク質又
は分泌タンパク質であるタンパク質もしくはペプチド、あるいは細胞内で作用す
るタンパク質もしくはペプチドをコードするならば、好ましくは、核酸配列は、
プロセシング、分泌、細胞内局在などのための適切な配列を更に含む。
【００５１】
ある実施態様において、少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくと
も１つの神経栄養因子の発現を調節することは利点がありうる。核酸配列の発現
調節の特に好適な方法としては、発現ベクターへの部位特異的組換え部位の付加
が挙げられる。部位特異的組換え部位を含む発現ベクターをリコンビナーゼと接
触させることは、組換え事象により、コーディング配列の転写をアップレギュレ
ート又はダウンレギュレートするか、又は同時に、１つのコーディング配列の転
写をアップレギュレートし、別のコーディング領域の転写をダウンレギュレート
するであろう。部位特異的組換えを使用して核酸配列の転写を調節することは、
例えば、米国特許第５，８０１，０３０号、同第６，０６３，６２７号及び国際
特許出願ＷＯ ９７／０９４３９に記載されている。
も１つの神経栄養因子の発現を調節することは利点がありうる。核酸配列の発現
調節の特に好適な方法としては、発現ベクターへの部位特異的組換え部位の付加
が挙げられる。部位特異的組換え部位を含む発現ベクターをリコンビナーゼと接
触させることは、組換え事象により、コーディング配列の転写をアップレギュレ
ート又はダウンレギュレートするか、又は同時に、１つのコーディング配列の転
写をアップレギュレートし、別のコーディング領域の転写をダウンレギュレート
するであろう。部位特異的組換えを使用して核酸配列の転写を調節することは、
例えば、米国特許第５，８０１，０３０号、同第６，０６３，６２７号及び国際
特許出願ＷＯ ９７／０９４３９に記載されている。
【００５２】
好ましくは、本発明の方法の発現ベクターは、血管形成阻害剤をコードする核
酸を含む。より好ましくは、核酸配列は、血管形成の複数の阻害剤をコードする
。“血管形成阻害剤”は、血管新生を防止又は改善する任意の因子を意味する。
当業者は、血管新生の完全な防止又は改善が治療効果を実現するために必要では
無いことを理解しよう。それ故、本発明の方法では、血管形成の部分的及び完全
の両方の防止及び改善を意図する。血管形成阻害剤としては、例えば抗血管形成
因子、血管形成因子に特異的なアンチセンス分子、リボザイム、血管形成因子の
受容体、及び血管形成因子の受容体と結合する抗体が挙げられる。
酸を含む。より好ましくは、核酸配列は、血管形成の複数の阻害剤をコードする
。“血管形成阻害剤”は、血管新生を防止又は改善する任意の因子を意味する。
当業者は、血管新生の完全な防止又は改善が治療効果を実現するために必要では
無いことを理解しよう。それ故、本発明の方法では、血管形成の部分的及び完全
の両方の防止及び改善を意図する。血管形成阻害剤としては、例えば抗血管形成
因子、血管形成因子に特異的なアンチセンス分子、リボザイム、血管形成因子の
受容体、及び血管形成因子の受容体と結合する抗体が挙げられる。
【００５３】
本発明での使用のために意図される抗血管形成因子としては、色素上皮由来因
子、アンジオスタチン、バスキュロスタチン（vasculostatin）、エンドスタチ
ン、血小板因子４、ヘパリナーゼ、インターフェロン（例えば、ＩＮＦα）など
が挙げられる。当業者は、任意の抗血管形成因子が修飾又は短縮化されても、抗
血管形成活性を維持できることを理解しよう。それ故、抗血管形成因子の活性フ
ラグメント（即ち、血管形成を阻害するのに十分な生物活性を有するフラグメン
ト）もまた、本発明の方法での使用に適切である。
子、アンジオスタチン、バスキュロスタチン（vasculostatin）、エンドスタチ
ン、血小板因子４、ヘパリナーゼ、インターフェロン（例えば、ＩＮＦα）など
が挙げられる。当業者は、任意の抗血管形成因子が修飾又は短縮化されても、抗
血管形成活性を維持できることを理解しよう。それ故、抗血管形成因子の活性フ
ラグメント（即ち、血管形成を阻害するのに十分な生物活性を有するフラグメン
ト）もまた、本発明の方法での使用に適切である。
【００５４】
血管形成因子に特異的なアンチセンス分子は一般的には、阻害されるべき血管
形成因子をコードする核酸の少なくとも一部、好ましくは少なくとも約２０個の
連続するヌクレオチドに実質的に同一であるべきであるが、必ずしも同一である
必要はない。阻害効果が、核酸に相同性又は実質的な相同性を示す遺伝子のファ
ミリー内の他のタンパク質に適用されるように、アンチセンス核酸分子を設計す
ることができる。導入されるアンチセンス核酸分子はまた、１次転写産物又は十
分にプロセシングされたｍＲＮＡに対し完全長である必要はない。一般的に、よ
り高い相同性は、より短い配列の使用を補うために使用できる。更に、アンチセ
ンス分子は、同じイントロン又はエキソンパターンを持つ必要がなく、非コーデ
ィングセグメントの相同性は等しく有効であろう。アンチセンスホスホロチオタ
ック（antisense phosphorothiotac）オリゴデオキシヌクレオチド（ＰＳ−ＯＤ
Ｎ）は、血管形成因子に特異的なアンチセンス分子の代表である。
形成因子をコードする核酸の少なくとも一部、好ましくは少なくとも約２０個の
連続するヌクレオチドに実質的に同一であるべきであるが、必ずしも同一である
必要はない。阻害効果が、核酸に相同性又は実質的な相同性を示す遺伝子のファ
ミリー内の他のタンパク質に適用されるように、アンチセンス核酸分子を設計す
ることができる。導入されるアンチセンス核酸分子はまた、１次転写産物又は十
分にプロセシングされたｍＲＮＡに対し完全長である必要はない。一般的に、よ
り高い相同性は、より短い配列の使用を補うために使用できる。更に、アンチセ
ンス分子は、同じイントロン又はエキソンパターンを持つ必要がなく、非コーデ
ィングセグメントの相同性は等しく有効であろう。アンチセンスホスホロチオタ
ック（antisense phosphorothiotac）オリゴデオキシヌクレオチド（ＰＳ−ＯＤ
Ｎ）は、血管形成因子に特異的なアンチセンス分子の代表である。
【００５５】
実質的に任意の標的ＲＮＡと特異的に対合し、かつ特定の個所でホスホジエス
テル骨格を切断し、それによって標的ＲＮＡを機能的に不活化するリボザイムを
設計できる。リボザイムは、リボザイムそれ自体はこの切断を行う際に変化せず
、それ故、再利用でき、かつ他の分子を切断できるという点で、正真正銘の酵素
である。アンチセンスＲＮＡ内にリボザイム配列を包含させることは、アンチセ
ンスＲＮＡにＲＮＡ切断活性を付与し、それによって構築物の活性を増加させる
。標的ＲＮＡ特異的リボザイムの設計と使用は、Haseloff et al., Nature, 334
,585-591(1988)に記載されている。好ましくは、リボザイムは、リボザイムの活
性部位の各側において標的配列に相補的な少なくとも約２０個の連続的なヌクレ
オチドを含む。
テル骨格を切断し、それによって標的ＲＮＡを機能的に不活化するリボザイムを
設計できる。リボザイムは、リボザイムそれ自体はこの切断を行う際に変化せず
、それ故、再利用でき、かつ他の分子を切断できるという点で、正真正銘の酵素
である。アンチセンスＲＮＡ内にリボザイム配列を包含させることは、アンチセ
ンスＲＮＡにＲＮＡ切断活性を付与し、それによって構築物の活性を増加させる
。標的ＲＮＡ特異的リボザイムの設計と使用は、Haseloff et al., Nature, 334
,585-591(1988)に記載されている。好ましくは、リボザイムは、リボザイムの活
性部位の各側において標的配列に相補的な少なくとも約２０個の連続的なヌクレ
オチドを含む。
【００５６】
血管形成因子に特異的な受容体は、細胞応答を促進できる機能的受容体から増
殖因子を隔離することによって、血管新生を阻害する。例えば、Ｆｌｔ及びＦｌ
ｋ受容体、並びにＶＥＧＦ受容体キメラタンパク質は、血管内皮細胞上のＶＥＧ
Ｆ受容体と競合し、内皮細胞増殖を阻害する（Aiello, PNAS, 92,10457(1995)）
。また、血管形成因子を中和するか、又は血管形成因子の受容体と結合する増殖
因子特異的抗体及びそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2及びＦ
ｖ）も意図される。
殖因子を隔離することによって、血管新生を阻害する。例えば、Ｆｌｔ及びＦｌ
ｋ受容体、並びにＶＥＧＦ受容体キメラタンパク質は、血管内皮細胞上のＶＥＧ
Ｆ受容体と競合し、内皮細胞増殖を阻害する（Aiello, PNAS, 92,10457(1995)）
。また、血管形成因子を中和するか、又は血管形成因子の受容体と結合する増殖
因子特異的抗体及びそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2及びＦ
ｖ）も意図される。
【００５７】
本発明はまた、少なくとも１つの神経栄養剤（又は神経栄養因子）をコードす
る核酸配列の、眼細胞又は加齢性黄斑変性と関連した細胞への送達を意図する。
神経栄養因子は、成長するニューロンの成熟や成人のニューロンの維持に関与す
ると考えられている。神経栄養因子は３つのサブクラス（ニューロポイエティッ
ク（neuropoietic）サイトカイン；ニューロトロフィン；及び線維芽細胞増殖因
子）に分類される。毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）は、ニューロポイエティッ
クサイトカインの例である。ＣＮＴＦは、毛様体神経節ニューロンの生存を促進
し、ＮＧＦ応答性である特定のニューロンを支持する。ニューロトロフィンとし
ては、例えば、脳由来神経栄養因子及び神経成長因子（恐らく、最も特徴付けら
れた神経栄養因子）が挙げられる。本発明の方法の核酸配列によってコードされ
るのに適切な他の神経栄養因子としては、例えば、トランスフォーミング増殖因
子、グリア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン
４／５、及びインターロイキン１−βが挙げられる。ａＦＧＦやｂＦＧＦなどの
血管形成と関連する神経栄養因子は、あまり好ましくはない。本発明の方法の神
経栄養因子はまた、ニューロン栄養因子(neuronotrophic factor)、例えば、ニ
ューロンの生存を増大させる因子でありうる。神経栄養因子は実際に、ニューロ
ンの分解をさせないようにできると仮定されている。このような因子は、おそら
く、視力喪失と関連するニューロンの変性を治療するのに有用である。神経栄養
因子は、パラクリン及びオートクリンの両方の様式で機能し、神経栄養因子を理
想的な治療薬とする。好ましくは、本発明の核酸配列は、血管形成阻害剤と神経
栄養因子の両方をコードする。より好ましくは、核酸配列は、抗血管形成性と神
経栄養性の両方の性質を含む少なくとも１つの因子をコードする。最も好ましく
は、抗血管形成性と神経栄養性の両方の性質を含む因子は、色素上皮由来因子（
ＰＥＤＦ）である。
る核酸配列の、眼細胞又は加齢性黄斑変性と関連した細胞への送達を意図する。
神経栄養因子は、成長するニューロンの成熟や成人のニューロンの維持に関与す
ると考えられている。神経栄養因子は３つのサブクラス（ニューロポイエティッ
ク（neuropoietic）サイトカイン；ニューロトロフィン；及び線維芽細胞増殖因
子）に分類される。毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）は、ニューロポイエティッ
クサイトカインの例である。ＣＮＴＦは、毛様体神経節ニューロンの生存を促進
し、ＮＧＦ応答性である特定のニューロンを支持する。ニューロトロフィンとし
ては、例えば、脳由来神経栄養因子及び神経成長因子（恐らく、最も特徴付けら
れた神経栄養因子）が挙げられる。本発明の方法の核酸配列によってコードされ
るのに適切な他の神経栄養因子としては、例えば、トランスフォーミング増殖因
子、グリア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン
４／５、及びインターロイキン１−βが挙げられる。ａＦＧＦやｂＦＧＦなどの
血管形成と関連する神経栄養因子は、あまり好ましくはない。本発明の方法の神
経栄養因子はまた、ニューロン栄養因子(neuronotrophic factor)、例えば、ニ
ューロンの生存を増大させる因子でありうる。神経栄養因子は実際に、ニューロ
ンの分解をさせないようにできると仮定されている。このような因子は、おそら
く、視力喪失と関連するニューロンの変性を治療するのに有用である。神経栄養
因子は、パラクリン及びオートクリンの両方の様式で機能し、神経栄養因子を理
想的な治療薬とする。好ましくは、本発明の核酸配列は、血管形成阻害剤と神経
栄養因子の両方をコードする。より好ましくは、核酸配列は、抗血管形成性と神
経栄養性の両方の性質を含む少なくとも１つの因子をコードする。最も好ましく
は、抗血管形成性と神経栄養性の両方の性質を含む因子は、色素上皮由来因子（
ＰＥＤＦ）である。
【００５８】
アーリーポピュレーションダブリングファクター−１（early population dou
bling factor-1）（ＥＰＣ−１）とも言われるＰＥＤＦは、セルピンという名の
セリンプロテアーゼ阻害剤のファミリーに相同性を有する分泌タンパク質である
。ＰＥＤＦは、網膜色素上皮細胞によって主に産生され、身体の大部分の組織や
細胞型で検出できる。ＰＥＤＦは、網膜芽細胞腫細胞で分化を誘導することが観
察され、ニューロン集団の生存を増大させる（Chader, Cell Different., 20,20
9-216(1987)）。ＰＥＤＦのように、不利な条件下でニューロンの生存を増大さ
せる因子は、本明細書記載のように“ニューロン栄養性”と言われる。ＰＥＤＦ
は更に、グリア抑制(gliastatic)活性、又はグリア細胞増殖を阻害する能力を有
する。上記のように、ＰＥＤＦはまた、抗血管形成活性を有する。ＰＥＤＦの抗
血管形成誘導体としては、ＷＯ ９９／０４８０６で考察されたＳＬＥＤタンパ
ク質が挙げられる。ＰＥＤＦは細胞老化に関与するとも仮定されたきた（Pignol
o et al., J.Biol.Chem., 268(12), 8949-8957(1998)）。本発明の方法で使用さ
れるＰＥＤＦは任意の源由来でありえ、そして米国特許第５，８４０，６８６号
、並びに国際特許出願ＷＯ ９３／２４５２９及びＷＯ ９９／０４８０６に更に
特徴付けられている。
bling factor-1）（ＥＰＣ−１）とも言われるＰＥＤＦは、セルピンという名の
セリンプロテアーゼ阻害剤のファミリーに相同性を有する分泌タンパク質である
。ＰＥＤＦは、網膜色素上皮細胞によって主に産生され、身体の大部分の組織や
細胞型で検出できる。ＰＥＤＦは、網膜芽細胞腫細胞で分化を誘導することが観
察され、ニューロン集団の生存を増大させる（Chader, Cell Different., 20,20
9-216(1987)）。ＰＥＤＦのように、不利な条件下でニューロンの生存を増大さ
せる因子は、本明細書記載のように“ニューロン栄養性”と言われる。ＰＥＤＦ
は更に、グリア抑制(gliastatic)活性、又はグリア細胞増殖を阻害する能力を有
する。上記のように、ＰＥＤＦはまた、抗血管形成活性を有する。ＰＥＤＦの抗
血管形成誘導体としては、ＷＯ ９９／０４８０６で考察されたＳＬＥＤタンパ
ク質が挙げられる。ＰＥＤＦは細胞老化に関与するとも仮定されたきた（Pignol
o et al., J.Biol.Chem., 268(12), 8949-8957(1998)）。本発明の方法で使用さ
れるＰＥＤＦは任意の源由来でありえ、そして米国特許第５，８４０，６８６号
、並びに国際特許出願ＷＯ ９３／２４５２９及びＷＯ ９９／０４８０６に更に
特徴付けられている。
【００５９】
眼関連疾患の予防的処置又は治療的処置の方法に加えて、本発明は更に、ＰＥ
ＤＦ又はその治療性フラグメントをコードする核酸配列を含むウイルスベクター
であって、その核酸配列がＰＥＤＦ又はその治療性フラグメントの発現に必要な
制御配列に機能可能に結合している、ウイルスベクターを提供する。核酸配列は
、任意の源から得ることができる（例えば、天然から単離されたもの、合成的に
産生されたもの、遺伝子操作された生物から単離されたものなど）。適切なウイ
ルスベクターと制御配列は、本明細書で考察されている。天然では、ＰＥＤＦは
、殆どヒト胎児網膜細胞でのみ産生される。ＲＰＥ細胞からのヒトＰＥＤＦの少
ない産生及びＰＥＤＦの源となる組織の不足は、この価値のある可能性のある治
療因子の使用を複雑にする。本発明のウイルスベクターは、十分な量の組換えＰ
ＥＤＦを産生するのに使用してもよいし、又は研究もしくは処置の方法、例えば
、本発明の方法で使用できる。
ＤＦ又はその治療性フラグメントをコードする核酸配列を含むウイルスベクター
であって、その核酸配列がＰＥＤＦ又はその治療性フラグメントの発現に必要な
制御配列に機能可能に結合している、ウイルスベクターを提供する。核酸配列は
、任意の源から得ることができる（例えば、天然から単離されたもの、合成的に
産生されたもの、遺伝子操作された生物から単離されたものなど）。適切なウイ
ルスベクターと制御配列は、本明細書で考察されている。天然では、ＰＥＤＦは
、殆どヒト胎児網膜細胞でのみ産生される。ＲＰＥ細胞からのヒトＰＥＤＦの少
ない産生及びＰＥＤＦの源となる組織の不足は、この価値のある可能性のある治
療因子の使用を複雑にする。本発明のウイルスベクターは、十分な量の組換えＰ
ＥＤＦを産生するのに使用してもよいし、又は研究もしくは処置の方法、例えば
、本発明の方法で使用できる。
【００６０】
発現ベクター、例えば、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベク
ターはまた、少なくとも１つの血管形成阻害剤又は少なくとも１つの神経栄養因
子の治療性フラグメントをコードする核酸配列を含みうる。当業者は、任意の血
管形成阻害剤又は神経栄養因子、例えばＰＥＤＦが、修飾又は短縮化されても、
抗血管形成活性又は神経栄養性活性を保持できることを理解しよう。それ故、治
療性フラグメント（即ち、例えば、血管形成を阻害するか又はニューロン生存を
促進するのに十分な生物活性を有するフラグメント）はまた、発現ベクターに組
み込むのに適切である。また、置換、欠失、又は付加を含むが、機能性血管形成
阻害剤又は神経栄養因子、又は上述の任意の治療性フラグメントをコードする核
酸配列は、発現ベクターへの組み込みに適切である。同様に抗血管形成因子若し
くは神経栄養因子又はその治療性フラグメント、及び例えば、ペプチドのコンフ
ォメーションを安定化する部分を含む融合タンパク質もまた、発現ベクターに存
在しうる。機能性血管形成阻害剤又はその治療性フラグメントは、血管新生を防
止又は改善する。機能性神経栄養因子又はその治療性フラグメントは望ましくは
、ニューロン細胞分化を促進し、グリア細胞増殖を阻害し、及び／又はニューロ
ン細胞生存を促進する。当業者は、血管新生の完全な防止又は改善が治療効果を
実現するために必要ではないことを理解しよう。同様に、ニューロン生存又は分
化の完全な誘導は、利益を実現するために必要ではない。それ故、部分的と完全
の両方の血管形成の防止と改善又はニューロン生存の促進が適切である。当業者
は、例えば、ニューロン細胞分化と生存アッセイ（例えば、米国特許第５，８４
０，６８６号参照）、血管新生のマウス耳モデル、又はラット後肢虚血モデルを
用いて、修飾治療性因子又はそのフラグンメントが神経栄養性治療活性と抗血管
形成治療活性を有するかどうかを決定する能力を有する。
ターはまた、少なくとも１つの血管形成阻害剤又は少なくとも１つの神経栄養因
子の治療性フラグメントをコードする核酸配列を含みうる。当業者は、任意の血
管形成阻害剤又は神経栄養因子、例えばＰＥＤＦが、修飾又は短縮化されても、
抗血管形成活性又は神経栄養性活性を保持できることを理解しよう。それ故、治
療性フラグメント（即ち、例えば、血管形成を阻害するか又はニューロン生存を
促進するのに十分な生物活性を有するフラグメント）はまた、発現ベクターに組
み込むのに適切である。また、置換、欠失、又は付加を含むが、機能性血管形成
阻害剤又は神経栄養因子、又は上述の任意の治療性フラグメントをコードする核
酸配列は、発現ベクターへの組み込みに適切である。同様に抗血管形成因子若し
くは神経栄養因子又はその治療性フラグメント、及び例えば、ペプチドのコンフ
ォメーションを安定化する部分を含む融合タンパク質もまた、発現ベクターに存
在しうる。機能性血管形成阻害剤又はその治療性フラグメントは、血管新生を防
止又は改善する。機能性神経栄養因子又はその治療性フラグメントは望ましくは
、ニューロン細胞分化を促進し、グリア細胞増殖を阻害し、及び／又はニューロ
ン細胞生存を促進する。当業者は、血管新生の完全な防止又は改善が治療効果を
実現するために必要ではないことを理解しよう。同様に、ニューロン生存又は分
化の完全な誘導は、利益を実現するために必要ではない。それ故、部分的と完全
の両方の血管形成の防止と改善又はニューロン生存の促進が適切である。当業者
は、例えば、ニューロン細胞分化と生存アッセイ（例えば、米国特許第５，８４
０，６８６号参照）、血管新生のマウス耳モデル、又はラット後肢虚血モデルを
用いて、修飾治療性因子又はそのフラグンメントが神経栄養性治療活性と抗血管
形成治療活性を有するかどうかを決定する能力を有する。
【００６１】
同様に、当業者は、血管形成阻害剤及び／又は神経栄養因子が抗血管形成因子
の受容体又は神経栄養因子の受容体に作用し、それによって所望の生物効果を生
じうる因子であることを理解しよう。例えば、発現ベクターは、ＰＥＤＦの生物
活性の原因である一連の細胞内事象をシグナル伝達するＰＥＤＦ受容体と結合し
、かつ活性化する抗体をコードする核酸配列を含みうる。ＰＥＤＦ受容体の考察
については、例えば、Alberdi et al., J.Biol.Chem., 274(44), 31605(1999)を
参照のこと。
の受容体又は神経栄養因子の受容体に作用し、それによって所望の生物効果を生
じうる因子であることを理解しよう。例えば、発現ベクターは、ＰＥＤＦの生物
活性の原因である一連の細胞内事象をシグナル伝達するＰＥＤＦ受容体と結合し
、かつ活性化する抗体をコードする核酸配列を含みうる。ＰＥＤＦ受容体の考察
については、例えば、Alberdi et al., J.Biol.Chem., 274(44), 31605(1999)を
参照のこと。
【００６２】
本発明はまた、本発明の方法において、キメラ又は融合ペプチドをコードする
核酸配列の使用を意図する。組換えＤＮＡ技術により、科学者は、２つ以上のタ
ンパク質を組み合わせたアミノ酸配列を含む融合タンパク質を産生できた。当業
者は、２つ以上の因子の活性ドメインを融合し、所望の活性を有するキメラペプ
チドを産生できる。キメラペプチドは、２つ以上のペプチドの全体のアミノ酸配
列を含みうるか、あるいは、２つ以上のペプチドの部分（例えば、１０、２０、
５０、７５、１００、４００、５００、又はそれ以上のアミノ酸残基）を含むよ
うに構築できる。望ましくは、キメラペプチドは、抗血管形成及び神経栄養性活
性を含む。これらの活性は、ルーチンな方法を用いて、決定できる。
核酸配列の使用を意図する。組換えＤＮＡ技術により、科学者は、２つ以上のタ
ンパク質を組み合わせたアミノ酸配列を含む融合タンパク質を産生できた。当業
者は、２つ以上の因子の活性ドメインを融合し、所望の活性を有するキメラペプ
チドを産生できる。キメラペプチドは、２つ以上のペプチドの全体のアミノ酸配
列を含みうるか、あるいは、２つ以上のペプチドの部分（例えば、１０、２０、
５０、７５、１００、４００、５００、又はそれ以上のアミノ酸残基）を含むよ
うに構築できる。望ましくは、キメラペプチドは、抗血管形成及び神経栄養性活
性を含む。これらの活性は、ルーチンな方法を用いて、決定できる。
【００６３】
本明細書考察のように、本発明の方法の発現ベクターは、少なくとも１つの血
管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子をコードする核酸配列を
含む。それ故、核酸配列は、複数の、即ち、２つ、３つ、又はそれ以上の血管形
成阻害剤をコードしうる。同様に、核酸配列は、複数の、即ち、２つ、３つ、又
はそれ以上の神経栄養因子をコードしうる。好適な実施態様において、核酸配列
は、ＰＥＤＦ及び毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）をコードする。また好ましく
は、核酸配列は、少なくとも１つの血管形成阻害剤及び少なくとも１つの神経栄
養因子をコードする。複数の血管形成阻害剤及び／又は複数の神経栄養因子は、
異なるプロモーターに機能可能に結合できる。本明細書で考察されるように、異
なるプロモーターは、相違する活性レベルとパターンを有する。当業者は、複数
のプロモーターの使用により、異なるコーディング配列の発現を命令する自由度
を理解しよう。あるいは、複数のコーディング配列は、ポリシストロンエレメン
トを形成するように、同じプロモーターに機能可能に結合できる。ポリシストロ
ンエレメントは、眼細胞に形質導入されたとき、単一ｍＲＮＡ分子に転写される
。ｍＲＮＡ分子の翻訳は、各コーディング配列で開始され、それによって、複数
の分離したペプチドが同時に産生される。本発明ではまた、眼細胞又は加齢性黄
斑変性と関連する細胞を、発現ベクター（各発現ベクターは、異なる血管形成阻
害剤及び／又は神経栄養因子をコードする）のカクテルに接触させることを意図
する。発現ベクターのカクテルは、異なる型の発現ベクター、例えば、アデノウ
イルスベクターとアデノ随伴ウイルスベクターを更に含みうる。
管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子をコードする核酸配列を
含む。それ故、核酸配列は、複数の、即ち、２つ、３つ、又はそれ以上の血管形
成阻害剤をコードしうる。同様に、核酸配列は、複数の、即ち、２つ、３つ、又
はそれ以上の神経栄養因子をコードしうる。好適な実施態様において、核酸配列
は、ＰＥＤＦ及び毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）をコードする。また好ましく
は、核酸配列は、少なくとも１つの血管形成阻害剤及び少なくとも１つの神経栄
養因子をコードする。複数の血管形成阻害剤及び／又は複数の神経栄養因子は、
異なるプロモーターに機能可能に結合できる。本明細書で考察されるように、異
なるプロモーターは、相違する活性レベルとパターンを有する。当業者は、複数
のプロモーターの使用により、異なるコーディング配列の発現を命令する自由度
を理解しよう。あるいは、複数のコーディング配列は、ポリシストロンエレメン
トを形成するように、同じプロモーターに機能可能に結合できる。ポリシストロ
ンエレメントは、眼細胞に形質導入されたとき、単一ｍＲＮＡ分子に転写される
。ｍＲＮＡ分子の翻訳は、各コーディング配列で開始され、それによって、複数
の分離したペプチドが同時に産生される。本発明ではまた、眼細胞又は加齢性黄
斑変性と関連する細胞を、発現ベクター（各発現ベクターは、異なる血管形成阻
害剤及び／又は神経栄養因子をコードする）のカクテルに接触させることを意図
する。発現ベクターのカクテルは、異なる型の発現ベクター、例えば、アデノウ
イルスベクターとアデノ随伴ウイルスベクターを更に含みうる。
【００６４】
本発明の方法は、他の治療態様を含む処置法の一部でありうる。それ故、眼関
連疾患、即ち、眼血管新生又は加齢性黄斑変性が、幾つかの眼治療の任意のもの
、例えば、薬剤治療、光力学治療、光凝固レーザー治療、汎網膜治療、温熱療法
、放射線療法、又は手術によって治療されたか、治療されているか、又は治療さ
れる予定であるならば、それは適切である。好ましくは、手術は、黄斑トランス
ロケーション、網膜下血液の除去、又は網膜下脈絡膜血管新生膜の除去である。
発現ベクターは好ましくは、手術、レーザー光凝固術、及び光力学治療によって
治療される加齢性黄斑変性又は持続的もしくは再発性眼血管新生の予防的処置又
は治療的処置のために、眼内に投与される。
連疾患、即ち、眼血管新生又は加齢性黄斑変性が、幾つかの眼治療の任意のもの
、例えば、薬剤治療、光力学治療、光凝固レーザー治療、汎網膜治療、温熱療法
、放射線療法、又は手術によって治療されたか、治療されているか、又は治療さ
れる予定であるならば、それは適切である。好ましくは、手術は、黄斑トランス
ロケーション、網膜下血液の除去、又は網膜下脈絡膜血管新生膜の除去である。
発現ベクターは好ましくは、手術、レーザー光凝固術、及び光力学治療によって
治療される加齢性黄斑変性又は持続的もしくは再発性眼血管新生の予防的処置又
は治療的処置のために、眼内に投与される。
【００６５】
哺乳動物などの動物、特にヒトが、眼血管新生又は加齢性黄斑変性のリスクに
ある（予防的処置）又は眼血管新生又は加齢性黄斑変性を発症し始めた（治療的
処置）ことが決定された後、できるだけ早く、発現ベクターを投与するのが好ま
しい。処置は、部分的に、使用される特定の核酸配列、核酸配列から発現される
特定の血管形成阻害剤及び／又は神経栄養因子、投与経路、及びもしあれば、現
実化した眼血管新生又は加齢性黄斑変性の原因と程度に依存しよう。例えば、全
身投与又は両方の眼への投与は、黄斑変性の予防的処置には好適である。なぜな
ら、一方の眼が冒されると、他方の眼もリスクを有するからである（１年につき
最大１９％）。
ある（予防的処置）又は眼血管新生又は加齢性黄斑変性を発症し始めた（治療的
処置）ことが決定された後、できるだけ早く、発現ベクターを投与するのが好ま
しい。処置は、部分的に、使用される特定の核酸配列、核酸配列から発現される
特定の血管形成阻害剤及び／又は神経栄養因子、投与経路、及びもしあれば、現
実化した眼血管新生又は加齢性黄斑変性の原因と程度に依存しよう。例えば、全
身投与又は両方の眼への投与は、黄斑変性の予防的処置には好適である。なぜな
ら、一方の眼が冒されると、他方の眼もリスクを有するからである（１年につき
最大１９％）。
【００６６】
本発明の発現ベクターは望ましくは、医薬として許容できる担体と発現ベクタ
ーを含む医薬組成物で投与される。任意の適切な医薬として許容できる担体は、
本発明の状況において使用でき、このような担体は当業界周知である。担体の選
択は、部分的には、組成物が投与される特定の部位及び組成物を投与するために
使用される特定の方法によって決定されよう。
ーを含む医薬組成物で投与される。任意の適切な医薬として許容できる担体は、
本発明の状況において使用でき、このような担体は当業界周知である。担体の選
択は、部分的には、組成物が投与される特定の部位及び組成物を投与するために
使用される特定の方法によって決定されよう。
【００６７】
適切な製剤としては、水溶液と非水溶液、等張性滅菌溶液（抗酸化剤、緩衝剤
、細菌抑制剤、及び意図されたレシピエントの血液もしくは眼内液体と製剤とを
等張にする溶質を含みうる）、並びに懸濁剤、可溶化剤、増量剤、安定化剤、及
び保存剤を含みうる水溶性と非水溶性滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、アンプ
ルやバイアルなどの単回投与もしくは複数回投与用の密封容器で提示されること
ができ、使用直前に、滅菌液体担体、例えば、水の添加のみを必要とするフリー
ズドライ（凍結乾燥）状態で保存できる。即席の溶液と懸濁液は、上記の種類の
滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から製造できる。好ましくは、医薬として許容できる
担体は、緩衝化生理食塩水である。より好ましくは、本発明の方法で使用される
発現ベクターは、投与の前にダメージから発現ベクターを保護するように製剤化
された医薬組成物で投与される。例えば、ガラス器具、シリンジ、又は針などの
発現ベクターを製造し、保存し、又は投与するために使用されるデバイス上での
発現ベクターの喪失を減少させるように、医薬組成物は製剤化されうる。医薬組
成物は、発現ベクターの光感受性及び／又は温度感受性を減少させるように製剤
化できる。この目的のために、医薬組成物は好ましくは、例えば上記のものなど
の医薬として許容できる液状担体、及びポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、
ポリビニルピロリドン、トレハロース、及びそれらの組み合わせからなる群から
選択される安定化剤を含む。このような医薬組成物の使用は、ベクターの保存寿
命を延長し、投与を容易にし、本発明の方法の効率を増加させよう。この点に関
し、医薬組成物はまた、形質導入効率を増大させるように、製剤化できる。
、細菌抑制剤、及び意図されたレシピエントの血液もしくは眼内液体と製剤とを
等張にする溶質を含みうる）、並びに懸濁剤、可溶化剤、増量剤、安定化剤、及
び保存剤を含みうる水溶性と非水溶性滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、アンプ
ルやバイアルなどの単回投与もしくは複数回投与用の密封容器で提示されること
ができ、使用直前に、滅菌液体担体、例えば、水の添加のみを必要とするフリー
ズドライ（凍結乾燥）状態で保存できる。即席の溶液と懸濁液は、上記の種類の
滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から製造できる。好ましくは、医薬として許容できる
担体は、緩衝化生理食塩水である。より好ましくは、本発明の方法で使用される
発現ベクターは、投与の前にダメージから発現ベクターを保護するように製剤化
された医薬組成物で投与される。例えば、ガラス器具、シリンジ、又は針などの
発現ベクターを製造し、保存し、又は投与するために使用されるデバイス上での
発現ベクターの喪失を減少させるように、医薬組成物は製剤化されうる。医薬組
成物は、発現ベクターの光感受性及び／又は温度感受性を減少させるように製剤
化できる。この目的のために、医薬組成物は好ましくは、例えば上記のものなど
の医薬として許容できる液状担体、及びポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、
ポリビニルピロリドン、トレハロース、及びそれらの組み合わせからなる群から
選択される安定化剤を含む。このような医薬組成物の使用は、ベクターの保存寿
命を延長し、投与を容易にし、本発明の方法の効率を増加させよう。この点に関
し、医薬組成物はまた、形質導入効率を増大させるように、製剤化できる。
【００６８】
更に、当業者は、本発明の発現ベクター、例えばウイルスベクターが他の治療
薬又は生物活性剤を有する組成物中に存在しうることを理解しよう。例えば、特
定の適用症の治療に有用な治療因子が存在しうる。例えば、視力喪失を治療する
ならば、眼の硝子体中の血液と血液タンパク質の分解を生じさせるために、ヒア
ルロニダーゼを組成物に加えることができる。イブプロフェン又はステロイドな
どの炎症を制御する因子は、ウイルスベクターのインビボ投与と関連した膨潤や
炎症及び眼の苦痛を減少させるために、組成物の一部でありうる。免疫系抑制剤
は、ベクターそれ自体に対する免疫応答、又は眼疾患と関連した免疫応答を減少
させるために、本発明の方法と組み合わせて投与できる。可溶性増殖因子受容体
、増殖因子アンタゴニスト、即ち、アンジオテンシン、などの抗血管形成因子は
また、更なる神経栄養因子と同様に、組成物の一部でありうる。同様に、ビタミ
ンやミネラル、抗酸化剤、及び微量栄養素が共投与できる。抗生物質、即ち、殺
微生物剤や殺真菌剤は、遺伝子導入方法や他の疾患と関連した感染のリスクを減
少させるために存在しうる。
薬又は生物活性剤を有する組成物中に存在しうることを理解しよう。例えば、特
定の適用症の治療に有用な治療因子が存在しうる。例えば、視力喪失を治療する
ならば、眼の硝子体中の血液と血液タンパク質の分解を生じさせるために、ヒア
ルロニダーゼを組成物に加えることができる。イブプロフェン又はステロイドな
どの炎症を制御する因子は、ウイルスベクターのインビボ投与と関連した膨潤や
炎症及び眼の苦痛を減少させるために、組成物の一部でありうる。免疫系抑制剤
は、ベクターそれ自体に対する免疫応答、又は眼疾患と関連した免疫応答を減少
させるために、本発明の方法と組み合わせて投与できる。可溶性増殖因子受容体
、増殖因子アンタゴニスト、即ち、アンジオテンシン、などの抗血管形成因子は
また、更なる神経栄養因子と同様に、組成物の一部でありうる。同様に、ビタミ
ンやミネラル、抗酸化剤、及び微量栄養素が共投与できる。抗生物質、即ち、殺
微生物剤や殺真菌剤は、遺伝子導入方法や他の疾患と関連した感染のリスクを減
少させるために存在しうる。
【００６９】
当業者は、発現ベクターを眼細胞と接触させる、発現ベクターを投与する適切
な方法、即ち侵襲性方法及び非侵襲性方法が利用できることを理解しよう。２つ
以上の経路を、特定の発現ベクターを投与するために使用できるけれども、特定
の経路が、別の経路よりも迅速かつ有効な反応を提供しうる。それ故、記載した
投与経路は単に例示であり、決して限定的なものではない。
な方法、即ち侵襲性方法及び非侵襲性方法が利用できることを理解しよう。２つ
以上の経路を、特定の発現ベクターを投与するために使用できるけれども、特定
の経路が、別の経路よりも迅速かつ有効な反応を提供しうる。それ故、記載した
投与経路は単に例示であり、決して限定的なものではない。
【００７０】
本発明の方法は、所望の効果を達成するために、動物、好ましくはヒトに発現
ベクターを投与する様式に依存しない。それ故、発現ベクターが適切な眼細胞と
接触する限り、いかなる投与経路も適切である。本発明の方法で使用する発現ベ
クターは、注射、眼ローション、軟膏、インプラントなどの形態で適切に製剤化
され、投与される。発現ベクターは、例えば、全身的、局所的、結膜下、眼内、
眼球の後方（retrobulbarly）、眼の周囲（perioculary）、網膜下、脈絡膜上に
投与できる。ある場合には、発現ベクターへの眼細胞の十分な暴露を確保するた
めに、複数の適用を投与し、複数の経路、例えば、網膜下及び硝子体内、を用い
ることが適切でありうる。発現ベクターの複数の適用もまた、所望の効果を達成
するために必要でありうる。
ベクターを投与する様式に依存しない。それ故、発現ベクターが適切な眼細胞と
接触する限り、いかなる投与経路も適切である。本発明の方法で使用する発現ベ
クターは、注射、眼ローション、軟膏、インプラントなどの形態で適切に製剤化
され、投与される。発現ベクターは、例えば、全身的、局所的、結膜下、眼内、
眼球の後方（retrobulbarly）、眼の周囲（perioculary）、網膜下、脈絡膜上に
投与できる。ある場合には、発現ベクターへの眼細胞の十分な暴露を確保するた
めに、複数の適用を投与し、複数の経路、例えば、網膜下及び硝子体内、を用い
ることが適切でありうる。発現ベクターの複数の適用もまた、所望の効果を達成
するために必要でありうる。
【００７１】
特定の場合に依存すると、発現ベクターを患者に非侵襲的に投与することは望
ましいかもしれない。例えば、複数の手術が行われ、患者は、麻酔薬に低い耐性
しか示さないならば、又は他の眼関連疾患が存在するならば、発現ベクターの局
所投与が最も適切であるかもしれない。局所用製剤は、当業者に周知である。こ
のような製剤は、皮膚への適用のために、本発明の状況において適切である。パ
ッチ、角膜シールド（例えば、米国特許第５，１８５，１５２号参照）、眼用溶
液（例えば、米国特許第５，７１０，１８２号参照）、及び軟膏、例えば、点眼
薬の使用もまた、当業界の技術内である。発現ベクターはまた、Bioject,Inc.か
ら入手できるBiojector 2000 Needle-Free Injection Management System（登録
商標）などの針無し注射デバイスを用いて、非侵襲的に投与できる。
ましいかもしれない。例えば、複数の手術が行われ、患者は、麻酔薬に低い耐性
しか示さないならば、又は他の眼関連疾患が存在するならば、発現ベクターの局
所投与が最も適切であるかもしれない。局所用製剤は、当業者に周知である。こ
のような製剤は、皮膚への適用のために、本発明の状況において適切である。パ
ッチ、角膜シールド（例えば、米国特許第５，１８５，１５２号参照）、眼用溶
液（例えば、米国特許第５，７１０，１８２号参照）、及び軟膏、例えば、点眼
薬の使用もまた、当業界の技術内である。発現ベクターはまた、Bioject,Inc.か
ら入手できるBiojector 2000 Needle-Free Injection Management System（登録
商標）などの針無し注射デバイスを用いて、非侵襲的に投与できる。
【００７２】
発現ベクターは好ましくは、眼用スポンジ、網、メカニカルリザーバー、又は
メカニカルインプラントなどの、発現ベクターの制御された又は持続した放出を
可能とするデバイス内又はデバイス上に存在する。インプラント（例えば、米国
特許第５，４４３，５０５号、同第４，８５３，２２４号、及び同第４，９９７
，６５２号参照）、移植可能デバイスなどのデバイス（例えば、米国特許第５，
５５４，１８７号、同第４，８６３，４５７号、同第５，０９８，４４３号及び
同第５，７２５，４９３号参照）、例えば、メカニカルリザーバー、眼内デバイ
スもしくは眼内管（intraocular conduit）をもつ眼外デバイス、又はポリマー
組成物からなるインプラントもしくはデバイスは、発現ベクターの眼投与に特に
有用である。本発明方法の発現ベクターは、例えば、ゼラチン、コンドロイチン
硫酸、ビス−２−ヒドロキシエチル−テレフタレート（ＢＨＥＴ）などのホスホ
エステル、又はポリアクティック（polyactic）グリコール酸を含む放出持続型
製剤（例えば、米国特許第５，３７８，４７５号参照）の形態でも投与できる。
メカニカルインプラントなどの、発現ベクターの制御された又は持続した放出を
可能とするデバイス内又はデバイス上に存在する。インプラント（例えば、米国
特許第５，４４３，５０５号、同第４，８５３，２２４号、及び同第４，９９７
，６５２号参照）、移植可能デバイスなどのデバイス（例えば、米国特許第５，
５５４，１８７号、同第４，８６３，４５７号、同第５，０９８，４４３号及び
同第５，７２５，４９３号参照）、例えば、メカニカルリザーバー、眼内デバイ
スもしくは眼内管（intraocular conduit）をもつ眼外デバイス、又はポリマー
組成物からなるインプラントもしくはデバイスは、発現ベクターの眼投与に特に
有用である。本発明方法の発現ベクターは、例えば、ゼラチン、コンドロイチン
硫酸、ビス−２−ヒドロキシエチル−テレフタレート（ＢＨＥＴ）などのホスホ
エステル、又はポリアクティック（polyactic）グリコール酸を含む放出持続型
製剤（例えば、米国特許第５，３７８，４７５号参照）の形態でも投与できる。
【００７３】
あるいは、発現ベクターは、例えば、場合によっては硝子体切除によって先行
される硝子体内注射又は網膜下注射などの侵襲的方法を用いて投与できる。網膜
下注射は、眼の異なるコンパートメント、即ち、前房、に投与できる。眼内注射
が好ましいが、注射可能組成物は、筋肉内、静脈内、及び腹腔内にも投与できる
。注射可能組成物のための医薬として許容できる担体は、当業者に周知である（
Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B.Lippincott Co., Philadelphia, P
A, Banker and Chalmers, eds., p.238-250(1982)、及びASHP Handbook on Inj
ectable Drugs, Toissel, 4th ed., p.622-630(1986)参照）。あまり好ましくは
ないが、発現ベクターはまた、パーティクルボンバードメント（particle bombe
rdment）、即ち、遺伝子銃によってもインビボで投与できる。
される硝子体内注射又は網膜下注射などの侵襲的方法を用いて投与できる。網膜
下注射は、眼の異なるコンパートメント、即ち、前房、に投与できる。眼内注射
が好ましいが、注射可能組成物は、筋肉内、静脈内、及び腹腔内にも投与できる
。注射可能組成物のための医薬として許容できる担体は、当業者に周知である（
Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B.Lippincott Co., Philadelphia, P
A, Banker and Chalmers, eds., p.238-250(1982)、及びASHP Handbook on Inj
ectable Drugs, Toissel, 4th ed., p.622-630(1986)参照）。あまり好ましくは
ないが、発現ベクターはまた、パーティクルボンバードメント（particle bombe
rdment）、即ち、遺伝子銃によってもインビボで投与できる。
【００７４】
好ましくは、発現ベクターは、眼の特定の領域への送達のために眼科用装置を
介し投与される。特殊化した眼科用装置の使用は、発現ベクターの正確な投与を
確保し、隣接した眼組織へのダメージを最小化する。眼の特定の領域への発現ベ
クターの送達はまた、血管形成阻害剤及び／又は神経栄養因子への、冒されてい
ない細胞の暴露を制限し、それによって副作用のリスクを減少させる。好適な眼
科用装置は、鉗子及び網膜下針もしくは鋭い屈曲カニューレの組み合わせである
。
介し投与される。特殊化した眼科用装置の使用は、発現ベクターの正確な投与を
確保し、隣接した眼組織へのダメージを最小化する。眼の特定の領域への発現ベ
クターの送達はまた、血管形成阻害剤及び／又は神経栄養因子への、冒されてい
ない細胞の暴露を制限し、それによって副作用のリスクを減少させる。好適な眼
科用装置は、鉗子及び網膜下針もしくは鋭い屈曲カニューレの組み合わせである
。
【００７５】
特に好適ではないが、発現ベクターは非経口的に投与できる。好ましくは、眼
関連疾患、即ち、眼血管新生又は加齢性黄斑変性の予防的処置又は治療的処置の
ために患者に非経口的に投与される任意の発現ベクターは、特異的に眼細胞を標
的とする。本明細書での考察のように、発現ベクターは、可能性のある宿主細胞
上の受容体に対する発現ベクターの結合特異性又は認識を変化させるように、修
飾されることができる。アデノウイルスに関し、このような操作としては、ファ
イバー、ペントンもしくはヘキソンの領域の欠失、コートタンパク質の部分内に
種々のネイティブもしくは非ネイティブのリガンドの挿入などを挙げることがで
きる。当業者は、適切な宿主細胞に発現ベクターを効果的に送達するために、非
経口投与が、高い投与量又は複数の投与を必要としうることを理解しよう。
関連疾患、即ち、眼血管新生又は加齢性黄斑変性の予防的処置又は治療的処置の
ために患者に非経口的に投与される任意の発現ベクターは、特異的に眼細胞を標
的とする。本明細書での考察のように、発現ベクターは、可能性のある宿主細胞
上の受容体に対する発現ベクターの結合特異性又は認識を変化させるように、修
飾されることができる。アデノウイルスに関し、このような操作としては、ファ
イバー、ペントンもしくはヘキソンの領域の欠失、コートタンパク質の部分内に
種々のネイティブもしくは非ネイティブのリガンドの挿入などを挙げることがで
きる。当業者は、適切な宿主細胞に発現ベクターを効果的に送達するために、非
経口投与が、高い投与量又は複数の投与を必要としうることを理解しよう。
【００７６】
当業者はまた、投与量及び投与経路が宿主の免疫系による発現ベクターの喪失
を最小化するように選択できることを理解しよう。例えば、インビボで眼細胞を
接触させる場合、本発明の方法を実施する前に、宿主に空発現ベクター（即ち、
少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子をコ
ードする核酸配列を含まない発現ベクター）を投与することは、利点がありうる
。空発現ベクターの前もっての投与は、宿主において発現ベクターに対する免疫
を作成し、それによって、免疫系によって取り除かれるベクターの量を減少させ
るのに役立ちうる。
を最小化するように選択できることを理解しよう。例えば、インビボで眼細胞を
接触させる場合、本発明の方法を実施する前に、宿主に空発現ベクター（即ち、
少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子をコ
ードする核酸配列を含まない発現ベクター）を投与することは、利点がありうる
。空発現ベクターの前もっての投与は、宿主において発現ベクターに対する免疫
を作成し、それによって、免疫系によって取り除かれるベクターの量を減少させ
るのに役立ちうる。
【００７７】
本発明に従って動物、特にヒトに投与される発現ベクターの投与量は、合理的
な時間枠にわたって動物に所望の応答を生じさせるのに十分であるべきである。
当業者は、投与量が、年齢、種、問題の病理、及び状態もしくは病気の状態を含
む種々の因子によるであろうことを認識しよう。投与量はまた、発現される血管
形成阻害剤及び／又は神経栄養因子、並びに眼関連疾患に冒されるはずの、又は
実際に冒された眼組織の量に依存する。投与量の大きさはまた、投与の経路、タ
イミング及び頻度、並びに特定の発現ベクターの投与に伴いうる何らかの有害な
副作用の影響及び所望の生理的効果の存在、性質及び程度によって決定されよう
。種々の状態又は病気の状態、特に慢性の状態又病気の状態が、複数の投与を含
む長期間の処置を必要としうることは、当業者に理解されよう。
な時間枠にわたって動物に所望の応答を生じさせるのに十分であるべきである。
当業者は、投与量が、年齢、種、問題の病理、及び状態もしくは病気の状態を含
む種々の因子によるであろうことを認識しよう。投与量はまた、発現される血管
形成阻害剤及び／又は神経栄養因子、並びに眼関連疾患に冒されるはずの、又は
実際に冒された眼組織の量に依存する。投与量の大きさはまた、投与の経路、タ
イミング及び頻度、並びに特定の発現ベクターの投与に伴いうる何らかの有害な
副作用の影響及び所望の生理的効果の存在、性質及び程度によって決定されよう
。種々の状態又は病気の状態、特に慢性の状態又病気の状態が、複数の投与を含
む長期間の処置を必要としうることは、当業者に理解されよう。
【００７８】
適切な投与量及び投与法は、当業者公知の通常の範囲決定技術によって決定で
きる。好ましくは、約１０6ウイルス粒子〜約１０12ウイルス粒子が患者に送達
される。換言すれば、約１０6粒子／ｍｌ〜約１０12粒子／ｍｌ（約１０6粒子／
ｍｌ〜約１０12粒子／ｍｌの範囲内の全ての整数を含む）の発現ベクター濃度、
好ましくは、約１０10粒子／ｍｌ〜約１０12粒子／ｍｌの発現ベクター濃度を含
む医薬組成物が投与でき、典型的には、眼当たりこのような医薬組成物の約０．
１μｌ〜約１００μｌの眼内投与を含むであろう。発現ベクターがプラスミドで
あるとき、好ましくは、約０．５ｎｇ〜約１０００μｇのＤＮＡが投与される。
より好ましくは、約０．１μｇ〜約５００μｇが投与され、更に好ましくは、約
１μｇ〜約１００μｇのＤＮＡが投与される。最も好ましくは、約５０μｇのＤ
ＮＡが眼当たり投与される。もちろん、他の投与経路は、治療効果を達成するた
めに、より小さな、又はより大きな投与量を必要としうる。投与量と投与経路に
おける任意の必要なバリエーションは、当業界公知の慣用的な技術を用いて当業
者によって決定できる。
きる。好ましくは、約１０6ウイルス粒子〜約１０12ウイルス粒子が患者に送達
される。換言すれば、約１０6粒子／ｍｌ〜約１０12粒子／ｍｌ（約１０6粒子／
ｍｌ〜約１０12粒子／ｍｌの範囲内の全ての整数を含む）の発現ベクター濃度、
好ましくは、約１０10粒子／ｍｌ〜約１０12粒子／ｍｌの発現ベクター濃度を含
む医薬組成物が投与でき、典型的には、眼当たりこのような医薬組成物の約０．
１μｌ〜約１００μｌの眼内投与を含むであろう。発現ベクターがプラスミドで
あるとき、好ましくは、約０．５ｎｇ〜約１０００μｇのＤＮＡが投与される。
より好ましくは、約０．１μｇ〜約５００μｇが投与され、更に好ましくは、約
１μｇ〜約１００μｇのＤＮＡが投与される。最も好ましくは、約５０μｇのＤ
ＮＡが眼当たり投与される。もちろん、他の投与経路は、治療効果を達成するた
めに、より小さな、又はより大きな投与量を必要としうる。投与量と投与経路に
おける任意の必要なバリエーションは、当業界公知の慣用的な技術を用いて当業
者によって決定できる。
【００７９】
幾つかの実施態様では、少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくと
も１つの神経栄養剤をコードする核酸配列を含む発現ベクターの２回以上（即ち
、複数）の投与を投与することは利点がある。本発明の方法は、眼血管新生又は
他の眼関連疾患を予防的に処置又は治療的に処置するために、血管形成阻害剤及
び／又は神経栄養剤の複数の適用を提供する。例えば、外来核酸、例えば、少な
くとも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養剤をコードす
る核酸配列を含む発現ベクターの少なくとも２回の適用が同じ眼に対し投与でき
る。好ましくは、複数の投与は、バックグラウンドレベルを超えて遺伝子発現を
保持している間に投与する。また好ましくは、眼細胞は、約３０日又はそれ以上
内に、発現ベクターの２回以上の適用と接触させられる。より好ましくは、約９
０日又はそれ以上内に同じ眼の眼細胞に２回以上の適用が投与される。しかし、
遺伝子発現が起こり、眼血管新生が阻害され、又は改善される限り、３回、４回
、５回、６回又はそれ以上の投与が、任意の時間枠内で投与できる（例えば、投
与の間隔は、２、７、１０、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３
、７０、７７、８５又はそれ以上の日数である）。
も１つの神経栄養剤をコードする核酸配列を含む発現ベクターの２回以上（即ち
、複数）の投与を投与することは利点がある。本発明の方法は、眼血管新生又は
他の眼関連疾患を予防的に処置又は治療的に処置するために、血管形成阻害剤及
び／又は神経栄養剤の複数の適用を提供する。例えば、外来核酸、例えば、少な
くとも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養剤をコードす
る核酸配列を含む発現ベクターの少なくとも２回の適用が同じ眼に対し投与でき
る。好ましくは、複数の投与は、バックグラウンドレベルを超えて遺伝子発現を
保持している間に投与する。また好ましくは、眼細胞は、約３０日又はそれ以上
内に、発現ベクターの２回以上の適用と接触させられる。より好ましくは、約９
０日又はそれ以上内に同じ眼の眼細胞に２回以上の適用が投与される。しかし、
遺伝子発現が起こり、眼血管新生が阻害され、又は改善される限り、３回、４回
、５回、６回又はそれ以上の投与が、任意の時間枠内で投与できる（例えば、投
与の間隔は、２、７、１０、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３
、７０、７７、８５又はそれ以上の日数である）。
【００８０】
少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子を
コードする核酸配列を含む発現ベクターが、ある一定の動物、特にヒトから以前
に取り出した細胞に、好ましくは眼細胞にエキソビボで導入されることができる
ことはまた、当業者によって理解されよう。動物又はヒトに再導入された自己又
は同種のこのような形質導入された細胞は、インビボで少なくとも１つの血管形
成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子を直接的に発現しよう。１つ
のエキソビボ治療選択としては、生体適合性のカプセル内に感染した眼細胞をカ
プセル化すること、及びそれを、眼又は身体の任意の他の部分に移植できること
が挙げられる。当業者は、このような細胞は、患者から単離される必要がなく、
代わりに別の個体から単離でき、患者に移植できることを理解しよう。
コードする核酸配列を含む発現ベクターが、ある一定の動物、特にヒトから以前
に取り出した細胞に、好ましくは眼細胞にエキソビボで導入されることができる
ことはまた、当業者によって理解されよう。動物又はヒトに再導入された自己又
は同種のこのような形質導入された細胞は、インビボで少なくとも１つの血管形
成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子を直接的に発現しよう。１つ
のエキソビボ治療選択としては、生体適合性のカプセル内に感染した眼細胞をカ
プセル化すること、及びそれを、眼又は身体の任意の他の部分に移植できること
が挙げられる。当業者は、このような細胞は、患者から単離される必要がなく、
代わりに別の個体から単離でき、患者に移植できることを理解しよう。
【００８１】
発現ベクター、好ましくはアデノウイルスベクターは、少なくとも１つの血管
形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子をコードする複数の核酸配
列を含むことができることが理解されよう。例えば、発現ベクターは、多コピー
のＰＥＤＦコーディング配列を含み得、各々のコピーは、異なるプロモーター又
は同一のプロモーターに機能可能に結合している。
形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの神経栄養因子をコードする複数の核酸配
列を含むことができることが理解されよう。例えば、発現ベクターは、多コピー
のＰＥＤＦコーディング配列を含み得、各々のコピーは、異なるプロモーター又
は同一のプロモーターに機能可能に結合している。
【００８２】
上記に加えて、少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つの
神経栄養因子をコードする核酸配列は、１つ以上の他の導入遺伝子を更に含むこ
とができる。“導入遺伝子”は、細胞内で発現できる任意の核酸を意味する。望
ましくは、導入遺伝子の発現は、眼細胞又は眼に対し利益のある、例えば予防的
に、もしくは治療的に利益のあるものである。導入遺伝子が、細胞に予防的又は
治療的利益をもたらすならば、導入遺伝子は、ＲＮＡ又はタンパク質のレベルで
その効果を発揮できる。例えば、導入遺伝子は、疾患、例えば、眼関連疾患の治
療又は研究に使用できる、血管形成阻害剤又は神経栄養因子以外のペプチドをコ
ードしうる。あるいは、導入遺伝子は、アンチセンス分子、リボザイム、スプラ
イシングもしくは３’プロセシング（例えば、ポリアデニル化）に影響を与える
タンパク質、又は例えば、ｍＲＮＡ蓄積もしくは輸送の速度の変化を仲介するこ
とによって、又は転写後調節における変化を仲介することによって、細胞内の別
の遺伝子の発現レベルに影響を及ぼすタンパク質（即ち、遺伝子発現は、転写の
開始からプロセスタンパク質の産生までの全てのステップを含むものと広く考え
られている）をコードできる。導入遺伝子は、眼関連疾患の組み合わせ治療のた
めのキメラペプチドをコードしうる。導入遺伝子は、血管形成阻害剤又は神経栄
養剤とは異なる標的分子に作用する因子をコードしうる。実際、導入遺伝子産物
は、血管形成阻害剤もしくは神経栄養因子の異なるシグナル伝達経路に作用しう
るか、又は血管形成阻害剤もしくは神経栄養因子の同じシグナル伝達経路の異な
る点に作用しうる。好ましくは、治療性物質は、ＣＮＴＦなどの神経栄養因子で
ある。ＣＮＴＦは、神経栄養因子のニューロポイエティックサイトカインのサブ
クラスに属する。ＣＮＴＦは、毛様体神経節ニューロンの生存を促進し、かつ神
経成長因子（ＮＧＦ）応答性である特定のニューロンを支持する。
神経栄養因子をコードする核酸配列は、１つ以上の他の導入遺伝子を更に含むこ
とができる。“導入遺伝子”は、細胞内で発現できる任意の核酸を意味する。望
ましくは、導入遺伝子の発現は、眼細胞又は眼に対し利益のある、例えば予防的
に、もしくは治療的に利益のあるものである。導入遺伝子が、細胞に予防的又は
治療的利益をもたらすならば、導入遺伝子は、ＲＮＡ又はタンパク質のレベルで
その効果を発揮できる。例えば、導入遺伝子は、疾患、例えば、眼関連疾患の治
療又は研究に使用できる、血管形成阻害剤又は神経栄養因子以外のペプチドをコ
ードしうる。あるいは、導入遺伝子は、アンチセンス分子、リボザイム、スプラ
イシングもしくは３’プロセシング（例えば、ポリアデニル化）に影響を与える
タンパク質、又は例えば、ｍＲＮＡ蓄積もしくは輸送の速度の変化を仲介するこ
とによって、又は転写後調節における変化を仲介することによって、細胞内の別
の遺伝子の発現レベルに影響を及ぼすタンパク質（即ち、遺伝子発現は、転写の
開始からプロセスタンパク質の産生までの全てのステップを含むものと広く考え
られている）をコードできる。導入遺伝子は、眼関連疾患の組み合わせ治療のた
めのキメラペプチドをコードしうる。導入遺伝子は、血管形成阻害剤又は神経栄
養剤とは異なる標的分子に作用する因子をコードしうる。実際、導入遺伝子産物
は、血管形成阻害剤もしくは神経栄養因子の異なるシグナル伝達経路に作用しう
るか、又は血管形成阻害剤もしくは神経栄養因子の同じシグナル伝達経路の異な
る点に作用しうる。好ましくは、治療性物質は、ＣＮＴＦなどの神経栄養因子で
ある。ＣＮＴＦは、神経栄養因子のニューロポイエティックサイトカインのサブ
クラスに属する。ＣＮＴＦは、毛様体神経節ニューロンの生存を促進し、かつ神
経成長因子（ＮＧＦ）応答性である特定のニューロンを支持する。
【００８３】
あるいは、細胞分化と関連した因子をコードする１つ以上の更なる核酸配列（
例えば、導入遺伝子）を、発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）に含める
ことができる。好ましくは、導入遺伝子は、Ｍａｔｈ１もしくはＨａｔｈ１など
のアトナル（atonal）関連ペプチド、又は上記のどちらかの生物活性フラグメン
トをコードする。Ｍａｔｈ１は、転写因子のマウス塩基性ヘリックス−ループ−
ヘリックスファミリーのメンバーであり、Drosophila遺伝子のアトナルと相同で
ある。Ｈａｔｈ１は、Ｍａｔｈ１のヒト対応物である。Ｍａｔｈ１は、毛の発生
に必須であることが示され、耳の毛の再生を刺激できる。神経栄養性活性とアト
ナル関連ペプチドの毛細胞分化性との組み合わせは、例えば、感覚疾患の治療及
び研究の強力なツールを提供する。Ｍａｔｈ１は、例えば、Bermingham et al.,
Science, 284, 1837-1841（1999）及びZheng and Gao, Nature Neuroscience,
3(2),580-586(2000)に更に特徴付けがなされている。
例えば、導入遺伝子）を、発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）に含める
ことができる。好ましくは、導入遺伝子は、Ｍａｔｈ１もしくはＨａｔｈ１など
のアトナル（atonal）関連ペプチド、又は上記のどちらかの生物活性フラグメン
トをコードする。Ｍａｔｈ１は、転写因子のマウス塩基性ヘリックス−ループ−
ヘリックスファミリーのメンバーであり、Drosophila遺伝子のアトナルと相同で
ある。Ｈａｔｈ１は、Ｍａｔｈ１のヒト対応物である。Ｍａｔｈ１は、毛の発生
に必須であることが示され、耳の毛の再生を刺激できる。神経栄養性活性とアト
ナル関連ペプチドの毛細胞分化性との組み合わせは、例えば、感覚疾患の治療及
び研究の強力なツールを提供する。Ｍａｔｈ１は、例えば、Bermingham et al.,
Science, 284, 1837-1841（1999）及びZheng and Gao, Nature Neuroscience,
3(2),580-586(2000)に更に特徴付けがなされている。
【００８４】
発現ベクターは、少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は少なくとも１つ
の神経栄養因子に加えて血管成熟因子をコードする核酸配列を含みうる。多くの
眼疾患は、血管からの血液産物の漏出と関与し、それは、視力を混濁させえ、眼
の層内にて免疫応答を誘導しうる。血管成熟因子は血管での漏出量を減少させ、
それ故、例えば、滲出性眼疾患を治療するのに有用である。血管成熟因子として
は、アンジオポイエチン（Ａｎｇ、例えば、Ａｎｇ−１及びＡｎｇ−２）、腫瘍
壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、ミドカイン（ＭＫ）、ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ
、及びヘパリン結合神経栄養因子（ＨＢＮＦ、ヘパリン結合増殖因子としても知
られる）が挙げられるがそれらに限定されない。イムノサプレッサーをコードす
るヌクレオチド配列も、眼関連疾患又は発現ベクターの投与の結果としての眼内
の不適切な免疫応答を減少させるために、発現ベクターに組み込むことができる
。
の神経栄養因子に加えて血管成熟因子をコードする核酸配列を含みうる。多くの
眼疾患は、血管からの血液産物の漏出と関与し、それは、視力を混濁させえ、眼
の層内にて免疫応答を誘導しうる。血管成熟因子は血管での漏出量を減少させ、
それ故、例えば、滲出性眼疾患を治療するのに有用である。血管成熟因子として
は、アンジオポイエチン（Ａｎｇ、例えば、Ａｎｇ−１及びＡｎｇ−２）、腫瘍
壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、ミドカイン（ＭＫ）、ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ
、及びヘパリン結合神経栄養因子（ＨＢＮＦ、ヘパリン結合増殖因子としても知
られる）が挙げられるがそれらに限定されない。イムノサプレッサーをコードす
るヌクレオチド配列も、眼関連疾患又は発現ベクターの投与の結果としての眼内
の不適切な免疫応答を減少させるために、発現ベクターに組み込むことができる
。
【００８５】
発現ベクターは、更なる抗血管形成物質をコードする１つ以上の更なる核酸配
列を含むことができる。上記のように、抗血管形成物質は、血管新生を防止又は
改善する任意の生物因子である。当業者は、抗血管形成物質が治療効果を達成す
るために、血管形成の部分的又は完全な防止及び改善を生じさせうることを理解
しよう。抗血管形成物質としては、例えば抗血管形成因子、血管形成因子に特異
的なアンチセンス分子、リボザイム、血管形成因子の受容体、及び血管形成因子
の受容体に結合する抗体が挙げられる。
列を含むことができる。上記のように、抗血管形成物質は、血管新生を防止又は
改善する任意の生物因子である。当業者は、抗血管形成物質が治療効果を達成す
るために、血管形成の部分的又は完全な防止及び改善を生じさせうることを理解
しよう。抗血管形成物質としては、例えば抗血管形成因子、血管形成因子に特異
的なアンチセンス分子、リボザイム、血管形成因子の受容体、及び血管形成因子
の受容体に結合する抗体が挙げられる。
【００８６】
導入遺伝子は、緑蛍光タンパク質又はルシフェラーゼなどのマーカータンパク
質をコードできる。このようなマーカータンパク質は、ベクター構築及びベクタ
ー移動の決定に有用である。マーカータンパク質はまた、所望ならば、治療の広
範な区域を提供するために、発現ベクターの注射の間隔を効率的に空けるために
、注射個所又は治療される眼組織を決定するために使用できる。あるいは、導入
遺伝子は選別因子をコードできる。それはまた、ベクター構築プロトコルで有用
である。所望ならば、導入遺伝子は、発現カセットの一部でありうる。
質をコードできる。このようなマーカータンパク質は、ベクター構築及びベクタ
ー移動の決定に有用である。マーカータンパク質はまた、所望ならば、治療の広
範な区域を提供するために、発現ベクターの注射の間隔を効率的に空けるために
、注射個所又は治療される眼組織を決定するために使用できる。あるいは、導入
遺伝子は選別因子をコードできる。それはまた、ベクター構築プロトコルで有用
である。所望ならば、導入遺伝子は、発現カセットの一部でありうる。
【００８７】
本明細書で記載した任意の核酸配列が、それらの治療効果を増大させるために
、ネイティブ形態から変化させうることを理解すべきである。例えば、治療性核
酸の細胞質形態は、コードされた遺伝子産物にシグナルペプチドを導入すること
によって、分泌形態に変換できる。少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は
少なくとも１つの神経栄養因子は、ＶＰ２２とのそのペプチドの融合によって、
隣接する細胞に取り込まれるように設計できる。このことにより、治療性核酸を
含む眼細胞が、哺乳動物内の多数の眼細胞に対して治療効果を有することが可能
となる。
、ネイティブ形態から変化させうることを理解すべきである。例えば、治療性核
酸の細胞質形態は、コードされた遺伝子産物にシグナルペプチドを導入すること
によって、分泌形態に変換できる。少なくとも１つの血管形成阻害剤及び／又は
少なくとも１つの神経栄養因子は、ＶＰ２２とのそのペプチドの融合によって、
隣接する細胞に取り込まれるように設計できる。このことにより、治療性核酸を
含む眼細胞が、哺乳動物内の多数の眼細胞に対して治療効果を有することが可能
となる。
【００８８】
本発明の方法はまた、他の医薬として活性な化合物の共投与を含みうる。“共
投与”は、例えば、同じ製剤もしくは別の製剤中で発現ベクターと組み合わせて
、前に投与すること、同時に投与すること、又は上記のように発現ベクターの投
与後に投与することを意味する。例えば、イブプロフェン又はステロイドなどの
炎症を制御する因子は、発現ベクターの眼内投与と関連した膨潤及び炎症を減少
させるために、共投与できる。免疫抑制剤は、眼疾患又は本発明の方法の実施に
関連した不適切な免疫応答を減少させるために、共投与できる。可溶性増殖因子
受容体、増殖因子アンタゴニスト、即ち、アンジオテンシンなどの抗血管形成因
子も、神経栄養因子と同様に、共投与できる。同様に、ビタミンとミネラル、抗
酸化剤、及び微量栄養素も共投与できる。抗生物質、即ち、殺微生物剤と殺真菌
剤は、眼方法及び幾つかの眼関連疾患と関連した感染のリスクを減少させるため
に、共投与できる。
投与”は、例えば、同じ製剤もしくは別の製剤中で発現ベクターと組み合わせて
、前に投与すること、同時に投与すること、又は上記のように発現ベクターの投
与後に投与することを意味する。例えば、イブプロフェン又はステロイドなどの
炎症を制御する因子は、発現ベクターの眼内投与と関連した膨潤及び炎症を減少
させるために、共投与できる。免疫抑制剤は、眼疾患又は本発明の方法の実施に
関連した不適切な免疫応答を減少させるために、共投与できる。可溶性増殖因子
受容体、増殖因子アンタゴニスト、即ち、アンジオテンシンなどの抗血管形成因
子も、神経栄養因子と同様に、共投与できる。同様に、ビタミンとミネラル、抗
酸化剤、及び微量栄養素も共投与できる。抗生物質、即ち、殺微生物剤と殺真菌
剤は、眼方法及び幾つかの眼関連疾患と関連した感染のリスクを減少させるため
に、共投与できる。
【００８９】
本発明の発現ベクターは、血管新生コンポーネントと加齢性黄斑変性を含む眼
疾患を含む眼疾患の研究又は治療に特に有用であるけれども、発現ベクターを用
いて、種々の動物疾患を研究できるし、及び／又は予防的処置もしくは治療的処
置を行うことができることが理解されよう。例えば、ＰＥＤＦ又はその治療性フ
ラグメントをコードする核酸配列を含むウイルスベクターは、神経系、尿生殖器
疾患、癌、感染疾患、及び心臓血管異常、並びにその他の健康妨害の研究又は治
療に使用できる。ウイルスベクターを用いて、例えば、睡眠疾患、ＡＬＳ（ルー
・ゲーリッヒ病）、アルツハイマー病、てんかん、多発性硬化症、パーキンソン
病、末梢性ニューロパシー、精神分裂病、うつ病、不安、脊髄傷害、外傷性脳傷
害、又は急性、慢性もしくは炎症性疼痛を研究又は治療できる。本発明の発現ベ
クターを用いて、例えば、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、インポテンツ、神経因
性膀胱障害、尿失禁、腎不全及び末期腎疾患を含む尿生殖器疾患を治療できる。
発現ベクターは、例えば、膀胱癌、脳癌、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、頭部癌と
頚部癌、肝癌／肝細胞癌、肺癌、メラノーマ、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、
精巣癌、子宮癌／子宮内膜癌、白血病、及びリンパ腫などの癌を治療するのに有
用である。発現ベクターによって治療される感染疾患の例としては、クラミジア
、ヘルペス、マラリア、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ＡＩＤＳ／ＨＩＶ
、肺炎球菌性肺炎、インフルエンザ、髄膜炎、肝炎、及び結核が挙げられるがそ
れらに限定されない。例えば、血管新生疾患、虚血、うっ血性心不全、冠動脈疾
患、不整脈、アテローム性動脈硬化症、ＬＤＬ／ＨＤＬ比の増加、血管形成術後
の再狭窄もしくはステント内（in-stent）再狭窄、脳卒中、鎌状赤血球貧血、及
び血友病などの心臓血管疾患は、例えば、肥満、臓器移植／移植臓器拒絶、骨粗
鬆症、脱毛症、毛髪喪失、関節炎、アレルギー（ブタクサ、花粉、及び動物の鱗
屑に対するものなど）、嚢胞性線維症、糖尿病、及び聴力喪失の緩和と同様に、
治療又は研究できる。当業者は、上記疾患状態の多くに対し動物モデルが存在す
ることを理解しよう。
疾患を含む眼疾患の研究又は治療に特に有用であるけれども、発現ベクターを用
いて、種々の動物疾患を研究できるし、及び／又は予防的処置もしくは治療的処
置を行うことができることが理解されよう。例えば、ＰＥＤＦ又はその治療性フ
ラグメントをコードする核酸配列を含むウイルスベクターは、神経系、尿生殖器
疾患、癌、感染疾患、及び心臓血管異常、並びにその他の健康妨害の研究又は治
療に使用できる。ウイルスベクターを用いて、例えば、睡眠疾患、ＡＬＳ（ルー
・ゲーリッヒ病）、アルツハイマー病、てんかん、多発性硬化症、パーキンソン
病、末梢性ニューロパシー、精神分裂病、うつ病、不安、脊髄傷害、外傷性脳傷
害、又は急性、慢性もしくは炎症性疼痛を研究又は治療できる。本発明の発現ベ
クターを用いて、例えば、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、インポテンツ、神経因
性膀胱障害、尿失禁、腎不全及び末期腎疾患を含む尿生殖器疾患を治療できる。
発現ベクターは、例えば、膀胱癌、脳癌、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、頭部癌と
頚部癌、肝癌／肝細胞癌、肺癌、メラノーマ、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、
精巣癌、子宮癌／子宮内膜癌、白血病、及びリンパ腫などの癌を治療するのに有
用である。発現ベクターによって治療される感染疾患の例としては、クラミジア
、ヘルペス、マラリア、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ＡＩＤＳ／ＨＩＶ
、肺炎球菌性肺炎、インフルエンザ、髄膜炎、肝炎、及び結核が挙げられるがそ
れらに限定されない。例えば、血管新生疾患、虚血、うっ血性心不全、冠動脈疾
患、不整脈、アテローム性動脈硬化症、ＬＤＬ／ＨＤＬ比の増加、血管形成術後
の再狭窄もしくはステント内（in-stent）再狭窄、脳卒中、鎌状赤血球貧血、及
び血友病などの心臓血管疾患は、例えば、肥満、臓器移植／移植臓器拒絶、骨粗
鬆症、脱毛症、毛髪喪失、関節炎、アレルギー（ブタクサ、花粉、及び動物の鱗
屑に対するものなど）、嚢胞性線維症、糖尿病、及び聴力喪失の緩和と同様に、
治療又は研究できる。当業者は、上記疾患状態の多くに対し動物モデルが存在す
ることを理解しよう。
【００９０】
実施例
以下の実施例で更に本発明を説明するが、もちろん、その範囲を如何なる様式
にも限定するものとして解釈されるべきではない。
にも限定するものとして解釈されるべきではない。
【００９１】実施例１
本実施例は、インビボ網膜で、アデノウイルスベクターから、抗血管形成活性
と神経栄養性活性の両方を含む因子を発現させる好適な方法を説明する。
と神経栄養性活性の両方を含む因子を発現させる好適な方法を説明する。
【００９２】
アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ３及びＥ４領域の１つ以上の必須遺伝子機能
に欠損を有し、かつＰＥＤＦ遺伝子を含むアデノウイルスベクター（Ａｄ．ＰＥ
ＤＦ）を、ＷＯ ９９／１５６８６（McVey et al.）に記載のように好適に構築
する。しかし、本発明の方法は、使用したベクター構築の方法に依存するもので
はなく、以前に記載されたベクター構築法もまた適切である。 眼血管新生の幾つかのインビボモデルが利用できる。網膜の血管新生は、例え
ば、新生児動物、即ち、新生児マウスにおいて、マウスを誕生後直ぐに低酸素条
件に曝すことによって得られる。数日後、新生児マウスを、標準的大気条件に曝
して、網膜の虚血誘導血管新生を生じさせる。
に欠損を有し、かつＰＥＤＦ遺伝子を含むアデノウイルスベクター（Ａｄ．ＰＥ
ＤＦ）を、ＷＯ ９９／１５６８６（McVey et al.）に記載のように好適に構築
する。しかし、本発明の方法は、使用したベクター構築の方法に依存するもので
はなく、以前に記載されたベクター構築法もまた適切である。 眼血管新生の幾つかのインビボモデルが利用できる。網膜の血管新生は、例え
ば、新生児動物、即ち、新生児マウスにおいて、マウスを誕生後直ぐに低酸素条
件に曝すことによって得られる。数日後、新生児マウスを、標準的大気条件に曝
して、網膜の虚血誘導血管新生を生じさせる。
【００９３】
Ａｄ．ＰＥＤＦを、硝子体内注射により、例えば、ケタミン又はケタミンとキ
シラジンの組み合わせによって麻酔した少なくとも１２日齢マウスの右眼に投与
する。注射は、眼の後部に導入部位を形成し、Ａｄ．ＰＥＤＦを含む組成物を約
０．１〜５．０μｌ投与することによって行う。ほとんどの場合、発現ベクター
の注射は、一方の眼のみに投与され、残りの眼は対照とする。マウスを投与後種
々の時点で屠殺し、網膜におけるＰＥＤＦ発現の程度と持続時間を測定する。各
動物の右眼と左眼を摘出し、組織学的解析のために固定するか、又はＰＥＤＦ発
現解析のために調製する。ＰＥＤＦ ＤＮＡ、ＰＥＤＦ ＲＮＡ又はＰＥＤＦタ
ンパク質の検出は、ＰＣＲやブロッティング技術などの当業界周知の方法（例え
ば、Sambrook et al., 上記）を用いて成し遂げることができる。
シラジンの組み合わせによって麻酔した少なくとも１２日齢マウスの右眼に投与
する。注射は、眼の後部に導入部位を形成し、Ａｄ．ＰＥＤＦを含む組成物を約
０．１〜５．０μｌ投与することによって行う。ほとんどの場合、発現ベクター
の注射は、一方の眼のみに投与され、残りの眼は対照とする。マウスを投与後種
々の時点で屠殺し、網膜におけるＰＥＤＦ発現の程度と持続時間を測定する。各
動物の右眼と左眼を摘出し、組織学的解析のために固定するか、又はＰＥＤＦ発
現解析のために調製する。ＰＥＤＦ ＤＮＡ、ＰＥＤＦ ＲＮＡ又はＰＥＤＦタ
ンパク質の検出は、ＰＣＲやブロッティング技術などの当業界周知の方法（例え
ば、Sambrook et al., 上記）を用いて成し遂げることができる。
【００９４】
例えば、ヒトにおいて、インビボでの血管新生に対するＰＥＤＦの効果を測定
するために、網膜の間接的検眼鏡検査が理想的である。立体写真は、広範な血管
新生を検出するのに有用であるが、微妙な病巣を検出するのに適切ではない。
するために、網膜の間接的検眼鏡検査が理想的である。立体写真は、広範な血管
新生を検出するのに有用であるが、微妙な病巣を検出するのに適切ではない。
【００９５】実施例２
本実施例は、インビボ脈絡膜で、アデノウイルスベクターから、抗血管形成活
性と神経栄養性活性の両方を含む因子を発現させる好適な方法を示す。以下の実
施例は更に、血管新生に対するＰＥＤＦの効果を測定する方法を提供する。
性と神経栄養性活性の両方を含む因子を発現させる好適な方法を示す。以下の実
施例は更に、血管新生に対するＰＥＤＦの効果を測定する方法を提供する。
【００９６】
アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ３及びＥ４領域の１つ以上の必須遺伝子機能
に欠損を有し、かつＰＥＤＦ遺伝子を含むアデノウイルスベクター（Ａｄ．ＰＥ
ＤＦ）を、ＷＯ ９９／１５６８６（McVey et al.）に記載のように構築する。
に欠損を有し、かつＰＥＤＦ遺伝子を含むアデノウイルスベクター（Ａｄ．ＰＥ
ＤＦ）を、ＷＯ ９９／１５６８６（McVey et al.）に記載のように構築する。
【００９７】
脈絡膜血管新生のインビボモデルは、例えば、マウス又はウサギの眼の網膜を
はく離し、色素化した（pigmented）上皮の創面切除を行うことによって得るこ
とができる。脈絡毛細管再生を、処置眼と非処置眼の両方でモニターする。網膜
色素上皮（ＲＰＥ）の混乱前にＡｄ．ＰＥＤＦを投与し、脈絡膜血管新生の防止
における本発明の方法の効果を測定する。もちろん、Ａｄ．ＰＥＤＦは、血管新
生に対する本方法の治療効果の測定のために、網膜とＲＰＥとを混乱させた後に
投与される。
はく離し、色素化した（pigmented）上皮の創面切除を行うことによって得るこ
とができる。脈絡毛細管再生を、処置眼と非処置眼の両方でモニターする。網膜
色素上皮（ＲＰＥ）の混乱前にＡｄ．ＰＥＤＦを投与し、脈絡膜血管新生の防止
における本発明の方法の効果を測定する。もちろん、Ａｄ．ＰＥＤＦは、血管新
生に対する本方法の治療効果の測定のために、網膜とＲＰＥとを混乱させた後に
投与される。
【００９８】
脈絡膜血管新生は、当業界で普通に使用される眼底（fundus）写真、フルオレ
セイン血管造影法及び／又はインドシアニン−緑色血管造影法を用いてインビボ
でモニターできる。これらの方法を用いて、当業者は、新規血管の成長及び血管
新生にしばしば付随する血管漏出を検出できる。研究目的のために、血管新生は
また、眼を摘出し、そして血管キャスト（vascular cast）を製造することによ
って、又は走査型電子顕微鏡により眼組織を検査することによっても測定できる
。
セイン血管造影法及び／又はインドシアニン−緑色血管造影法を用いてインビボ
でモニターできる。これらの方法を用いて、当業者は、新規血管の成長及び血管
新生にしばしば付随する血管漏出を検出できる。研究目的のために、血管新生は
また、眼を摘出し、そして血管キャスト（vascular cast）を製造することによ
って、又は走査型電子顕微鏡により眼組織を検査することによっても測定できる
。
【００９９】実施例３
本実施例は、複数回投与の外来核酸を眼に送達させるためのアデノウイルスベ
クターの有用性を示す。
クターの有用性を示す。
【０１００】
ルシフェラーゼ遺伝子を含むアデノウイルスベクター（Ａｄ．Ｌ）又は導入遺
伝子を含まない対照アデノウイルスベクター（Ａｄ．ｎｕｌｌ）を、Ｃ５７ＢＬ
６マウスの眼の硝子体内空間に注射した（０日目）。アデノウイルスベクターの
注射の１日後（１日目）に、ＡｄＬを感染させた眼を摘出し、凍結した（１回目
投与）。Ａｄ．ｎｕｌｌを感染させた眼を３群にわけた。グループＩにおいて、
Ａｄ．Ｌベクターを、１４日目（Ａｄ．ｎｕｌｌの最初の投与の１４日後）に、
眼の硝子体内空間に注射した。アデノウイルスベクターの２回目の投与の翌日（
１５日目、２回目投与）に、グループＩの眼を摘出し、凍結した。１４日目に、
グループＩＩの眼にＡｄ．ｎｕｌｌを硝子体内に注射し、Ａｄ．ｎｕｌｌによる
最初の注射から４週間後に、Ａｄ．Ｌベクターを硝子体内に注射した（２８日目
、３回目投与）。次いで、アデノウイルスベクターの３回目投与の翌日に眼を摘
出し、凍結した。１４日目と２８日目に、グループＩＩＩの眼にＡｄ．ｎｕｌｌ
を硝子体内に注射し、Ａｄ．ｎｕｌｌによる最初の注射から６週間後にＡｄ．Ｌ
ベクターを注射した（４２日目、４回目投与）。次いで、アデノウイルスベクタ
ーの４回目投与の翌日に眼を摘出し、凍結した。ルシフェラーゼアッセイを眼サ
ンプルに対し行い、ベクターの複数回投与に伴う感染及び遺伝子発現の効率を測
定した。
伝子を含まない対照アデノウイルスベクター（Ａｄ．ｎｕｌｌ）を、Ｃ５７ＢＬ
６マウスの眼の硝子体内空間に注射した（０日目）。アデノウイルスベクターの
注射の１日後（１日目）に、ＡｄＬを感染させた眼を摘出し、凍結した（１回目
投与）。Ａｄ．ｎｕｌｌを感染させた眼を３群にわけた。グループＩにおいて、
Ａｄ．Ｌベクターを、１４日目（Ａｄ．ｎｕｌｌの最初の投与の１４日後）に、
眼の硝子体内空間に注射した。アデノウイルスベクターの２回目の投与の翌日（
１５日目、２回目投与）に、グループＩの眼を摘出し、凍結した。１４日目に、
グループＩＩの眼にＡｄ．ｎｕｌｌを硝子体内に注射し、Ａｄ．ｎｕｌｌによる
最初の注射から４週間後に、Ａｄ．Ｌベクターを硝子体内に注射した（２８日目
、３回目投与）。次いで、アデノウイルスベクターの３回目投与の翌日に眼を摘
出し、凍結した。１４日目と２８日目に、グループＩＩＩの眼にＡｄ．ｎｕｌｌ
を硝子体内に注射し、Ａｄ．ｎｕｌｌによる最初の注射から６週間後にＡｄ．Ｌ
ベクターを注射した（４２日目、４回目投与）。次いで、アデノウイルスベクタ
ーの４回目投与の翌日に眼を摘出し、凍結した。ルシフェラーゼアッセイを眼サ
ンプルに対し行い、ベクターの複数回投与に伴う感染及び遺伝子発現の効率を測
定した。
【０１０１】
アデノウイルスベクターの１回目と２回目投与後の眼細胞におけるルシフェラ
ーゼ発現はほぼ等しかった。換言すれば、遺伝子導入ベクターの２回の投与後、
遺伝子発現の喪失は検出されなかった。１回目投与と２回目投与からの遺伝子発
現と比較して、アデノウイルスベクターの３回目投与からの遺伝子発現は、１０
〜１００倍減少したが、なおバックグラウンドレベル以上であった（例えば、Ａ
ｄ．ｎｕｌｌで形質導入された細胞で検出した場合）。アデノウイルスベクター
の４回目投与からの遺伝子発現は、３回目投与後に観察された遺伝子発現と比較
して約３〜１０倍減少した。しかし、４回目投与後の遺伝子発現のレベルはバッ
クグラウンドレベル以上であった。 本実施例は、眼細胞において外来核酸を発現させるために、眼に対してアデノ
ウイルスベクターの複数の適用を行うことの実現可能性を示す。
ーゼ発現はほぼ等しかった。換言すれば、遺伝子導入ベクターの２回の投与後、
遺伝子発現の喪失は検出されなかった。１回目投与と２回目投与からの遺伝子発
現と比較して、アデノウイルスベクターの３回目投与からの遺伝子発現は、１０
〜１００倍減少したが、なおバックグラウンドレベル以上であった（例えば、Ａ
ｄ．ｎｕｌｌで形質導入された細胞で検出した場合）。アデノウイルスベクター
の４回目投与からの遺伝子発現は、３回目投与後に観察された遺伝子発現と比較
して約３〜１０倍減少した。しかし、４回目投与後の遺伝子発現のレベルはバッ
クグラウンドレベル以上であった。 本実施例は、眼細胞において外来核酸を発現させるために、眼に対してアデノ
ウイルスベクターの複数の適用を行うことの実現可能性を示す。
【０１０２】実施例４
本実施例は、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を阻害するための、抗血管形成性と神
経栄養性の両方を含む因子をコードする核酸配列を含む発現ベクターの能力を示
す。
経栄養性の両方を含む因子をコードする核酸配列を含む発現ベクターの能力を示
す。
【０１０３】
標準的技術を用いて、ＣＭＶ即時初期型（immediate early）プロモーターと
機能可能に結合したＰＥＤＦのコーディング配列を含む複製欠損（Ｅ１−／Ｅ３
−欠損）アデノウイルスベクター（ＡｄＰＥＤＦ．１０）を構築した。ＰＥＤＦ
コーディング配列を含まないベクターの空バージョン（ＡｄＮｕｌｌ．１０）も
構築した。
機能可能に結合したＰＥＤＦのコーディング配列を含む複製欠損（Ｅ１−／Ｅ３
−欠損）アデノウイルスベクター（ＡｄＰＥＤＦ．１０）を構築した。ＰＥＤＦ
コーディング配列を含まないベクターの空バージョン（ＡｄＮｕｌｌ．１０）も
構築した。
【０１０４】
Harvardポンプ微量注入装置とプルド(pulled)ガラスマイクロピペットを用い
て、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＡｄＮｕｌｌ．１０又はＡｄＰＥＤＦ．１０を
硝子体内に注射した。ウイルス１０9粒子を含むビヒクル１μｌを各眼に対し、
硝子体内に注射した。あるいは、ビヒクル１μｌに懸濁したウイルス１０8粒子
を、各眼に対し網膜下に注射した。注射５日後に、マウスをケタミン塩酸塩（１
００ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔した。トピカマイド（topicamide）（１％）を用い
て、瞳孔を拡張し、次いで、ダイオードレーザー光凝固術によってブルッフ膜の
破断を行った。ブルッフ膜の破断は、脈絡膜の血管新生を誘導することが知られ
ている。
て、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＡｄＮｕｌｌ．１０又はＡｄＰＥＤＦ．１０を
硝子体内に注射した。ウイルス１０9粒子を含むビヒクル１μｌを各眼に対し、
硝子体内に注射した。あるいは、ビヒクル１μｌに懸濁したウイルス１０8粒子
を、各眼に対し網膜下に注射した。注射５日後に、マウスをケタミン塩酸塩（１
００ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔した。トピカマイド（topicamide）（１％）を用い
て、瞳孔を拡張し、次いで、ダイオードレーザー光凝固術によってブルッフ膜の
破断を行った。ブルッフ膜の破断は、脈絡膜の血管新生を誘導することが知られ
ている。
【０１０５】
ブルッフ膜のレーザー誘導破断の１４日後に、脈絡膜フラットマウント（Edel
man et al., Invest.Ophthalmol.Vis.Sci., 41, S834 (2000) に記載）を調製し
、脈絡膜の血管新生の程度を観察した。要約すると、眼を被験体から取り出し、
リン酸緩衝化ホルマリンに固定した。角膜、レンズ及び網膜を洗眼用カップ（ey
ecup）から取り出し、洗眼用カップにフラットマウントした（flat-mounted）。
次いで、フラットマウントを蛍光顕微鏡で検査し、画像を、コンピューター画像
解析のために３色ＣＣＤビデオカメラ（ＩＫ−ＴＵ４０Ａ、東芝、東京、日本）
を用いてデジタル化した。
man et al., Invest.Ophthalmol.Vis.Sci., 41, S834 (2000) に記載）を調製し
、脈絡膜の血管新生の程度を観察した。要約すると、眼を被験体から取り出し、
リン酸緩衝化ホルマリンに固定した。角膜、レンズ及び網膜を洗眼用カップ（ey
ecup）から取り出し、洗眼用カップにフラットマウントした（flat-mounted）。
次いで、フラットマウントを蛍光顕微鏡で検査し、画像を、コンピューター画像
解析のために３色ＣＣＤビデオカメラ（ＩＫ−ＴＵ４０Ａ、東芝、東京、日本）
を用いてデジタル化した。
【０１０６】
血管新生の大きな区域が、未注射の眼及びＡｄＮｕｌｌ．１０を受けた眼で観
察された。網膜下又は硝子体内にＡｄＰＥＤＦ．１０を注射した眼は、コンピュ
ーター画像解析を用いると、対照と比較して血管新生のより小さな区域を示した
。
察された。網膜下又は硝子体内にＡｄＰＥＤＦ．１０を注射した眼は、コンピュ
ーター画像解析を用いると、対照と比較して血管新生のより小さな区域を示した
。
【０１０７】
上記結果は、臨床的動物関連モデルでの眼血管新生、即ち、脈絡膜血管新生（
ＣＮＶ）を阻害する、本発明の方法の能力を説明する。
ＣＮＶ）を阻害する、本発明の方法の能力を説明する。
【０１０８】実施例５
本実施例は、虚血誘導網膜血管新生を阻害する、抗血管形成性と神経栄養性の
両方を含む因子をコードする核酸配列を含む発現ベクターの能力を示す。
両方を含む因子をコードする核酸配列を含む発現ベクターの能力を示す。
【０１０９】
標準的技術を用いて、ＣＭＶ即時初期型プロモーターと機能可能に結合したＰ
ＥＤＦのコーディング配列を含む複製欠損アデノウイルスベクターを構築した。
ＰＥＤＦをコードするＥ１−／Ｅ３−／Ｅ４−欠損ベクター（ＡｄＰＥＤＦ．１
１）と、ＰＥＤＦコーディング配列を含まないベクターの空バージョン（ＡｄＮ
ｕｌｌ．１１）を構築した。
ＥＤＦのコーディング配列を含む複製欠損アデノウイルスベクターを構築した。
ＰＥＤＦをコードするＥ１−／Ｅ３−／Ｅ４−欠損ベクター（ＡｄＰＥＤＦ．１
１）と、ＰＥＤＦコーディング配列を含まないベクターの空バージョン（ＡｄＮ
ｕｌｌ．１１）を構築した。
【０１１０】
虚血性網膜症を、以前に記載されたように（例えば、Smith et al., Invest.O
phthalmol.Vis.Sci., 35,101(1994)）、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスで生じさせた
。要約すると、７日齢マウス（Ｐ７）を、７５＋／−３％酸素の大気に５日間曝
した。Ｐ１０で、マウスに、ＡｄＰＥＤＦ．１１又はＡｄＮｕｌｌ．１１の１０ 9 粒子を硝子体内に注射し、酸素に２日間戻し、次いで、室大気に戻した。Ｐ１
７で、マウスを屠殺し、眼を素早く取り出し、最適切断温度包埋化合物（ＯＣＴ
；Miles Diagnostics, Elkhart, IN）中で凍結した。
phthalmol.Vis.Sci., 35,101(1994)）、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスで生じさせた
。要約すると、７日齢マウス（Ｐ７）を、７５＋／−３％酸素の大気に５日間曝
した。Ｐ１０で、マウスに、ＡｄＰＥＤＦ．１１又はＡｄＮｕｌｌ．１１の１０ 9 粒子を硝子体内に注射し、酸素に２日間戻し、次いで、室大気に戻した。Ｐ１
７で、マウスを屠殺し、眼を素早く取り出し、最適切断温度包埋化合物（ＯＣＴ
；Miles Diagnostics, Elkhart, IN）中で凍結した。
【０１１１】
血管新生を検出するために、眼を切片にし、ビオチニル化グリフォニア・シン
プリシフォリアレクチンＢ４（griffonia simplicifolia lectin B4）（ＧＳＡ
，Vector Laboratories, Burlingame, CA）で組織化学的に染色した。次いで、
スライドを、メタノール／Ｈ2Ｏ2中で１０分間、４℃でインキュベートし、０．
０５Ｍトリス緩衝化生理食塩水ｐＨ７．６（ＴＢＳ）で洗浄し、１０％正常ブタ
血清中で３０分間インキュベートした。次いで、スライドを、ビオチニル化ＧＳ
Ａと２時間インキュベートし、ＴＢＳでリンスし、アビジン結合アルカリホスフ
ァターゼ（Vector Laboratories）と４５分間インキュベートした。ＴＢＳでの
１０分の洗浄後、スライドをHistomark Redとインキュベートした。ＧＳＡで染
色した一連の１０μｍ切片を、Axioskop顕微鏡を用いて検査した。コンピュータ
ー画像解析のために、３色ＣＣＤビデオカメラ（IK-TU40A、東芝、東京、日本）
を用いて、画像をデジタル化した。
プリシフォリアレクチンＢ４（griffonia simplicifolia lectin B4）（ＧＳＡ
，Vector Laboratories, Burlingame, CA）で組織化学的に染色した。次いで、
スライドを、メタノール／Ｈ2Ｏ2中で１０分間、４℃でインキュベートし、０．
０５Ｍトリス緩衝化生理食塩水ｐＨ７．６（ＴＢＳ）で洗浄し、１０％正常ブタ
血清中で３０分間インキュベートした。次いで、スライドを、ビオチニル化ＧＳ
Ａと２時間インキュベートし、ＴＢＳでリンスし、アビジン結合アルカリホスフ
ァターゼ（Vector Laboratories）と４５分間インキュベートした。ＴＢＳでの
１０分の洗浄後、スライドをHistomark Redとインキュベートした。ＧＳＡで染
色した一連の１０μｍ切片を、Axioskop顕微鏡を用いて検査した。コンピュータ
ー画像解析のために、３色ＣＣＤビデオカメラ（IK-TU40A、東芝、東京、日本）
を用いて、画像をデジタル化した。
【０１１２】
広範な網膜血管新生が、ウイルスを注射しなかった眼で検出された。ＡｄＮｕ
ｌｌ．１１を注射した眼は、未注射の眼よりも少ない血管新生を示したが、Ａｄ
ＰＥＤＦ．１１を注射した眼よりも有意により大きな血管新生を示した。ＡｄＰ
ＥＤＦ．１１を注射した眼は、最小量の血管新生を含んでいた。
ｌｌ．１１を注射した眼は、未注射の眼よりも少ない血管新生を示したが、Ａｄ
ＰＥＤＦ．１１を注射した眼よりも有意により大きな血管新生を示した。ＡｄＰ
ＥＤＦ．１１を注射した眼は、最小量の血管新生を含んでいた。
【０１１３】
本実施例は、臨床関連動物モデルにおいて、眼関連疾患、即ち、虚血誘導網膜
血管新生を阻害する、本発明の方法の能力を明白に示す。
血管新生を阻害する、本発明の方法の能力を明白に示す。
【０１１４】
本明細書で引用した全ての参考文献は、各参考文献が、引用により援用される
ことが個別的かつ具体的に記載され、かつその全体が本明細書に記載されている
のと同じ程度まで、引用により本明細書に援用されるものとする。
ことが個別的かつ具体的に記載され、かつその全体が本明細書に記載されている
のと同じ程度まで、引用により本明細書に援用されるものとする。
【０１１５】
本発明を、好適な実施態様を強調して記載したが、好適な実施態様のバリエー
ションを用いることができること、並びに本発明は本明細書に具体的に記載した
以外にも実施できることが意図されていることは、当業者に明白であろう。それ
故、本発明は、特許請求の範囲によって規定された本発明の思想と範囲内に包含
される全ての改変を含むものとする。
ションを用いることができること、並びに本発明は本明細書に具体的に記載した
以外にも実施できることが意図されていることは、当業者に明白であろう。それ
故、本発明は、特許請求の範囲によって規定された本発明の思想と範囲内に包含
される全ての改変を含むものとする。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年４月３０日（２００２．４．３０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(31)優先権主張番号 ６０／２２８，３３７
(32)優先日 平成12年８月28日(2000．8．28)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 マクヴェイ、ダンカン エル．
アメリカ合衆国、メリーランド州 20855、
ダーウッド、マンキャスター ミル ロウ
ド 6016
(72)発明者 ウェイ、リサ
アメリカ合衆国、メリーランド州 20878、
ゲイダーズバーグ、サッドル リヴァー
ドライヴ 14109
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 CA06 DA03
EA02 GA11 HA17
4C084 AA13 CA53 CA56 MA17 MA66
NA14 ZA331 ZB211
4C087 AA01 AA02 AA03 BB65 BC83
MA17 MA66 NA14 ZA33 ZB21
Claims (39)
- 【請求項１】 眼関連疾患のための動物の予防的処置又は治療的処置の方法
であって、眼細胞を、以下： （ａ）血管形成阻害剤をコードする核酸配列、及び神経栄養剤をコードする同じ
もしくは異なる核酸配列を含む発現ベクター、又は （ｂ）各々が血管形成阻害剤をコードする核酸配列及び／又は神経栄養剤をコー
ドする核酸配列を含む、異なる発現ベクター と接触させることを含み、 血管形成阻害剤をコードする核酸及び／又は神経栄養剤をコードする核酸配列
を発現させ、それによって血管形成阻害剤及び／又は神経栄養剤を産生させ、眼
関連疾患のために動物を予防的処置又は治療的処置する方法。 - 【請求項２】 血管形成阻害剤をコードする核酸配列及び神経栄養剤をコー
ドする核酸配列を含む発現ベクターと、眼細胞を接触させることを含む、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項３】 血管形成阻害剤をコードする核酸配列及び神経栄養剤をコー
ドする核酸配列が同じ核酸配列である、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 各々の発現ベクターが血管形成阻害剤をコードする核酸配列
及び／又は神経栄養剤をコードする核酸配列を含む、少なくとも２つの異なる型
の発現ベクターと、眼細胞を接触させることを含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 眼関連疾患が眼血管新生である、請求項１〜４のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項６】 眼血管新生が脈絡膜の血管新生である、請求項５に記載の方
法。 - 【請求項７】 眼血管新生が網膜の血管新生である、請求項５に記載の方法
。 - 【請求項８】 網膜の血管新生が糖尿病性網膜症に付随するものである、請
求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 眼関連疾患が加齢性黄斑変性である、請求項１〜４のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項１０】 少なくとも１つの発現ベクターがアデノ随伴ベクターであ
る、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】 少なくとも１つの発現ベクターがアデノウイルスベクター
である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１２】 少なくとも１つの発現ベクターがアデノウイルスベクター
であり、少なくとも１つの発現ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、
請求項１〜９のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１３】 アデノウイルスベクターが複製欠損である、請求項１１又
は１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 発現ベクターを、神経起源の細胞、毛様体上皮細胞、網膜
色素上皮細胞、グリア細胞、線維芽細胞、内皮細胞、又は線維柱網細胞に投与す
る、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１５】 発現ベクターを、虹彩上皮細胞、角膜細胞、毛様体上皮細
胞、ミュラー細胞、又はアストロサイトに投与する、請求項１〜１３のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項１６】 発現ベクターを、５５歳を超える患者に投与する、請求項
１〜１５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１７】 発現ベクターを、血管漏出の区域に投与する、請求項１〜
１６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１８】 発現ベクターが、発現ベクターの制御された放出を可能と
するデバイス内、又はその上に存在する、請求項１〜１７のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項１９】 発現ベクターを、局所、結膜下、眼球の後方、眼の周囲、
網膜下、脈絡膜上、又は眼内に投与する、請求項１〜１８のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項２０】 少なくとも１つの発現ベクターが血管形成阻害剤をコード
する核酸配列を含む、請求項４〜１９のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２１】 血管形成阻害剤が、抗血管形成因子、血管形成因子に特異
的なアンチセンス分子、リボザイム、及び血管形成因子の受容体からなる群から
選択される、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２２】 血管形成阻害剤をコードする核酸配列が複数の血管形成阻
害剤をコードする、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２３】 少なくとも１つの発現ベクターが神経栄養因子をコードす
る核酸配列を含む、請求項４〜２２のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２４】 少なくとも１つの発現ベクターが、血管形成阻害剤をコー
ドする核酸配列と神経栄養剤をコードする核酸配列を含む、請求項４〜２３のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項２５】 血管形成阻害剤と神経栄養剤が単一因子である、請求項３
〜２４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２６】 神経栄養剤が色素上皮由来因子である、請求項１〜２５の
いずれかに記載の方法。 - 【請求項２７】 動物の同じ眼に２回以上の適用で発現ベクターを投与する
ことを含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２８】 色素上皮由来因子又はその治療性フラグメントをコードす
る核酸配列を含むウイルスベクターであって、該核酸配列が色素上皮由来因子又
はその治療性フラグンメントの発現に必要な制御配列と機能可能に結合している
、ウイルスベクター。 - 【請求項２９】 アデノウイルスベクターである、請求項２８に記載のウイ
ルスベクター。 - 【請求項３０】 複製欠損である、請求項２９に記載のウイルスベクター。
- 【請求項３１】 Ｅ１領域の全て又は一部を欠いている、請求項３０に記載
のウイルスベクター。 - 【請求項３２】 Ｅ１ａ領域の全てもしくは一部を欠いている、及び／又は
Ｅ１ｂ領域の全てもしくは一部を欠いている、請求項３１に記載のウイルスベク
ター。 - 【請求項３３】 Ｅ４領域の全て又は一部を欠いている、請求項３０〜３２
のいずれかに記載のウイルスベクター。 - 【請求項３４】 Ｅ３領域の全て又は一部を欠いている、請求項３１〜３３
のいずれかに記載のウイルスベクター。 - 【請求項３５】 アデノ随伴ベクターである、請求項２８に記載のウイルス
ベクター。 - 【請求項３６】 色素上皮由来因子又はその治療性フラグメント以外の治療
性物質をコードする１つ以上の更なる核酸配列を更に含む、請求項２８〜３５の
いずれかに記載のウイルスベクター。 - 【請求項３７】 １つ以上の更なる核酸配列が毛様体神経栄養因子をコード
する、請求項３６に記載のウイルスベクター。 - 【請求項３８】 １つ以上の更なる核酸配列がアトナル関連ペプチドをコー
ドする、請求項３６に記載のウイルスベクター。 - 【請求項３９】 １つ以上の更なる核酸配列が抗血管形成物質をコードする
、請求項３６に記載のウイルスベクター。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US18174300P | 2000-02-11 | 2000-02-11 | |
| US60/181,743 | 2000-02-11 | ||
| US09/599,997 US6821775B1 (en) | 2000-02-11 | 2000-06-23 | Viral vector encoding pigment epithelium-derived factor |
| US09/599,997 | 2000-06-23 | ||
| US22833700P | 2000-08-28 | 2000-08-28 | |
| US60/228,337 | 2000-08-28 | ||
| PCT/US2001/004203 WO2001058494A2 (en) | 2000-02-11 | 2001-02-09 | Gene therapy for treating ocular-related disorders |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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| CA (1) | CA2398571A1 (ja) |
| WO (1) | WO2001058494A2 (ja) |
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