WO2009116639A1 - ラクリチンの部分ペプチド - Google Patents

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WO2009116639A1
WO2009116639A1 PCT/JP2009/055489 JP2009055489W WO2009116639A1 WO 2009116639 A1 WO2009116639 A1 WO 2009116639A1 JP 2009055489 W JP2009055489 W JP 2009055489W WO 2009116639 A1 WO2009116639 A1 WO 2009116639A1
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polypeptide
amino acid
acid sequence
seq
lacritin
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毅 中嶋
光佳 東
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千寿製薬株式会社
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide having a specific partial sequence of lacritin, which is a protein in tears.
  • the polypeptides of the present invention can promote cell adhesion, particularly cell adhesion between cells and extracellular matrix. Furthermore, the polypeptides of the present invention can promote lacrimation.
  • adhesion between cells and extracellular matrix is involved in various functions such as cell survival and motility. This is an essential process for regulating individual normal development, tissue maintenance, or recovery from injury or infection. Such abnormal signaling pathways based on cell adhesion may lead to developmental abnormalities, cardiovascular diseases, and cell transformation / metastasis.
  • adhesion between the cell and the extracellular matrix is inhibited, it has been reported that the cell falls into a cell death called “anoikis”, and the adhesion to the extracellular matrix is important for the survival of the cell. (Refer nonpatent literature 1).
  • Lacritin is a protein identified as a lacrimation promoter or growth factor-like protein (see Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 2).
  • lacritin the following 1) to 5) have been reported: 1) Lacritin has an activity as a growth factor for corneal epithelial cells and lacrimal gland acinar cells; 2) Lacritin has an effect of promoting tear protein secretion; 3) Lacritin is expressed in cells derived from tissues such as lacrimal gland, parotid gland, minor salivary gland, submandibular gland, thyroid gland, mammary gland and corneal epithelium; 4) Eye drops containing lacritin may be used for the treatment of eye diseases such as dry eye syndrome, Sjogren's syndrome or corneal epithelial wounds; 5) The ability to search for lacritin and a compound that binds to the lacritin receptor by using cells expressing lacritin receptor and using calcium signals that depend on lacritin as an index.
  • An object of the present invention is to provide a substance capable of promoting adhesion between cells and extracellular matrix, in particular, corneal epithelial cells and extracellular matrix, and / or substance capable of promoting secretion of tear fluid from lacrimal acinar cells. .
  • the present inventors have found that a polypeptide having a specific partial sequence of lacritin can promote adhesion between corneal epithelial cells and extracellular matrix, and further from lacrimal gland acinar cells.
  • the present invention was completed. That is, the present invention is as follows.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having an amino acid length of 70 residues or less.
  • 70 residues comprising an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having an activity equivalent to that of the polypeptide described in [1] above
  • a polypeptide having the following amino acid length [3] The polypeptide according to [1] above, wherein the portion other than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is composed of a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • [8] It consists of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 3 to 5, and has an activity equivalent to that of the polypeptide of [7] above Having a polypeptide.
  • a method for promoting cell adhesion which comprises contacting the cell with an effective concentration of the polypeptide according to any one of [1] to [8] above.
  • a lacrimal secretion promoter comprising the polypeptide according to any one of [1] to [8] above.
  • the present invention it is possible to provide a novel polypeptide that can promote adhesion between cells and extracellular matrix, particularly corneal epithelial cells and extracellular matrix.
  • a novel polypeptide capable of promoting tear secretion from lacrimal gland acinar cells. Substances that act directly on the lacrimal gland and can promote lacrimation can be useful prophylactic and therapeutic agents for dry eye and diseases associated with dry eye.
  • polypeptide of the present invention is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 below.
  • QGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA SEQ ID NO: 1
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 corresponds to the 69th to 102nd sites of human-derived full-length lacritin consisting of 138 residues shown in SEQ ID NO: 2 (see GenBank / EBI data accession numbers NM_033277 and ay005150 (genomic)) To do.
  • polypeptide of the present invention has 1 to 3, preferably 1 to 2, more preferably 1 amino acid deleted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 as long as it has an activity equivalent to that of the polypeptide. It may be a polypeptide comprising a substituted or added amino acid sequence.
  • the amino acid length of the polypeptide of the present invention is usually 70 residues or less, preferably 60 residues or less, particularly preferably 32-58 residues, and most preferably 34-55 residues. It is also preferred that it is 35-55 residues.
  • a part of the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (or an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1).
  • the other part can be any amino acid sequence as long as it contains.
  • the arbitrary amino acid sequence is the N-terminal side or C-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (or an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1). Alternatively, it may be located on both the N-terminal side and the C-terminal side.
  • the partial sequence (after-mentioned) of the amino acid sequence shown to sequence number 2 is mentioned, for example.
  • the polypeptide of the present invention comprises only a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 except for the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 means any partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (amino acid sequence of lacritin), and includes a part or all of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. There may be.
  • the partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be added to the N-terminal side, C-terminal side, or both the N-terminal side and C-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the polypeptide of the present invention is a polypeptide of 70 residues or less including the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and as a whole, becomes a continuous partial peptide of lacritin. That is, one embodiment of the polypeptide of the present invention is a partial peptide of lacritin having 70 residues or less consisting of a continuous amino acid sequence of a part of amino acids 33 to 138 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • 1 in the amino acid sequence thereof Up to 3, preferably 1 to 2, more preferably 1 amino acid may be deleted, substituted or added.
  • a further preferred embodiment of the polypeptide of the present invention is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 3 to 5 below.
  • VQGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA SEQ ID NO: 3
  • QGTAKVTSSRRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKAGKGMHGGVPGG SEQ ID NO: 4
  • QGTAKVTSSRRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKAGKGMHGGVPGGKQFIENGSEF SEQ ID NO: 5
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 correspond to amino acids 68-102, 69-113 or 69-123 of the amino acid sequence of lacritin (SEQ ID NO: 2). That is, the polypeptide of the present invention consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 5 is a partial peptide of lacritin.
  • polypeptide of the present invention is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 below.
  • EISGPAEPAPPETTTTAQETSAAAVQGTAKVTSSRRQELNPLKSIVEEKSILLTEQALAKA SEQ ID NO: 8
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 corresponds to amino acids 43 to 102 of the amino acid sequence of lacritin (SEQ ID NO: 2). That is, the polypeptide of the present invention consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is a partial peptide of lacritin.
  • polypeptide of the present invention which is a partial peptide of lacritin, has the same activity as the polypeptide, that is, the cell adhesion promoting action and / or tear secretion promoting action of the polypeptide is maintained.
  • amino acid sequences 1 to 3, preferably 1 to 2, more preferably 1 amino acid may be deleted, substituted or added.
  • amino acid usually means “natural amino acid”, but may be “non-natural amino acid” as long as the object of the present invention is satisfied.
  • natural amino acid means the L-isomer of a natural amino acid. Natural amino acids are glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, methionine, threonine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, cysteine, proline, histidine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, arginine, ornithine, and lysine .
  • non-natural amino acid means an amino acid that is not normally contained in a protein.
  • non-natural amino acids include norleucine, para-nitrophenylalanine, homophenylalanine, para-fluorophenylalanine, 3-amino-2-benzylpropionic acid, D-form of homoarginine or D-phenylalanine.
  • partial peptide refers to a polypeptide consisting of a partial amino acid sequence in the amino acid sequence of lacritin shown in SEQ ID NO: 2.
  • amino acid deletion means that a constituent amino acid is removed at any position in an amino acid sequence.
  • amino acid substitution means that a constituent amino acid is replaced with another amino acid at an arbitrary position in an amino acid sequence.
  • conservative substitution is preferred. A conservative substitution is one in which an amino acid is replaced with another amino acid having similar properties, so that one skilled in the art of peptide chemistry would expect that the secondary structure and hydropathic properties of the polypeptide will not change substantially. Refers to substitution.
  • glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine and tyrosine The following are generally known as a group of amino acids that are conservative substitutions for each other: (1) glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine and tyrosine; (2) alanine, valine, leucine, isoleucine, proline. (3) glycine, alanine, serine, threonine and methionine; (4) leucine, isoleucine and valine; (5) glutamine and asparagine; (6) glutamic acid and aspartic acid; (7) arginine, lysine And (8) phenylalanine, tryptophan and tyrosine.
  • “addition of an amino acid” refers to addition of an arbitrary amino acid at an arbitrary position in an amino acid sequence, and includes insertion of an amino acid.
  • the polypeptide of the present invention has 1 to 3, preferably 1 to 2, more preferably 1 amino acid deleted in its amino acid sequence as long as it has an activity equivalent to that of the polypeptide. It may be substituted or added, and such polypeptides are also within the scope of the present invention.
  • “having equivalent activity” means that about 80% or more, preferably about 90% or more of the cell adhesion promoting action of the polypeptide before amino acid is deleted, substituted or added. It means having adhesion promoting action. Examples of the cell adhesion promoting action include an action that can promote the adhesion between the cells and the extracellular matrix.
  • this effect is achieved by adding a test polypeptide on a plate coated with an appropriate extracellular matrix, overlaying corneal epithelial cells, incubating for a predetermined time, and then measuring the number of cells adhered. Can be assayed.
  • “having equivalent activity” means about 80% or more, and preferably about 90% or more tear fluid, with respect to the lacrimal secretion promoting action of the polypeptide before deletion, substitution or addition of amino acids. It means having a secretion promoting action.
  • the lacrimal secretion promoting action include an action of promoting the secretion of tear fluid proteins (eg, lactoferrin) from lacrimal gland acinar cells. As described in Examples below, this action is performed by culturing appropriate lacrimal acinar cells, adding a test polypeptide to the medium, and quantifying the amount of tear protein secreted into the medium. Can be assayed.
  • each polypeptide described above may be a derivative in which the N-terminal amino group, the C-terminal carboxy group, or the functional group of the amino acid side chain is chemically modified within a range that does not affect the activity thereof.
  • derivatization include addition of a protecting group to an amino group (for example, acetylation, formylation, Bocation, Fmocation), esterification of a carboxyl group (ethylation, etc.) and the like.
  • glutamine is present at the N-terminus, the side chain may be closed to become pyroglutamic acid.
  • Each polypeptide may be in the form of a salt by a known method.
  • a salt with a pharmacologically acceptable base for example, alkali metal
  • an acid for example, alkali metal
  • a pharmacologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Pharmacologically acceptable acid addition salts include salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid). Examples thereof include salts with acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid.
  • inorganic acids eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • polypeptide of the present invention can be produced by an ordinary chemical synthesis method or a recombinant DNA technique.
  • the polypeptide of the present invention When the polypeptide of the present invention is produced by a chemical synthesis method, it can be produced according to a known peptide synthesis method.
  • Peptide synthesis methods include a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method, and a solid phase synthesis method is preferred.
  • An example of the solid phase synthesis method is the Fmoc method.
  • the Fmoc method is a method in which an ⁇ -amino group is protected with a 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group and a side chain functional group is protected with a t-butyl alcohol-based protecting group.
  • the Fmoc group is protected with a secondary amine, piperidine.
  • the Fmoc amino acid is condensed while deprotecting, and finally the side chain protecting group is deprotected with a weak acid such as trifluoroacetic acid. That is, from the C-terminal side of the peptide to be synthesized, a series of operations including selective removal of the ⁇ -amino protecting group and condensation of the protected amino acid are repeated to construct a protected peptide chain, and the protecting group of the side chain functional group is removed. By protecting, the target peptide can be obtained.
  • a weak acid such as trifluoroacetic acid
  • a primer is designed based on the base sequence of cDNA encoding the polypeptide, and an appropriate cDNA library is used as a template for polymerase chain reaction ( By amplifying the target sequence by PCR), a cDNA encoding the polypeptide can be produced.
  • PCR techniques are well known in the art and are described, for example, in “PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications”, Academic Press, Michael, et al., Eds., 1990.
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention is then incorporated into an appropriate expression vector, which is introduced into either eukaryotic or prokaryotic cells to express the desired polypeptide. Can be obtained.
  • a vector refers to a single-stranded or double-stranded nucleic acid molecule that can be transfected into a cell and replicate in the cell genome or independently thereof.
  • the expression vector includes a promoter region that drives the expression of DNA, and may further include transcriptional and translational control sequences such as a TATA box, a capping sequence, a CAAT sequence, a 3 ′ non-coding region, an enhancer, and the like.
  • promoters include bla promoter, cat promoter, lacZ promoter when used in prokaryotic hosts, mouse metallothionein I gene sequence promoter, herpesvirus TK promoter when used in eukaryotic hosts, Examples include SV40 early promoter and yeast glycolytic enzyme gene sequence promoter.
  • vectors include, but are not limited to, pBR322, pUC118, pUC119, ⁇ gt10, ⁇ gt11, pMAM-neo, pKRC, BPV, vaccinia, SV40, 2-micron and the like.
  • the expression vector preferably has one or more markers so that a host cell containing it can be selected.
  • the marker those that give nutrition to an auxotrophic host, antibiotic resistance (for example, ampicillin, tetracycline, neomycin, hygromycin, geneticin, etc.), or heavy metal resistance (for example, copper) can be used.
  • the vector can be constructed so that the polypeptide of the present invention is secreted and expressed using a signal sequence, or the polypeptide of the present invention is expressed in the form of a fusion polypeptide with another polypeptide. it can. By using a fusion polypeptide, the stability of the polypeptide can be improved or purification can be facilitated.
  • the construction of such expression vectors is well known in the art.
  • a vector constructed to express the polypeptide of the present invention is introduced into an appropriate host cell by transformation, transfection, conjugation, protoplast fusion, electroporation, particle gun technology, calcium phosphate precipitation, direct microinjection, etc. can do.
  • the polypeptide of the present invention can be obtained by growing a cell containing the vector in an appropriate medium to produce the polypeptide of the present invention, and recovering and purifying the desired recombinant polypeptide from the cell or the medium. it can.
  • the polypeptide of the present invention encodes the polypeptide by performing a modification corresponding to the deleted, substituted or added amino acid position by a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method or a method analogous thereto. It can also be produced by obtaining cDNA and subjecting it to the same recombinant DNA technique as described above. For example, mutation introduction kits using site-directed mutagenesis (for example, Mutant-K (Takara Bio Inc.) or Mutant-G (Takara Bio Inc.)), or Takara Bio This can be done using the LA PCR in vitro Mutagenesis series kit from the company.
  • site-directed mutagenesis for example, Mutant-K (Takara Bio Inc.) or Mutant-G (Takara Bio Inc.)
  • Takara Bio Takara Bio This can be done using the LA PCR in vitro Mutagenesis series kit from the company.
  • isolation and purification of the polypeptide of the present invention obtained as described above can be performed by a known method.
  • isolation and purification methods include salting out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, etc. Examples include electric point electrophoresis.
  • the polypeptide of the present invention thus obtained promotes adhesion between cells and extracellular matrix, particularly corneal epithelial cells and extracellular matrix, and the specific use thereof will be described below.
  • the polypeptide of the present invention is particularly effective during the preparation of a corneal epithelial sheet for transplantation due to the adhesion promoting effect of corneal epithelial cells and extracellular matrix. Adhesion between the corneal epithelial cells and the base can be promoted.
  • the corneal epithelial sheet is a substitute for a living cornea for the purpose of recovery of visual acuity for corneal opacity and is used for the treatment of intractable corneal epithelial diseases such as Stevens-Johnson syndrome and chemical trauma.
  • the corneal epithelial sheet is cultured, for example, by adding cells such as corneal epithelial cells on a base such as amniotic membrane or collagen sheet in a serum medium, and then co-culturing with 3T3 fibroblasts, air-lifting, etc. It is prepared by stratification by the method (Ophthalmology, Vol. 42, No. 3, pp. 245-250, 2000).
  • known methods described in WO 03/043542, JP-A 2004-298447, JP-A 2004-261533, JP-A 2002-331525, and the like are applied.
  • a known one used for producing a corneal epithelial sheet can be used, and any of a biologically derived base and an artificially prepared base can be used.
  • an amnion is used as the base derived from the living body, and a collagen sheet is used as the base derived from the artificial.
  • the amniotic membrane is a membrane that covers the outermost layer of the uterus and placenta, and is released outside the body together with the placenta at the time of delivery.
  • the culture medium used for cell culture known culture liquids used for the production of corneal epithelial sheets, for example, EpiLife medium (manufactured by Cascade Biologics), DMEM / F12 medium (manufactured by Invitrogen), DMEM medium ( Invitrogen Co., Ltd.) can be used, and the culture medium can contain known serum.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as the cells can grow well, and is usually about 15 to 45 ° C.
  • the culture time is not particularly limited as long as the cells can grow well, and is usually about 1 to 30 days.
  • the polypeptide of the present invention can be added to a culture solution for preparing the corneal epithelial sheet and can be an active ingredient for promoting adhesion between the corneal epithelial cells and the base.
  • concentration of the polypeptide in the culture medium is usually 0.0001 w / v% to 0.1 w / v%, preferably 0.001 w / v% to 0.01 w / v%.
  • the polypeptide of the present invention promotes the fixation between the extracellular matrix of the base and corneal epithelial cells, and enables the preparation of a strong and stable corneal epithelial sheet that is prevented from dropping out of cells. it can.
  • the polypeptide of the present invention is useful as a cell adhesion promoter because it promotes adhesion between cells and extracellular matrix.
  • the adhesion promoter of the present invention is a cell derived from a mammal (eg, rat, mouse, guinea pig, bird, sheep, horse, cow, pig, monkey, chimpanzee, human, etc.) (for example, corneal epithelial cell, corneal endothelial cell, For example, conjunctival cells, and preferably for human-derived corneal epithelial cells.
  • the extracellular matrix is not particularly limited as long as it is an extracellular matrix that can adhere to cells, (1) fibrous proteins such as collagen and elastin, (2) cell-adhesive glycoproteins such as fibronectin, laminin, and vitronectin, (3) Basement membranes (for example, Bowman's membrane, Descemet's membrane, amniotic membrane, etc.) including complex carbohydrates such as glycosamide glycans containing heparin, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, etc., and composed of these extracellular matrices ).
  • fibrous proteins such as collagen and elastin
  • cell-adhesive glycoproteins such as fibronectin, laminin, and vitronectin
  • basement membranes for example, Bowman's membrane, Descemet's membrane, amniotic membrane, etc.
  • complex carbohydrates such as glycosamide glycans containing heparin, hyaluronic acid, chondroitin sulf
  • the polypeptide of the present invention suppresses cell death of corneal epithelial cells in the surface layer of the eye by promoting adhesion of corneal epithelial cells to the basement membrane (such as Bowman's membrane) of the corneal epithelium composed of the extracellular matrix .
  • repair of the corneal epithelium is known to involve cell movement consisting of division, migration (extension), and adhesion (Suzuki, K. et al., Prog. Retin. Eye Res. 2003, 22) , 113).
  • the polypeptides of the present invention promote the repair of corneal epithelial damage (ie, wounds or defects) by promoting the adhesion process in this cell motility.
  • the medicament containing the polypeptide of the present invention is useful for the treatment of corneal epithelial disorder.
  • diseases that cause corneal epithelial disorder include corneal ulcer, corneal epithelial detachment (corneal fistula), corneal epithelial edema, corneal burn, as well as keratitis due to physical / chemical stimulation, allergy, bacterial / fungal / viral infection Corneal corrosion due to chemical substances, dry eye, dry eye, chronic superficial keratitis, punctate superficial keratopathy, corneal epithelial fistula, prolonged corneal epithelial defect, and the like.
  • the polypeptides of the present invention are particularly useful for the treatment of corneal epithelial disorders associated with these diseases.
  • the polypeptide of the present invention has a lacrimal secretion promoting action from lacrimal gland acinar cells.
  • the lacrimal fluid covers the surface of the eyeball composed of the cornea and the conjunctiva, maintains the wettability of the cornea and prevents drying.
  • various kinds of sensations such as fatigue and foreign body sensation have occurred due to dryness of the keratoconjunctiva surface associated with tear reduction, dryness of the eye when a contact lens is worn, or dryness of the eye that occurs during operation of an OA device.
  • An increasing number of people complain of symptoms, ie dry eye symptoms.
  • Dry eye is often accompanied by corneal epithelial disorder or corneal epithelial fistula due to corneal epithelial cell damage, and, in severe cases, may cause corneal ulcers or eye infections.
  • artificial tears mainly composed of salts such as sodium chloride, eye drops containing hydroxyethyl cellulose, chondroitin sulfate or hyaluronic acid have been used. There is no kimono at present.
  • these symptomatic therapies can alleviate symptoms, they are not causal therapies for fundamental treatment.
  • tears are thought to have an effect of healing keratoconjunctival damage caused by dry eye due to its original function, substances that directly act on the lacrimal gland and promote lacrimation are suitable for diseases involving dry eye and dry eye. It is expected to be a useful preventive and therapeutic drug.
  • the dosage form of the pharmaceutical agent containing the polypeptide of the present invention is not particularly limited, but preferably includes eye drops, eye washes, eye ointments, tablets and the like, and more preferably eye drops or eye ointments.
  • eye drops can be prepared using commonly used techniques.
  • an eye drop can be prepared by appropriately blending an isotonic agent, buffer, pH adjuster, solubilizer, thickener, stabilizer, preservative and the like as an additive.
  • a stable eye drop can be obtained by adding a pH adjuster, a thickener, a dispersant and the like to suspend the drug.
  • Examples of the isotonic agent include glycerin, propylene glycol, sodium chloride, potassium chloride, sorbitol, mannitol and the like.
  • Examples of the buffer include phosphoric acid, phosphate, citric acid, acetic acid, ⁇ -aminocaproic acid, trometamol, and the like.
  • Examples of the pH adjuster include hydrochloric acid, citric acid, phosphoric acid, acetic acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, boric acid, borax, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate and the like.
  • Examples of the solubilizer include polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, macrogol 4000, and the like.
  • thickener and dispersant examples include cellulose-based polymers such as hydroxypropylmethylcellulose and hydroxypropylcellulose, polyvinyl alcohol, and polyvinylpyrrolidone.
  • stabilizer examples include edetic acid and sodium edetate. It is done.
  • preservatives include general-purpose sorbic acid, potassium sorbate, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, methyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, and chlorobutanol. These preservatives may be used in combination. it can.
  • the ophthalmic solution containing the polypeptide of the present invention preferably has a pH of 4 to 8, and an osmotic pressure ratio of about 1.
  • the concentration of the polypeptide of the present invention in a pharmaceutical containing the polypeptide of the present invention may be set according to symptoms, age, etc., and is not particularly limited.
  • the polypeptide of the present invention is applied as an eye drop or an eye wash. In the case of inclusion in the above, it is 0.001 w / v% to 1 w / v%, preferably 0.05 w / v% to 0.5 w / v%.
  • the dosage in the case of eye drops, for example, one drop to several drops may be applied once to several times a day.
  • the eye drop may be a normal eye drop or an eye drop that is dissolved at the time of use.
  • the pharmaceutical agent containing the polypeptide of the present invention as an active ingredient can be used, for example, in mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, bird, sheep, horse, cow, pig, monkey, chimpanzee, human, etc.). it can.
  • mammals eg, rat, mouse, guinea pig, bird, sheep, horse, cow, pig, monkey, chimpanzee, human, etc.
  • Example 1 Synthesis of Polypeptide Polypeptides were synthesized using a solid phase synthesis method. That is, an amino acid introduced with a fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group is supported on a resin, dichloromethane is used as a solvent, and 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3 is used as a coupling reagent. An amide bond formation reaction was performed using 3-tetramethyluronium (HBTU) and N-methylpyrrolidone (NMP). The removal of the protecting group was performed using DMF / 20% piperidine.
  • Fmoc fluorenylmethoxycarbonyl
  • polypeptides 1-3 having the following amino acid sequences.
  • Polypeptide 1 VQGTAKVTSSRRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA (SEQ ID NO: 3)
  • White powder MALDI-TOF-MS Calcd .: 3750.13; Found: 3752.27; Purity (HPLC A / A%) 96.207%
  • Polypeptide 2 QGTAKVTSSRRQELNPLKSIVEEKSILLTEQALAKAGKGMHGGVPGG (SEQ ID NO: 4)
  • White powder MALDI-TOF-MS Calcd .: 4588.35; Found: 4590.14; Purity (HPLC A / A%) 96.88%
  • Polypeptide 3 QGTAKVTSSRRQELNPLKSIVEEKSILLTEQALAKAGKGMHHGVPGGKQFIENGSEF (SEQ ID NO:
  • Example 2 Synthesis of Polypeptide Polypeptides were synthesized using a solid phase synthesis method. That is, an amino acid introduced with a fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group is supported on a resin, dichloromethane is used as a solvent, and 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3 is used as a coupling reagent. An amide bond formation reaction was performed using 3-tetramethyluronium (HBTU) and N-methylpyrrolidone (NMP). The removal of the protecting group was performed using DMF / 20% piperidine.
  • Fmoc fluorenylmethoxycarbonyl
  • polypeptides 6 and 7 having the following amino acid sequences.
  • Polypeptide 6 QGTAKVTSSRRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA (SEQ ID NO: 1) White powder MALDI-TOF-MS Calcd .: 3653.27; Found: 3652.28; Purity (HPLC A / A%) 99.26%
  • Polypeptide 7 EIGPAEPAPPETTTTAQETSAAAVQGTAKVTSSRRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA (SEQ ID NO: 8) White powder MALDI-TOF-MS Calcd .: 6148.92; Found: 6146.82; Purity (HPLC A / A%) 87.47%
  • Polypeptides 4 and 5 having the following amino acid sequences were obtained in the same manner as in Example 1 above.
  • Polypeptide 4 EISGPAEPASPPETTTTAQETSAAAAVQGTAKVT (SEQ ID NO: 6)
  • White powder MALDI-TOF-MS Calcd .: 3197.56; Found: 3199.98; Purity (HPLC A / A%) 99.53%
  • Polypeptide 5 QGTAKVTSSRRQELNPL (SEQ ID NO: 7)
  • White powder MALDI-TOF-MS Calcd .: 1728.94; Found: 1728.82; Purity (HPLC A / A%) 98.01%
  • Test Example 1 Effect of Lacritin Partial Peptide on Promoting Adhesion of Human Corneal Epithelial Cells to Extracellular Matrix Extracellular Matrix Solution (Collagen Type IV: Becton Decktonson Co., Ltd.) was added. It was incubated at 37 ° C. for 1 hour and the plate was coated with extracellular matrix. To remove excess extracellular matrix solution and to block areas not coated with extracellular matrix, 0.1% BSA solution (Sigma-Aldrich) was added. Subsequently, the BSA solution was removed, and after washing twice with PBS, polypeptides 1 to 5 (concentration 100 ⁇ g / mL) synthesized in Example 1 and Comparative Example 1 were added in an amount of 50 ⁇ L per well.
  • BSA solution Sigma-Aldrich
  • HCE-T human corneal epithelial cells
  • 10 4 cells / 100 ⁇ L DMEM / F12 medium / well were added. After incubating it at 37 ° C. for 20 minutes to allow the cells to adhere to the plate, the number of adherent cells was measured by MTT assay (Dojindo Laboratories). Table 1 shows the cell adhesion rate determined when the polypeptide was not added as 100%.
  • polypeptides 1-3 which are polypeptides comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, have an activity of promoting cell adhesion between corneal epithelial cells and extracellular matrix. .
  • Test Example 2 Effect of Lacritin Partial Peptide to Promote Adhesion of Human Corneal Epithelial Cells to Extracellular Matrix Extracellular Matrix Solution (Collagen Type IV: Becton) at a Concentration of 10 ⁇ g / mL in 96 Well Plate (Iwaki Glass Co., Ltd.) ⁇ Decktonson Co., Ltd.) was added. It was incubated at 37 ° C. for 1 hour and the plate was coated with extracellular matrix. To remove excess extracellular matrix solution and to block areas not coated with extracellular matrix, 0.1% BSA solution (Sigma-Aldrich) was added.
  • Collagen Type IV Becton
  • Example 2 the polypeptides 4, 6 and 7 synthesized in Example 2 and Comparative Example 1 were suspended in PBS to a final concentration of 10 ⁇ M, and 50 ⁇ L per well. Added one by one.
  • 2 ⁇ 10 2 of established human corneal epithelial cells HCE-T: prepared by the method described in Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995, 36, 614) previously cultured overnight in a serum-free state in this well.
  • 4/100 [mu] L DMEM / F12 was added to a culture medium / well. After incubating it at 37 ° C. for 25 minutes to allow the cells to adhere to the plate, the number of adherent cells was determined by MTT assay (Dojindo Laboratories). Table 2 shows the cell adhesion rate obtained when the polypeptide was not added as 100%.
  • Test Example 3 Effect of Lacritin Partial Peptide to Promote Tear Protein Secretion from Monkey Lacrimal Gland Asiner Cells
  • the monkey lacrimal gland was minced in DMEM / F12 medium (Invitrogen Inc.) and 0.76 mg / mL EDTA (Sigma-Aldrich stock) Company) and treated with DMEM / F12 medium containing 200 U / mL collagenase A (Roche Corporation), 698 U / mL Hyarulonidase (Worthington Corporation), and 10 U / mL DNase (Roche Diagnostics Corporation) And the cells were isolated.
  • DMEM / F12 medium Invitrogen Inc.
  • EDTA Sigma-Aldrich stock
  • Lactoferrin was detected by Western blotting as a tear protein secreted into the medium, and quantified using human lactoferrin (Sigma-Aldrich) as a standard.
  • the collected medium was purified with a 2D clean up kit (Bio-rad Co., Ltd.), dissolved in NuPAGE LDS sample buffer (Invitrogen Co., Ltd.), and then heat-denatured at 70 ° C. for 10 minutes. Equal amounts of samples were electrophoresed in 4-12% NuPAGE Bis Tris gel and MES buffer (Invitrogen) at 200V for 35 minutes, and then a PVDF membrane (Bio-rad) was used using a transblot minicell (Bio-rad).
  • Formulation Example 1 Culture solution for preparation of corneal epithelial sheet 4 mL of HCGS growth additive (contents: mEGF, hydrocortisone, insulin, transferrin and BPE, Kurashiki Boseki Co., Ltd. catalog number: KC-6150) and 15 mg of polypeptide 1 in EpiLife Medium (corneal epithelial cell basal medium, Cascade Biologics, catalog number: M-EPI-500-CA) is added to prepare a culture solution of 500 mL in total.
  • HCGS growth additive contents: mEGF, hydrocortisone, insulin, transferrin and BPE, Kurashiki Boseki Co., Ltd. catalog number: KC-6150
  • EpiLife Medium corneal epithelial cell basal medium, Cascade Biologics, catalog number: M-EPI-500-CA
  • Formulation Example 2 Ophthalmic Solution Containing Lacritin Partial Peptide
  • the ophthalmic solution shown below is prepared by a conventional method.
  • Polypeptide 1 0.1g Sodium dihydrogen phosphate 0.1g Sodium chloride 0.9g Sodium hydroxide
  • Appropriate amount Sterilized purified water
  • Appropriate amount Total volume 100mL (pH7)

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Abstract

　本発明は、細胞と細胞外マトリックスとの接着を促進し得る、ラクリチンの部分配列を有するポリペプチド；および涙液分泌促進作用を有する、ラクリチンの部分配列を有するポリペプチドを提供することを課題とする。 　本発明は、ラクリチンの特定の部分配列である配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、７０残基以下のアミノ酸長を有するポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、細胞と細胞外マトリックスとの接着を促進し得る。本発明のポリペプチドは、涙腺腺房細胞の涙液分泌を促進し得る。

Description

ラクリチンの部分ペプチド
　本発明は、涙液中のタンパク質であるラクリチンの特定の部分配列を有するポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドは、細胞接着、特に細胞と細胞外マトリックスとの細胞接着を促進し得る。さらに本発明のポリペプチドは涙液分泌を促進し得る。
　細胞と細胞外マトリックスの接着は、細胞の生存や運動性などの種々の機能に関与することが知られている。これは個体の正常な発達、組織の維持、あるいは損傷や感染からの回復を調節するための必須のプロセスである。このような細胞接着に基づいたシグナリング経路の異常が、発達異常、循環器疾患、細胞の形質転換・転移につながる場合もある。
　また、細胞－細胞外マトリックス間の接着が阻害された場合、細胞は「アノイキス（ａｎｏｉｋｉｓ）」と呼ばれる細胞死に陥ることが報告されており、細胞外マトリックスへの接着は細胞の生存にとって重要である（非特許文献１参照）。
　一方、ラクリチン（Lacritin）は、涙液分泌促進因子または成長因子様タンパク質として同定されたタンパク質である（特許文献１及び２、並びに非特許文献２参照）。ラクリチンについては、以下１）～５）が報告されている：
１）ラクリチンは、角膜上皮細胞や涙腺腺房細胞の成長因子としての活性を有していること；
２）ラクリチンは、涙液タンパク質分泌促進効果を有していること；
３）ラクリチンは、涙腺、耳下腺、小唾液腺、顎下腺、甲状腺、乳腺及び角膜上皮等の組織に由来する細胞で発現していること；
４）ラクリチンを含有する点眼剤が、ドライアイ症候群、シェーグレン症候群または角膜上皮創傷等の眼疾患の治療に利用できる可能性があること；
５）ラクリチン受容体を発現させた細胞を用い、ラクリチンに依存するカルシウムのシグナルを指標とすることで、ラクリチンやラクリチン受容体に結合する化合物を探索できること。
　また、ラクリチンまたはその両末端の一部分を切断したペプチドが、３Ｈ－チミジンの取り込みを検出する試験から唾液腺細胞の分裂を促進する作用を有することが報告されている（非特許文献３参照）。
　しかしながら、ラクリチンまたはそのフラグメント（部分ペプチド）が、細胞と細胞外マトリックスとの接着に関与することはこれまで報告されていない。また、ラクリチンのフラグメントが涙腺腺房細胞からの涙液タンパク質の分泌促進作用を有することは報告されていない。
国際公開第０２/０６５９４３号パンフレット 国際公開第０５/１１９８９９号パンフレット Frisch, S. M. et al., Journal of Cell Biology 124, pp.619-626 (1994年) Sanghi, S. et al., Journal of Molecular Biology 310, pp.127-139 (2001年) Wang, J. et al. Journal of Cell Biology 174, pp.689-700 (2006年)
　本発明の目的は、細胞と細胞外マトリックス、特に角膜上皮細胞と細胞外マトリックスの接着を促進し得る物質及び／又は涙腺腺房細胞からの涙液タンパク質の分泌促進作用を有する物質の提供にある。
　本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、ラクリチンの特定の部分配列を有するポリペプチドが、角膜上皮細胞と細胞外マトリックスとの接着を促進し得ること、さらに涙腺腺房細胞からの涙液タンパク質の分泌を促進し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
［１］配列番号１に示すアミノ酸配列を含み、７０残基以下のアミノ酸長を有するポリペプチド。
［２］配列番号１に示すアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ上記［１］記載のポリペプチドと同等の活性を有する、７０残基以下のアミノ酸長を有するポリペプチド。
［３］配列番号１に示すアミノ酸配列以外の部分が配列番号２に示すアミノ酸配列の部分配列で構成されている、上記［１］記載のポリペプチド。
［４］上記［３］記載のポリペプチドの配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記［３］記載のポリペプチドと同等の活性を有するポリペプチド。
［５］配列番号２に示すアミノ酸配列の部分配列からなる上記［１］記載のポリペプチド。
［６］上記［５］記載のポリペプチドの配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記［５］記載のポリペプチドと同等の活性を有するポリペプチド。
［７］配列番号３～５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［８］配列番号３～５のいずれかに示すアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記［７］記載のポリペプチドと同等の活性を有するポリペプチド。
［９］上記［１］～［８］のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する、細胞接着促進剤。
［１０］上記［１］～［８］のいずれか１項に記載のポリペプチドの有効濃度を細胞に接触させることを含む、細胞の接着を促進させる方法。
［１１］上記［１］～［８］のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する、涙液分泌促進剤。
　本発明によれば、細胞と細胞外マトリックス、特に角膜上皮細胞と細胞外マトリックスの接着を促進し得る新規ポリペプチドを提供することが可能となる。本発明のポリペプチドは、移植用の角膜上皮シートを調製するための培養液に加えることによって、細胞の脱落が防止された長期間安定に機能する角膜上皮シートを調製することができる。さらに、本発明によれば、涙腺腺房細胞からの涙液分泌を促進し得る新規ポリペプチドを提供することが可能となる。涙腺に直接作用し、涙液分泌を促進し得る物質は、ドライアイおよびドライアイを伴う疾病に対して有用な予防治療薬となり得る。
　本発明のポリペプチドの一実施態様は、以下の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
ＱＧＴＡＫＶＴＳＳＲＱＥＬＮＰＬＫＳＩＶＥＫＳＩＬＬＴＥＱＡＬＡＫＡ（配列番号１）
　配列番号１に示すアミノ酸配列は、配列番号２に示す１３８残基からなるヒト由来全長ラクリチン（ＧｅｎＢａｎｋ/ＥＢＩデータバンクのアクセッション番号NM_033277およびay005150（ゲノミック）参照）の６９～１０２番の部位に相当する。
　さらに本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドと同等の活性を有する限り、配列番号１に示すアミノ酸配列において１～３個、好ましくは１～２個、より好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
　本発明のポリペプチドのアミノ酸長は、通常７０残基以下、好ましくは６０残基以下、特に好ましくは３２～５８残基、最も好ましくは３４～５５残基である。３５～５５残基であることもまた好ましい。
　本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、その一部に配列番号１に示すアミノ酸配列（又は配列番号１に示すアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列）を含んでいるものであれば、その他の部分は任意のアミノ酸配列であり得る。該任意のアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列（又は配列番号１に示すアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列）のＮ末端側、Ｃ末端側、または、Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に位置していてもよい。任意のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列の部分配列（後述）が挙げられる。
　好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列以外の部分は配列番号２に示すアミノ酸配列の部分配列のみで構成されている。配列番号２に示すアミノ酸配列の部分配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列（ラクリチンのアミノ酸配列）の任意の部分配列を意味し、配列番号１に示すアミノ酸配列の一部または全部を含むものであってもよい。配列番号２に示すアミノ酸配列の部分配列は、該配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端側、Ｃ末端側、または、Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に付加され得る。
　配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側の両方に、配列番号２に示すアミノ酸配列の部分配列が付加される場合、それらは互いに、配列番号２に示すアミノ酸配列中において連続していてもよく、連続していなくともよく、または一部もしくは全部が重複したものであってもよい。
　ここで、得られるポリペプチドは、当該ポリペプチドと同等の活性を有する限り、即ち当該ポリペプチドが有する細胞接着促進作用および／または涙液分泌促進作用が維持されている限り、そのアミノ酸配列において１～３個、好ましくは１～２個、より好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
　本発明のポリペプチドは、より好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む７０残基以下のポリペプチドであって、全体としてラクリチンの連続した部分ペプチドとなるものである。すなわち、本発明のポリペプチドの一実施態様は、配列番号２に示すアミノ酸配列の３３～１３８番の一部の連続したアミノ酸配列からなる、７０残基以下のラクリチンの部分ペプチドである。
　ここで、得られるポリペプチドは、当該ポリペプチドと同等の活性を有する限り、即ち当該ポリペプチドが有する細胞接着促進作用および／または涙液分泌促進作用が維持されている限り、そのアミノ酸配列において１～３個、好ましくは１～２個、より好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
　本発明のポリペプチドのさらに好ましい実施態様は、以下の配列番号３～５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
ＶＱＧＴＡＫＶＴＳＳＲＱＥＬＮＰＬＫＳＩＶＥＫＳＩＬＬＴＥＱＡＬＡＫＡ（配列番号３）
ＱＧＴＡＫＶＴＳＳＲＱＥＬＮＰＬＫＳＩＶＥＫＳＩＬＬＴＥＱＡＬＡＫＡＧＫＧＭＨＧＧＶＰＧＧ（配列番号４）
ＱＧＴＡＫＶＴＳＳＲＱＥＬＮＰＬＫＳＩＶＥＫＳＩＬＬＴＥＱＡＬＡＫＡＧＫＧＭＨＧＧＶＰＧＧＫＱＦＩＥＮＧＳＥＦ（配列番号５）
　配列番号３、配列番号４または配列番号５に示すアミノ酸配列は、ラクリチンのアミノ酸配列（配列番号２）の６８～１０２番、６９～１１３番または６９～１２３番にそれぞれ相当する。すなわち、配列番号３～５に示すアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドは、ラクリチンの部分ペプチドである。
　本発明のポリペプチドのさらに別の好ましい実施態様は、以下の配列番号８に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
ＥＩＳＧＰＡＥＰＡＳＰＰＥＴＴＴＴＡＱＥＴＳＡＡＡＶＱＧＴＡＫＶＴＳＳＲＱＥＬＮＰＬＫＳＩＶＥＫＳＩＬＬＴＥＱＡＬＡＫＡ（配列番号８）　
　配列番号８に示すアミノ酸配列は、ラクリチンのアミノ酸配列（配列番号２）の４３～１０２番に相当する。すなわち、配列番号８に示すアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドは、ラクリチンの部分ペプチドである。
　上記したラクリチンの部分ペプチドである本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチドと同等の活性を有する限り、即ち当該ポリペプチドが有する細胞接着促進作用および／または涙液分泌促進作用が維持されている限り、それらのアミノ酸配列において１～３個、好ましくは１～２個、より好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
　本明細書において「アミノ酸」とは、通常「天然のアミノ酸」を意味するが、本発明の目的を満たす限り「非天然のアミノ酸」のものであってもよい。ここで「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ－異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。ここで「非天然のアミノ酸」とは、タンパク質中に通常は含有していないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ－ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ－フルオロフェニルアラニン、３－アミノ－２－ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＤ－フェニルアラニンが挙げられる。
　本明細書において「部分ペプチド」とは、配列番号２に示されるラクリチンのアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸配列からなるポリペプチドを示す。
　本明細書において「アミノ酸の欠失」とは、アミノ酸配列の任意の位置において、構成アミノ酸が取り除かれることをいう。
　本明細書において「アミノ酸の置換」とは、アミノ酸配列の任意の位置において、構成アミノ酸が別のアミノ酸に置き換わることをいう。アミノ酸の置換としては、保存的置換が好ましい。保存的置換とは、アミノ酸が同様の特性を有する別のアミノ酸で置換され、そのためペプチド化学分野の当業者によってポリペプチドの２次構造およびハイドロパシー特性が実質的に変化しないことが予期されるような置換をいう。互いに保存的置換であるアミノ酸の群としては一般に以下のものが知られている：（１）グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニンおよびチロシン；（２）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファン；（３）グリシン、アラニン、セリン、トレオニンおよびメチオニン；（４）ロイシン、イソロイシンおよびバリン；（５）グルタミンおよびアスパラギン；（６）グルタミン酸およびアスパラギン酸；（７）アルギニン、リジンおよびヒスチジン；（８）フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン。
　本明細書において「アミノ酸の付加」とは、アミノ酸配列の任意の位置において、任意のアミノ酸が付け加わることをいい、アミノ酸の挿入を含む。
　上述のように、本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチドと同等の活性を有する限り、そのアミノ酸配列において１～３個、好ましくは１～２個、より好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよく、そのようなポリペプチドも本発明の範疇である。ここで、「同等の活性を有する」とは、アミノ酸が欠失、置換または付加される前のポリペプチドが有する細胞接着促進作用に対して、約８０％以上、好ましくは約９０％以上の細胞接着促進作用を有することを意味する。細胞接着促進作用としては、細胞と細胞外マトリックスとの接着を促進し得る作用が例示される。この作用は、後述の実施例に記載のように、適当な細胞外マトリックスをコーティングしたプレート上に被験ポリペプチドを加え、角膜上皮細胞を重層し、所定時間インキュベートした後に接着した細胞の数を測定することによりアッセイすることができる。あるいは「同等の活性を有する」とは、アミノ酸が欠失、置換または付加される前のポリペプチドが有する涙液分泌促進作用に対して、約８０％以上、好ましくは約９０％以上の涙液分泌促進作用を有することを意味する。涙液分泌促進作用としては、涙腺腺房細胞からの涙液タンパク質（例、ラクトフェリン）の分泌を促進する作用が例示される。この作用は、後述の実施例に記載のように、適当な涙腺線房細胞を培養し、その培地中に被験ポリペプチドを添加し、培地中に分泌された涙液タンパク質の量を定量することによってアッセイすることができる。
　また、上記した各ポリペプチドは、その活性に影響を及ぼさない範囲でＮ末端のアミノ基、Ｃ末端のカルボキシ基またはアミノ酸側鎖の官能基が化学的に修飾された誘導体であってもよい。誘導化の例としては、アミノ基への保護基の付加（例えば、アセチル化、ホルミル化、Ｂｏｃ化、Ｆｍｏｃ化）、カルボキシル基のエステル化（エチル化など）などが挙げられる。Ｎ末端にグルタミンが存在する場合には、側鎖が閉環されピログルタミン酸になっていてもよい。
　各ポリペプチドは公知の方法により塩の形態であってもよい。ポリペプチドの塩としては、薬理学的に許容される塩基（例えばアルカリ金属）や酸との塩が用いられるが、特に、薬理学的に許容される酸付加塩が好ましい。薬理学的に許容される酸付加塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などを例示することができる。
　本発明のポリペプチドは、通常の化学的合成法または組換えＤＮＡ技術などにより製造することができる。
　本発明のポリペプチドを化学的合成法で製造する場合には、公知のペプチド合成法に従って製造することができる。ペプチド合成法には、固相合成法、液相合成法等があり、固相合成法が好ましい。固相合成法としては、例えばＦｍｏｃ法が挙げられる。Ｆｍｏｃ法は、α－アミノ基を９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、側鎖官能基をｔ－ブチルアルコール系保護基で保護する方法で、Ｆｍｏｃ基を第二級アミンであるピペリジンにより脱保護しつつＦｍｏｃアミノ酸を縮合し、最後に側鎖保護基をトリフルオロ酢酸のような弱酸により脱保護する。つまり、合成しようとするペプチドのＣ末端側より、α－アミノ保護基の選択的除去、保護アミノ酸の縮合という一連の操作を繰り返して保護ペプチド鎖を構築し、側鎖官能基の保護基を脱保護することにより、目的のペプチドを得ることができるものである。
　固相ペプチド合成法においては、自動ペプチド合成装置による合成も一般的に用いられている（例えば、「新生化学実験講座１ タンパク質IV」(1992) 日本生化学会編, 東京化学同人；“The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology” Vol. 1-5, ed. by E. Gross, J. Meienhofer; Vol. 6-9, ed. by S. Udenfriend, J. Meienhofer, Academic Press, New York (1979-1987))。
　本発明のポリペプチドを組換えＤＮＡ技術で製造する場合には、例えば、当該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列に基づいてプライマーを設計し、適当なｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により目的とする配列を増幅することにより、当該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを製造することができる。このようなＰＣＲ手法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、“PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications”, Academic Press, Michael, et al., eds., 1990に記載されている。次いで、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを、適当な発現ベクター中に組み込み、これを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して、それぞれの鎖を発現させることにより所望のポリペプチドを得ることができる。本発明のポリペプチドを発現させるために用いることができる宿主細胞の例としては、限定されないが、大腸菌、枯草菌等の原核生物宿主、および酵母、真菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核生物宿主が挙げられる。ベクターとは、細胞にトランスフェクトすることができ、細胞ゲノム中でまたはそれとは独立に複製しうる一本鎖または二本鎖の核酸分子を表す。発現ベクターは、ＤＮＡの発現を駆動するプロモーター領域を含み、さらに転写および翻訳の制御配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、３’非コード領域、エンハンサー等を含んでいてもよい。プロモーターの例としては、原核生物宿主中で用いる場合には、ｂｌａプロモーター、ｃａｔプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、真核生物宿主中で用いる場合には、マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母解糖系酵素遺伝子配列プロモーター等が挙げられる。ベクターの例には、限定されないが、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、λｇｔ１０、λｇｔ１１、ｐＭＡＭ－ｎｅｏ、ｐＫＲＣ、ＢＰＶ、ワクチニア、ＳＶ４０、２－ミクロン等が含まれる。
　発現ベクターは、これを含有する宿主細胞を選択することができるように、１またはそれ以上のマーカーを有することが好ましい。マーカーとしては、栄養要求性宿主に対する栄養、抗生物質耐性（例えばアンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ジェネティシン等）、または重金属耐性（例えば銅）を与えるものを用いることができる。
　さらに、シグナル配列を用いて本発明のポリペプチドを分泌発現させるように、あるいは、本発明のポリペプチドを別のポリペプチドとの融合ポリペプチドの形で発現させるように、ベクターを構築することができる。融合ポリペプチドを用いることにより、ポリペプチドの安定性を改良し、または精製を容易にすることができる。そのような発現ベクターの構築は当該技術分野においてよく知られている。
　本発明のポリペプチドを発現するよう構築したベクターは、トランスフォーメーション、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈澱、直接マイクロインジェクション等により、適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを含む細胞を適当な培地中で成長させて本発明のポリペプチドを産生させ、細胞または培地から所望の組換えポリペプチドを回収し、精製することにより、本発明のポリペプチドを得ることができる。
　本発明のポリペプチドは、Kunkel法又はGapped duplex法等の公知手法またはこれに準ずる方法により、その欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸位置に該当する改変を施すことにより、当該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを得、その遺伝子を用いて上述と同様の組換えＤＮＡ技術に付すことにより製造することもできる。遺伝子への変異導入は、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(タカラバイオ株式会社）やMutant-G(タカラバイオ株式会社）)など、あるいは、タカラバイオ株式会社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて行うことができる。
　上述のようにして得られた本発明のポリペプチドの単離及び精製は、公知の方法により行うことができる。公知の単離及び精製法としては、塩析、溶媒沈殿、透析、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などが挙げられる。
　このようにして得られる本発明のポリペプチドは、細胞と細胞外マトリックス、特に角膜上皮細胞と細胞外マトリックスの接着を促進するものであり、以下にその具体的用途を説明する。
（１）本発明のポリペプチドを含有する角膜上皮シート調製用培養液
　本発明のポリペプチドは、角膜上皮細胞と細胞外マトリックスの接着促進効果により、移植用の角膜上皮シートの調製時において特に、角膜上皮細胞と基剤との接着を促進し得る。
　角膜上皮シートとは、角膜混濁に対する視力回復などを治療目的とした生体角膜の代用物であり、スティーブンス・ジョンソン症候群や化学外傷など、難治性角膜上皮疾患の治療に用いられる。角膜上皮シートは、例えば、血清培地中において羊膜やコラーゲンシート等の基剤上に角膜上皮細胞等の細胞を加えて培養し、その後、３Ｔ３線維芽細胞との共培養や、air-liftingなどの方法で重層化することにより調製される（眼科、第４２巻、第３号、２４５～２５０頁、２０００年）。角膜上皮シートの調製方法としては、ＷＯ０３／０４３５４２号、特開２００４－２９８４４７号、特開２００４－２６１５３３号、特開２００２－３３１０２５号などに記載されている公知の方法が適用される。
　当該角膜上皮シートの製造方法において、基剤としては、角膜上皮シート製造に用いられる公知のものが使用でき、生体由来の基剤及び人工的に作製される基剤のいずれもが使用できる。具体的には、生体由来の基剤としては羊膜、人工由来の基剤としてはコラーゲンシートが挙げられる。なお、羊膜は、子宮と胎盤の最表層を覆う膜で、出産時に胎盤とともに体外へ出される膜である。
　細胞の培養に用いられる培養液としては、角膜上皮シートの製造に使用される公知の培養液、例えば、EpiLife培地（Cascade Biologics社製）、DMEM/F12培地（Invitrogen株式会社製）、DMEM培地（Invitrogen株式会社製）などが使用でき、培養液には公知の血清を含有させることができる。培養温度は、上記細胞が良好に生育できる温度であれば特に限定されず、通常１５～４５℃程度である。培養時間は、上記細胞が良好に生育できる期間であれば特に限定されず、通常１～３０日程度である。
　本発明のポリペプチドは、該角膜上皮シートを調製するための培養液に加えられ、角膜上皮細胞と基剤との接着を促進するための有効成分となり得る。培養液中のポリペプチドの濃度は、通常０．０００１ｗ／ｖ％～０．１ｗ／ｖ％、好ましくは０．００１ｗ／ｖ％～０．０１ｗ／ｖ％である。本発明のポリペプチドは、基剤の細胞外マトリックスと角膜上皮細胞との定着を促進し、細胞の脱落が防止された強固で長期間安定に機能する角膜上皮シートの調製を可能とすることができる。
（２）本発明のポリペプチドを含有する医薬
　本発明のポリペプチドは、細胞と細胞外マトリックスとの接着を促進するため、細胞接着促進剤として有用である。本発明の接着促進剤は、哺乳動物（例、ラット、マウス、モルモット、トリ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ヒト等）由来の細胞（例えば、角膜上皮細胞、角膜内皮細胞、結膜細胞など）に対して用いられ、好ましくはヒト由来の角膜上皮細胞に対して用いられる。細胞外マトリックスとは、細胞と接着し得る細胞外マトッリクスであれば特に限定されず、（１）コラーゲン、エラスチン等の繊維性タンパク質、（２）フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン等の細胞接着性糖タンパク質、（３）ヘパリン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸を含むグリコサミドグリカン等の複合糖質等が含まれ、また、これらの細胞外マトリックスから構成される基底膜（例えば、ボーマン膜、デスメ膜、羊膜など）も含むものである。
　細胞の生存には、細胞外マトリックスへの細胞接着が重要であることが報告されている（Frisch, S. M. et al., J. Cell Biol. 1994, 124, 619., Porcu, M., et al., Cornea 2007, 26, 73.）。また、角膜において、細胞外マトリックスの一つであるラミニン5の消失による細胞接着阻害が、角膜上皮細胞の細胞死を促進することも報告されている。本発明のポリペプチドは、細胞外マトリックスから構成されている角膜上皮の基底膜（ボーマン膜など）への角膜上皮細胞の接着を促進することにより、眼表層における角膜上皮細胞の細胞死を抑制する。また、角膜上皮の修復には、分裂、移動（伸展）、接着からなる細胞の運動が関与することが知られている（Suzuki, K. et al., Prog. Retin. Eye Res. 2003, 22, 113）。本発明のポリペプチドは、この細胞運動における接着過程を促進することによって、角膜上皮の損傷（すなわち、創傷または欠損）の修復を促進する。
　従って、本発明のポリペプチドを含有する医薬は角膜上皮障害の治療に有用である。角膜上皮障害を引き起こす具体的疾患としては、物理的・化学的刺激、アレルギー、細菌・真菌・ウイルス感染等による角膜炎のほか、角膜潰瘍、角膜上皮剥離（角膜糜爛）、角膜上皮浮腫、角膜熱傷、化学物質等による角膜腐蝕、ドライアイ、眼球乾燥症、慢性表層角膜炎、点状表層角膜症、角膜上皮糜爛、遷延性角膜上皮欠損等が挙げられる。本発明のポリペプチドはこれらの疾患に伴う角膜上皮障害の治療に特に有用である。
　また、本発明のポリペプチドは、涙腺腺房細胞からの涙液分泌促進作用を有する。涙液は、角膜や結膜からなる眼球表面を覆って角結膜の湿潤性を保持し、乾燥を防いでいる。しかしながら、近年、涙液減少症に伴う角結膜表面の乾燥、コンタクトレンズ装用時の眼の乾燥、あるいはＯＡ機器の操作中に起きる眼の乾燥等により、疲労感、異物感を始めとした種々の症状、すなわち、ドライアイ症状を訴える人が増えている。ドライアイは、しばしば角膜上皮細胞の障害による角膜上皮障害や角膜上皮糜爛等を伴い、重篤な場合は角膜潰瘍や眼感染症を発症させることもある。これらの乾燥に伴うさまざまな症状を緩和するために、塩化ナトリウム等の塩類を主剤とした人工涙液、ヒドロキシエチルセルロース、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸を含む点眼剤等が使用されているが、未だ満足すべきものがないのが現状である。しかしながら、これらの対症療法によって症状を軽減することはできるが、根本的に治療するための原因療法とはならない。涙液にはその本来の機能によりドライアイによる角結膜障害を治癒する効果があると考えられるので、涙腺に直接作用し、涙液分泌を促進する物質は、ドライアイおよびドライアイを伴う疾病に対して有用な予防治療薬となることが期待される。
　本発明のポリペプチドを含有する医薬品の投与剤型は特に制限されないが、好ましくは点眼剤、洗眼剤、眼軟膏、錠剤等が挙げられ、より好ましくは点眼剤または眼軟膏である。これらは汎用されている技術を用いて調製することができる。例えば、点眼剤は、添加物として、等張化剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、保存剤等を適宜配合して調製することができる。また、ｐＨ調節剤、増粘剤、分散剤などを添加し、薬物を懸濁化させることによって、安定な点眼剤を得ることもできる。
　等張化剤としては、例えばグリセリン、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ソルビトール、マンニトール等が挙げられる。
　緩衝剤としては、例えばリン酸、リン酸塩、クエン酸、酢酸、ε－アミノカプロン酸、トロメタモール等が挙げられる。
　ｐＨ調節剤としては、例えば塩酸、クエン酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ホウ酸、ホウ砂、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられる。
　可溶化剤としては、例えばポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、マクロゴール４０００等が挙げられる。
　増粘剤、分散剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース系高分子、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等が、また、安定化剤としては、例えばエデト酸、エデト酸ナトリウム等が挙げられる。
　保存剤としては、汎用のソルビン酸、ソルビン酸カリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール等が挙げられ、これらの保存剤を組み合わせて使用することもできる。
　本発明のポリペプチドを含有する点眼剤は、そのｐＨを４～８に設定することが望ましく、また、浸透圧比を１付近に設定することが望ましい。
　本発明のポリペプチドを含有する医薬品における本発明のポリペプチドの濃度は症状、年齢等に応じて設定すればよく、特に限定する必要はないが、例えば本発明のポリペプチドを点眼剤、洗眼剤等に含める場合、０．００１ｗ／ｖ％～１ｗ／ｖ％、好ましくは０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％である。投与量としては、点眼剤を例にすれば１回１滴～数滴、１日１～数回点眼すればよい。点眼剤は、通常の点眼液のほか、用時溶解型の点眼液でもよい。
　本発明のポリペプチドを有効成分として含有する医薬品は、例えば、哺乳動物（例、ラット、マウス、モルモット、トリ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ヒト等）などに使用することができる。
　以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１　ポリペプチドの合成
　ポリペプチドの合成は、固相合成法を用いて行った。すなわち、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を導入したアミノ酸を樹脂に担持し、溶媒としてジクロロメタンを用い、カップリング試薬として２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）及びＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）を用いてアミド結合形成反応を行った。保護基の脱離は、ＤＭＦ/２０％ピペリジンを用いて行った。得られた生成物を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＯＤＳ、溶媒：水/アセトニトリル/０．０５％ＴＦＡ）を用いて精製し、以下のアミノ酸配列から成るポリペプチド１～３を得た。
ポリペプチド１：ＶＱＧＴＡＫＶＴＳＳＲＱＥＬＮＰＬＫＳＩＶＥＫＳＩＬＬＴＥＱＡＬＡＫＡ（配列番号３）
白色粉末　MALDI-TOF-MS Calcd.: 3750.13; Found: 3752.27; Purity (HPLC A/A%) 96.207%
ポリペプチド２：ＱＧＴＡＫＶＴＳＳＲＱＥＬＮＰＬＫＳＩＶＥＫＳＩＬＬＴＥＱＡＬＡＫＡＧＫＧＭＨＧＧＶＰＧＧ（配列番号４）
白色粉末　MALDI-TOF-MS Calcd.: 4588.35; Found: 4590.14; Purity (HPLC A/A%) 96.88%
ポリペプチド３：ＱＧＴＡＫＶＴＳＳＲＱＥＬＮＰＬＫＳＩＶＥＫＳＩＬＬＴＥＱＡＬＡＫＡＧＫＧＭＨＧＧＶＰＧＧＫＱＦＩＥＮＧＳＥＦ（配列番号５）
白色粉末　MALDI-TOF-MS Calcd.: 5768.64; Found: 5767.61; Purity (HPLC A/A%) 95.15%
実施例２　ポリペプチドの合成
　ポリペプチドの合成は、固相合成法を用いて行った。すなわち、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を導入したアミノ酸を樹脂に担持し、溶媒としてジクロロメタンを用い、カップリング試薬として２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）及びＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）を用いてアミド結合形成反応を行った。保護基の脱離は、ＤＭＦ/２０％ピペリジンを用いて行った。得られた生成物を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＯＤＳ、溶媒：水/アセトニトリル/０．０５％ＴＦＡ）を用いて精製し、以下のアミノ酸配列から成るポリペプチド６および７を得た。
ポリペプチド６：ＱＧＴＡＫＶＴＳＳＲＱＥＬＮＰＬＫＳＩＶＥＫＳＩＬＬＴＥＱＡＬＡＫＡ（配列番号１）
白色粉末　MALDI-TOF-MS Calcd.: 3653.27; Found: 3652.28; Purity (HPLC A/A%) 99.26%
ポリペプチド７：ＥＩＳＧＰＡＥＰＡＳＰＰＥＴＴＴＴＡＱＥＴＳＡＡＡＶＱＧＴＡＫＶＴＳＳＲＱＥＬＮＰＬＫＳＩＶＥＫＳＩＬＬＴＥＱＡＬＡＫＡ（配列番号８）
白色粉末　MALDI-TOF-MS Calcd.: 6148.92; Found: 6146.82; Purity (HPLC A/A%) 87.47%　
比較例１
　上記の実施例１と同様の手法により、以下のアミノ酸配列からなるポリペプチド４および５を得た。
ポリペプチド４：ＥＩＳＧＰＡＥＰＡＳＰＰＥＴＴＴＴＡＱＥＴＳＡＡＡＶＱＧＴＡＫＶＴ（配列番号６）
白色粉末　MALDI-TOF-MS Calcd.: 3197.56; Found: 3199.98; Purity (HPLC A/A%) 99.53%
ポリペプチド５：ＱＧＴＡＫＶＴＳＳＲＱＥＬＮＰＬ（配列番号７）
白色粉末　MALDI-TOF-MS Calcd.: 1728.94; Found: 1728.82; Purity (HPLC A/A%) 98.01%
試験例１　ラクリチンの部分ペプチドによる、細胞外マトリックスへのヒト角膜上皮細胞の接着促進効果
　９６ウェルプレート（岩城硝子株式会社）に、１０μｇ/ｍＬの濃度の細胞外マトリックス溶液（コラーゲンタイプIV：ベクトン・デッキンソン株式会社）を加えた。それを３７℃で１時間インキュベートし、プレートに細胞外マトリックスをコーティングした。余分な細胞外マトリックス溶液を除去し、細胞外マトリックスでコーティングされなかった領域をブロッキングするために、０．１％のＢＳＡ溶液（Sigma-Aldrich株式会社）を加えた。続いて、ＢＳＡ溶液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄後、実施例１および比較例１で合成したポリペプチド１～５（濃度１００μｇ/ｍＬ）を１ウェル当たり５０μＬずつ加えた。さらに、このウェルに予め無血清の状態で一晩培養した株化ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥ－Ｔ：Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995, 36, 614に記載された方法にて調製され得る）を２×１０４個／１００μＬ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地／ウェルになるように加えた。それを３７℃で２０分間インキュベートし、細胞をプレートに接着させた後、接着した細胞の数をＭＴＴアッセイ法（同仁化学研究所）により測定した。ポリペプチドを加えなかった場合を１００％として求めた細胞接着率を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１から明らかなように、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドであるポリペプチド１～３は、角膜上皮細胞と細胞外マトリックスとの細胞接着を促進する活性を有することが確認された。
試験例２：ラクリチンの部分ペプチドによる、細胞外マトリックスへのヒト角膜上皮細胞の接着促進効果
　９６ウェルプレート（岩城硝子株式会社）に、１０μｇ/ｍＬの濃度の細胞外マトリックス溶液（コラーゲンタイプIV：ベクトン・デッキンソン株式会社）を加えた。それを３７℃で１時間インキュベートし、プレートに細胞外マトリックスをコーティングした。余分な細胞外マトリックス溶液を除去し、細胞外マトリックスでコーティングされなかった領域をブロッキングするために、０．１％のＢＳＡ溶液（Sigma-Aldrich株式会社）を加えた。続いて、ＢＳＡ溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄後、実施例２および比較例１で合成したポリペプチド４、６および７を最終濃度１０μＭになるようにＰＢＳに懸濁し、１ウェル当たり５０μＬずつ加えた。さらに、このウェルに、予め無血清の状態で一晩培養した株化ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥ－Ｔ：Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995, 36, 614に記載された方法にて調製され得る）を２ｘ１０４個／１００μＬ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地／ウェルになるように加えた。それを３７℃で２５分間インキュベートし、細胞をプレートに接着させた後、接着した細胞の数をＭＴＴアッセイ法（同仁化学研究所）により測定した。ポリペプチドを加えなかった場合を１００％として求めた細胞接着率を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
試験例３　ラクリチンの部分ペプチドによる、サル涙腺アシナー細胞からの涙液タンパク質分泌促進効果
　サル涙腺をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Invitrogen株式会社）中で細切し、０．７６ｍｇ／ｍＬ　ＥＤＴＡ（Sigma-Aldrich株式会社）を含むＨＢＳＳ（Invitrogen株式会社）と２００Ｕ／ｍＬ　collagenase A（Roche株式会社），６９８Ｕ／ｍＬ　Hyarulonidase（Worthington株式会社），１０Ｕ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ（Roche Diagnostics株式会社）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で処理し、細胞を単離した。０．０１ｍｇ／ｃｍ２　Collagen I（ベクトン・デッキンソン株式会社）でコートされた６　ウェル　プレート（旭硝子株式会社）へ１ｘ１０６個の細胞を播種し、ＣＯ２インキュベーターで終夜３７℃で培養した。翌日にサプリメントを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地へ培地を交換し、３７℃で３０分間のプレインキュベート後に、１μＭのポリペプチド１または４を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で３７℃で１０分間インキュベートした。培地中に分泌された涙液タンパク質としてラクトフェリンをウエスタンブロット法で検出し、ヒトラクトフェリン（Sigma-Aldrich株式会社）を標準として定量を行った。回収した培地は2D clean up kit（Bio-rad株式会社）で精製し、NuPAGE LDS sample buffer（Invitrogen株式会社）に溶解後７０℃で１０分間の熱変性を行った。等量のサンプルを４－１２％　NuPAGE Bis Tris gel、MES buffer（Invitrogen株式会社）中で２００Ｖ、３５分間の電気泳動の後、トランスブロットミニセル（Bio-rad株式会社）を用いて、ＰＶＤＦメンブレン（日本ミリポア株式会社）に１００Ｖで６０分間のブロッティングを行った。メンブレンは５％スキムミルク（Bio-rad株式会社）入りＴＴＢＳ（Bio-rad株式会社）で室温３０分間のブロッキング後、終夜４℃で１０００倍希釈のラクトフェリン抗体（ウサギで作製、Sigma-Aldrich株式会社）と反応させた。ＴＴＢＳで洗浄後、抗ｒａｂｂｉｔ　ＨＲＰの２次抗体を５０００倍に希釈し室温６０分間の反応を行い、ECL plus（GE healthcare株式会社）を用いて検出した。また、分泌したラクトフェリン量は、同じメンブレン上にヒトラクトフェリンの検量線を作製し、バンドのデンシティーの比較により、定量を行った。
　表３に示すように、配列番号３に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドであるポリペプチド１は、涙液タンパク質の分泌マーカーの一つであるラクトフェリンの分泌を促進した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
製剤例１　角膜上皮シート調製用培養液
　４ｍＬのHCGS増殖添加剤（内容物：mEGF、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリンおよびBPE、倉敷紡績株式会社　カタログ番号：KC-6150）および１５ｍｇのポリペプチド１にEpiLife培地（角膜上皮細胞基礎培地　Cascade Biologics社　カタログ番号：M-EPI-500-CA)を加え、全量５００ｍＬの培養液を調製する。
製剤例２　ラクリチン部分ペプチドを含有する点眼液
　常法により下に示す点眼液を調製する。
　ポリペプチド１　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
　リン酸二水素ナトリウム　　　　　　　　　　０．１ｇ
　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　０．９ｇ
　水酸化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　適量
　滅菌精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　全量１００ｍＬ（ｐＨ７）
　本出願は、日本で出願された特願２００８－０７１０６５を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (10)

  1. 　配列番号１に示すアミノ酸配列を含み、７０残基以下のアミノ酸長を有するポリペプチド。
  2. 　配列番号１に示すアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ請求項１記載のポリペプチドと同等の活性を有する、７０残基以下のアミノ酸長を有するポリペプチド。
  3. 　配列番号１に示すアミノ酸配列以外の部分が配列番号２に示すアミノ酸配列の部分配列で構成されている、請求項１記載のポリペプチド。
  4. 　請求項３記載のポリペプチドの配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ請求項３記載のポリペプチドと同等の活性を有するポリペプチド。
  5. 　配列番号２に示すアミノ酸配列の部分配列からなる請求項１記載のポリペプチド。
  6. 　請求項５記載のポリペプチドの配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ請求項５記載のポリペプチドと同等の活性を有するポリペプチド。
  7. 　配列番号３～５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  8. 　配列番号３～５のいずれかに示すアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ請求項７記載のポリペプチドと同等の活性を有するポリペプチド。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する、細胞接着促進剤。
  10. 　請求項１～８のいずれか１項に記載のポリペプチドの有効濃度を細胞に接触させることを含む、細胞の接着を促進させる方法。
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EP09722944.7A EP2270141B9 (en) 2008-03-19 2009-03-19 Partial peptide of lacritin
CA2718706A CA2718706A1 (en) 2008-03-19 2009-03-19 Partial peptide of lacritin
CN2009801094681A CN102083974A (zh) 2008-03-19 2009-03-19 催泪蛋白的部分肽
MX2010010213A MX2010010213A (es) 2008-03-19 2009-03-19 Peptido parcial de lacritina.
JP2010503936A JP5475640B2 (ja) 2008-03-19 2009-03-19 ラクリチンの部分ペプチド

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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011034207A1 (en) * 2009-09-16 2011-03-24 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. Partial peptide of lacritin
WO2011037196A1 (ja) * 2009-09-25 2011-03-31 千寿製薬株式会社 ラクリチン遺伝子の転写調節因子のスクリーニング方法
WO2017217535A1 (ja) * 2016-06-16 2017-12-21 サンスター株式会社 新規トリペプチド
JP2020508349A (ja) * 2017-02-21 2020-03-19 ティアソリューションズ・インコーポレイテッドＴｅａｒｓｏｌｕｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ． 安定なペプチド組成物

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201304829D0 (en) * 2013-03-15 2013-05-01 Petrowell Ltd Method and apparatus
KR102337935B1 (ko) * 2019-04-18 2021-12-10 코스맥스 주식회사 라크리틴을 포함하는 피부장벽 개선 및 보습 증진용 화장료 조성물
CN117143256B (zh) * 2023-10-27 2024-01-26 英特菲尔(成都)生物制品有限责任公司 一种用于毛发修护的细胞外基质蛋白及其制备方法与应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002065943A2 (en) 2001-02-20 2002-08-29 University Of Virginia Patent Foundation Ocular tear growth factor-like protein
JP2002331025A (ja) 2001-05-09 2002-11-19 Minoru Ueda 角膜治療用培養上皮細胞シート及びその製造方法
WO2003043542A1 (en) 2001-11-19 2003-05-30 Amniotec Inc. Ectocornea-like sheet and method of constructing the same
JP2004261533A (ja) 2003-02-14 2004-09-24 Mitsuo Okano 高生着性角膜上皮代替細胞シート、製造方法及びその利用方法
JP2004298447A (ja) 2003-03-31 2004-10-28 Menicon Co Ltd 結膜上皮細胞からなる角膜ないし結膜治療用培養シート、およびその作製方法
WO2005119899A2 (en) 2004-05-13 2005-12-15 University Of Virginia Patent Foundation Use of lacritin in promoting ocular cell survival
JP2008071065A (ja) 2006-09-13 2008-03-27 Hitachi Ltd インライン展開を行うコンパイル装置、方法、プログラム、記憶媒体

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008033477A2 (en) * 2006-09-14 2008-03-20 University Of Virginia Patent Foundation Antimicrobial activity in variants of lacritin

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002065943A2 (en) 2001-02-20 2002-08-29 University Of Virginia Patent Foundation Ocular tear growth factor-like protein
JP2004536570A (ja) * 2001-02-20 2004-12-09 ユニバーシティ オブ バージニア パテント ファウンデーション 眼涙増殖因子様タンパク質
JP2002331025A (ja) 2001-05-09 2002-11-19 Minoru Ueda 角膜治療用培養上皮細胞シート及びその製造方法
WO2003043542A1 (en) 2001-11-19 2003-05-30 Amniotec Inc. Ectocornea-like sheet and method of constructing the same
JP2004261533A (ja) 2003-02-14 2004-09-24 Mitsuo Okano 高生着性角膜上皮代替細胞シート、製造方法及びその利用方法
JP2004298447A (ja) 2003-03-31 2004-10-28 Menicon Co Ltd 結膜上皮細胞からなる角膜ないし結膜治療用培養シート、およびその作製方法
WO2005119899A2 (en) 2004-05-13 2005-12-15 University Of Virginia Patent Foundation Use of lacritin in promoting ocular cell survival
JP2008071065A (ja) 2006-09-13 2008-03-27 Hitachi Ltd インライン展開を行うコンパイル装置、方法、プログラム、記憶媒体

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications", 1990, ACADEMIC PRESS
"Shin-Seikagaku Jikken-Koza vol. 1, protein IV", 1992
"The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", vol. 1-5
FRISCH, S. M. ET AL., J. CELL BIOL., vol. 124, 1994, pages 619
FRISCH, S. M. ET AL., JOURNAL OF CELL BIOLOGY, vol. 124, 1994, pages 619 - 626
INVEST OPHTHALMOL VIS SCI., vol. 36, 1995, pages 614
MA P. ET AL.: "Heparanase deglycanation of syndecan-1 is required for binding of the epithelial-restricted prosecretory mitogen lacritin.", J. CELL BIOL., vol. 174, no. 7, 2006, pages 1097 - 1106, XP009130717 *
OPHTHALMOLOGY, vol. 42, no. 3, 2000, pages 245 - 250
PORCU, M. ET AL., CORNEA, vol. 26, 2007, pages 73
SANGHI, S. ET AL., JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 310, 2001, pages 127 - 139
See also references of EP2270141A4
SUZUKI, K. ET AL., PROG. RETIN. EYE RES., vol. 22, 2003, pages 113
WANG J.: "Restricted epithelial proliferation by lacritin via PKCalpha-dependent NFAT and mTOR pathways", J. CELL BIOL., vol. 174, no. 5, 2006, pages 689 - 700, XP009150209 *
WANG, J. ET AL., JOURNAL OF CELL BIOLOGY, vol. 174, 2006, pages 689 - 700

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011034207A1 (en) * 2009-09-16 2011-03-24 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. Partial peptide of lacritin
JP2013504519A (ja) * 2009-09-16 2013-02-07 千寿製薬株式会社 ラクリチンの部分ペプチド
US8518412B2 (en) 2009-09-16 2013-08-27 Senju Pharmaceutical Co, Ltd. Partial peptide of lacritin
WO2011037196A1 (ja) * 2009-09-25 2011-03-31 千寿製薬株式会社 ラクリチン遺伝子の転写調節因子のスクリーニング方法
WO2017217535A1 (ja) * 2016-06-16 2017-12-21 サンスター株式会社 新規トリペプチド
JPWO2017217535A1 (ja) * 2016-06-16 2019-04-04 サンスター株式会社 新規トリペプチド
US10676505B2 (en) 2016-06-16 2020-06-09 Sunstar Inc. Tripeptides having angiotensin converting enzyme inhibitory activity and uses thereof
JP2020508349A (ja) * 2017-02-21 2020-03-19 ティアソリューションズ・インコーポレイテッドＴｅａｒｓｏｌｕｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ． 安定なペプチド組成物
JP7223712B2 (ja) 2017-02-21 2023-02-16 ティアソリューションズ・インコーポレイテッド 安定なペプチド組成物

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