JP2005500035A - 新規線維芽細胞成長因子およびそれをコード化する核酸 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＦＧＦ−ＣＸ、新規単離ポリペプチド、ならびにＦＧＦ−ＣＸをコード化するポリヌクレオチドおよびＦＧＦ−ＣＸに免疫特異的に結合する抗体、または誘導体、変異体、またはＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのフラグメント、ポリヌクレオチドまたは抗体を提供する。加えて、本発明は、幅広い範囲の病態の検出および処置、ならびにたの使用において用いられるＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体を提供する。

Description

【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、一般に核酸およびポリペプチドに関する。本発明は、特に線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーに関するポリペプチドをコード化する核酸に関する。
【０００２】
（本発明の背景）
サイトカインである線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）グループは、成長、生存、アポトーシス、運動性および分化のような多種多様の細胞機能を調節する少なくとも２１のメンバーを含む。プロトタイプメンバーが、酸性ＦＧＦ（ＦＧＦ−１）および塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ−２）を含むタンパク質であるＦＧＦファミリーは、４つの関連する受容体チロシンキナーゼに結合する。これらの分子は、細胞表面チロシンキナーゼＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）との高親和性相互作用を経由してシグナルを伝達する。これらのＦＧＦ受容体は、組織培養において大部分の細胞タイプで発現する。リガンド結合上のＦＧＦ受容体モノマーの２量体化は、受容体のリン酸化を導くキナーゼドメインの活性化に必要であると報告されてきた。４つのＦＧＦ受容体の広範な発現パターンを示すＦＧＦ受容体１（ＦＧＦＲ−１）は、少なくとも７つのチロシンリン酸化部位を含有する。多くのシグナル伝達分子は、これらのリン酸化部位に対する異なる親和性での結合により作用される。
【０００３】
正常成長および正常発生での関与に加えて、既知のＦＧＦはまた、癌を含む病態の発生において関係するとみなされてきた。ＦＧＦは、腫瘍細胞の成長を直接的に増強することにより腫瘍の原因となり得る。例えば、同一細胞でのＦＧＦとＦＧＦＲの共発現を介するオートクリン成長刺激は、細胞の形質転換を導くと報告されてきた。
【０００４】
（発明の概要）
本発明は、タンパク質である線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーに対して相同性を有する新規ポリペプチドをコード化する核酸の発見に部分的に基づく。線維芽細胞成長因子ＣＸ（ＦＧＦ−ＣＸ）と名付けられたポリヌクレオチド配列は本発明に含まれ、これらの核酸配列によりコード化されたＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、およびスプライスバリアント、ＳＮＰ、フラグメント、相同体、類似体、およびそれらの誘導体が本発明において請求される。ＦＧＦ−ＣＸ核酸の実施例は配列番号：１であり、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの実施例は配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。このアミノ酸配列は、配列番号：１の核酸配列によりコード化される。
【０００５】
１つの態様において、本発明は単離ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを含む。いくつかの実施態様においては、単離ポリペプチドは配列番号：２のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、本発明は配列番号：２の変異体を含み、変異体のいくつかのアミノ酸残基において、例えば、配列番号：２のアミノ酸配列の１％、２％、３％、５％、１０％または１５％未満が変更を受けている。いくつかの実施態様においては、単離ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型のアミノ酸配列、または配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型の変異体を含む。好ましくは、アミノ酸配列の成熟型の変異体において配列番号：２のアミノ酸配列の１％、２％、３％、５％または１５％未満が変更を受ける。
【０００６】
ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの変異体、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの成熟型およびＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの成熟型の変異体のフラグメントを含むＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのフラグメント、ならびにＦＧＦ−ＣＸ核酸の対立遺伝子変異体および１塩基多型によりコード化されるＦＧＦ−ＣＸポリペプチドも、本発明において含まれる。ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの実施例は、配列番号：２の残基５４〜２１１または配列番号：２の残基２４〜２１１を含むフラグメントである。
【０００７】
別の態様において、本発明は単離ＦＧＦ−ＣＸ核酸分子を含む。ＦＧＦ−ＣＸ核酸分子は、上で開示された任意のＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、変異体、またはフラグメント、またはかかる核酸配列のいずれかに対する相補体をコード化する配列を含に得る。１つの実施態様において、配列は、配列番号：１において開示されたものを含む。他の実施態様において、ＦＧＦ−ＣＸ核酸は、配列番号：１において与えられるものと異なるヌクレオチドが取り込まれ得る配列を含む。好ましくは、ヌクレオチドの１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、または２０％未満が変更を受ける。
【０００８】
１つの実施態様において、 核酸は、配列番号：２の残基５４〜２１１または配列番号：２の残基２４〜２１１を含むポリペプチドフラグメントをコード化する。核酸は、例えば、配列番号：１のヌクレオチド１６３〜６３３または配列番号：１のヌクレオチド７０〜６３３を含むことができる。
【０００９】
他の実施態様において、本発明はこれらの核酸配列のフラグメントまたは相補体を含む。ＦＧＦ−ＣＸ核酸を取り込むベクターおよび細胞はまた、本発明において含まれる。
【００１０】
本発明は、本明細書において記載される任意のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体も含む。様々な実施態様におけるＦＧＦ−ＣＸ抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体および／またはヒト抗体を含む。
【００１１】
本発明は、加えて、本発明のＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、ＦＧＦ−ＣＸ核酸またはＦＧＦ−ＣＸ抗体を含む医薬組成物を提供する。例えば、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、ＦＧＦ−ＣＸ核酸またはＦＧＦ−ＣＸ抗体を含むキットも本発明において含まれる。
【００１２】
いくつかの方法が、本発明において含まれる。例えば、試料中の本発明のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの存在または量を測定する方法が開示される。方法は、試料をポリペプチドに免疫特異的に結合するＦＧＦ−ＣＸ抗体と接触させること；および該ポリペプチドに結合する抗体の存在または量を測定することを含み、かかる抗体が、試料中のポリペプチドの存在または量を示す。
【００１３】
同様に、本発明は、試料中のＦＧＦ−ＣＸ核酸分子の存在または量を測定する方法を開示する。方法は、試料を核酸分子に結合するプローブと接触させること；および核酸分子に結合するプローブの存在または量を測定することを含み、かかるプローブが試料中のＦＧＦ−ＣＸ核酸分子の存在または量を示す。
【００１４】
本発明により、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドに結合する物質を同定する方法も提供される。方法は、候補物質がＦＧＦ−ＣＸポリペプチドに結合する否かの決定を含む。候補物質の結合は、物質がＦＧＦ−ＣＸポリペプチド結合物質であることを示す。
【００１５】
本発明は、病態の処置において用いる潜在的治療物質を同定する方法も含む。病態は、例えば、本発明のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの異常発現、異常プロセッシング、または異常生理的相互作用と関係する。この方法は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを発現し、かつポリペプチドに基づく性質または機能を有する細胞を用意すること；用意した細胞を、候補物質を含む組成物と接触させること；および対照細胞との比較において物質がポリペプチドに基づく性質または機能を変化させるか否かを決定することを含む。かかる物質のいずれかが、潜在的治療物質として同定される。さらに、治療物質は、この方法で同定された任意の潜在的治療物質を、病態の処置において用いる治療物質を同定するための付加試験の対象とすることにより同定され得る。
【００１６】
いくつかの実施態様において、性質または機能が細胞成長または細胞増殖に関与し、物質がポリペプチドに結合し、それによりポリペプチドの活性化を調節する。いくつかの実施態様においては、候補物質は約１５００Ｄａ以下の分子量を有する。いくつかの実施態様において、候補物質は抗体である。本発明は、加えて、本明細書において記載されるような方法を用いて同定される任意の治療物質を提供する。
【００１７】
本発明の別の重要な態様は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドと関連する疾患の処置または予防する方法に関与する。疾患は、細胞または組織の不十分な成長または役に立たない成長により、または細胞または組織の過形成または異常増殖により特徴付けられる。方法は、該対象の疾患を処置または予防するのに十分な量および持続時間での本発明のＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、または本発明のＦＧＦ−ＣＸ核酸、または本発明の任意の他の治療物質を対象に投与することを含む。有意義な実施態様において、対象はヒトである。
【００１８】
本発明は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの異常発現、異常プロセッシング、または異常生理的相互作用と関連する疾患の潜在活性または素因のモジュレーターをスクリーニングする方法も含む。方法は、本発明のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを組替え発現し、疾患に対して増加したリスクのある被検動物を用意すること；被検動物に試験化合物を投与すること；化合物の投与後の被検動物中のポリペプチドの活性を測定すること；および被検動物中のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの活性を、化合物を投与されていない対照動物中のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの活性と比較することを含む。対照動物と比較して被検動物中のポリペプチドの活性での変化が存在すると、試験化合物は疾患の潜在活性または素因のモジュレーターである。
【００１９】
本発明はまた、第１の哺乳動物対象中の本発明のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドまたはＦＧＦ−ＣＸ核酸の変化したレベルと関連する疾病の存在または素因を決定する方法を提供する。方法は、第１の哺乳動物対象由来の試料中のポリペプチドの発現レベルまたは核酸の量を測定すること；試料中のその量を、疾病を有さない、または素因を有さないと知られている第２の哺乳動物対象由来の対照試料中その量と比較することを含む。対照試料と比較して第１の対象中のポリペプチドの発現レベルまたは核酸の量での変化は、疾病の存在または素因を示す。
【００２０】
本発明により、哺乳動物において病態を処置する方法も提供される。ここで、病態は、本発明のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの異常発現、異常プロセッシング、または異常生理的相互作用に関与する。方法は、哺乳動物へ病態を緩和するのに十分な量で本発明のポリペプチドを投与することを含む。ここで、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または実に９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性なフラグメントである。別の関係する方法において、本発明の抗体が、哺乳類に投与される。
【００２１】
別の態様において、本発明は対象における細胞成長を促進する方法を含む。方法は、細胞成長の促進に作用する量および持続時間で本発明のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを対象へ投与することを含む。いくつかの実施態様において、対象はヒトであり、成長が促進されるべき細胞は、傷の近くにある細胞、血管系における細胞、血管新生において含まれる細胞、赤血球新生において含まれる細胞、消化管の内壁にある細胞、および毛包にある細胞から選択され得る。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は対象における細胞成長を阻害する方法を提供する。ここで、成長は本発明のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの発現と関係する。この方法は、細胞成長を阻害する組成物を対象へ投与することを含む。非常に重要な実施態様において、組成物は本発明の抗体または別の治療物質を含む。有意義なことに、対象はヒトであり、成長が阻害されるべき細胞は、形質転換細胞、過形成細胞、腫瘍細胞、および異常増殖細胞から選択される。
【００２３】
なお更なる態様において、本発明は、組織増殖と関連する疾患を処置または予防、または進行を妨げる方法を提供する。方法は、かかる処置または予防または進行の妨げが対象中の組織増殖と関連する疾患を処置、予防、または進行を妨げるのに十分な量でＦＧＦ−ＣＸ核酸、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、またはＦＧＦ−ＣＸ核酸抗体を望む対象への投与を含む。
【００２４】
ＦＧＦ−ＣＸ核酸分子、ポリペプチドまたは抗体を用いて診断、処置、予防または進行を妨げられる組織増殖と関連する疾患は、上皮細胞、例えば、手術後の眼球前部での線維芽細胞およびケラチノサイトを含み得る。他の組織増殖と関連する疾患は、例えば、腫瘍、再狭窄、乾癬、デュピュイトレン拘縮（Dupuytren's contracture）、糖尿病合併症、カポジ肉腫、および関節リウマチを含む。
【００２５】
別段の定義がなければ、本明細書において用いられる全技術用語および科学用語は、本発明が属する当分野の通常の知識を有するものにより普通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似または等しい方法および物質が、本発明の実施または試験において用いることができるが、適当な方法および物質は以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、全体として、参考文献により取り込まれる。矛盾のある場合は、定義を含む本明細書が支配する。加えて、物質、方法、および実施例は、ただ例示的なものであり、制限されることを意図するものでない。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および請求項から明らかであろう。
【００２６】
（図面の簡単な説明）
図１は、ＦＧＦ−ＣＸのウエスタン分析を示す。２９３細胞由来試料（パネルＡ）または望ましい構築物で一過性に形質移入したＮＩＨ３Ｔ３細胞由来試料（パネルＢ）を、抗Ｖ５抗体を用いたウエスタン分析により調べた。ＣＭは条件培地、ＳＥはスラミンで抽出した条件培地である。分子量マーカーは左に示す。
【００２７】
図２は、２９３細胞により分泌されたＦＧＦ−ＣＸタンパク質のウエスタン分析を示す。
【００２８】
図３は、E.coli細胞において発現させたＦＧＦ−ＣＸ(配列番号：２)タンパク質のウエスタン分析を示す。
【００２９】
図４は、ＦＧＦ−ＣＸ特異的ＴａｑＭａｎ試薬を用いたリアルタイム定量的ＰＣＲにより得たＦＧＦ−ＣＸの発現分析である。正常ヒト組織試料由来の標準化ＲＮＡの結果をパネルＡに示し、腫瘍細胞株由来の標準化ＲＮＡの結果をパネルＢに示す。手術で直接的に得た腫瘍組織を用いて得た結果を、パネルＣおよびパネルＤに示す。
【００３０】
図５は、ＤＮＡ合成への作用により表される、組換えＦＧＦ−ＣＸの生物学的活性を表示する。細胞を、血清飢餓状態におき、望ましい因子と１８時間インキュベートし、ＢｒｄＵ取込みアッセイにより分析した。試料は３度実行された。パネルＡはＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞である。パネルＢはＣＣＤ−１０７０ヒト線維芽細胞である。パネルＣはＣＣＤ−１１０６ヒトケラチノサイトである。
【００３１】
図６は、細胞成長への作用により表される組換えＦＧＦ−ＣＸの生物学的活性を表示する。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、望ましい因子を補足した無血清培地でインキュベートし、４８時間後にカウントした。試料は２度実行された。
【００３２】
図７は、細胞形態への作用により表される組換えＦＧＦ−ＣＸの生物学的活性である。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＦＧＦ−ＣＸまたは対照タンパク質と４８時間インキュベートし、２５倍の拡大率で写真撮影した。
【００３３】
図８は、ＦＧＦ−ＣＸの腫瘍化活性を表すグラフである。望ましい構築物で安定的に形質移入したＮＩＨ３Ｔ３細胞を、胸腺欠損ヌードマウスの皮下組織に注入し、２週間の期間にわたり腫瘍形成について調べた。４匹の動物の最小値をそれぞれのデータポイントに用いた。
【００３４】
図９は、ＦＧＦ−ＣＸ構築物で安定的に形質移入したＮＩＨ３Ｔ３細胞を皮下組織へ注入された対照胸腺欠損ヌードマウスおよび胸腺欠損ヌードマウスの写真である。
【００３５】
図１０は、還元条件下および非還元条件下で調整されたＦＧＦ−ＣＸの精製試料のクーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのイメージである。
【００３６】
図１１は、７８６−０ヒト腎臓腺癌細胞を用いて実行した投与量タイトレーション実験の結果を提供する。この実験において、種々の量のＦＧＦ−ＣＸ（図２１において２０８５８として表す）により誘導されたブロモデオキシウリジンの取込みを測定した。
【００３７】
図１２は、インビトロでの病巣の形成を示す。望ましい構築物で形質移入したＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＤＭＥＭ／５％子ウシ血清中で２週間培養し、染色して写真撮影した。ｐＩｇκ−ＦＧＦ−２０構築物によりもたらされる病巣は、多数だが、密集に起因して小さい。
【００３８】
図１３は、ＦＧＦ−ＣＸの受容体結合特異性を評価する実験の結果を示す。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を血清飢餓状態におき、望ましい成長因子（四角はＰＤＧＦ−ＢＢ；三角はａＦＧＦ；丸はＦＧＦ−ＣＸ）のみ、または望ましい可溶性ＦＧＦＲと共にのいずれかでインキュベーションし、ＢｒｄＵ取込アッセイにより分析した。実験を３度実行し、成長因子のみを受け取った細胞と比べるＢｒｄＵの取込でのパーセントＢｒｄＵ増加として表す。
【００３９】
図１４は、プラスミドｐＥＴ２４ａ−ＦＧＦ２０Ｘ−ｄｅｌ１５４コドンをE.coli菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた場合に得たアルギニン上清のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのイメージを示す。
【００４０】
図１５は、全長ＦＧＦ−ＣＸ（図中でＦＧＦ２０と表す）と比較して、ＤＮＡ合成への作用により表す組換えＦＧＦ−ＣＸの切断型（図中で（ｄ１〜２３）ＦＧＦ２０により示す）の生物学的活性を示す。ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞を血清飢餓状態におき、望ましい因子で１８時間インキュベートし、ＢｒｄＵ取込アッセイにより分析した。
【００４１】
（発明の詳細な説明）
この発明は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーであるポリペプチドをコード化する新規ＦＧＦ−ＣＸ核酸配列の発見に部分的に基づく。本明細書において開示される様に、表示「ＦＧＦ−ＣＸ」は、核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、および変異体、誘導体およびそれらのいずれかのフラグメント、ならびにこれらのクラスの化合物のいずれかに免疫特異的に結合する抗体に関する。
【００４２】
上述した様に、ＦＧＦファミリーのメンバーは、成長、生存、アポトーシス、運動性および分化のような多種多様な細胞機能を制御する(Szebenyi & Fallon (1999) Int. Rev. Cytol. 185, 45-106)。これらの分子は、細胞表面チロシンキナーゼＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）との高親和性相互作用を経由して細胞内にシグナルを伝達する。４つのＦＧＦ受容体が今までに同定された(Xu, X., Weinstein, M., Li, C. & Deng, C. (1999) Cell Tissue Res. 296, 33-43; Klint, P. & Claesson-Welsh, L. (1999) Front. Biosci. 4, 165-177)。これらのＦＧＦ受容体は、組織培養での多くの細胞タイプで発現する。リガンド結合上のＦＧＦ受容体モノマー２量体化は、受容体のリン酸化を導くキナーゼドメインの活性化に必要であると報告されてきた。４つのＦＧＦ受容体の広範な発現パターンを示すＦＧＦ受容体１（ＦＧＦＲ−１）は、少なくとも７つのチロシンリン酸化部位を含有する。多くのシグナル伝達分子は、これらのリン酸化部位に異なる親和性で結合することにより作用する。
【００４３】
ＦＧＦはまた、低親和性にも関わらず、たいていの細胞表面および細胞外基質（ＥＣＭ）に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合する。ＦＧＦとＨＳＰＧとの相互作用は、ＦＧＦ／ＦＧＦＲ相互作用を安定させ、かつＦＧＦを隔離してそれらを分解から守るために働く(Szebenyi, G. & Fallon, J. F. (1999))。成長促進能力に起因するため、ＦＧＦファミリーの１メンバーであるＦＧＦ−７は現在、化学療法により誘導された粘膜炎（mucositis）の処置のための臨床試験中である(Danilenko, D. M. (1999) Toxicol. Pathol. 27, 64-71)。
【００４４】
正常成長および正常発生において関与することに加えて、既知のＦＧＦはまた、癌を含む病態の発生に関係してきた(Basilico, C & Moscatelli, D. (1992) Adv. Cancer Res. 59, 115-165)。ＦＧＦは、腫瘍細胞の成長を直接的に増強することによる腫瘍の原因であり得る。例えば、同一細胞でのＦＧＦとＦＧＦＲの共発現を介するオートクリン成長刺激は、細胞の形質転換を導く(Matsumoto-Yoshitomi, et al. (1997) Int. J. Cancer 71, 442-450)。同じく、変異または転位を経由するＦＧＦＲの常時活性化は、無調節の増殖を導く(Lorenzi, et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8956-8961; Li, et al. (1997) Oncogene 14, 1397-1406)。さらに、いくつかのＦＧＦは血管原性である(Gerwins, et al. (2000) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 34, 185-194)。かかるＦＧＦは、腫瘍成長を維持するために必要とされる血液供給の発達を促進することにより腫瘍形成過程の原因となり得る。驚くことではないが、少なくとも１つのＦＧＦが現在、癌療法の潜在的標的として研究中である(Gasparini (1999) Drugs 58, 17-38)。
【００４５】
出生時マウスおよび成長マウスの脳でのＦＧＦおよびそれらの受容体の発現は調べられてきた。ＦＧＦ−４を除く全てのＦＧＦ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡは、これらの組織において検出される。ＦＧＦ−３遺伝子、ＦＧＦ−６遺伝子、ＦＧＦ−７遺伝子およびＦＧＦ−８遺伝子は、出生後の期間よりも胚後期においてより高い発現を示す。このことは、これらのメンバーが脳発生の後期において関与することを示す。対照的に、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−５の発現は、出生後増加した。特に、出生時マウスでのＦＧＦ−６発現が、胚の大脳発生のはあるが、５日目の新生児の小脳のはない強力なシグナルを有する中枢神経系および骨格筋に限られることが報告されてきた。ＦＧＦ−６の同族受容体であるＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）４は、類似の時空発現を示す。このことは、ＦＧＦ−６およびＦＧＦ−４が神経系の成熟においてリガンド受容体システムとして重要な働きをすることを示す。Ozawa等によると、これらの結果は、様々なＦＧＦおよびそれらの受容体が、神経の前駆細胞の増殖および遊走、神経細胞の分化およびグリア細胞の分化、神経突起伸長、およびシナプス形成のような脳の様々な発生過程の制御において関与することを強く示す。
【００４６】
ＦＧＦポリペプチドファミリーの他のメンバーは、ＦＧＦ受容体チロシンキナーゼ（ＦＧＦＲＴＫ）ファミリーおよびＦＧＦ受容体ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＦＧＦＲＨＳ）ファミリーを含む。これらのメンバーは、活性化および特異的ＦＧＦＲシグナル伝達複合体を制御する。これらの制御活性化は、哺乳動物の幅広いレンジの器官および組織、および正常組織および腫瘍組織の両方において多様化される。制御された選択的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）スプライシングおよび変異体サブドメインの組合せは、ＦＧＦＲＴＫモノマーの多様性を生じる。２価の陽イオンは、ＦＧＦＲＨＳと協力し、キナーゼ活性の抑制を引き起こし、ＦＧＦによるＦＧＦＲ複合体の適当な活性化を促進する、ＦＧＦＲＴＫトランスリン酸化を高次構造的に制限する。例えば、ＦＧＦＲＴＫにおける異なる点変異が、全ＦＧＦＲ複合体のＦＧＦ依存性活性での段階的な増加による頭蓋顔面異常および骨格異常の段階的な重傷を一般に引き起こすことは知られている。ＦＧＦファミリーが重大な作用を発揮する他の過程は、肝臓成長および肝臓機能、および前立腺腫瘍の進行である。
【００４７】
別のＦＧＦファミリーメンバーであるグリア細胞活性化因子（ＧＡＦ）は、ヒト神経膠腫細胞株の培養上清から精製されたヘパラン結合成長因子である。Miyamoto et al. 1993, Mol Cell Biol 13(7): 4251-4259を参照されたい。ＧＡＦは、他の既知の成長因子のものとは若干異なる活性のスペクトルを示し、ＦＧＦ−９と名付けられる。ヒトＦＧＦ−９ｃＤＮＡは、２０８アミノ酸のポリペプチドをコード化する。ＦＧＦファミリーの他のメンバーに対する配列類似性は、約３０％であると推定された。他のファミリーメンバーにおいて見られる２つのシステイン残基および他の共通配列も、ＦＧＦ−９配列においてよく保存されていた。ＦＧＦ−９は、酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦ中のものの様なＮ末端中の典型的シグナル配列を有さないと分かった。
【００４８】
酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦは、通常の方法で細胞から分泌されないことは知られている。しかしながら、ＦＧＦ−９は、典型的シグナル配列を欠くにもかかわらずｃＤＮＡを形質移入されたＣＯＳ細胞から効率的に分泌されることが分かった。それは、細胞培地においてもっぱら検出されることができた。分泌タンパク質は、開始メチオニンを除くｃＤＮＡ配列により予測されるものに関して、Ｎ末端でアミノ酸残基を失っていない。ラットＦＧＦ−９ｃＤＮＡもクローン化され、構造分析はＦＧＦ−９遺伝子が非常に保存されていることを示した。
【００４９】
データベース検索を用いて、染色体８ｐ２２〜２１．３由来のヒト配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ２０８５８）はアフリカツメガエルＦＧＦ２０に相同すると同定された。Kirikoshi et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 274: 337-343, 2000, PMID 10913340を参照されたい。ヒト配列に対して設計されたＰＣＲプライマーを用いて、大腸癌細胞株および胃癌細株由来の重複ＦＧＦ２０ｃＤＮＡを増幅した。ＦＧＦ２０の３つの予測エキソンは、ＦＧＦコアドメインを含有する推定２１１アミノ酸タンパク質をコード化する。予測分子量は、２３ｋＤａである。ＦＧＦ２０は、ＦＧＦコアドメインにおいて強疎水性領域およびＮ末端にて弱疎水性領域を含有する。Ｎ末端シグナル配列または潜在的Ｎグリコシル化部位は、同定されていない。ＦＧＦ２０は、ＦＧＦ９およびＦＧＦ１６とそれぞれ７１．６％および６６．２％の全体的アミノ酸配列同一性を共有する。Kirikoshi et al. (2000)は、系統学的解析から、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ９、およびＦＧＦ１６が哺乳類ＦＧＦファミリー間のサブファミリーを形成すると結論付けた。２０の成人および胎児組織、および８つの癌細胞株のノーザンブロット分析を用いて、Kirikoshi et al. (2000)は、２．４〜ｋｂのＦＧＦ２０転写物を大腸癌細胞株ＳＷ４８０においてのみ検出した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＳＷ４８０細胞においてＦＧＦ２０の大量発現を確認し、ヒト胎児脳、胎児肝臓、胎児腎臓、および胃癌細胞株において低レベルの発現を示した。
【００５０】
Kirikoshi et al. (2000)は、染色体８ｐ２２〜ｐ２１．３領域は、ヒト癌においてヘテロ接合性喪失頻繁部位であることに気付いた。
本発明は、新規ヒトＦＧＦならびにその対応するｃＤＮＡを提供する。この遺伝子のタンパク質産物は、成長刺激性および発現性を示す。さらに、ＦＧＦｍＲＮＡの過剰発現が、ある特定の癌細胞株において見つかった。これらの知見は、新規ＦＧＦがヒトの悪性腫瘍の処置で優れた標的として働くことにより有用であり得ることを示す。
【００５１】
本発明はまた、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド成熟型、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド成熟型の変異体、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド成熟型のフラグメントおよびＦＧＦ−ＣＸポリペプチド変異体の成熟型のフラグメント、およびそれらポリペプチドおよびフラグメントをコード化する核酸を含む。本明細書において使用する様に、本発明において開示されたＦＧＦ−ＣＸポリペプチドまたはＦＧＦ−ＣＸタンパク質の「成熟」型は、天然に存在するポリペプチド、前駆体型、またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質は、実施例に限定されないで、対応する遺伝子によりコード化された全長遺伝子産物を含む。いくつかの実施態様において、成熟型は、本明細書において記載されるオープンリーディングフレームによりコード化されるＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、前駆体、プロタンパク質を含む。産物「成熟」型は、例えば、遺伝子産物が生じる細胞、または宿主細胞内で起こり得る１またはそれ以上の天然に存在するプロセッシングステップの結果として生じることができる。
【００５２】
ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型を導く、かかるプロセッシングステップの実施例は、オープンリーディングフレームの開始コドンによりコード化されたＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解性の切断を含む。従って、残基１〜Ｎを有する（ここで、残基１はＮ末端メチオニンである）ＦＧＦ−ＣＸ前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は、Ｎ末端メチオニンの除去後残存するＮを介する残基２を有するＮ末端メチオニンである。または、残基１〜Ｎ（ここで、残基１〜ＭのＮ末端シグナル配列は切断されている。）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は、残存する残基Ｎに対する残基Ｍ＋１由来の残基を有する。加えて、「成熟」タンパク質またはフラグメントは、開始メチオニンの除去またはシグナルペプチドの除去以外の切断現象から生じ得る。本明細書においてさらに用いられる様に、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型は、タンパク質分解性切断現象以外の翻訳後修飾のステップから生じ得る。かかる別の過程は、実施例に限定されないで、グリコシル化、ミリストイル化またはリン酸化を含む。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質は、これら過程の１つのみの働き、またはそれらのいずれかの組合せから生じ得る。
【００５３】
本明細書において使用する様に「同一」残基は、２配列アラインメントの等しいヌクレオチド塩基またはアミノ酸残基が同一残基である２つの配列間比較における、それらの残基に対応する。残基は代わりに、アラインメントの２配列間比較が、比較において等しい位置にある残基が以下で定義される同一アミノ酸または保存アミノ酸のいずれかであることを示すと、「類似」または「ポジティブ」として記載される。
【００５４】
ＦＧＦ−ＣＸ核酸、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドまたはそれらの一部をコード化する単離核酸、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、これらの核酸を含有するベクター、ＦＧＦ−ＣＸ核酸で形質転換された宿主細胞、抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体、および医薬組成物が、本発明において含まれる。ＦＧＦ−ＣＸを生成する方法、ならびにスクリーニング、診断、これらの化合物を用いる状態を処置する方法、およびＦＧＦ−ＣＸポリペプチド活性を調節する化合物をスクリーニングする方法も、開示される。以下の表Ａは、本発明を通じて用いられる配列記述子を表す。
【００５５】
表Ａ
【表１】

【００５６】
本明細書において話題にするＦＧＦ−ＣＸ核酸およびポリペプチド、ならびにＦＧＦ−ＣＸ抗体、治療物質および医薬組成物は、とりわけ組織増殖関連疾患の処置において有用である。これらの組織増殖関連疾患は、上皮細胞、例えば、手術後の眼球前部での線維芽細胞およびケラチノサイトに作用する疾患を含み得る。他の組織増殖関連疾患は、例えば、腫瘍、再狭窄、乾癬、デュピュイトレン拘縮、糖尿病合併症、カポジ肉腫、および関節リウマチを含む。
【００５７】
本発明において、線維芽細胞成長因子２０Ｘ（ＦＧＦ−ＣＸ）（表１；配列番号：１を参照）と名付けられた新規線維芽細胞成長因子をコード化するヌクレオチド配列（配列番号：１）が含まれる。このコード配列は、ヒトゲノムＤＮＡ配列において同定された。開示されたＤＮＡ配列は、２１１アミノ酸残基（配列番号：２）を有すると予測されるポリペプチドをコード化する６３３塩基を有する。表１および配列番号：２において示された配列に基づくＦＧＦ−ＣＸの予測分子量は、２３４９８．４Ｄａである。
【００５８】
表１
表１は、本発明の新規ＦＧＦ−ＣＸポリヌクレオチドおよびタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号：１）および翻訳アミノ酸配列（配列番号：２）の表示である(ＣＧ５３１３５−０１または線維芽細胞成長因子ＡＢ０２０８５８としても言及される）。
【表２】

【００５９】
ＦＧＦ−ＣＸ核酸配列を、ＢＬＡＳＴＮ検索でのクエリーヌクレオチド配列として用いて、関連核酸配列を同定した。ＦＧＦ−ＣＸヌクレオチド配列は、マウス線維芽細胞成長因子９（ＦＧＦ−９）（５４３のうち３９２塩基同一、または７２％同一；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ８２０２３）およびグリア細胞活性化因子（ＧＡＰ）をコード化するヒトＤＮＡ（５５４のうち３８５塩基同一、または６９％；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｅ０５８２２、ＦＧＦ−９とも称される）に対して高類似性を有する。加えて、ＦＧＦ−ＣＸは、名称「Glia-Activating Factor And Its Production」の日本国特許番号：ＪＰ１９９３３０１８９３でNaruo等により開示されたＧＡＦ配列（配列番号：５）に対して同程度の同一性（４２４のうち３１１塩基同一、または７３％同一）を有すると判明した（表２を参照）。
【００６０】
表２
表２は、ＦＧＦ−９様グリア細胞活性化因子（ＧＡＦ）配列（配列番号：５）を有する配列番号：１の核酸配列のＢＬＡＳＴＮアラインメントである。
【表３】

【００６１】
ゲノム探索により同定されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が正しいことを示すために、ＰＣＲ増幅を用いて、予測ゲノムクローンに対応するｃＤＮＡを得た。得られた産物のヌクレオチド配列は、予測遺伝子のものと正確に一致する（実施例１を参照）。
【００６２】
表３は、ヒト染色体８の伸長ゲノムフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２０８５８）である３つの非連続セグメント（それぞれ、表３Ａ〜表３Ｃの配列番号：６〜８）を有する配列番号：１の核酸配列の相補鎖のＢＬＡＳＴＮアラインメントである。
【００６３】
表３Ａ
【表４】

【００６４】
表３Ｂ
【表５】

【００６５】
表３Ｃ
【表６】

【００６６】
ｃＤＮＡによりコード化されるタンパク質は、アフリカツメガエルのＦＧＦ−２０Ｘ（本明細書においてＸＦＧＦ−ＣＸまたはＸＦＧＦ−２０Ｘと名付ける）、ならびにヒトＦＧＦ−９およびヒトＦＧＦ−１６（それぞれ、８０％、７０％および６４％アミノ酸同一性である；表４および表５を参照）に非常に密接に関係する。ＸＦＧＦ−ＣＸとの高相同性に基づき、本発明の開示において同定された遺伝子は、そのヒトのオルソログを表すと分かり、本明細書においてＦＧＦ−ＣＸと名付けられる。
【００６７】
加えて、ＦＧＦファミリーメンバー間で保存されるアミノ酸残基は、表４および表５として表されるアラインメントにより示される様に、変化に対する影響を多少受けると予測される。例えば、本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、ＦＧＦファミリーメンバー、すなわち、ＦＧＦ−９およびＸＦＧＦ−ＣＸタンパク質、およびＦＧＦ−ＣＸ相同体中に典型的保存領域の少なくとも１つのドメインを含有し得る。従って、これらの保存ドメインは、変異の影響を受けにくいであろう。しかしながら、他のアミノ酸残基（例えば、保存されていないもの、またはＦＧＦタンパク質のメンバーのうち半分のみ保存されたもの）は、活性に対して本質的でないかもしれなく、従って変異の影響をよりうけやすいであろう。黒、グレーおよび白は、それぞれアラインメントでの同一残基、保存残基および非保存残基を表す。
【００６８】
表４
表４．本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質（配列番号：２）を有する４つの脊椎動物ＦＧＦ様タンパク質（配列番号：９〜１２）のＣｕｌｓｔａｌＷアラインメント
【表７】

【００６９】
ＦＧＦ−ＣＸを、ヒトＦＧＦ−９、ヒトＦＧＦ−１６およびアフリカツメガエルＦＧＦ−ＣＸ（それぞれ、受託番号Ｄ１４８３８、ＡＢ００９３９１およびＡＢ０１２６１５）でアラインメントした。ＣｌｕｓｔａｌＷを、表５に示す。
【００７０】
表５．他の３つのＦＧＦファミリーメンバーでのＦＧＦ−ＣＸのＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント
【表８】

【００７１】
ヒトＦＧＦ−９（配列番号：９）を有するＦＧＦ−ＣＸポリペプチド配列（配列番号：２）の最初の２０８アミノ酸のＢＬＡＳＴＰアラインメントを、表６に示す。グリア細胞活性化因子前駆体（ＧＡＦ）（線維芽細胞成長因子９）についてのＳＷＩＳＳＰＲＯＴ受託番号Ｐ３１３７１；Miyamoto et al. 1993 Mol. Cell. Biol. 13:4251-4259；およびNaruo et al. 1993 J. Biol. Chem. 268:2857-2864を参照されたい。ポジティブ残基は、整列させたときの比較配列の同一関連部位での同一アミノ酸残基（「｜」）または保存アミノ酸残基（「＋」）のいずれかである残基を含む。以下を参照されたい。
【００７２】
表６は、同一残基（「｜」）およびポジティブ残基（「＋」）を示す、ヒトＦＧＦ−９（配列番号：９）でのＦＧＦ−ＣＸポリペプチド配列（配列番号：２）のＢＬＡＳＴＰアラインメントである。
【表９】

【００７３】
マウスＦＧＦ−９（配列番号：１０）およびラットＦＧＦ−９（配列番号：１１）配列を有するＦＧＦ−ＣＸポリペプチド（配列番号：１から翻訳された配列番号：２）の最初の２０８アミノ酸のＢＬＡＳＴＸアラインメントを、それぞれ表７および表８に示す。マウスＦＧＦ−９について、グリア細胞活性化因子前駆体（ＧＡＦ）（線維芽細胞成長因子９）のＳＷＩＳＳＰＲＯＴ受託番号Ｐ５４１３０、Santos-Ocampo et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:1726-1731；および、ラットＦＧＦ−９について、グリア細胞活性化因子前駆体（ＧＡＦ）（線維芽細胞成長因子９）（ＦＧＦ−９）のＳＷＩＳＳＰＲＯＴ受託番号Ｐ３６３６４、Miyamoto, 1993 Mol. Cell. Biol. 13:4251-4259を参照。
【００７４】
表７は、同一残基（「｜」）およびポジティブ残基（「＋」）を示す、マウスＦＧＦ−９（配列番号：１０）でのＦＧＦ−ＣＸポリペプチド配列（配列番号：２）のＢＬＡＳＴＸアラインメントである。
【表１０】

【００７５】
表８は、同一残基（「｜」）およびポジティブ残基（「＋」）を示す、ラットＦＧＦ−９（配列番号：１１）でのＦＧＦ−ＣＸポリペプチド配列（配列番号：２）のＢＬＡＳＴＸアラインメントである。
【表１１】

【００７６】
表６〜９において棒（「｜」）により示された様に、全３種のＦＧＦ−９配列は、７０％の全体的配列同一性について、ＦＧＦ−ＣＸ（配列番号：２）と２０８のうち１４７残基同一を有する。加えて、２０８のうち１７０残基が、８１％のポジティブ残基の全体的パーセンテージについて、ＦＧＦ−ＣＸ（配列番号：２）の配列に対してポジティブである。
【００７７】
全長ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド（配列番号：２）をまた、アフリカツメガエルＸＦＧＦ−ＣＸ（配列番号：１２）でのＢＬＡＳＴＸにり整列させた。表９に示す様に、アフリカツメガエルＸＦＧＦ−ＣＸと比較して、ＦＧＦ−ＣＸは、２１１のうち１７０（８０％）同一残基、および２１１のうち１８９（８９％）ポジティブ残基を有する。アフリカツメガエルＸＦＧＦ−ＣＸが、プローブとして哺乳動物ＦＧＦ−９に基づくプライマーで実施した変性ＰＣＲ産物を用いる尾芽ステージで調製されたｃＤＮＡライブラリーから最近得られた。Koga et al., 1999 Biochem Biophys Res Commun 261(3):756-765を参照されたい。ＸＦＧＦ−ＣＸオープンリーディングフレームの推定２０８アミノ酸配列は、ＦＧＦファミリーのモティーフ特性を含有する。ＸＦＧＦ−ＣＸは、ＸＦＧＦ−９に対して７１．３％全体類似性を有するが、そのアミノ末端領域（３３．３％類似）においてＸＦＧＦ−９と異なる。このことは、ヒトを含む（上記参照）様々な哺乳動物ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１６配列に関して、本発明において開示される配列番号：２について見られ類似性に似ている。表４、５およいｂ７〜９を参照。
【００７８】
表９は、同一残基（「｜」）およびポジティブ残基（「＋」）を示す、アフリカツメガエルＦＧＦ−９（配列番号：１２）でのＦＧＦ−ＣＸポリペプチド配列（配列番号：２）のＢＬＡＳＴＸアラインメントである。
【表１２】

【００７９】
別のＦＧＦ−２０変異体が実施例において記載の様にクローン化され、同定された。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ解析を、２つの変異体、特にＣＧ５３１３５−０２およびＣＧ５３１３５−０６について実施した。高スコアが、本発明の線維芽細胞成長因子２０様遺伝子の配列を用いる、日付０６／１２／０１のＧｅｎＢａｎｋ合成物（ＨＴＧではない）のＢＬＡＳＴＮ検索により決定された様に、一致する。高スコアが、本発明の線維芽細胞成長因子２０様タンパク質の配列を用いるＢＬＡＳＴＰ検索（日付０６／１２／０１の非重複合成物に対する）により決定された様に、一致する。結果を、それぞれ、表１０および１１に示す。
【００８０】
表１０．ＦＧＦ−２０ＣＧ５３１３５−０２変異体のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ結果
【表１３】

【００８１】
表１１．ＦＧＦ−２０ＣＧ５３１３５−０６変異体のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ結果
【表１４】

【００８２】
表１（配列番号：２）のポリペプチド配列を、小胞体の膜およびミクロボディー（ペルオキシソーム）の膜を介する局在化について高確率を有するようにプログラムＰＲＯＳＴにより予測する。ＣＧ５３１３５−０２およびＣＧ５３１３５−０６変異体ポリペプチドを、小胞体（膜）に存在する確率０．８５００を有するように、ＰＳＯＲＴにより予測する。これに代わる実施態様において、ＣＧ５３１３５−０２およびＣＧ５３１３５−０６変異体ポリペプチドは、確率０．７９００で細胞膜、確率０．７４７８でミクロボディー（ペルオキシソーム）、または確率０．１００でミトコンドリアの内膜に位置する。ＣＧ５３１３５−０２およびＣＧ５３１３５−０６変異体ポリペプチドを、アミノ酸残基６２〜７８（６０〜８１）の間の膜貫通型ドメインである〜６．４２の可能性を有するように、ソフトウエアプログラムＩＮＴＥＧＲＡＬにより予測される。ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、タイプＩＩ(Ｎｃｔｙ Ｃｅｘｏ)膜タンパク質であると思われる。
【００８３】
加えて、それは予測された既知の切断シグナル配列をＮ末端で有さないが、タンパク質の疎水性親水性指標プロットは、ＦＧＦＧ−ＣＸが約９０〜約１１５のアミノ酸位置（配列番号：１３）で卓越した疎水性セグメントを有することを示す。この単一疎水性領域は、ＦＧＦファミリーの他のメンバーにおいて局在化シグナルとして知られている。それゆえに、配列番号：１３のアミノ酸を含むポリペプチドは、小胞体、ゴルジ膜または細胞膜のような、様々な細胞の膜を介する分泌を可能とする局在化シグナルとして有用である。ＣＧ５３１３５−０２およびＣＧ５３１３５−０６変異体タンパク質の疎水性親水性指標プロットは、２つの卓越した疎水性セグメントが約２３〜約６０のアミノ酸位置および約８２〜末端のアミノ酸位置に属することを示す。様々な実施態様において、疎水性セグメントは、ＦＧＦ−ＣＸ／ＦＧＦ−２０様タンパク質特異的抗体に対する抗原性および標的である。
【００８４】
ＦＧＦ−ＣＸは、その最も近いヒトファミリーメンバー（例えば、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１６）のいくつかについて丁度見られる様に、ＰＳＯＲＴ(Nakai, K & Kanehisa, M. (1992) Genomics 14, 897-911)およびＳＩＧＮＡＬＰ（Nielsen, et al. (1997) Protein Eng. 10, 1-6）コンピューターアルゴリズムにより予測される様に古典的アミノ末端シグナル配列を失っている。にもかかわらず、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１６の両方が、分泌される（Matsumoto-Yoshitomi, et al. (1997) Int. J. Cancer 71, 442-450; Miyake, et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Comm. 243, 148-152; Miyakawa, et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 29352-29357; Revest et al. (2000) J Biol. Chem. 275, 8083-8090）。ＦＧＦ−ＣＸも分泌されるか否かを決定するために、全長ＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコード化するｃＤＮＡを、ｐＦＧＦ−ＣＸと名付けられた哺乳類発現ベクターにサブクローン化した。ヒト胚腎臓２９３細胞がこのベクターで形質移入されると発現されるタンパク質は、培養上清において見つかり、〜２７ｋＤａのウエスタンブロットの見かけ上の分子量で（図１、実施例７）、Ｃ末端Ｖ５エピトープに対する抗体により検出されるバンドを表す。発現タンパク質の別の部分は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）との相互作用を阻害する物質での処理により２９３細胞の隔離から放出される。この方法により放出されたタンパク質はまた、同様のウェスタンブロットパターンを表す（図１）。同様に、タンパク質が対応するＩｇκシグナル配列を取り込む組換えプラスミド由来のＨＥＫ２９３細胞において発現すると、バンドは、約３４ｋＤａの見かけ上の分子量を有するウエスタンブロットにより検出される（図２、実施例５）。
【００８５】
本発明のＦＧＦ−ＣＸを含むいくつかの多種多様なＦＧＦ様タンパク質についてのＣｌｕｓｔａｌＷ多型タンパク質アラインメント（Thompson, et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680）は、図４および図５において見られる。３つの哺乳動物のタンパク質（配列番号：９〜１１）は、それぞれ非常に似ているが、本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質（配列番号：２）とかなり異なる。また、アフリカツメガエルＸＦＧＦ−ＣＸおよび配列番号：２の配列は、ＦＧＦ−９のそれより、それぞれ非常に似ている。ＦＧＦ−９分泌において関係する内部疎水ドメイン（例えば、Miyakawa, et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 29352-29357を参照）は、ＦＧＦ−９配列の残基９５〜１２０を補う。ＦＧＦ−ＣＸの疎水性親水性指標プロットを測定するソフトウエアは、当分野においてよく知られており、例えば、Kyte Doolittle、および以下にさらに記載するたのアルゴリズムを含む。
【００８６】
ＸＦＧＦ−２０およびアフリカツメガエルＦＧＦ−９の発現は、それぞれ異なる。ＸＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡは、２倍体細胞、胞胚ステージの胚および胞胚ステージ後の胚において、および大人の胃および精巣において特異的に発現する；ＸＦＧＦ−９ ｍＲＮＡは、卵および多くの大人組織において母系性に発現する。上述のKoga et alを参照。原腸形成でのＸＦＧＦ−ＣＸの正しい発現は、Xenopus laevisnの正常頭構造の形成に必要えあることは明らかである。ＸＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡが初期胚において発現したら、原腸形成が異常であり、前構造の発生が抑制されたものである。上述のKoga et alを参照。かかる胚において、精巣でのＸｂｒａ転写発現は、原腸形成において抑制され、このことはＸｂｒａ遺伝子の発現がＸＦＧＦ−ＣＸエフェクターを調節することを示す。上述のKoga et al.,を参照されたい。
【００８７】
増殖組織（例えば、卵、精巣、胃、および母カエルの多型組織を含む）での関連ＸＦＧＦ−９ポリペプチドの発現パターンは、機能器官の生成を正常に行う組織の維持でのＸＦＧＦ−２０の役割を示す。
【００８８】
ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡは正常小脳、ならびに肺、胃および大腸の腺癌を含むいくつかのヒト腫瘍細胞株において発現するが、対応する正常組織において発現しないことを、実施例８において示す。正常肺、胃および大腸でのＦＧＦ−ＣＸ発現を欠くこと、およびこれらの組織由来の腫瘍細胞株でのその存在は、これらの癌細胞株が適当でない種類のＦＧＦ−ＣＸを明らかに過剰発現することを示す。ＦＧＦ−ＣＸが位置する染色体領域は、結腸直腸、肺および胃腺癌において普通に変化する（Emi, et al. (1992) Cancer Res. 52, 5368-5372; Baffa, et al. (2000) Clin. Cancer Res. 6, 1372-1377）。これらの細胞中のＦＧＦ−ＣＸ促進オートクリン成長ループの構築が、それらの腫瘍化変換の開始および／または引き続く増殖の原因となることは可能である。このシナリオは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞でのＦＧＦ−ＣＸ促進オートクリンループの生成が腫瘍化潜在性を活性化するという発見により支持される（実施例１１を参照）。腫瘍細胞によるＦＧＦ−ＣＸ分泌はストローマ細胞上のパラクリン作用を経由するインビボでの成長を刺激することも可能とする。
【００８９】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞での異種性ＦＧＦ−ＣＸの発現は、それらの形質転換および腫瘍形成を誘導することが分かる（実施例１１参照）。これらの作用は、天然のＦＧＦ−ＣＸ（構築物ｐＦＧＦ−ＣＸ）およびアミノ末端の異種性Ｉｇκシグナル配列（構築物ｐＩｇκ−ＦＧＦ−ＣＸ）で発現させたＦＧＦ−ＣＸの両方により仲介される。しかしながら、より高いインビトロでの形質転換能力（データは示されていない）およびインビボでの腫瘍形成（図８）により証明される様に、ｐＩｇκ−ＦＧＦ−ＣＸがｐＦＧＦ−ＣＸより、発癌遺伝子的により高く活性であることは気付かれなければならない。ｐＦＧＦ−ＣＸに比べｐＩｇκ−ＦＧＦ−ＣＸの優れた発癌能は、ｐＩｇκ−ＦＧＦ−ＣＸが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてｐＦＧＦ−ＣＸより有意に多い分泌ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を産生する事実に起因するようである（図１Ｂ）。
【００９０】
ＦＧＦ−ＣＸの様に、他のＦＧＦは、異所性発現に従い、細胞を形質転換することがわかった。かつ、ある場合において、ＦＧＦ−ＣＸシグナル伝達の遮断が、細胞の形質転換を抑制することが分かった（Matsumoto-Yoshitomi, et al. (1997) Int. J. Cancer 71, 442-450; Li, et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14, 7660-7669を参照）。
【００９１】
本明細書において記載するＦＧＦ−ＣＸの発現、ならびに関連ＦＧＦタンパク質について見られるエフェクターとの類似性に基づき、ＦＧＦ−ＣＸがヒト悪性腫瘍において重要な働きをすると信じられている。これらの理由のため、本明細書において開示されるＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、核酸および抗体は、これらの組成物の存在または量を診断する方法、ＦＧＦ−ＣＸ関連病態に関係する治療物質のスクリーニングおよび同定、および様々な種類の悪性腫瘍の処置方法において有用である。
【００９２】
ＦＧＦ−ＣＸ核酸
本発明の核酸は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはＦＧＦ−ＣＸ様タンパク質のコード化物を含む。これらの間で、核酸は、配列が表１および配列番号：１において提供される核酸、またはそれらのフラグメントである。ＦＧＦ−ＣＸ核酸は、ゲノムＦＧＦ−ＣＸ核酸のヌクレオチド配列、またはｃＤＮＡのヌクレオチド配列を有することができる。加えて、本発明は配列番号：１の突然変異体または変異体核酸、またはそれらのフラグメントを含み、任意の塩基が、表１において示される対応する塩基から変更され得る一方で、そのＦＧＦ−ＣＸ様活性および生理機能を維持するタンパク質を依然としてコード化する。本発明は、フラグメント、誘導体、類似体およびそれらの相同体を含む、配列番号：１の核酸の相補的配列をさらに含む。ＦＧＦ−ＣＸの部分の相補鎖の実施例を、表３において示す。本発明は、加えて、構造が化学的修飾を含む核酸または核酸フラグメント、またはそれらの相補的配列を含む。
【００９３】
本発明の１つの態様は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分をコード化する単離核酸分子に関する。ＦＧＦ−ＣＸコード化核酸（例えば、ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いるのに十分な核酸フラグメント、および増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして用いられるフラグメントまたはＦＧＦ−ＣＸ核酸分子の変異体も含まれる。本明細書いおいて用いる用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、および誘導体、フラグメントおよびそれらの相同体を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００９４】
「プローブ」は、可変長の核酸配列、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、使用に依存する約６，０００ｎｔと同数の核酸配列について言及する。プローブは、同一、類似、または相補的核酸配列の検出において使用される。天然供給源または組換え供給源から普通に得られるより長いプローブは、オリゴマーより非常に特異的にハイブリダイズし、ずっとゆっくりハイブリダイズする。プローブは、一本鎖または二本鎖であることができ、ＰＣＲ、膜ベースのハイブリダイゼーションテクノロジー、またはＥＬＩＳＡ様テクノロジーにおいて特異性を有するようにデザインされ得る。
【００９５】
「単離」核酸分子は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。単離核酸分子の実施例は、制限されることなく、ベクターに含有される組換えＤＮＡ分子、異種性宿主細胞中で維持される組換えＤＮＡ分子、部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含む。好ましくは、「単離」核酸は、核酸がもたらされる生物のゲノムＤＮＡ中の天然の隣接核酸（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）である遊離配列である。例えば、様々な実施態様において、単離ＦＧＦ−ＣＸ核酸分子は、核酸がもたらされる細胞のゲノムＤＮＡ中の天然の隣接核酸分子である約５０ｋｂ、２５ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有できる。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、組換え技術により産生された場合の他の細胞の物質または培養上清、または化学的に合成された場合の化学物質前駆体または他の化学物質の実質的な遊離物であり得る。
【００９６】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号：１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこのヌクレオチド配列のいずれかの相補的配列は、標準分子生物学的技術および本明細書において提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号：１の核酸配列の全てまたは一部を用いて、ＦＧＦ−ＣＸ核酸配列は、標準ハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を使用して単離され得る（例えば、Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989;および Ausubel, et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993に記載される）。
【００９７】
本発明の核酸は、鋳型および適切なオリゴヌクレオチドプライマーとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、代わりにゲノムＤＮＡを用いて、標準ＰＣＲ増幅技術により増幅され得る。増幅された核酸は、適切なベクターにクローン化され、ＤＮＡ配列解析により特徴付けられることができる。さらに、ＦＧＦ−ＣＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準合成技術、例えば、自動ＤＮＡ合成機により準備されることができる。
【００９８】
本明細書において用いる様に、用語「オリゴヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドがＰＣＲ反応に用いられるために十分な数のヌクレオチド塩基を有する連鎖ヌクレオチドのシリーズに言及する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づくか、またはそれからデザインされ、特定の細胞または組織中の同一、類似または相補的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅、確認、または明らかにするために用いられる。オリゴヌクレオチドは、長さ約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔ、好ましくは長さ約１５ｎｔから３０ｎｔを有する核酸配列の一部を含む。１つの実施態様において、長さ１００ｎｔ未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号：１の少なくとも６連続ヌクレオチド、またはそれらの相補的配列をさらに含む。
【００９９】
別の実施態様において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：１において示されるヌクレオチド配列の相補的配列である核酸分子を含む。別の実施態様において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：１において示されるヌクレオチド配列の相補的配列である核酸分子、またはこのヌクレオチド配列の一部を含む。配列番号：１において示されるヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、配列番号：１に示されるヌクレオチド配列にほとんどミスマッチなしでまたは全くミスマッチなしで水素結合し、それにより安定二本鎖を形成する配列番号：１において示されるヌクレオチド配列に十分に相補的なものである。
【０１００】
本明細書において使用する、用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のWatson-Crick型塩基対またはHoogsteen型塩基対に言及し、用語「結合」は、２つのポリペプチドまたは化合物または関連ポリペプチドまたは化合物、またはそれらの組合せの物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン結合、非イオン結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用等を含む。物理的相互作用は、直接的または非直接的のいずれかであり得る。非直接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物の作用を介したものであるか、またはそれに起因したものである。直接的結合は、別のポリペプチドまたは化合物の作用を介しては生じないか、またはそれに起因しない相互作用に言及するが、それよりむしろ他の実質的な化学中間体なしである。
【０１０１】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号：１の核酸配列の一部のみ、例えば、プローブまたはプライマーとして用いられ得るフラグメント、またはＦＧＦ−ＣＸの生物学的に活性な部分をコード化するフラグメントを含み得る。本明細書において提供されるフラグメントは、核酸の少なくとも６（隣接）核酸または少なくとも４（隣接）アミノ酸の配列として、それぞれ核酸の場合の特異的ハイブリダイゼーション、またはアミノ酸の場合のエピトープの特異的認識を可能とするのに十分な長さを定義し、多くても全長配列より短い部分である。フラグメントは、核酸またはアミノ酸配列の任意の隣接部分の選択に由来する。誘導体は、直接的、修飾、部分的な置換のいずれかにより天然の化合物から形成された核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、天然の化合物に類似だが同一でない構造を有するが、ある成分または側鎖に関してそれと異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、合成であるか、または異なる進化起源由来であり得るし、かつ野生型と比較し類似または逆の代謝活性を有し得る。
【０１０２】
誘導体および類似体は、誘導体または類似体が以下に記載する様に修飾核酸またはアミノ酸を含有する場合、全長または全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体または類似体は、限定されることなく、様々な実施態様において、同一サイズの核酸またはアミノ酸の少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％と同一性（好ましくは８０〜９９％の同一性を有する）により、またはアラインメントが当分野において既知のコンピューター相同プログラムによりなされる整列配列に比較した場合、本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同な領域を含む分子、または厳密、中厳密、または低厳密条件下で上述のタンパク質をコード化する配列の相補的配列にハイブリダイズする能力があるそのコード化核酸を含む。例えば、Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993、および以下を参照されたい。例示的プログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI）は、Smith−Watermanのアルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2: 482-489、ここで全体を参考文献により本明細書に取り込まれる）を使用するデフォルト設定を用いるＧａｐプログラムである。
【０１０３】
「相同核酸配列」または「相同アミノ酸配列」、またはそれらの誘導体は、上述した様にヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性により特徴付けられる配列に言及する。相同ヌクレオチド配列は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのアイソフォームをコードするこれらの配列をコード化する。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同一生物の異なる組織において発現し得る。または、アイソフォームは、異なる遺伝子によりコード化され得る。本発明において、相同ヌクレオチド配列は、限定されることなく、哺乳動物、従って例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物を含む得るヒト以外の種のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む。相同ヌクレオチド配列はまた、制限されることなく、本明細書において設定されるヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子バリエーションおよび変異を含む。しかしながら、相同ヌクレオチド配列は、ヒトＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含まない。相同核酸配列は、配列番号：２の保存的アミノ酸置換（以下を参照）、ならびにＦＧＦ−ＣＸ活性を有するポリペプチドをコード化するそれらの核酸配列を含む。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の生物学的活性は、以下に記載される。相同アミノ酸配列は、ヒトＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのアミノ酸配列をコード化しない。
【０１０４】
ヒトＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他の細胞タイプ、例えば、他の組織由来のＦＧＦ−ＣＸ相同体、ならびに他の哺乳動物由来のＦＧＦ−ＣＸ相同体の同定および／またはクローニングにおいて使用するためにデザインされるプローブおよびプライマーの生成を可能とする。プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを典型的に含む。オリゴヌクレオチドは、配列番号：１の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００またはそれ以上の連続センス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号：１のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号：１の天然に存在する突然変異体に厳密な条件下でハイブリダイズするヌクレオチドの領域を典型的に含む。
【０１０５】
ヒトＦＧＦ−ＣＸヌクレオチド配列に基づくプローブを用いて、転写物、または同一タンパク質または相同タンパク質をコード化するゲノム配列を検出できる。様々な実施態様において、プローブは、それらに結合する標識群、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補助因子であり得るラベル群をさらに含む。かかるプローブを、対象由来の細胞試料中のＦＧＦ−ＣＸコード化核酸のレベルを測定すること、例えば、ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡレベルを測定すること、またはゲノムＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を突然変異したか、または欠損するか否かを決定することにより、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を異所性発現する細胞または組織の同定のための診断試験キットの一部として用いることができる。
【０１０６】
「ＦＧＦ−ＣＸの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、用量依存性であるまたは依存性でない特定の生物学的アッセイにおいて測定される様に、成熟型を含む本発明のポリペプチドの活性に類似だが同一である必要のない活性を表すポリペプチドに言及する。「ＦＧＦ−ＣＸの生物学的に活性な部分」をコード化する核酸フラグメントを、ＦＧＦ−ＣＸの生物学的活性（ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の生物学的な活性は、以下に記載する）を有する、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質のコード化部分を発現する（例えば、インビトロでの組換え発現により）、およびＦＧＦ−ＣＸのコード化部分の活性を評価するポリペプチドをコード化する配列番号：１の一部を単離することにより調製されることができる。例えば、ＦＧＦ−ＣＸの生物学的に活性な部分をコード化する核酸フラグメントは、ＡＴＰ結合ドメインを任意で含むことができる。別の実施態様において、ＦＧＦ−ＣＸの生物学的に活性な部分をコード化する核酸フラグメントは、１またはそれ以上の領域を含む。
【０１０７】
ＦＧＦ−ＣＸ変異体
本発明は、遺伝子コードの縮重に起因する図１において示されるヌクレオチド配列と異なる核酸分子をさらに包含する。従って、これらの核酸は、配列番号：１において示されるヌクレオチド配列によりコード化されるものの様に同一ＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコード化する。別の実施態様において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：２において示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を有する。
【０１０８】
配列番号：１において示されるヒトＦＧＦ−ＣＸヌクレオチド配列に加えて、ＦＧＦ−ＣＸのアミノ酸配列の変化を導くＤＮＡ配列多型は、集団内（例えば、ヒト集団）に存在し得ることは、当業者により認識されるであろう。ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のかかる遺伝子多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して集団内の個体間で存在し得る。本明細書において使用する、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、好ましくは哺乳動物ＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコード化するオープンリーディングフレームを含む核酸分子に言及する。かかる天然の対立遺伝子のバリエーションは、典型的に、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のヌクレオチド配列の１〜５％バリエーションとなり得る。かかるヌクレオチドバリエーションのいずれかおよび全ては、天然の対立遺伝子バリエーションの結果物であり、かつＦＧＦ−ＣＸの機能活性を変化させないＦＧＦ−ＣＸ中の結果として生じるアミノ酸多型性は、本発明の範囲内にあることを意図される。
【０１０９】
さらに、他の種由来のＦＧＦ−ＣＸたんぱく質をコード化する核酸分子、およびゆえに配列番号：１のヒト配列と異なるヌクレオチド配列を有する核酸は、本発明の範囲内であることを意図される。天然の対立遺伝子変異体に対応する核酸分子および本発明のＦＧＦ−ＣＸｃＤＮＡの相同体は、本明細書において開示されるヒトＦＧＦ−ＣＸ核酸に対する相同性に基づき、厳密なハイブリダイゼーション条件下の標準ハイブリダイゼーション技術によるハイブリダイゼーションプローブとして、ヒトｃＤＮＡ、またはそれらの一部を用いて単離され得る。例えば、可溶性ヒトＦＧＦ−ＣＸｃＤＮＡは、ヒト膜結合ＦＧＦ−ＣＸに対する相同性に基づき単離され得る。同じく、膜結合ヒトＦＧＦ−ＣＸｃＤＮＡは、可溶性ヒトＦＧＦ−ＣＸに対する相同性に基づき単離され得る。
【０１１０】
または、別の実施態様において、本発明の単離核酸分子は、少なくとも長さ６ヌクレオチドであり、配列番号：１のヌクレオチド配列を含む核酸分子に厳密な条件下でハイブリダイズする。別の実施態様において、核酸は、少なくとも長さ１０、２５、５０、１００、２５０、５００または７５０ヌクレオチドである。別の実施態様において、本発明の単離核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書において用いられる様に、用語「厳密な条件下でハイブリダイズする」は、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が、典型的に互いにハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載することを意図される。
【０１１１】
相同体（すなわち、ヒト以外の種由来のＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコード化する核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ）は、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングの当分野においてよく知られた方法を用いるプローブとして、特定のヒト配列の全部または一部との低厳密、中程度厳密、または高厳密なハイブリダイゼーションにより得られることができる。
【０１１２】
本明細書において用いられる様に、語句「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件に言及する。厳密な条件は、配列依存性であり、違った状況で異なるものである。長い配列は、短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般的に、厳密な条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで特異的な配列の温熱性融解温度（Ｔｍ）より約５度低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（定義されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下）。標的配列は、一般に過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占められる。典型的に、厳密な条件は、塩濃度が約１．０Ｍのナトリウムイオン未満であり、典型的にはｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）、および温度は短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）のために少なくとも約３０℃であり、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドのために少なくとも約６０℃である。厳密な条件は、ホルムアミドの様な不安定試薬の添加でも成し遂げられ得る。
【０１１３】
上述したような厳密な条件は、当業者にとって既知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.16.3.6において見られる。好ましくは、条件は、互いに少なくとも約６５％、７０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％相同である配列が、典型的に互いに結合したままである様な条件である。厳密な条件の非制限の実施例は、６５℃で６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩バッファー中でのハイブリダイゼーションである。このハイブリダイゼーションは、５０℃で０．２×ＳＳＣ、０．０１％ＢＳＡ中での１回またはそれ以上の洗浄が続く。配列番号：１の配列に厳密な条件下でハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書において用いられる様に、「天然に存在する」核酸分子は、天然において生じるヌクレオチド配列（例えば、天然のタンパク質をコード化する）を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子に言及する。
【０１１４】
相同体（すなわち、ヒト以外の種由来のＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコード化する核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ）は、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングの当分野においてよく知られた方法を用いるプローブとして、特定のヒト配列の全部または一部との低厳密、中程度厳密、高厳密なハイブリダイゼーションにより得られる。
【０１１５】
第２の実施態様において、配列番号：１のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはフラグメント、それらの類似体または誘導体に中程度厳密な条件下でハイブリダイズすることが可能である核酸配列が提供される。中程度厳密なハイブリダイゼーション条件の非制限の実施例は、５５℃で６×ＳＳＣ、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーションであり、３７℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回またはそれ以上の洗浄が続く。用いられ得る中程度厳密な他の条件は、当分野においてよく知られている。例えば、Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, and Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYを参照されたい。
【０１１６】
第３の実施態様において、配列番号：１のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはフラグメント、それらの類似体または誘導体に低厳密な条件下でハイブリダイゼーションする核酸が提供される。低厳密なハイブリダイゼーション条件の非制限の実施例は、４０℃で３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（wt/vol）デキストラン硫酸中でのハイブリダイゼーション、５０℃で２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳ中での１回またはそれ以上の洗浄が続く。用いられ得る低厳密な他の条件は、当分野においてよく知られている（例えば、異種間ハイブリダイゼーションに用いられる様に）。例えば、Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY、およびKriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Shilo and Weinberg, 1981, Proc Natl Acad Sci USA 78: 67896792を参照されたい。
【０１１７】
保存的変異体
集団中に存在し得るＦＧＦ−ＣＸ配列の天然に生じる対立遺伝子変異体に加えて、当業者は、変更が配列番号：１のヌクレオチド内への変異により誘導され得ること、それによりＦＧＦ−ＣＸタンパク質の機能的能力を変えることなくコード化ＦＧＦ−ＣＸタンパク質のアミノ酸配列の変更を導き得ることをさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換は、配列番号：１の配列において起こり得る。「非必須」アミノ酸残基は、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を必要とするのに、生物学的活性を変えることなくＦＧＦ−ＣＸの野生型配列から変更され得る残基である。例えば、本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質間で保存されるアミノ酸残基は、変更に特に従わないものであると予測される。
【０１１８】
本発明の別の態様は、活性に必須でないアミノ酸残基での変化を含有するＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコード化する核酸分子に関する。かかるＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、配列番号：２由来のアミノ酸配列において異なり、生物学的活性は依然保持している。１つの実施態様において、単離核酸分子は、タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含み、該タンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸によりコード化されるタンパク質は、配列番号：２に少なくとも約８０％相同であり、さらに好ましくは、配列番号：２に少なくとも約９０％、９５％、９８％、および最も好ましくは少なくとも約９９％相同である。
【０１１９】
配列番号：２のタンパク質に対するＦＧＦ−ＣＸタンパク質相同体をコード化する単離核酸分子は、１またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠損がコード化タンパク質に誘導される様な１またはそれ以上のヌクレオチド置換、配列番号：１のヌクレオチド配列への付加または欠損を導入することにより生成され得る。
【０１２０】
変異は、部位指向変異誘発およびＰＣＲ仲介変異誘発のような標準技術により配列番号：１に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１またはそれ以上の予測非必須アミノ酸残基でもたらされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で取って代わられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野において定義されてきた。あるアミノ酸は、１より多い分類特性を伴う側鎖を有する。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、チロシン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。従って、成長因子中の予測非必須アミノ酸残基は、同一の側鎖ファミリーから別のアミノ酸残基で取って代わる。または、別の実施態様において、変異は、飽和変異誘発によるような成長因子コード化配列の全部または一部に沿って、ランダムに導入され、結果として生じる変異は、成長因子の生物学的活性をスクリーニングして、活性を保持する変異を同定することができる。配列番号：１および３の変異誘発に続くコード化タンパク質を、当分野において既知の任意の組換え技術により発現させることができ、かつタンパク質の活性は決定され得る。
【０１２１】
別の重要な実施態様において、変異ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、（１）タンパク質を形成する能力：タンパク質が他のＦＧＦ−ＣＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、またはそれらの生物学的に活性な部分と相互作用する、（２）変異ＦＧＦ−ＣＸタンパク質とＦＧＦ−ＣＸ受容体との複合体形成；（３）変異ＦＧＦ−ＣＸタンパク質が細胞内標的タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）；または（４）抗ＦＧＦ−ＣＸタンパク質抗体に特異的に結合する能力についてアッセイされ得る。
【０１２２】
アンチセンス
本発明の別の態様は、配列番号：１のヌクレオチドを含む核酸分子、またはフラグメント、それらの類似体または誘導体にハイブリダイズ可能であるか、または相補的配列である単離アンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコード化する「センス」核酸に相補的配列、例えば、二本鎖ｃＤＮＡのコード鎖に相補的配列、またはｍＲＮＡに相補的な配列であるヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、アンチセンス核酸分子は、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドまたは全ＦＧＦ−ＣＸコード鎖、またはそれら部分のみに対する相補的配列を含むものを提供する。配列番号：２のＦＧＦ−ＣＸタンパク質のフラグメント、相同体、誘導体および類似体をコード化する核酸分子、または配列番号：１のＦＧＦ−ＣＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸は、さらに提供される。
【０１２３】
１つの実施態様において、アンチセンス核酸分子は、ＦＧＦ−ＣＸをコード化するヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対するアンチセンスである。用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域（例えば、配列番号：２に対応するヒトＦＧＦ−ＣＸのタンパク質コード領域）に言及する。別の実施態様において、アンチセンス核酸分子は、ＦＧＦ−ＣＸをコード化するヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないコード領域に隣接する５’および３’配列（すなわち、５’および３’非翻訳領域にも言及する）に言及する。
【０１２４】
本明細書において開示されるＦＧＦ−ＣＸ（例えば、配列番号：１）をコード化するコード鎖配列を与えられ、本発明のアンチセンス核酸は、Watson and Crick型塩基対またはHoogsteen型塩基対のルールによりデザインされ得る。アンチセンス核酸分子は、ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、さらに好ましくは、ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に対して相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当分野において既知の方法を用いる化学合成または酵素ライゲーションを使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に生じるオリゴヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増大するためにデザインされたまたはアンチセンスとセンス核酸間で形成される二本鎖の物理的安定性を増大するために様々に修飾されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る。例えば、ホスホロチオネート誘導体およびヌクレオチドを置換されたアクリジンが用いられ得る。
【０１２５】
アンチセンス核酸を生成するために用いられ得る修飾ヌクレオチドの実施例は以下を含む：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシ水酸化メチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルエクノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルエクオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキヨシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。または、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンスの向きでサブクローンされた発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入核酸から転写されたＲＮＡは、該標的核酸に対するアンチセンス向きのものであり、以下の節においてさらに記載される）。
【０１２６】
本発明のアンチセンス核酸は、細胞のｍＲＮＡおよび／またはＦＧＦ−ＣＸをコード化するゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、または結合し、それによりタンパク質の発現を阻害、例えば転写および／または翻訳を阻害することにより対象に典型的に投与されるか、または組織内で生成される。ハイブリダイゼーションは、安定二本鎖を形成するための通常のヌクレオチド相補的配列によるものであり、または、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合において、二本鎖ヘリックスの大溝での特異的相互作用を介するものであり得る。本発明のアンチセンス核酸の投与経路の実施例は、組織部位での直接注入を含む。または、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするために修飾され、次に全身性に投与され得る。例えば、全身性投与のため、アンチセンス分子は、選択された細胞表面上で発現する受容体または抗原に特異的に結合するように、例えば、細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に対するアンチセンス核酸分子に結合することにより修飾され得る。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載するベクターを用いる細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が、強力なｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれるベクター構築物が好ましい。
【０１２７】
さらに別の実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、普通のβ−ユニットと反対で、鎖が互いに平行に走る相補的ＲＮＡとハイブリダイズする特異的な二本鎖を形成する(Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: 66256641)。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: 61316148)またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(Inoue et al. (1987) FEBS Lett 215: 327330)を含み得る。
【０１２８】
リボザイムおよびＰＮＡ部分
かかる修飾は、実施例に限定されることなく、修飾塩基、および糖リン酸主鎖が修飾されるかまたは誘導される核酸を含む。これらの修飾は、例えば、対象での治療応用において核酸に結合するアンチセンスとして用いられ得るように、修飾された核酸の化学的安定性を増大するために少なくとも一部実行される。
【０１２９】
さらに別の実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムである。リボザイムは、相補的領域を有するｍＲＮＡの様な一本鎖核酸を切断する能力のあるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイムは（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585591において記載される）を用いて、ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによりＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ＦＧＦ−ＣＸコード化核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書において開示されるＦＧＦ−ＣＸＤＮＡ（すなわち、配列番号：１）のヌクレオチド配列に基づいてデザインされ得る。例えば、テトラヒメナＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体は、活性化部位のヌクレオチド配列が、ＦＧＦ−ＣＸコード化ｍＲＮＡにおいて切断されるべきヌクレオチド配列に相補的配列であものに構築され得る。例えば、Cech等の米国特許番号４，９８７，０７１；およびCech等の米国特許番号５，１１６，７４２を参照されたい。または、ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼを有する触媒性ＲＮＡを選択することができる。Bartel et al., (1993) Science 261:14111418を参照されたい。
【０１３０】
代わりに、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現は、ＦＧＦ−ＣＸの制御領域（例えば、ＦＧＦ−ＣＸプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることにより阻害されて、標的細胞中のＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の転写を妨げる３重ヘリックス構造を形成し得る。Helene. (1991) Anticancer Drug Des. 6: 56984; Helene. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:2736；およびMaher (1992) Bioassays 14: 80715を一般に参照。
【０１３１】
様々な実施態様において、ＦＧＦ−ＣＸの核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸主鎖で修飾され、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または可溶性を改善され得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸主鎖は、修飾されて、ペプチド核酸を生成し得る（Hyrup et al. (1996) Bioorg Med Chem 4: 523を参照）。本明細書において用いられる様に、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸主鎖が擬ペプチド主鎖により取って代わられ、４つの元々の核酸塩基のみ保持する核酸ミメティクス、例えば、ＤＮＡミメティクスに言及する。ＰＮＡの天然の主鎖は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的なハイブリダイゼーションを可能とすると見られてきた。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Hyrup et al. (1996) above; PerryO'Keefe et al. (1996) PNAS 93: 14670675に記載される様に、標準固相ペプチド合成プロトコールを用いて実行され得る。
【０１３２】
ＦＧＦ−ＣＸのＰＮＡは、治療応用および診断応用において用いられ得る。例えば、ＰＮＡは、遺伝子発現の配列特異的調節のためアンチセンスまたは抗原物質として、転写または翻訳の抑止を誘導、または複製を阻害することにより、用いられ得る。ＦＧＦ−ＣＸのＰＮＡは、例えば、遺伝子の単一塩基対変異の解析において、例えば、ＰＮＡ指向性ＰＣＲｃｌａｍｐｉｎｇ法より；他の酵素との組合せにおいて用いられる場合の人工制限酵素、例えば、ＳＩヌクレアーゼ（上述のHyrup B. (1996)）として；またはＤＮＡ配列決定およびハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマー（上述のHyrup et al. (1996)；上述のPerry−O'Keefe (1996)）としても用いられ得る。
【０１３３】
別の実施態様において、ＦＧＦ−ＣＸのＰＮＡは、親油性またはＰＮＡに対する他のヘルパー群と関連することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成により、または当分野において既知の薬輸送のリボソームまたは他の技術の使用により例えば、安定性または細胞の取り込みを増強するために修飾され得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得るものを生成され得る。かかるキメラは、ＤＮＡ認識酵素、例えば、ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ部分と相互作用することを可能とする一方で、ＰＮＡ部分は高結合親和性および特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基間の多くの結合、および向きの点で選択される適当な長さのリンカーを用いて結びつき得る（上述のHyrup (1996)）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、上述のHyrup (1996)およびFinn et al. (1996) Nucl Acids Res 24: 335763に記載される様に実行されることができる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準ホスホラミダイトカップリング化学反応、およびモディファイされたヌクレオシド類似体、例えば、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間で用いられ得る５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホラミダイトを用いて固体支持上で合成され得る（Mag et al. (1989) Nucl Acid Res 17: 597388）。ＰＮＡモノマーは次に、段階的な方法でカップリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を産生する（上述のFinn et al. (1996)）または、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントと共に合成され得る。Petersen et al. (1975) Bioorg Med Chem Lett 5: 111911124を参照されたい。
【０１３４】
他の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ペプチドの様な他の添加群（例えば、インビボにおいて宿主細胞受容体を標的とする）、または細胞膜を介する輸送を促進する物質（例えば、Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:65536556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648652; ＰＣＴ公開番号Ｗ０８８／０９８１０を参照）、または血管脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号Ｗ０８９／１０１３４を参照）を含み得る。加えて、オリゴヌクレオチドは、切断を引き起こすハイブリダイゼーション試薬（例えば、Krol et al., 1988, BioTechniques 6:958976を参照）または介在試薬（例えば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539549を参照）でモディファイされ得る。最後に、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、クロスリンクを引き起こすハイブリダイゼーション試薬、輸送物質、切断を引き起こすハイブリダイゼーション試薬等と共役し得る。
【０１３５】
ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド
本発明の新規タンパク質は、表１（配列番号：２）において提供される配列のＦＧＦ−ＣＸ様タンパク質を含む。本発明はまた、表１において示される対応する残基から任意の残基が変更され得る一方、ＦＧＦ−ＣＸ様活性化および生理学的機能を維持するタンパク質、またはそれらの機能的なフラグメントを依然コード化する突然変異体または変異体タンパク質を含む。突然変異体または変異体タンパク質において、残基の２０％以下またはそれより多くが、そのように変更され得る。
【０１３６】
一般に、ＦＧＦ−ＣＸ様機能を維持するＦＧＦ−ＣＸ様変異体は、配列の特定の位置の残基が、他のアミノ酸により置換された任意の変異体を含み、および別の残基または該タンパク質の２残基間の残基を挿入する可能性、ならびに該配列由来の１またはそれ以上の残基を欠く可能性をさらに含む。任意のアミノ酸置換、挿入、または欠損が本発明により包含される。好ましい場合において、置換は上で定義されたように保存的置換である。さらに、本発明の範囲を制限することなく、表１２の以下の位置（配列番号：２において提供される番号付けを用いる）が、突然変異体または変異体タンパク質が１またはそれ以上の指示された置換の１つを含み得るように指示された様に置換され得る。示された置換は、与えられた位置でおこり得る可能な置換の範囲を制限しない。
【０１３７】
表１２
【表１５】

【０１３８】
表１２の続き
【表１６】

【０１３９】
本発明の１つの態様は、単離ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、およびそれらの生物学的に活性な部分、または誘導体、フラグメント、それらの類似体または相同体に関する。抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体を生じる免疫原としての使用に適したポリペプチドフラグメントもさらに提供される。１つの実施態様において、天然のＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、標準タンパク質精製技術を用いる適当な精製スキームにより細胞または組織供給源から単離されることができる。別の実施態様において、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により産生される。組換え発現の代わりに、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはポリペプチドは、標準ペプチド合成技術を用いて化学的に合成され得る。
【０１４０】
「単離」または「精製」タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分は、細胞の物質またはＦＧＦ−ＣＸタンパク質がもたらされる細胞または組織供給源由来のタンパク質の混入が実質的にない、または化学的前駆体または化学的に合成される場合の他の化学物質が実質的にない。用語「細胞の物質が実質的にない」は、タンパク質は単離または組替え的に産生されるもの由来の細胞の細胞成分から分離されるＦＧＦ−ＣＸタンパク質の標本を含む。１つの実施態様において、用語「細胞の物質が実質的にない」は、非ＦＧＦ−ＣＸタンパク質（「混入するタンパク質」として本明細書においても言及される）の約３０％（乾燥重量による）未満、より好ましくは、非ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の薬２０％未満、さらに好ましくは、非ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の約１０％未満、そしてさらに好ましくは非ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の約５％未満を有するＦＧＦ−ＣＸタンパク質の標本を含む。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分が組変え的に産生される場合、好ましくは培養上清が実質的にない、すなわち、培養液が約２０％未満、さらに好ましくは、約１０％未満、そして最も好ましくはタンパク質標本の用量の約５％未満を意味する。
【０１４１】
用語「化学的前駆体または他の化学物質が実質的にない」は、タンパク質が化学的前駆体またはタンパク質の合成において関与する他の化学物質から分離されるＦＧＦ−ＣＸタンパク質の標本を含む。１つの実施態様において、用語「化学的前駆体または他の化学物質が実質的にない」は、化学的前駆体または非ＦＧＦ−ＣＸ化学物質の約３０％（乾燥重量による）未満、さらに好ましくは、化学的前駆体または非ＦＧＦ−ＣＸ化学物質の約２０％未満、なおさらに好ましくは、化学的前駆体または非ＦＧＦ−ＣＸ化学物質の約１０％未満、そして最も好ましくは、化学的前駆体または非ＦＧＦ−ＣＸ化学物質の約５％未満を有するＦＧＦ−ＣＸタンパク質の標本を含む。
【０１４２】
ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列またはＦＧＦ−ＣＸタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列、例えば、全長ＦＧＦ−ＣＸタンパク質より少ないアミノ酸を含む配列番号：２において示されるアミノ酸配列を含むペプチドを含み、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の少なくとも１つの活性を表す。典型的に、生物学的に活性な部分は、少なくとも１つのＦＧＦ−ＣＸタンパク質の活性を有するドメインまたはモティーフを含む。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さ１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸であるポリペプチドであり得る。
【０１４３】
本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、ＦＧＦファミリータンパク質間で実質的に保存された上で同定されたドメインの少なくとも１つを含有し得る。さらに、タンパク質の他の領域を欠いている他の生物学的に活性な部分は、組換え技術により調製され、かつ天然のＦＧＦ−ＣＸタンパク質の１またはそれ以上の機能的活性化を評価し得る。
【０１４４】
１つの実施態様において、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、配列番号：２においれ示されるアミノ酸配列を有する。他の実施態様において、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、配列番号：２に実質的に相同であり、配列番号：２のタンパク質の機能的活性化を保持し、以下に詳細に記載する様に、天然の対立遺伝子バリエーションまたは変異誘発に起因するアミノ酸配列において依然異なる。他の実施態様によると、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも４５％相同なアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：２のＦＧＦ−ＣＸタンパク質の機能的活性を保持するタンパク質である。別の実施態様において、ＦＧＦ−ＣＸは、配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列、さらに好ましくは、約５５、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８さらに９９％相同なアミノ酸配列を含有し、かつ配列番号：２の配列を有する対応ポリペプチドのＦＧＦ−ＣＸタンパク質の機能的活性を保持するタンパク質である。
【０１４５】
２またはそれ以上の配列間の相同性の測定
２つのアミノ酸または２つの核酸のパーセント相同性を測定するために、配列を最適な比較目的のため整列させる（例えば、ギャップが配列間の最適なアラインメントのため比較された配列のいずれかにおいて導入され得る）。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドは、次に比較される。第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置の同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められている場合、分子はその位置で相同である（すなわち、本明細書において用いられる様に、アミノ酸または核酸「相同性」は、アミノ酸または核酸「同一」と等しい。）
【０１４６】
核酸配列相同性は、２配列間の同一性の程度として測定され得る。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェアのような、当分野において既知のコンピュータープログラムを用いて測定され得る。Needleman and Wunsch 1970 J Mol Biol 48: 443-453を参照されたい。核酸配列比較の以下の設定：５．０のＧＡＰ生成ペナルティーおよび０．３のＧＡＰ伸長ペナルティーを伴なうＧＣＧ ＧＡＰソフトウエアを用いて、上で言及された類似核酸配列のコード領域は、配列番号：１において示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード化）部分と好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を表す。
【０１４７】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、比較の特定領域にわたって残基毎に同一である程度に言及する。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較の領域にわたって、２つの最適整列配列を比較すること、一致位置の数をもたらすために両配列において生じる同一核酸塩基（例えば、核酸の場合、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）のある位置の数を測定すること、比較の領域中の位置の合計数（すなわち、ウィンドウサイズ）により一致位置の数を割ること、および配列同一性のパーセンテージをもたらすために、結果を１００倍することにより測定される。本明細書において用いられる様に、用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示す。ここで、該ポリヌクレオチドは、比較領域にわたって参考配列と比較して、少なくとも８０％配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％同一性、およびしばしば９０〜９５％配列同一性、さらに一般的には少なくても９９％配列同一性を有する配列を含む。用語「ポジティヴ残基のパーセンテージ」は、比較の領域にわたって２つの最適化整列配列を比較すること、上で定義された様に同一および保存アミノ酸置換が、一致位置の数をもたらすために両配列間で生じる位置の数を測定すること、比較の領域の位置の合計数（すなわち、ウインドウサイズ）により一致位置の数を割ること、およびポジティブ残基のパーセンテージをもたらすために、結果を１００倍することにより測定される。
【０１４８】
キメラタンパク質および融合タンパク質
本発明はまた、ＦＧＦ−ＣＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書において用いられる様に、ＦＧＦ−ＣＸ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドに作用可能に結合したＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを含む。「ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド」は、ＦＧＦ−ＣＸに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドに言及し、「非ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド」は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に実質的に相同でないタンパク質、例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質と異なり、かつ同一生物または異なる生物からもたらされるタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドに言及する。ＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質内で、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の全部または一部に対応し得る。１つの実施態様において、ＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質は、少なくとも１つのＦＧＦ−ＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分を含む。別の実施態様において、ＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質は、少なくとも２つのＦＧＦ−ＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質内で、用語「作用可能に結合する」は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドおよび非ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドが互いにインフレームで融合されることを示すことを意図する。非ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。
【０１４９】
例えば、１つの実施態様において、ＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質は、第２のタンパク質の細胞外ドメインに作用可能に結合するＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを含む。かかる融合タンパク質は、ＦＧＦ−ＣＸ活性を調節する化合物のスクリーニングアッセイ（かかるアッセイは、以下で詳細に記載される）においてさらに利用され得る。
【０１５０】
別の実施態様において、融合タンパク質は、ＦＧＦ−ＣＸ配列がＧＳＴのＣ末端に融合する（すなわち、グルタチオンＳトランスフェラーゼ）ＧＳＴ−ＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質である。かかる融合タンパク質は、組換えＦＧＦ−ＣＸの精製を促進することができる。
【０１５１】
さらに別の実施態様において、融合タンパク質は、Ｎ末端にある異種性シグナル配列を含有するＦＧＦ−ＣＸタンパク質である。例えば、天然のＦＧＦ−ＣＸシグナル配列（すなわち、配列番号：２のアミノ酸１〜２０）が、取り除かれ、別のタンパク質由来のシグナル配列で取って代わられ得る。ある宿主細胞において（例えば、哺乳動物細胞）、ＦＧＦ−ＣＸの発現または／および分泌は、異種性シグナル配列の使用を介して増加され得る。
【０１５２】
別の実施態様において、融合タンパク質は、１またはそれ以上のドメインを含むＦＧＦ−ＣＸ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーからもたらされる配列に融合されるＦＧＦ−ＣＸ免疫グロブリン融合タンパク質である。本発明のＦＧＦ−ＣＸ免疫グロブリン融合タンパク質は、医薬組成物に取り込まれ、対象に投与され、細胞表面上のＦＧＦ−ＣＸリガンドとＦＧＦ−ＣＸタンパク質との相互作用を阻害し、それによりインビボでのＦＧＦ−ＣＸ仲介シグナル伝達を抑制できる。制限されない実施例において、本発明の考えられるＦＧＦ−ＣＸリガンドは、ＦＧＦ−ＣＸ受容体である。ＦＧＦ−ＣＸ免疫グロブリン融合タンパク質を用いて、ＦＧＦ−ＣＸ同族リガンドの生物学的利用能に作用させることができる。ＦＧＦ−ＣＸリガンド／ＦＧＦ−ＣＸ相互作用の阻害は、増殖性疾患および分化性疾患の両方の処置、ならびに細胞生存の調節（例えば、促進または阻害）のために治療的に有用であり得る。さらに、本発明のＦＧＦ−ＣＸ免疫グロブリン融合タンパク質を免疫原として用いて、対象において抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体を産生し、ＦＧＦ−ＣＸリガンドを精製し、ＦＧＦ−ＣＸリガンドとのＦＧＦ−ＣＸの相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングにおいて用いられ得る。
【０１５３】
本発明のＦＧＦ−ＣＸキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準組換えＤＮＡ技術により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、例えば、ライゲーションのための平滑末端またはねじれ（stagger）末端、適当な末端を提供するための制限酵素切断、適当な粘着末端の充填、望まない結合を避けるためのアルカリフォスファターゼ処理、および酵素ライゲーションを用いることにより、従来技術に従いインフレームで互いに結合する。別の実施態様において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成され得る。または、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、引き続いてアニーリングし、再増幅され、キメラ遺伝子配列を精製し得る２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて実行されうる（例えば、 Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992を参照）。さらに、多くの発現ベクターは、融合部分を既にコード化する市販されるもの（例えば、ＧＳＴポリペプチド）である。ＦＧＦ−ＣＸコード化核酸は、融合部分がＦＧＦ−ＣＸタンパク質にインフレームで結合するように発現ベクターにクローン化され得る。
【０１５４】
ＦＧＦ−ＣＸ作用物質および拮抗物質
本発明はまた、ＦＧＦ−ＣＸ作用物質（ミメティクス）またはＦＧＦ−ＣＸ拮抗物質のいずれかとして機能するＦＧＦ−ＣＸタンパク質の変異体に関する。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の変異体は、変異誘発、例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の別々の点変異または切断により生成され得る。ＦＧＦ−ＣＸの作用物質は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の天然に存在する型の生物学的に活性な同一物またはサブセットを実質的に保持し得る。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の拮抗物質は、例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を含む細胞のシグナルカスケイドの下流または上流のメンバーに競合的に結合することにより、１またはそれ以上のＦＧＦ−ＣＸタンパク質の天然に生じる形の活性化を阻害し得る。従って、特異的な生物学的作用は、機能を制限された変異体との処理により誘発され得る。１つの実施態様において、タンパク質の天然に生じる形の生物学的に活性なサブセットを有する変異体との対象の処理は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の天然に生じる形との処置と関係する対象においてより少ない副作用を有する。
【０１５５】
ＦＧＦ−ＣＸ作用物質（ミメティクス）としてまたはＦＧＦ−ＣＸ拮抗物質のいずれかとして作用するＦＧＦ−ＣＸタンパク質の変異体は、例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の作用物質または拮抗物質の活性についてＦＧＦ−ＣＸタンパク質の切断突然変異体の組合せライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施態様において、ＦＧＦ−ＣＸ変異体の多彩アなライブラリーは、核酸レベルの組合せ変異誘発により生成され、多彩な遺伝子ライブラリーによりコード化される。ＦＧＦ−ＣＸ変異体の多彩なライブラリーは、例えば、潜在的なＦＧＦ−ＣＸ配列の変性セットが、個々のポリペプチドとして、または代わりにＦＧＦ−ＣＸ配列のセットを含有するより大きな融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイ）として発現可能である様な遺伝子配列に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的にライゲーションすることにより産生され得る。変性オリゴヌクレオチド配列由来の潜在的ＦＧＦ−ＣＸ変異体のライブラリーを産生するために用いられ得る様々な方法がある。変性遺伝子配列の化学的合成を、自動ＤＮＡ合成機において実行することができ、合成遺伝子は次に、適当な発現ベクターに結合させられる。遺伝子の変性セットの使用は、潜在的ＦＧＦ−ＣＸ配列の望まれるセットをコード化する配列の全部である混合物の１つにおいて供給を可能とする。変性オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当分野において既知である（例えば、Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu Rev Biochem 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucl Acid Res 11:477を参照）。
【０１５６】
ポリペプチドライブラリー
加えて、ＦＧＦ−ＣＸコード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の変異体のスクリーニングおよび続く選択のためのＦＧＦ−ＣＸの多彩な群を産生し得る。１つの実施態様において、コード配列フラグメントのライブラリーは、ニッキングが１分子あたり約１回のみ生じる条件下でヌクレアーゼを有するＦＧＦ−ＣＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントの処理、ニ本鎖ＤＮＡの変性、異なるニック産物由来のセンス／アンチセンスプライマーを含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためのＤＮＡの再生、Ｓ１ヌクレアーゼとの処理によりニ本鎖の再形成から一本鎖部分を取り除くこと、および結果として生じるフラグメントライブラリーの発現ベクターへのライゲーションにより生成されうる。この方法により、発現ライブラリーは、Ｎ末端およびＦＧＦ−ＣＸタンパク質の様々なサイズの内部フラグメントをコード化するものがもたらされ得る。
【０１５７】
点変異または切断により作られた組合せライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングすること、および選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするいくつかの技術は、当分野において既知である。かかる技術は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の組合せ変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適している。複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローン化、結果として生じるベクターライブラリーとの適当な細胞の形質移入、および望まれる活性の検出が産物が検出される遺伝子をコード化するベクターの単離を促進する条件下での組合せ遺伝子の発現を典型的に含む大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングする高処理量分析に従った技術が、最も広く用いられる。ライブラリーの機能的変異の頻度を増大する新たな技術である再帰全変異誘発（ＲＥＭ）が、ＦＧＦ−ＣＸ変異体を同定するためのスクリーニングアッセイとの組合せにおいて用いられ得る(Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89:78117815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6:327331)。
【０１５８】
抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体
本明細書において用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子に言及する。かかる抗体は、限定されることなく、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーを含む。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、分子に存在する天然の重鎖により別のものと異なる任意のクラスのＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤに関する。あるクラスは、同様に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ等のサブクラスを有する。さらに、ヒトにおいて、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。抗体に対する本明細書における参考文献は、ヒト抗体種のかかるクラス、サブクラスおよびタイプの全てに対する参考文献を含む。
【０１５９】
抗原、またはそれらの一部またはフラグメントとして機能することを意図される単離タンパク質は、ポリクローナル抗体標本およびモノクローナル抗体標本の標準技術を用いる、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。全長タンパク質を用いることができるか、または、本発明は免疫原としての使用のため抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、配列番号：２において示されるアミノ酸配列のような全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸残を含み、全長タンパク質またはエピトープを含有する任意のフラグメントとの特異的免疫複合体を形成するペプチドに対して生じる抗体のエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ酸残基、または少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドにより包含される好ましいエピトープは、その表面に位置するタンパク質の領域；普通は、親水性領域である。
【０１６０】
本発明のある実施態様において、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも１つのエピトープが、タンパク質の表面に位置するＦＧＦ−ＣＸの領域、例えば親水性領域である。ヒトＦＧＦ−ＣＸタンパク質配列の疎水性分析は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの領域が特定の親水性領域であり、それゆえ、抗体産物の標的化に有用である表面残基をコード化することを示す。抗体産物の標的化を意味する様に、親水性領域および親水性を示す疎水性親水性指標プロットは、例えば、フーリエ形質転換ありでまたはなしのいずれかでのKyte Doolittle法またはHopp Woods法を含む、当分野においてよく知られた任意の方法により生成され得る。例えば、Hopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828；Kyte and Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-142を参照されたい。それぞれ、全体として参考文献により本明細書において取り込まれる。抗原性タンパク質、または誘導体、フラグメント、それらの類似体または相同体内の１またはそれ以上のドメインに特異的な抗体も、本明細書において提供される。
【０１６１】
本発明のタンパク質、または誘導体、フラグメント、類似体、それらの相同体またはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成での、免疫原として利用され得る。
【０１６２】
当分野内において既知の様々な方法は、本発明のタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、類似体、またはそれらの相同体またはオルソログに対して指示されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生に用いられ得る（例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照。参考文献により本明細書に組み込まれる）。これらの抗体のいくつかを、以下に論じる。
【０１６３】
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の産生のために、様々な適当な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）が、ＦＧＦ−ＣＸ天然タンパク質、それらの合成変異体、または上述の誘導体を伴う１回またはそれ以上の注入により免疫され得る。適当な免疫原性標本は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を表す化学的に合成されたポリペプチド、または組換え的に発現させた免疫原性タンパク質を含有することができる。さらに、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、免疫された哺乳動物での免疫原であると知られた第２のタンパク質に複合され得る。かかる免疫原性タンパク質の実施例は、制限されることなく、キーホールカサガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターを含む。標本は、アジュバントをさらに含むことができる。免疫学的反応を増大させるために用いられる様々なアジュバントは、制限されることなく、フロイント（完全および不完全）、ミネラルジェル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール等）、Bacille Calmette-GuerinおよびCorynebacterium parvumのようなヒトに使用可能なアジュバント、または類似の免疫促進剤が挙げられる。使用し得るアジュバントのさらに別な例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成ジコリノミコール酸トレハロース）を挙げ得る。
【０１６４】
免疫原性ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に対して指示されるポリクローナル抗体分子は、哺乳動物（例えば、血液から）単離され、免疫血清のＩｇＧ分画を第１に提供するタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇを用いるアフィニティークロマトグラフィーのようなよく知られた技術によりさらに精製され得る。引き続いて、または代わりに、探された免疫グロブリンの標的である特異的抗原、またはそれらのエピトープは、免疫親和性クロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製するためのカラム上に固定され得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)により考察される。
【０１６５】
２．モノクローナル抗体
本明細書において用いる用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、特徴のある軽鎖遺伝子産物および特徴のある重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の１分子種のみを含有する抗体分子群に言及する。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、全ての分子群において同一である。従って、ＭＡｂは、それらに特徴のある結合親和性により特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応が可能な抗原結合部位を含有する。
【０１６６】
モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により記載される様に、ハイブリドーマ法を用いて調製され得る。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、または他の適当な宿主動物は、免疫試薬で典型的に免疫され、免疫試薬に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生可能であるリンパ球を促進する。または、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【０１６７】
免疫試薬は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質抗原、それらのフラグメントまたはそれらの融合タンパク質を典型的に含む。ヒト起源の細胞が望まれるなら用いられ一般に、末梢血液リンパ球が用いられ、非ヒト哺乳動物起源が望まれるなら、脾細胞またはリンパ節が用いられる。リンパ球は、そこでポリエチレングリコールのような適当な融合試薬を用いた不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する。例えば、Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103を参照されたい。不死化細胞株は、普通は、哺乳類細胞特定の場合げっ歯類、ウシおよびヒト機嫌の骨髄腫に形質移入される。普通は、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、非融合細胞不死化細胞の成長または生存を阻害する１またはそれ以上の物質を含有する適当な培養液において培養され得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマの培養液は、物質がＨＧＰＲＴ欠乏細胞の成長を妨げるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を典型的に含む。
【０１６８】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高発現レベルをサポートするものであり、ＨＡＴ培地のような培地に感受性がる。さらに好ましくい不死化細胞株は、例えば、the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California and the American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから得られる、マウス骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、ヒトモノクローナル抗体の産物についても記載される。例えば、Kozbor: J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al.: Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63を参照されたい。
【０１６９】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養液は、そのとき抗原に対して指示するモノクローナル抗体の存在をアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロ結合アッセイにより測定される。かかる技術およびアッセイは、当分野において既知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のScatchard analysisにより測定され得る。それは、高い程度の特異性および標的抗原の高結合親和性を有する抗体を同定するためのモノクローナル抗体の治療的増幅において特に重要な目的であり。
【０１７０】
望ましいハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈法によりサブクローン化され、標準方法（Goding,1986）により成長する。この目的に適当な培地は、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地およびＲＰＭＩ培地を含む。または、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物の腹水の様にインビボにおいて成長し得る。
【０１７１】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、単離されるか、または例えば、タンパク質Ａセファロース、ヒドロキシルアバタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳道、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製により、培地または腹水液から精製される。
【０１７２】
モノクローナル抗体はまた、米国特許番号４，８１６，５６７において記載される様な組換えＤＮＡ方法により作られることがきる。本発明のモノクローナル抗体をコード化するＤＮＡは、迅速に単離され、通常の方法（例えば、マウス抗体の重鎖おとび軽鎖をコード化する遺伝子に免疫特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブ用いることにより）を用いて配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として働く。一旦単離されると、ＤＮＡは、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を別に産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞に形質移入される発現ベクター内に位置し、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得られる。ＤＮＡは、例えば、相同マウス配列の場所にあるヒト重鎖および軽鎖定常ドメインの配列をコードする置換（米国特許番号４，８１６，５６７；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)）により、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部の免疫グロブリンコード配列に共有結合性結合することによりモディファイされ得る。かかる非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインのために置換され得るし、またはキメラ二価抗体を生成するための本発明の抗体の抗原結合部位の可変ドメインのために置換され得る。
【０１７３】
３．ヒト化抗体
本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質抗原に対して指示する抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を生じさせることなくヒトへの投与に適している。抗体のヒト化型は、ヒト免疫グロブリンの配列を主に含み、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または他の抗体の抗原結合配列）である。ヒト化は、Winter and co-workers (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従い、ヒト交代の対応する配列のげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を置換することにより実行され得る（米国特許番号５，２２５，５３９も参照）。時には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基により置きかえられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体において、または移動されたＣＤＲまたはフレームワーク配列のどちらにおいても見られない残基も含む。一般に、ヒト化抗体は、可変ドメインの少なくとも１つの全体、および典型的な２つの可変ドメインを実質的に含む。ここで、非ヒト免疫グロブリンの対応するＣＤＲ領域の全て、または実質的に全て、およびフレームワーク領域の全て、または実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン共通配列の領域である。ヒト化抗体は、好ましくは、少なくとも免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部、ヒト免疫グロブリンの一部を典型的に含む(Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992))。
【０１７４】
４．ヒト抗体
完全にヒト抗体は、ヒト遺伝子から生じるＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の全配列の抗体分子に基本的に関与する。かかる抗体は、本明細書において「ヒト抗体」または「完全にヒト抗体」と名付けられる。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に対して指示するヒトモノクローナル抗体は、trioma技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole, et al., 1985 In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 7796を参照）により調製され得る。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において利用され得るし、ヒトハイブリドーマを用いることにより、またはインビトロでのＥＢウイルスとのヒトＢ細胞の形質移入により産生され得る（Cole, et al., 1985 In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 7796を参照）。
【０１７５】
加えて、ヒト交代はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む別の技術を用いて産生され得る（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)）。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば部分的に不活性化されたまたは完全に不活性化された内在性免疫グロブリン遺伝子であるマウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより作られることができる。挑戦により、ヒト抗体産物は、遺伝子再配列、構築、抗体レパートリーを含む全観点においてヒトにおいて見られるものはよく似ていることを観察される。このアプローチは、例えば、米国特許番号５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６、およびMarks et al. (Bio/Technology 10, 779-783 (1992))；Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994))；Morrison ( Nature 368, 812-13 (1994))；Fishwild et al,( Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996))；Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996))；およびLonberg and Huszar (Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))において記載される。
【０１７６】
ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に特別に結合するヒト抗体は、抗原により、挑戦に対する応答での動物の内在性抗体よりむしろ完全にヒト抗体を産生するためにモディファイされるトランスジェニック非ヒト動物を用いて別に産生され得る（公開番号ＷＯ９４／０２６０２参照）。非ヒト宿主での重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコード化する内在性遺伝子は、能力を奪われ、宿主のゲノムに挿入されるヒト重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコード化する遺伝子座を活性化する。ヒト遺伝子は、例えば、要求されるヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母人工染色体を用いて組み込まれる。全ての望まれる修飾を提供する動物は、修飾の全相補的配列より少ない相補的配列を含有するトランスジェニック動物が仲介する交配により子孫として得られる。かかる非ヒト動物の好ましい実施態様は、マウスおよびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６において開示される様にXenomouseTMと名付けられる。この動物は、完全にヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体の標本、またはモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのような動物由来の不死化Ｂ細胞由来の標本として該ＦＧＦ−ＣＸ免疫グロブリンでの免疫の後の動物から直接的に得られることができる。加えて、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコード化する遺伝子は、回復させ、直接的に抗体を得るために発現させるか、または例えば、一本鎖Ｆｖ分子のような抗体の類似体を得るためにさらにモディファイされ得る。
【０１７７】
マウスとして例示され、内在性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主を産生する方法の実施例は、米国特許番号５，９３９，５９８において開示される。それは、遺伝子座の転座および転座免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成を防ぐために胚性幹細胞での少なくとも１つの内在性重鎖遺伝子座由来のＪセグメントを欠くことを含む方法により得られることができ、欠損は、選択可能なマーカーをコード化する遺伝子を含有するベクターを標的とすること；および体細胞および生殖細胞が胚性幹細胞から選択可能なマーカーをコード化する遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを賛成することにより作用される。
【０１７８】
ヒト抗体のような、該抗体を産生する方法は、米国特許番号５，９１６，７７１において開示される。それは、重鎖をコード化するヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを培養での１つの哺乳動物宿主細胞内へ導入すること、軽鎖をコード化するヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを別の哺乳動物宿主細胞へ導入すること、およびハイブリドーマ細胞を形成するために２つの細胞を融合させることを含む。ハイブリドーマ細胞は、重鎖および軽鎖を含有する交代を発現する。
【０１７９】
この産物のさらなる改良において、免疫原の臨床的に関連するエピトープを同定する方法、および高親和性で関連するエピトープに免疫特異的に結合する抗体を選択する相関連する方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５３０４９において開示される。
【０１８０】
５．Ｆａｂフラグメントおよび一本鎖抗体
本発明によると、技術は、本発明の抗原性ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に対して特異的な一本鎖抗体の産物に適応させ得る（例えば、米国特許番号４，９４６，７７８を参照）。加えて、方法は、タンパク質または誘導体、フラグメント、類似体またはそれらの相同体にたいする望まれる特別性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で効果的な同定を可能とするＦａｂ発現ライブラリー（例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 12751281を参照）の構造に適応され得る。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、制限されることなく、：（i）抗体分子のペプシン切断により産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ii）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィドブリッジを還元することにより生成されるＦａｂフラグメント；（iii）パパインでの抗体分子の処理により生成されるＦａｂフラグメントおよび還元剤および（iv）Ｆｖフラグメントを含む当分野において既知の技術により産生され得る。
【０１８１】
６．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、モノクローナルであり、好ましくは少なくとも２つの異なる抗原への結合特異性を有するヒトまたはヒト化抗体である。当該場合において、結合特異性の１つは、本発明の抗原性タンパク質によるものである。第２の結合標的は、別の抗原であり、有利には細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットである。
【０１８２】
二重特異性抗体を作る方法は、当分野において既知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産物は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖ペアーの共発現に基づき、２つの重鎖は、異なる特異性を有する(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。
免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな分類のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１つのみが正しい二重特異性構造の１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生する。正しい分子の精製は普通、アフィにティークロマトグラフィーステップにより成し遂げられる。類似の方法が、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９、およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)において開示される。
【０１８３】
望まれる結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。好ましくは、融合は、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと共にある。好ましくは、少なくとも融合の１つにおいて存在する軽鎖結合を必要とする部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有する。免疫グロブリン重鎖融合をコード化するＤＮＡは、望まれるなら、免疫グロブリン軽鎖は、別の発現ベクターに挿入され、適当な宿主生物に同時形質移入される。二重特異性抗体の生成のさらんる詳細のため、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１８４】
ＷＯ９６／２７０１１において記載される別のアプローチによると、抗体分子ペアー間の干渉は、組換え細胞培養から回復させるヘテロダイマーの最大パーセンテージに設計され得る。好ましい干渉は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。最後に、第１の抗体分子の干渉由来の１またはそれ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）でとって代わられる。大きな側鎖と同一または類似の側鎖の代償性「穴」は、より小さなものでの大きなアミノ酸側鎖を取って代わることにより第２の抗体分子の干渉で生成される。このことは、ホモダイマーのような他の望まれていない末端産物のヘテロダイマー分野を増大するメカニズムを提供する。
【０１８５】
二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術は、文献において記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学的な連鎖を用いて調製され得る。Brennan et al., Science 229:81 (1985)は、無処理抗体が、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成するためにタンパク質分解性に切断され得る方法を記載する。これらのフラグメントは、ジチオール複合体試薬ナトリウム亜ヒ酸塩存在下において近接ジチオールを安定化、分子間ジスルフィド形成を防ぐために置換される。生成されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエイト（thionitrobenzoate）（ＴＮＢ）誘導体にそこのとき変換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、そのときＦａｂ’−チオールにメルカプトエチルアミンとの置換により再変換され、二重特異性抗体を形成するために他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合される。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための試薬として用いられ得る。
【０１８６】
加えて、Ｆａｂ’フラグメントは、E.coliから直接的に回復され、二重特異性抗体を形成するために化学的にカップリングされ得る。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217225 (1992)は、完全にヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子産物を記載する。それぞれのＦａｂ’フラグメントは、E.coliから別々に分泌され、二重特異性抗体を形成するためにインビトロでの直接化学カップリングの対象とされた。従って、形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞、および正常ヒトＴ細胞、ならびにヒト乳癌標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解性活性のトリガーに結合可能であった。
【０１８７】
組換え細胞培養に直接由来する二重特異性抗体フラグメントを作り、単離するための様々な技術は、また記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生され得る。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):15471553 (1992)を参照。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合させた。抗体ホモダイマーを、モノマーを形成するためにヒンジ領域で還元し、抗体へテロダイマーを形成するために再び酸化した。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:64446448 (1993)により記載される「ダイアボーイ」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作る選択的メカニズムを提供した。フラグメントは、同一鎖の２つのドメイン間の対形成を可能とするには短いリンカーにより軽鎖可変領域（ＶＬ）に結合する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。代わりに、１つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインを有する対に強制され、それにより、２つの後援結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用による二重特異性抗体フラグメントを作る別のストラテジーも、報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１８８】
２より多い結合価を有する抗体が熟慮される。例えば、三重特異性抗体が、調製され得る。Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)を参照。
【０１８９】
例示的に二重特異性抗体は、少なくとも１つが本発明のタンパク質抗原に起源を有する、２つの異なるエピトープに結合することができる。また、免疫グロブリン分子の抗−抗原性アームは、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、ＦｃｙＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃｙＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃｙＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のような特定の抗原を発現する細胞にたいする細胞の防御メカニズムに力をおくために白血球上の引き金を引く分子に結合するアームと結合されることができる。二重特異性抗体を用いて、細胞障害性試薬を特定の抗原を発現する細胞に直接作用させることができる。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞障害性試薬またはＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡのような放射性核種キレート剤を結合するアームを有する。当該別の二重特異性抗体は、本明細所において記載されるタンパク質抗原に結合し、組織因子（ＴＦ）にさらに結合する。
【０１９０】
ヘテロ結合抗体
ヘテロ結合抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合抗体は、２つの共有結合性に結合した抗体から構成される。かかる抗体は、例えば、望まれる細胞に対して免疫系細胞を標的するため（米国特許番号４，６７６，９８０）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）提案される。抗体が、クロスリンクする試薬を含むそれらを含む、合成タンパク質化学反応において既知の方法を用いて調製され得る。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、チオエーテル結合の形成により構築され得る。この目的のための適切な試薬の実施例は、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチリミデイトおよび例えば、米国特許番号４，６７６，９８０に開示されるものを含む。
【０１９１】
エフェクター機能操作
例えば、癌処置における抗体の有効性を増強するために、エフェクター機能に関する本発明のＦＧＦ−ＣＸ抗体をモディファイことは望ましい。例えば、システイン残基（ｓ）は、Ｆｃ領域に挿入され、それにより、この領域での内部鎖のジスルフィド結合形成を可能とする。従って、生成されたホモダイマー抗体は、改善したインターナリゼーション能力および／または増大した相補的配列仲介の細胞死滅および抗体依存の細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有することができる。Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992)およびShopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)において記載される様にヘテロ二重特異性クロスリンカーを用いて調製され得る。または、抗体は、二重Ｆｃ領域を有するものを操作され、それにより、増強した相補的な分解およびＡＤＣＣ能力を有することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
【０１９２】
９．免疫複合体
本発明は、化学療法物質、毒（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒、またはそれらのフラグメント）、または放射性同位元素（すなわち、放射性複合体）の様な細胞傷害性物質に結合したＦＧＦ−ＣＸ抗体を含む免疫複合体に関する。
【０１９３】
そのような免疫複合体の生成に有用な化学療法物質を上述した。使用できる酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、内毒素Ａ鎖（Pseudomonas aeruginosa由来）、リシンＡ鎖、アビリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ディアンティンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、momoridica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalisc阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種を放射性複合抗体の生産に利用できる。例として、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙおよび^１８６Ｒｅを挙げ得る。
【０１９４】
抗体と細胞障害性薬剤との複合体を、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２機能性誘導体（ジメチルアジピイミデートＨＣＬのような）、活性エステル（ジサクシンイミジルスベレートのような）、アルデヒド（グルタルアルデヒドのような）、ビスアジド誘導体（ビス−（ｐ−アジドベンゾイル）−ヘキサンジアミンのような）、ビスジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンのような）、ジイソシアネート（トリエン２、６−ジイソシアネートのような）、およびビス活性フッ素化合物（１,５−ジフルオロ２,４−ジニトロベンゼンのような）のような種々の２機能性タンパク質カップリング剤を用いて作る。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)に記載のように調製することができる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＭＸ−ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合するための典型的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
【０１９５】
もう一つの実施態様では、抗体を、腫瘍をプレターゲティンブのための「受容体」（ストレプトアビジンのような）に結合することができて、そこでは抗体−受容体複合体を患者に投与し、引き続いて未結合の複合体を除去剤を用いて血液循環から除去し、次いで今度は細胞障害性薬剤に複合した「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【０１９６】
１０．免疫リポソーム
本明細書のおいて開示される抗体はまた、免疫リポソームとして処方され得る。抗体を含有するリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)；および米国特許番号４，４８５，０４５および４，５４４，５４５に記載されるような、当分野において既知の方法により調製される。増大した循環時間を有するリポソームは、米国特許番号５，０１３，５５６において開示される。
【０１９７】
特に有用なリポソームリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法により生成し得る。リポソームリポソームを定められた孔径のフィルターを通して押し出して、所望の直径のリポソームリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ'フラグメントを、Martin et al ., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームリポソームに結合し得る。化学療法剤(ドキソルビシンのような)を任意にリポソーム内に含有する。Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)を参照されたい。
【０１９８】
１１．本発明のタンパク質に対して指向した抗体の診断応用
本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質に対して指向した抗体を、タンパク質の局在および／または定量（例えば、適切な生理的試料中のタンパク質レベルの測定における使用、診断法における使用、タンパク質のイメージングにおける使用等）に関する当分野内において公知の方法で使用し得る。ある一定の実施態様では、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体、または相同体に対する抗原結合ドメインを含有する抗体を、薬理学的に活性な化合物として利用する（下記を参照）。
【０１９９】
本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質に対して特異的な抗体を、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術により、タンパク質を単離するために使用し得る。そのような抗体を、細胞由来の天然タンパク質および宿主細胞で発現する組換え的に生産した抗原の精製を容易にし得る。さらに、そのような抗体を使用して、抗原タンパク質の存在量またはパターンを評価するために抗原タンパク質（例えば、細胞溶解物または細胞上清中の）を検出することができる。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に対して指向した抗体を診断的に使用して、例えば、与えられた処置法の有効性を測定するために臨床検査の手順の一環として組織中のタンパク質レベルをモニターすることができる。抗体を検出可能な物質にカップリング（即ち物理的に連結）することにより、検出を促進し得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、配合群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を挙げる。適当な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを挙げ得る；適当な配合群の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを挙げ得る；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを挙げ得る；発光物質の例としては、ルミノールを挙げ得る；生物発光物質の例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを挙うるし、適当な放射性物質の例としては、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓまたは^３Ｈを挙げ得る。
【０２００】
１２．抗体療法
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および完全なヒト化抗体を含む本発明のＦＧＦ−ＣＸ抗体は、治療物質として用いられ得る。かかる物質は、一般に、対象の疾病または病態を処置または予防するために使用される。抗体調合物、好ましくは標的抗原に対する高特異性および高親和性を有する抗体調合物は、対象に投与され、標的との結合に起因する作用を一般に有する。かかる作用は、２種のうちの１つであり、与えられる抗体分子と当該標的抗原との相互作用の特異的性質に依存する。第１の場合、抗体の投与は、標的が本来結合する内在性リガンドとの標的の結合を抑制または阻害し得る。この場合、抗体は標的に結合し、リガンドがエフェクター分子として働く、天然に存在するリガンドの結合部位を覆う。従って、受容体は、リガンドが責任を負うシグナル伝達経路を仲介する。
【０２０１】
または、作用は、抗体が標的分子上のエフェクター結合部位への結合である長所による生理的結果を誘発するものであり得る。この場合の標的において、疾病または病態において存在しないか、または不完全であり得る内在性リガンドを有する受容体は、代わりのエフェクターリガンドとして抗体を結合し、受容体に基づくシグナル伝達事象を開始する。
【０２０２】
本発明の抗体の治療的に有効な量は、一般に治療目的を達成するのに必要とされる量に関与する。上述のように、このことは抗体とその標的抗原との結合相互作用であり得、ある場合においては標的の機能との干渉、そして他の場合においては生理的応答を促進し得る。投与に必要な量は、その特異的抗原に対する抗体の結合親和性にさらに依存し、投与される抗体が投与される他の対象において遊離の量から使い果たされる速度にも依存する。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療的に有効な投与量の通常の範囲は、限定されない例として、体重あたり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇであり得る。通常の投与回数は、例えば、１日２回から１週間に１回の範囲である。
【０２０３】
１３．抗体の医薬組成物
本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質を免疫特異的に結合する抗体、ならびに本明細書において開示されるスクリーニングアッセイにより同定される他の分子は、医薬組成物の形で様々な疾患を処置するために投与され得る。かかる組成物の調製に関与する原理および考慮事項、ならびに成分の選択の指針は、例えば、Remington : The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995; Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; および Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New Yorkにおいて提供される。
【０２０４】
抗原性タンパク質が細胞内にあり、かつ全抗体が阻害剤として用いられると、内部移行抗体が好ましい。しかしながら、リポソームを用いて、抗体、または抗体フラグメントを細胞内に輸送することができる。抗体フラグメントが用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害剤フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、ペプチド分子が標的タンパク質配列を結合する能力を保持するようにデザインされ得る。かかるペプチドは、化学的に合成されるか、および／または、組換えＤＮＡ技術により産生されることができる。例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい。本明細書における製剤は、処置される特定の徴候に必要である１より多い活性化化合物、好ましくは、互いに逆に作用しない相補的活性を有するものを含有できる。代わりに、または加えて、組成物は、例えば細胞障害性物質、サイトカイン、化学療法剤、または成長阻害物質のような機能を増強する物質を含むことができる。かかる分子は、意図される目的のために作用する量の組合せにおいて適切に存在する。
【０２０５】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えば、ハイドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリル酸塩）マイクロカプセルにより、それぞれ、コロイド薬輸送システム（例えば、リポソーム、アルブミン微粒子、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョン中に封入され得る。
【０２０６】
インビボ投与に用いられるべき製剤は無菌でなければならない。このことは、無菌ろ過膜を介するろ過により容易に成し遂げられる。
【０２０７】
ＦＧＦ−ＣＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明に別の態様は、ベクター、好ましくは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、誘導体、フラグメント、類似体、またはそれらの相同体をコード化する核酸を含有する発現ベクターに関する。本明細書において使用する、用語「ベクター」は、それが結合した別の核酸を輸送する能力のある核酸分子に言及する。ベクターの１つのタイプは、別のＤＮＡセグメントが結合され得る環状二本鎖ＤＮＡループに言及する「プラスミド」である。ベクターの別のタイプは、ウイルスベクターであり、別のＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムに結合され得る。あるベクター（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピゾームの哺乳類ベクター）は、そららが導入される宿主細胞において自立増殖できる。他のベクター（例えば、非エピゾーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入において宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、あるベクターは、作用可能に結合するゲノムの発現に指示することができる。かかるベクターは、本明細書において「発現ベクター」として言及される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形である。本発明の明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドはベクターの最も普通に用いられる形であるので、交互に用いられることができる。しかしながら、本発明は、等しい機能を有するウイルスベクター（例えば、複製能を欠いたレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような、発現ベクターの他の形を含むことを意図する。
【０２０８】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸発現に適当な形で本発明の核酸を含み、このことは、組換え発現ベクターが、発現のために用いられる宿主細胞に基づき選択される１またはそれ以上の制御配列、発現されるべき核酸配列に作用可能に結合することを意味する。組換え発現ベクター内で、「作用可能に結合する」は、該ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能とする哺乳動物において（例えば、インビトロの転写システム／翻訳システムにおいて、またはベクターが宿主細胞に導入される宿主細胞において）制御配列に結合することを意味することを意図する。用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。かかる制御配列は、例えば、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)において記載される。制御配列は、宿主細胞の多くのタイプでのヌクレオチド配列の構成的発現に指示するもの、およびある宿主細胞でのヌクレオチドの発現に指示するもの（例えば、組織特異的制御配列）を含む。発現ベクターのデザインが形質転換されるべき宿主細胞の選択、望まれるタンパク質の発現のレベル等のような因子に依存し得ることは、当業者により理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それにより、本明細書において記載される核酸によりコード化される融合タンパク質または融合ペプチドを含む、タンパク質またはペプチド（例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ＦＧＦ−ＣＸの成熟型、融合タンパク質等）を産生することができる。
【０２０９】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞におけるＦＧＦ−ＣＸの発現のためにデザインされる得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸは、E.coliのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞、または哺乳類細胞において発現され得る。適当な宿主細胞は、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)においてさらに記載される。または、組換え発現ベクターは、インビトロにおいて、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、転写および翻訳され得る。
【０２１０】
真核細胞でのタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現に指示する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを有するE.coliにおいて、しばしば実行される。融合ベクターは、多くのアミノ酸を、それらにコード化されるタンパク質、普通は組換えタンパク質のアミノ末端に加える。かかる融合ベクターは、３つの目的：（１）組換えタンパク質の発現を増加するため；（２）組換えタンパク質の溶解性を増加するため；および（３）アフィニティー精製でのリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の溶解性を増加するために、典型的に役立つ。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性の切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との結合で導入され、融合部分からの組換えタンパク質の分離、引き続いて、融合タンパク質の精製を可能とする。かかる酵素、およびそれらの同族認識配列は、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合するｐＧＥＣ（Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson (1988) Gene 67:3140）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, Mass.）およびｐＲＩＴ５（Pharmacia, Piscataway, N.J.）を含む。
【０２１１】
適当な誘導性非融合E.coli発現ベクターの実施例は、ｐＴｒｃ（Amrann et al., (1988) Gene 69:301315）およびｐＥＴ１１ｄ（Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 6089）を含む。
【０２１２】
E.coliでの組換えタンパク質発現を最大にする１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解性に切断する障害性能力を有する宿主細菌でのタンパク質を発現することである。Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119128を参照されたい。別のストラテジーは、それそれのアミノ酸の個々のコドンがE.coliで優先的に利用されるものであるように、発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸配列を変えることである(Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:21112118)。本発明の核酸配列のかかる変化は、標準ＤＮＡ合成技術により実行されることができる。
【０２１３】
別の実施態様において、ＦＧＦ−ＣＸ発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母S. cerivisaeでの発現のためのベクターの実施例は、pYepSec1（Baldari, et al., (1987) EMBO J 6:229234）、ｐＭＦａ（Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933943）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al., (1987) Gene 54:113123）、ｐＹＥＳ２（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.）、およびｐｉｃＺ（InVitrogen Corp, San Diego, Calif.）を含む。
【０２１４】
代わりに、ＦＧＦ−ＣＸは、バキュロウイルス発現ベクターを用いる昆虫細胞において発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）でのタンパク質発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Smith et al. (1983) Mol Cell Biol 3:21562165）およびｐＶＬシリーズ（Lucklow and Summers (1989) Virology 170:3139）を含む。
【０２１５】
なお別の実施態様において、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いる哺乳類細胞において発現する。哺乳類発現ベクターの実施例は、ｐＣＤＭ８（(1987) Nature 329:840を参照）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman et al. (1987) EMBO J 6:187195）を含む。哺乳類細胞において用いられると、発現ベクターの調節機能は、ウイルス制御エレメントによりしばしば提供される。例えば、普通に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０由来である。原核細胞および真核細胞の両方に適当な他の発現システムについては、例えば、Chapters 16 and 17 of Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい。
【０２１６】
別の実施態様において、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞タイプにおいて核酸の発現を優先的に指示する能力がある（例えば、組織特異的制御エレメントを用いて、核酸を発現する）。組織特異的制御エレメントは、当分野において既知である。適当な組織特異的プロモーターの制限されない実施例は、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkert et al. (1987) Genes Dev 1:268277）、リンパ系特異的プロモーター（Calame and Eaton (1988) Adv Immunol 43:235275）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Winoto and Baltimore (1989) EMBO J 8:729733）および免疫グロブリンのプロモーター（Banerji et al. (1983) Cell 33:729740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741748）、神経細胞特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター; Byrne and Ruddle (1989) PNAS 86:54735477）、膵臓特異的プロモーター（Edlund et al. (1985) Science 230:912916）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許番号４，８７３，３１６およびヨーロッパ出願公開番号２６４，１６６）を含む。発生的に制御されるプロモーターは、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Kessel and Gruss (1990) Science 249:374379）およびα−フェトタンパク質プロモーター（Campes and Tilghman (1989) Genes Dev 3:537546）を包含する。
【０２１７】
本発明はさらに、発現ベクターの中にアンチセンスの配向でクローン化した本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、脳ＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にするような様式で、調節配列に機能し得るように結合する。種々の細胞タイプ中のアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指示するアンチセンスの配向にクローン化した核酸に機能し得るように結合した調節配列、例えば、ウイルスのプロモーターおよび／またはエンハンサーを選択することができるか、またはアンチセンスＲＮＡの組織特異的または細胞タイプ特異的な構成的発現を指示する調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、ベクターを導入した細胞タイプにより活性を決定する高効率調節領域の制御下で、アンチセンス核酸を生産する組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形であり得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察については、Weintraub, et al., 「Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis」 Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
【０２１８】
本発明のもう一つの態様は、本発明の組換え発現ベクターを導入する宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」を、本明細書においては互換的に使用する。そのような用語は、特定の対象の細胞のみならずそのような細胞の子孫または潜在的子孫をまた指すことを理解する。突然変異または環境の影響により後の世代に特定の修飾が生じるかもしれないため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書において使用する用語の範囲内になお含まれる。
【０２１９】
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を、E. coliのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）のような細菌の細胞中で発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者に周知である。
【０２２０】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換または形質移入技術により原核細胞または真核の細胞の中に導入することができる。本明細書において使用する用語「形質転換」および「形質移入」とは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介性形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む外来の核酸(例えばＤＮＡ)を宿主細胞に導入するために当分野で認める種々の技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換しまたは形質移入するための適当な方法は、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)および他の実験室マニュアルに見出すことができる。
【０２２１】
哺乳動物細胞の安定的な形質移入については、使用される発現ベクターおよび形質移入の技法に依存して、細胞のごく小数のフラクションが外来性ＤＮＡをそのゲノムの中に組み込み得る。これらの組み込み体を同定し選択するために、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する抵抗性）が一般的に、興味のある遺伝子と一緒に宿主細胞に導入される。種々の選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８,ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤に抵抗性を与えるものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸を、ＦＧＦ−ＣＸをコードするものと同一のベクター上で宿主細胞に導入することができか、または別のベクター上で導入することもできる。導入された核酸で安定に形質移入された細胞は、薬剤選択により同定されることができる（例えば、選択可能なマーカーを組み込んでいる細胞は生き残る一方で、他の細胞は死ぬ）。
【０２２２】
培地中の原核細胞または真核細胞のような本発明の宿主細胞を用いて、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を生産する（即ち、発現する）ことができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を用いるＦＧＦ−ＣＸタンパク質の生産方法をさらに提供する。一つの実施態様では、その方法は、本発明の宿主細胞(その中にＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターを導入する)を、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を生産するような適当な培地中で培養することを含む。もう一つの実施態様では、その方法は、培地または宿主細胞からＦＧＦ−ＣＸタンパク質を単離することをさらに含む。
【０２２３】
トランスジェニック動物
本発明の宿主細胞をまた使用して、非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。例えば、一つの実施態様では、本発明の宿主細胞は、その中にＦＧＦ−ＣＸタンパク質コード化配列を導入する受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、そのような宿主細胞を使用して、その中で外来性のＦＧＦ−ＣＸ配列をゲノムの中に導入する非ヒトトランスジェニック動物、またはその中で内在性のＦＧＦ−ＣＸ配列を変更する相同な組換え動物を創成することができる。そのような動物は、ＦＧＦ−ＣＸの機能および／または活性の研究にならびにＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書において使用する「トランスジェニック動物」とは、その中で動物の一つまたはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両棲類等を挙げ得る。導入遺伝子は、それからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムの中に取り込まれ、そして成熟動物のゲノム内に残存して、それによりトランスジェニック動物の一つまたはそれ以上の細胞タイプまたは組織中におけるコード化遺伝子産物の発現を指令する外来性ＤＮＡである。本明細書において使用する「相同の組換え動物」とは、その中で内在性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子が内在性遺伝子および、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞の中に動物の発生前に導入された外来性ＤＮＡ分子との間で相同組換えにより変更した非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスである。
【０２２４】
本発明のトランスジェニック動物は、ＦＧＦ−ＣＸをコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核の中に、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により導入して、卵母細胞を偽妊娠雌性仮親動物の体内で発生することを可能にすることにより、創成することができる。配列番号：１のＦＧＦ−ＣＸＤＮＡ配列を、非ヒト動物のゲノム内に導入遺伝子として導入することができる。これに代えて、マウスＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のようなヒトＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の非ヒト相同体を、ヒトＦＧＦ−ＣＸのｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション（上にさらに詳述）に基づいて単離して、導入遺伝子として使用し得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現効率を増加するために導入遺伝子中に含み得る。組織特異的調節配列をＦＧＦ−ＣＸ導入遺伝子に機能し得るように結合して、特定の細胞にＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現を指示し得る。胚の操作およびマイクロインジェクションによる、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物の作成方法は当分野において従来的となってきており、例えば、米国特許番号４,７３６,８６６; ４,８７０,００９; および４,８７３,１９１;ならびにHogan, 1986. In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている。類似の方法を他のトランスジェニック動物の生産に用い得る。初代トランスジェニック動物を、ゲノム内のＦＧＦ−ＣＸ導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞中におけるＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡの発現に基づいて、同定し得る。次いで、初代トランスジェニック動物を、導入遺伝子を保持する追加的動物の繁殖に使用し得る。さらに、ＦＧＦ−ＣＸをコードする導入遺伝子を保持するトランスジェニック動物を使用して、他の導入遺伝子を保持するさらに別なトランスジェニック動物を繁殖し得る。
【０２２５】
相同の組換え動物を創成するために、その中に欠失、付加または置換を導入していて、それによりＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を変化させる例えば機能的に破壊するあるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の少なくとも一部を含有するベクターを調製する。ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば配列番号：１）であり得るが、さらに好ましくはヒトＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の非ヒト相同体である。例えば、配列番号：１のヒトＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のマウス相同体を使用して、マウスゲノム中の内在性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を変更するのに適する相同組換えベクターを構築することができる。一つの実施態様では、ベクターを、相同組換えにより、内在性遺伝子を機能的に破壊する（即ち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼称する）ようにデザインする。
【０２２６】
これに代えて、ベクターは、相同組換えにより内在性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を変異するかまたは他のように変更するが、依然機能性タンパク質をコードする（例えば、上流の調節領域を変更してそれにより内在性ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現を変更する）ようにデザインし得る。相同組換えベクターでは、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の変更したタンパク質は、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のさらに別な核酸により５'末端または３'末端に隣接して、ベクターにより保持する外来性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子および胚性幹細胞中の内在性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の間で相同組換えが起こることを可能にする。さらに別な隣接ＦＧＦ−ＣＸ核酸は、内在性遺伝子と成功裏に相同組換えが起きるように十分な長さを持つ。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ（５'末端および３'末端の両方とも）をベクターに含み得る。相同組換えベクターの記載については、例えば、Thomas, et al., (1987). Cell 51: 503を参照されたい。次いで、ベクターを胚性幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションにより）導入し、そしてその中で導入したＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を内在性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子と相同的に組み換えた細胞を選択する（例えば、Li, et al., (1992). Cell 69: 915を参照）。
【０２２７】
次いで、選択した細胞を動物(例えば、マウス)の胚盤胞の中に注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Bradley, 1987. In: TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, ed. IRL, Oxford, pp. 113-152を参照されたい。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌性仮親動物に植え込んで、胚を満期出産する。生殖細胞内に相同組換えしたＤＮＡを保持している子孫を用いて、その中で動物の全ての細胞が、導入遺伝子の生殖系列を介した伝達により相同組換えＤＮＡを含有する動物を繁殖させることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Bradley, (1991). Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829; ＰＣＴ国際公開第: ＷＯ９０／１１３５４号；ＷＯ９１／０１１４０号；ＷＯ９２／０９６８号；およびＷＯ９３／０４１６９号にさらに記載される。
【０２２８】
もう一つの実施態様では、導入遺伝子の調節発現を可能にする選択したシステムを含有する非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。そのようなシステムの一つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムの記載については、例えば、Lakso, et al., (1992). PNAS 89: 6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Saccharomyces cerevisiaeのＦＬＰリコンビナーゼシステムである。O'Gorman, et al., (1991). Science 251:1351-1355を参照されたい。もしｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを用いて導入遺伝子の発現を調節するならば、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要となる。そのような動物は、例えば、一つは選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、他はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する二つのトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物の構築により提供し得る。
【０２２９】
本明細書に説明した非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmut, et al., (1997). Nature 385: 810-813. In brief, a cell, e.g., a somatic cellに記載された方法にしたがって生産することができる。略述すれば、トランスジェニック動物から細胞（例えば体細胞）を単離し、誘導して、増殖サイクルから抜け出てＧ_０期に入ることができる。次いで、静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により静止細胞を単離したのと同じ種類の動物由来の脱核した卵母細胞と融合することができる。次いで、再構成した卵母細胞を、それを桑実胚または胚盤胞にまで発生させて、次いで擬妊娠雌性仮親動物に導入するように培養する。この雌性仮親動物から生まれた子孫は、細胞、例えば、体細胞を単離する動物のクローンである。
【０２３０】
医薬組成物
本発明のＦＧＦ−ＣＸ核酸分子、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、抗−ＦＧＦ−ＣＸ抗体（本明細書では「活性化合物」ともいう）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、類似体および相同体を投与に適する医薬組成物の中に組込み得る。典型的に、そのような組成物は核酸分子、タンパク質または抗体およびおよび医薬的に許容され得る担体を含む。本明細書において使用する「医薬的に許容され得る担体」とは、医薬品投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗かび剤、等張および吸収遅延剤等を含むことを意図する。適当な担体は、この分野で標準的な参照テキストであるRemingtonの薬剤学の最新版（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。そのような担体または賦形剤の好ましい例としては、水、食塩水、ビンガー溶液、ブドウ糖溶液および５％ヒト血清アルブミンを挙げるが、それらに限定しない。リポソームおよび脂肪油のような非水溶性ビークルもまた使用する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤は当分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物に適合しない限りでなければ、組成物内のそれらの使用を意図する。補助的な活性化合物をまた、組成物の中に組込み得る。
【０２３１】
本発明の医薬組成物を、その意図する投与経路に適合するように処方する。投与経路の例としては、非経口の、例えば、静脈の、皮内の、皮下の、経口の（吸入）、経皮の（局所）、経粘膜のおよび直腸の投与を挙げ得る。非経口の、皮内のまたは皮下の応用に使用する溶液または懸濁液としては、以下の成分を挙げることができる：注射用水のような無菌賦形剤、食塩水溶液、脂肪油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような等張性を調整する薬剤。塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いてｐＨを調整することができる。非経口性製剤を、ガラスまたはプラスチックで作るアンプル、使い捨て注射器、または多回使用バイアルの中に封入し得る。
【０２３２】
注射用に適する医薬組成物としては、無菌水溶液（水溶性である場合）または分散液および無菌注射用の溶液または分散液の必要に応じて調合する製剤用の無菌粉末を挙げ得る。静脈投与のためには、適当な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EL[登録商標] （BASF, Parsippany, N.J.）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を挙げ得る。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。それは製造および保管の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液性ポリエチレングリコール等）ならびにそれらの適当な混合液を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、保持し得る。微生物作用の保護は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等、により達成される。多くの場合に、組成物中に、等張性薬剤、例えば、砂糖、マニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成剤の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらせ得る。
【０２３３】
無菌注射用溶液を、適切な溶媒の中に一つまたは上で列挙した成分の組合せと共に必要な量で活性化合物（例えば、あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質または抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体）を組み込み、ついでろ過滅菌を行なうことにより調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上で列挙したものから必要な他の成分を含有する無菌ビークルの中に活性化合物を組み込むことにより調製することができる。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製方法は、活性成分の粉末プラス前もって無菌ろ過されたその溶液からの任意のさらに別の望ましい成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０２３４】
一般的に、経口の組成物は、不活性賦形剤または食用の担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入するかまたは錠剤に打錠することができる。経口治療投与の目的には、活性化合物を添加物と共に組込んで錠剤、トローチまたはカプセルの形状で使用することができる。経口の組成物をまた、うがい薬としての使用のために液体担体を用いて調製し得るが、そこでは液体担体中の化合物を経口的に塗布し、さっと取り除いて、吐き出すか飲み込む。薬学的に適合する結合剤、おおび／またはアジュバント材料を組成物の一部として含み得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は任意の以下の成分または同様な性質を持つ化合物を含有し得る：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたは乳糖のような添加剤、アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロートのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑り剤；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；またはハッカ、サルチル酸メチル、オレンジ香料のような着香剤。
【０２３５】
吸入による投与のためには、化合物を、適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器またはディスペンザー、またはネブライザーからエアゾールスプレイの形式で送達し得る。
【０２３６】
全身的投与はまた、経粘液または経皮手段により得る。経粘液または経皮投与のためには、透過すべきバリアーに適切な浸透剤を処方に使用する。そのような浸透剤は当分野において一般的に公知であり、そして、例えば、経粘液投与のためには、洗剤、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を挙げ得る。経粘液投与は鼻腔スプレーまたは坐剤の使用により達成され得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当分野において一般的に公知であるように、軟膏、軟膏剤、ゲルまたはクリームの中に処方される。
【０２３７】
化合物をまた、直腸送達のために坐薬（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤用基材と共に）または保持浣腸剤の形式で調製し得る。
【０２３８】
一つの実施態様において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、化合物を身体からの迅速な排泄から防止する担体と共に調製する。酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酢酸のような、生物分解性で生体適合性のポリマーを使用し得る。そのような製剤を調製する方法は当業者に明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販で入手可能である。リポソームの懸濁液(モノクローナル抗体を持つ感染した細胞からウイルス抗体に至って標的化したリポソームを含む)をまた、医薬的に許容され得る担体として使用することができる。これらを、例えば米国特許番号４,５２２,８１１に記載のように、当業者に公知の方法に従い調製し得る。
【０２３９】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口性または非経口性の組成物を単位投与剤型で処方することが特に有益である。本明細書で使用する単位投与剤型とは、処置する対象に対して単一の投与量として適する物理学的に分離した単位を指し；それぞれの単位は、必要な薬学的な担体と一緒に望ましい治療効果を生じるように計算した予め決められた量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与剤型の規格は、活性化合物の特異な特色および達成するべき特別な治療効果により指示されかつ直接に依存する。
【０２４０】
本発明の核酸分子をベクターの中に挿入して遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターを輸送して、例えば米国特許番号５，７０３，０５５に記載されるように多くの経路のいずれかによる対象とされ得る。従って、輸送はまた、例えば、静脈注射、局所投与により（米国特許番号５,３２８,４７０を参照）または走触性注射（例えば、Chen, et al., (1994). PNAS USA 91: 3054-3057を参照）を含む。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される賦形剤の中に遺伝子治療ベクターを含むか、またはその中に遺伝子治療ベクターを埋め込んだ持続性マトリックスを含み得る。これに代えて、完全な遺伝子治療ベクターを組換え細胞、例えばレテロウイルスベクターから無傷で生産し得る場合には、医薬製剤は遺伝子送達システムを生産する一つまたはそれ以上の細胞を含み得る。
医薬製剤を、投与指示書と共に、容器、パックまたはディスペンサーの中に含み得る。
【０２４１】
本発明の使用および方法
本明細書のおいて記載される核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、および抗体は、以下の方法の１つまたはそれ以上において用いられ得る：（ａ）スクリーニングアッセイ；（ｂ）検出アッセイ（例えば、染色体マッピング、組織タイピング、法医学的生物学）、（ｃ）予測医療（例えば、診断アッセイ、予測アッセイ、臨床試験のモニタリング、および薬理ゲノミクス）；および（ｄ）処置方法（例えば、治療的および予防的）。本明細書において記載されるように、ある実施態様において、本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質はＡＴＰに結合する能力を有する。
【０２４２】
以下に詳述するように、本発明の単離核酸分子を使用して、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を発現し(例えば、遺伝子治療応用において宿主細胞中で組換え発現ベクターを介して)、ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡ(例えば、生物学的試料中の)またはＦＧＦ−ＣＸ遺伝子中の遺伝的欠損を検出し、そしてＦＧＦ−ＣＸ活性を調整することができる。加えて、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を用いて、ＦＧＦ−ＣＸの活性または発現を調整する薬または化合物をスクリーニングし、ならびに、例えば、増殖性疾患または分化性疾患のようなＦＧＦ−ＣＸタンパク質の不十分なまたは過剰な生産、またはＦＧＦ−ＣＸの野生型タンパク質と比較して低下または異常な活性を有するＦＧＦ−ＣＸタンパク質型の生産を特徴とする疾患を処置し得る。加えて、本発明の抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体を使用して、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を検出しかつ単離し、そしてＦＧＦ−ＣＸ活性を調整し得る。
本発明はさらに、本明細書に説明するスクリーニングアッセイで同定する新規な薬剤および上述の処置のためのそれらの使用に関する。
【０２４３】
スクリーニングアッセイ
本発明は、モジュレーター、即ち、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に結合するか、または、例えばＦＧＦ−ＣＸの発現またはＦＧＦ−ＣＸの活性に促進的または阻害的作用を有する候補または試験化合物または薬剤(例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、低分子または他の薬)を同定する方法（本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼称する）を提供する。
【０２４４】
一つの実施態様では、本発明は、膜結合型のあるＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分の活性を調整する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物を、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス参照可能な並列の固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成的ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法：を含む、当分野において周知のコンビナトリアルライブラリーにおける数多くのアプローチのいずれを用いても得られる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定される一方で、他の４種のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である。例えば、Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145を参照されたい。
【０２４５】
分子ライブラリー合成方法の例を、例えば、DeWitt, et al., (1993). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909、Erb, et al., (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422、Zuckermann, et al., (1994). J. Med. Chem. 37: 2678、Cho, et al., (1993). Science 261: 1303; Carrell, et al., (1994). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059、Carell, et al., (1994). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061、およびGallop, et al., (1994). J. Med. Chem. 37: 1233における当分野に見出し得る。
【０２４６】
化合物のライブラリーを、溶液中で(例えば、Houghten, (1992). Biotechniques 13: 412-421)、またはビーズ上で(Lam, (1991). Nature 354: 82-84)、チップ上で(Fodor, (1993). Nature 364: 555-556)、バクテリア(Ladner, 米国特許番号５,２２３,４０９)、胞子 (Ladner, 米国特許番号５,２３３,４０９)、プラスミド (Cull, et al., (1992). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869)上でまたはファージ上で(Scott and Smith, (1990). Science 249: 386-390; Devlin, (1990). Science 249: 404-406、Cwirla, et al., (1990). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382、Felici, (1991). J. Mol. Biol. 222: 301-310)で提供し得る。
【０２４７】
ある実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、そこでは膜結合型のＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触させ、そして試験化合物があるＦＧＦ−ＣＸタンパク質に結合する能力を測定する。細胞は、例えば、哺乳動物由来または酵母細胞であり得る。試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質に結合する能力を測定することは、例えば、試験化合物を放射性同位元素または酵素標識とカップリングして、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分への試験化合物の結合を、複合物中の標識化合物を検出することにより測定できるようにする。例えば、試験化合物を、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃまたは^３Ｈで直接的にまたは間接的に標識し、そして放射性同位元素を放射線放射の直接計数またはシンチレーション計数により検出する。これに代えて、試験化合物を、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼにより酵素的に標識し、そして適切な基質の生産物への変換の測定により酵素標識を検出する。ある実施態様では、アッセイは、膜結合型のＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を、ＦＧＦ−ＣＸに結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成して、アッセイ混合物を試験化合物と接触し、そして試験化合物があるＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に、既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０２４８】
もう一つの実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、膜結合型のＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調整する（例えば促進または阻害する）能力を測定することを含む。試験化合物がＦＧＦ−ＣＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調整する活性を測定することは、例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質があるＦＧＦ−ＣＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することにより達成し得る。本明細書において使用する「標的分子」とは、自然界にあるＦＧＦ−ＣＸタンパク質が結合または相互作用する分子、例えば、あるＦＧＦ−ＣＸと相互作用するタンパク質を発現する細胞表面の分子、２番目の細胞表面の分子、細胞外の環境中の分子、細胞膜の内側表面と会合している分子または細胞質の分子である。ＦＧＦ−ＣＸの標的分子は、非ＦＧＦ−ＣＸ分子または本発明のあるＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。一つの実施態様では、あるＦＧＦ−ＣＸの標的分子は、細胞外のシグナル（例えば、膜結合ＦＧＦ−ＣＸ分子への化合物の結合により発生するシグナル）を細胞膜を通してかつ細胞内への伝達を促進する情報伝達経路の成分である。標的は、例えば、触媒活性を有する２番目の細胞内タンパク質または下流のシグナル分子とＦＧＦ−ＣＸとの会合を促進するタンパク質であり得る。
【０２４９】
ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を、あるＦＧＦ−ＣＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することは、直接的な結合を測定する上述の方法の一つにより達成し得る。一つの実施態様では、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質があるＦＧＦ−ＣＸの標的分子と結合または相互作用する能力を測定することは、標的分子の活性を測定することにより達成することができる。例えば、標的分子の活性を、標的の細胞性第二のメッセンジャー(即ち、細胞内Ｃａ^２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ_３等)の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒／酵素活性を検出すること、受容体遺伝子(検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼ、をコードする核酸に機能し得るように結合したＦＧＦ−ＣＸ応答性調節要素を含む)の誘導を検出すること、または細胞応答、例えば、細胞の生存、細胞の分化、または細胞の増殖、を検出することにより測定し得る。
【０２５０】
なおもう一つの実施態様では、本発明のアッセイは無細胞アッセイであって、あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を測定することを含む。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質への試験化合物の結合を、上述のように、直接的または間接的のどちらかで測定することができる。一つのそのような実施態様では、アッセイは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＦＧＦ−ＣＸと結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、および試験化合物があるＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０２５１】
なおもう一つの実施態様では、アッセイは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質の活性を調整する（例えば促進または阻害する）能力を測定することを含む無細胞アッセイである。ＦＧＦ−ＣＸの活性を調整する試験化合物の能力を測定することは、例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質があるＦＧＦ−ＣＸの標的分子に結合する活性を直接な結合を測定するために上述した方法の一つにより達成することができる。さらに別の実施態様では、試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質の活性を調節する能力を測定することは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質がさらにあるＦＧＦ−ＣＸの標的分子を調整する能力を測定することにより達成することができる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性を上述のように測定することができる。
【０２５２】
なおもう一つの実施態様では、無細胞アッセイは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＦＧＦ−ＣＸタンパク質と結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、そして試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質があるＦＧＦ−ＣＸの標的分子に優先的に結合するかまたはその活性を調整する能力を測定することを含む。
【０２５３】
本発明の無細胞アッセイは、可溶性型または膜結合型のＦＧＦ−ＣＸタンパク質の両方に使用することができる。膜結合型のＦＧＦ−ＣＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、膜結合型のＦＧＦ−ＣＸタンパク質を溶液中に維持するように、可溶化剤を利用するのが望ましい。そのような可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ［登録商標］Ｘ-１００、Ｔｒｉｔｏｎ［登録商標］Ｘ-１１４、Ｔｈｅｓｉｔ［登録商標］、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)_ｎのような非イオン性界面活性剤、Ｎ−ドデシル−Ｎ,Ｎ−ジメチル−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳ)、または３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−２ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳＯ)を挙げ得る。
【０２５４】
本発明の上記のアッセイ法の二つ以上の実施態様において、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその標的分子を固相化して、一つまたは両方のタンパク質の非複合型から複合型の分離を容易にし、ならびにアッセイの自動化に適合することができる。試験化合物のＦＧＦ−ＣＸタンパク質への結合、または候補化合物存在下および非存在下でのＦＧＦ−ＣＸタンパク質と標的分子との相互作用は、反応物質を含有するのに適する任意の容器において達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心チューブを挙げ得る。一つの実施態様では、一つまたは両方のタンパク質をマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、ＧＳＴ−ＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質をグルタチオンセファローズビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）またはグルタチオンで誘導体化したマイクロタイタープレート上に吸着し、これを次いで試験化合物、または試験化合物および非吸着標的タンパク質またはＦＧＦ−ＣＸタンパク質のどちらかと結合し、そして混合物を複合体形成を促進する条件下で（例えば、塩およびｐＨに関して生理的な条件で）インキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレート穴を洗滌して、非結合成分を全て除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定化し、複合体を例えば上述のように、直接的にまたは間接的に測定する。これに代えて、複合体をマトリックスから解離し、そしてＦＧＦ−ＣＸタンパク質の結合または活性レベルを標準的技術を用いて測定することもできる。
【０２５５】
マトリックス上にタンパク質を固定化する他の技術をまた、本発明のスクリーニングアッセイに使用し得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその標的分子のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチニル化ＦＧＦ−ＣＸタンパク質または標的分子をビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミド)から当分野内で周知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.）を用いて調製して、ストレプトアビジンをコーティングした９６穴プレート（Pierce Chemical）の穴に固定化することができる。これに代えて、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質または標的分子と反応性であるが、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質のその標的タンパク質への結合を妨害しない抗体をプレートの穴に誘導体化して、非結合標的またはＦＧＦ−ＣＸタンパク質を抗体との結合により穴に捕捉することができる。そのような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ−固定化複合体について上述したものに加えて、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質または標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにＦＧＦ−ＣＸタンパク質または標的分子に関連した酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを挙げ得る。
【０２５６】
もう一つの実施態様では、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質発現のモジュレータを、細胞を候補化合物と接触し、細胞中のＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定する。候補化合物の存在下でのＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の非存在下でのＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次いで、候補化合物を、この比較に基づいてＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡまたはタンパク質のモジュレータとして同定し得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも多い（即ち統計的に有意に多い）ときには、候補化合物を、ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡまたはタンパク質発現の促進剤として同定する。これに代えて、ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも少ない（即ち統計的に有意に少ない）ときには、候補化合物を、ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定する。細胞中のＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルを、ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書で説明する方法により測定することができる。
【０２５７】
本発明のなおもう一つの態様では、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ（例えば米国特許番号5,283,317、Zervos, et al., 1993. Cell 72: 223-232、Madura, et al., 1993. J. Biol. Chem. 268: 12046-12054、Bartel, et al., 1993. Biotechniques 14: 920-924、Iwabuchi, et al., 1993. Oncogene 8: 1693-1696、および Brent 第ＷＯ９４／１０３００号を参照)おける「ベイトタンパク質」として使用して、ＦＧＦ−ＣＸと結合または相互作用をしてＦＧＦ−ＣＸ活性を調整する他のタンパク質(「ＦＧＦ−ＣＸ結合タンパク質」または「ＦＧＦ−ＣＸ−ｂｐ」)を同定し得る。そのようなＦＧＦ−ＣＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＦＧＦ−ＣＸ経路の上流または下流の要素としてＦＧＦ−ＣＸタンパク質によるシグナルの増幅に関与する。
【０２５８】
２ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインより成る殆どの転写因子のモジュール構成的性質に基づく。略述すれば、アッセイには２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物においては、ＦＧＦ−ＣＸをコードする遺伝子を既知の転写因子(例えば、ＧＡＬ−４)のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構築物においては、未同定のタンパク質（「プレイ」または「試料」）をコードするＤＮＡ配列ライブラリー由来のＤＮＡを、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。もし「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してＦＧＦ−ＣＸ依存性複合体を形成することができれば、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインを近くに引き寄せ得る。この近接は、転写因子に応答性の転写調節部位に機能し得るように結合したレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出し、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離し、そしてこれを用いてＦＧＦ−ＣＸと相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
本発明はさらに前述のスクリーニングアッセイにより同定する新規薬剤および本明細書に説明する処置へのその使用に関する。
【０２５９】
検出アッセイ
本明細書で同定するｃＤＮＡの一部またはフラグメント（および対応する完全な遺伝子配列）をポリヌクレオチド試薬として種々の方式で使用することができる。例として、限定は無しに、これらの配列を：（i）染色体上にそれぞれの遺伝子をマップし；かくして遺伝的疾患に関連した遺伝子領域を位置決定する；（ii）微量の生物学的試料から個体を同定する（組織タイピング）；および（iii）生物学的試料の法医学的同定を助けるために用い得る。
【０２６０】
本発明のＦＧＦ−ＣＸ配列をまた使用して、微量な生物学的試料から個体を同定し得る。この技術では、個体のゲノムＤＮＡを一つまたはそれ以上の制限酵素で消化して、サザンブロット上でプローブ結合し、同定用のユニークなバンドを生成する。本発明の配列は、ＲＦＬＰ(制限断片長多型、米国特許番号５,２７２,０５７に記載)のさらに別なＤＮＡマーカーとして有用である。
【０２６１】
さらに、本発明の配列を使用して、個体のゲノムの選択した部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を測定するさらに別な技術を提供し得る。かくして、本明細書に説明したＦＧＦ−ＣＸ配列を用いて、配列の５'末端および３'末端から二つののＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを用いて、個体のＤＮＡを増幅し、引き続いてこれをシークエンシングし得る。
【０２６２】
それぞれの個体は、対立遺伝子の違いによるそのようなＤＮＡの特徴的セットを有するため、この様式で調製した個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、特徴的個体の同定を提供し得る。本発明の配列を使用して、個体および組織由来のそのような同定配列を得ることができる。本発明のＦＧＦ−ＣＸ配列は、ヒトゲノムの部分を特徴的に表現する。対立遺伝子の変異は、これらの配列のコード化領域中にある程度起こり、そして非コード化領域中にはより大きな程度で起こる。個別のヒト間の対立遺伝子の変異は、５００塩基に約１個の頻度で起こるとみつもられる。対立遺伝子変異の多くは、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を含む単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に因る。
【０２６３】
本明細書に説明する配列のそれぞれを、個体由来のＤＮＡを同定の目的で比較し得る標準として、ある程度、使用し得る。上述した様に配列番号：１の非コード化領域にはより多くの遺伝子多型が起こるため、個体を識別するにはより少ない配列が必要である。非コード化配列は、それぞれが１００塩基の非コード化増幅配列を生じる多分１０〜１,０００個のプライマーのパネルにより個体の明白な同定を無理なく提供し得る。もし予想するコード化配列を使用すれば、明白な個体の同定のためのさらに適切なプライマーの数は５００〜２,０００である。
【０２６４】
予測医学
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス、および臨床試験のモニタリングを予後的（予測的）目的で使用し、それにより個体を予防的に処置する、予測医学の分野に関する。したがって、本発明の１つの態様は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／または核酸の発現ならびにＦＧＦ−ＣＸ活性を生物学的試料（例えば、血液、血清、細胞、組織）との関連で測定して、それにより個体が異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連した疾患または障害に罹患しているか、または障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための診断アッセイに関する。本発明はまた、個体がＦＧＦ−ＣＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための予後的(予測的)アッセイを提供する。例えば、あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の突然変異を生物学的試料中でアッセイし得る。そのようなアッセイを、予後的または予測的目的に使用し、それによりＦＧＦ−ＣＸタンパク質、核酸の発現または活性を特徴とするかまたはこれと関連する障害の発生に先立って個体を予防的に処置し得る。
【０２６５】
本発明のもう一つの態様は、個体におけるＦＧＦ−ＣＸタンパク質、核酸発現または活性を測定し、それによりその個体にとって適切な治療的または予防的な薬剤を選択する方法（本明細書では「薬理ゲノミクス」と呼称する）を提供する。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型に基づいた個体の治療的または予防的処置のための薬剤（例えば薬）の選択を可能にする（例えば、個体の遺伝子型を検査して、個体が特定の薬剤に応答する能力を測定する）。
【０２６６】
本発明のなおもう一つの態様は、薬剤（例えば、薬、化合物）が臨床試験においてＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に与える影響をモニタリングすることに関する。
これらおよび他の薬剤については以下のセクションで詳細に説明する。
【０２６７】
診断アッセイ
線維芽細胞成長因子ＦＧＦ−１ないしＦＧＦ−９は、特定の成長因子受容体を輸送する細胞において細胞増殖を一般に促進する。ＦＧＦ成長促進の実施例は、手術後の眼球前部での線維芽細胞およびケラチノサイトのような上皮細胞を含む。細胞の増殖が機能する他の条件は、腫瘍、再狭窄、乾癬、デュピュイトレン拘縮、糖尿病合併症、カポジ肉腫および関節リウマチを含む。
【０２６８】
ＦＧＦ−ＣＸは、試料または組織中の対応する線維芽細胞成長因子受容体ＣＸ（ＦＧＦＲＣＸ）を検出する本発明の方法において用いられる。方法は、細胞または組織をＦＧＦ−ＣＸと接触させること、受容体−リガンド対の形成を可能とし、任意のＦＧＦＲＣＸ：ＦＧＦ−ＣＸ対を検出することを含む。ＦＧＦ−ＣＸを含有する組成物を用いて、例えば、軟骨または骨修復を刺激するために、ＦＧＦＲＣＸ活性を増大させることができる。ＦＧＦ−ＣＸ拮抗物質またはＦＧＦ−ＣＸ結合試薬（例えば、抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体）を含有する組成物は、ＦＧＦ−ＣＸの過剰またはＦＧＦＲＣＸの過剰活性、特に多数または唯一の遺伝性外骨腫症、外反母趾変形、軟骨形成不全、滑膜骨軟骨腫症およびendochondromasにより引き起こされる疾病を処置するために用いられ得る。
【０２６９】
グリア細胞活性化因子（ＧＡＦ）およびＧＡＦをコード化するＤＮＡは、グリア細胞の成長を特異的に促進するために働く。ＧＡＦがグリア細胞の活性化を調節するために利用され得るグリア関連疾患のいくつかの実施例は、大脳傷害、大脳浮腫、老年痴呆、アルツハイマー病、糖尿病性神経障害等である。同様に、ＦＧＦ−ＣＸは、グリア細胞関連疾患の診断または処置において用いられ得る。ＦＧＦ−ＣＸのグリア細胞調節活性は、神経保護様活性としてであり、ＦＧＦ−ＣＸは、神経保護試薬として用いられ得る。グリア活性化因子として元々同定されたＦＧＦ−ＣＸのＦＧＦ−９に対する近接する相同性に起因し、ＦＧＦ−ＣＸ配列がグリア活性化因子であることを推定できる。ＦＧＦ−ＣＸは、それゆえ、グリア細胞の成長を刺激するために用いられ、大脳傷害の治癒を促進するか、または大脳浮腫、老年痴呆、アルツハイマー病、または糖尿病性神経障害を処置するために用いられ得る。
【０２７０】
ＦＧＦ−ＣＸはまた、用いて、線維芽細胞（火傷、傷、潰瘍の治癒を加速するために）、巨核球（血小板の数を増加するための）、造血細胞、免疫システム細胞、および血管の平滑筋細胞を刺激し得る。ＦＧＦ−ＣＸはまた、骨形成促進活性を有すると予測され、かつ骨折および骨粗鬆症の両方の処置に用いられ得る。ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドまたは核酸部分のアッセイは、大脳腫瘍の診断で用いられ得るし、抗体もかかる腫瘍の処置のために用いられ得る。それはまた、培養細胞の成長を促進する物質として用いられ得る。処置される疾患のタイプまたは重症度に非常に依存するが、予測投与量は、１日当たり、１ｎｇ〜０．１ｍｇ／体重である。ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、血小板増加物質、骨形成促進物質として、または大脳疾病または肝硬変のような肝障害のために用いられ得る。それらはまた、抗癌剤と一緒に用いられると癌を処置し得る。ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、またはフラグメント、誘導体、またはそれらの類似体に対して指示する抗体を、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの生物学的活性を検出または決定するため、またはＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを精製するために用いられ得る。ＦＧＦ−ＣＸの細胞成長活性を中和もするこれらの抗体は、抗癌剤として用いられ得る。
【０２７１】
全部ではないが、当分野において既知の相同タンパク質は、密接に関係し、または同一の機能を有する。例えば、Lewin, "Chapter 21: Structural Genes Belong to Families" In: Genes II, 1985, John Wiley and Sons, Inc., New Yorkを参照されたい。ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、高増殖性組織（例えば、上述のKoga et al.,を参照）で特異的に発現するべきと明らかに見られるアフリカツメガエルＸＦＧＦ−ＣＸタンパク質に非常に似ている。それゆえ、ＦＧＦ−ＣＸはまた高増殖性組織での細胞活性を調節することは推定される。従って、ＦＧＦ−ＣＸは、かかる成長が抑制または阻害された病態に打ち勝つために増殖性疾患の診断、および細胞および組織の成長の刺激において特に有用であり得る。配列番号：１のＦＧＦ−ＣＸ核酸の任意の位置に対応するオリゴヌクレオチドは、用いられて、ＦＧＦ−ＣＸ様遺伝子の発現を検出し得る。本発明のタンパク質は、タンパク質に免疫特異的に結合する抗体の産生を刺激するために用いられ得る。かかる抗体は、試料中のタンパク質の発生を検出するための免疫診断的方法で用いられ得る。本発明のタンパク質は、かかる成長が好ましいものである条件下で、細胞成長および細胞増殖を刺激するために用いられ得る。実施例は、例えば、血管新生および血小板形成、消化管の内壁、および毛包への化学療法剤の反対の毒性副作用である。それらはまた、例えば、アルツハイマー病を含む神経性疾患での新たな細胞成長を刺激するために用いられ得る。または、拮抗作用的な処置は、本発明のＦＧＦ−ＣＸ様タンパク質に免疫特異的に結合する抗体がタンパク質の特異的な成長誘導作用を抑制するので投与され得る。かかる抗体は、例えば、様々な腫瘍および良性過形成を含む増殖性疾患の処置において有用であり得る
【０２７２】
生物学的試料中におけるＦＧＦ−ＣＸの存在または非存在を検出する例示的な方法は、被験対象から生物学的試料を得ること、および生物学的試料をＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する能力のある化合物または薬剤と接触し、ＦＧＦ−ＣＸの存在が生物学的試料中で検出できるようにすることを伴う。ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの検出用の薬剤は、ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズする能力のある標識核酸プローブである。核酸プローブは、上述のように、例えば、配列番号：１の核酸のような全長ＦＧＦ−ＣＸ核酸、または少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長でそして厳密な条件下でＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドの一部である。本発明の診断的アッセイにおいて使用するための他の適当なプローブを本明細書で説明する。
【０２７３】
ＦＧＦ−ＣＸタンパク質検出用の薬剤は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')_２)を使用し得る。プローブまたは抗体に関する用語「標識」とは、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする（即ち物理的に連結する）ことによりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、ならびに直接標識したもう一つの試薬との反応性によりプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含する。間接的な標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出、および蛍光標識したストレブトアビジンで検出し得るように、ビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することを挙げ得る。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含む。即ち、本発明の検出法を使用して、インビトロおよびインビボで生物学的試料中のＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出し得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインシツハイブリダイゼーションを挙げ得る。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を挙げ得る。ＦＧＦ−ＣＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。さらに、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を検出するためのインビボ技術は、対象中へ標識抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体を導入することを含む。例えば、抗体を、対象中のその存在および位置を標準造影技術で検出し得る放射活性マーカーで標識することができる。
【０２７４】
一つの実施態様では、生物学的試料は被験対象由来のタンパク質分子を含有する。これ代えて、生物学的試料は、被験対象由来のｍＲＮＡ分子または被験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。好ましい生物学的試料は、対象より従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。
【０２７５】
もう一つの実施態様では、方法は、対照対象から対照の生物学的試料を得ること、対照試料をＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出する能力のある化合物または薬剤と、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を生物学的試料中で検出するように接触すること、および対照試料中のＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を試験試料中のＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと比較することをさらに伴う。
【０２７６】
本発明はまた、生物学的試料中のＦＧＦ−ＣＸの存在を検出するキットを包含する。例えば、キットは：生物学的試料中のＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはｍＲＮＡを検出する能力のある標識化合物または薬剤；試料中のＦＧＦ−ＣＸの量を測定する手段；および試料中のＦＧＦ−ＣＸの量を標準と比較する手段を含み得る。化合物および薬剤を適当な容器中に包装し得る。キットは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質または核酸を検出するキットの使用のための使用説明書をさらに含み得る。
【０２７７】
予後アッセイ
さらに、本明細書に説明する診断方法を利用して、異常ＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。例えば、先行の診断アッセイおよび以下のアッセイのような、本明細書で説明するアッセイを利用して、例えば、過形成、腫瘍、再狭窄、乾癬、デピュイトレン拘縮、糖尿病性合併症、または関節リウマチ等のような増殖性疾患または分化性疾患；および大脳障害、糖尿病性神経障害、大脳浮腫、老年痴呆、アルツハイマー病等のようなグリア細胞関連疾患でのＦＧＦ−ＣＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。これに代えて、予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。かくして、本発明は、試験試料を対象から得て、そして異常なＦＧＦ−ＣＸタンパク質または核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連した疾患または障害を同定する方法を提供し、そこではＦＧＦ−ＣＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象に対する診断になる。本明細書において使用する「試験試料」とは、興味のある対象から得られる生物学的試料を指す。例えば、試験試料は生物学的流体(例えば血清)、細胞試料、または組織であり得る。
【０２７８】
さらに、本明細書に説明する予後アッセイを使用して、異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連した疾患または障害を処置するために、対象に薬剤(例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の医薬候補物)を投与することができるか否かを決定し得る。例えば、そのような方法を使用して、対象の増殖性疾患、分化性疾患、グリア細胞関連疾患などのような疾患を薬剤により有効に処置するか否かを決定し得る。かくして、本発明は、試験試料を得て、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質または核酸を検出する異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連した障害を薬剤により対象を有効に処置し得るか否かを決定する方法を提供する(例えば、そこではＦＧＦ−ＣＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連した障害を処置するために薬剤を投与され得る対象に対する診断になる)。
【０２７９】
本発明の方法をまた使用してあるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子中の遺伝的損傷を検出し、それにより損傷のある遺伝子を有する対象が増殖性疾患、分化性疾患、グリア細胞関連疾患などのリスク、または病むリスクにあるか否かを決定し得る。種々の実施態様において、これらの方法は、対象由来の細胞試料中において、あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも一つの変更、またはＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の誤発現を特徴とする遺伝的損傷の存在または不在の検出を含む。例えば、そのような遺伝的損傷を、（１）あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子からの一つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失；（２）あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子への一つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加；（３）あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の一つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、（４）あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の染色体再編成、（５）あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルの変化、（６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのようなあるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の異常修飾、（７）あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（８）あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質の非野生型レベル、（９）あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の対立遺伝子欠失、および（１０）あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾の少なくとも一つの存在の確認により検出し得る。本明細書に説明するあるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の損傷を検出するために使用し得る当分野において公知の多数のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的試料は、対象から従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞を含む有核細胞を含有する任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２８０】
特定の実施態様では、損傷の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(例えば米国特許番号４,６８３,１９５および４,６８３,２０２を参照)におけるかまたはこれに代えて、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Landegran, et al., (1988). Science 241: 1077-1080、およびNakazawa, et al., (1994). PNAS. USA 91: 360-364を参照）におけるプローブ／プライマーの使用を伴うが、後者はＦＧＦ−ＣＸ遺伝子中の点突然変異検出に特に有用であり得る（Abravaya, et al., (1995). Nucl. Acids Res. 23: 675-682を参照）。この方法は、患者から細胞試料を集め、試料の細胞から核酸(例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方)を単離し、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子（もし存在するならば）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起きるような条件下で、あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子と特異的にハイブリダイズする一つまたはそれ以上のプライマーと核酸試料を接触し、そして増幅産物の存在または不在を検出し、または増幅産物のサイズを検出し、そして対照試料と長さを比較するステップを含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に説明する変異の検出に使用する任意の技術と一緒に予備的増幅ステップとして使用するのが望ましい。
【０２８１】
さらに別な増幅法としては：自己保持配列複製（Guatelli, et al., (1990). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878を参照）、転写増幅システム（Kwoh, et al., (1989). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177を参照）；Ｑβレプリカーゼ（Lizardi, et al, (1988). BioTechnology 6: 1197を参照）、または任意の他の核酸増幅法に引き続いて当業者に周知の技術を用いる増幅分子の検出を挙げ得る。これらの検出スキームは、核酸分子がごく少数で存在するならば、そのような分子の検出に特に有用である。
【０２８２】
さらに別の実施態様では、試料細胞由来のあるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子中の変異を、制限酵素切断パターンの変化により同定し得る。例えば、試料および対照のＤＮＡを単離し、増幅し（任意に）、一つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで処理し、そしてフラグメントのサイズをゲル電気泳動で測定して比較する。試料と対照のＤＮＡ間のフラグメントサイズの差は試料ＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム（例えば、米国特許番号５,４９３,５３１を参照）を使用して、リボザイム切断部位の発生または消失により特異的な変異の存在を評価し得る。
【０２８３】
他の実施態様では、ＦＧＦ−ＣＸ中の遺伝的突然変異は、試料および対照の核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを数百または数千個のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズすることにより同定することができる。例えば、Cronin, et al., (1996). Human Mutation 7: 244-255、Kozal, et al., (1996). Nat. Med. 2: 753-759を参照されたい。例えば、ＦＧＦ−ＣＸ中の遺伝的変異を、上述のCronin, et al.に記載するように光を発生するＤＮＡプローブを含有する２次元アレイ中で同定し得る。略述すれば、プローブの１番目のハイブリダイゼーションアレイを用いて、試料と対照中の長い一続きのＤＮＡをスキャンして、一連の重なり合うプローブの線形アレイを作成することにより配列間の塩基変化を同定し得る。このステップは点突然変異の同定を可能にする。これに、検出した全ての変異体または突然変異に相補的なさらに小さな特別のプローブアレイを用いることにより特定の変異の特徴化を可能にする２番目のハイブリダイゼーションを行う。それぞれの変異アレイは、一つは野生型遺伝子に相補的で、他は突然変異遺伝子に相補的な並行なプローブのセットから成る。
【０２８４】
なおもう一つの実施態様において、当分野において公知の種々のシークエンシング反応のいずれかを使用してＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を直接にシークエンシングして、試料のＦＧＦ−ＣＸの配列を対応する野生型（対照）配列と比較することにより変異を検出し得る。シークエンシング反応の例としては、Maxim and Gilbert, (1977). PNAS. USA 74: 560またはSanger, (1977). PNAS. USA 74: 5463により開発された技術に基づくものを挙げ得る。質量分析によるシークエンシング（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号; Cohen, et al., (1996). Adv. Chromatography 36: 127-162およびGriffin, et al., (1993). Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159を参照）を含む種々の自動化シークエンシング方法のいずれも診断アッセイの実施に際して利用され得ることをまた考え得る（例えば、Naeve, et al., (1995). Biotechniques 19: 448を参照）。
【０２８５】
ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子中の変異を検出する他の方法としては、切断剤からの保護を用いてＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法を挙げ得る。例えば、Myers, et al., (1985). Science 230: 1242を参照されたい。一般に、「ミスマッチ切断」の当分野の技術は、野生型ＦＧＦ−ＣＸ配列を含有する（標識した）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料より得た潜在的突然変異体のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズすることにより形成したヘテロ二重鎖を提供することから始まる。二重鎖を、対照および試料の鎖の間の塩基のミスマッチのために存在する二重鎖の単鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をＲＮａｓｅで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ_１ヌクレアーゼで処置し、ミスマッチ領域を酵素的に処理し得る。他の実施態様では、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡの二重鎖のどちらかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理し得る。ミスマッチ領域の処理の後、得られた材料を次いで変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離して変異の部位を決定する。例えば、Cotton, et al., (1988). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397、Saleeba, et al., (1992). Methods Enzymol. 217: 286-295を参照されたい。一つの実施態様では、対照のＤＮＡまたはＲＮＡを検出用に標識し得る。
【０２８６】
なおもう一つの実施態様では、ミスマッチ切断反応は、細胞の試料より得られたＦＧＦ−ＣＸｃＤＮＡ中で点突然変異を検出しマッピングするために、規定したシステム中で二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する一つまたはそれ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を使用する。例えば、E. coliのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシダーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを切断する。例えば、Hsu, et al., (1994). Carcinogenesis 15: 1657-1662を参照されたい。例示的な実施態様によれば、あるＦＧＦ−ＣＸ配列、例えば、野生型ＦＧＦ−ＣＸ配列に基づくプローブを、試験細胞（複数を含む）由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物とハイブリダイズする。この二重鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理して、切断生産物をもしあれば電気泳動のプロトコール等から検出し得る。例えば、米国特許番号５,４５９,０３９を参照されたい。
【０２８７】
他の実施態様では、電気泳動上の移動度の変化を用いて、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の突然変異を同定する。例えば、単鎖コンフォーメーション多型（ＳＳＣＰ）を使用して、突然変異体および野生型核酸の間の電気泳動移動度の差を検出し得る。例えば、Orita, et al., (1989). Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86: 2766、Cotton, (1993). Mutat. Res. 285: 125-144、Hayashi, 1992. Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79を参照されたい。試料および対照のＦＧＦ−ＣＸ核酸の単鎖ＤＮＡフラグメントを変性し、復元することを可能にする。単鎖核酸の二次構造は配列により異なり、電気泳動上の移動度のそこで得た変化はたとえ１個の塩基変化の検出をも可能にする。ＤＮＡフラグメントを標識プローブで標識または検出し得る。アッセイの感度を、２次構造が配列変化により感受性であるＲＮＡ（ＤＮＡよりもむしろ）を使用することにより増大し得る。一つの実施態様では、主題の方法は、ヘテロ二重らせん分析を利用して、電気泳動の移動度の変化に基づいて二重らせんへテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Keen, et al., (1991). Trends Genet. 7: 5を参照されたい。
【０２８８】
なおもう一つの実施態様では、ある勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲル中での突然変異体または野生型フラグメントの移動を、変性濃度勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)を用いてアッセイする。例えば、Myers, et al., (1985). Nature 313: 495を参照されたい。ＤＧＧＥを分析法として使用する際、ＤＮＡを修飾し、例えば、凡そ４０ｂｐの高融点ＧＣ富化ＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲで付加することにより、それが完全に変性しないことを保証する。さらなる実施態様では、変性勾配に代えて温度勾配を使用して、対照および試料のＤＮＡの移動度の差を同定する。例えば、Rosenbaum and Reissner, (1987). Biophys. Chem. 265: 12753を参照されたい。
【０２８９】
点突然変異を検出するための他の技術の例として、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長を挙げ得るが、これらに限定しない。例えば、既知の変異を中央に置いたオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全なマッチが見られる場合にのみハイブリダイゼーションを認める条件下で、標的ＤＮＡとハイブリダイズする。例えば、Saiki, et al., (1986). Nature 324: 163、Saiki, et al., (1989). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230を参照されたい。オリゴヌクレオチドをハイブリダイズ用膜に付着して、標識した標的ＤＮＡとハイブリダイズする際、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅した標的ＤＮＡまたはある数の異なる突然変異体とハイブリダイズする。
【０２９０】
これに代えて、選択的ＰＣＲ増幅に基づく対立遺伝子特異的増幅技術を本発明と一緒に使用し得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、興味のある変異を分子の中央で（増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように；例えば、Gibbs, et al., (1989). Nucl. Acids Res. 17: 2437-2448を参照）または適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を阻止または低減できる（例えば、Prossner, (1993). Tibtech. 11: 238を参照）一つのプライマーの３'最末端において保持していてもよい。加えて、切断に基づく検出を創成するために、変異の領域に新規制限部位を導入するのが望ましい。例えば、Gasparini, et al., (1992). Mol. Cell Probes 6: 1を参照されたい。特定の実施態様では、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを使用して実施され得ることを予想する。例えば、Barany, (1991). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189を参照されたい。このような場合には、５'末端配列の３'末端に完全なマッチがある場合にのみ連結が起こり、増幅の存在または不在を調べることにより特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０２９１】
本明細書に説明する方法を、例えば、本明細書に説明する少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含むプレパック診断キットを利用することにより実施し得る。これを、例えば、臨床の場においてＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の関与する疾患または疾病の症状を示すかまたは家族歴のある患者を診断するのに簡便に使用し得る。
【０２９２】
さらに、ＦＧＦ−ＣＸを発現する任意の細胞タイプまたは組織、好ましくは末梢血白血球を本明細書に説明した予後アッセイに利用し得る。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞の有核細胞を含む任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２９３】
薬理ゲノミクス
本明細書に説明したスクリーニングアッセイにより同定するようなＦＧＦ−ＣＸ活性(例えば、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現)に促進的または阻害的効果を有する薬剤またはモジュレータを個体に投与し、異常ＦＧＦ−ＣＸ活性よ関連する疾患（例えば、神経性疾患、癌関連疾患、または妊娠性疾患）を（予防的にまたは治療的に）処置することができる。そのような処置と一緒に、個体の薬理ゲノミクス(即ち、個体の遺伝子型および外来性化合物または薬に対するその個体の応答との間の関係の研究)を考慮し得る。治療薬の代謝の差は、薬理学的に活性な薬の用量と血中濃度の関係を変えることにより、重症の毒性または治療の失敗をもたらし得る。かくして、個体の薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型の考慮に基く予防的または治療的処置ための有効な薬剤(例えば薬)の選択を許容する。そのような薬理ゲノミクスをさらに用いて、適切な投与量および治療方法を決定し得る。したがって、個体のＦＧＦ−ＣＸタンパク質の活性、ＦＧＦ−ＣＸ核酸の発現、またはＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の変異の含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置に適切な薬剤（複数を含む）を選択し得る。
【０２９４】
薬理ゲノミクスは、罹患した人における変化した薬剤分布および異常な作用に因る薬への応答における臨床的に有意な遺伝的変異を取り扱う。例えば、Eichelbaum, 1996. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 23: 983-985; Linder, 1997. Clin. Chem., 43: 254-266を参照されたい。一般に、二つのタイプの薬理遺伝学的異常を区別し得る。薬が身体に作用する方式を変える単一の因子として伝達する遺伝的異常（変化した薬剤作用）または身体が薬に作用する方式を変える単一因子として伝達する遺伝的異常（変化した薬物代謝）がある。これらの薬理遺伝学的異常は、稀な欠陥または多型性のどちらかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）欠乏症は、よくみられる遺伝性酵素異常症であり、そこでは主な臨床的合併症は、酸化剤の薬（抗マラリア剤、スルホンアミド剤、鎮痛剤、ニトロフラン類）摂取後またはソラマメ摂食後の溶血である。
【０２９５】
例示的実施態様として、薬の代謝酵素の活性は、薬の作用の強度および持続の両者の主たる決定因子である。薬の代謝酵素の遺伝的多型性（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）ならびにチトクロームＰ４５０酵素のＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の発見は、なぜ或る患者は標準かつ安全用量の薬物摂取後に期待した薬の効果を得られないかまたは過大な薬の応答および重篤な毒性を示すのかについての説明を提供する。これらの多型性を、人口集団で高代謝群（ＥＭ）および低代謝群（ＰＭ）の２つの表現型で表現する。ＰＭの存在比率は異なる集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型性で、そして幾つかの変異が、機能的なＣＹＰ２Ｄ６の不在をもたらすＰＭを同定する。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、標準的な用量の投与を受けた際、極めて頻繁に過剰な薬の応答および副作用を経験する。代謝物が活性な治療成分であるならば、ＣＹＰ２Ｄ６が生成する代謝物モルヒネにより仲介するコデインの鎮痛作用について実証するように、ＰＭは治療応答を示さない。それと全く正反対なのが、標準の用量に応答しないいわゆる超高速代謝群である。最近、超高速代謝群の分子的根拠をＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に因ると確認した。
【０２９６】
従って、個体のＦＧＦ−ＣＸタンパク質の活性、ＦＧＦ−ＣＸ核酸の発現、またはＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の変異含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置のために適切な薬剤（複数を含む）を選択し得る。加えて、薬理遺伝学的研究を用いて、薬の代謝酵素をコードする遺伝子多型の対立遺伝子の遺伝子型決定を、個体の薬の応答性の表現型の同定に応用し得る。この知識を投与量および薬の選択に応用する際、本明細書で説明する例示的スクリーニングアッセイの一つにより同定したモジュレータのようなＦＧＦ−ＣＸモジュレータで対象を処置する際に、有害作用または治療失敗を避け、かくして治療的または予防的効率を増強し得る。
【０２９７】
臨床作用のモニタリング
ＦＧＦ−ＣＸの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調整する活性）に対する薬剤（例えば、薬、化合物）の影響をモニタリングすることは、基礎的な薬のスクリーニングに応用できるだけでなく、また臨床試験にも応用できる。例えば、本明細書に説明したようにスクリーニングアッセイにより、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加し、またはＦＧＦ−ＣＸ活性を上方調節すると決定した薬剤の有効性を、低下したＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または下方制御されたＦＧＦ−ＣＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。これに代えて、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを減少し、またはＦＧＦ−ＣＸ活性を下方調節すると決定した薬剤の有効性を、増加したＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または上方制御したＦＧＦ−ＣＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。そのような臨床試験において、ＦＧＦ−ＣＸ、および、好ましくは、例えば、細胞増殖性疾患または神経障害性疾患に関係する他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の免疫応答性の「読み出し」またはマーカーとして使用し得る。
【０２９８】
例えば、ＦＧＦ−ＣＸ活性（例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定する）を調整する薬剤（例えば、化合物、薬または低分子）を用いた処置により細胞中で調整するＦＧＦ−ＣＸを含む遺伝子を同定し得る。従って、細胞増殖障害に対する薬剤の効果を、例えば、臨床試験において検討するために、細胞を単離してＲＮＡを調製し、そして障害に関連すると思うＦＧＦ−ＣＸおよび他の遺伝子の発現レベルを分析し得る。遺伝子発現レベル（即ち、遺伝子発現パターン）を、本明細書に説明するようにノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲにより、またはこれに代えて本明細書で説明する方法の一つにより生産したタンパク質の量を測定することにより、またはＦＧＦ−ＣＸまたは他の遺伝子の活性レベルを測定することにより、定量することができる。この様式においては、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての役割を果たす。したがって、薬剤による個体の処置の前および処置中の種々の時点で、この応答状態を測定し得る。
【０２９９】
一つの実施態様において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチドミメティック、低分子、または本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した他の薬候補物）で対象を処置することの有効性をモニターする方法を提供し、その方法は、(i)薬剤投与前に対象から投与前試料を得て、(ii)投与前試料中のＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し、(iii)対象から一つまたはそれ以上の投与後の試料を得て、(iv)投与後の試料中のＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを検出し、(v)投与前の試料中のＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを投与後のひとつまたは複数の試料中のＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較し、そして(vi)それにしたがって対象への薬剤の投与を変更するステップを含む。例えば、ＦＧＦ−ＣＸの発現または活性を検出したより高レベルに増加するためには、即ち、薬剤の有効性を増加するためには、薬剤の増加した投与が望ましい。これに代えて、ＦＧＦ−ＣＸの発現または活性を検出したより低レベルに減少する、即ち、薬剤の有効性を減少するためには、薬剤の減少した投与が望ましい。
【０３００】
処置方法
本発明は、異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連した疾患のリスクにある（感受性）かまたは疾患を有する対象を処置する予防的方法および治療的方法の両方を提供する。
【０３０１】
増加したレベル（疾患または障害に罹患していない対象と比べて）または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性に拮抗する（即ち、低下するかまたは阻害する）治療薬で処置し得る。活性に拮抗する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、(i)ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメントまたは相同体；(ii) ＦＧＦ−ＣＸペプチドに対する抗体；(iii) ＦＧＦ−ＣＸペプチドをコードする核酸；(iv)アンチセンス核酸およびＦＧＦ−ＣＸペプチドの内在的機能を相同組換えにより「ノックアウト」するのに使用する「機能障害性」である核酸（即ち、ＦＧＦ−ＣＸペプチドに対するコード化配列のコード化配列内への異種挿入に因る）の投与（例えば、Capecchi, 1989. Science 244: 1288-1292を参照）；または(v) ＦＧＦ−ＣＸペプチドおよびその結合相手との相互作用を変化するモジュレータ（即ち、本発明のさらに別なペプチドのミメティックまたは本発明のペプチドに特異的な抗体を含む阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト）を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０３０２】
減少したレベル（疾患または障害に罹患していない対象と比べて）または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性を増加する（即ち、アゴニストである）治療薬で処置し得る。活性を上方制御する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、ＦＧＦ−ＣＸペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメント、または相同体；またはバイオアベイラビリティーを増加するアゴニストを挙げ得るが、これらに限定しない。
【０３０３】
増加または減少したレベルを、患者の組織試料（例えば、生検組織から）を得て、インビトロでＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現したペプチド（またはＦＧＦ−ＣＸペプチドのｍＲＮＡ）の構造および／または活性をアッセイすることにより、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することにより容易に検出し得る。当分野内で周知の方法としては、イムノアッセイ（例えば、ウエスタンブロット分析、免疫沈降とそれに引き続くドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学、等）および／またはｍＲＮＡ発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インシツハイブリダイゼーション、等）を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０３０４】
一つの態様では、異常なＦＧＦ−ＣＸ発現または少なくともあるＦＧＦ−ＣＸ活性を調整する薬剤を対象に投与することにより、本発明は、異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連した疾患または異常を、対象において予防する方法を提供する。異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性が原因または一因となって生じる疾患のリスクを有する対象を、例えば、本明細書で説明するように診断的アッセイまたは予後的アッセイのいずれかまたはそれらの組合せによって同定し得る。疾患または障害を予防し、または、これに代えて、その進行を遅らせるようにＦＧＦ−ＣＸ異常に特徴的な症状の出現に先立って予防的薬剤の投与を行い得る。ＦＧＦ−ＣＸ異常のタイプに依存して、例えば、あるＦＧＦ−ＣＸアゴニストまたはＦＧＦ−ＣＸアンタゴニストである薬剤を対象の処置に使用し得る。適切な薬剤を、本明細書で説明するスクリーニング法に基づいて決定することができる。本発明の予防的方法をさらに以下のサブセクションで考察する。
【０３０５】
治療的方法
本発明のもう一つの態様は、治療目的のためにＦＧＦ−ＣＸの発現または活性を調整する方法に関する。本発明の調整方法は、細胞を細胞に関連するＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性の一つまたはそれ以上の活性を調整する薬剤と接触することを含む。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性を調整する薬剤は、核酸またはタンパク質、あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質の天然に存在する同属のリガンド、ペプチド、あるＦＧＦ−ＣＸペプチドミメティック、または低分子のような本明細書に説明する薬剤であり得る。一つの実施態様では、薬剤は一つまたはそれ以上のＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性を促進する。そのような促進的薬剤の例としては、活性なＦＧＦ−ＣＸタンパク質および細胞中に導入したＦＧＦ−ＣＸをコードする核酸分子を挙げ得る。もう一つの実施態様では、薬剤は一つまたはそれ以上のＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性を阻害する。そのような阻害的薬剤の例としては、アンチセンスＦＧＦ−ＣＸ核酸分子および抗−ＦＧＦ−ＣＸ抗体を挙げ得る。これらの調整方法は、インビトロで（例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより）または、これに代えて、インビボで（例えば、薬剤を対象に投与することにより）実施し得る。このように、本発明はあるＦＧＦ−ＣＸタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。一つの実施態様では、その方法は、薬剤（例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した薬剤）またはＦＧＦ−ＣＸの発現または活性を調整する（例えば、上方制御または下方制御する）薬剤の組合せを投与することを伴う。もう一つの実施態様では、その方法は減少または異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性を補償するための治療としてあるＦＧＦ−ＣＸタンパク質または核酸分子を投与することを伴う。
【０３０６】
実施例
実施例１．ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の同定
ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を、クエリーとしてアフリカツメガエルＦＧＦ−ＣＸを有するＧｅｎｂａｎｋヒトゲノムＤＮＡ配列（Koga, et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 261, 756-765；受託番号ＡＢ０１２６１５）の検索である、ＴＢＬＡＳＴＮ（Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410）に従い、同定した。この検索により、染色体８上の高相同性の遺伝子座（受託番号ＡＢ０２０８５８）を同定した。イントロン／エキソン境界を、既知のＦＧＦ由来の相同体と共に、標準コンセンサススプライスパラメーター(Mount (1996) Science 271, 1690-1692)を用いて推定した。ＦＧＦ−ＣＸ開始コドンは、ＡＢ０２０８５８配列の１６２１４ｂｐに位置し、このエキソンの残存３’部分は、１５９３０ｂｐに続く。ＦＧＦ−ＣＸの５’ＵＴＲは、公開ＥＳＴ（受託番号ＡＡ２３２７２９、ＡＡ２３６５２２、ＡＩ２７２８７６およびＡＩ２７２８７８）を用いて別の６０６ｂｐにより、開始コドンの上流に伸長した。遺伝子座ＡＢ０２０８５８に関する様にＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の残存構造は、以下にの通りである：イントロン１（１５９２９〜９９４２ｂｐ）；エキソン２（９９４１〜９８３８ｂｐ）；エキソン３（７４９９ｂｐで開始し、表１３において示す様に続く；３’非翻訳領域の構造がまだ決定されていない）。表１３は、ＦＧＦ−ＣＸのヌクレオチド（配列番号：２５）配列および推定アミノ酸（配列番号：２）配列を含むＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の解析である。開始コドンおよび停止コドンは、はっきりしており、５’ＵＴＲに備わるインフレームの停止コドンに下線を引いてある。
【０３０７】
表１３
【表１７】

【０３０８】
上述の段落の方法により発見した遺伝子は、３つのエキソンおよび２つのイントロンを含む（表１３）。ＤＮＡ配列は、開始メチオニンの１１７ｂｐ上流のインフレームの停止コドンを有する２１１アミノ酸残基のＯＲＦを予測する。探し出された遺伝子由来のＤＮＡセグメントは、放射線ハイブリッド解析により確認された位置である染色体８ｐ２１．３〜ｐ２２に位置する（実施例２参照）。
【０３０９】
Ｇ−Ｘ−［ＬＩ］−Ｘ−［ＳＴＡＧＰ］−Ｘ（６，７）−［ＤＥ］−Ｃ−Ｘ−［ＦＬＭ］−Ｘ−Ｅ−Ｘ（６）−Ｙである、ＦＧＦの特別のモティーフを、ＰＲＯＳＩＴＥ検索(Bucher & Bairoch (1994) Ismb. 2, 53-61)により同定し、二重下線を引いたアミノ酸残基１２５〜１４８間に位置し、イントロン／エキソンの境界は、矢印で表す。イントロン１および２は、それぞれ５９８８ｂｐおよび２３３８ｂｐの長さである。５’ＵＴＲ配列は、公開ＥＳＴに由来し、全体としては示していない。
【０３１０】
実施例２．ＦＧＦ−ＣＸの放射線ハイブリッドマッピング
ヒト染色体マーカーを用いる放射線ハイブリッドマッピングを、ＦＧＦ−ＣＸについて行った。用いた方法は、Steen, RG et al. (A High-Density Integrated Genetic Linkage and Radiation Hybrid Map of the Laboratory Rat, Genome Research 1999 (Published Online on May 21, 1999)Vol. 9, AP1-AP8, 1999)に記載されるものと類似である。無作為放射線誘導ヒト染色体フラグメントを含有する９３細胞クローンのパネルを特徴的な方法で検索したクローンを同定するためにデザインされたＰＣＲプライマーを用いて９６ウェルプレート中でスクリーニングした。同定したＦＧＦ−ＣＸをコード化するヌクレオチド配列由来のＤＮＡセグメントを、染色体８ｐ２１．３〜ｐ２２へのマッピングとして注釈をつけた。この結果を、マーカーＡＦＭ１７７ＸＢ１０にオーバーラップすし、かつマーカーＷＩ−５１０４由来の１．６ｃＲおよびマーカーＷＩ−９２６２由来の３．２ｃＲである遺伝子座にある染色体８に位置するＦＧＦ−ＣＸの発見による本解析により、絞り込んだ。
【０３１１】
実施例３．ＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコード化する配列の分子クローニング
オリゴヌクレオチドプライマーを、オープンリーディングフレームを表し、全長ＦＧＦ−ＣＸをコードする、ＤＮＡセグメントのＰＣＲにより増幅のためにデザインした。順方向プライマーは、ＢｇｌＩＩ制限部位（ＡＧＡＴＣＴ）および一致コザック配列（ＣＣＡＣＣ）を含む。逆方向プライマーは、さらなるサブクローニング目的のためのインフレームのＸｈｏＩ制限部位を含有する。順方向および逆方向プライマーの両方は、５’クランプ配列（ＣＴＣＧＴＣ）を含有する。プライマーの配列は、以下である：
ＦＧＦ−ＣＸ 順方向：５’−ＣＴＣＧＴＣ ＡＧＡＴＣＴ ＣＣＡＣＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＣＣＣ ＴＴＡ ＧＣＣ ＧＡＡ ＧＴＣ−３’（配列番号：３）
ＦＧＦ−ＣＸ 逆方向：５’−ＣＴＣＧＴＣ ＣＴＣＧＡＧ ＡＧＴ ＧＴＡ ＣＡＴ ＣＡＧ ＴＡＧ ＧＴＣ ＣＴＴ Ｇ−３’（配列番号：４）
【０３１２】
ＰＣＲ反応を、５０μｌの用量中の全部で５ｎｇのヒト前立腺ｃＤＮＡ鋳型、それぞれ１μＭのＦＧＦ−ＣＸ順方向およびＦＧＦ−ＣＸ逆方向プライマー、５μｍｏｌのｄＮＴＰ（Clontech Laboratories, Palo Alto CA）および１μｌの５０×Advantage-HF2ポリメラーゼ（Clontech Laboratories）を用いて実施した。以下のＰＣＲ反応条件を用いた：
ａ） ９６℃ ３分
ｂ） ９６℃ ３０秒 変性
ｃ） ７０℃ ３０秒 プライマーアニーリング この温度を１℃／サイクルにより徐々に下げた。
ｄ） ７２℃ １分 伸長
ステップ（ｂ）〜（ｄ）を１０回繰り返す
ｅ） ９６℃ ３０秒 変性
ｆ） ６０℃ ３０秒 アニーリング
ｇ） ７２℃ １分 伸長
ステップ（ｅ）〜（ｇ）を２５回繰り返す
ｈ） ７２℃ ５分 最終伸長
【０３１３】
約６４０ｂｐの予測した配列を有するシングルＰＣＲ産物を、アガロースゲルの電気泳動後単離し、ｐＣＲ２．１ベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）に結合させた。クローン化したインサートを、ベクターに特異的なＭ１３順方向（〜４０）Ｍ１３逆方向プライマーを用いて配列決定し、ヌクレオチド配列が上流ＢｇｌＩＩクローニング部位と下流ＸｈｏＩ部位との間に直接挿入された表１の配列（配列番号：１）に１００％同一であることを確認した。クローン化配列は、予測ＦＧＦ−ＣＸ全長タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを構成する。クローンをＴＡ−ＡＢ０２０８５−Ｓ２７４−Ｆ１９と呼ぶ。
【０３１４】
実施例４．哺乳類発現ベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃの調製
オリゴヌクレオチドプライマーｐＳｅｃ−Ｖ５−Ｈｉｓ 順方向（ＣＴＣＧＴ ＣＣＴＣＧ ＡＧＧＧＴ ＡＡＧＣＣ ＴＡＴＣＣ ＣＴＡＡＣ（配列番号：１４）およびｐＳｅｃ−Ｖ５−Ｈｉｓ 逆方向（ＣＴＣＧＴ ＣＧＧＧＣ ＣＣＣＴＧ ＡＴＣＡＧ ＣＧＧＧＴ ＴＴＡＡＡ Ｃ（配列番号：１５）を、Ｖ５およびＨｉｓ６を含むｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５Ｈｉｓ（Invitrogen, Carlsbad, CA）発現ベクター由来のフラグメントを増幅するためにデザインした。ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩおよびＡｐａＩで切断し、Ｉｇκリーダー配列にある（Invitrogen, Carlsbad CA）ＸｈｏＩ／ＡｐａＩ切断ｐＳｅｃＴａｇ２ Ｂベクター に結合させた。インフレームのＩｇκリーダーおよびＶ５−Ｈｉｓ６を含む結果として得たベクターｐＳｅｃＶ５Ｈｉｓの正しい構造を、ＤＮＡ配列分析により確認した。ベクターｐＳｅｃＶ５Ｈｉｓを、正しいフレーム中の上記エレメントを保持するフラグメントを提供するためにＰｍｅＩおよびＮｈｅＩで切断した。ＰｍｅＩ−ＮｈｅＩフラグメントをＢａｍＨＩ／クレノーおよびＮｈｅＩ処理ベクターｐＣＥＰ４（Invitrogen, Carlsbad, CA）に結合した。結果として得たベクターをｐＣＥＰ４／Ｓｅｃと名付け、ベクターは、インフレームのＩｇκリーダー、該クローンの挿入部位、およびＰＣＭＶおよび／またはＰＴ７プロモーターの制御下のＶ５エピトープ６×Ｈｉｓを含んでいる。ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃは、任意のタンパク質をＩｇκ鎖シグナルペプチドに続く多型クローニング部位に融合されることにより異種性タンパク質の発現および分泌を可能とする発現ベクターである。発現タンパク質の検出および精製は、Ｃ末端にあるＶ５エピトープ標識（Invitrogen, Carlsbad, CA）および６×Ｈｉｓ標識の存在により助けられる。
【０３１５】
実施例５．ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞でのＦＧＦ−ＣＸの発現
ＦＧＦ−ＣＸ配列を含有するＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ＴＡ−ＡＢ０２０８５−Ｓ２７４−Ｆ１９（実施例３）から単離し、発現ベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸを生成するためにＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ切断ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃにサブクローン化した。ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸベクターを、製造元（Gibco/BRL/Life Technologies, Rockville, MD）の指示に従い、LipofectaminePlus試薬を用いて２９３細胞に形質移入した。細胞ペレットおよび上清を、形質移入後７２時間で回収し、抗Ｖ５抗体でのウェスタンブロット（還元条件）によりＦＧＦ−ＣＸ発現を調べた。図２は、ＦＧＦ−ＣＸを、２９３細胞により分泌された約３４ｋＤＡタンパク質である見かけ上の分子量（Ｍｒ）を有するポリペプチドとして発現することを示す。
【０３１６】
実施例６．E.coliでのＦＧＦ−ＣＸの発現
ベクターｐＲＳＥＴＡ（InVitrogen Inc., Carlsbad, C）を、ＸｈｏＩおよびＮｃｏＩ制限酵素で切断した。配列５’ ＣＡＴＧＧＴＣＡＧＣＣＴＡＣ ３’（配列番号：１６）および５’ ＴＣＧＡＧＴＡＧＧＣＴＧＡＣ ３’（配列番号：１７）のオリゴヌクレオチドリンカーを、３７℃でアニーリングし、ＸｈｏＩ−ＮｃｏＩで処理したｐＲＳＥＴＡに結合させた。結果として得たベクターを、制限分析および配列決定により確認し、ｐＥＴＭＹと名付けた。ＦＧＦ−ＣＸをコード化する配列のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメント（実施例３参照）を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で切断されたベクターぺＴＭＹに結合させた。発現ベクターを、ｐＥＴＭＹ−ＦＧＦ−ＣＸと名付ける。このベクターにおいて、ｈＦＧＦ−ＣＸを、Ｎ末端の６×Ｈｉｓ標識おとびＴ７エピトープに融合させた。プラスミドｐＥＴＭＹ−ＦＧＦ−ＣＸを、そこでE.coli発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３、ｐＬＹｓ）（Novagen, Madison, WI）に形質移入し、タンパク質ＦＧＦ−ＣＸの発現を製造元の指示により誘導した。誘導後、全細胞を回収し、タンパク質を抗ＨｉｓＧｌｙ抗体（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いるウエスタンブロットにより分析した。図３は、ＦＧＦ−ＣＸをＭｒ約３２ｋＤａとして発現することを示す。
【０３１７】
実施例７．クローン化シグナルペプチドを伴なう組換えＦＧＦ−ＣＸタンパク質および伴なわない組換えＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現の比較
ａ）シグナルペプチドを伴なわない発現
本発明の詳細な説明で言及した様に、ＦＧＦ−ＣＸは、古典的なアミノ末端シグナル配列を明らかに欠いている。ＦＧＦ−ＣＸが、哺乳類細胞から分泌されるか否かを決定するために、全長ＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコード化するＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントとして得たｃＤＮＡを、ＴＡ−ＡＢ０２０８５−Ｓ２７４−Ｆ１９（実施例３）からＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ切断ｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen）にサブクローンした。これは、ｐＦＧＥ−ＣＸと名付けられた哺乳類発現ベクターを提供する。この構造は、同定および精製のそれぞれにおいて確認されるためにタンパク質のカルボキシ末端にＶ５エピトープ標識およびポリヒスチジン標識を取り込み、約２７ｋＤａのポリペプチドを生成するはずである。２９３ヒト胚腎臓細胞への一過性の形質移入の後、培養上清を形質移入後４８時間で回収した。
【０３１８】
培養上清へのＦＧＦ−ＣＸの分泌に加えて、細胞ペレット／ＥＣＭと関連することも分かった（データは示していない）。ＦＧＦは、細胞表面および細胞外基質（ＥＣＭ）ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合することが知られているので、本発明者は、ＦＧＦ−ＣＸをこの方法で解離することが可能かを調べた。最後に、ＦＧＦ−ＣＸで形質移入した細胞を成長因子とＨＳＰＧとの低親和性の相互作用を分断することが知られている化合物である、１００Ｍの スラミンを含有する０．５ｍｌのＤＭＥＭでの３０分間、４℃での処理により抽出した(La Rocca, R.V., Stein, C.A. & Myers, C.E. (1990) Cancer Cells 2, 106-115)。スラミンで抽出した培養上清を、次に回収し、遠心分離（５分；２００×ｇ）により明らかにした。
【０３１９】
培養上清およびスラミン抽出物を次に、同量の２×ゲルローディングバッファーと混合した。試料を、１０分間沸騰させ、還元条件下で４〜２０％の勾グラジエントポリアクリルアミドゲル（Novex, Dan Diego, CA）上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースフィルター（Novex）にトランスファーした。ウエスタン分析を、ＨＲＰ結合抗Ｖ５抗体（Invitrogen）およびＥＣＬ検出システム（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を用いる標準方法により実施した。
【０３２０】
予測Ｍｒを有する１つのバンドを、ｐＦＧＦ−ＣＸで形質移入した２９３細胞由来の培養上清で同定した（図１Ａ、レーン１）。対照ベクターで形質移入した細胞由来の培養上清は、抗体と反応しなかった（図１Ａ、レーン５）。スラミン処置の後、有意な量のＦＧＦ−ＣＸが、細胞表面／ＥＣＭから実際に放出され得ることがわかった。このことは、ＨＳＰＧがこのタンパク質の隔離において働きそうであることを示す（図１Ａ、レーン２）。これらの結果は、ＨＧＦ−ＣＸが古典的なシグナルペプチドを伴なわず分泌され得ることを示す。
【０３２１】
組換えＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、ＤＮＡ合成、細胞増殖、細胞表面受容体へのＦＧＦ−ＣＸの高親和性結合を経由して仲介され、およびＨＳＰＧとの低親和性相互作用を経由して調節されるべき作用を刺激する。スラミン抽出物のデータは、ＦＧＦ−ＣＸが細胞表面および／またはＥＣＭに存在するＨＳＰＧに結合することを示す。
【０３２２】
ｂ）シグナルペプチドを伴なう発現
タンパク質分泌を増強するゴールで、ＦＧＦ−ＣＸｃＤＮＡをＩｇκ遺伝子由来の切断可能なアミノ末端分泌シグナル配列と共にインフレームで融合させた、構造（ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸ）を生成した。結果として得られるタンパク質はまた、ｐＦＧＦ−ＣＸについて上述したようにカルボキシ末端のＶ５およびポリヒスチジン標識を含有していた。２９３細胞への形質移入に続き、約３１ｋＤａの予測Ｍｒを有するタンパク質産物を得た。スラミンが有意な量の解離ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を放出することが再び分かった（図１Ａ、レーン３および４）。予測した様に、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸは、ｐＦＧＦ−ＣＸより可溶性の高いＦＧＦ−ＣＸタンパク質を生成した。
２９３細胞について上述したものと同様の結果を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞でも得た（図１Ｂ）。
【０３２３】
実施例８．ＰＣＲによるＦＧＦ−ＣＸ核酸のリアルタイム定量的発現解析
様々なクローンの定量的発現を、４１の正常試料および５５の腫瘍試料（多くの場合、図４のパネルＡおよびＢにおいて表す試料が、表１４において同定されたものである。）において、Perkin-Elmer Biosystems ABI PRISM［登録商標］７７００配列検出システムで実施するリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＮ［登録商標］分析）により評価した。表１４において、以下の略語を用いた：
ｃａ．＝癌腫
^＊＝転移から確立された
s cell var＝小細胞変異体
non-s＝non-sm＝非小細胞
squam＝扁平上皮
pl. eff＝pl effusion＝胸膜浸出液
glio＝神経膠腫
astro＝星細胞腫、および
neuro＝神経芽細胞腫
【０３２４】
第１に、９６ＲＮＡ試料をβアクチンおよびグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対して標準化した。ＲＮＡ（〜５０ｎｇ トータルまたは〜１ｎｇ ｐｏｌｙＡ^＋）を、ＴＡＱＭＡＮ［登録商標］逆転写試薬キット（PE Biosystems, Foster City, CA；カタログ番号Ｎ８０８−０２３４）および製造元のプロトコールによるランダム６量体化を用いてｃＤＮＡに転換した。反応を、２０μｌで実行し、３０分間、４８℃でインキュベートした。ｃＤＮＡ（５μｌ）を次に、製造元のプロトコールにより、βアクチンおよびＧＡＰＤＨ ＴＡＱＭＡＮ［登録商標］アッセイ試薬（PE Biosystems；それぞれ、カタログ番号４３１０８８１Ｅおよび４３１０８８４Ｅ）およびＴＡＱＭＡＮ［登録商標］universal PCR Master Mix(PE Biosystems；カタログ番号４３０４４４７)を用いるＴＡＱＭＡＮ［登録商標］反応のための分離プレートに移した。反応を、以下のパラメーターを用いて２５μｌで実施した：５０℃で２分；９５℃で１０分；９５℃で１５秒／６０℃で１分（４０サイクル）。結果を、ｌｏｇスケールを用いるＣＴ値（与えられた試料が蛍光の閾値を横切るサイクル）として、与えられた試料とΔＣＴの値に対して２として表される最も低いＣＴ値を有する試料とのＲＮＡ濃度の差で記録した。パーセント比較発現を、次にこのＲＮＡの差の逆数を求め、かつ１００倍することにより得られた。β−アクチンおよびＧＡＰＤＨについて得られた平均ＣＴ値を用いて、ＲＮＡ試料を標準化した。最も高いＣＴ値を生成するＲＮＡ試料は、さらなる希釈を必要としない一方で、他の全部の試料をβ−アクチン／ＧＡＰＤＨ平均ＣＴ値によりこの試料と比べて希釈した。
【０３２５】
標準化ＲＮＡ（μｌ）をｃＤＮＡに変換してOne Step RT-PCR Master Mix Reagent（PE Biosystems；カタログ番号４３０９１６９）および製造元の指示により遺伝子特異的なプライマーをを用いるＴＡＱＭＡＮ［登録商標］を経由して分析した。プローブおよびプライマーを、Perkin Elmer Biosystemのプライマー発現ソフトウエアパッケージ（version I for Apple Computer's Macintosh Power PC）により、クローン１０３２６２３０．０．３８の配列を入力として用いて互いのアッセイのためデザインした。デフォルト設定を反応条件のために用いて、以下のパラメーターをプライマー選択の前に設定した：プライマー条件＝２５０ｎＭ、プライマーメルティング温度（Ｔｍ）範囲＝５８℃〜６０℃、プライマー最適Ｔｍ＝５９℃、最大プライマー温度差＝２℃、プローブが５’Ｇを有さない、プローブＴｍがプライマーのＴｍより１０℃高くなければならない、増幅サイズが７５ｂｐ〜１００ｂｐである。選択したプローブおよびプライマー（以下を参照）をSynthegen （Houston, TX, USA）により合成した。プローブをＨＰＬＣにより二重精製して、未結合のダイを取り除き、質量分析法により評価して、プローブの５’末端および３’末端、それぞれに対する受容体とクエンチャーダイとのカップリングを示した。それらの最終濃度は、順方向プライマーおよび逆方向プライマーがそれぞれ９００ｎＭ、およびプローブが２００ｎＭであった。
【０３２６】
ＰＣＲのため、それぞれの組織および細胞株由来の標準化ＲＮＡを９６穴ＰＣＲプレート（Perkin Elmer Biosystems）の各ウエルにスポットした。２つのプローブ（１つはＦＧＦ−ＣＸに特異的であり、２つめは内部標準として機能する遺伝子特異的プローブ）を含むＰＣＲカクテルをPE Biosystems 7700の１×ＴａｑＭａｎ［登録商標］PCR Master Mixを用いて、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ（１：１：１：２の割合のｄＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）、０．２５Ｕ／ｍｌ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ［登録商標］（PE Biosystems）、および０．４Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅインヒビター、および０．２５Ｕ／μｌ 逆転写酵素で設定した。逆転写を、４８℃で３０分間のあと、以下のような：９５℃１０分、次に９５℃１５秒、６０℃１分の４０サイクルの増幅／ＰＣＲサイクルにより実施した。
【０３２７】
表１４．ＴａｑＭａｎ発現解析において用いた組織試料
【表１８】

【０３２８】
表１４の続き
【表１９】

【０３２９】
本発明において開示される線維芽細胞成長因子２０様遺伝子は、少なくとも以下の組織において発現する：哺乳動物組織、大腸、肺、脳、肝臓、腎臓、および胃。発現情報は、ＣｕｒａＧｅｎ ＡＣＣ番号ＣＧ５３１３５−０２の配列の誘導において含まれる配列の組織供給源由来であった。
【０３３０】
以下のプライマーおおびプローブをデザインした。それぞれ、ＦＧＦ−ＣＸに特異的であるために、非常に相同であるヒトＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１６遺伝子の対応する領域の３つのミスマッチの最小値を有する。セットＡｇ８１ｂは、表１の塩基２７０〜塩基３４３（配列番号：１）由来の領域を覆う。それは他の既知のＦＧＦファミリーメンバーを決して検出しない。利用したプライマーおよびプローブは：
Ａｇ８１ｂ（Ｆ）：５’−ＧＧＡＣＣＡＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＧＧＴＡ−３’（配列番号：１８）；
Ａｇ８１ｂ（Ｒ）：５’−ＴＧＴＣＣＡＣＡＣＣＴＣＴＡＡＴＡＣＴＧＡＣＣＡＧ−３’（配列番号：１９）；および
Ａｇ８１ｂ（Ｐ）：５’−ＦＡＭ−ＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号：２０）である。
【０３３１】
代表的な実験結果を図４、パネルＡおよびＢにおいて示す。発現を、最も高いレベルの発現を示す試料のパーセンテージとしてプロットする。４回の反復実施を行い、様々な斜線であらわした。調べた３９のヒト正常組織において、ＦＧＦ−ＣＸは、脳、特に小脳において最も高発現することが分かった（図４、パネルＡおよびＢ）。中枢神経系の他の組織は、ずっと低いレベルのＦＧＦ−ＣＸを発現した。調べた５４のヒト腫瘍細胞のうち、ＦＧＦ−ＣＸは、肺癌腫細胞株（ＬＸ−１）、大腸癌腫細胞株（ＳＷ−４８０）、大腸癌細胞株および転移（ＳＷ４８０）および胃癌腫細胞株（ＮＣＩ−Ｎ８７；図４、パネルＡおよびＢを参照）において、最も高発現することがわかった。
【０３３２】
別のリアルタイム発現分析を、手術において得た腫瘍組織の広範なパネルで行った。これらの組織は、実際の腫瘍本体から得られた部分、らびに「正常隣接組織（ＮＡＴ）」と名付けられた部分を含む、典型的に既に炎症しており異形性の組織学的な証拠を示す。ＦＧＦ−ＣＸに特異的であるように選択されたプライマーとプローブのセット（Ａｇ８１）を、かかる外科手術の組織試料でのＴａｑＭａｎ実験において用いた。２度の反復実施を行った：
Ａｇ８１（Ｆ）：５’−ＡＧＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＡＧＡＴＡＧＡＴ−３’（配列番号：２１）；
Ａｇ８１（Ｒ）：５’−ＡＧＣＡＧＣＴＴＴＡＣＣＴＣＡＴＴＣＡＣＡＡＴＧ−３’（配列番号：２２）；および
Ａｇ８１（Ｐ）：ＴＥＴ−５’−ＣＣＡＴＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＡＧＡＡ−３’−ＴＡＭＲＡ（配列番号：２３）
【０３３３】
セットＡｇ８１は、表１の塩基４７７〜塩基５５４（配列番号：１）由来の領域を覆う。複製を。図４、パネルＣおよびＤにおいてグレーおよび黒の斜線として示す。結果は、腫瘍とそれらの形質異常ＮＡＴ試料の多くの対応ペアーについて、ＦＧＦ−ＣＸは、ＮＡＴにおいて高発現するが、腫瘍においては発現しないこと；さらに特異的には、腫瘍に隣接する実質細胞においては発現することを劇的に示す。この対応パターンが生じる実施例は、卵巣癌、子宮癌、肺癌、前立腺癌および肝臓癌を含む。
【０３３４】
それにより制限されることなく、図４における結果、パネルＣおよびパネルＤから、ＦＧＦ−ＣＸが腫瘍上皮および／または宿主組織中の他の成分（内皮細胞、胃線維芽細胞、非浸潤上リンパ球、および類似の細胞タイプ）のパラクリン刺激による腫瘍進行の原因となり得ることがわかる。同じく、ＦＧＦ−ＣＸは、オートクライン方法でのＦＧＦ−ＣＸ合成または分泌する宿主組織中の成分を刺激するために機能しうる。これらの宿主成分細胞は、腫瘍成分で引き続いてふるまう。
【０３３５】
ＦＧＦ−ＣＸの高発現特徴は、腫瘍進行の予測する働きまたは促進する働きをする非対応正常組織に関係する。それゆえ、多くの標的アプローチ（制限されない例として、モノクローナル抗体、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、同族受容体とのＦＧＦ−ＣＸの相互作用を中和するペプチド、およびＦＧＦ−ＣＸの未同定受容体を調節する小薬を含む。）のいずれかを用いるＦＧＦ−ＣＸの治療標的を予測し、標的は疾病の進行へのポジティブな治療の影響を有する。同じく、腫瘍進行でのＦＧＦ−ＣＸの生物活性を調節するような物質の使用を予測し、通常の化学療法および放射線療法にシナジーを与えるか、または増強させる。ＦＧＦ−ＣＸの治療標的が適用される特異的な疾病の同一性は、大腸、前立腺、胚、腎臓、子宮、乳房、膀胱、卵巣の腺癌を含む
【０３３６】
実施例９．組換えＦＧＦ−ＣＸによるブロモデオキシウリジン取込刺激
２９３ＥＢＮＡ細胞（Invitrogen）を、製造元のプロトコール（Life Technologies, Gaithersburg, MD）により、Lipofectamine 2000を用いて形質移入した。細胞を、形質移入後の５時間、１０％子ウシ血清（FBS; Life Technologies）で補った。ＢｒｄＵおよび成長アッセイ（実施例１０）のタンパク質を生成するために、細胞を洗浄し、形質移入後１８時間、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM; Life Technologies）を与えた。４８時間後、培地を除去し、細胞単層を０．５ｍｌＤＭＥＭ中１００μＭスラミン（Sigma, St. Louis, MO）で、３０分、４℃でインキュベートした。スラミン抽出培養上清を、次に取り除き、遠心分離（５分；２０００×ｇ）により明らかにして、製造元の指示により、カルボキシ末端ポリヒスチジン標識を利用するＴＡＬＯＮメタルアフィニティークロマトグラフィー（Clontech, Palo Alto, CA）の対象とした。保留融合タンパク質を、イミダゾールでのカラム洗浄により放出させた。
【０３３７】
ＦＧＦ−ＣＸタンパク質濃度を、既知の濃度のＶ５標識タンパク質で作成された標準曲線を用いるウエスタン分析により推定した。ウエスタン分析のため、培養上清を形質移入後４８時間で回収し、細胞単層を、１００μＭのスラミンを含有する０．５ｍｌのＤＭＥＭで、３０分間４℃でインキュベートした。スラミン含有培養上清を次に回収した。
【０３３８】
対照タンパク質を生成するために、２９３−ＥＢＮＡ細胞を、ｐＣＥＰ４プラスミド（Invitrogen）で形質移入し、上でアウトラインを記載した精製方法の対象とした。
【０３３９】
組換えＦＧＦ−ＣＸを、ＤＮＡ合成を誘導する能力についてブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取込アッセイにおいて試験した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８、American Type Culture Collection, Manassas, VA）、ＣＣＤ−１０７０ｓｋ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２０９１）またはＭＧ−６３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４２７）を、９６ウエルプレートにて１００％の密集度まで培養し、ＤＭＥＭで洗浄し、ＤＭＥＭ中で２４時間（ＮＩＨ３Ｔ３）または４８時間（ＣＣＤ−１０７０ｓｋおよびＭＧ−６３）血清飢餓状態にした。組換えＦＧＦ−ＣＸまたは対照タンパク質を、次に細胞に１８時間添加した。ＢｒｄＵアッセイを、製造元（Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN）の説明により、５時間ＢｒｄＵ取込時間を用いて実施した。
【０３４０】
ＦＧＦ−ＣＸが、ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞において〜５ｎｇ／ｍｌの最大半分の濃度で、ＤＮＡ合成を誘導することが分かった（図５のパネルＡ）。対照的に、対照ベクターで形質移入した細胞から精製したタンパク質は、ＤＮＡ合成を誘導しなかった。ＦＧＦ−ＣＸが、ＢｒｄＵ取込により決定された様に、ＣＣＤ−１０７０ｓｋ正常ヒト皮膚線維芽細胞（図５、パネルＢ）、ＣＣＤ−１１０６ケラチノサイト（図５、パネルＣ）、ＭＧ−６３骨肉腫細胞（データは示していない）、および乳房上皮細胞を含む様々なヒト細胞株での比較可能な投与レベルで、ＤＮＡ合成を誘導することも分かった。
【０３４１】
実施例１０．組換えＦＧＦ−ＣＸによる細胞増殖の誘導
組換えＦＧＦ−ＣＸが細胞増殖を誘導するかを決定するため、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を６ウェルプレート中で５０％の密集度まで培養し、ＤＭＥＭで洗浄し、組換えＦＧＦ−ＣＸまたは対照タンパク質を含有するＤＭＥＭを４８時間与え、次にカウントした。細胞数を、細胞をトリプシン処理し、Beckman Coulter Z1シリーズのカウンター（Beckman Coulter, Fullerton, CA）でカウントすることにより決定した。このアッセイにおいてＦＧＦ−ＣＸが、対照タンパク質と比べ細胞数で約３倍の増加を誘導することが分かった（図６）。
【０３４２】
増殖での形態的変化を測定するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＤＭＥＭ／２％子ウシ血清中の組換えＦＧＦ−ＣＸまたは対照タンパク質で処理し、Zeiss Axiovert 100顕微鏡（Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY）で写真撮影した。
【０３４３】
より高い細胞密度（図６）にいたることに加えて、実施例９で記載した様に調製したＦＧＦ−ＣＸの存在下で培養したＮＩＨ３Ｔ３細胞は、接触阻害の減少を示す、成長の整理されていないパターンを表した（図７）。さらに、個々の細胞は、細長くかつ屈折していることが分かった。これらの結果は、ＦＧＦ−ＣＸが成長因子としてふるまうことを示し、組換えＦＧＦ−ＣＸがＮＩＨ３Ｔ３細胞の形態的な形質転換を仲介することを示す。
【０３４４】
実施例１１．ヌードマウスでの異所性ＦＧＦ−ＣＸで形質移入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞による腫瘍形成
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、製造元のプロトコール（Life Technologies）により、Lipofectamine Plusを用いて、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸまたは対照ベクターで形質移入した。細胞に形質移入後５時間で、１０％子ウシ血清（CS; Life Technologies）を添加した。ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸで形質移入された細胞は、形質移入後４８時間までに形態的に形質転換され、ハイグロマイシン含有成長培地中でのセレクションの２週間後でも残っていることがわかった。対照的に、対照ベクターえ形質移入された細胞は、正常な形態を保持していた（データは示していない）。従って、形質移入された細胞は、例えば、実施例１０において報告した実験に基づいて予測される様にふるまう。
【０３４５】
異所性腫瘍の誘導を研究するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、様々な実験ベクターおよび対照ベクターで形質移入した。形質移入後２日で、細胞を、ＤＭＥＭ／５％ＣＳ（ｐＦＧＦ−ＣＸで形質移入した細胞用）または５００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを添加したＤＭＥＭ／１０％ＣＳ（ｐＳＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸで形質移入した細胞）のいずれかに置いた。培養２週間後、半分密集した細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ／１０％で中和し、ＰＢＳで洗浄してカウントした。ＰＢＳ中の１００万個の細胞を、メス胸腺欠損ヌードマウス（Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME）の側方皮下組織に注入した。
【０３４６】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＦＧＦ−ＣＸ発現プラスミド（ｐＦＧＦ−ＣＸおよびｐＩｇκ―ＦＧＦ−ＣＸ）またはそれらの適当な対照ベクターで形質移入した。ＦＧＦ−ＣＸ発現ベクターのいずれかで形質移入された細胞を、形質移入後４８時間までに形態学的に形質転換し（データは示していない）、組換えＦＧＦ−ＣＸにさらされた後に生成されたものと類似のフェノタイプを有することが分かった（図６）。対照的に、対照ベクターで形質移入された細胞は、正常な形態を保持していた（データは示していない）。
【０３４７】
ＦＧＦ−ＣＸの異所性発現がインビボにおいてＮＩＨ３Ｔ３細胞の腫瘍形成を誘導するかを決定するために、安定な形質移入体を生成し、ヌードマウスの皮下に注入した。１１日までに、ｐＦＧＦ−ＣＸまたはｐＩｇκ−ＦＧＦ−ＣＸのいずれかで形質移入した細胞で注入した全ての動物が、１４日までに急激な腫瘍サイズの増大を有し、一方で、対照細胞で注入された動物のいずれもが ２週間までに腫瘍を発生しなかった（図８）。対照処理を受けたあるマウスおよびＦＧＦ−ＣＸベクターで形質移入した細胞を受けた別のマウスの写真を、図９に示す。これらの結果は、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を有するベクターとの形質移入により形質移入された細胞が、インビボでの腫瘍発生および腫瘍成長を促進することを示す。
【０３４８】
実施例１２．ＦＧＦ−ＣＸの発現
ＦＧＦ−ＣＸは、実施例６において記載される様に、本来発現する。タンパク質を、Ｎｉ^２＋アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、還元条件と非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥの対象とし、クーマシーブルーを用いて染色した。結果を、図１０において示す。それは、両方の条件下で見られ、タンパク質は、約２９〜３０ｋＤａの見かけ上の分子量と共に移動する。
【０３４９】
実施例１３．組換えＦＧＦ−ＣＸによるブロモでオキシウリジン取込刺激
ＢｒｄＵの取込についての用量反応実験を、ヒト腎臓癌腫細胞（786-0; American Type Culture Collection, Manassas, VA）を用いて行った。結果を図１１において示す。ＦＧＦ−ＣＸは、「２０８５８」と名付けられる。ＦＧＦ−ＣＸは、約２．５ｎｇ／ｍｌである半分作用する用量で対照よりは４倍より多く、腎臓癌腫細胞の増殖を刺激することが分かる。
【０３５０】
実施例１４．ＦＧＦ−ＣＸで形質移入された細胞でのインビトロでの病巣形成
培養における異所性ＦＧＦ−ＣＸ発現の細胞成長への作用を評価するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＦＧＦ−ＣＸ発現プラスミド（図１２においてｐＦＧＦ−２０およびｐＩｇκ−κ−ＦＧＦ−ＣＸ−２０として同定した。実施例７を参照）または対照ベクターで形質移入した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、製造元のプロトコール（Life Technologies）により、Lipofectamine-Plusを用いて形質移入した。細胞を、形質転換後５時間で１０％子ウシ血清（CS; Life Technologies）で補足した。形質移入後２日で、細胞を、９０ｍｍディッシュに移し、子ウシ血清をプラスしたＤＭＥＭで２週間培養した。細胞を、次に０．２％クリスタルヴァイオレット／７０％エタノール溶液で染色し、写真撮影した。９０ｍｍディッシュそれぞれは、１．５μｇのプラスミドＤＮＡで形質移入された３５ｍｍディッシュ由来の細胞の半分を表す。
【０３５１】
２つのＦＧＦ−ＣＸ発現ベクターいずれかで形質移入された細胞は、形質移入後約２週間で形態的に形質導入された細胞の病巣を生成するが、一方で対照ベクターで形質移入された細胞は正常形態を維持していることがわかった（図１２）。ｐＩｇκ−ＦＧＦ−２０構造は、密集に起因し、見られるイメージにおいて小さい病巣の形成において、ｐＦＧＦ−２０構造より有意により効率的であるように改善した（図１２参照）。
【０３５２】
実施例１５．ＦＧＦ−ＣＸの受容体結合特異性
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、形態形成、細胞の分化、血管形成、組織リモデリング、炎症、腫瘍形成を含む様々な機能において重要な働きをする。ＦＧＦは、普通の３次構造を有する保存１２０アミノ酸ＦＧＦコアドメインを含有する。ＦＧＦシグナル伝達を、一般に膜貫通型チロシンキナーゼ受容体の活性化により生じると予測する。ＦＧＦＲ１ないしＦＧＦＲ４である、４つの受容体を同定し、活性化受容体変異または不活性化受容体変異を、マウスおよびハムスターの両方でこれらの遺伝子のサブセットについて記載した。
【０３５３】
ＦＧＦ−ＣＸの受容体結合特異性を測定するために、組換えＦＧＦ−ＣＸによりＮＩＨ３Ｔ３細胞でのＤＮＡ合成の誘導への可溶性ＦＧＦ−ＣＸ受容体（ＦＧＦＲ）の作用を調べた。４つの受容体を、今日までに同定した(Klint P and Claesson-Welsh L. Front. Biosci., 4: 165-177, 1999; Xu X, et al. Cell Tissue Res., 296: 33-43, 1999)。ＦＧＦＲ１β（IIIc）、ＦＧＦＲ２α（IIIb）、ＦＧＦＲ２β（IIIb）、ＦＧＦＲ２α（IIIc）、ＦＧＦＲ３α（IIIc）およびＦＧＦＲ４の可溶性受容体を利用した。これらＦＧＦＲのそれぞれの可溶性型は、ＦＧＦ−ＣＸの生物学的活性化を特異的に阻害できることが分かった（図１３を参照）。完全阻害またはほぼ完全な阻害を、可溶性ＦＧＦＲ２α（IIIb）、ＦＧＦＲ２β（IIIb）、ＦＧＦＲ２α（IIIc）、およびＦＧＦＲ３α（IIIc）で得たが、一方で、部分的な阻害を、可溶性ＦＧＦＲ１β（IIIc）およびＦＧＦＲ４で成し遂げた。可溶性受容体物質のいずれもが、それにより、それらの特異性を示す、ＰＤＧＦ−ＢＢによるＤＮＡ合成の誘導での妨害をしなかった。それぞれの可溶性受容体物質の完全性を、分析下でずべてのＦＧＦＲと相互作用すると知られている因子であるａＦＧＦ（酸性ＦＧＦ）によるＤＮＡ合成の誘導を阻害する能力を示すことにより示した。
【０３５４】
実施例１６．ＦＧＦ−ＣＸのＮ末端欠損型のクローニングおよび発現
プラスミドｐＥＴ２４ａ−ＦＧＦ２０Ｘ−ｄｅｌ１５４コドンを宿すE.colli菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Invitrogen）を、ＬＢ培地中で、３７℃で成長させた。このプラスミドは、位置５５で宿すＦＧＦ−ＣＸのＣ末端部分をコード化する。細胞の密集度が０．６ＯＤに達したときに、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように加えた。誘導培養液を、次に追加の４時間、３７℃でインキュベートした。細胞を、３０００×ｇ、１５分間、４℃での遠心分離により回収し、ＰＢＳに縣濁し、次にマイクロ流動化（microfluidizer）を介して２つの層で分離した。可溶性タンパク質および非可溶性タンパク質を分離するために、溶解物を、１０，０００×ｇ、２０分間、４℃で遠心分離の対象とした。非溶解性分画（ペレット）を、１Ｍ Ｌアルギニンを含有するＰＢＳで抽出した。残存非可溶性物質を、次に遠心分離により除去し、アルギニン抽出の可溶性分画を、０．２μ低タンパク質結合膜を介してフィルター処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。結果を、産物が約２０ｋＤａの見かけ上の分子量（矢印参照）を有するポリペプチドであることを示す図１４に示す。発現ポリペプチドのＮ末端配列決定は、ＦＧＦ−ＣＸの残基５５〜６９（表１、配列番号：２）に１００％同一である配列ＡＱＬＡＨＬＨＧＩＬＲＲＲＱＬを提供する。
【０３５５】
実施例１７．ＦＧＦ−ＣＸの切断型に対する応答でのＮＩＨ３Ｔ３細胞へのブロモデオキシウリジン取込刺激
ＦＧＦ−ＣＸの残基２４〜２１１（（ｄ１〜２３）ＦＧＦ−ＣＸ；表１および配列番号：２）を発現するベクターを調製した。この切断型を取り込むベクターを用いて得た条件培地で処理したＮＩＨ３Ｔ３細胞によるＢｒｄＵの取込を、全長ＦＧＦ−ＣＸをコード化するベクターを用いて条件培地での処置への応答での取込と比較した。この実験を実施例９において記載した様に行った。
【０３５６】
結果を、図１５において示す。（ｄ１〜２３）ＦＧＦ−ＣＸは、最も低濃度１０ｎｇ／ｍｌで試験した場合に高活性を維持する。この濃度で、全長ＦＧＦ−ＣＸの活性は、非常に低下し、対照のレベルに接近する。（ｄ１〜２３）ＦＧＦ−ＣＸは、全長ＦＧＦ−ＣＸより少なくとも５倍の活性化であり得ることを推定する。
【０３５７】
実施例１８．ＦＧＦ−ＣＸ変異体ＣＧ５３１３５−０２のクローニングおよび発現
線維芽細胞成長因子２０様タンパク質の変異体をコード化するヌクレオチド配列は、受託番号ＣＧ５３１３５−０２と関連し、同定された。受託番号ＣＧ５３１３５−０２の配列は、配列のコンピューターでの予測によるｃＤＮＡフラグメントの実験室でのクローニングによりもたらされた。ＤＮＡ配列の全長または配列の一部のいずれか、または両方を覆うｃＤＮＡフラグメントをクローン化した。コンピュータでの予測は、ＣｕｒａＧｅｎ専売配列データベースまたは公開ヒト配列データベースにおいて利用可能な配列に基づき、全長ＤＮＡ配列、またはそれらのいくつかの部分のいずれかを提供した。実験室のクローニングを、以下に要約する１またはそれ以上の方法を用いて実行した。
【０３５８】
SeqCalling［登録商標］技術：ｃＤＮＡは、多様な組織タイプ、正常および疾病状態、病態、および異なるドナー由来の発生状態を表す様々なヒト試料からもたらされた。試料を、全体として、一次細胞または一次細胞または細胞株を培養した組織として得た。細胞および細胞株を、遺伝子発現を制御する生物学的物質または化学的物質、例えば、成長因子、ケモカイン、またはステロイドで処理した。従って、もたらされたｃＤＮＡをＣｕｒａＧｅｎの専売SeqCalling技術を用いて配列決定した。配列トレースを手動で評価し、適切な場合、訂正のため編集した。時としてヒト公開配列を含む、全試料由来のｃＤＮＡ配列を、互いのアセンブリーのための共通配列を生むためのバイオインフォマティックプログラムを用いて、一緒に集めた。それぞれのアセンブリーを、ＣｕｒａＧｅｎコーポレーションのデータベースに含む。配列を、互いの成分との同一性の伸展が少なくとも５０ｂｐを超える９５％である場合、アセンブリーのための成分として含んだ。それぞれのアセンブリーは、遺伝子またはそれらの部分を表し、スプライスフォーム１塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠損および他の配列変異体のような、変異体の情報を含む。
【０３５９】
エキソン結合：ＣＧ５３１３５−０２配列をコードするｃＤＮＡを、プライマー：５’−ＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＴＡＴＴＧＧＣ−３’（配列番号：２６）および５’−ＣＴＧＴＣＴＧＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＴＴＣＴＴＧＡＴＣ−３’（配列番号：２７）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりクローン化した。プライマーを、本発明のｃＤＮＡ／タンパク質配列の全長またはある部分（１またはそれ以上のエキソン）のコンピューターでの予測に基づいてデザインした。これらのプライマーを用いて、以下の組織由来の発現ヒト配列を含有するプールからｃＤＮＡを増幅した：副腎、骨髄、脳−扁桃体、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児の脳、胎児の腎臓、胎児の肝臓、胎児の肺、心臓、腎臓、リンパ腫−Ｒａｊｉ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管および子宮。
【０３６０】
多数のクローンを配列決定し、時として公開ヒト配列を含むこれらのフラグメントを、互いのアセンブリーのため共通配列を生むためのバイオインフォマティックプログラムを用いて一緒に集めた。それぞれのアセンブリーは、ＣｕｒａＧｅｎのデータベースに含まれる。配列を、互いの成分との同一性の伸展が、少なくとも５０ｂｐを超える９５％である場合、アセンブリーの成分として含まれる。互いのアセンブリーは、それらの遺伝子またはタンパク質を表し、スプライスフォーム１塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠損および他の配列変異体のような変異体の情報を含む。
【０３６１】
物理的クローン：全オープンリーディングフレームを覆う、エキソン結合によりもたらされたＰＣＲ産物を、クローン１３７６２７：：１６００８３８７４．Ａ９を提供するためにInvitrogenのｐＣＲ２．１ベクターにクローン化した。
【０３６２】
新規線維芽細胞成長因子２０様遺伝子のＤＮＡ配列およびタンパク質配列を、エキソン結合により得た。ＣｕｒａＧｅｎ受託番号ＣＧ５３１３５−０２として本明細書において報告する。
【０３６３】
新規線維芽細胞成長因子２０様タンパク質（配列番号：２９）をコード化する５４０ヌクレオチド（ＣｕｒａＧｅｎ受託番号ＣＧ５３１３５−０２と名付けられた）の新規核酸（配列番号：２８）を、表１５に示す。オープンリーディングフレームを、ヌクレオチド１〜３で始まり、ヌクレオチド５３８〜５４０で終わることを同定した。このポリペプチドは、新規線維芽細胞成長因子２０様タンパク質を表す。オープンリーディングフレームの開始コドンおよび停止コドンは、太字で強調する。推定の非翻訳領域（下線）は、もしあれば、開始コドンから上流および終止コドンから下流で見つかる。１７９アミノ酸残基を有するコード化タンパク質を、表１６において１文字コードを用いて表す。
【０３６４】
表１５．本発明の線維芽細胞成長因子２０様タンパク質をコード化するヌクレオチド配列（配列番号：２８）
【表２０】

【０３６５】
表１６．上記の表１５において示されたヌクレオチド配列によりコード化されるタンパク質配列（配列番号：２９）
【表２１】

【０３６６】
配列データベース検索において、例えば、本発明の核酸配列が、Homo sapiens（ＦＧＦ−２０のHomo sapiens mRNA,完全コード領域）由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ ＩＤ：ＡＢ０４４２７７｜ａｃｃ：ＡＢ０４４２７７．１ｍＲＮＡに同一な５０６のうち４９５塩基（９７％）を有することがわかった（表１０）。本発明のタンパク質の全長アミノ酸配列は、Homo sapiens（ヒト）由来の２１１アミノ酸残基ｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｑ９ＮＰ９５タンパク質（線維芽細胞成長因子２０（ＦＧＦ−２０））に同一な１６２のうち１６０のアミノ酸残基（９８％）を有し、類似の１６２のうち１６０のアミノ酸残基（９８％）を有することが分かった（表１０）。
【０３６７】
多様な配列アラインメントを、本発明のタンパク質を本発明のタンパク質を関連タンパク質配列と比較したClustalW解析において第１の線で示す、表１７に示す。この配列が、位置２０〜５１で示された様に線維芽細胞成長因子のスプライスフォームを表すことに注意されたい。
【０３６８】
表１７．ＣＧ５３１３５−０２タンパク質と関連するタンパク質のClustalWアラインメント
【表２２】

【０３６９】
表１７において示すアラインメントにおいて、黒で輪郭を描かれたアミノ酸残基は、配列（すなわち、構造的性質または機能的性質を保つことを必要とされ得る残基）間で完全に保存された残基を示し；グレーの背景を伴うアミノ酸残基は、タンパク質構造または機能が変わらない（例えば、群Ｌ、Ｖ、ＩおよびＭを類似であるとみなされる）同程度の物理的性質および／または化学的性質を有する配列間で互いに類似である；および白の背景を伴うアミノ酸残基は、配列間で保存されないか、あるいは類似でない。
【０３７０】
本明細書において開示するタンパク質中の同定可能なドメインの存在を、Ｐｆａｍ、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＰｒｏＤｏｍ、ＢｌｏｃｋまたはＰｒｉｎｔのようなドメインデータベースに対する検索により決定し、プロリン間のドメイン受託番号により同定した。有意な一致を、表１８において要約する様に、ＩＰＲ００２２０９；（ＨＢＧＦ＿ＦＧＦ）ドメインに対して見た。
【０３７１】
表１８．ＣＧ５３１３５−０２のドメイン解析
【表２３】

【０３７２】
ＩＰＲ００２２０９；（ＨＢＧＦ＿ＦＧＦ）ヘパリン結合成長因子ＩおよびＩＩ（ＨＢＧＦ）（中胚葉起源または神経外胚葉起源の広範なバラエティーに富む細胞の成長または刺激を促進する構造上関連するマイトジェンである酸性および塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）としても知られる。例えば、Burgess & Maciag, 1989参照。）Annu. Rev. Biochem. 58: 575-606; Thomas 1988 Trends Biochem. Sci. 13: 327-328を参照。これらの２つのタンパク質は、成長因子ファミリーに属し、インターロイキン１タンパク質、Ｋｕｎｉｔｚタイプダイズトリプシン阻害剤（ＳＴＩ）およびヒスタクトフィリン（histactophilin）も含有するスーパーファミリーのメンバーである腫瘍形成に属する。
全てが非常に小さな構造を有するが、ＨＢＧＦおよびインターロイキン１ファミリーは配列類似性（約２５％）を共有するけれど、ＳＴＩに対して全く示さない。例えば、Burgess & Maciag, 1989) Annu. Rev. Biochem. 58: 575-606; Thomas 1988 Trends Biochem. Sci. 13: 327-328; Heath et al. 1995 Curr. Biol. 5: 500-507; Matthews et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 3441-3445; Murzin 1992 J. Mol. Biol. 223: 531-543; Gimenez-Gallego et al. 1985 Science 230: 1385-1388; Copeland et al. 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 9850-9857;およびAyres et al. 1994 Virology 202: 586-605を参照されたい。
【０３７３】
ＨＢＧＦは、細胞の分化および成長調節に関連する多くの分化過程において含まれる。例えば、Burgess & Maciag, 1989) Annu. Rev. Biochem. 58: 575-606を参照されたい。ＨＢＧＦ１およびＨＢＧＦ２は、類似の作用を有する：それらは、胚形成での中胚葉形成を誘導し、傷修復、血管新生、神経細胞の伸長を仲介する；それらはまた、線維芽細胞、内皮細胞、およびアストログリア細胞の増殖および遊走を誘導する。ＨＢＧＦ３（ｉｎｔ−２）およびＨＢＧＦ４（ｈｓｔ／ｋｓ）は、それぞれ胃癌およびカポジ肉腫由来の既知の癌遺伝子である。ＨＢＧＦおよびＨＢＧＦ６はまた、癌遺伝子産物である。ケラチノサイイト成長因子である、ＨＢＧＦ７は、正常上皮細胞増殖の主要なパラクリンエフェクターである。
【０３７４】
これらの成長因子は、細胞内シグナル伝達えお導く、それらのチロシンキナーゼ受容体上の２量体化を引き起こす。線維芽細胞成長因子の４つの既知のチロシンキナーゼ受容体が現在存在する。これらの受容体は、このファミリーのいくつかの異なるメンバーにそれぞれ結合する。例えば、Heath et al. 1995 Curr. Biol. 5: 500-507を参照されたい。
【０３７５】
ＨＢＧＦ１およびＨＢＧＦ２の結晶構造を溶解した。例えば、Matthews et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 3441-3445を参照されたい。ＨＢＧＦ１およびＨＢＧＦ２は、インターロイキン１およびＫｕｎｉｔｚタイプダイズトリプシン阻害剤両方のような同一の１２本鎖βシート構造を有する例えば、Murzin 1992 J. Mol. Biol. 223: 531-543を参照されたい。ＨＢＧＦ１およびインターロイキン１は、類似であると分かり、類似の構造を有することを予測した。例えば、Gimenez-Gallego et al. 1985 Science 230: 1385-1388を参照されたい。βシートを、抗類似βバレルを形成する６本鎖である中心軸のまわりの３つの類似葉にアレンジする。ＨＢＧＦ１のいくつかの領域は、受容体結合、明白に、β構造１ないし３、および鎖８と９との間のループにおいて関係する。鎖１０と１１との間のループは、ヘパリン結合において関係すると考える。
【０３７６】
このことは、本発明の配列がＨＢＧＦ１様およびＨＢＧＦ２様ドメインを含有すると知られている他のタンパク質の配列と類似する性質、かつこれらのドメインの性質に類似する性質を有することを示す。
【０３７７】
本発明の核酸およびタンパク質は、様々な疾病および疾患の診断および／または処置での応用を有する。例えば、本発明の組成物は、：ヒルシュスプルング病、クローン病、虫垂炎、炎症性腸疾患、憩室疾患、全身性エリトマトーデス、自己免疫疾患、喘息、肺気腫、強皮症、アレルギー、ＡＲＤＳ、フォンヒッペルリンドウ（Von Hippel-Lindau）（ＶＨＬ）症候群、肝硬変、移植、高カルシウム血症、潰瘍、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、先天性心臓欠陥、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）チャネル欠損症、動脈管開存症、肺動脈弁狭窄、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節性硬化症、強皮症、糖尿病、自己免疫疾患、腎動脈狭窄、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎、全身性エリトマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、高カルシウム血症、アルツハイマー病、脳梗塞、結節硬化、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、脳性麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、白質萎縮症、行動障害、依存症、不安、痛み、神経変性、ならびに他の疾病、疾患、状態を病む患者の処置に効力を有する。
【０３７８】
実施例１９．ＦＧＦ−ＣＸ変異体ＣＧ５３１３５−０６のクローニングおよび発現
受託番号ＣＧ５３１３５−０６に言及した線維芽細胞成長因子２０様タンパク質（配列番号：３１）の変異体をコード化するヌクレオチド配列を、表１９および２０に示す様に同定した。SeqCallingアセンブリー配列を、ＦＧＦ２０のＳＮＰ変異体および／またはＦＧＦ２０ファミリーのメンバー対して類似性を有するタンパク質に翻訳されるＤＮＡ配列についてのＣｕｒａｇｅｎコーポレーションヒトSeqCalling［登録商標］データベースの検索によりまず同定した。１またはそれ以上のSeqCallingアセンブリー１７４２０３２９９を、適当な類似性を有するとして同定した。上に示した表１１を参照されたい。選択されたアセンブリーを、さらに解析して、新規全長タンパク質ならびに新規スプライスフォームをコード化する任意のオープンリーディングフレームを同定した。結果として得られたＤＮＡ配列およびＦＧＦ２０様遺伝子の新規ＳＮＰ変異体のタンパク質配列を、ＣｕｒａＧｅｎ受託番号ＣＧ５３１３５−０６として本明細書において報告する。
【０３７９】
表１９．本発明のＦＧＦ２０様タンパク質（受託番号ＣＧ５３１３５−０６）のＳＮＰ変異体をコード化するヌクレオチド配列（配列番号：３０）
【表２４】

【０３８０】
表２０．表１９において示されたヌクレオチド配列によりコード化されるタンパク質配列（配列番号：３１）
【表２５】

【０３８１】
多型配列アラインメントを、関連タンパク質配列を有する本発明のタンパク質と比較するClustalW解析での第１のラインに示す本発明のタンパク質を伴う表２１に示す。この配列がＣＧ５３１３５−０６の位置５３において示された様にＦＧＦ２０のＳＮＰを表すことに注意されたい。別のＳＮＰを、以下の実施例２１において記載する。
【０３８２】
表２１．ＣＧ５３１３５−０６タンパク質と関連するタンパク質のClustalWアラインメント
【表２６】

【０３８３】
本明細書において開示されるタンパク質の同定可能なドメインの存在を、Ｐｆａｍ、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＰｒｏＤｏｍ、ＢｌｏｃｋまたはＰｒｉｎｔのようなドメインデータベースに対する検索により決定し、次にプロリン間のドメイン受託番号により同定した。有意義なドメインを表２２に要約する。プロリン間ＩＰＲ００２２０９ＦＧＦドメインを上述する。
【０３８４】
表２２．ＣＧ５３１３５−０６のドメイン解析
【表２７】

【０３８５】
実施例２０．最適化ＦＧＦ−ＣＸを含むＦＧＦ−ＣＸ変異体のクローニングおよび特徴
別のＦＧＦ−ＣＸ変異体を、上述のようにクローン化した。ヌクレオチドおよびポリペプチドを表２３〜２９において示す。コドン最適化ＦＧＦ−ＣＸを表２５に示す。
【０３８６】
表２３．ＣＧ５３１３５−０３のヌクレオチドおよびポリペプチド配列、コンセンサスＤＮＡ配列
【表２８】

【０３８７】
表２４．ＣＧ５３１３５−０４のヌクレオチドおよびポリペプチド配列：コンセンサスＤＮＡ配列：
【表２９】

【０３８８】
表２５．クローンアセンブリー、ＦＧＦ−２０Ｘ、コドン最適化、ＣＧ５３１３５−０５のヌクレオチドおよびポリペプチド配列
【表３０】

【０３８９】
表２６．ＣＧ５３１３５−０７のヌクレオチドおよびポリペプチド配列
【表３１】

【０３９０】
表２７．ＣＧ５３１３５ｐｅｐ２、ＣＧ５３１３５−０８のヌクレオチドおよびポリペプチド配列
【表３２】

【０３９１】
表２８．ＣＧ５３１３５ｐｅｐ、ＣＧ５３１３５−０９のヌクレオチドおよびポリペプチド配列
【表３３】

【０３９２】
表２９．ＦＧＦ−２０、ＣＧ５３１３５ｐｅｐ、ＣＧ５３１３５−１０のヌクレオチドおよびポリペプチド配列
【表３４】

【０３９３】
ＦＧＦ−ＣＸ変異体ＣＧ５３１３５−０１ないしＣＧ５３１３５−０８（それぞれ、ｖ−０１ないしｖ−０４として標識した）のClustalWアラインメントを表３０に示す。
【０３９４】
表３０．ＣＧ５３１３５−０１変異体からＣＧ５３１３５−０８変異体のClustalW多様性アラインメント
【表３５】

【０３９５】
コドン最適化ＦＧＦ−ＣＸ核酸（配列番号：３７８）およびポリペプチド（配列番号：３８）配列のＢＬＡＳＴＰアラインメントおよびＢＬＡＳＴＮアラインメントを実施した。結果を表３１に示す。
【０３９６】
表３１．配列番号：３７および３８のＢＬＡＳＴ解析
【表３６】

【０３９７】
実施例２１．ＦＧＦ−ＣＸ ＳＮＰ変異体のクローニングおよび発現
SeqCalling［登録商標］技術：ｃＤＮＡは、多様な組織タイプ、正常および疾病状態、病態、および異なるドナー由来の発生状態を表す様々なヒト試料からもたらされた。試料を、全体組織、細胞株、一次細胞または一次細胞および細胞株を培養した組織として得た。細胞および細胞株を、遺伝子発現を制御する生物学的物質または化学的物質、例えば、成長因子、ケモカイン、ステロイドで処理した。それゆえにもたらされたｃＤＮＡを、次に、ＣｕｒａＧｅｎ専売のSeqCalling技術を用いて配列決定した。配列トレースを、手動で評価し、適切な場合、訂正のため編集した。全試料由来のｃＤＮＡ配列を、それ自体、SeqCallingアセンブリーのＣｕｒａｇｅｎのヒトSeqCallingデータベースを生成するためのバイオインフォマティックプログラムを用いる公開ＥＳＴで集めた。それぞれのアセンブリーは、１またはそれ以上のヒト試料からもたらされた１またはそれ以上の重複ｃＤＮＡ配列を含有する。フラグメントおよびＥＳＴを、アセンブリーの別の成分との同一性の伸展が、少なくとも５０ｂｐを超える９５％であると、アセンブリーの成分として含まれる。それぞれのアセンブリーは、スプライスフォームおよび／または１塩基多型（ＳＮＰ）およびそれらの組合せのような遺伝子および／またはその変異体をあらわすことができる。
【０３９８】
ヒトゲノムＤＮＡにおいて同定された様々な配列は、この発明に含まれる。変異体配列は、１塩基多型（ＳＮＰ）を含むことができる。ＳＮＰは、時には、ｃＤＮＡとしてＳＮＰ起源を含有するヌクレオチド配列意味する「ｃＳＮＰ」として言及することができる。ＳＮＰを様々な方法で生じさせることができる。例えば、ＳＮＰは、多型部位での別のものへの１ヌクレオチドの置換に起因し得る。かかる置換は、トランジションまたはトランスバージョンのいずれかであり得る。ＳＮＰはまた、参考対立遺伝子と関係するヌクレオチドの欠損またはヌクレオチドの挿入から生じ得る。この場合、多型部位は、ある対立遺伝子は、別の対立遺伝子中の特定のヌクレオチドに関して、ギャップを生む部位である。遺伝子内で生じるＳＮＰは、ＳＮＰの位置の遺伝子によりコード化されたアミノ酸の変化において結果として起こり得る。しかしながら、ＳＮＰはまた、ＳＮＰを含むコドンが遺伝子コードの重複性の結果として同一アミノ酸をコード化する場合、サイレントであり得る。遺伝子領域の外側、または遺伝子内のイントロン中で生じるＳＮＰは、タンパク質の任意のアミノ酸配列中で変化を生じないが、発現パターンの変化制御、例えば、時間的な発現での変化、生理的応答制御、細胞タイプ発現制御、発現の強度、転写されたメッセンジャーの安定性において生じる。
【０３９９】
新規ＳＮＰ同定方法：ＳＮＰは、ＣｕｒａＧｅｎ専売特許のＳＮＰＴｏｏｌアルゴリズムでのDeep SNP Mining（ＤＳＭ）により同定された。ＳＮＰＴｏｏｌは、以下の基準でのアセンブリーでのバリエーションを同定する：それぞれアセンブリー位置に対して、アラインメントの両末端上の１０塩基対内で解析されない；ウインドウサイズ（一見の塩基数）が１０である；ウインドウでのミスマッチの許される数は２である；最小のＳＮＰ塩基の質（ＰＨＲＥＤスコア）は２３である；スコアＳＮＰに対する変化の最小数は２である。ＳＮＰＴｏｏｌは、アセンブリーを解析し、アセンブリーでの個々の変異体配列と関連するＳＮＰ位置、与えられた位置でのアセンブリーの深さ、推定アセンブリー対立遺伝子頻度、ＳＮＰ配列変異体、およびゲノムＤＮＡプール供給源を表す。配列トレースを選択し、手動での確認のため図する。内臓のフレーム検索ソフトウエアは、アミノ酸変更ＳＮＰの同時同定を可能とする。イントロン／エキソン境界に接するＳＮＰを、ＳＮＰコンセンサスをＣｕｒａＴｏｏｌに入力することおよび該ＣＧＵＩＤタンパク質配列に対する１×１ＴＢＬＡＳＴＮをを実施することにより二重チェックした。包括的なＳＮＰデータ解析を次にSNPCallingデータベースに出力した。
【０４００】
新規ＳＮＰ確認方法：ＳＮＰを、Pyrosequencingとして知られる有効な方法を利用して確認する。Pyrosequencingの詳細なプロトコールは、Alderborn et al.. (2000). Genome Research. 10, Issue 8, Augustにおいて見ることができる。ＳＮＰ結果を、表３２に示す。
【０４０１】
表３２．図１において記載したヌクレオチド配列の変異体
【表３７】

【０４０２】
実施例２２．ＦＧＦ−ＣＸ変異体ＣＧ５３１３５−０４の分子クローニング
Ａ．ＣＧ５３１３５−０４の残基１〜１７９の分子クローニング
残基１〜１７９由来のＣＧ５３１３５−０４の全長型をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲによる「インフレーム」クローニングの標的とした。ＰＣＲ鋳型は、以前に同定されたプラスミドに基づく。
【０４０３】
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標的ｃＤＮＡ配列をクローン化した：
Ｆ１ ５’−ＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴ ＡＴＧＧＣＴＣＣＣＴＴＡＧＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＧＧＧＣ−３’（配列番号：５５）
Ｒ１ ５’−ＧＣＣＧＴＣＧＡＣ ＡＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＴＡＧＧＴＣＣＴＴＧＴＡＣＡＡＴＴＣ−３’（配列番号：５６）
【０４０４】
下流のクローニング目的のため、順方向プライマーは、インフレームのＢｇｌＩＩ制限部位を含み、逆方向プライマーは、インフレームのＳａｌＩ制限部位を含有する。
２度のＰＣＲ反応を、ＣＧ５３１３５−０４のインサートを含有するプラスミドの全量１〜５ｎｇを用いてセットアップした。
【０４０５】
反応混合液は、５０μｌ反応用量中の、２μｌのそれぞれのプライマー（元々の濃度：５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ（Clontech Laboratories, Palo Alto CA）および１μｌの５０×Advantage-HF２ポリメラーゼ（Clontech Laboratories）を含有していた。以下の反応条件を用いた：
ＰＣＲ条件１：
ａ） ９６℃ ３分
ｂ） ９６℃ ３０秒 第２の変性
ｃ） ６０℃ ３０秒 プライマーアニーリング
ｄ） ７２℃ ６分 伸長
ステップｂ〜ｄを１５回繰り返す
ｅ） ９６℃ １５秒 変性
ｆ） ６０℃ ３０秒 プライマーアニーリング
ｇ） ７２℃ ６分 伸長
ステップｅ〜ｇを２９回繰り返す
ｅ） ７２℃ １０分 最終伸長
ＰＣＲ条件２：
ａ） ９６℃ ３分
ｂ） ９６℃ １５秒 第２の変性
ｃ） ７６℃ ３０秒 サイクル当たり１℃温度を下げる
ｄ） ７２℃ ４分 伸長
ステップｂ〜ｄを３４回繰り返す
【０４０６】
増幅産物を、アガロース電気泳動により検出した。フラグメントをゲル精製し、製造元の指示に従い、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）に結合させた。ＰＣＲ反応当たり１２クローンをピックアップし、配列決定した。インサートを、ベクター特異的Ｍ１３順方向プライマーおよびＭ１３逆方向プライマーを用いて配列決定した。
ＳＦ１：ＧＴＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＧＴＧＴＧＧＣ（配列番号：５７）
ＳＦ２：ＴＧＧＴＣＴＣＴＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＧＡＡＴＧＡＣ（配列番号：５８）
ＳＲ１：ＧＡＡＧＡＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＣ（配列番号：５９）
ＳＲ２：ＡＣＴＧＴＣＣＡＣＡＣＣＴＣＴＡＡＴＡＣＴＧＡＣＣ（配列番号：６０）
【０４０７】
インサートアセンブリー２５００５９５９６が、ＣＧ５３１３５−０４の標的配列の残基１と残基１７９の間のオープンリーディングフレームをコード化することが分かった。表３３〜３６を参照されたい。クローンインサートは、元々の配列に対して１００％同一である。ＣＧ５３１３５−０４でのアラインメントを、表３７のClustalWに示す。アセンブリーの最初の３アミノ酸残基および最後の３アミノ酸残基は、サブクローニングの目的のプライマーに加えられた制限酵素部位由来である。白またはグレーの背景を有する異なるアミノ酸に注意し、欠損／挿入アミノ酸を、その位置でコードしない配列の破線により検出できる。
【０４０８】
表３３．クローン配列
【表３８】

【０４０９】
表３４．クローン配列
【表３９】

【０４１０】
表３５．ＣＧ５３１３５−０４のビューＤＮＡ配列解析
【表４０】

【０４１１】
表３６．２５００５９５９６のビューＤＮＡ配列解析
【表４１】

【０４１２】
表３７．クローン配列のClustalW
【表４２】

【０４１３】
Ｂ，ＣＧ５３１３５−０４の分子クローニング（３１〜１６２ａａ）
残基３１〜１６２由来のＣＧ５３１３５−０４のドメインをコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲによる「インフレーム」クローニングの標的とした。ＰＣＲ鋳型は、以前に同定されたプラスミドに基づく。
【０４１４】
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標的ｃＤＮＡ配列をクローン化した：
Ｆ２ ５’−ＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴ ＡＴＣＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＴＡＴＴＧＣＣ−３’（配列番号：６３）：
Ｆ２ ５’−ＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴ ＡＴＣＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＴＡＴＴＧＣＣ−３’（配列番号：６３）：
Ｒ２ ５’−ＧＣＣＧＴＣＧＡＣ ＴＧＧＴＣＴＡＧＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＴＧＴＡＡＡＴＴＴＣＴＧＡＴＧＣＣ−３’（配列番号：６４）
【０４１５】
下流のクローニング目的のため、順方向プライマーは、インフレームのＢｇｌＩＩ制限部位を含み、逆方向プライマーは、インフレームのＳａｌＩ制限部位を含有する。
ＰＣＲ反応を、ＣＧ５３１３５−０４のインサートを含有する全部で１〜５ｎｇのプラスミドを用いてセットアップした。
【０４１６】
反応混合液は、５０μｌの反応液中に、２μｌのそれぞれのプライマー（元々の濃度：５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ（Clontech Laboratories, Palo Alto CA）および１μｌの５０×Advantage-HF２ポリメラーゼ（Clontech Laboratories）を含有する。用いた反応条件は、実施例２２Ａにおいて、上で提供される。
【０４１７】
増幅産物を、アガロース電気泳動により検出した。フラグメントをゲル精製し、製造元の指示に従い、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）に結合させた。ＰＣＲ反応当たり１２クローンをピックアップし、配列決定した。インサートを、ベクター特異的Ｍ１３順方向プライマーおよびＭ１３逆方向プライマーを用いて配列決定した。
【０４１８】
インサートアセンブリー２５００５９６２９が、ＣＧ５３１３５−０４の標的配列の残基３１と１６２との間のオープンリーディングフレームをコード化することが分かった。クローン化インサートは、元々の配列と１００％同一である。表３８〜４２を参照されたい。ＣＧ５３１３５−０４でのアラインメントを、表４２のClustalWにおいて示す。アセンブリーの最初の３アミノ酸残基および最後の３アミノ酸残基は、サブクローニングの目的のためのプライマーに加えられた制限酵素部位由来である。白またはグレーの背景を有する異なるアミノ酸に注意し、欠損／挿入アミノ酸を、その位置でコードしない配列中の破線により検出できる。
【０４１９】
表３８．クローン配列
【表４３】

【０４２０】
表３９．クローン配列
【表４４】

【０４２１】
表４０．ＣＧ５３１３５−０４のビューＤＮＡ配列解析
【表４５】

【０４２２】
表４１．２５００５９６２９のビューＤＮＡ配列解析
【表４６】

【０４２３】
表４２．ClustalWアラインメント
【表４７】

【０４２４】
Ｃ．ＣＧ５３１３５−０４の分子クローニング（３１〜１７９ａａ）
残基３１〜１７９由来のＣＧ５３１３５−０４の成熟型をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲにより「インフレーム」の標的とした。ＰＣＲ鋳型は、以前に同定されたプラスミドに基づく。
【０４２５】
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標的ｃＤＮＡ配列をクローン化した：
Ｆ２ ５’−ＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴ ＡＴＣＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＴＡＴＴＧＣＣ−３’（配列番号：６３）
Ｒ１ ５’−ＧＣＣＧＴＣＧＡＣ ＡＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＴＡＧＧＴＣＣＴＴＧＴＡＣＡＡＴＴＣ−３’（配列番号：５６）
【０４２６】
下流クローニング目的のため、順方向プライマーは、インフレームのＢｇｌＩＩ制限部位を含み、逆方向プライマーは、インフレームのＳａｌＩ制限部位を含有する。
２度のＰＣＲ反応を、ＣＧ５３１３５−０４のインサートを含有するプラスミドの全量１〜５ｎｇを用いてセットアップした。
【０４２７】
反応混合液は、５０μｌ反応量中で、２μｌのそれぞれのプライマー（元々の濃度：５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ（Clontech Laboratories, Palo Alto CA）および１μｌの５０×Advantage-HF２ポリメラーゼ（Clontech Laboratories）を含有する。用いた反応条件は、実施例２２Ａにおいて上で提供された。
【０４２８】
増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により検出した。フラグメントを、ゲル精製し、製造元の指示に従い、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）に結合させた。ＰＣＲ反応当たり１２クローンをピックアップし、配列決定した。インサートを、ベクター特異的なＭ１３順方向プライマーおよびＭ１３プライマーを用いて配列決定した。
【０４２９】
インサートアセンブリー２５００５９６６９が、標的配列のＣＧ５３１３５−０４の残基３１と１７９間のオープンリーディングフレームをコード化することが分かった。クローンインサートは、元々の配列と１００％同一である。表４３〜４６を参照されたい。ＣＧ５３１３５−０４でのアラインメントを、表４７でのClustalWに示す。アセンブリーの最初の３アミノ酸残基および最後の３アミノ酸残基は、サブクローニングの目的のためのプライマーに加えられた制限酵素部位由来である。白またはグレーの背景を有する異なるアミノ酸に注意し、欠損／挿入アミノ酸を、その位置でコードしない配列中の破線により検出され得る。
【０４３０】
表４３．クローン配列
【表４８】

【０４３１】
表４４．クローン配列
【表４９】

【０４３２】
表４５．ＣＧ５３１３５−０４のビューＤＮＡ配列解析
【表５０】

【０４３３】
表４６．２５００５９６６９のビューＤＮＡ配列解析
【表５１】

【０４３４】
表４７．ClustalWアラインメント
【表５２】

【０４３５】
（相当発明）
本発明の特別な実施例の上述の詳細な記載から、特定の新規組成物および記載した核酸、ポリペプチド、抗体、検出および処置を含む方法が明らかである。これらの特定の実施態様は本明細書において開示されたが、このことは例示のみを目的とする実施例によりなされ、以下の添付請求項の範囲に関して制限することを意図するものではない。特に、様々な置換、変更、および修飾が、請求項により定義されるように本発明の要旨を逸脱しないで当業者にとって日課として行われ得ることは、本発明者により意図される。実際、本明細書において記載したものに加えて、本発明の様々な修飾が、上述の記載および添付の図から当業者にとって明らかである。かかる修飾は、添付請求項の範囲内にあることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０４３６】
【図１】図１は、ＦＧＦ−ＣＸのウエスタン分析を示す。
【図２】図２は、２９３細胞により分泌されたＦＧＦ−ＣＸタンパク質のウエスタン分析を示す。
【図３】図３は、E.coli細胞において発現させたＦＧＦ−ＣＸ(配列番号：２)タンパク質のウエスタン分析を示す。
【図４−Ａ】図４−Ａは、ＦＧＦ−ＣＸ特異的ＴａｑＭａｎ試薬を用いたリアルタイム定量的ＰＣＲにより得たＦＧＦ−ＣＸの発現分析である。正常ヒト組織試料由来の標準化ＲＮＡの結果をパネルＡに示す。
【図４−Ｂ】図４−Ｂは、ＦＧＦ−ＣＸ特異的ＴａｑＭａｎ試薬を用いたリアルタイム定量的ＰＣＲにより得たＦＧＦ−ＣＸの発現分析である。腫瘍細胞株由来の標準化ＲＮＡの結果をパネルＢに示す。
【図４−Ｃ】図４−Ｃは、ＦＧＦ−ＣＸ特異的ＴａｑＭａｎ試薬を用いたリアルタイム定量的ＰＣＲにより得たＦＧＦ−ＣＸの発現分析である。手術で直接的に得た腫瘍組織を用いて得た結果を、パネルＣに示す。
【図４−Ｄ】図４−Ｄは、ＦＧＦ−ＣＸ特異的ＴａｑＭａｎ試薬を用いたリアルタイム定量的ＰＣＲにより得たＦＧＦ−ＣＸの発現分析である。手術で直接的に得た腫瘍組織を用いて得た結果を、パネルＤに示す。
【図５−Ａ】図５−Ａは、ＤＮＡ合成への作用により表される、組換えＦＧＦ−ＣＸの生物学的活性を表示する。
【図５−Ｂ】図５−Ｂは、ＤＮＡ合成への作用により表される、組換えＦＧＦ−ＣＸの生物学的活性を表示する。
【図５−Ｃ】図５−Ｃは、ＤＮＡ合成への作用により表される、組換えＦＧＦ−ＣＸの生物学的活性を表示する。
【図６】図６は、細胞成長への作用により表される組換えＦＧＦ−ＣＸの生物学的活性を表示する。
【図７】図７は、細胞形態への作用により表される組換えＦＧＦ−ＣＸの生物学的活性である。
【図８】図８は、ＦＧＦ−ＣＸの腫瘍化活性を表すグラフである。
【図９】図９は、ＦＧＦ−ＣＸ構築物で安定的に形質移入したＮＩＨ３Ｔ３細胞を皮下組織へ注入された対照胸腺欠損ヌードマウスおよび胸腺欠損ヌードマウスの写真である。
【図１０】図１０は、還元条件下および非還元条件下で調整されたＦＧＦ−ＣＸの精製試料のクーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのイメージである。
【図１１】図１１は、７８６−０ヒト腎臓腺癌細胞を用いて実行した投与量タイトレーション実験の結果を提供する。
【図１２】図１２は、インビトロでの病巣の形成を示す。
【図１３】図１３は、ＦＧＦ−ＣＸの受容体結合特異性を評価する実験の結果を示す。
【図１４】図１４は、プラスミドｐＥＴ２４ａ−ＦＧＦ２０Ｘ−ｄｅｌ１５４コドンをE.coli菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた場合に得たアルギニン上清のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのイメージを示す。
【図１５】図１５は、全長ＦＧＦ−ＣＸと比較して、ＤＮＡ合成への作用により表す組換えＦＧＦ−ＣＸの切断型の生物学的活性を示す。

Claims (65)

1. ａ）配列番号：２により与えられるアミノ酸配列；
   ｂ）選択された配列において特定される任意のアミノ酸が配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の変異体；
   ｃ）配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型；および
   ｄ）選択された配列の成熟型の任意のアミノ酸が成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２により与えられるアミノ酸の成熟型の変異体；および
   ｅ）ａ）からｄ）において記載されたアミノ酸配列のフラグメント
   からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
2. 請求項１に記載のポリペプチドのフラグメント。
3. 該ポリペプチドが配列番号：２の天然に存在する対立遺伝子変異体である、請求項１に記載のポリペプチド。
4. 変異体が１塩基多型の翻訳物である、請求項３に記載のポリペプチド。
5. 該ポリペプチドが変異体ポリペプチドであり、かつ配列番号：２において特定される１またはそれ以上の任意のアミノ酸が変更されて保存的置換を与える、請求項１に記載のポリペプチド。
6. ａ）配列番号：２を含むポリペプチド；
   ｂ）選択された配列において特定された任意のアミノ酸が配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で、異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２の変異体；
   ｃ）配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型；および
   ｄ）選択された配列の成熟型の任意のアミノ酸が成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型の変異体；
   ｅ）ａ）からｄ）において記載されたアミノ酸配列のフラグメント；および
   ｆ）ａ）からｅ）において記載された任意の核酸分子の相補的配列（complement）
   からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を含む単離核酸分子。
7. 核酸分子が天然に存在する対立遺伝子核酸の変異体のヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の核酸分子。
8. 該核酸分子が天然に存在するポリペプチドの変異体のポリペプチド配列を有する変異体ポリペプチドをコード化する、請求項６に記載の核酸分子。
9. 核酸分子が該変異体ポリペプチドをコード化する１塩基多型を含む、請求項６に記載の核酸分子。
10. 該核酸分子が、
    ａ）配列番号：１により与えられるヌクレオチド配列；
    ｂ）配列番号：１により与えられるヌクレオチド配列中の１またはそれ以上のヌクレオチドが、ヌクレオチドの２０％より多くは変更を受けないという条件で、選択された配列により与えられるものから異なるヌクレオチドに変更されている、ヌクレオチド配列；
    ｃ）ａ）において記載された配列の核酸フラグメント；
    ｄ）ｂ）において記載された配列の核酸フラグメント；および
    ｅ）任意の該核酸分子の相補的分子（complement）、
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の核酸分子。
11. 核酸分子が、選択されたヌクレオチド配列のコード配列において特定された任意のヌクレオチドが選択されたコード配列中のヌクレオチドの２０％より多くは変更を受けないという条件で、選択された配列により与えられるものから異なるヌクレオチドに変更されているヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の核酸分子。
12. ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのフラグメントをコード化する単離核酸分子。
13. 該ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドが配列番号：２の変異体である、請求項１２に記載の核酸分子。
14. 該ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドが、成熟ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドである、請求項１２に記載の核酸分子。
15. 該ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドが配列番号：２の成熟型の変異体である、請求項１２に記載の核酸分子。
16. 請求項６に記載の核酸分子を含むベクター。
17. 請求項１６に記載のベクターを含む細胞。
18. （ａ）配列番号：２により与えられるアミノ酸配列；（ｂ）選択された配列において特定される任意のアミノ酸が配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の変異体；（ｃ）配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型；および（ｄ）選択された配列の成熟型の任意のアミノ酸が成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型の変異体；および（ｅ）（ａ）から（ｄ）において記載されたアミノ酸配列のフラグメント、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体。
19. 該抗体がモノクローナル抗体である、請求項１８に記載の抗体。
20. 該抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１８に記載の抗体。
21. 試料中の（ａ）配列番号：２により与えられるアミノ酸配列；（ｂ）選択された配列において特定される任意のアミノ酸が配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の変異体；（ｃ）配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型；および（ｄ）選択された配列の成熟型の任意のアミノ酸が成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型の変異体；および（ｅ）（ａ）から（ｄ）において記載されたアミノ酸配列のフラグメント、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドの存在または量を測定する方法であって、方法が：
    （i）試料を用意すること；
    （ii）試料をポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体と接触させること；および
    （iii）該ポリペプチドに結合する抗体の存在または量を測定すること、
    それにより、該試料中のポリペプチドの存在または量を測定すること、を含む方法。
22. 試料中の請求項６に記載の核酸分子の存在または量を測定する方法であって、方法が：
    （i）試料を用意すること；
    （ii）試料を該核酸分子に結合するプローブと接触させること；および
    （iii）該核酸分子に結合するプローブの存在または量を測定すること、
    それにより、該試料中の核酸分子の存在または量を測定すること、を含む方法。
23. （ａ）配列番号：２により与えられるアミノ酸配列；（ｂ）選択された配列において特定される任意のアミノ酸が配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型の変異体；（ｃ）配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型；および（ｄ）選択された配列の成熟型の任意のアミノ酸が成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２により与えれるアミノ酸配列の成熟型の変異体；および（ｅ）（ａ）から（ｄ）において記載されたアミノ酸配列のフラグメント、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドに結合する作用物質を同定する方法であって、方法が：
    （i）該ポリペプチドを候補物質と接触させること；および
    （ii）該候補物質が該ポリペプチドに結合するか否かを決定すること；
    ここで結合する候補物質が作用物質であること、を含む方法。
24. 候補物質が約１５００Ｄａ以下の分子量を有する、請求項２３に記載の方法。
25. （ａ）配列番号：２により与えられるアミノ酸配列；（ｂ）選択された配列において特定される任意のアミノ酸が配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の変異体；（ｃ）配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型；および（ｄ）選択された配列の成熟型の任意のアミノ酸が成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型の変異体；および（ｅ）（ａ）から（ｄ）において記載されたアミノ酸配列のフラグメント、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドの活性を調節する方法であって、ポリペプチドをポリペプチドの活性を調節するのに十分な量でポリペプチドに結合する化合物と接触させることを含む、方法。
26. 病変の処置において有用な潜在的治療物質を同定する方法であって、当該病変が、（ａ）配列番号：２により与えられるアミノ酸配列；（ｂ）選択された配列において特定される任意のアミノ酸が配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の変異体；（ｃ）配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型；および（ｄ）選択された配列の成熟型の任意のアミノ酸が成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型の変異体；および（ｅ）（ａ）から（ｄ）において記載されたアミノ酸配列のフラグメント、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドの異常発現、異常プロセッシング、または異常生理的相互作用に関連し、方法が
    （i）ポリペプチドを発現しかつポリペプチドに基づく性質または機能を有する細胞を用意すること；
    （ii）（i）において用意された細胞を試験物質と接触させること；および
    （iii）試験物質がポリペプチドに基づく性質または機能を変えるか否か決定すること；
    それにより、試験物質の存在下で観察されるポリペプチドの性質または機能の変化が、試験物質が潜在的治療物質であることを示すこと、を含む方法。
27. さらに潜在的治療物質を該物質が治療物質であることを同定するための付加試験に付することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
28. 候補物質が抗体であるか、または約１５００Ｄａ以下の分子量を有する、請求項２６に記載の方法。
29. 性質または機能が細胞成長または細胞増殖を含む、請求項２６に記載の方法。
30. 試験物質がポリペプチドに結合する、請求項２９に記載の方法。
31. 請求項２６に記載の方法により同定される治療物質。
32. 請求項２７に記載の方法を用いて同定される治療物質。
33. 物質が、抗体であるか、または約１５００Ｄａ以下の分子量を有する、請求項３１に記載の治療物質。
34. アミノ酸配列を含む単離ポリペプチドと関連する疾患を処置または予防する方法であって；
    該アミノ酸配列が、（ａ）配列番号：２により与えられるアミノ酸配列；（ｂ）選択された配列において特定される任意のアミノ酸が配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の変異体；（ｃ）配列番号：２により与えられるアミノ酸の成熟型；および（ｄ）選択された配列の成熟型の任意のアミノ酸が成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２により与えられるアミノ酸の成熟型の変異体；および（ｅ）（ａ）から（ｄ）において記載されたアミノ酸配列のフラグメント；からなる群から選択され、該疾患が、細胞または組織の不十分な成長または役に立たない成長により特徴付けられ、該方法が、該対象中の該ポリペプチド関連疾患を処置または予防するのに十分な量および持続時間で対象に該ポリペプチドを投与することを含み、対象は、疾患の傾向があるか、または疾患を病んでいると思われる、方法。
35. 該対象がヒトである、請求項３４に記載の方法。
36. 単離ポリペプチドの異常発現、異常プロセッシング、または異常生理的相互作用と関連する疾患を処置または予防する方法であって、該単離ポリペプチドが、（ａ）配列番号：２により与えられるアミノ酸配列；（ｂ）選択された配列において特定される任意のアミノ酸が、配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の変異体；（ｃ）配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型；および（ｄ）選択された配列の成熟型の任意のアミノ酸が成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更さている、配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型の変異体；および（ｅ）ａ）からｄ）において記載されたアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
    疾患は細胞または組織の不十分な成長または役に立たない成長により特徴づけられ、該方法は、（ｅ）配列番号：２を含むポリペプチド；（ｆ）選択された配列中において特定される任意のアミノ酸が、配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で、異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２の変異体；（ｇ）配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型；および（ｈ）選択された配列の成熟型の任意のアミノ酸が、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％より多くは変更を受けないという条件で、異なるアミノ酸に変更されている、配列番号：２により与えられるアミノ酸配列の成熟型の変異体；（ｉ）（ｅ）から（ｈ）において記載されたアミノ酸配のフラグメント；および（ｊ）（ｅ）から（ｉ）において記載された任意の核酸分子の相補的分子（complement）、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を含む単離核酸分子を、該対象において該疾患を処置または予防するのに十分な量で、または持続時間で対象に投与することを含み、対象は疾患の傾向があるか、または疾患を病んでいると思われる、方法。
37. 該対象がヒトである、請求項３６に記載の方法。
38. 請求項１に記載のポリペプチドの異常発現、異常プロセッシング、または異常生理的相互作用と関連する疾患を処置または予防する方法であって、疾患が細胞または組織の過形成または異常増殖により特徴付けられ、該方法が該対象における該疾患を処置または予防するのに十分な量で治療薬を対象に投与することを含み、対象が疾患の傾向があるか、または疾患を病んでいると思われる、方法。
39. 治療薬が請求項１８に記載の抗体である、請求項３８に記載の方法。
40. 対象がヒトである、請求項３８に記載の方法。
41. 請求項１に記載のポリペプチドおよび医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
42. 請求項６に記載の核酸分子および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
43. 請求項１８に記載の抗体および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
44. 請求項３１に記載の治療物質および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
45. 治療物質が約１５００Ｄａ以下の分子量を有する、請求項４４に記載の医薬組成物。
46. 請求項４１に記載の医薬組成物を、１またはそれ以上の容器内に含むキット。
47. 請求項４２に記載の医薬組成物を、１またはそれ以上の容器内に含むキット。
48. 請求項４３に記載の医薬組成物を、１またはそれ以上の容器内に含むキット。
49. 請求項１に記載のポリペプチドの異常発現、異常プロセッシング、または異常生理的相互作用と関連する疾患の潜在活性または素因のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、該方法は：
    ａ）疾患のリスクの増大した被検動物を用意すること、該被検動物は、請求項１に記載のポリペプチドを組変え的に発現する；
    ｂ）試験化合物を被検動物に投与すること；
    ｃ）段階（ａ）の化合物を投与後の該被検動物中の該ポリペプチドの活性を測定すること；および
    ｄ）該被検動物中の該タンパク質の活性を、該化合物を投与されていない対照動物中の該ポリペプチドの活性と比較すること；
    該対照動物と比べた該被検動物中の該ポリペプチドの活性の変化は、試験化合物が疾患の潜在活性または素因のモジュレーターであることを示す、ことを含む方法。
50. 該被検動物が、試験タンパク質導入遺伝子を発現するか、または野生型被検動物と比較して増大したレベルのプロモーターの制御下で該導入遺伝子を発現する組換え被検動物であり、該プロモーターは該導入遺伝子の天然の遺伝子プロモーターでない、請求項４９に記載の方法。
51. 第１の対象中の請求項１に記載のポリペプチドの変化レベルと関連する疾病の存在または素因を測定する方法であって、方法は：
    ａ）第１の哺乳動物対象由来の試料中のポリペプチドの発現レベルを測定すること；および
    ｂ）段階（ａ）の試料中の該ポリペプチドの量を、該疾病を有さない、または素因を有さないと知られている第２の哺乳動物対象由来の対照試料に存在するポリペプチドの量と比較すること、
    対照試料と比較して第１の対象中のポリペプチドの発現レベルの変化は、該疾病の存在または素因を示す、ことを含む方法。
52. 第１の哺乳動物対象中の請求項６に記載の核酸分子の変化したレベルと関連する疾病の存在または素因を決定する方法であって、方法は：
    ａ）第１の哺乳動物対象由来の試料中の核酸の量を測定すること；および
    ｂ）段階（ａ）の試料中の核酸の量を、疾病を有さない、または素因を有さないことが知られている第２の哺乳動物対象由来の対照試料において存在する核酸の量と比較すること；
    対照試料と比較したときの第１の対象中の核酸のレベルの変化は、疾病の存在または素因を示す、ことを含む方法。
53. 哺乳動物における病態を処置する方法であって、病変が請求項１に記載のポリペプチドの異常発現、異常プロセッシング、または異常生理相互作用と関連し、方法が病態を緩和するのに十分な量で哺乳動物にポリペプチドを投与することを含み、ポリペプチドは配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに少なくとも９５％同一なアミノ酸配列、またはそれらの生物学的に活性なフラグメントを有するポリペプチドである、方法。
54. 哺乳動物の病態を処置する方法であって、病変がＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの異常発現、異常プロセッシング、または異常生理的相互作用と関連し、病態を緩和するのに十分な量および持続時間で請求項１８に記載の抗体を哺乳動物に投与することを含む、方法。
55. 対象における細胞の成長を促進する方法であって、細胞成長を促進するのに作用する量および持続時間で請求項１に記載のポリペプチドをそれらを必要とする対象に投与することを含む、方法。
56. 対象がヒトである、請求項５５に記載の方法。
57. 成長が促進されるべき細胞が、傷の近くにある細胞、血管系の細胞、血管新生に関与する細胞、赤血球新生に関与する細胞、消化管の内壁にある細胞、および毛包にある細胞からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
58. 対象中の細胞の成長を阻害する方法であって、成長が、請求項１に記載のポリペプチドの発現と関連し、該対象中の細胞の成長を阻害するのに十分な量で対象に組成物を投与することを含む、方法。
59. 組成物がＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの切断を阻害する、請求項５８に記載の方法。
60. 組成物が抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体またはＦＧＦ−ＣＸ治療物質を含む、請求項５８に記載の方法。
61. 対象がヒトである、請求項５８に記載の方法。
62. 成長が阻害されるべき細胞が、形質転換細胞、過形成細胞、腫瘍細胞、および腫瘍性細胞からなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
63. フラグメントが配列番号：２の残基５５〜２１１および配列番号：２の残基２４〜２１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリペプチドフラグメント。
64. 核酸分子が、配列番号：２の残基５５〜２１１および配列番号：２の残基２４〜２１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドフラグメントをコード化する核酸配列を含む、請求項６に記載の単離核酸分子。
65. 核酸配列が配列番号：１のヌクレオチド１６３〜６３３および配列番号：１のヌクレオチド７０〜６３３からなる群から選択される配列を含む、請求項１０に記載の核酸分子。

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