CN1816279A - 用于保存器官、生物组织或者活细胞的培养基 - Google Patents

用于保存器官、生物组织或者活细胞的培养基 Download PDF

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Abstract

本发明涉及保存器官、生物组织或者活细胞的培养基，其包含液体营养基质，并以包含高分子量透明质酸和氯化钠且无动物来源成分为特征。

Description

用于保存器官、生物组织或者活细胞的培养基
本发明涉及保存活细胞的技术领域。更精确地，本发明的目的是发明一种保存活器官、生物组织和细胞尤其是活的人角膜的新型培养基。
在器官移植领域，为了将器官移植给受体而从供体取下器官时，需要一种能够维持器官生活力以便移植成功的保存培养基。实际上，此过程经常需要多种培养基。具体而言，以人角膜为例，一般使用的培养基包括：
-一种将角膜从供体机构转移至培养机构以及将角膜从培养机构转移至移植机构的运输培养基，
-一种保存培养基。通常在4℃或者31℃保存。该培养基必须保证在培养基保存期间即约4至5周内细胞的生活力得到最佳保存，并在质量(内皮测试)和无菌性(细菌学、血清学和病毒学测试)方面具最大安全性，以及
-一种去肿胀的培养基，该培养基在移植前约24小时使用，目的是减少角膜的厚度并且使角膜透明化。
目前使用的上述培养基大多数包含动物来源的成分：胎牛血清白蛋白、诸如运铁蛋白、胰岛素等动物来源蛋白质。
由于这些培养基中动物来源成分的存在，所以难以保证它们在朊病毒病尤其是克-雅病上的医学安全性。此外，这些培养基易受传染性介质污染，而且不具有能够完全重复生产的组合物。
在本文中，本发明的目的在于提供一种保存活细胞生活力的新型保存培养基。
本发明的另一目的是提供一种依靠所含成分而降低造价的培养基。
根据本发明的保存培养基同样必须在质量和无菌方面具有最大安全性。
此外，本发明具有能够由完全合成的成分来制备的优势，即可以通过重组以及化学合成制得，所以本发明无免疫原性，并且不被传染性介质污染。因此，根据本发明的保存培养基具有能够成批次重复生产的精确组合物。
更精确地，本发明涉及一种包含液体营养基质的用于活器官、生物组织和细胞的保存培养基，其中所述培养基包含高分子量透明质酸和氯化钠，并且不包含动物来源成分。
本发明的目的还有此类培养基在用作活器官、生物组织和细胞尤其是活的人角膜的保存、器官培养、细胞培养、运输以及去肿胀中的用途。
活生物器官、细胞和组织的意思是指人或动物来源的成分，包括活成纤维细胞、内皮细胞、和/或上皮细胞。
本发明的保存培养基能够作为辅助治疗产品进行描述。
根据本发明的保存培养基包含旨在保护内皮细胞和周围组织的粘弹性物质(VES)。具体而言，这些粘弹性物质是高分子量的透明质酸。
高分子量的透明质酸，即分子量大于或者等于1百万道尔顿的透明质酸，可以是动物来源(尖锐湿疣提取物或者脐带血液)、细菌来源(取自链球菌培养物)、或者植物来源。当然，由于根据本发明的保存培养基中没有动物来源成分，所以该培养基包含植物来源的高分子量的透明质酸。具体而言，本发明的保存培养基用小麦的高分子量透明质酸制备，该小麦透明质酸以商品名为Cristalhyal的粉末形式或者以商品名为Vitalhyal的1％水溶液形式销售，这两种产品均来自Laboratoire Bomann(GroupeSoliance)，而且其分子量等于或者大于106道尔顿并且在20℃时Brookfield粘度是1500厘泊。
根据本发明的保存培养基还包含作为拟晶体的氯化钠。氯化钠的功能主要是防止透明质酸沉淀，也参与维持溶液的摩尔渗透压浓度。
具体而言，根据本发明的保存培养基包含：
-80-4000mg/l、优选100-200mg/l、优选100-160mg/l的高分子量透明质酸，和
-4500-9000mg/l、优选5500-9000mg/l、优选7000mg/l的氯化钠。
有利地，根据本发明的培养基将包含普罗沙姆(poloxamer)188，具体而言，普罗沙姆188具有增加培养基粘度的功能。
普罗沙姆188，也被称为Pluronic F68和LutrolF68，是分子量为7680-950g/mol的聚氧乙烯-聚氧丙烯多聚体序列，并且通式是：
HO-(CH2-CH2-O)x-[CH2-CH(CH3)-O]y-(CH2-CH2-O)x-H
其中x近似等于79，y近似等于28。
当所述培养基旨在用于器官去肿胀以及活组织、细胞的运输和保存以及特别是人角膜移植时，在根据本发明的培养基中存在普罗沙姆188是尤其有利的。根据本发明的培养基将包含优选地为200-75000mg/l、优选地为450-50000mg/l的普罗沙姆188。
目前市场上旨在用于角膜去肿胀的保存培养基包含葡聚糖。葡聚糖的功能是减少角膜的厚度，因而能够用在根据本发明的培养基中使角膜去肿胀。然而，普罗沙姆188也能够减少角膜的厚度，并且其细胞毒性更小，所以普罗沙姆188比葡聚糖更加优选。
根据本发明的保存培养基能够包含的另一VES是甲基纤维素。甲基纤维素是植物来源，并且可以从棉花植绒或者木浆来源的纤维素纤维获得。所得纤维素纤维用苛性钠溶液处理以便与二氯甲烷发生醚化反应。置换反应程度在1.64至1.92之间，该值对应每个葡糖苷单位甲氧基化置换物的数量。具体而言，为了制备本发明的保存培养基，可以使用SEPPIC以商品名Metolose SM 400销售的甲基纤维素，其Brookfield粘度为4000厘泊(20℃下，以2％的浓度溶于水)、分子量为86000道尔顿。根据本发明的培养基将包含优选地为210-5000mg/l、优选地为1900-2500mg/l、优选地为2205mg/l的甲基纤维素。
所用VES能够使细胞通过保持水而发生水合作用，进而表现出对周围细胞和组织的一定的粘着性或附着性，从而保证了对所述周围细胞和组织抵抗化学腐蚀和空气毒性效应的保护作用。
根据本发明的保存培养基同样包含在活细胞保存领域更常用的其它成分。
具体而言，本保存培养基包含在器官和细胞培养物保存培养基中经典使用的液体化学营养基质。值得注意的参考文献是“Le technoscope debiofutur”，第133期，1944年4月，3-16页，其中给出的营养基质包含：
-氨基酸，在细胞新陈代谢中起提供氮和碳的作用。一些细胞除了需要13种必需氨基酸外还需要特异的氨基酸(例如淋巴样细胞需要丝氨酸)；
-糖，尽管当需要限制乳酸积累时可以用半乳糖代替葡糖糖，但广泛使用的糖是葡萄糖；
-维生素，基本上是B族维生素，认为其中8种是必需的；
-离子，以平衡的盐溶液形式提供，在维持膜电位和渗透压上发挥重要作用，同时也是许多酶促反应的辅因子；
-痕量金属，似乎发挥越来越重要的作用，尤其是在精确的培养基中进行培养时微量金属的作用越来越重要。最重要的金属是硒、镉和锂。
此类型的基质能够用这些多种组成成分制备。也有一些液体和固体形式的商品化化学营养基质：固体形式必须在水中重新配制。具体应用的有：IMDM(伊思考夫改良杜尔贝可培养基(Iscove’s modified Dulbecco’smedium)，参考文献：Iscove，N.N.和Melchers(1978)J.of Exp.Med.147：923-933)、来自Stainers，C.P.等人Nature New Biol.230，52(1971)的MEM Alpha、来自Click等人Cell.Immunol.3，264(1972)的Click RPMI、来自Parker，R.C.等人Special Publications，N.Y.Academy of Sciences，5，303，(1957)的CMRL1066培养基、来自Leibovitz，A.，Am.J.Hyg.78，173(1963)和Morton，H.J.，In vitro，6，89(1970)的Leibovitz L15培养基、来自Morgan，J.F等人Proc.Soc.Exp.Biol.Med.73，1(1950)的M199培养基和来自Barnes，D.和Sato，G.Anal.Biochem.102，255(1980)的DMEM/HAM F12培养基、包含多种维持细胞和组织生活力必需物质的液体营养基质、尤其是多种痕量元素、氨基酸、维生素、电解质、稳定pH值的缓冲液、pH指示剂(例如酚红)以及葡萄糖或者半乳糖(L15)。痕量元素的意思是指除NaCl外的以微量或者略大量存在的所有金属无机盐。
因此根据本发明的保存培养基很方便地包含主要通过所用营养基质提供的氨基酸、痕量元素、维生素、电解质和稳定pH值的缓冲液。如果所用基质不包含足量的上述元素，那么可以补充加入所述元素。
根据本发明的保存培养基方便且独立地包含1-50mg/l硫酸软骨素、0.1-25mg/l硫酸乙酰肝素、500-2000mg/l藻酸和1000-10000mg/l羟乙基淀粉。
当保存培养基用于人角膜移植时，该培养基将优选地包含在房水中存在的各种成分，如乳酸钠、醋酸纳、柠檬酸钠、抗坏血酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、丙酮酸钠和氯化钙。
根据本发明的保存培养基以非常有利的方式独立或者联合包含：
·0.01-350mg/l维生素，优选下列物质：
-维生素E乙酸盐
-维生素A乙酸盐
-氢醌
-维生素C
-维生素B1-HCl
-维生素B2
-维生素B5
-吡哆醛HCl B6
-生物素B8
-叶酸B9
-维生素B12
-烟酰胺B3 PP
-乳清酸铬B13
·0.01-650mg/l痕量元素，优选下列物质：
-CaCl2，2H2O
-KCl
-CaH2PO4.2H2O
-NaH2PO4.H2O
-NaHCO3
-MgCO3.7H2O
-MgSO4.7H2O
-FeSO4.7H2O
-CuSO4.5H2O
-MnCO3.4H2O
-MnCl2.4H2O
-Na2SiO3.9H2O
-H2SeO3
-NH4VO3
-(NH4)6Mo7O24.4H2O
-SnCl2.2H2O
-ZnSO4.7H2O
-氧化锌
-NiCl2.6H2O
·0.005-150mg/l核苷，优选下列物质：
-腺苷
-胞苷
-脱氧腺苷
-脱氧胞苷
-脱氧鸟苷
-鸟苷
-尿苷
-胸苷
·800-4000mg/l氨基酸，
·500-9000mg/l单糖，优选葡萄糖和/或半乳糖，
·其它元素，总浓度0.001-75000mg/l，其中具体是：
-醋酸纳(3H2O)
-柠檬酸钠
-乳酸钠
-丙酮酸钠
-葡萄糖酸亚铁
-亚硒酸钠
-普罗沙姆188
-油酸
-亚油酸
-亚麻酸
-棕榈酸
-吐温80。
根据本发明的保存培养基可以是液体或者半固体形式。其具有足够支持细胞保护的粘度。有利地，根据本发明的保存培养基在20℃时的Brookfield粘度介于1和15厘泊(cps)之间，优选地在2.5和10cps之间。因此，由于粘度原因根据本发明的保存培养基是非注射的。
根据本发明的培养基的摩尔渗透压浓度同样重要，具体而言，该数值介于300-465mOsm±40之间。培养基的摩尔渗透压浓度具体取决于NaCl的浓度。当根据本发明的培养基用于保存或者运输时，其摩尔渗透压浓度将有利地在300-360mOsm±40之间的范围；当根据本发明的培养基旨在用于去肿胀时，其摩尔渗透压浓度将有利地介于350-465mOsm±40之间。目前市场上的保存培养基的摩尔渗透压浓度低于上述值。能够提供用于运输、保存和去肿胀的单一培养基是本发明的一个优点。
根据本发明的保存培养基通过混合多种成分进行制备。优选地，为了提高透明质酸在液体生物营养基质中的溶解度，将其先和氯化钠混合，然后加入到已包含甲基纤维素的营养基质中。
根据本发明的保存培养基不包含动物来源的成分。的确，在一个方面，与迄今所用的大多数保存活器官、生物组织和活细胞的培养基相反，根据本发明的培养基既不包含胎牛血清白蛋白、乳铁蛋白、运铁蛋白、胰岛素，也不包含其它动物来源的蛋白质。而且，所用的高分子量透明质酸和甲基纤维素在合成时不使用动物来源的原材料。因此这种保存培养基无疑符合法国公共健康法(French Public Health Code)第L.1263-1条款所定义的辅助治疗产品的法规。无动物来源成分的保存培养基的使用使得提高所保存细胞的医学安全性成为可能。
根据本发明的保存培养基能够用于活器官、生物组织和细胞尤其是活的人角膜的保存、器官培养、细胞培养、冷冻、运输以及去肿胀。具体而言，根据本发明的保存培养基能够在介于-196℃和37℃的温度范围内使用。
根据本发明的保存培养基可以根据预期应用进行调整。
例如，如果根据本发明的培养基旨在用于外科手术前的去肿胀，那么该培养基将有利地包含浓度为200-75000mg/l、优选450-50000mg/l的普罗沙姆188。
如果培养基旨在用于冷冻活细胞，那么将用具有低温防护作用的二甲基亚砜(DMSO)替换该培养基中的部分水。
下列实施例对本发明进行举例说明，但不作任何限制。下列实施例使用了Laboratoire Bowman(Groupe Soliance)以商品名Cristalhyal销售的粉末形式的透明质酸、SEPPIC以商品名Metolose SM 4000销售的甲基纤维素和Sigma Aldrich销售的NaCl。实施例1-3(保存培养基)具有74％体积的IMDM基质，实施例4-7(去肿胀培养基)则具有88％体积的IMDM基质。
摩尔渗透压浓度用Fisher Bioblock Scientific销售的渗透压力计按照参照M85501进行测量(通过按键自动调零[蒸馏水]并校对标准[300mOsm/kg]；反应时间1分钟)。
粘度用Fisher Bioblock Scientific销售的粘度计按照参照M57571用低粘度适配器从1cps的参照M57510开始测量(同时显示速度、选择的流动相、以cps和百分数范围表示的粘度以及温度；与Brookfield兼容；流动相直接插入样品中)。
实施例1：实施例1培养基有利地用于运输和保存。
高分子量透明质酸                  100mg/l
甲基纤维素                        2205mg/l
NaCl                              6985mg/l
氨基酸                            1838mg/l
痕量元素                          5390mg/l
葡萄糖                            4500mg/l
碳水化合物                        1167mg/l
核苷                              10mg/l
维生素                            163mg/l
脂肪酸酯                          46mg/l
缓冲液                            8982mg/l
pH                                7.3
摩尔渗透压浓度                    394mOsm
粘度                              5cps(Brookfield，20℃)
实施例2：实施例2培养基有利地用于运输和保存。
高分子量透明质酸                  100mg/l
甲基纤维素                        2205mg/l
NaCl                              5585mg/l
氨基酸                            1838mg/l
痕量元素                          5390mg/l
葡萄糖                            4500mg/l
碳水化合物                        1167mg/l
核苷                              10mg/l
维生素                            163mg/l
脂肪酸酯                          46mg/l
缓冲液                            8982mg/l
pH                                7.3
摩尔渗透压浓度                    372mOsm
粘度                              5cps(Brookfield，20℃)
实施例3：实施例3培养基有利地用于运输和保存。
高分子量透明质酸                  160mg/l
普罗沙姆188                       2205mg/l
NaCl                              5585mg/l
氨基酸                            1838mg/l
痕量元素                          5390mg/l
葡萄糖                            4500mg/l
碳水化合物                        1167mg/l
核苷                              10mg/l
维生素                            163mg/l
脂肪酸酯                          46mg/l
缓冲液                            8982mg/l
pH                                7.3
摩尔渗透压浓度                    305mOsm
粘度                              1.5cps(Brookfield，20℃)
实施例4：实施例4培养基有利地用于去肿胀。
高分子量透明质酸                  100mg/l
甲基纤维素                        2205mg/l
葡聚糖                            50000mg/l
NaCl                              6895mg/l
氨基酸                            1838mg/l
痕量元素                          5390mg/l
葡萄糖                            4500mg/l
碳水化合物                        1167mg/l
核苷                              10mg/l
维生素                            163mg/l
脂肪酸酯                          46mg/l
缓冲液                            8982mg/l
pH                                7.3
摩尔渗透压浓度                    694mOsm
粘度                              10cps(Brookfield，20℃)
实施例5：实施例5培养基有利地用于去肿胀。
高分子量透明质酸                  100mg/l
甲基纤维素                        2205mg/l
葡聚糖                            50000mg/l
NaCl                              5585mg/l
氨基酸                            1838mg/l
痕量元素                          5390mg/l
葡萄糖                            4500mg/l
碳水化合物                        1167mg/l
核苷                              10mg/l
维生素                            163mg/l
脂肪酸酯                          46mg/l
缓冲液                            8982mg/l
pH                                7.3
摩尔渗透压浓度                    585mOsm
粘度                              10cps(Brookfield，20℃)
实施例6：实施例6培养基有利地用于去肿胀。
高分子量透明质酸                  160mg/l
葡聚糖                            50000mg/l
NaCl                              5585mg/l
氨基酸                            1838mg/l
痕量元素                          5390mg/l
葡萄糖                            4500mg/l
碳水化合物                        1167mg/l
核苷                              10mg/l
维生素                            163mg/l
脂肪酸酯                          46mg/l
缓冲液                            8982mg/l
pH                                7.3
摩尔渗透压浓度                    595mOsm
粘度                              8.5cps(Brookfield，20℃)
实施例7：实施例7培养基有利地用于去肿胀。
高分子量透明质酸                  160mg/l
普罗沙姆188                       50000mg/l
NaCl                              5585mg/l
氨基酸                            1838mg/l
痕量元素                          5390mg/l
葡萄糖                            4500mg/l
碳水化合物                        1167mg/l
核苷                              10mg/l
维生素                            163mg/l
脂肪酸酯                          46mg/l
缓冲液                            8982mg/l
pH                                7.3
摩尔渗透压浓度                    376mOsm
粘度                             5cps(Brookfield，20℃)
材料和方法
保存顺序
科学用人角膜(捐赠给科学的器官)在供体死后24小时之内获得。为了维持来自同一供体的两个角膜的相似性，供体不能进行过眼内外科手术。进行角膜摘除之后，将此对角膜分别浸入50ml运输培养基中。所用培养基或者是参照培养基(Inosol，Chauvin-Opsia/Baush和Lomb，Toulouse，法国)或者是根据本发明的培养基(实施例1-3)。立即将包含上述角膜的密封烧瓶置于31℃的干燥箱中。在于器官培养基中保存的第二天，根据下文描述的过程测定内皮细胞密度(ECD)。然后将角膜重新浸没于新的100ml烧瓶中的同种类型培养基中，并用缝合线使之悬浮以避免角膜与烧瓶壁及沉积在烧瓶底部的沉淀接触。保存14天后，将角膜转移至新的100ml烧瓶中。保存30天后(这是欧洲的最大推荐保存期限)，进行一次新的ECD测定，并且计算在前述保存期内细胞的损失率。然后将角膜浸没于50ml“去肿胀”培养基中以减少角膜厚度。所用培养基或者是Exosol(Chauvin-Opsia/Baush和Lomb)，或者是根据本发明的对应50000mg/l葡聚糖或者50000mg/l普罗沙姆188的培养基(实施例4-7)。48小时后，同一对角膜的两个角膜并排放置在8条逐渐变粗的黑线的背光方格网上进行照相。该照片作为角膜透明度的记录。角膜厚度通过超声测厚仪(TomeyAL-2000，Tokyo，日本)在顶点处测量得到。为了将细胞膜染色，与pH4.5的磷酸盐缓冲液中的4％茜素红(sigma)孵育，孵育45秒后进行第三次ECD测定。由于其具有细胞毒性，这种非致死性着色只能在保存结束时使用。
整个方法的实施是在不告知保存培养基性质的情况下进行的。
确保盲法分析的方法
将两种保存和去肿胀培养基包装在相同的容器中(125ml的Nalgene烧瓶)，并由既不参与保存也不参与ECD测定的人员进行数字标记。基于随机化表格的计数系统根据不同烧瓶上的数字来鉴别培养基。
ECD测定方法
在用BSS(平衡的盐溶液，Alcon，Kaysersberg，法国)冲洗角膜之后，用0.4％的台盼蓝(sigma)覆盖内皮1分钟，然后用0.9％的氯化钠冲洗4分钟。
随后在与Gain P.等人在Br J Ophthalmol 2002，86，306-11页和531-6页描述的角膜内皮镶嵌分析仪(endothelial mosaic analyzer)样机连接的光学显微镜下放大10倍对该角膜内皮进行观察。采集10个不同区域的内皮图象，并存于计算机硬盘上以便将来分析。每次分析包括300个以上的细胞。
结果
供体特征
供体是年龄在57-90岁之间的6名女性和10名男性，平均年龄74.4岁。从死亡到角膜摘除之间的延迟时间介于4.5-44小时，平均延迟时间为20小时。
结果
  Opsia培养基  实施例1(保存培养基)实施例4(去肿胀培养基)
  保存开始时(d2)的ECD值保存结束时(d30)的ECD值细胞损失率(％)   18141600-11.8  18481693-8.4
  去肿胀后的ECD值去肿胀后的细胞损失率(％)去肿胀后的角膜厚度(μm)   1300-18.7703  1542-8.9717
总损失百分数：Opsia培养基：30.5，根据本发明的实施例1和4的培养基：17.3。
  Opsia培养基   实施例2(保存培养基)实施例5(去肿胀培养基)
  保存开始时(d2)的ECD值保存结束时(d30)的ECD值细胞损失率(％)   13731280-6.8   13921300-6.7
  去肿胀后的ECD值去肿胀后的细胞损失率(％)去肿胀后的角膜厚度(μm)   980-23.4723   1163-10.5716
总损失百分数：Opsia培养基：30.2，根据本发明的实施例2和5的培养基：17.2。
  Opsia培养基   实施例3实施例6
  保存开始时(d2)的ECD值保存结束时(d30)的ECD值细胞损失率(％)   24412239-8.3   21902090-4.6
  去肿胀后的ECD值去肿胀后的细胞损失率(％)去肿胀后的角膜厚度(μm)   1573-29.7797   2255-3950
总损失百分数：Opsia培养基：38，而根据本发明的实施例3和6的培养基：7.6。
  Opsia培养基   实施例3实施例7
  保存开始时(d2)的ECD值保存结束时(d30)的ECD值细胞损失率(％)   27882239-29.4   26022370-8.9
  去肿胀后的ECD值去肿胀后的细胞损失率(％)去肿胀后的角膜厚度(μm)   1928-2.1755   2088-11.9832
总损失百分数：Opsia培养基：31.5，而根据本发明的实施例3和7的培养基：20.8。
讨论
总结本研究，发明者开发了一种无任何动物来源成分的精确培养基，该培养基能够保证30天以上的内皮存活力显著高于用角膜银行所使用的参照培养基获得的结果。这一点至关重要，因为获得了平均数几乎是16.9％的额外的内皮细胞增加量，其结果使得保存质量大大提高。该增加量使得受体拥有高于迄今可能的内皮保存率(endothelial reserve)。对受体而言，该保存率意味着对并发事件(外伤、免疫排斥、眼内手术)更强的抵抗力，也意味着移植体保持透明的时间的增加。
基于所得到的结果，普罗沙姆188的细胞毒性低于葡聚糖。

Claims (14)

1.包含液体营养基质的用于活器官、生物组织和细胞的保存培养基，其中所述培养基包含高分子量透明质酸和氯化钠并且所述培养基不包含动物来源的成分。
2.根据权利要求1所述的保存培养基，其中所述培养基包含：
-80-4000mg/l、优选地100-200mg/l、优选地100-160mg/l的高分子量透明质酸，和
-4500-9000mg/l、优选地5500-9000mg/l、优选地7000mg/l的氯化钠。
3.根据权利要求1或2所述的保存培养基，其中所述培养基还包含普罗沙姆188。
4.根据权利要求3所述的保存培养基，其中所述培养基包含200-75000mg/l、优选地450-50000mg/l的普罗沙姆188。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的保存培养基，其中所述培养基还包含甲基纤维素。
6.根据权利要求5所述的保存培养基，其中所述培养基包含210-5000mg/l、优选地1900-2500mg/l并且优选地2205mg/l的甲基纤维素。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的保存培养基，其中所述培养基具有300-465mOsm±40mOsm的摩尔渗透压浓度。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的保存培养基，其中所述培养基在20℃下具有1-15厘泊、优选地2.5-10厘泊的Brookfield粘度。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的保存培养基，其中所述培养基包含痕量元素、氨基酸、维生素和稳定pH的缓冲液。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的保存培养基，其中所述培养基不包含葡聚糖。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的保存培养基的用途，其用于保存活的人角膜。
12.根据权利要求1-10中任意一项所述的保存培养基的用途，其用于活器官、生物组织和细胞尤其是活的人角膜的器官培养。
13.根据权利要求1-10中任意一项所述的保存培养基的用途，其用于活器官、生物组织和细胞尤其是活的人角膜的运输。
14.根据权利要求1-10中任意一项所述的保存培养基的用途，其用于活器官、生物组织和细胞尤其是活的人角膜的去肿胀。
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