CN101889569A - 一种生物羊膜干燥保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物羊膜干燥保存方法，该生物羊膜干燥保存方法包括以下步骤：1)取羊膜洗净后灭菌，备用；2)将无菌羊膜从绒毛膜分离出来，并丢弃绒毛膜；用刀片将无菌羊膜表面的海绵层、纤维母细胞层刮除，仅留上皮细胞层及基底层；3)将步骤2)所得到的无菌羊膜平铺于硝酸纤维素滤纸或无菌纱布上并进行分割得到无菌羊膜组织碎片；4)将分割后的无菌羊膜组织碎片置于含有干燥剂的干燥皿中进行干燥；5)将干燥后的无菌羊膜组织碎片置于无菌容器并抽真空，3～5℃保存。本发明提供了一种保存效果好、操作简单、价格低廉生物羊膜干燥保存方法。

Description

一种生物羊膜干燥保存方法

技术领域

本发明属生物医学领域，尤其涉及一种生物羊膜干燥保存方法。

背景技术

在角膜手术中，羊膜材料作为角膜的可替代物，已在临床上广泛应用。羊膜是胎盘的最内层，构成胎盘的胎儿部分。它是胚胎时期羊膜囊扩大的囊壁，附着于绒毛膜内表面的透明薄膜。至妊娠晚期，羊膜与绒毛膜紧密相贴，但能与平滑绒毛膜完全分开。羊膜光滑，无血管、神经及淋巴。具有一定的弹性。正常羊膜厚约0.02～0.5mm.是人体中最厚的基底膜。羊膜自内向外可分为5层：上皮细胞层(为单层无纤毛立方上皮细胞)、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层。但是，实时获取用于角膜手术的新鲜羊膜组织在临床上存在很大的难度，因此，寻找简单、有效的羊膜保存方法则具有重要的临床和经济意义。目前临床上常用的羊膜保存方法有：1.甘油4℃保存，2.DMEM-甘油低温保存，3.深低温保存，4.无水酒精保存，5.真空干燥保存等方法。

其中，甘油4℃保存法是将羊膜片置于内装3ml消毒纯甘油的羊膜容器中，24小时后取出羊膜片，转移到第二个盛有甘油的小瓶内，封闭瓶口后置于4℃冰箱中保存。使用时取出用生理盐水冲去甘油，在Hanks液(Hanks液是常见的平衡盐溶液(BSS)之一)(内含1∶1000妥布霉素)中浸30分钟。

DMEM甘油低温保存法是将羊膜片放人装有预先准备好并灭菌的DMEM纯甘油液(DMEM∶甘油体积比＝1∶1，各1.5ml)的羊膜容器中，封闭瓶口置一70℃冰箱保存备用。用前将小瓶放于室温下解冻10分钟即可使用。

对于深低温保存法，有简化二步深低温保存法和简化一步深低温保存法之分。

简化二步深低温保存法可以是：(a)冷冻保护液配方和冷平衡方法：用20％人血清白蛋白为溶媒，配置2种浓度的二甲基亚枫(5％，7.5％)分装于2个羊膜容器内，将羊膜片依次在每种冷冻保护液中浸泡各20分钟冷平衡(均在4℃冰箱中进行)。以上冷冻保护液在使用前1～6小时按无菌配制置于4℃冰箱中备用。(b)深低温保存方法：将冷平衡后的第2个羊膜容器加盖，迅速从4℃冰箱中取出，置于冷冻仪中，先以约1.5℃/min的冷冻速率降温至约一30℃，然后改用约8～10℃/min的速率降温冷冻至一80℃以下，此时将羊膜容器连同羊膜直接浸泡于液氮中，作简明卡片标记后移于液氮贮存罐中长期保存。(c)复温复温时用长镊子夹取羊膜容器，待瓶内残存的液氮经数秒至10余秒钟自然蒸喷后，迅速放人40℃水浴内轻稳地摆动，复温约100秒钟，待羊膜周围仅残留一层薄冰，用无菌镊子取出羊膜，放人在4℃冰箱中预冷的20％人血清白蛋白中，以清除羊膜上的冷冻保护液，10分钟后即可取出羊膜使用。

简化一步深低温保存法：冷冻保护液是由M199(一种细胞培养液)液中加10％二甲基亚枫(DMSO)配制而成。冷冻和复温方法同简化二步深低温保存法。在40℃水浴复温后，用无菌镊子取出羊膜，放人在生理盐水中浸泡10分钟(在2～4℃冰箱中进行)，然后取出羊膜使用。

无水酒精保存法：将羊膜片放入装有75％酒精的羊膜容器中，24h后取出，转移至另一个装有100％的酒精的容器中，4℃或室温保存备用。用前在平衡盐溶液中浸泡复水。

(5)真空干燥保存法：将羊膜片放入羊膜容器中，低温真空干燥1h，加盖蜡封后置于4℃冰箱中保存备用。用前在平衡盐溶液中浸泡复水。

以上这些方法保存的羊膜，其细胞的超微结构受到严重的破坏，在眼表疾病的治疗中很难发挥治疗作用。这些方法均存在费用高、条件要求复杂、保存效果不佳等缺点，因此，在临床工作中，急需一种简单、有效、保存效果好的羊膜保存方法。

发明内容

为了解决背景技术中存在的上述问题，本发明提供了一种保存效果好、操作简单、价格低廉生物羊膜干燥保存方法。

本发明的技术解决方案是：本发明提供了一种生物羊膜干燥保存方法，其特殊之处在于：所述生物羊膜干燥保存方法包括以下步骤：

1)取羊膜洗净后灭菌，备用；

2)将无菌羊膜从绒毛膜分离出来，并丢弃绒毛膜；用刀片将无菌羊膜表面的海绵层、纤维母细胞层刮除，仅留上皮细胞层及基底层；

3)将步骤2)所得到的无菌羊膜平铺于硝酸纤维素滤纸或无菌纱布上并进行分割得到无菌羊膜组织碎片；

4)将分割后的无菌羊膜组织碎片置于含有干燥剂的干燥皿中进行干燥；

5)将干燥后的无菌羊膜组织碎片置于无菌容器并抽真空，3～5℃保存。

上述步骤4)中干燥条件是：将分割后的无菌羊膜组织碎片置于干燥皿中25-35℃下静置24～72小时。

上述步骤4)中的干燥剂是无水氯化钙、生石灰、五氧化二磷、硅胶干燥剂或活性矿物干燥剂。

上述步骤4)中的干燥剂是无水氯化钙时，其使用量是不低于125g/L。

上述步骤3)是将无菌羊膜的上皮面朝上并平铺于硝酸纤维素滤纸或无菌纱布上。

上述硝酸纤维素滤纸的孔径是0.22～0.45μm。

上述无菌羊膜组织碎片的大小是15mm×15mm～25mm×25mm。

上述无菌羊膜组织碎片的大小是20mm×20mm。

本发明的优点是：

1、保存效果好。本发明对现有保存的羊膜的方法进行全部更新，用新的方法进行替换，直接将无菌羊膜组织置于含有干燥剂的干燥皿中进行干燥并抽真空保存，在干燥剂是无水氯化钙的条件下，干燥效果显著，通过动物实验及临床运用均表明，保存后的羊膜在使用中效果良好，能够很好满足临床需求。

2、保存方法简单、便利、价格低廉。本发明中所用的方法就是普通的干燥和真空冷藏保存，尽管简单，但羊膜通常不用该方法，本发明克服常有的技术偏见，进行大胆创新，用普通干燥抽真空冷藏保存的方式对羊膜进行长期保存，其方法简单易学，一般技术人员经过简单培训即可掌握；同时，本发明中使用的干燥剂为无水氯化钙，其获得简单，价格低廉，常温下即可保存，不需低温冷藏，不需配制低温冷藏液，成本低，经济实用。

3、便于运输。本发明所提供的生物羊膜干燥保存方法可在干燥后，装入无菌袋中，由于抽取真空保存，因此能够方便进行运输，可以很方便的使保存的羊膜组织方便的进行流通，具有较高的经济价值。

具体实施方式

本发明提供了一种生物羊膜干燥保存方法，该方法包括以下步骤：

1)取羊膜洗净后灭菌，备用；

2)将无菌羊膜从绒毛膜分离出来，并丢弃绒毛膜，该分离方法是非常成熟的现有的任何一种方式，例如，将整片无菌羊膜及其上附着的绒毛膜平铺于无菌纱布之上，用无菌纱布擦除绒毛膜，并丢弃绒毛膜，并留下完整羊膜组织；进一步在显微镜下用刀片将羊膜组织中的海绵层、纤维母细胞层及浆液性渗出物，仅留含上皮组织层及基底层的羊膜组织备用。

3)将步骤2)所得到的无菌羊膜上皮面朝上平铺于孔径为0.22～0.45μm的硝酸纤维素滤纸或者无菌纱布上并进行分割得到无菌羊膜组织碎片；该无菌羊膜组织碎片可以修剪成20mm×20mm的组织片；硝酸纤维素滤纸或者无菌纱布的主要作用就是把新鲜羊膜周边的组织液、渗出液、浆液之类的吸干，同时，便于将大的羊膜组织片修剪成小片；将无菌羊膜组织碎片修剪成20mm×20mm的组织片主要是由于临床上使用的组织片一般为这个大小，过大还需要修剪，增加手术时的步骤和时间；过小，则有可能导致该组织片无法使用。

4)将分割后的无菌羊膜组织碎片上皮面朝上平铺放在培养皿内以暂时保存，并置于含有干燥剂的干燥皿中进行干燥；该干燥剂可以是是无水氯化钙、生石灰、五氧化二磷、硅胶干燥剂或活性矿物干燥剂，当选用无水氯化钙为干燥剂时，是使用量不低于125g/L(无水氯化钙在干燥皿固定空间内的使用量)；在使用时，每个干燥皿中可以容纳培养皿8个，即8片无菌羊膜组织碎片，可以根据使用条件进行调整，并不局限于8片无菌羊膜组织碎片。将无菌羊膜组织碎片置于干燥皿中后，室温下静置，48小时后即可完成干燥脱水。

5)将干燥后的无菌羊膜组织碎片在超净台上取出其内羊膜组织，将该干燥羊膜组织装入无菌塑料袋内，抽真空后，4℃保存，保存期可达一年以上。

Claims (8)

1.一种生物羊膜干燥保存方法，其特征在于：所述生物羊膜干燥保存方法包括以下步骤：

1)取羊膜洗净后灭菌，备用；

2)将无菌羊膜从绒毛膜分离出来，并丢弃绒毛膜；用刀片将无菌羊膜表面的海绵层、纤维母细胞层刮除，仅留上皮细胞层及基底层；

3)将步骤2)所得到的无菌羊膜平铺于硝酸纤维素滤纸或无菌纱布上并进行分割得到无菌羊膜组织碎片；

4)将分割后的无菌羊膜组织碎片置于含有干燥剂的干燥皿中进行干燥；

5)将干燥后的无菌羊膜组织碎片置于无菌容器并抽真空，3～5℃保存。

2.根据权利要求1所述的生物羊膜干燥保存方法，其特征在于：所述步骤4)中干燥条件是：将分割后的无菌羊膜组织碎片置于干燥皿中25-35℃下静置24～72小时。

3.根据权利要求2所述的生物羊膜干燥保存方法，其特征在于：所述步骤4)中的干燥剂是无水氯化钙、生石灰、五氧化二磷、硅胶干燥剂或活性矿物干燥剂。

4.根据权利要求3所述的生物羊膜干燥保存方法，其特征在于：所述步骤4)中的干燥剂是无水氯化钙时，其使用量是不低于125g/L。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的生物羊膜干燥保存方法，其特征在于：所述步骤3)是将无菌羊膜的上皮面朝上并平铺于硝酸纤维素滤纸或无菌纱布上。

6.根据权利要求5所述的生物羊膜干燥保存方法，其特征在于：所述硝酸纤维素滤纸的孔径是0.22～0.45μm。

7.根据权利要求6所述的生物羊膜干燥保存方法，其特征在于：所述无菌羊膜组织碎片的大小是15mm×15mm～25mm×25mm。

8.根据权利要求7所述的生物羊膜干燥保存方法，其特征在于：所述无菌羊膜组织碎片的大小是20mm×20mm。