CN1753697A - 来自羊膜的医用材料及其制作方法 - Google Patents

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Abstract

提供操作容易、可进行充分的灭菌处理、以及作为基材用于在其上构建细胞层的发挥良好功能的来自羊膜的医用材料。(i)残留基底膜的至少一部分，从羊膜上去除上皮层，然后(ii)在残存的基底膜使用时在其上保持着细胞可接合及增殖的构造的条件下，使其干燥。

Description

来自羊膜的医用材料及其制作方法
技术领域
本发明涉及来自羊膜的医用材料及其使用。本发明的医用材料，例如可用于填补创伤的材料、保护创伤的材料、治愈创伤的材料、防止愈合的材料、人工组织等，具体来说，可用于制作移植用的上皮(例如角膜上皮)或移植用的内皮(例如角膜内皮)。
背景技术
在细胞培养技术的发展和医疗技术的进步的背景下，试图重建(再生)不能发挥原来功能的组织的尝试，以各种组织为目标进行着。例如，有这样的尝试：在适当的基材上使皮肤表皮或角膜上皮在体外(invitro)重新构建，将其作为移植用的组织来利用。对于在构建这样的移植用组织中所用的基材，要求其对生命体有高的亲和性(及低的免疫原性)，并且与目的细胞良好地接合，还要有可以增殖等的特性。以往，羊膜作为具备这种特性的材料被广泛地利用。羊膜是与羊水一起将胎儿包入的膜，由于其免疫原性低，被认为是制作移植片的特别优选的材料。羊膜概略上说，具有在含有胶原的实质层上，通过基底膜形成上皮层的构造。如上所述，羊膜虽然是免疫原性低的组织，但为了获得更低的免疫原性，并在其上构建细胞层来构建移植用的组织的时候，有必要防止混入来自羊膜的细胞，为此，认为优选除去上皮层后使用(参照特开平5-56987号公报)。
发明内容
制作除去上皮层的羊膜，例如可按以下进行。首先，洗净采取的羊膜，去除多余的附着物，然后剥离上皮层。如此得到的不含有上皮的羊膜，除了制作后立刻使用的情况外，可冷藏或冻结保存直至使用。因此，要求在使用前有充分的温度管理，其操作(特别是运送的时候)需要特别地注意。另外，因为是向生命体移植的材料，所以在使用前需要进行灭菌处理，但本发明人等的研究结果表明，如果对冷藏状态或者冻结状态下的不含有上皮的羊膜进行γ线或电子射线等的处理，可观察到溶液的变色等，其不能耐受必要的灭菌处理。
本发明鉴于上述课题，其主要目的是提供作为基材具有良好功能的来自羊膜的医用材料，该材料容易操作，可进行充分的灭菌处理，并在其上可构建细胞层。
本发明人等关注羊膜的基底膜，为了作为可构建细胞层的基材成为适宜的医用材料，认为使基底膜残存的同时维持其构造是重要的。另外，从操作的角度讲，认为在使用前为干燥的形态是最优选的。在上述思考下，本发明人等将羊膜作为初始原料，尝试构建能达到上述目的的医用材料。首先，使基底膜的至少一部分残存，去除羊膜的上皮。接着，通过真空冻结干燥的方法去除水分，得到干燥状态的羊膜(不含有上皮的羊膜)。为了研究得到的不含有上皮的羊膜的特性，以该羊膜作为基材尝试构建细胞层。结果是，在用角膜上皮细胞作为模型时，观察到细胞在该羊膜上有良好的接合及增殖，更进一步，观察到重层化。然后，将最终得到的细胞层(角膜上皮样片)作为移植片，进行移植试验，结果移植片确实地附着在生命体上生长，并确认了良好的角膜重建效果。本发明是在上述成果的基础上的产物，提供以下的各种构成。
[1]具备以下的性状(1)～(3)的来自羊膜的医用材料：
(1)是干燥状态；
(2)不具有上皮层；及
(3)具有在使用时在其上保持着细胞可结合及增殖的构造的基底膜。
[2]如[1]中所述的来自羊膜的医用材料，其特征为，进一步具备以下的性状(4)：
(4)在与氧没有实质地接触的状态下，被装入容器中。
[3]如[1]或[2]中所述的来自羊膜的医用材料，上述与氧没有实质地接触的状态是容器内作成真空或是用氮置换了的状态。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的来自羊膜的医用材料，其中上述细胞是角膜上皮细胞、角膜内皮细胞或口腔粘膜上皮细胞。
[5]来自羊膜的医用材料的制作方法，包括以下的步骤(i)和(ii)：
(i)残留基底膜的至少一部分，从羊膜上去除上皮层的步骤；及
(ii)在残存的基底膜在使用时在其上保持着细胞可接合及增殖的构造的条件下，将步骤(i)得到的不含有上皮的羊膜干燥的步骤。
[6]如[5]所述的来自羊膜的医用材料的制作方法，其中上述步骤(ii)是通过冻结干燥处理来实施的。
[7]如[5]或[6]所述的来自羊膜的医用材料的制作方法，进一步包括以下的步骤(iii)：
(iii)将步骤(ii)得到的干燥体，在使之与氧没有实质地接触的状态下，装入容器中的步骤。
[8]如[7]所述的来自羊膜的医用材料的制作方法，上述与氧没有实质地接触的状态是容器内作成真空或是用氮置换了的状态。
[9]角膜上皮样片的制作方法，包括以下的步骤：
在[1]～[4]中任一项所述的医用材料上培养角膜上皮细胞的步骤。
[10]角膜上皮样片的制作方法，包括以下的步骤(a)及(b)：
(a)在[1]～[4]中任一项所述的医用材料上培养角膜上皮细胞或是具有向角膜上皮样细胞分化的能力的细胞的步骤；及
(b)在上述细胞增殖、重层化之后，使最表层与空气接触的步骤。
[11]如[10]所述的角膜上皮样片的制作方法，上述步骤(a)是在支持细胞的共存下实施的。
[12]如[10]所述的角膜上皮样片的制作方法，上述步骤(a)是在支持细胞的共存下、并且在该支持细胞和上述医用材料之间存在该支持细胞不能通过的孔径的隔离膜的状态下实施的。
[13]如[10]～[12]中任一项所述的角膜上皮样片的制作方法，在上述步骤(a)中培养的细胞是口腔粘膜上皮细胞。
[14]角膜内皮样片的制作方法，包括以下的步骤(A)～(C)：
(A)培养采取的角膜内皮细胞，使之增殖的步骤；
(B)将增殖的角膜内皮细胞回收，制作细胞悬浮液的步骤；及
(C)将上述细胞悬浮液在[1]～[4]中任一项所述的医用材料上播种、培养的步骤。
[15]如[14]所述的角膜内皮样片的制作方法，在上述步骤(B)之后实施以下的步骤(B-1)：
(B-1)通过离心处理，提高上述细胞悬浮液的细胞密度的步骤。
[16]如[14]或[15]所述的角膜内皮样片的制作方法，其特征为，在上述步骤(C)中，播种细胞悬浮液后作离心处理。
[17]如[14]或[15]所述的角膜内皮样片的制作方法，上述步骤
(C)包括以下的步骤(C-1)～(C-5)：
(C-1)在培养容器内，留置具有由培养液可以通过的孔径的膜形成的底面的容器的步骤；
(C-2)在上述容器的上述底面上，载置[1]～[4]中任一项所述的医用材料的步骤；
(C-3)将上述细胞悬浮液播种在上述医用材料上的步骤；
(C-4)离心处理的步骤；及
(C-5)培养的步骤。
只要没有特别地记述，本说明书中所说的“角膜上皮细胞”是作为包括角膜上皮细胞层中含有的细胞，即也包含角膜上皮干细胞。同样，所洗的“角膜内皮细胞”是作为包括角膜内皮细胞层中含有的细胞，即也包含角膜内皮干细胞。另外，本说明书中所说的“角膜上皮样片”是作为意味着具有类似角膜上皮的特征、可以代替角膜上皮供给移植的细胞层的用语使用的。同样，所说的“角膜上皮移植用片”是作为意味着备有具有类似角膜上皮特征的细胞层、可用于角膜上皮重建供给移植的组合物的用语使用的。另一方面，所说的“角膜内皮样片”是作为意味着具有类似角膜内皮特征、可代替角膜内皮供给移植的细胞层的用语使用的。同样，所说的“角膜内皮移植用片”是作为意味着备有具有类似角膜内皮特征的细胞层、可用于角膜内皮重建供给移植的组合物的用语使用的。
附图说明
图1是用扫描电镜显示的羊膜的图像。A是正常状态(没有进行上皮处理的状态)的羊膜表面的图像；B是对上皮作搔扒处理后的羊膜表面的图像。在A中可观察到多角形的羊膜上皮。另一方面，在B中无法看出羊膜上皮，确认上皮被完全地除去了。
图2是综合冻结干燥羊膜的表面分析结果的表。表中+表示阳性，-表示阴性。AM(-)Fdγray：在实施例5的方法中得到的干燥羊膜；AM(+)：采取后只是进行洗净的样本；AM(-)：进行上皮的去除、不进行冻结干燥处理的样本；AM(-)dispase：通过分散酶处理去除上皮、不进行干燥处理的样本；AM(-)FD：进行去除上皮及冻结干燥处理、不进行灭菌处理的样本；AM(-)γray：去除上皮后、不作冻结干燥处理而进行灭菌处理的样本。
图3是示意地显示在羊膜上培养口腔粘膜上皮细胞的时候的器具等的状态的断面图。在culture dish 1内静置culture insert 2，在culture dish 1的底面形成3T3细胞层5。另外，显示了在culture insert 2的底面上静置羊膜3，在其上培养角膜上皮细胞4的状态。符号6是培养基。
图4是显示在冻结干燥羊膜上形成的角膜上皮细胞层的图像(HE(苏木精伊红)染色的图像)。
图5是观察手术前眼表面的状态的图像(上图)，及显示移植角膜上皮移植用片后经过2天时的眼表面的状态(荧光素染色的图像)(下图)的图像。用荧光素染色的部分(箭头所示)用斜线表示。眼表面(移植部分)没有被荧光素染色，可知移植片在眼表面附着生长了。另外，在移植片的周围整个一周可确认有荧光素的染色性。
图6是显示移植角膜上皮移植用片后，经过7天时眼表面的状态的图像(上图是直接观察的图像，下图是荧光素染色的图像)。可知移植片维持了透明性(上图)。用荧光素染色的部分(箭头所示)用斜线表示。可知的是，显示染色性的区域很少，移植片残存在眼表面上，而且与移植后2天时相比，向周围伸展了。
具体实施方式
本发明的第1部分是涉及来自羊膜的医用材料，其特征为，具备以下的性状(1)～(3)：
(1)是干燥状态，
(2)没有上皮层，
(3)具有在使用时在其上保持着可以接合及增殖的构造的基底膜。
本发明的医用材料的第1个特征是来自羊膜。所说的“来自羊膜”意味着广义的以羊膜为初始原料得到的物质。从免疫原性的角度讲，本发明的医用材料优选来自人的羊膜。人的羊膜是覆于子宫和胎盘最表层的膜，是在胶原丰富的实质组织上形成基底膜、上皮层而构成的。
本发明的医用材料通过具备(1)的性状，使操作变得容易。具体来说，即使保存在常温(例如大约10℃～35℃)下也可以。也就是说，在使用前在冷冻以及冷藏环境下的管理变得没有必要、其操作(保存、运送等)变得容易。但是，以上所述并不意味着本发明的医用材料不能在低温保存，根据需要也可以提供冷冻以及冷藏保存。
另一方面，由于处于干燥状态，可以进行不影响其使用的、有效的灭菌处理。另外，因为是干燥状态，随时间的劣化是非常少的，可长时间维持高品质的状态。
本发明具备的(2)的性状对免疫原性的降低是有贡献的。也就是说，羊膜本来就是免疫原性低的材料，而通过将上皮层完全地去除，免疫原性会更低。另一方面，从可以在本发明的医用材料上良好地构建目的细胞层的观点看，没有上皮层的性状是重要的。如果以上皮层残存的状态的羊膜作为基材，在其上播种特定的细胞构建细胞层，播种的细胞的增殖会因羊膜上皮细胞而被抑制。通过使用完全去除了上皮层的羊膜，就不会担心这样的因羊膜上皮细胞所致的抑制增殖。这样，通过没有上皮的特征，本发明的医用材料可以作为构建目的细胞层的适宜的基材而发挥功能。
本发明的医用材料通过具备(3)的性状，可以成为作为用于构建目的细胞层的基材而可以适宜地使用的材料。完全去除上皮后使之自然干燥的羊膜，即只含有实质层的自然干燥的羊膜，一般来说，由于基底膜的成分被分解，在其上播种细胞时该细胞不会良好地接合。但是，本发明的医用材料中因为使基底膜残存并且使之高度保持其构造，通过基底膜中含有的接合因子，使在其上播种的细胞良好地接合，结果就发生了细胞的增殖及重层化。
还有，在(3)的性状中所说的“在使用时”，是指将本发明的医用材料浸渍在适当的溶液中(灭菌水、生理盐水、磷酸缓冲液、适当的培养基等)，使之从干燥状态复原了的时候。
对于基底膜的有无，可用通过检测基底膜中特征性的构成成分胶原IV(α1、α2及α5)、胶原VII、昆布氨酸5等的存在来确认。也就是说，在用本发明的医用材料使之复原了的时候，这些成分的至少一个，优选是多个，更优选是全部被检测出来。另外，胶原IV等的检测，可用它们的特异性抗体通过免疫染色法来实施。
作为在本发明的医用材料上被增殖的细胞，可举例如上皮细胞(角膜上皮细胞、皮肤上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞等)、内皮细胞(角膜内皮细胞等)。另外，口腔粘膜上皮细胞是例如在齿根部存在的细胞(口腔内缘粘膜上皮细胞)、口唇部的粘膜上皮细胞、腭部的粘膜上皮细胞，颊部的粘膜上皮细胞等。
如上，本发明的来自羊膜的医用材料，对于构建以移植为前提的细胞层，是非常有用的材料。
本发明的医用材料，优选在实施上与氧不接触的状态下装入容器中来提供。所述的形态，不会因氧而致品质劣化，可以长时间地维持高品质。所说的“实质上与氧不接触的状态”是指容器内氧实质上不存在的状态，具体来说，可以举例如将容器内作成真空的状态或在容器内填充氮气置换的状态。其中的“容器”只要是适于装入本发明的医用材料就可以，没有特别地限定，例如，可以使用可塑性合成树脂制的袋状或管状的容器(将两枚片状物重合，使周边部封上的容器亦可)、或是用玻璃等无机材料制的瓶状容器等来作本发明的容器。
以上的本发明的医用材料，可例如用以下的方法(本发明的第二个层面)来制作。
本发明的第二个层面涉及来自羊膜的医用材料的制作方法，其特征为，包括以下的步骤(i)和(ii)
(i)残留基底膜的至少一部分，从羊膜上去除上皮层的步骤。
(ii)残存的基底膜在使用时在其上保持细胞可接合及增殖的构造的条件下，将步骤(i)得到的不含有上皮的羊膜干燥的步骤。
在步骤(i)中去除上皮层，但此时不是将基底膜一并去除，至少要使它残存一部分。这样的处理，例如可以用细胞刮器(cell scraper)、镊子等在上皮层作搔扒来进行。优选的是，用EDTA和蛋白分解酶等来预先减缓构成上皮层的细胞之间的接合，再用细胞刮器等来实施搔扒。但是，这样的前处理(利用EDTA等的处理)，优选在不破坏居于上皮层在向实质层接合之间的基底膜的构造的条件下来实施。例如，如果用分散酶在一般条件下(例如，添加分散酶至1.2IU的状态，在37℃下使其反应1小时的条件)处理，不只是上皮层，连基底膜也会受到很大的损害。进行这样的前处理时，就不能使保持原来功能的基底膜残存下来。本发明的步骤(i)中的重点是，使基底膜的至少一部分在保持原来功能的状态下残存下来，同时完全地去除上皮层。例如通过用EDTA的前处理(例如，添加EDTA至0.02％～0.1％的状态，在4℃～37℃下使其反应1小时～4小时的条件)，对基底膜的影响是非常小的。
步骤(i)中所使用的羊膜优选是人的羊膜。人的羊膜，例如可以在分娩时从产后得到的人胎儿膜、胎盘等上采取。具体来说，可以通过处理·精制刚刚分娩后得到的含有人胎儿膜、胎盘及脐带的一体物来制备人的羊膜。这样的人的羊膜的制备方法可以采用特开平5-56987号中所述的方法等公知的方法。也就是说，从分娩时得到的胎儿膜上剥离羊膜，用超声波洗净等的物理方法处理及酶处理等来去除残存的组织，经过适当的洗净工序就可制备人的羊膜。这样制备的人的羊膜可以冻结保存到要开始进行步骤(i)时。人的羊膜的冻结，例如可以在-80℃下，保存在DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)和甘油等体积混合的液体中。通过冻结保存可提高操作性是勿庸置疑的，还有望减少抗原性。
在步骤(i)之后实施的步骤(ii)中，在残存的基底膜在使用时在其上保持细胞可接合及增殖的构造的条件下，将步骤(i)得到的不含有上皮的羊膜进行干燥处理。只要能在这样的条件下处理，干燥处理的方法不作限定，但优选的是采用冻结干燥处理。冻结干燥处理一般是在使沸点达到约-20℃(107Pa，0.8Torr)～约-50℃(4Pa，0.03Torr)的低气压环境(真空)中，通过升华将水分从处于冻结固化状态的试验材料(例如在约-40℃冻结保存的试验材料)中除去。通过冻结干燥处理，可使内部均匀地脱去水分，另外由于实现了高的干燥度，可以在高度保持原本的功能及形态的状态下使其干燥。另外，冻结干燥处理具有如下等的特征：1.处理过程中的劣化少、2.可以容易地进行无菌化、3.可得到具有良好复原性的干燥体、4.可得到具有良好保存性的干燥体。
冻结干燥处理可以用具备真空室、冷却·加热装置、排气装置(冷槽(cold trap)及真空泵)的冻结干燥机来进行。有很多的冻结干燥装置在市售着，在本发明的步骤(ii)中可以使用从这些装置中任意选择的装置。另外，处理条件可以按照使用的装置所附的使用说明书来设定。在设定时可以考虑提供的试验材料的大小、干燥度等。例如可以设定干燥度使得水分活性(AM)小于0.5。
在以上的步骤(ii)后，优选实施以下的步骤(iii)。
(iii)将由步骤(ii)得到的干燥体，以达到实质上不与氧接触的状态装入容器的步骤。
如果进行这个步骤(iii)，可得到与氧实质上被隔断状态下被包装的不含有上皮的羊膜的干燥体。由此成为能够长期保存的来自羊膜的医用材料。
步骤(iii)，例如在将由步骤(ii)得到的干燥体装入适当的容器内后，可将容器内作成真空，或者通过将容器内进行氮置换来实施。或者，还可通过在容器内一起封入脱氧剂来实施。另外，作为容器可使用例如可塑性的合成树脂制的袋状或管状的容器(将两枚片状物重合，使周边部封上的容器亦可)、或是可以使用玻璃等无机材料制的瓶状容器等。
本发明的其他层面涉及由本发明的第一层面提供的来自羊膜的医用材料的利用方法，其中一种实施方式是角膜上皮样片的制备方法。在这种实施方式中，在来自羊膜的医用材料上培养角膜上皮细胞或是具有向角膜上皮细胞样细胞分化的能力的细胞(以下，将这样的细胞统称“角膜上皮用细胞”)。角膜上皮细胞可由适当的供者的角膜上取得。在可以利用的情况下，优选的是使用受者自身的角膜上皮细胞。这是因为在提供移植的时候可以制作没有免疫排斥危险的角膜上皮样片，由此可以进行没有免疫排斥反应的移植手术。在不能得到受者自身的角膜上皮的时候或是难以得到的时候，也可以使用受者以外的角膜上皮细胞，但此时优选选择考虑到免疫适合性的供者。
所说的“具有向角膜上皮细胞样细胞分化的能力的细胞”是指，通过在体外培养或是在移植后在生命体内可以构建角膜上皮样细胞层的细胞。这里所说的“角膜上皮样细胞层”是指，具有为达到作为角膜上皮的功能所必要的各种性状(例如，具有高的透明性、最上层的细胞没有角化、具有屏障功能等)的细胞层。
本发明人等确认了口腔粘膜上皮细胞具有这样的向角膜上皮样细胞分化的能力(参照PCT/JP02/11857)。考虑在口腔粘膜上皮细胞中可能存在干细胞，可以容易地向形成上皮样细胞层的细胞进行分化诱导。另外，使用口腔粘膜上皮细胞具有采取容易、可以采取大量的细胞、进而在处置双眼性的患者的时候可以用自身的细胞制备移植材料等的优点。特别是，对于不能采取角膜上皮细胞的患者来说，可以适用来自自身细胞的移植材料的优点，有望在临床上很大地消解非常重要的排斥反应的问题。
作为口腔粘膜上皮细胞，可使用存在于牙根部的细胞(口腔内缘粘膜上皮细胞)、口唇部的细胞、腭部的细胞、颊部的细胞。其中，口腔内缘粘膜上皮细胞因其增殖能力高、且抗原性低，特别优选使用它。口腔粘膜上皮细胞可用手术刀等在目的细胞存在的地方，通过切除、搔扒的方法来采取。对于口腔内缘粘膜上皮细胞，可以将拔下的牙齿上附着的口腔粘膜上皮从牙釉质骨质移行部位分离下来，在得到的组织切片上采取。另外，为了去除结缔组织等不纯物质，优选用分散酶或胰蛋白酶等酶进行处理及过滤处理。
本发明所制备的角膜上皮样片，可以使用从被移植患者以外的口腔中采取的口腔粘膜上皮细胞，但如果考虑免疫排斥反应，优选从患者自身的口腔中采取口腔粘膜上皮细胞，进行培养。
角膜上皮用细胞在本发明的来自羊膜的医用材料上被培养。也就是说，将采取的角膜上皮用细胞在来自羊膜的医用材料上播种，在适当的条件下培养。例如可以将角膜上皮用细胞在来自羊膜的医用材料上播种，使得细胞密度约为1×103个/cm2或更多，优选约1×103个/cm2～约1×107个/cm2，更优选约1×104个/cm2～约1×106个/cm2。
角膜上皮细胞的培养优选是在支持细胞存在的条件下进行。支持细胞也叫喂养细胞，在培养液中供给成长因子等等。通过与支持细胞共存的条件下培养，可以期待角膜上皮用细胞增殖效率的提高。支持细胞例如可以使用3T3细胞(瑞士鼠3T3细胞、鼠NIH3T3细胞、3T3J2细胞等)等。其中，从增殖效率、容易操作等的角度讲，优选使用鼠NIH3T3细胞作支持细胞。
优选预先用丝裂霉素C将支持细胞作失活处置。这是为了防止因支持细胞自身的增殖而阻害角膜上皮用细胞的增殖，从而提高角膜上皮用细胞的增殖效率。这样的失活处置可用辐射线处理等来进行。
角膜上皮用细胞的培养在与支持细胞共存的条件下进行的时候，优选在支持细胞和胶原层之间设置支持细胞不能通过的孔径的隔离膜。通过利用这个隔离膜，可以在培养时防止支持细胞侵入到来自羊膜的医用材料的一侧(即，角膜上皮用细胞的一侧)。其结果是，最终得到的角膜上皮样片内没有混入支持细胞的危险。这意味着可以制作没有因支持细胞所致的免疫排斥反应问题的角膜上皮样片，在临床上非常有意义。
作为隔离膜，可以适当地选择使用具有支持细胞不能通过的孔径的公知的隔离膜。例如可以使用聚碳酸酯制的孔径约0.4μm～3.0μm的膜。隔离膜的材质没有特别的限定，除了聚碳酸酯，还可用聚酯等。这样的隔离膜有市售的，可以容易地得到。
作为使用隔离膜时培养方法的例子，可以举出以下的方法。首先，通过在培养皿等的容器(第1容器)中播种不活化处理过的支持细胞并培养，在容器的表面上形成支持细胞层。其次，将用隔离膜形成底面的第2容器设置在第1容器内。此时，调整第2容器的位置，使第2容器的底面浸入培养液中。接着，在第2容器的底面，即在隔离膜上载置来自羊膜的医用材料。然后，在来自羊膜的医用材料上播种角膜上皮用细胞，进行培养。
也可以预先在第2容器的底面载置来自羊膜的医用材料(载置后也可进行干燥处理)，将此第2容器设置在播种了支持细胞的第1容器内，然后在来自羊膜的医用材料上播种角膜上皮用细胞，进行培养。
支持细胞的细胞密度，例如可以为约1×102个/cm2或更多，优选约1×102个/cm2～约1×107个/cm2，更优选约1×103个/cm2～1×105个/cm2。就与角膜上皮用细胞数之间的对比来说，例如相对于角膜上皮用细胞数，使用的支持细胞数在1/103倍～1/10u倍，优选是1/102～1倍的条件下可以进行培养。如果支持细胞数少，角膜上皮用细胞的增殖率就低，太少的时候就得不到角膜上皮用细胞的重层化。另一方面，支持细胞数太多的时候反而使角膜上皮用细胞的增殖率低下，不适宜。
在培养角膜上皮用细胞时所用的培养液，只要是可使该细胞增殖、重层化的即可，没有特别的限定。例如，可以使用将通常在上皮细胞的生长中所使用的DMEM(Dulbecco’modified Eagle’s medium)和Ham’s F12培养基(Ham’s F12 medium)按一定比例混合，添加了FBS、生长因子、抗生素等的培养基。作为具体的例子，可以举出添加了FBS(10％)、胰岛素(5mg/ml)、霍乱毒素(0.1nM))、上皮细胞增殖因子(EGF)(10ng/ml)以及青霉素—链霉素(50IU/ml)的DMEM和Ham’s F12培养基的混合培养基(混合体积比为1∶1)。另外，也可以使用进一步添加了三碘甲状腺氨酸(例如2nM)、谷酰胺(例如4mM)、铁传递蛋白(例如5mg/ml)、腺嘌呤(例如0.18mM)和/或氢化可的松(ハイドロコルチゾン)(例如0.4mg/ml)的DMEM/Ham’s F12的混合培养基。
通过在来自羊膜的医用材料上培养角膜上皮用细胞(步骤(a))，角膜上皮用细胞在来自羊膜的医用材料上增殖、重层化。接着，为了让形成细胞层的细胞分化和诱导屏障功能，进行使重层化的细胞层的表层与空气接触的步骤(步骤(b))。此步骤的过程在本说明书中叫作“空气—上举”(Air-lifting)。
此步骤(b)，通过用吸液玻璃管、移液管将培养液的一部分一时性地去除使培养液的表面降低，由此可以使细胞层的最表层一时性地暴露在培养液外来实施。另外，也可以通过将细胞层和来自羊膜的医用材料一起抬高，使最表层从培养液的表面一时性地暴露来实施。进而，还可以通过用试管等将空气送入培养液中，使空气接触细胞层的最上层来实施该步骤。从操作的容易性的角度讲，优选的是通过使培养液的表面下降，从而使细胞层的最表层暴露的方法来实施
进行步骤(b)的时间，也就是使重层化的细胞层的最表层与空气接触的时间，根据细胞状态及培养条件等而变动，可例如为3天～3周左右，优选的是5天～2周，更优选的是约1周。
通过以上本发明的方法，可以在来自羊膜的医用材料上形成来自角膜上皮用细胞的细胞重层化而得的细胞层(角膜上皮样片)。这种角膜上皮样片和作为培养基质使用的来自羊膜的医用材料一起，可以作为对有角膜损伤、欠损等的患者的移植材料(角膜上皮的替代物)而使用。这种情况下，将来自羊膜的医用材料层以成为眼球侧的方式移植到角膜上皮欠损的部位。移植的时候，优选用手术用的缝合线将移植片与周围的组织固定，从而促使它的生长附着。另外，移植后，优选用治疗用的隐形眼镜将移植部位的表面一时性地盖住来进行保护。
另外，可以将去除了来自羊膜的医用材料的一部分，或者去除了全部的片(即只有细胞层)作为移植片来使用。去除来自羊膜的医用材料，可以通过用EDTA等的化学处理、用蛋白分解酶等的酶处理及用镊子等的搔扒等的物理处理来进行。
通过以上的方法，可制作经来自角膜上皮用细胞的细胞重层化的角膜上皮样细胞层(角膜上皮样片)。但本方法也可视为提供在来自羊膜的医用材料上形成该细胞层而成的角膜移植用的移植材料(角膜上皮移植用片)。也就是说，本发明方法可以作为具有这样构造的角膜上皮移植用片的制作方法来使用。
作为角膜上皮用细胞，在使用口腔粘膜上皮细胞的时候，在角膜上皮样片中，来自口腔粘膜上皮细胞的细胞发生重层化。来自口腔粘膜上皮的细胞，在构成角膜上皮样片的细胞中，可以以发现口腔粘膜上皮细胞特异性的角蛋白4或角蛋白13作为指标来确认。或者，也可以以发现角蛋白3作为指标。这种角蛋白3，被认为是角膜特异性的角蛋白之一，但口腔粘膜上皮细胞中也确认发现了它。另外，从发现了作为角膜特异性的角蛋白的角蛋白3这一点来看，也可以说优选将口腔粘膜上皮细胞作为制作角膜上皮移植用的组合物的材料来使用。
另一方面，也可以通过检测口腔粘膜上皮细胞特异性的基因表达，来确认形成细胞层的细胞是来自口腔粘膜上皮细胞的。
本发明所提供的角膜上皮样片，优选的是，具有以下性状或特性中的几个。特别优选的是，具备以下的全部的性状或特性。
(1)最上层的细胞没有角化。这是角膜上皮具备的特征之一。通过确认此特征，可以期待本发明的角膜上皮样片与角膜上皮类似，并发挥与角膜上皮同样的功能。另外，所说的角化，别名也可称为角质化，是指在细胞内生出角蛋白，失去细胞核等的细胞内小器官的现象。细胞是否发生角化，例如可以以细胞的扁平化或有没有细胞核作为指标来确认。
(2)最上层的细胞为扁平形状。也就是来自角膜形成用细胞的细胞层具有在由略圆柱形的细胞形成的层上形成有由扁平形状的细胞形成的层的构造。认为扁平形状的细胞通过覆盖最上层来提高细胞间的气密性，从而达到下面的屏障功能。在角膜上皮中，最上层的细胞也是扁平形状的。通过确认此特征，可以期待本发明的角膜上皮样片与角膜上皮类似，并发挥与角膜上皮同样的功能。
(3)具有屏障功能。所说的屏障功能，是指防止液体、气体等在表层的浸润，及防止隔着表层的液体扩散的功能。通过具有所说的屏障功能，可以使移植后在其表面保持水分(眼泪)，或是防止过多的水分扩散。角膜通过具有屏障功能，可以在其表面保持水分，由此发挥可以耐受眨眼的功能。因此，具有屏障功能是角膜用移植材料所要求的重要特性之一。通过确认此特征，可以期待本发明的角膜上皮样片与角膜上皮类似，并发挥与角膜上皮同样的功能。是否具有屏障功能，例如可以通过含有辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase)等的标记物质的溶液的浸润程度来检测。
本发明的来自羊膜的医用材料的其他的利用方式涉及角膜内皮样片的制作方法。在这种实施方式中，通过在来自羊膜的医用材料上培养角膜内皮细胞来构建角膜内皮样细胞层。具体来说，按照以下的顺序进行角膜内皮样细胞的制作。
<1>角膜内皮细胞的采取及增殖
角膜内皮细胞可以从受者自身或适当的供者的角膜上用通常的方法采取。例如将角膜组织的德斯米(Descemet)膜和内皮细胞层从角膜的实质上剥离后，移入培养皿中，用分散酶等处理。由此角膜内皮细胞从德斯米膜上脱落。残存在德斯米膜上的角膜内皮细胞可以用吸管操作(pipetting)等使之脱落。去除德斯米膜后，在可以育成角膜内皮细胞的适当的培养液中培养角膜内皮细胞。作为培养液，可以使用在市售的DMEM(Dulbecco’modified Eagle’s medium)中适当添加FBS(胎儿牛血清)、b-FGF(basic-fibloblast growth factor)、EGF(epidermal growth factor)、insulin及青霉素、链霉素等的抗生素的培养液。培养容器(培养皿)优选使用在其表面覆有I型胶原、IV型胶原、纤连蛋白、昆布氨酸、或牛内皮细胞的细胞外基质等的容器。因为这样可以促进角膜内皮细胞向培养容器表面的附着，进行良好的增殖。
培养角膜内皮细胞时的温度条件，只要可以育成角膜内皮细胞即可，没有特别的限定，例如，约25℃～约45℃；考虑到增殖效率，优选的是约30℃～约40℃；更优选的是约37℃。培养时间是随使用细胞的状态而异，可例如为7～14天。
在此，在可以利用的情况下，优选使用受者自身的角膜内皮细胞。因为这样可以制作在提供移植时没有免疫排斥反应危险的角膜内皮样片，由此，使不伴有免疫排斥反应的移植手术成为可能。当受者自身的角膜内皮细胞不能得到或难以得到时，也可使用受者以外的角膜内皮细胞，但这时优选考虑免疫适合性来选择供者。
<2>继代培养、细胞悬浮液的制作
用于培养的角膜内皮细胞在增殖后，可进行继代培养。优选在亚长满状态(subconfluent)到长满状态(confluent)的时候进行继代培养。继代培养可按如下进行。首先，通过用胰蛋白酶(trypsin)-EDTA等处理将细胞从培养容器表面剥离，然后回收细胞。在回收的细胞中加入培养液即成细胞悬浮液。优选在回收细胞的时候，或回收后进行离心处理。通过所做的离心处理可以调制细胞密度高的细胞悬浮液。另外，在此的离心处理的条件，可以例举出500rpm(30g)～1000rpm(70g)、1～10分钟。
细胞悬浮液可与上述初期培养同样地播种在培养容器内，提供培养。继代培养可以在与上述初期培养同样的培养条件下进行。培养时间随使用细胞的状态而异，可例如7～21天。以上的继代培养根据需要可以进行多次。通过反复地进行继代培养，可以增加细胞数，还可调制细胞密度高的细胞悬浮液。优选调制出最终具有约5×105细胞/ml～20×105细胞/ml的细胞密度的细胞悬浮液。
<3>细胞悬浮液的播种、培养
将细胞悬浮液播种在来自羊膜的医用材料上，提供培养。此时，一般来说，为了在最终制作成的角膜内皮样片中形成所希望的细胞密度的细胞层，要调整播种的细胞数。具体来说，为了形成细胞密度为约2000～约4000细胞/mm2的细胞层，例如在每1mm2上播种约3000个～约7500个，优选的是约5000个～7500个细胞。培养可以在与上述初期培养等相同的条件下进行。培养时间随使用细胞的状态而异，可例如3～21天。
对于来自羊膜的医用材料，优选在去除上皮而露出的一面(即基底膜一侧)上播种角膜内皮细胞。因为认为在这一面富含IV型胶原，可以很好地使播种的角膜内皮细胞接合、增殖。
在来自羊膜的医用材料上例如可以进行如下的角膜内皮细胞的培养。首先，将具有由培养液可以通过的孔径的膜形成的底面的容器(以下称为“培养插入容器”)，底面朝下置于培养容器内。接着，在培养插入容器的底面上(培养插入容器的内侧)放置来自羊膜的医用材料。在来自羊膜的医用材料上播种细胞悬浮液，进行培养。另外，也可以在培养插入容器的底面上预先放置来自羊膜的医用材料。也就是说，例如也可以在培养插入容器的底面上放置来自羊膜的医用材料(放置后也可进行干燥处理)，将此培养插入容器设置在培养容器内，然后播种细胞悬浮液，进行培养。
培养插入容器的底面上可使用的膜，例如可举出聚碳酸酯制的、孔径约0.4μm～3.0μm的膜。此外，还可使用聚酯制的膜等。这样的膜可以通过市售容易地得到。
在培养插入容器内播种细胞悬浮液后，可以进行离心处理。由此，可以提高来自羊膜的医用材料上的细胞密度。另外，细胞向来自羊膜的医用材料的表面上的接合也变好。进而，也可得到细胞密度的偏差变小的效果。另外，在此的离心处理的条件，可以例举为500rpm(30g)～1000rpm(70g)、1～10分钟。
通过进行以上的培养，可以在来自羊膜的医用材料上形成含有来自角膜内皮的细胞的细胞层所形成的角膜内皮样的片。这种角膜内皮样片可作为对需要进行角膜内皮移植的疾病，例如水疱性角膜症、角膜浮肿、角膜白斑、圆锥角膜的治疗的移植材料(替代角膜内皮)而使用。另外，还可以将去除了来自羊膜的医用材料的一部分的片或全部去除了的片(即只有细胞层)作为移植片而使用。这种来自羊膜的医用材料的去除可以通过用EDTA等的化学处理、用蛋白分解酶等的酶处理、用镊子等的搔扒等的物理处理来进行。
可以在与支持细胞共存的条件下进行角膜内皮细胞的培养(包括初期培养、继代培养及在来自羊膜的医用材料上的培养)。通过在与支持细胞共存的条件下进行培养，有望提高角膜内皮细胞的增殖效率、得到促进分化等的效果。支持细胞可以使用例如，10T1/2纤维芽细胞(HyldahlL：Primary cell cultures from human embryonic corneas.J Cell Sci.66：343-351，1984)、3T3细胞(瑞士鼠3T3细胞、鼠NIH3T3细胞、3T3J2细胞等)、角膜实质细胞等。
在与支持细胞共存的条件下进行角膜内皮细胞的培养时，优选在角膜内皮细胞和支持细胞之间用支持细胞不能通过的隔离膜隔开。通过利用此隔离膜，可防止在培养时支持细胞侵入到角膜内皮细胞一侧。其结果是，不存在支持细胞混杂在最终得到的角膜内皮样片内的危险。这样，就意味着可以制作出不会因支持细胞而发生免疫排斥问题的角膜内皮样片，在临床上非常有意义。
在使用支持细胞时，优选预先用丝裂霉素C等对支持细胞进行失活处置。这是为了防止由于支持细胞自身的增殖而阻害角膜内皮细胞的增殖。这样的失活处理可用放射线处理等来进行。
作为隔离膜，可采用与上述在培养插入容器中使用的膜同样的物质。也就是说，可使用例如由聚碳酸酯、聚酯等形成的孔径约0.4μm～3.0μm的膜。
支持细胞的细胞密度可以是例如，约1×102个/cm2或更多，优选是1×102个/cm2～约1×107个/cm2，更优选是1×103个/cm2～约1×105个/cm2。认为如果支持细胞数少，角膜内皮细胞的增殖率就低，不优选。另一方面，如果支持细胞数过多，反而会使角膜内皮细胞的增殖率变低，不优选。
将用以上的方法制作的角膜内皮样片进行移植的方法，可以例示出全层环锯法和深层角膜切除法。前者的方法是用环锯先将角膜全层取下，用本发明的角膜内皮样片置换角膜内皮细胞层后，再将它复位到受者，具体来说，可按以下进行。首先用环锯将受者(主体)的角膜全层切开，将角膜的一部分(或全部)以按钮状取下。接着，从取下的角膜片上剥离德斯米膜及角膜内皮细胞层。使本发明的角膜内皮样片接合附着在暴露出的角膜实质上。此时，将来自羊膜的医用材料置于实质侧。然后将角膜片复位到受者，用缝合线固定。
另外，深层角膜切除法不是将角膜全层摘出，而是只将角膜深层的部分切除，被认为是对受者负担较小的方法。具体来说，可以按如下进行。首先，将受者的角膜实质的一部分剥离，将角膜实质深层的一部分和德斯米膜及内皮细胞层的一部分切除。另外，也可以只将内皮细胞层，或只将内皮细胞层及德斯米膜剥离切除。也可以只将受损的受者角膜内皮细胞剥离。接着，用刮勺等将本发明的角膜内皮样片插入到切除部。根据需要，在前房内注入空气，将移植片固定。
另外，移植的角膜内皮样片对生命体来说，是否与角膜内皮样细胞层同样地发挥屏障功能、泵功能，可以通过例如检查移植后角膜厚度的变化、浮肿的发生来确认。
以下，用实施例进一步详细说明本发明。
<实施例1>羊膜的采取
对没有全身合并症的打算做剖腹产的孕妇，事先和妇科医生一起征得其同意(informed consent)之后，在手术室做剖腹产时采取羊膜。操作要注意清洁，按手术操作标准洗手后穿上专用服装。在分娩前准备好采取羊膜用的清洁平接器和洗净用的生理盐水。分娩后，将胎盘组织移到平接器上，用手将羊膜组织从胎盘上剥离。羊膜与胎盘愈合强的部分用剪刀切除。
<实施例2>羊膜的处理
羊膜的处理过程按(1)洗净、(2)修整、(3)保存的顺序进行。对于全部的过程，操作优选在清洁的通风装置内进行，使用的容器和器具也都要使用经灭菌处理的，培养皿等使用灭菌的一次性(disposable)的用品。采取的羊膜上附着的血液成分，用生理盐水边洗净边去除，进一步用充足的生理盐水(添加0.005％的loxacin)洗净。接着，用添加了青霉素—链霉素(50IU)的磷酸缓冲液(PBS)共计洗净3次。接着，将羊膜移到培养皿内，用剪刀分割成约4×3cm左右的大小。分割后，以形状及厚度等为基准，选出状态好的羊膜。
<实施例3>羊膜的保存
在2cc的灭菌冷冻保存管中各加入1cc的保存液，向其中将采取、洗净、选出后的羊膜各加入一枚，标记好后，放入-80℃的低温冷藏柜中保存。保存液是使用在DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium：GIBCOBRL公司)中加入50％的灭菌后的甘油。保存的羊膜的使用期限是3个月，超过期限就焚烧处置。另外，不进行这样的保存处理，实施以下的上皮处理亦可。
<实施例4>羊膜上皮的处理
将-80℃下保存的羊膜在室温下解冻后，用添加了青霉素一链霉素(50IU)的磷酸缓冲液(PBS)洗净2次。将洗净后的羊膜浸入0.02％EDTA溶液(Nacalaitesque公司)中(100mm的培养皿)，放入CO2孵育箱中，37℃下反应1小时。反应后，用足够量的PBS洗净羊膜2次，在实体显微镜下，用cell scraper(Nunc公司USA)像用手似的搔扒(去除)上皮。另外，用这种处理方法是否将一层的羊膜上皮完全地搔扒除去，可用光学及电子显微镜的操作(扫描型电子显微镜)来确认(图1)。另外，图1是用扫描型电子显微镜观察的羊膜像。A是正常的状态(没有进行上皮处理的状态)的羊膜表面的像；B是进行上皮搔扒处理(0.02％EDTA溶液)后的羊膜表面的像。
<实施例5>冻结干燥羊膜的制作
用一组经灭菌后的塑料架将去除上皮的羊膜夹持后，用夹子固定。将每个架子移入-80℃的低温保藏箱内，确认羊膜冻结后，用真空冻结干燥机(Yamato，NEOCOOL)进行冻结干燥处理(-110℃，约1小时)。按照使用说明书，设定能得到充分干燥物的条件。将冻结干燥后的羊膜从架子上取下，移入具有外侧是聚酰胺尼龙、内侧是聚乙烯的双层构造的袋子中，用家庭用真空打包器(フレ一ムノバ、マジツクパツク)进行真空包装。对这样得到的真空包状态的羊膜照射γ线(约25kGy)灭菌。将灭菌处理后的羊膜以真空包的状态在常温下保存到即将使用时。另外，从保存开始经过12个月的时候，也可维持刚刚冻结干燥后的状态。以下的试验是使用在常温下保持一个月的干燥羊膜而进行的。
<实施例6>冻结干燥羊膜的表面分析
对于由实施例5得到的干燥羊膜，为了确认在去除上皮一侧的表面上残存有基底膜，并保持该构造，按以下的程序进行免疫学分析。首先，将干燥的羊膜浸入PBS液中复原，以适宜的大小切下来，冻结包埋在OCTcompound中。然后在低温恒温器中薄薄地切，制作滑切片。将滑切片用PBS洗净后，用1％胎儿牛血清做阻遏(blocking)，抑制非特异的抗体反应。然后，与一次抗体在室温下反应1小时。一次抗体中，使用分别与胶原I～V和VII、接触蛋白、纤连蛋白及昆布氨酸5对应的特异性结合抗体(COSMOBIO公司制)。反应完成后，用含有triton-X的PBS液洗15分钟，洗3次，接着与用荧光标记的抗体(2次抗体)在室温下反应1小时。接着，用PBS洗15分钟，洗3次，封入后用共焦显微镜来观察组织。作为对照组，准备采取后只进行洗净的试样(AM(+))、去除上皮而没有进行冻结干燥处理的试样(AM(-))、用分散酶处理(37℃、1小时)来去除上皮而没进行干燥处理的试样(AM(-)dispase)、去除上皮并进行冻结干燥处理而没进行灭菌处理的试样(AM(-)FD)、去除上皮后不做冻结干燥处理而进行灭菌处理的试样(AM(-)γray)，各试样按上述同样的方法进行1次抗体反应及2次抗体反应。总结了免疫学分析结果的表在图2中示出。表中“+”表示阳性，“-”表示阴性。另外，在实施例5的方法中得到的干燥羊膜(去除上皮、进行冻结干燥处理及灭菌处理的羊膜)用AM(-)FDγray来表示。
如表所示，去除了上皮的试样(AM(-))上检测出基底膜的特征性成分胶原IV(α2及α5)、胶原V、胶原VII及昆布氨酸5。另外，上皮处理后进行冻结干燥处理的试样(AM(-)FD)及进一步做灭菌处理的试样(AM(-)FDγray)也同样地检测出这些成分。由此结果可知，采用实施例4的方法来做去除上皮的处理，可以在使基底膜残存的状态下去除上皮。另外，可知去除上皮后即使进行冻结干燥处理也可维持基底膜残存的状态，进一步做灭菌处理可使残存的基底膜几乎不受损伤。另一方面，用分散酶来去除上皮的试样(AM(-)dispase)中，没有检测到这些基底膜的特征性成分。这表明用分散酶处理后基底膜被破坏了。
通过以上的分析结果可确认，用上述方法调制的干燥羊膜具有保持了原来构造的基底膜。
<实施例7>角膜上皮细胞的回收
将从6周龄的日本白色家兔上采取的角膜浸入含有10％胎儿牛血清(FBS)的DMEM中，切除结膜、角膜内皮等不需要的组织。然后，将组织在磷酸缓冲液(PBS)中洗净，在含有1.2U/ml分散酶(Nacalai tesque公司)的磷酸缓冲液(PBS)中在37℃下浸渍1小时。取出处理后的组织，室温下浸渍于0.02％EDTA中2分钟，接着在室温下浸渍于磷酸缓冲液中2分钟使分散酶的活性终止。在含有10％胎儿牛血清(FBS)的DMEM中搔扒角膜上皮细胞后，通过离心处理浓缩、回收角膜上皮细胞。
<实施例8>共培养细胞的调制
作为共培养细胞(支持细胞)，使用NIH-3T3细胞(以下简称“3T3细胞”)。将事先在75F培养皿中(BD Falcon公司)培养并长满了的3T3细胞浸渍于0.05％丝裂霉素C的溶液中2小时，抑制3T3的增殖活性。接着在磷酸缓冲液(PBS)中洗净数次来去除丝裂霉素C。将细胞在0.05％胰蛋白酶—EDTA溶液中处理后，用吸管操作(pippeting)制成细胞悬浊液(3T3细胞悬浊液)。
<实施例9>角膜上皮样片的形成
将由实施例5得到的冻结干燥羊膜在室温下浸渍于PBS中直到充分复原。这样调制的羊膜作为基质，按以下的顺序培养角膜上皮细胞和3T3细胞。作为培养器具，使用6孔的培养皿(culture dish)(Corning公司，NY)和培养插入容器(culture insert)(聚碳酸酯制的平均孔径为0.3μm，Corning公司，NY)。
首先，在培养皿上以达到约1×104个/cm2的细胞密度的方式来播种3T3细胞悬浊液，在37℃、5％CO2的条件下培养。另外，在培养插入容器上将基底膜一侧(存在有上皮的一侧)向上粘贴羊膜，将它在室温下干燥10分钟。然后，在粘贴了羊膜的培养插入容器上以达到约1×105个/cm2的细胞密度的方式来播种角膜上皮细胞悬浊液。
进行以上的操作后，如图3所示将培养插入容器设置于培养皿内，将3T3细胞和角膜上皮细胞在相同的培养基中培养。另外，图3为显示培养中的状态的模式断面图。在培养皿1中静置培养插入容器2，在培养皿1的底面上形成3T3细胞层5。另外，在培养插入容器2的底面上静置羊膜3，在其上显示出角膜上皮细胞被培养的状态。符号6是培养基。
培养基是使用在DMEM/Ham’s F12混合培养基中(混合体积比1∶1)，添加了10％FBS、胰岛素(5mg/ml)、霍乱毒素(0.1nM)、青霉素链霉素(50IU/ml)、人重组上皮细胞增殖因子(EGF)(10ng/ml)的培养基。
在上述的培养基中培养3周(Submerge)。然后，为了进行粘膜上皮的分化诱导，用所谓的Air-lifting法培养一周。所谓的Air-lifting法，是将培养基的液面置到在羊膜上形成的来白角膜上皮细胞的细胞层的表面，使该细胞层的表面暴露于空气中的方法。Submerge过程中隔日更换培养基，air-lifting后每日更换培养基来培养。
<实施例10>验证角膜上皮样片的组织学特征
用以上的方法培养的结果是，从培养开始经过约20天的时候，会形成类似角膜上皮的细胞层(图4)。在细胞层中，可知与正常角膜上皮同样地有4～5层细胞重层化了。在此细胞层的羊膜侧存在着相对为圆柱形的类似基底细胞的细胞群。另外，最表层的细胞呈扁平型，但有核、与皮肤不同其表面没有角化。这样，可以确认在羊膜上形成了类似角膜上皮的细胞层(角膜上皮样层)。
使用以上的方法制作的、在羊膜上形成角膜上皮样细胞层的移植用片(以下称为“角膜上皮移植用片”)来进行移植试验。
<实施例11>移植实验
首先，对采取了角膜上皮细胞的白色家兔，用月牙刀从距离其轮部4mm的外侧全部去除100μm厚的角膜及结膜上皮。通过此操作，使含有角膜上皮干细胞的上皮细胞不存在，从而可以认为人为的眼表面干细胞疲劳症得到再现。另外，观察了移植前的眼表面(图5上图)。
接着，将角膜上皮移植用片移植到距离轮部稍微内侧的区域。移植时用10-0尼龙线与周围的组织缝合。移植后，在移植片上缝上治疗用的隐形眼镜。手术后，2次/日涂擦抗生剂及类固醇眼软膏。移植后的时刻，眼表面显示出与移植前的角膜上皮移植用片同样的透明性。
在移植后经过2日及移植后经过7日的时候，观察实施了移植术的眼表面。在移植后经过2日的时候，被移植的角膜上皮移植用片保持着透明性，另外，用荧光素染色确认了其在眼表面上没有缺损地残存着(图5下图)。另外，移植片没有显示出荧光素染色性，因此确认了角膜上皮移植用片具有与角膜上皮同样的屏障功能。进而，用荧光素染色，在移植片的整个周围看到了荧光素的染色性，因此确认在移植部位存在的组织并不是周围残存的结膜上皮的污染物。另外，角膜上皮的细胞之间是通过紧密接合的构造来结合的，所以其表面没有荧光素色素的浸润，不显示荧光素染色的染色性。另一方面，在细胞间的接合变缓和、细胞自身剥离、屏障功能受损的时候，发生荧光素色素的浸润、将组织染色。因此，通过检测荧光素染色的染色性，可以确认移植的角膜上皮移植用片是否具有与角膜上皮同样的屏障功能。
在移植后经过7日的时候，确认了移植的角膜上皮移植用片残存在眼表面上，而且与移植后经过2天的时候的状态比较其向周围伸展，被覆于眼表面的全部(图6下图)。另外，如图6所示移植片不显示荧光素染色性，确认了维持着角膜上皮所必要的屏障功能。另外，也维持着透明性(图6上图)。
以上结果表明，用干燥羊膜制作的角膜上皮移植用片在眼表面生长、伸展，术后经过长时间后维持着透明性。也就是说，确认了用上述方法制作的角膜上皮移植用片含有作为角膜上皮的代替品而发挥良好功能的细胞层，可以作为在角膜损伤、缺损的时候用于再建眼表面的移植材料而适宜地利用。
<实施例12>用口腔粘膜上皮制作角膜上皮样片
将在供者拔下的牙上附着的口腔粘膜上皮从牙釉质骨质的移行部位上分离。另外，这一系列的操作，优选使用经过灭菌的器具，尽量进行灭菌。
将取下的口腔粘膜上皮用含有50IU/ml的青霉素链霉素、硫酸庆大霉素的磷酸缓冲液(PBS)在室温的条件下浸渍30分钟，进行2次。然后，在37℃的条件下将组织浸渍于含有1.2U分散酶(Nacalai tesque公司)的磷酸缓冲液(PBS)中1小时，接着浸渍于0.05％胰蛋白酶—EDTA溶液(GIBCOBRL公司)中30分钟，浸渍处理后分离细胞。通过将其浸渍于含有10％胎儿牛血清(FBS)的DMEM中使酶的活性终止。然后，用60μm的细胞滤器去除多余的组织，单独分离出口腔粘膜上皮细胞(口腔内缘粘膜上皮细胞)。使用这样得到的口腔粘膜上皮细胞，用与实施例8及9所示的同样的方法，使其形成角膜上皮样细胞层。
<实施例13>角膜内皮样片的制作
(13-1)人角膜内皮细胞的采取、初期培养
从供者的角膜组织中用镊子将德斯米膜和内皮细胞层从实质剥离后，置于35mm的培养皿中，用在不含钙的PBS中稀释2倍而得的分散酶(dispase)1ml(最终浓度为1.2U/ml)，在37℃、5％CO2的条件下处理60分钟。通过该处理，角膜内皮细胞的大多数从德斯米膜上脱落。为使在德斯米膜上残存的角膜内皮细胞脱落，进行吸管操作(pipetting)处理。接着，去除德斯米膜，将角膜内皮细胞移入15cc的离心管中。加入培养液使全部液量为5ml后，在1000rpm、70g、3分钟的条件下离心。培养液可以使用在DMEM(GIBCOBRL公司制)中添加10％FBS(大日本制药株式会社制)、b-FGF(Invitrogen公司制)2ng/ml、青霉素(50U/ml)—链霉素(50μg/ml)(Nacalai公司制)的培养液。去除上清液后，加入培养液制成约1ml的细胞悬浮液。将该细胞悬浮液播种于覆有IV型胶原的24孔培养皿中，在37℃、5％CO2的条件下培养。以后，每48小时交换培养液。
(13-2)内皮细胞的继代培养
在培养的细胞长满(confluent)的时候去除培养液，用不含有钙的PBS1ml洗净细胞3次。洗净后加入0.05％胰蛋白酶(trypsin)—EDTA200μl，在37℃、5％CO2的条件下静置3分钟。通过此处理，附着于培养皿底部的内皮细胞悬浮起来。加入培养液5ml后，将细胞悬浮液移入15cc离心管中，在1000rpm、70g、3分钟的条件下做离心处理。去除上清液后，加入培养液成约2ml的细胞悬浮液。将该细胞悬浮液播种于覆有IV型胶原的35mm的培养皿中，在37℃、5％CO2的条件下培养。以后，每48小时交换培养液。在细胞达到长满状态时，进行与上述相同的操作，反复进行继代培养直到得到需要的细胞数。
(13-3)角膜内皮样片的制作
将继代培养的细胞用0.05％胰蛋白酶—EDTA处理后，计数细胞数。在接下来离心处理去除上清液后，以使细胞密度为约2.0×106个/ml的方式来添加培养液。使用得到的细胞悬浮液，按以下的顺序制作角膜内皮细胞层。作为培养器具，可以使用6孔培养皿(Corning公司制、NY)和培养插入容器(culture insert：聚碳酸酯制、平均孔径为3.0μm、Corning公司制、NY)。培养液可以使用与上述使用相同的培养液。
首先，在培养皿内留置培养插入容器。接着用PBS将由实施例5得到的干燥羊膜复原，将复原后的羊膜敷于培养插入容器内(底面上)，将上皮存在的一侧向上，使之伸展。接着，在羊膜上以5000个/mm2的方式播种细胞悬浮液。然后，将培养皿在1000rpm、70g、3分钟的条件下离心。离心后，在37℃、5％CO2的条件下培养。由此，构建单层的细胞层。
本发明并不限定于上述发明的实施形态及实施例的说明。只要不超越权利要求所记载的范围，本领域技术人员能想到的范围的各种变形方式也包含在本发明中。
产业上利用的可能性
通过本发明，可以提供操作容易且能充分耐受必要的灭菌处理的来自羊膜的医用材料。本发明的医用材料由于上皮被去除了，免疫原性变得非常低；同时，由于基底膜高度维持了原来的构造、至少有一部分残存下来，作为用于构建细胞层的基材发挥良好的功能。

Claims (17)

1.具备以下的性状(1)～(3)的来自羊膜的医用材料：
(1)是干燥状态；
(2)不具有上皮层；
(3)具有在使用时在其上保持着细胞可接合及增殖的构造的基底膜。
2.权利要求1所述的来自羊膜的医用材料，其特征为，进一步具备以下的性状(4)：(4)在与氧没有实质地接触的状态下，被装入容器中。
3.权利要求1或2中所述的来自羊膜的医用材料，其中上述与氧没有实质地接触的状态是将容器内作成真空或是用氮置换的状态。
4.权利要求1～3中任一项所述的来自羊膜的医用材料，其中上述细胞是角膜上皮细胞、角膜内皮细胞或口腔粘膜上皮细胞。
5.来自羊膜的医用材料的制作方法，包括以下的步骤(i)和(ii)：
(i)残留基底膜的至少一部分，从羊膜上去除上皮层的步骤；
(ii)在残存的基底膜使用时在其上保持着细胞可接合及增殖的构造的条件下，使由步骤(i)得到的不含有上皮的羊膜干燥的步骤。
6.权利要求5所述的来自羊膜的医用材料的制作方法，其中上述步骤(ii)是通过冻结干燥处理来实施的。
7.权利要求5或6所述的来自羊膜的医用材料的制作方法，其中进一步包括以下的步骤(iii)：
(iii)将由步骤(ii)得到的干燥体，在使之与氧没有实质地接触的状态下，装入容器中的步骤。
8.权利要求7所述的来自羊膜的医用材料的制作方法，其中上述与氧没有实质地接触的状态是将容器内作成真空或是用氮置换的状态。
9.角膜上皮样片的制作方法，包括以下的步骤：
在权利要求1～4中任一项所述的医用材料上培养角膜上皮细胞的步骤。
10.角膜上皮样片的制作方法，包括以下的步骤(a)及(b)：
(a)在权利要求1～4中任一项所述的医用材料上培养角膜上皮细胞或是具有向角膜上皮样细胞分化的能力的细胞的步骤；
(b)在上述细胞增殖、重层化后，使最表层与空气接触的步骤。
11.权利要求10所述的角膜上皮样片的制作方法，其中上述步骤(a)是在支持细胞的共存下实施的。
12.权利要求10所述的角膜上皮样片的制作方法，其中上述步骤(a)是在支持细胞的共存下、并且在该支持细胞和上述医用材料之间存在该支持细胞不能通过的孔径的隔离膜的状态下实施的。
13.权利要求10～12中任一项所述的角膜上皮样片的制作方法，其中在上述步骤(a)中培养的细胞是口腔粘膜上皮细胞。
14.角膜内皮样片的制作方法，包括以下的步骤(A)～(C)：
(A)培养采取的角膜内皮细胞，使之增殖的步骤；
(B)将增殖的角膜内皮细胞回收，制作细胞悬浮液的步骤；
(C)将上述细胞悬浮液在权利要求1～4中任一项所述的医用材料上播种、培养的步骤。
15.权利要求14所述的角膜内皮样片的制作方法，其中在上述步骤(B)之后实施以下的步骤(B-1)：
(B-1)通过离心处理，提高上述细胞悬浮液的细胞密度的步骤。
16.权利要求14或15所述的角膜内皮样片的制作方法，其特征为，在上述步骤(C)中，播种细胞悬浮液后作离心处理。
17.权利要求14或15所述的角膜内皮样片的制作方法，其中上述步骤(C)包括以下的步骤(C-1)～(C-5)：
(C-1)在培养容器内，留置具有由培养液可以通过的孔径的膜形成的底面的容器的步骤；
(C-2)在上述容器的上述底面上，载置权利要求1～4中任一项所述的医用材料的步骤；
(C-3)将上述细胞悬浮液播种在上述医用材料上的步骤；
(C-4)离心处理的步骤；
(C-5)培养的步骤。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101889569A (zh) * 2010-07-23 2010-11-24 马吉献 一种生物羊膜干燥保存方法
CN105308175A (zh) * 2013-03-11 2016-02-03 日本化学研究株式会社 人角膜上皮片的制造法

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101102800A (zh) * 2005-01-14 2008-01-09 阿如布勒斯特有限公司 使用羊膜的片状组合物及其制作方法
WO2006129673A1 (ja) * 2005-05-30 2006-12-07 Arblast Co., Ltd. 組織再建用材料及びその使用
KR101313033B1 (ko) 2005-07-25 2013-10-01 시게루 기노시타 시트형 조성물
WO2007023750A1 (ja) 2005-08-26 2007-03-01 National University Corporation University Of Toyama 乾燥羊膜及び羊膜の乾燥処理方法
JP5092119B2 (ja) * 2006-08-10 2012-12-05 国立大学法人富山大学 乾燥羊膜からなる眼表面の再建用医療材料
JP4977345B2 (ja) * 2005-08-26 2012-07-18 国立大学法人富山大学 乾燥羊膜及び羊膜の乾燥処理方法
EP1933852B1 (en) 2005-09-27 2018-12-19 TissueTech, Inc. Amniotic membrane preparations and purified compositions and methods of use
US8187639B2 (en) 2005-09-27 2012-05-29 Tissue Tech, Inc. Amniotic membrane preparations and purified compositions and anti-angiogenesis treatment
WO2007083685A1 (ja) 2006-01-19 2007-07-26 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. 生体内で細胞増殖可能な角膜内皮製剤
US8372437B2 (en) 2006-08-17 2013-02-12 Mimedx Group, Inc. Placental tissue grafts
US8658851B2 (en) * 2006-10-20 2014-02-25 Keracure, Inc. Devices with cells cultured on flexible supports
JP5181172B2 (ja) * 2007-02-21 2013-04-10 国立大学法人富山大学 培養重層上皮シートの作製方法
JP5224250B2 (ja) * 2007-02-23 2013-07-03 国立大学法人富山大学 医用代用膜
CN101066471B (zh) * 2007-04-25 2010-05-19 中山大学中山眼科中心 一种脱细胞角膜基质及其制备方法
CA2736663C (en) 2007-09-07 2018-01-02 Surgical Biologics, Llc. Placental tissue grafts and improved methods of preparing and using the same
WO2009110647A1 (en) * 2008-03-03 2009-09-11 Modern Cell & Tissue Technologies Inc. Tissue sheet of cornea or conjunctiva using nasal mucosa epithelium
US9480549B2 (en) 2008-04-25 2016-11-01 Allosource Multi-layer tissue patches
US9358320B2 (en) 2008-04-25 2016-06-07 Allosource Multi-layer tissue patches
AU2009240564A1 (en) * 2008-04-25 2009-10-29 Allosource Anti-adhesion barrier wound dressing comprising processed amniotic tissue and method of use
EP2383334A4 (en) 2009-01-23 2013-01-16 Univ Osaka NOURISHING CELL FOR INDUCING TARGET CELLS
WO2011074208A1 (ja) * 2009-12-18 2011-06-23 国立大学法人東北大学 皮膚真皮又は羊膜透明化による角膜移植材料調製法
US10130736B1 (en) 2010-05-14 2018-11-20 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US9352003B1 (en) 2010-05-14 2016-05-31 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US8883210B1 (en) 2010-05-14 2014-11-11 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US8840665B2 (en) 2010-06-11 2014-09-23 Liventa Bioscience, Inc. Method of tendon repair with amnion and chorion constructs
WO2012003377A2 (en) * 2010-06-30 2012-01-05 Tissuetech, Inc. Methods of preparing chorion tissue and products derived therefrom
US9526770B2 (en) 2011-04-28 2016-12-27 Tissuetech, Inc. Methods of modulating bone remodeling
CA2837878A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Tissuetech, Inc. Methods of processing fetal support tissues, fetal support tissue powder products, and uses thereof
US8961617B2 (en) 2012-03-08 2015-02-24 Liventa Bioscience, Inc. Amnion and chorion constructs and uses thereof in abdominal surgery
TW201603818A (zh) 2014-06-03 2016-02-01 組織科技股份有限公司 組成物及方法
US10765705B2 (en) 2014-11-24 2020-09-08 Prime Merger Sub, Llc Visco-supplement compositions, and methods of use thereof
WO2016138025A2 (en) 2015-02-23 2016-09-01 Tissuetech, Inc. Apparatuses and methods for treating ophthalmic diseases and disorders
CN107847526A (zh) 2015-05-20 2018-03-27 组织技术公司 用于预防上皮细胞的增殖和上皮‑间充质转换的组合物和方法
CA3177726A1 (en) 2015-05-21 2016-11-24 Musculoskeletal Transplant Foundation Modified demineralized cortical bone fibers
TW201733600A (zh) 2016-01-29 2017-10-01 帝聖工業公司 胎兒扶持組織物及使用方法
CZ2017846A3 (cs) * 2017-12-27 2019-01-02 BioHealing k.s. Způsob přípravy materiálu na bázi amniové membrány a materiál připravitelný tímto způsobem
CN108498865B (zh) * 2018-04-11 2020-11-06 济南磐升生物技术有限公司 一种人造角膜的制备方法及应用
KR101979286B1 (ko) * 2018-05-17 2019-05-15 경북대학교병원 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱 및 이의 제조방법

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09122225A (ja) * 1995-10-31 1997-05-13 Bio Eng Lab:Kk 医用材料の原料膜材およびその製造方法
JPH10295369A (ja) * 1997-02-26 1998-11-10 Japan Tobacco Inc 造血幹細胞の製造方法
AUPQ196799A0 (en) * 1999-08-02 1999-08-26 Pinfold, Ann Method of preservation of amnion and uses thereof
JP4397082B2 (ja) * 1999-12-09 2010-01-13 有限会社ジャパン・オフサルミック・コンサルタンツ 移植用細胞片及びその作成方法
US7347876B2 (en) * 2001-04-25 2008-03-25 Ray Jui-Fang Tsai Method for expansion of epithelial stem cells
JP4745525B2 (ja) * 2001-05-09 2011-08-10 実 上田 角膜治療用培養上皮細胞シート及びその製造方法
JP4475847B2 (ja) * 2001-07-26 2010-06-09 株式会社セルシード 前眼部関連細胞シート、３次元構造体、及びそれらの製造法
TWI290055B (en) * 2002-03-14 2007-11-21 Tissuetech Inc Amniotic membrane covering for a tissue surface and devices facilitating fastening of membranes
WO2003092762A1 (fr) * 2002-04-30 2003-11-13 Amniotec Inc. Feuille de type endothelium corneen et procede permettant de la produire

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101889569A (zh) * 2010-07-23 2010-11-24 马吉献 一种生物羊膜干燥保存方法
CN101889569B (zh) * 2010-07-23 2013-05-22 马吉献 一种生物羊膜干燥保存方法
CN105308175A (zh) * 2013-03-11 2016-02-03 日本化学研究株式会社 人角膜上皮片的制造法
CN105308175B (zh) * 2013-03-11 2018-09-21 日本化学研究株式会社 人角膜上皮片的制造法
US10335439B2 (en) 2013-03-11 2019-07-02 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for producing human corneal epithelium sheet

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