CN1649998A - 为研究、临床眼晴表面移植和组织工程的应用而生长人类结膜组织等同物的方法 - Google Patents

为研究、临床眼晴表面移植和组织工程的应用而生长人类结膜组织等同物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于生产眼睛表面组织等同物，特别是结膜组织等同物的材料和方法。本发明的方法包括合适组织的活组织检查，在特定培养基中的原始培养，在第二种培养基中的增殖培养，和在第三种培养基中的分化培养。所述组织等同物通常是在基质，通常是在羊膜上生长的，它的一个优点是便于控制。

Description

为研究、临床眼睛表面移植和组织工程的应用而生长 人类结膜组织等同物的方法
本发明领域
本发明涉及体外培养结膜干细胞，以便形成结膜上皮组织等同物的方法，包括扩增所述移植的结膜干细胞，然后在培养物中对它们进行分化。本发明还涉及用于支持所述方法的培养基。本发明还涉及通过移植包括结膜上皮细胞的组织等同物治疗眼部疾病的方法。
本发明背景
R.J.-F.Tsai等(NEJM 343：86(2000)，I.R.Schwab等(角膜19：421(2000)和G.Pellegrini等(The Lancet 349：990(1997))披露了为了治疗由异组织边缘干细胞缺陷引起的疾病而移植异组织边缘干细胞，以便恢复角膜上皮完整性。
Tsai的论文提到了结膜上皮细胞是眼睛表面整体的一部分，不过，Tsai等的文章以及其他有关异组织边缘干细胞移植的论文表明(i)结膜和角膜细胞类型在功能和形态学方面差别很大，所述异组织边缘细胞是角膜细胞的祖细胞；和(ii)为了实现所述角膜表面的再生，要移植的重要的干细胞类型是所述异组织边缘干细胞。Tsai等和其他作者未能证实可以将结膜上皮用于恢复所述角膜表面。所述异组织边缘干细胞在恢复所述角膜表面方面确实是重要因素，但是，结膜干细胞是防止异组织边缘干细胞和角膜上皮损伤的最重要的因素。这是因为结膜干细胞的支持性功能对于眼睛表面的再生和恢复来说是重要的。
Z-G.Wei等(Investigative Ophthalmology and Visual Science34：1814(1993))披露了穹窿结膜干细胞的起源。Y.Diebold等(Graefe′s Arch.Clin.Exp.Ophthalmol.233：268(1997))披露了源于穹窿结膜组织的原始细胞培养物。
附图的简要说明
图1表示眼球的示意性剖视图，表示位于角膜(2)和结膜(3，3′)的结合部分的异组织边缘区(1)，结膜位于眼球周边，并且位于眼睑(7)的内表面上。结膜干细胞(4)位于眼球顶部的穹窿(5)处。异组织边缘干细胞(6)位于所述异组织边缘区。
图2A表示结膜组织活组织检查的原始外植体的相差显微照片，显示源于所述外植体的细胞的融合生长。
图2B是图2A所示培养物一部分的更高放大倍数的图像。
图2C是人羊膜基质上的原始结膜外植体培养物的相差显微照片。箭头表示业已从所述外植体移出的上皮片层边缘。
图3A表示对细胞角蛋白K4染色的本发明分化的结膜上皮细胞。染色是通过本领域的常用方法，用抗细胞角蛋白K4的小鼠单克隆抗体进行的，参见K.L.Krenzer和T.F.Freddo(InvestigativeOphthalmology and Visual Science 38：142(1997))。所述细胞体呈阳性染色。
图3B表示对细胞角蛋白K3染色的本发明分化的结膜上皮细胞。染色是按照上述方法进行的，不过，使用的是来自小鼠的抗细胞角蛋白K3的AE-5单克隆抗体。所述结膜上皮细胞不能表达所述角膜专一性角蛋白，K3。所述细胞体没有被染色。
图4A是源于皮下注射到无胸腺小鼠侧腹的培养的结膜上皮细胞胞囊的低倍光学照片。由移植物(10)形成的所述复层扁平上皮，由小鼠基质(11)构成的胞囊的边缘包围着。
图4B是图4A所示胞囊一部分的更高放大倍数的图像。由表面细胞层(12)和基底细胞(13)构成的复层扁平上皮(10)的外观是清晰的。
图5A是结膜组织等同物剖面的光学照片，表示生长在人羊膜基质上的上皮细胞。人羊膜是通过双头箭头表示的所述部位的下部。
图5B是结膜组织-等同物用细胞角蛋白K4抗体进行的免疫染色，显示阳性染色。
图5C是结膜组织-等同物用细胞角蛋白K3抗体进行的免疫染色，显示阴性染色。定标线条＝63mm.
图6A表示在人羊膜基质上多层培养的结膜上皮的电子显微照片。所述多层结膜上皮包括一层表面细胞(12)，它能表达微绒毛延伸部分的表面层(14)，和基底细胞(13)，图中它位于人羊膜基质(9)上。存在多个细胞桥粒(连接结构)(15)。
图6B是人羊膜基质上的多层培养的结膜上皮的高倍电子显微照片。该图表示细胞桥粒连接结构(15)的存在。
图7是在进行从上球结膜(superior bulbar conjunctiva)收获的结膜组织的大型自体移植之后，常规翼状胬肉切除结果的示意图；示出了开张器(16)，上球结膜收获部位(17)和在切除的翼状胬肉部位缝合的结膜移植物(18)的位置。
图8A是临床实验患者的手术前照片，显示位于鼻侧的翼状胬肉。
图8B是临床实验患者的手术后早期的照片，显示按照本发明制备的结膜等同物的位置。该照片还示出了放置在所述结膜等同物上，用于在愈合期间保护移植物的一片羊膜。
图8C是图8E所示移植物的照片，是在手术后一个月拍摄的。随着边异组织边缘和结膜解剖的恢复，所述移植物表示较出色的″相容(take)″。
图9A是第二位临床实验患者的手术前照片，显示位于鼻侧和颞侧定位的翼状胬肉。
图9B是图9A所示患者的手术后照片，是在手术后一个月拍摄的。示出了随着异组织边缘和结膜解剖的恢复的结膜等同物移植物，和没有翼状胬肉复发迹象的出色功能和美容效果。
本发明的详细说明
所述眼睛表面包括两种基础上皮表面，角膜上皮(它覆盖角膜)和结膜上皮，它覆盖巩膜，以及眼睑内表面(参见图1)。连续取代角膜上皮的干细胞群体位于被称为异组织边缘干细胞(LSC)的边缘。另一方面，业已示出了连续取代结膜上皮的干细胞在兔子眼睛中，它位于结膜穹窿处。位于巩膜和眼睑的穹窿结合部位的结膜的最上部和(可能)最下部的干细胞，被称为结膜干细胞(CSC)。
分布在结膜表面上的结膜上皮细胞之间的分泌粘蛋白的杯状细胞，据推测也是源于双能成人CSC。所述LSC和CSC干细胞群，在眼睛表面上位于彼此远离的地方。
另外，角膜和结膜上皮细胞似乎属于两种不同的谱系(Z.G.Wei等，Investigative Ophthalmol.And Visual Science，34：1814(1993))例如，只有角膜上皮细胞能够表达角蛋白K12(W.Y.W.Chen等，Current Eye Research pp.765-778(1994))。
结膜的主要作用是通过分泌粘蛋白的杯状细胞产生眼泪以提供眼睛表面水合作用和润滑作用，以及提供光滑湿润的细胞表面支撑所述角膜表面上的泪膜，后者由此导致了在光学上透明的光学表面，并且导致清晰视觉。因此，所述结膜支撑着角膜上皮的健康，它同样是保持清晰视觉的清澈透明的角膜所必需的。为了保持清晰的视觉，所述角膜上皮总体上取决于健康的结膜表面。结膜的病变或损伤，导致了整个眼睛表面的干涩和慢性炎症，导致角膜上皮破坏，逐渐的继发性损伤，和LSCs的增加，以及角膜上皮的最终疤痕斑和破损，导致角膜基质浑浊化，血管化，溶化，并且导致失明。因此，现在已经清楚的是，LSC和角膜上皮的完整性，需要健康的结膜。
眼睛表面的这些概念，慢性炎症的作用，以及异组织边缘和结膜干细胞的作用只是近些年才被认识到。各种干细胞群体的位置仍然在研究之中(例如，仍然存在一些这样的问题：CSCs是否存在于眼睑边缘，以及存在于结膜穹窿中)。参见图1。
眼睛表面疾病是以对结膜或角膜上皮的损伤为特征的一类疾病，但最终的结果是损伤的瘢痕性的角膜表面。眼睛表面疾病的例子包括对眼睛的化学和热烧伤，Stevens Johnson综合症(SJS)和眼瘢痕性类天疱疮(OCP)。在所有这些疾病中，在急性情况下，结膜和角膜上皮都受到损伤，不过，最初的损伤通常出现在结膜上。对LSCs和角膜上皮继发性损伤随后以后期的慢性阶段跟着发生，并且，它会导致失明。在所述疾病中，CSC很少受到损伤，因为所述干细胞位于结膜穹窿的最上方或最下方(在这里它们不会受到化学和热损伤)。
不过，现有技术的状态仅仅集中在角膜上皮和LSCs上。有关LSCs和异组织边缘干细胞移植的所有现有文献，包括前面引用的Tsai，Wei等的文章，都披露了在继发性角膜和LSC损伤业已发生的疾病过程的晚期阶段生长和再移植LSCs的方法。事实上，某些，例如Wei的文章，最初试图利用结膜上皮(不是CSCs)取代角膜上皮，并且指出这样做不起作用，然后他们提出包括LSCs的异组织边缘上皮在取代角膜上皮方面更成功。因此，本领域的现有技术表明，可以用LSCs治疗LSC缺陷，这种治疗能够恢复健康的角膜上皮。
本发明在概念上是明显不同的，因为我们是利用CSCs修复结膜缺陷，而不是异组织边缘缺陷。尽管可以利用本发明的方法取代角膜上皮(这一目的可以利用LSCs实现)，本发明的方法还可以进行CSC移植，以便恢复健康的结膜表面。这样又能够避免继发性异组织边缘和角膜损伤，并且防止继发性LSC缺陷。很多眼睛表面疾病始于结膜损伤，随后是异组织边缘和角膜损伤。本发明提供了在所述疾病过程的更早阶段进行的手术干预，以便在它发生之前，首先避免异组织边缘和LSC损伤，因此消除了对后来的LSC移植和角膜重建的需要。这种早期干预利用LSC移植是无法实现的。
通过LSC移植体现的本发明和现有技术的另一个主要差别是，CSCs和LSCs处在完全不同的部位。LSCs位于角膜周围的窄的条带上，而CSCs要么集中在上部结膜穹窿最上方，要么位于下部结膜穹窿的最下方，在这两种情况下，都远离眼睛的所述异组织边缘区，因此，手术技术也是不同的。通过Tsai和其他人披露的常规方法收获LSCs不会采集到任何CSCs，并且，迄今为止，还没有人披露CSC收获技术。任何故意包括靠近LSC收获部位的结膜上皮的做法，都不包括CSCs的存在。另外，从结膜穹窿中获得CSCs，不会导致随后的角膜或异组织边缘损伤，与从异组织边缘获得LSCs不同，它必然会导致某种程度的异组织边缘和角膜损伤。以前的研究业已证实，异组织边缘干细胞的伤失，即使是来自其他方面健康的角膜的伤失，都可能是破坏性的。
与异组织边缘干细胞移植的现有技术不同，本发明专门致力于结膜干细胞分离，扩增和分化。本发明可用于提供用于治疗结膜病变或创伤的细胞和组织等同物。后一种类型的条件变化更多，并且不仅包括异组织边缘缺陷相关的眼睛表面疾病(它能够治疗异组织边缘干细胞恢复)，而且包括完全不同的指征(例如，在诸如翼状胬肉切除的手术，青光眼，视网膜和斜视手术之后的结膜重建)，没有指明对它的异组织边缘移植。
另外，眼睛表面疾病的结膜干细胞移植明显不同于异组织边缘干细胞移植。在很多眼睛表面疾病中，受到损伤的原始组织是结膜，并且导致源于结膜损伤的并发症，瘢痕和炎症，随后会导致异组织边缘干细胞缺陷和继发性角膜损伤。
本发明能够在结膜缺陷的更早阶段，在继发性异组织边缘缺陷出现之前治疗眼睛表面疾病。例如，Stevens Johnson综合症(以结膜损伤为特征的疾病)具有开始的急性期，期间因为结膜水疱而发生了结膜的严重伤失。在此阶段，据信出现了最低的异组织边缘干细胞损伤。在该急性阶段之后，对结膜的严重损伤导致了瘢痕，慢性炎症，结膜表面皱缩和干燥(源于结膜缺陷)，眼睑变形和外露。以上过程会导致持久的和慢性眼睛表面炎症，导致继发性异组织边缘干细胞损伤，角膜损伤以及在数月之后的视力伤失，如果在继发性异组织边缘损伤发生之前进行结膜干细胞扩增和移植的话，可能会预防上述症状的发生。
因此，本发明治愈了所述原发性疾病，即所述结膜细胞缺陷，它是以多种形式的眼睛表面疾病出现的。简单地治愈异组织边缘干细胞缺陷可能不能长期有效，因为如果不解决所述结膜问题的话，所述损伤异组织边缘干细胞的结膜因素有可能长期存在。因此，本发明能够预防或减轻继发性异组织边缘干细胞损伤。另外，在进行CSC移植，以便恢复结膜的解剖学和功能完整性没有完全成功并且仍然需要LSC移植的情况下，眼睛表面完整性的部分恢复有可能在LSC移植物本身的存活方面发挥重要的支持作用。。
结膜干细胞手术时间，明显早于异组织边缘干细胞手术，并且，结膜干细胞手术的指征比异组织边缘干细胞手术宽。
在本发明培养过程的某些部分，细胞是在常规基质——人羊膜上生长的。不过，能够在物质意义上支持上皮组织，并且能够促进组织成层和成体终末分化的人工基质，可以在所述过程的合适点使用。例如，所述细胞可以在作为物理支持物的可透膜上生长，所述膜可以从一种培养条件转移到另外一种培养条件，以便能够将合适的因子从培养基转移到所述细胞中，以便选择性地促进细胞增殖或增殖中的细胞分化，从而形成组织等同物。
在本发明的一种实施方案中，将硝酸纤维素膜制成环绕羊膜的支架。然后让所述结膜干/上皮细胞在支架膜支持物上生长。在本发明的一种实施方案中，所述细胞是在羊膜的基础膜一侧的表面上培养的。例如，所述羊膜可由进行选择性剖腹产手术患者保留的生产后组织获得。
用于本发明的培养基根据在所述过程中细胞的阶段而改变，从组织的活组织检查到所述细胞的长出(原始培养)，以及其数量的增加(增殖培养)，以及所述细胞的分化和组织等同物的形成(分化培养)。用于原始培养的培养基，在组织样品分散和干细胞从组织样品中转移出来期间，具有保持结膜干细胞的活力，增殖和分化能力的功能。添加占培养基体积5-10％的血清，并且使用浓度为0.7-1.1mM，优选大约0.9mM的钙离子(Ca2+)对于所述功能来说是重要的。
用于增殖培养的培养基能保持结膜干细胞的活力和分化能力，并且还提供了细胞生长和分裂所需要的因子，以便增加细胞数量。所述增殖培养基还发挥使得上皮细胞的生长优先于成纤维细胞生长的作用。垂体提取物(优选牛垂体提取物)的使用和血清的省略，并且将钙离子浓度降低到0.03-0.3mM(优选0.12-0.17mM，通常0.15mM)，对于增殖培养培养基的功能来说是重要的。
所述分化培养基能支持所述细胞的活力，并且还提供了促进所述细胞分化的因子，以便表达上皮细胞表型。钙离子浓度的提高，与增殖培养基的量相比，优选提高到1.1-1.4mM(优选大约1.3mM)，对于分化培养基的功能来说是重要的。
表皮生长因子(EGF)，胰岛素和氢化可的松存在于本发明所使用的所有三种培养基中。这些成分能够改善在所述培养过程中结膜上皮细胞优先于成纤维细胞的选择性。
本发明的方法优选适用于制备结膜组织等同物。不过，本发明一般还可用于类上皮细胞的生长和分化。本发明可应用于所有眼睛表面上皮细胞，如异组织边缘细胞和角膜上皮细胞。本发明还可用于杯状细胞和角化细胞的生长和分化。
本发明和现有技术的差别是选择结膜组织活组织检查作为本发明使用的细胞来源。选择结膜干细胞作为原始细胞类型，导致了组织等同物的产生，它是透明的并且在它的表面缺少角化层，如在将角化细胞用于生产皮肤组织等同物时所发生的情况。以上结果与Pelligrini等，同上，披露的现有技术的结果不同，所述现有技术的结果表明，通过将结膜直接移植到所述角膜表面上进行的所述角膜表面的恢复是完全不合适的，导致了角膜的″新血管形成，慢性炎症，复发性上皮缺陷和基质瘢痕″。本发明克服了这些问题，本发明提供了结膜等同物，在将它移植到眼睛的结膜表面上之后，能恢复结膜的功能完整性，因此保护角膜上皮表面，并因此不会导致″新血管形成，慢性炎症，复发性上皮缺陷和基质瘢痕″。
利用结膜干细胞作为原始细胞，用本发明方法获得的细胞能够表达所述上皮细胞表型的特征。具体地讲，所述细胞在与表面结合之后，是卵圆形的。这种形状与成纤维细胞表现的星形或纺锤形形状不同。另外，通过本发明获得的结膜上皮细胞能够表达细胞角蛋白K4，它是非-角蛋白化的，层状上皮细胞的标记，与结膜上皮的情况类似(K.L.Krenzer和T.F.Freddo.Investigative Ophthalmology and Visual Science38：142(1997))。所获得的结膜上皮细胞对于角膜专一性细胞角蛋白，K3的表达也是阴性的(A.schemer等(The Journal of Cell Biology103：49(1986))。
通过本发明获得的细胞在移植到患者眼睛中之后还形成了复层扁平上皮。这种层状组织结构如图5A，5B，5C，4B，6A和6B所示。
用于本发明的培养基包括基础培养基和各种添加剂。用于原始培养步骤的优选培养基包括：
a)Dulbecco改进的必需培养基和Ham′s F-12培养基，比例为1∶1；
b)胎牛血清或人血清白蛋白；
c)人表皮生长因子
d)胰岛素；
e)霍乱毒素；
f)氢化可的松；
g)抗生素或抗生素的混合物；
在所述原始培养基中，上述成分的用量优选在以下范围内
b)5-15％血清(优选胎牛血清或人血清白蛋白)；
c)5-15ng/ml表皮生长因子(优选人)
d)2-10μg/ml胰岛素(优选人)；
e)7-10ng/ml霍乱毒素；
f)0.3-1μg/ml氢化可的松；
g)10-100μg/ml抗生素或抗生素的混合物。
在所述原始培养基中，通常含有浓度为0.7-1.1mM，优选大约0.9mM的钙离子(Ca2+)。
用于增殖培养的优选培养基包括：
a)角化细胞生长培养基；
b)表皮生长因子(优选人)；
c)胰岛素(优选人)；
d)氢化可的松；
e)垂体提取物(通常是牛的)；
f)抗生素或抗生素的混合物；
在用于增殖培养的优选培养基中，这些成分的用量为：
b)5-15ng/ml人表皮生长因子；
c)2-10μg/ml胰岛素；
d)0.3-1μg/ml氢化可的松；
e)15-140μg/ml，优选15-120μg/ml，更优选15-100μg/ml，更优选15-70μg/ml垂体提取物；30-100μg/ml或50-100μg/ml或70-100μg/ml的范围也是可取的；
f)10-100μg/ml抗生素或抗生素的混合物。
在增殖培养基中，钙离子的存在浓度通常是0.03-0.3mM，优选0.12-0.17mM，更优选0.15mM。另外，使用大量的垂体提取物通常可获得更好的集落形成效率和更快的增殖。
用于分化培养的优选培养基包括：
a)Dulbecco改进的必需培养基和Ham’s F-12培养基，比例为3∶1；
b)胎牛血清或人血清白蛋白；
c)表皮生长因子(优选人)
d)胰岛素(优选人)；
e)霍乱毒素；
f)氢化可的松；
g)抗生素或抗生素的混合物。
在用于分化培养的优选培养基中，这些成分的用量为：
b)0.5-5.0％胎牛血清或人血清白蛋白；
c)5-15ng/ml人表皮生长因子；
d)2-10μg/ml胰岛素；
e)7-10ng/ml霍乱毒素；
f)0.3-1μg/ml氢化可的松；
g)10-100μg/ml抗生素或抗生素的混合物。
在用于分化培养的培养基中，钙离子的使用浓度通常为1.1-1.4mM，优选大约1.3mM。
在上述培养基中，角化细胞生长培养基是MCDB 153培养基或该培养基的改进形式，由Clonetics公司以″角化细胞生长培养基″为名称出售。MCDB 153培养基具有以下成分：
成分                                    g/L
偏钒酸铵                                0.000000585
氯化钙-2H2O                            0.004411
硫酸铜-5H2O                            0.00000275
硫酸亚铁-7H2O                          0.00139
氯化镁                                  0.05713
硫酸锰                                  0.000000151
钼酸-4H2O(铵)                          0.00000124
氯化镍-6H2O                            0.00000012
氯化钾                                  0.11183
乙酸钠(无水)                            0.30153
氯化钠                                  7.599
偏硅酸钠-9H2O                          0.000142
磷酸氢二钠(无水)                        0.284088
亚硒酸钠                                0.0000038
氯化亚锡-2H2O                          0.000000113
硫酸锌-7H2O                            0.000144
L-丙氨酸                                0.00891
L-精氨酸-HCl                            0.2107
L-天冬酰胺-H2O                         0.015
L-天冬氨酸                              0.00399
L-半胱氨酸-HCl-H2O                     0.04204
L-谷氨酸                                0.01471
L-谷氨酰胺                              0.8772
甘氨酸                                  0.00751
L-组氨酸-HCl-H2O                       0.01677
L-异亮氨酸                              0.001968
L-亮氨酸                                0.0656
L-赖氨酸-HCI                            0.01827
L-甲硫氨酸                              0.00448
L-苯丙氨酸                              0.00496
L-脯氨酸                                0.03453
L-丝氨酸                                0.06306
L-苏氨酸                                0.01191
L-色氨酸                                0.00306
L-酪氨酸-2Na                            0.00341
L-缬氨酸                                0.03513
D-生物素                                0.0000146
氯化胆碱                                0.01396
叶酸                                    0.00079
肌醇                                    0.01802
烟酰胺                                  0.00003663
D-泛酸(半钙)                            0.000238
吡哆醇-HCl                              0.00006171
核黄素                                  0.0000376
硫胺素-HCl                              0.000337
维生素B-12                              0.000407
腺嘌呤-HCl                              0.03088
D-葡萄糖                                1.081
HEPES                                   6.6
酚红-Na                                 0.001242
腐胺-2HCl                               0.000161
丙酮酸-Na                               0.055
硫辛酸                                  0.000206
胸腺嘧啶脱氧核苷                        0.000727
对于用于各种培养基中的抗生素来说，在培养基I中，所述抗生素或抗生素的混合物优选包括40-60IU/ml青霉素和40-60μg/ml链霉素。在培养基II中，所述抗生素或抗生素的混合物优选包括40-60μg/ml庆大霉素和40-60ng/ml两性霉素B；以及在培养基III中，所述抗生素或抗生素的混合物优选包括40-60IU/ml青霉素和40-60μg/ml链霉素。
本发明还涉及通过本发明方法生产的结膜等同物。通过本发明获得的所述结膜组织等同物优选形成包括若干层结膜上皮细胞的复层扁平上皮。这些层优选通过在每一层的相邻细胞之间形成的一个或多个细胞桥粒结构连接。
本发明还涉及用于通过将所述结膜等同物自体或异体移植到患者眼内治疗眼睛疾病的方法。为了用于移植，通过本发明的培养方法获得的结膜组织等同物通常被移植到眼睛表面，通常移植到巩膜，穹窿或眼睑软骨部位，作为用于取代正常眼球(bulbar)，穹窿或眼睑软骨结膜的工程组织。可以将所述结膜等同物放置在现有结膜中，位于眼睑内表面。
这些实施方案构成了与现有技术不同的方法，它涉及移植通过培养异组织边缘干细胞形成的异组织边缘组织等同物。在现有技术中，所述异组织边缘组织等同物仅仅被直接移植到角膜上。
不过，本发明的结膜组织等同物还可用于在包括靠近角膜的眼睛表面的任何部位取代，支持或加强眼睛表面的上皮细胞。本发明的这些实施方案还可以通过按照本发明方法利用从眼睛表面的其他部分获得的组织外植体生长的组织等同物实现。
本发明的多步骤培养方法产生了生产通常是有组织的组织等同物形式的大群的结膜上皮细胞的理想效果。所述有组织的组织等同物通常包括多层排列的结膜上皮细胞，并且，在一种优选实施方案中，包括分散在上皮细胞之间的杯状细胞。所述杯状细胞的特征是椭圆形形状和含有包括粘蛋白的大的分泌颗粒。杯状细胞还能用PAS染料染色。
与用于培养上皮细胞的常规方法相比，本发明具有若干优点。组织培养的常规方法能够产生具有正常表型的上皮细胞，不过，它的缺陷是它需要使用血清和3T3饲养细胞(它是从瑞士小鼠获得的具有较长寿命的成纤维细胞)。使用血清(源于牛)具有与感染风险相关的缺陷(例如，克雅氏病或疯牛病)。在本发明中牛血清可以用人血清白蛋白取代或完全省略，大大降低了病原体污染结膜等同物的危险。
含有常规血清的培养基的使用，通常与3T3饲养细胞的使用组合。这会使得角化细胞(皮肤细胞)区室继续增殖。通过避免使用3T3细胞，我们的客户消除了对动物制品和组织的需要，这些制品的使用可能导致感染，例如，逆转录病毒感染，并且有可能因为使用异种移植物(从除了人以外的物种获得的移植物)导致移植失败。
本发明的方法省略了对任何饲养细胞层的使用，因此避免了上述缺陷。
使用没有饲养细胞的含有血清的常规培养基，还导致了成纤维细胞明显生长，妨碍了纯的结膜上皮细胞群体的获得。相反，通过使用具有低钙浓度的无血清培养条件，本发明有利于结膜上皮细胞而不是成纤维细胞的生长，因此获得可以忽略成纤维细胞污染的更一致的培养物。
所述分化培养步骤对于促进上皮细胞分化(层化和分化)，以及促进细胞-细胞相互作用的形成来说是重要的。通过电子显微镜检查发现了在结膜组织等同物中存在细胞桥粒，顶端微绒毛，和正常细胞骨骼。包括一个分化培养步骤，提高了组织结构的稳定性，这种稳定性对于临床移植来说是重要的。在缺少所述分化培养步骤的情况下，细胞的分化程度更低，成层更差，连接更少，并且所述组织等同物作为一个整体更不稳定。在所述移植过程中，以及在随后的患者恢复阶段，所述上皮细胞更有可能分离。  另一方面，包括所述分化培养步骤，提供了更稳定的组织等同物，它能导致更成功的临床结果。
本发明还提供了CSC移植的指征，它完全不同于LSC移植的指征。CSC移植在眼科手术方面具有额外用途，即取代不直接与常规眼睛表面疾病相关的病变的或手术损伤的结膜表面。其例子包括：
1.翼状胬肉手术。翼状胬肉手术详细披露于以下文献中：TheUniversity of Miami Bascom Palmer Eye Institute Atlas ofOphthalmology，R.K.Parrish，Jr.，ed.，c.2000 by ButterworthHeinemann，Philadelphia，PA，见第22章，第161页，以及图22-24。在这种形式的手术中，从结膜中取出翼状胬肉物质，留下了大的结膜缺陷，它现在被来自眼睑下面的大的自体移植物所取代，这样又会在其他地方留下另外一个结膜缺陷。在翼状胬肉手术之前生长结膜，使得外科医生能够利用所述额外的结膜片层，而又不会损伤眼睑下面的结膜的另一个大的部分。
2.青光眼手术-存在两种主要形式的青光眼手术，这两种手术都需要完整健康的结膜，以便能够成功地：
a.小梁切除术-在巩膜上，靠近所述异组织边缘手术形成一个排泄阀，在这里，允许含水流体从结膜下面流出，它向外突出，形成结膜水疱。不过，该方法具有较高的失败率，需要在该部位重复手术-以重新打开所述阀，并且在这样做的时候，上面的结膜会进一步瘢痕化或受到损伤，导致手术失败。另外，有时候结膜水疱形成孔，导致含水流体从所述手术部位泄露，具有随后感染的危险。在这两种情况下，修正手术是必要的，但健康结膜供给不充分是成功的限制因素。在修正手术之前生长自体结膜，使得外科医生能够用足够的结膜进行手术，并且因此增加手术的成功。用于获得CSCs的活组织检查部位位于上部或下部穹窿，并且远离小梁切除术部位，它通常位于上球结膜上，密切靠近所述上部异组织边缘。
b.挂线手术-在青光眼的晚期或高危期(通常是在失败的重复的小梁切除术之后)，将排泄移植物放置在所述结膜下面，靠近所述异组织边缘。这些平板形式的移植物具有从前房引出的导管，依靠于正常结膜上，以便覆盖所述移植物并且对它进行固定。在晚期青光眼的很多场合下，先前的手术常具有大的瘢痕性的结膜部位，并且不可能剖开足够游离的结膜，以便对所述移植物进行安全的寄存，从而防止挤出。同样，生长结膜以便增加结膜覆盖面积将是有用的，并且能够改善这种形式的手术。
3.斜视手术和视网膜分离手术-在这两种形式的手术中，手术是在眼睛外肌肉(斜视手术)或在巩膜表面(视网膜手术)进行的。为了进入，必须使结膜翻转，以便接触所述结构，并且在手术完成之后放回原处。在以前有过类似手术的情况下，覆盖结膜是瘢痕性的，并且向下附着在巩膜上，并且再次尝试翻转结膜，通常会导致有用的，健康的结膜的伤失，在手术之后，它不能够适当的取代。在这里，在再次手术之前制备用于取代损伤部位的结膜组织等同物，能够提供更好的手术效果。
本发明还能够应用于其他不常见的场合，不过，通常关键的医学状况，如眼睛创伤修复，肿瘤切除和眼窝手术，其中，结膜受到了严重损伤，结膜等同物的可利用性将降低手术难度，以及在这些方法中手术后并发症的发病率。
实施例
将通过以下实施例对本发明进行说明，这些实施例是说明性质的，而不限定本发明的范围。本发明的范围是通过下面的权利要求书限定的。
例1：
结膜干细胞活组织检查
对患者实施结膜干细胞活组织检查，所述患者被选择进行培养的结膜细胞的自体移植手术。结膜干细胞活组织检查是在移植手术之前2周进行的。手术过程是在无菌条件下进行的。用50％聚乙烯吡酮碘溶液清洗眼睑。将局部阿美索卡因滴眼剂滴在眼睛表面，作为局部麻醉剂。放入标准的眼睑开张器。在手术显微镜下，放置支持缝合的上部的异组织边缘角膜(7/0Vicryl)，然后通过下部的杯状退缩，以便露出上部结膜穹窿。穹窿的局部浸润是使用270针头，利用结膜下利多卡因2％注射进行的。进行穹窿结膜上皮的活组织检查，尺寸为1mm×3mm。第二个类似尺寸的活组织检查可以靠近原始活组织检查部位进行，以便在缺少一种样本的生长或污染的情况下，获得重复的干细胞培养物。所述活组织检查部位应当尽可能地高，位于穹窿结合部分，以便获得结膜干细胞的最大密度。使上皮与底部基质剥离，并且将所述组织放入DMEM，马上送到实验室进行培养。通过双极透热电疗机固定止血。进行结膜下地塞米松/庆大霉素注射。用Tobradex滴眼剂q.d.s.对患者施用1周时间。
例2：
结膜上皮细胞的培养及其用于体外生产人结膜等同物的用途
人羊膜制备
将人羊膜切割成2-3厘米的方形块，并且放置在硝酸纤维素滤纸上(Millipore，Inc.)，使基础膜一侧向上。将其保存在50％Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)和50％甘油中，并且在-80℃下保存。
羊膜解冻
将装有冷冻人羊膜的瓶子从储存库中取出。通过将所述瓶子放置在37℃的水浴中对所述膜进行迅速解冻。使用无齿镊子将所述膜从容器中取出，并且放置在装有磷酸盐缓冲溶液(PBS)的60mm培养皿中。用含有100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素和5μg/ml两性霉素B的PBS溶液漂洗所述膜2次，10分钟。然后在37℃，95％空气，5％CO2中用分散酶1.2U/ml培养所述膜30分钟，以便除去有可能感染随后的结膜上皮细胞生长的所有羊膜上皮细胞。
将培养皿从培养箱中取出，并且用小海绵轻柔摩擦所述基础膜表面，以便除掉任何残留的羊膜上皮细胞。应当小心以便确保羊膜受到最小的损伤，并且操纵，以免损伤或撕裂所述羊膜。通过三次PBS洗涤和一次DMEM洗涤洗去分散酶。然后将所述羊膜转移到另一片方形硝酸纤维素纸上，将中央窗口切除。所述硝酸纤维素膜的大小取决于需要移植的面积(大小通常为2.5cm×2.5cm)。所述中央窗口是便于观察和监测上皮细胞在所述膜表面上的生长用的。应当小心，以便确保将所述羊膜基础膜向上地放置。然后将所述膜浸泡在DMEM中，并且在培养箱中在37℃，95％空气，5％CO2中保持24小时。
人结膜上皮细胞的分离和培养
培养基和试剂
将以下培养基和试剂用于所述培养过程：
Dulbecco改进的Eagles培养基(DMEM)，Hank′s平衡盐溶液，人表皮生长因子(hEGF)，青霉素，链霉素，两性霉素B，胰蛋白酶，乙二胺四乙酸(EDTA)购自Gibco公司。胰岛素，氢化可的松，牛垂体提取物，霍乱毒素购自Sigma公司。角化细胞生长培养基，庆大霉素，和两性霉素B购自Bio Whittaker/Clonetics公司。胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司。
使用了以下培养基。
培养基1
a.DMEM和Hams F-12，比例为1∶1
b.10％胎牛血清
c.10ng/ml人表皮生长因子
d.5μg/ml胰岛素
e.8.4ng/ml霍乱毒素
f.0.4μg/ml氢化可的松
g.50IU/ml青霉素
h.50μg/ml链霉素
培养基2(无血清培养基)
a.角化细胞生长培养基(改进的MCDB 153培养基)
b.10ng/ml人表皮生长因子
c.5μg/ml胰岛素
d.0.5μg/ml氢化可的松
e.30μg/ml牛垂体提取物
f.50μg/ml庆大霉素
g.50ng/ml两性霉素B
培养基3
a.DMEM和Hams F-12，比例为3∶1
b.2.5％胎牛血清
c.10ng/ml人表皮生长因子
d.5μg/ml胰岛素
e.8.4ng/ml霍乱毒素
f.0.4μg/ml氢化可的松
g.50IU/ml青霉素
h.50μg/ml链霉素
在使用之前制备HAM
在使用所述膜之前，将上皮细胞培养基1加热到37℃。用预热的培养基1漂洗由硝酸纤维素纸支撑的所述膜2次，然后转移到35mm的培养皿上，浸泡在所述培养基中。
在羊膜上培养结膜上皮细胞。
立即处理所述结膜组织。将所述结膜组织从运输容器中取出，并且放置在装有PBS的60mm培养皿上。使用小解剖镊子和解剖刀片将所述结膜组织切成0.5mm大小的块。将这些块(外植体)放在所述羊膜的基础膜一侧。利用微量移液管顶端缓慢地小心添加培养基1，以便部分淹没每一个外植体。在37℃下，在5％CO2和95％空气中培养这些细胞。该培养基使用24-48小时，在此期间，实现了上皮细胞从外植体向所述膜的转移。然后将所述培养基换成培养基2，并且将所述外植体完全淹没在该培养基中。每隔2天更换所述培养基，加以小心以便不会排出所述外植体。
在10-12天内，生长所述上皮细胞以便在所述羊膜上形成融合的细胞层。在达到融合时，将培养基换成培养基3培养2-4天，以便促进进一步的增殖，层化和分化。由此建立的结膜等同物随后可用于移植。结果
对于第二代和第三代来说，在无血清培养基中培养的细胞的集落形成效率分别为14.5％和10.9％。具有饲养层的无血清培养基的使用不会改善所述细胞的增殖能力(第二代和第三代的平均集落形成效率分别为10.1％和6.0％)。对于第二代和第三代来说，具有3T3饲养层的含有血清的培养基的集落形成效率分别为20.6％和14.2％。
使用无血清培养基，上皮细胞平均可培养6代，并且在发生衰老之前进行26.9±8.0次细胞分裂。与饲养层共同培养不会提高所述细胞的增殖能力，并且它们平均只能培养4代，进行19.2±7.9次细胞分裂。具有饲养层的含血清培养基允许将细胞平均培养8代，并且进行36.5±9.9次细胞分裂。
体外的结膜上皮细胞扩增，导致了在人羊膜上形成融合的上皮层。光学显微镜检查发现了2-6层层化鳞状结膜上皮细胞，所述细胞才从基础层向上逐渐变平。超微结构检查发现了顶端微绒毛延伸部分，和多个细胞桥粒。所述培养的细胞表现出正常的结膜细胞角蛋白表达(K4阳性和K3阴性，图5B，5C)。
例3：
用于翼状胬肉手术和眼睛表面重建的自体培养的结膜等同物的移植
方法自体结膜等同物的移植是在需要进行眼睛表面手术的24位患者的25只眼睛上进行的：23位患者患有翼状胬肉，1位患者患有大结膜痣，1位患者患有持久性泄露青光眼水泡瘘管，需要结膜瘘管重建。结膜穹窿干细胞活组织检查(大小为1×3mm)是在最终手术之前2周获得的，并且利用例1和2的方法移植所述组织等同物。用于培养基2中的牛垂体提取物的量通常为30μg/ml。在某些场合下使用100-140μg/ml牛垂体提取物。使用各种浓度的结果是相当的，不过较低浓度的优点是使用较少的牛(非人来源)材料。
通过例2的方法将获得的结膜外植体在无血清条件下，在人羊膜上平均培养15天。在最后手术时，切除所述翼状胬肉和病变的结膜，并且将自体培养的结膜组织-等同物移植到结膜缺陷上。
翼状胬肉切除和结膜等同物移植
所述手术是在局部麻醉条件下进行的，并且是在手术现场使用手术显微镜进行的。用50％聚乙烯吡酮碘溶液清洗眼睑。麻醉剂包括局部阿美索卡因滴眼剂，应用在眼睛表面，眼球周围或眼球后麻醉。放置标准的眼睑开张器。放置上部异组织边缘角膜支持缝合器(7/0Vicryl)，并且按照裸露的巩膜技术切除翼状胬肉，并且安全止血。
用平衡的盐溶液漂洗包括羊膜/硝酸纤维素膜支持物的结膜等同物2次。使用无齿镊子，将复合片层转移到患者眼睛上覆盖裸露的巩膜缺陷，利用硝酸纤维素片作为支持物。利用中断的10/0Vicryl缝合线缝合固定所述结膜等同物。将超过结膜等同物尺寸2mm的另外的羊膜片移植物放置在结膜等同物上，使基础膜向下，发挥保护片的作用。结膜下施用地塞米松/庆大霉素。手术之后，给患者使用无防腐剂的抗生素-甾醇滴眼剂q.d.s.1周时间，在随后的3周使用拖尾(tail-down)剂量。在手术之后大约3-5天，取出所述羊膜片，以便在先前切除翼状胬肉的部位出现健康的和稳定的结膜等同物移植物。在手术之后1-5天，通过荧光素染色的缺乏证实全面的上皮形成。
对本发明的说明就是这样的，用于体现本发明的材料和方法的某些改进对本领域技术人员来说是显而易见的。这些改进被认为属于下面的权利要求书要求保护的范围。
本申请包括对专利和定期出版文献的引用。这些论文在这里被以它们的全文形式出于所述引用的所有目的收作本文参考。

Claims (29)

1.一种用于生产结膜组织等同物的方法，包括：
i)在培养基I中培养包括结膜干细胞的组织外植体，所述培养基I包括
a)Dulbecco改进的必需培养基和Ham’s F-12培养基，比例为1∶1；
b)胎牛血清或人血清白蛋白；
c)人表皮生长因子；
d)胰岛素；
e)霍乱毒素；
f)氢化可的松；
g)抗生素或抗生素的混合物；
ii)在培养基II中培养来自所述外植体的细胞，所述培养基II包括：
a)角化细胞生长培养基；
b)人表皮生长因子；
c)胰岛素；
d)氢化可的松；
e)垂体提取物；
f)抗生素或抗生素的混合物；
iii)在培养基III中培养所述细胞，以便获得结膜组织等同物，所述培养基III包括：
a)Dulbecco改进的必需培养基和Ham’s F-12培养基，比例为3∶1；
b)胎牛血清或人血清白蛋白；
c)人表皮生长因子；
d)胰岛素；
e)霍乱毒素；
f)氢化可的松；
g)抗生素或抗生素的混合物；
以便获得结膜组织等同物。
2.如权利要求1的方法，其中，所述培养步骤i)是维持所述外植的组织，并且允许所述结膜干细胞和上皮细胞长出的步骤；其中，所述培养步骤ii)导致了结膜干细胞和上皮细胞的增殖；并且，其中，所述培养步骤iii)导致了所述结膜干细胞和上皮细胞的分化，以便形成结膜等同物。
3.如权利要求1的方法，其中所述培养基I包括：
a)Dulbecco改进的必需培养基和Ham’s F-12培养基，比例为1∶1；
b)5-15％胎牛血清；
c)5-15ng/ml人表皮生长因子；
d)2-10μg/ml胰岛素；
e)7-10ng/ml霍乱毒素；
f)0.3-1μg/ml氢化可的松；
g)10-100μg/ml抗生素或抗生素的混合物。
4.如权利要求1的方法，其中，所述培养基II包括：
a)角化细胞生长培养基；
b)5-15ng/ml人表皮生长因子；
c)2-10μg/ml胰岛素；
d)0.3-1μg/ml氢化可的松；
e)15-140μg/ml垂体提取物；
f)10-100μg/ml抗生素或抗生素的混合物。
5.如权利要求1的方法，其中，所述培养基III包括：
a)Dulbecco改进的必需培养基和Ham’s F-12培养基，比例为3∶1；
b)0.5-5.0％胎牛血清或人血清白蛋白；
c)5-15ng/ml人表皮生长因子；
d)2-10μg/ml胰岛素；
e)7-10ng/ml霍乱毒素；
f)0.3-1μg/ml氢化可的松；
g)10-100μg/ml抗生素或抗生素的混合物.。
6.如权利要求3的方法，其中，所述培养基II包括：
a)角化细胞生长培养基；
b)5-15ng/ml人表皮生长因子；
c)2-10μg/ml胰岛素；
d)0.3-1μg/ml氢化可的松；
e)15-140μg/ml垂体提取物；
f)10-100μg/ml抗生素或抗生素的混合物。
7.如权利要求1的方法，其中，所述培养基II包括：
a)角化细胞生长培养基；
b)5-15ng/ml人表皮生长因子；
c)2-10μg/ml胰岛素；
d)0.3-1μg/ml氢化可的松；
e)15-140μg/ml垂体提取物；
f)10-100μg/ml抗生素或抗生素的混合物；并且
所述培养基III包括：
a)Dulbecco改进的必需培养基和Ham’s F-12培养基，比例为3∶1；
b)0.5-5.0％胎牛血清或人血清白蛋白；
c)5-15ng/ml人表皮生长因子；
d)2-10μg/ml胰岛素；
e)7-10ng/ml霍乱毒素；
f)0.3-1μg/ml氢化可的松；
g)10-100μg/ml抗生素或抗生素的混合物。
8.如权利要求1的方法，其中，在培养基I中，所述抗生素或抗生素混合物包括40-60IU/ml青霉素和40-60μg/ml链霉素；在培养基II中，所述抗生素或抗生素混合物包括40-60μg/ml庆大霉素和40-60ng/ml两性霉素B；而在培养基III中，所述抗生素或抗生素混合物包括40-60IU/ml青霉素和40-60μg/ml链霉素。
9.用权利要求1的方法生产的结膜组织等同物。
10.一种用于治疗眼睛疾病的方法，包括：
i)获得包括结膜干细胞的结膜组织活组织检查；
ii)在培养基I中培养所述组织，所述培养基I包括
a)Dulbecco改进的必需培养基和Ham’s F-12培养基，比例为1∶1；
b)胎牛血清或人血清白蛋白；
c)人表皮生长因子；
d)胰岛素；
e)霍乱毒素；
f)氢化可的松；
g)抗生素或抗生素的混合物；
iii)在培养基II中增殖源于所述外植体的细胞，所述培养基II包括：
a)角化细胞生长培养基；
b)人表皮生长因子；
c)胰岛素；
d)氢化可的松；
e)垂体提取物；
f)抗生素或抗生素的混合物；
iv)在培养基III中分化所述细胞，以便获得结膜组织等同物，所述培养基III包括：
a)Dulbecco改进的必需培养基和Ham’s F-12培养基，比例为3∶1；
b)胎牛血清或人血清白蛋白；
c)人表皮生长因子；
d)胰岛素；
e)霍乱毒素；
f)氢化可的松；
g)抗生素或抗生素的混合物；
v)将所述结膜组织等同物移植到患者眼睛中。
11.如权利要求1的方法，其中，所述培养步骤是在羊膜的基础膜一侧的表面上进行的。
12.如权利要求10的方法，其中，所述培养步骤是在羊膜的基础膜一侧的表面上进行的。
13.一种用于治疗眼睛疾病的方法，包括将通过权利要求1的方法生产的结膜等同物移植到患者眼睛中。
14.一种细胞培养基，包括：
a)Dulbecco改进的必需培养基和Ham’s F-12培养基，比例为3∶1；
b)胎牛血清或人血清白蛋白；
c)人表皮生长因子；
d)胰岛素；
e)霍乱毒素；
f)氢化可的松；和
g)抗生素或抗生素的混合物。
15.如权利要求14的培养基，包括：
a)Dulbecco改进的必需培养基和Ham’s F-12培养基，比例为3∶1；
b)0.5-5.0％胎牛血清或人血清白蛋白；
c)5-15ng/ml人表皮生长因子；
d)2-10μg/ml胰岛素；
e)7-10ng/ml霍乱毒素；
f)0.3-1μg/ml氢化可的松；
g)10-100μg/ml抗生素或抗生素的混合物。
16.如权利要求15的方法，其中，所述抗生素或抗生素混合物包括40-60IU/ml青霉素和40-60μg/ml链霉素。
17.如权利要求1的方法，其中，所述培养基I还包括浓度为0.7-1.1mM的钙离子，所述培养基II还包括浓度低于培养基I的钙离子，并且所述培养基III包括浓度高于培养基I的钙离子浓度。
18.如权利要求17的方法，其中，所述培养基II中的钙离子浓度为0.03-0.3mM，而培养基III中的钙离子浓度为1.1-1.4mM。
19.如权利要求1的方法，其中，所述包括结膜干细胞的外植体是通过远离角膜的组织的活组织检查，以保持角膜完整的方式获得的。
20.如权利要求9的结膜组织等同物，还包括基质，该基质包括羊膜，并且选择性地包括硝酸纤维素片层支持物。
21.如权利要求13的治疗眼睛疾病的方法，其中，将所述结膜等同物移植到所述角膜上，或移植到靠近角膜的部位。
22.一种生产结膜组织等同物的方法，包括：
i)在培养基I中培养包括结膜干细胞的组织外植体，所述培养基I包括
a)基础培养基；
b)胎牛血清或人血清白蛋白；
c)人表皮生长因子；
d)胰岛素；
e)氢化可的松；
f)浓度为0.7-1.1mM的钙离子；
ii)在培养基II中培养源于所述外植体的细胞，所述培养基II包括：
a)基础培养基；
b)人表皮生长因子；
c)胰岛素；
d)氢化可的松；
e)垂体提取物；
f)浓度为0.03-0.3mM的钙离子；
iii)在培养基III中培养所述细胞，以便获得结膜组织等同物，所述培养基III包括：
a)基础培养基；
b)人表皮生长因子；
c)胰岛素；
d)氢化可的松；
e)浓度为1.1-1.4mM的钙离子；
以便获得结膜组织等同物。
23.如权利要求21的方法，其中，所述外植体和由它衍生的细胞是在羊膜支持物表面培养的。
24.通过权利要求20的方法获得的结膜组织等同物。
25.一种用于生产眼睛组织等同物的方法，包括：
i)在培养基I中培养来自眼睛表面的组织的外植体，所述培养基包括
a)Dulbecco改进的必需培养基和Ham’s F-12培养基，比例为1∶1；
b)胎牛血清或人血清白蛋白；
c)人表皮生长因子；
d)胰岛素；
e)霍乱毒素；
f)氢化可的松；
g)抗生素或抗生素的混合物；
ii)在培养基II中培养源于所述外植体的细胞，所述培养基II包括：
a)角化细胞生长培养基；
b)人表皮生长因子；
c)胰岛素；
d)氢化可的松；
e)垂体提取物；
f)抗生素或抗生素的混合物；
iii)在培养基III中培养所述细胞，以便获得结膜组织等同物，所述培养基III包括：
a)Dulbecco改进的必需培养基和Ham’s F-12培养基，比例为of 3∶1；
b)胎牛血清或人血清白蛋白；
c)人表皮生长因子；
d)胰岛素；
e)霍乱毒素；
f)氢化可的松；
g)抗生素或抗生素的混合物；
以便获得所述眼睛组织的等同物。
26.如权利要求25的方法，其中，所述组织包括角膜上皮细胞或异组织边缘干细胞。
27.一种用于治疗眼睛疾病的方法，包括将通过权利要求25的方法生产的结膜等同物移植到患者眼睛中。
28.如权利要求25的方法，其中，所述包括结膜干细胞的外植体是通过远离角膜的组织的活组织检查，以保持角膜完整的方式获得的。
29.一种培养基，包括
a)基础培养基，它是角化细胞生长培养基或MCDB 153；
b)5-15ng/ml人表皮生长因子；
c)2-10μg/ml胰岛素；
d)0.3-1μg/ml氢化可的松；
e)70-140μg/ml垂体提取物；
f)浓度为0.03-0.3mM的钙离子；
g)10-100μg/ml抗生素或抗生素的混合物。
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