CN1227031C

CN1227031C - 减毒水痘－带状疱诊病毒在制备用于预防水痘的药物中的应用

Info

Publication number: CN1227031C
Application number: CNB001331043A
Authority: CN
Inventors: P·J·普罗沃斯特; D·L·克拉; P·A·弗里曼
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1992-06-04
Filing date: 1993-06-03
Publication date: 2005-11-16
Anticipated expiration: 2013-06-03
Also published as: US5360736A

Abstract

以较高的VZV产量制备活的减毒水痘-带状疱疹病毒疫苗。该新方法使活VZV疫苗的大量制备更为实用。另外，最佳单层细胞培养条件提供了一种提高单层细胞密度的方法，该方法可用于提高病毒疫苗的产量。根据该方法，在常规培养容器中通常获得接近500,000个细胞/cm²的细胞密度。

Description

减毒水痘-带状疱疹病毒在制备用于预防水痘的药物中的应用

本申请是申请日为1993年6月3日，申请号为93106673.5，发明名称为“制备减毒水痘-带状疱疹病毒疫苗的方法”的发明专利申请的分案申请。

水痘-带状疱疹病毒(VZV)引起水痘和带状疱疹。水痘是一种发生在无VZV免疫性个体上的高度传染性疾病。90％以上的人口在生命的头二十年间受到传染。该疾病严重威胁免疫抑制者和成年人。在许多病例中，VZV潜伏于背根神经节细胞中。VZV从潜伏态重新激活时则出现了带状疱疹，这是一种痛苦的慢性病。

通过免疫接种预防水痘是人们期望的目标，预计将实现用活的减毒水痘疫苗进行普遍的儿童免疫接种。现有技术已报道了VZV在各种细胞培养系统中的繁殖以及将活的减毒无细胞VZV用作为疫苗。美国专利3,985,615描述了在豚鼠的初生胚细胞中制备适于用作疫苗的减毒的VZV Oka株。美国专利4,008,317描述了在WI-38细胞中培养VZV的温度敏感性突变体以用作为疫苗稳定剂。用于维持活VZV的组合物如SPGA，也是本领域内已知的。

VZV疫苗的商品化生产受到的主要限制是从本领域内已知的细胞培养系统中获得无细胞VZV的产量。使用本发明的新方法可以将无细胞VZV的产量提高约5-20倍。

因此，本发明是一种高产量地制备活的减毒无细胞VZV疫苗的方法。

通常，本领域已知的单层细胞培养方法产生约80,000至160,000个细胞/cm²[Mann，Dev.Biol.Stand.37，149-152(1977)：Wood和Minor，Biologicals 18，143-146(1990)]。这些单层培养物只能生长到有限的密度，因而阻碍了用单层细胞培养物生产病毒抗原。

过去提高细胞培养物密度的努力已转向用专门的灌注培养容器将饱和密度提高到约1×10⁶个细胞/cm²[Mann，Dev.Biol.Stand.37，149-152(1977)]。本发明提供了独特的提高细胞产量的方法，但使用了现存的细胞培养系统。

本发明提供了一种方法，它可以使附着细胞生长至比迄今为止可能达到的密度高得多的密度从而使在用于生产疫苗的细胞单层上培养的病毒达到更高的产量。

本发明涉及用于单层细胞培养的新方法以及在该方法中使用的新组合物。该方法需要使用与基本培养基不同的加富培养基，并在该加富培养基中补充最适浓度的类脂。根据本发明方法，使用含有SRFE-2并补充了约0.02-0.4g/ml大豆类脂的新生长培养基，可使单层细胞培养密度大大提高。由此获得的提高了密度的单层细胞可用于改进病毒抗原的生产以制备抗病毒疫苗。

一种培养单层细胞的方法，该方法包括：

a.将细胞原液接种在培养容器中的基本培养基或加富培养基中，并使细胞植入24-72小时；

b.从步骤a的培养物中移出培养基，并用添加了最适浓度的类脂并非必要地含有血清添加剂的新鲜加富培养基代替；

c.在补充了类脂的加富培养基中培养细胞培养物；

d.在培养24-72小时后，非必要地用不添加类脂有新鲜培养基代替步骤c的培养基；

其中加富培养基是SRFE-2，类脂添加剂的浓度为0.02mg/ml至0.4mg/ml，细胞是MRC-5、WI-38或非洲绿猴肾二倍体细胞。

用于培养细胞单层培养物的组合物，该组合物包含补充了0.02-0.4mg/ml类脂的SRFE-2培养基。

当用于制备特定疫苗时，本发明是一种用于生产大批量可用于预防水痘的活的减毒无细胞VZV疫苗的方法，该方法包括：在使VZV产量和稳定性最高的条件下，在细胞培养物中最适地繁殖VZV并收集该病毒。该最佳方法的步骤包括：

a.利用大培养体积或加富培养基，并供应不能代谢的二糖如蔗糖，将选自人二倍体细胞如MRC-5的VZV易感染细胞在单层培养中培养至会合；

b.在尽可能接近会合点时，用实用范围内尽可能高感染复数的VZV感染细胞感染步骤(a)培养的细胞；

c.将VZV感染培养物在高营养状态下维持约22-96小时，并在VZV产量达到峰值时收集；

d.在收集VZV感染细胞前，用任选含有溶酶体营养剂如氯化铵或氯喹的生理溶液洗涤VZV感染培养物；

e.将VZV感染细胞收集到最小体积的稳定溶液中，并且或者立即破碎细胞，或者冷冻这些细胞供以后破碎；

f.破碎VZV感染细胞以最适地释放细胞结合的VZV，并除去细胞碎片，以提供无细胞VZV制备物。

图1.在添加蔗糖的培养基中VZV PFU的产量。

图2.无细胞VZV抗原的产量。

图3.-20℃或4℃时VZV在SPGA稳定剂中的稳定性。

图4.用不同的培养基获得的VZV PFU产量。

图5.输入的细胞结合感染复数对无细胞VZV产量的影响。

本发明涉及在单层培养中培养细胞的方法。本发明的目的在于提高附着培养细胞的密度。通过提供补充了最适浓度的类脂的加富生长培养基达到了上述目的。通过在本发明的新的培养基-类脂组合物中培养本发明的单层培养物，可以大大提高病毒噬斑形成单位(PFU)或病毒抗原的产量。因此，使用本发明的细胞培养方法有益于甲型肝炎病毒、水痘-带状疱疹病毒、风疹、轮状病毒、麻疹、脊髓灰质炎、流行性腮腺炎和其他病毒的疫苗。

用于该方法的一种优选的加富培养基是SRFE-2(可从SIGMA Chemical Co.，St.Louis，MO，S2138或从Serva FineChemicals，Heildelberg，Germany 47523购买)。Weiss等人[In Vitro16(7)，616-628，(1980)]描述了该培养基。按本文所述相同方式使用的其他等价培养基或组成略有变化的SRFE-2，是本发明的自然延伸。

在本发明中使用许多已知类脂添加剂中的任何一种都具有突出优点。例如，发现成年牛血清的富含胆固醇的类脂(SIGMACHEMICAL CO.catalog#L-4646)、EX-CYTE类脂I或极低内毒素(VLE)类脂(MILES Inc.，catalog#′s 82-004-7至8和82-019-1)是有益的加富培养基添加剂。一种优选的类脂添加剂是可从Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis IN，catolog#1074 482买到的大豆类脂提取物。Iscove和Melchers[J.al.Exp.Medicine，147，923-933，(1979)]描述了该物质或类似物质可替代B-淋巴细胞培养中的血清。在这篇文献和BoehringerMannheim公司的产品目录中，都没有提示大豆类脂添加剂可用于添加加富培养基。按照这些文献，类脂是用作为基本培养基中的血清替代物。而在本发明中使用的类脂是一种加富培养基添加剂。另外，按照已公开的文献，类脂的使用浓度约为10-100μg/ml。根据本发明，这些类脂的最佳使用浓度比文献中或制造商建议的浓度高2-3倍。再者，本发明中使用的类脂添加剂在添加血清时仍可使用，而不是代替血清的添加。

在本发明方法中，将MRC-5细胞、WI-38细胞、非洲绿猴肾异倍体细胞或另一种用于繁殖病毒的细胞类型接种在培养容器中。在本领域内已知的基本培养基如EMEM或EBME，或在加富培养基如无类脂添加剂的SRFE-2培养基中，完成起始细胞植入期。还可以供应约10％的胎牛血清(FCS)、抗生素如新霉素(约50μg/ml就足够)和L-谷氨酰胺(约2mM)。将细胞在细胞和病毒允许的温度下(通常约34-37℃，优选约35℃)，根据所要制备的病毒培养若干天。

在细胞已明显地附着并在单层培养中旺盛生长之后，除去基本培养基或加富培养基，用补充了最佳浓度类脂的新鲜加富培养基替代。

再培养一个阶段后，可再一次除去培养基并用不含类脂添加剂的新鲜加富培养基替代。发现在细胞已经接近或达到会合后提供类脂具有逆生产作用，会降低最大细胞产量。

在准备将已培养好的单层细胞用病毒接种物感染时，除去类脂添加剂，并将病毒原种导入一批新鲜的加富培养基中。这后一批培养基不含类脂，可使细胞生长延长而不产生上面提到的类脂诱导的细胞减少问题。

完成上述过程后，细胞和病毒的产量大大提高。例如，在MRC-5细胞上培养水痘病毒时，与在基本培养基或单独的SRFE-2培养基上培养MRC-5细胞时相比较，VZV PFU产量大大提高。同样，按这种新方法培养时，用于水痘生长或风疹病毒生产的WI-38细胞的生长密度要高得多。

当用于生产特定疫苗时，本发明新方法包括：在使病毒产量和稳定性最佳的条件下，在细胞培养物中繁殖VZV，并收集得到的VZV。对VZV的生产所述的优点适用于其他有被膜病毒的生产，包括除VZV以外的疱疹病毒、麻疹、流行性腮腺炎或风疹病毒的生产。

本发明的最终目标是提供一种能有效地生产用作疫苗的VZV的方法。根据该方法的每一步骤最佳化时最终获得的无细胞VZV的产量来衡量该方法的成功与否。根据最终的无细胞VZV制备物的感染效价来测定产量。利用Krah等人(J.Virol.Methods，1990，27：319-326)描述的琼脂糖覆盖法或液体覆盖法获得水痘-带状疱疹病毒(VZV)制备物的感染效价。简言之，该方法包括：将易于受VZV感染的MRC-5细胞培养至旺盛复制状态，即培养至细胞约有50-80％会合。然后将病毒以最小体积量覆盖在细胞单层上，使其附着到细胞上，然后加入另一些生长培养基。在生长若干天后，使细胞与一种蛋白质染色剂接触，并计数透明区域即噬斑。因此，对于一种已知体积的病毒接种物，每毫升的噬斑形成单位(PFU)数目是病毒产量的可靠尺度。如再乘上由任何给定病毒制备物得到的无细胞病毒的总体积，则可计算出PFU的总数。

由于检测方法本身的可变性，通过任何特定方法的最佳化获得的PFU数的提高，都是以对某种最佳化程度较差的方法步骤的比例来表示的。因此，所报道的成倍增加的病毒产量消除了PFU检测方法本身的任何可变性。最终，本文所描述的方法步骤可使VZV产量比用本领域已知方法获得的产量累计提高约16-20倍。在文献中没有报道这种成倍提高，因此这是对VZV疫苗制备领域的重要贡献。

由于VZV噬斑检测需要耗费大量时间，因而特别不便于在进行过程中进行控制。利用快速的VZV抗原ELISA可以测定VZV抗原的量，从而能够监测活水痘疫苗制备期间病毒的生长。另外，该检测方法可用于估测澄清的、声波处理过的大批量疫苗中VZV抗原的量，也许还可用于测定灌装疫苗冻干管中的抗原。简言之，进行上述检测的方法是：与抗VZV血清溶液一起保温测试样品中的VZV抗原。使剩余的游离抗体结合到固定于ELISA微量滴定板上的VZV抗原上。能结合到板上的抗体的量与测试样品中抗原的量成反比。通过与一种酶联抗人抗体和合适的底物反应而生成可用分光光度法定量测定的有色产物，从而定量测定该板上结合的抗体。

通常，VZV抗原ELISA和VZV噬斑检测应得到相关数据，但是应牢记，VZV抗原检测法既检测不能存活的VZV也检测活VZV。由于尚未证明被杀死的VZV产生的免疫应答与活的减毒病毒产生的应答同样有效，因而噬斑检测是测定VZV疫苗的病毒接种物剂量的关键性检测法。但是，抗原检测法的价值在于，该方法提供了施用于VZV疫苗受体的总抗原量的度量；该方法比PFU检测更快速，因而可在制备过程中监测VZV的产生；并且它至少与VZVPFU产量的峰值点相关，因而可供估测最佳收集时间。

采用下面的各个临界参数可使本发明方法更为成功，所有这些参数都在本发明范围内：

a.利用大培养体积或加富培养基使细胞达到高度复制，并供给不能代谢的二糖如蔗糖，将选自人二倍体细胞如MRC-5的VZV易感染细胞培养至在单层培养中会合：

可以使用本领域内已知用于制备VZV的许多不同细胞培养系统中的任何一种。例如，非洲绿猴肾异倍体细胞、WI-38细胞、MRC-5细胞、以及许多其他细胞类型都曾用于该目的。我们一直用可用于生产人用疫苗的MRC-5细胞。但是，如果使用除MRC-5外的产量特别高的细胞系，可能会使无细胞VZV产量提高至超出本文报道的范围，这也是不足为怪的。只要这样一种细胞系适合用于本方法，本发明就包括这种方法对这种细胞的应用。

将在35℃和5％CO₂气氛下，在含有2％或10％胎牛血清的伊格尔氏最低基本培养基(EMEM)中培养的亚会合或会合的MRC-5细胞单层中的无细胞活病毒产量进行比较，表明了细胞会合对无细胞VZV噬斑形成单位(PFU)产量的影响(见实施例2，表I)。

利用会合的细胞单层可使无细胞PFU/ml比采用亚会合单层感染获得的产量提高约2-3倍，不论亚会合培养物正在旺盛增殖(10％血清)与否(2％血清)。因此，在疫苗制备方法中会合但不是旺盛增殖的细胞对于提高VZV产量似乎是必需的。

病毒生长期间胎牛血清的百分含量看来对无细胞PFU产量没有大的影响。例如，一般情况下，在细胞生长期提供约10％的FCS，而在该方法的病毒生长期则提供约2％的FCS，无论细胞生长和病毒培养使用的是如EMEM或EBME的基本培养基还是如SRFE-2的加富培养基。

除了FCS和培养基外，通常向细胞培养和病毒生长培养基中加入一种抗生素(如50μg/ml新霉素)和谷氨酰胺(约2mM)。

1.细胞植入阶段：

将MRC-5或其他二倍体细胞接种到细胞培养容器(培养瓶、摇瓶，或这些培养容器的功能等同物)中，使细胞的初始浓度为约10,000至40,000个细胞/cm²。将添加了约10％胎牛血清，并充有5％CO₂气体的生长培养基供给细胞，并在约30-37℃，优选约35℃下培养。

植入细胞的体积可以小到完全覆盖静置培养中的细胞所必需的体积。可使用的体积与表面积的比例是每cm²生长表面约0.5ml培养基。当细胞在摇瓶中培养时，每850cm²加125ml培养基可能就足够了，但优选约425ml/cm²。

本领域内已知的用于细胞培养的市售基本培养基，如伊格尔氏最低基本培养基(EMEM)或添加了厄尔氏盐的伊格尔氏基本培养基(EBME)，可以添加约10％FCS而用于细胞植入期。或者，在该阶段使用更丰富的培养基也较为有利。从SIGMA公司得到的SRFE培养基[Weiss，et al.，In Vitro 16(7)，616-628(1980)]是一种加富培养基，在该阶段使用该培养基可能较为有利，但对于该方法的此阶段来说，加富培养基并不关键。

2.细胞生长期：

在该方法的此阶段提供足够的营养以确保细胞生长至高度会合是关键。这可通过提供大体积的基本培养基或较小体积的加富培养基来实现。细胞在约30-37℃，优选约32-35℃下培养。

在有足够时间供细胞附着和细胞生长后，移走并更换培养基，然后继续培养，这样可重新供给细胞养料。通过吸出或倾析，或任何其他不损害细胞单层完整性的方法都可以移走培养基。对于如上所述植入的MRC-5细胞来说，可以在细胞导入培养容器中约72小时后更换培养基。

更换培养基的体积可以与用于细胞植入期的体积相同。但是，优选的是，在细胞生长期提供的体积大于植入阶段使用的体积。当细胞是在基本培养基如EMEM或EBME加FCS中培养时，这一点尤其重要。大培养体积是确保细胞获得足够营养的一条途径。

如果生长期供应的培养基是加富培养基，则可降低对大体积的要求。达到该目的的一种特别优选的培养基是SRFE-2(SIGMA)。在该阶段使用加富培养基而不是基本培养基，可以大大地提高会合时细胞单层的密度。细胞密度的提高又提高了可从在加富培养基中培养的感染细胞培养物获得的VZV的产量。例如，在细胞生长期使用加富培养基使最终VZV产量比该阶段在基本培养基中培养细胞时获得的产量提高约2-4倍。

在一个优选实施方案中，用类脂补充SRFE-2。许多类脂添加剂中的任何一种都可使用。例如，发现来自成年牛血清的富含胆固醇的类脂(SIGMA CHEMICAL CO.)、EXCYTE类脂I或极低内毒素(VLE)类脂(MILES)是有益的加富培养基或基本培养基添加剂。已证明商品大豆类脂(Boehringer Mannheim，也可参阅Iscove et al.，J.Exp.Med.147，923-933(1978)]以约0.2mg/ml的浓度添加时是很好的添加剂。利用SRFE-2加类脂和FCS已达到接近约500,000/cm²的细胞密度。不论细胞是在基本培养基还是在加富培养基中生长，提供类脂都可使VZV产量提高。商品原料以20mg/ml类脂、100mg/ml牛血清白蛋白原液供应。该材料可方便地以1∶100最终稀释度使用。如果在细胞生长期用约0.2mg/ml大豆类脂添加SRFE-2，则最终VZV产量比单独用EMEM获得的VZV产量提高约9倍，比单独用SRFE-2培养基时提高约3.3倍。

3.感染前期

我们发现，在VZV感染前，使培养细胞与最适浓度的不能代谢的无毒二糖接触，可以进一步提高最终的VZV产量。一个十分成功的实施方案是在将细胞导入培养容器中后约72小时，优选在用VZV感染培养物前约24-96小时，供给约20-60mM蔗糖。实际上，在上述步骤2的新加培养基中加入约50mM蔗糖就能满足这些要求，并且可以减少使该步骤有效进行所需的许多无菌操作及前面同时进行的一些步骤。

其他二糖，包括乳糖、纤维二糖和麦芽糖，也可以提高最终VZV产量，但蔗糖是优选的。所测试的单糖如果糖和核糖，不能提高VZV产量(核糖甚至是有毒的)。看来，二糖在生长中的细胞的溶酶体中被浓缩，使溶酶体膨胀形成液泡[De Courcy and Storrie，Exp.CellRes.192.52-60(1991)]。二糖对VZV产量的这种影响可能是由于溶酶体对VZV的损伤减弱。除了二糖，预计三糖和四糖也具有有益的作用，因为Cohn和Ehrenreich [J.Exp.Med.129，201-222(1969)]在给巨噬细胞供应这些较高级的糖或蔗糖时，只要这些糖不被细胞代射，则也观察到相同的出现液泡现象。

b.在尽可能接近会合点时，用实用范围内尽可能高感染复数的VZV感染细胞感染步骤(a)培养的细胞：

通过反复试验，我们发现，按平均数计算，与用VZV感染刚会合的细胞时相比，在会合后将细胞放置48小时仅产生约50％的VZV PFU/ml。因此，使VZV接种物导入的时间尽可能接近会合点是很重要的。遗憾的是，会合是一种随培养基类型、所培养的细胞类型和所使用的其他培养条件而变化的参数。对于上述步骤(a)(1)中植入的MRC-5细胞，通常是在达到会合点时感染细胞。

优选的水痘-带状疱疹病毒(VZV)是在美国专利3,985,615中描述的并在ATCC保藏的Oka减毒病毒株。该病毒适合在豚鼠胚细胞培养物和人二倍体肺成纤维细胞培养物(例如MRC-5细胞)中生长。

可以如下制备活的感染性水痘感染细胞：以约1∶125的感染复数感染MRC-5细胞，维持该感染细胞以使病毒复制，用胰蛋白酶处理这些细胞，并立即用释放出的细胞作为操作用种细胞或贮存起来供以后使用和进行PFU定量，贮存方法是：加入冷冻保护剂如DMSO或甘油，以约10⁷个细胞/ml的浓度缓慢冷冻。可将冷冻的VZV感染细胞原液解冻，并加到会合的细胞培养物中以起动VZV感染。

或者，可以按Hondo等[Archiv fur die gesamte Virusforschung40，397-399(1973)]描述的方法将VZV感染细胞冻干，该方法允许冻干接种物在4℃下长期贮存。也可以使用无细胞VZV作为接种物，但由于收集时病毒产量有损失，使用细胞结合的接种物是优选的。

制备病毒感染细胞原液的另一种可行方法是：在植入生产细胞前起动细胞生长以生产种病毒。在用VZV感染的细胞感染种细胞时，可以开始植入生产细胞，以便在种病毒达到峰值VZV效价的同时达到会合。不是最合适但较为方便的是，将种细胞和大批细胞都同时植入小体积的培养基中(约125ml/850cm²摇瓶)。在生长约2-3天后，将生产VZV种病毒的摇瓶体积增加到约425ml，或换上加富培养基，以使其生长到会合。将生产细胞保留于小体积的基本培养基(包含约10％FCS)中使其处于相对体眠的状态，直至用VZV感染细胞感染操作用种细胞前约2天。在这时，将生产细胞的体积增加到约425ml，或换上加富培养基，例如添加了最适量的大豆类脂和胎牛血清的SRFE-2。然后使生产细胞生长至高度会合。在给生产细胞更换培养基两天后，用VZV感染的细胞以1∶125或更高的感染复数感染正处于会合点的操作用种细胞，并使VZV复制继续进行约2-3天。当种培养物中VZV产量达到峰值时，生产细胞也应已达到会合。然后收集种细胞，加入到生产细胞中。

不论怎样安排生产种子的时间，在VZV感染后的合适时间，将培养基从VZV感染种培养物中吸出，通过用胰蛋白酶处理(约0.25％胰蛋白酶)或其他非破坏性方法收集VZV感染种细胞，以已知的感染复数感染生产细胞培养物。

Schmidt，N.S.和Lennette，E.H.[Infection and Immunity 14，709-715(1976)]注意到了高感染复数对高VZV产量的重要性，但没有与低感染复数感染进行严格的比较。本发明对此进行了精确的比较。

从细胞培养物中移走生长培养基，并用含有已知量的按上述方法制备的VZV感染细胞的新鲜培养基替代，从而用VZV感染细胞。最好滴定病毒原液的水痘噬斑形成单位(PFU)，并计数受体细胞，以便定量测定感染复数。感染复数以接种物中VZV感染细胞与培养物中未感染单层细胞数的比例来表示。例如，1∶10的感染复数是高的，而1∶625是低的。高感染复数是所希望的，但实际上低至1∶125的感染复数就可获得良好的VZV产量。

当感染复数在1∶7和1∶625之间时，在最高感染复数时产生约500,000PFU/ml，在最低感染复数时产量降至约100,000PFU/ml(见实施例5的表3)。感染复数越高，到达PFU峰值需要的培养时间越短，产量越高。例如，根据感染复数和收集时间，最终PFU可达到约5倍的范围。

c.将VZV感染培养物在高营养状态下维持约22-96小时，并在VZV产量达到峰值时收集：

在感染后将VZV感染细胞继续培养约22-96小时。在该病毒生长阶段保持足够的营养是关键。最好是，或者提供大培养体积的基本培养基如加有约2-10％FCS的EMEM，或者提供较小体积的加富培养基。最优选的是，提供未补充类脂添加剂而加了2-10％FCS的SRFE-2。已注意到在该阶段加入类脂会降低VZV产量。

在感染后培养的22-96小时期间，VZV在已感染的细胞中进行复制，并传播开来而感染邻近的细胞。但是，老的感染细胞不会产生可回收的无细胞PFU。VZV生长曲线和随后的下降可能很陡。因此，正确地选择收集时间是达到最大感染性VZV产量的关键参数，通过对每一次生产操作输入的感染复数、营养和培养时间都进行严格的控制，可以精确地重复这一参数。另外，由于感染性VZV产量与VZV抗原的产量相关，至少直到开始出现病毒死亡的时刻为止，可以使用快速VZV抗原ELISA选择最适收集时间(见图5)。

对于在感染后约72小时收集的VZV感染MRC-5细胞，如果前面的每一步骤都是最佳的(即在加富培养基中生长并在感染前使细胞与50mM蔗糖接触72小时)，则无细胞VZ V的最终产量比在基本培养基中生长并在48小时时收集病毒获得的产量提高约16倍，比在96小时时收获产量提高更多(见实施例8，图1)。在感染后48小时收集病毒时在上述最佳条件下VZV的产量仅比在基本培养基中生长时的产量提高约4倍，但仍比在基本培养基中96小时收集时的产量大大提高。因而，在加富培养基中病毒产量高得多，病毒死亡大大减少，病毒产量并不随时间而陡降。在加富培养基中感染复数的关键性也降低。

d.在收集VZV感染细胞前，用任选含有溶酶体营养剂如氯化铵或氯喹的生理溶液洗涤VZV感染培养物：

为了从培养基中除去血清、类脂和细胞碎片，用不会裂解细胞的生理缓冲液洗涤单层培养物。磷酸盐缓冲盐水对此很适用。可将细胞洗涤几次，并通过倾析、吸出或任何其他方法移去洗涤溶液，只要不破坏单层的完整性就可以。

如果采用化学方法从培养容器中释放出细胞，应将这些细胞通过离心而浓缩，并用起稳定作用的溶液替代生理缓冲液。

已发现在收集细胞前提供氯化铵或氯喹可提高最终VZV产量。Kielian等人[EMBO J.5，3103-3109(1986)]利用氯化铵控制细胞内含物的内部pH值，在这些内含物内感染性病毒明显地度过了其某部分胞内生活。使细胞与溶酶体营养剂接触后VZV产量提高的机理可能与诱导出了较不苛刻的内含物环境有关。因此，在感染前供给细胞无毒的、不能代谢的二糖如蔗糖，以及使细胞与氯化铵或氯喹接触，可能也以类似的机理起作用。无论如何，经验已证实了下列结论：当在细胞破碎前提供终浓度为1-100mM(最优选的是在20-50mM范围)的氯化铵，并优选在约4℃供给约25-50分钟时，可以提高最终的VZV产量。浓度约230μM的第二种溶酶体营养剂即氯喹，也同样提高VZV PFU/ml的回收率。

e.将VZV感染细胞收集到最小体积的稳定溶液中，并且或者立即破碎细胞，或者冷冻这些细胞供以后破碎：

一旦VZV感染细胞已经洗涤，如果生长容器允许，可用刮擦法收集细胞，或用化学方法分离细胞。由于一旦细胞破碎残留的酶会降低病毒的产量，因而酶促释放细胞不太令人满意。如上面指出的，如果将细胞释放到生理盐水中，可通过离心浓缩细胞，并用最小体积的VZV稳定溶液代替生理盐水。体积与细胞生长表面积的合适比例为约40ml稳定剂/850cm²。

病毒稳定剂是本领域内已知的。例如，在美国专利3,985,615中建议用溶于磷酸盐缓冲盐水中的5％蔗糖作稳定剂，而其他报告中推荐了更复杂的稳定剂如SPGA。

在将VZV感染细胞重新悬浮于稳定剂溶液中后，可立即玻碎细胞，或在制备大量VZV的情况下，冷冻于-70℃供以后操作。如果立即玻碎细胞，每cm²培养细胞的VZV产量会略高一些，但冷冻步骤通常不会导致产量损失高于立即操作所得产量的10％。

f.破碎VZV感染细胞以最适地释放细胞结合的VZV，并除去细胞碎片，以提供无细胞的VZV制备物：

如上面所述，在破碎前最好先从细胞中移走培养基并用最小体积的VZV稳定剂代替，在该稳定剂中刮出细胞或用其他方法释放细胞。将细胞悬浮液冷却到0-4℃，然后利用合适的方法破碎细胞，例如声波处理、DOUNCE匀浆、比DO UNCE更容易测量的其他类型的剪切力，或这些技术的组合。

我们已经证实，单独的声波处理不能使无细胞VZV达到最佳回收率。事实上，如果以DOUNCE匀浆法作为起始破碎步骤，接着离心，保留该上清液作为上清液I，接着将沉淀用声波处理并离心获得上清液II，则可以大大提高破碎得到的VZV产量。上清液I和上清液II的总产量比单独用声波处理作为破碎技术得到的产量高四倍。

在细胞破碎后，通过离心、过滤，或本领域已知的任何其他方法除去细胞碎片，而不损害VZV。然后用稳定剂溶液稀释无细胞病毒制备物，再分装供作为疫苗使用。对于长期贮存来说，优选用一种本领域已知的方法将VZV冻干。

概括地讲，与在基本培养基中培养细胞时的VZV产量相比，采用该方法的最佳步骤使潜在产量提高的近似值报告如下：

方法步骤 PFU提高倍数

培养基/添加剂

1.感染复数 2-5

2.细胞会合 2-3

3.SRFE-2培养基+类脂 2-3

4.感染前期加蔗糖 2-5

5.最适培养基体积 1-2

培养基/稳定剂添加剂结合使用

和最适感染条件时的

净潜在提高 ≥8

摇瓶中3、4和5组合

观察到的提高 16

6.联合使用剪切/声波处理法

释放细胞结合的VZV 1.5

相对于非最佳方法的总的

潜在提高 ≥18

该方法对疫苗生产的实用性：

已证实了减毒无细胞VZV作为疫苗预防水痘的实用性。多次临床实验已经结论性地证明这种实用性，并且这样的证明现已是现有技术的一部分[见例如Pediatrics 88(3)，604-607(1991)；Pediatrics 87，(5)，604-610(1991)]。因而，本发明对该领域的重大贡献是提供了高产量地制备活的减毒VZV的高效方法。根据本发明制备的病毒可以按照本领域已知的方法配制成疫苗，并按照现在已完善的方案给药。例如，可将本发明的活的减毒无细胞VZV产品稀释到稳定剂中，装瓶，并以单位剂量冻干，这样，在贮存于约4℃或更低时，在使用时有效剂量约为1000PFU。根据本发明方法制备的VZV疫苗可以单位剂量制剂用于接种人体，诱导出免受VZV毒性株感染的保护性免疫应答。优选的是，通过皮下或肌内给药时最小剂量为约2000PFU/ml(1000PFU/0.5ml剂量)。已施用过的剂量高至总共15,000至20,000PFU，并且是能够接受的。

通过提供生产减毒VZV病毒的最佳方法，本发明使人们有可能应用本领域已知方法配制供增强抗VZV免疫应答以预防水痘的疫苗。

下面提供的实施例是为了说明本发明而不应误认为是限制发明范围。

实施例1

测定VZV产量的分析方法

利用Krah等人(J.Virol.Methods，1990，27：319-326)描述的琼脂糖覆盖法或液体覆盖方法，估测水痘-带状疱疹病毒(VZV)制备物的感染效价。该分析方法如下进行：

将MRC-5细胞以在5ml体积的添加了100mg/L半乳糖、50μg/ml新霉素、2mM L-谷氨酰胺的BME(添加了汉克斯氏平衡盐溶液的伊格尔氏基础培养基)中6×10⁵个细胞的浓度接种于60mm组织培养平板上，并于5％CO₂气氛中于35℃下培养。在培养24-48小时后，细胞达到50-80％会合。吸出生长培养基，并用稀释于适当病毒稀释液如SPGA缓冲液或液体维持培养基(LMM)中的100μl VZV溶液感染细胞。SPGA缓冲液含有7.5％(W/V)蔗糖、11mM磷酸钾、0.1％(W/V)谷氨酸钠和1％人血清白蛋白。使病毒在5％CO气氛中于35℃附着至少1小时。然后用5ml琼脂糖覆盖培养基(AOM)或液体维持培养基(LMM)覆盖VZV感染细胞培养物。琼脂糖覆盖培养基是二种溶液即液体覆盖培养基(LOM)和琼脂糖溶液的混合物。LOM含有添加了厄尔氏盐的基本必需培养基(MEM)、2％热失活的胎牛血清、50μg/ml硫酸新霉素以及2mML-谷氨酰胺。琼脂糖溶液的制备方法是：将100ml MEM中的4.5克低胶凝温度琼脂糖在121℃加热15分钟，并使该溶液冷至45℃。AOM的制备方法是：将1倍体积的琼脂糖溶液与4倍体积的1.25倍浓缩的LOM在45℃下混合。将平板冷却至23-25℃使AOM固化。培养该培养物使之显示噬斑。6-7天后，用5ml磷酸盐缓冲盐水覆盖加了LOM的平板，并用玻璃巴氏吸管吸其边缘以便松散和移出琼脂糖。从加了LMM的平板上吸出培养基，用溶于乙醇-1％乙酸中的0.2％(W/V)考马斯蓝R-250溶液染色细胞，从而显现噬斑。噬斑数取4-5个平行平板的平均值，并表示为每毫升的噬斑形成单位(PFU/ml)。

由于该分析方法具有潜在的可变性，VZV产量的提高是相对于在非最佳条件下选行同样的分析时的结果而报道的。

实施例2

感染时的细胞会合程度对VZV产量的影响

以4×10⁶个细胞/150cm²的浓度涂布MRC5细胞，并在10％胎牛血清(FCS)存在下使之在补充了伊格尔氏基础培养基(EBME)的厄尔氏盐中生长3天。当达到约12×10⁶个细胞/150cm²的亚会合细胞密度时，用补充了2％FCS或10％FCS的新鲜EBME更换细胞培养基。此时使亚会合细胞在有或无VZV感染(感染复数＝1∶125)的情况下进一步生长，并在48小时后监测细胞密度和病毒产量的提高。发现2％FCS中的未感染细胞的密度仅提高33％，而在10％FCS中则提高92％。感染培养物中细胞数目没有增加。如表I所示，不论是补充最小量(2％)还是最大量(10％)的FCS，培养物中细胞复制的能力都不影响亚会合细胞的病毒产量。

将其他细胞培养物在10％FCS中再培养2天达到约20×10⁶个细胞/150cm²培养瓶(会合条件)，并将培养基换为补充了2％FCS或10％FCS的新鲜EBME，并用VZV(感染复数1∶125)感染或不进行感染。48小时后监测细胞密度和病毒产量的提高。发现在2％FCS中未感染细胞的密度没有提高，而在10％FCS中细胞密度仅提高约15％。因而没有一种状态能使细胞大量复制。在2％或10％FCS中病毒产量相似，都比亚会合时感染的细胞中的产量提高约3倍(见表I)。这样便可以确认，为得到最佳产量的无细胞VZV，使用刚会合的细胞单层优于使用旺盛复制的亚会合细胞单层。

表I

感染时细胞病毒生长无细胞病毒生长期

单层的状态期间％FCS PFU/ml 间潜在的

实验细胞复制

A B

- -

亚会合 2 44,000 30,000 33％

10 33,000 27,000 92％

刚会合 2 119,000 117,000 0％

10 123,000 100,000 15％

实施例3

刚会合和长久会合细胞培养物中VZV产量的比较

将MRC-5细胞以约26,500个细胞/cm²的浓度接种于摇瓶(850cm²)中。所有细胞都在含有10％(V/V)胎牛血清(FCS10)的EBME培养基中，在5％CO气氛中于35℃培养。根据用VZV感染的时间将培养瓶分为两组。I组细胞培养五天，此时细胞单层会合。这时除去培养基，以感染复数为1∶125的细胞结合VZV感染细胞，并将细胞悬浮于EMEM+2％FCS中。加入另一些培养基，将细胞再培养48小时。II组细胞在以1∶125的感染复数感染前再维持48小时。

如下测定I组和II组细胞的VZV产量：从摇瓶中移出培养基，并用磷酸盐缓冲盐水淋洗细胞，在等体积稳定剂中用玻璃珠擦落细胞，并冷却至4℃。通过声波处理破碎冷细胞悬液。通过低速离心(325xg离心10分钟)除去病毒中的细胞碎片，保留病毒上清液。通过噬斑分析测定VZV的产量。如表2所示，用VZV感染刚会合的细胞单层时产量提高将近2倍。

表2

实验1 实验2

- -

条件 PFU/ml

刚会合 121,000 190,000

长久会合 82,000 85,000

实施例4

培养体积对VZV PFU/ml产量的影响：

在850cm²摇瓶中将MRC-5细胞(一千万个)接种于125ml体积的含10％FCS、50μg/ml新霉素和2mM L-谷氨酰胺的EBME中，在35℃下培养3天。加入300ml新鲜培养基，将培养物在35℃下再培养4天。然后移去培养基，用125或425ml含2％热失活FCS、50μg/ml新霉素和2mM L-谷氨酰胺的EMEM替代。加入VZV感染MRC-5细胞(感染复数约为1∶125)，给培养物充5％CO₂，在35℃下再培养46小时。除去培养基，用100ml体积的PBS洗涤细胞4次，借助玻璃珠将细胞擦落于43ml体积的稳定剂中。在-70℃冷冻细胞。通过声波处理制备无细胞病毒。用VZV噬斑分析法测定澄清(通过离心)的声波处理液中感染性病毒的数量。

结果：

培养基体积(ml) VZV PFU/ml

-------------- -----------

125 55,000；45,000

425 153,000；103,000

*二个平行培养物的结果

结论：使用较高的培养基体积使MRC-5细胞培养物中感染性VZV的产量提高约2倍。

实施例5

VZV感染复数对VZV PFU/ml产量的影响：

———————————————————————

将MRC-5细胞接种于摇瓶中并培养至会合。除去生长培养基并以不同感染复数用VZV感染细胞。定期收集并如实施例1进行分析，用噬斑分析法测定感染细胞培养物中VZV的产量。如表3和图5所示，采用较高的感染复数时无细胞感染性VZV的回收率较高，并在较短的培养时间内就能达到这一回收率。用较高的感染复数也可以更快地达到峰值抗原水平。在感染复数很低如1∶625时，抗原的产生推迟并且不是最佳的。

表3输入的细胞结合感染复数对单层

MRC-5培养物中无细胞VZV产量的影响-----------------------------------------------------------

感染复数无细胞VZV效价

(PFU/ml)×10^-3

---------- --------------------------

收集时间

22小时 37小时 42小时 60小时

1∶25 100 450 50 未测

1∶125 未测 150 325 100

1∶625 未测未测 100 90

实施例6

-20℃时VZV在稳定剂中稳定性的增加

--------------------------------

在SPGA中对感染细胞培养物进行声波处理，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤。然后通过声波处理释放出细胞结合的病毒，并离心去除细胞碎片。将无细胞病毒的浓度调至已知的PFU/ml浓度，并冻干稳定剂中病毒的等分样品，贮存于4℃或-20℃。在总共14个月内，每隔一个月取样使其复原，并测定剩余的PFU/ml效价。该实验的结果示于图3中。

很明显，贮存于-20℃达到的VZV稳定性大大优于贮存于4℃时的稳定性。

实施例7

在细胞生长的感染前期加入蔗糖的量

及时间的选择对最终VZV产量的影响：

-------------------------------

1.细胞植入阶段：

以120,000个细胞/ml的浓度(总共为600,000个细胞)将MRC-5细胞植入60mm平板中的EBME培养基中，并在5％CO₂气氛下35℃培养。该培养基含有10％FCS、50μg/ml新霉素、2mML-谷氨酰胺。

2.细胞生长/感染前期：

在植入后第3天细胞会合。吸出48个平板中的植入培养基，并用8ml体积的生长培养基替代，该培养基含有EBME或SRFE-2，并补充了10％FCS、50μg/ml，新霉素、2mM L-谷氨酰胺和0.2mg/ml大豆类脂/1mg/ml BSA，并含有或不含有50mM蔗糖。在加入新鲜的生长培养基后，将细胞在5％CO₂中在35℃下再培养3天。

3.VZV感染：

然后移出每个平板中的培养基，用8ml EMEM代替EBME，用8ml SRFE-2代替SRFE-2加大豆类脂。将所有平板中的FCS降低至2％，但其他的添加剂：新霉素、谷氨酰胺和蔗糖，与生长期相同。然后在每块平板加入在含2％FCS、新霉素、谷氨酰胺的EMEM中以1∶16稀释的VZV感染细胞(47,000PFU/ml)333μl。

使VZV在5％CO₂中于35℃下复制2天，然后每个不同条件移出两块平板的培养基。用PBS洗涤细胞4次。将细胞刮落到每平板1.2ml冰冷稳定剂中。将由平行平板得到的收集物合并在50ml锥形离心管中，并于-70℃下冷冻。

在VZV感染后的第三、第四和第五天，每个条件取两个平板重复进行前一自然段描述的相同步骤，并将每两个平板为一组的收集物合并后贮存于-70℃。

以后将按上述方法制备的每一种细胞收集物解冻，利用喇叭形超声仪将每一管在冰上声波处理30秒，并在4℃下以1000xg离心10分钟而使之澄清。移出上清液等份样品用于进行噬斑分析。按实施例1描述的方法进行噬斑分析，结果示于图1。

图1中提供的资料证实了几点结论：

1.在感染前用50mM蔗糖培养细胞对最终VZV产量十分有利。如果在感染前用蔗糖处理细胞，则在每一种培养基，即EMEM或SRFE-2中，VZV产量都较高。在感染后72小时，按PFU测定结果计算，在SRFE-2中培养的与蔗糖接触的细胞的VZV产量，比在不含蔗糖的基本培养基中的细胞的VZV产量约高16倍！

2.供应加富培养基(在细胞生长期供给SRFE-2加大豆类脂，在病毒生长期供给SRFE-2)有利于VZV产量，但和蔗糖的作用合在一起，可使产量再提高一个数量级。因而，看来加富培养基与蔗糖的作用协同起作用。

3.收集VZV的时间是非常重要的。甚至在最佳培养条件即SRFE-2和蔗糖等，感染后48小时也没有达到峰值VZV产量。此时产量仅比基本培养基产量增加4倍。但是，感染后72小时VZV产量约提高16倍。

在另一些实验中，如果在感染时而不是在感染前72小时加入50mM蔗糖，则不能使VZV产量增加同样多，从而表明了一个长感染前期对胞内蔗糖积累的重要性。我们还发现，加入25mM或100mM蔗糖不如加50mM蔗糖好。同样的近似浓度也适用于乳糖、纤维二糖和麦芽糖。

实施例8

多个强化方法参数对VZV产量的影响：

进行一个摇瓶试验以测定各种方法参数变化(培养基、添加蔗糖、稳定剂中加NH₄Cl、用匀浆法或声波处理法从细胞中释放出病毒)对无细胞VZV PFU产量的影响。将培养物以80×10³个细胞/ml植入每摇瓶中的125ml含10％FCS的EBME中。用EBME将体积调至425ml，或换用SRFE+大豆类脂培养基，用在125(“小体积”)或425(“大体积”)ml EMEM或SRFE培养基(无大豆类脂)中的操作用种VZV感染。这些培养基改变/感染时间的选择描述于实施例7中。在感染前不同时间(感染前96或24小时，或在感染时)，加入50mM蔗糖。在感染前加蔗糖的培养物在病毒感染培养基中也加蔗糖。以1∶15的近似感染复数用EMEM培养物中的VZV感染细胞感染所有培养物，46小时时将培养物收集于含20mM NH₄Cl(N)或不含任何添加剂的感染后稳定剂中。所有样品都冷冻于-70℃，随后通过声波处理或DOUNCE匀浆从细胞中释放病毒。在1000xg离心10分钟使所有样品澄清。

经声波处理的样品获得的PFU结果给出下列结论：

1.使用“大”体积的EMEM培养基使VZV PFU提高2倍。使用SRFE时，本试验和其他一些试验表明，在接近“小”培养基体积时获得最佳PFU产量。在某些情况下，在“大”体积培养基时产量受到抑制。

2.NH₄Cl对PFU的高回收率不是关键。

3.对于EBME/EMEM，蔗糖使PFU产量提高2倍，而对于SRFE培养物则提高5倍。这里似乎有加入蔗糖的时间对PFU的影响。在本实验的另一部分中，未加蔗糖的SRFE+大豆/SRFE培养物，PFU产量是94×10³，而分别在感染时、感染前24小时、以及感染前96小时加蔗糖的培养物，产量分别为296×10³、427×10³和671×10³。

4.经蔗糖处理的培养物比不含蔗糖的相同培养物的细胞病变效应小得多。在另一个实验中，经蔗糖处理的培养物在感染后1星期仍没有显示出退行性细胞病变效应，而相应的无蔗糖对照则完全溶解。因此，经蔗糖处理的细胞可能在延长的培养时间内(超过摇瓶实验中的46小时收集)积累了更多的VZV(抗原，尤其是PFU)。

5.由于是在SRFE培养基中培养细胞，本实验中未调整感染复数以在感染时达到较高的细胞密度，所以如果这个参数取最佳值，可以获得更大的PFU产量。

实施例9

通过机械剪切、声波处理及其组合获得的无细胞VZV的产量

利用生产VZV的多种不同的条件进行类似于实施例8中所述实验的大规模实验。在该实验中分析一个新的参数，即破碎细胞的方式。将只进行DOUNCE匀浆、只进行声波处理、以及DOUNCE匀浆和声波处理相结合获得的无细胞VZV产量进行比较，结果在后面报告。所报道的VZV培养条件用于在基本培养基(EBME/EMEM)或高营养培养基(在感染前期SRFE-2加大豆类脂/SRFE-2+50mM蔗糖)中培养的细胞。按实施例8中描述的方法培养细胞并收集，并按实施例1中描述的分析方法测定VZV PFU/ml。

表4

无细胞PFU/ml(×10^-3)

条件 DOUNCE 声波处理总数只声波

DOUNCE 处理

沉淀

EBMF/EMEM 42 7 49 38

EBME/EMEM 64 4 66 46

SRFE-2+蔗糖 154 47 201 42

由这些数据可见，当将机械剪切与声波玻碎细胞结合使用时，VZV产量可获得明显提高。

实施例10

应用SRFE-2培养基和大豆类脂添加剂提高MRC-5细胞中活水痘疫苗的回收率：

将MRC-5细胞接种于25cm²T形瓶的EBME中，并在35℃下培养3天。移去培养基，并用12.5ml的新鲜EMEM培养基，或添加了10％FCS、新霉素、谷氨酰胺并且不含大豆类脂或含1∶200稀释的类脂的SRFE-2培养基代替。将培养物在35℃下再培养3天。然后移出培养基，并在细胞中加入VZV感染MRC-5细胞以及12.5ml体积的含有2％胎牛血清、新霉素、谷氨酰胺的EMEM或SRFE-2。标示为“SRFE-2”的培养条件是在细胞培养和病毒培养期间加SRFE-2。“SRFE+大豆”条件是指样品在细胞培养期间加SRFE-2培养基和大豆类脂的1∶200稀释液，但在病毒培养期间只加SRFE-2培养基。培养48小时后，移出培养基，用5ml体积的PBS洗涤细胞4次，并将细胞刮落至1.2ml体积的稳定剂中。将来自二个平行培养瓶的样品合并，并冷冻于-70℃。随后解冻后，通过声波处理破碎细胞，经离心(1000xg 10分钟)澄清，并将上清液冷冻于-70℃，供以后进行病毒感染效价分析。结果示于图4。结论：用SRFE-2培养基代替EMEM可使活水痘的回收率提高2.5倍。在细胞培养期间使用补充了大豆的SRFE-2，可使病毒回收率再提高2.7倍，比利用EMEM病毒培养方法获得的结果净提高7倍。

实施例11

用于VZV抗原定量分析的竞争性ELISA：

由于VZV噬斑分析耗时长，因而不能很好地控制其过程。一种快速VZV抗原ELISA法可以测定VZV抗原的量，从而能够在活水痘疫苗制备期间监测病毒的生长。另外，这种检测方法可用来估测澄清的、经声波处理的大批量疫苗中VZV抗原的量，并潜在地可用于测定灌装疫苗冻干管中的抗原。简言之，进行该分析的方法是：用抗VZV血清溶液培养受试样品中的VZV抗原。使剩余的游离抗体与固定于ELISA微量滴定板上的VZV抗原结合。能够与滴定板结合的抗体的量与受试样品中抗原的量成反比。与一种酶联抗人抗体和合适的底物反应而生成能通过分光光度法定量测定的有色产物，从而定量测定结合到滴定板上的抗体。

VZV抗原ELISA和VZV噬斑分析通常应得到相关数据，但应牢记，VZV抗原分析既检测不能存活的VZV也检测活VZV。由于尚未证明被杀死的VZV产生的免疫应答与活的减毒病毒产生的应答同样有效，因而噬斑分析是测定制备VZV疫苗的病毒接种物剂量的关键性分析法。但是，抗原分析法也是有价值的，因为它提供了给予VZV疫苗受体的抗原总量的量度。

测试步骤：

1.用来自VZV感染或未感染MRC-5细胞的糖蛋白涂布ELISA平板，其上用含0.1％NaN的1％牛血清白蛋白[组分V，#A-9647，Sigma]涂布以减少抗体对平板的非特异性吸附。各行用VZV或对照抗原交替涂布(即A、C、E和G行涂VZV糖蛋白，而B、D、F和H行涂未感染MRC-5糖蛋白抗原)。

2.在12×75mm试管或小管中将已澄清(3250g-分钟)的受试抗原稀释于稳定剂中。将标准病毒抗原制备物(由斑点印迹检测到26单位/ml VZV抗原)以1∶10稀释，然后以1∶1.25倍连续稀释以提供2.6、2.1、1.7、1.3、1.1、0.9单位/ml抗原浓度。还可包括其他稀释液以提供0.7和0.5单位/ml的抗原。利用这一系列稀释液可以制做用于测定受试样品中抗原量的标准曲线。

3.将人抗VZV血清在稳定剂中稀释到最终所需稀释度的二倍。

4.将300μl体积的经稀释的抗原分装到小管中，与300μl稀释的抗VZV血清混合，并在35℃下培养15-22分钟。对照含有人抗VZV和稀释剂(无抗原)。

5.从每个血清-抗原混合物中取100μl等份试样，加到2个平行的VZV糖蛋白涂布孔和2个MRC-5糖蛋白涂布孔中(每个样品四个孔)(例如：样品1在第1列A、B、C和D行；样品2在第2列A、B、C和D行；等等)。

6.将平板在35℃下培养15±1分钟，以使游离抗体(没有与溶液中抗原复合)结合至固定于平板上的病毒抗原上。

7.洗掉未结合的抗体，向孔中加入碱性磷酸酶结合的羊抗人IgG以检测结合的人抗体。

8.在35℃下培养15±1分钟后，洗掉未结合的结合物。通过与溶于二乙醇胺缓冲液中的磷酸对硝基苯酯底物在35℃下保温15分钟而检测结合的结合物。

9.加入50μl/孔3M NaOH终止底物反应后，利用微量滴定板分光光度计定量测定显色反应(405nm处的OD值)。

试验结果的计算和解释：

1.分别计算平行的VZV和MRC-5涂布孔的平行OD值的平均值。经验证明，在不同的样品和稀释液之间MRC-5 OD值是一致的。因此，计算整个平板的MRC-5值的平均值，并用于校正一级抗体或结合物与未感染细胞提取物的非特异性结合。分别从每个VZV OD平均值中减去MRC-5 OD平均值，得出VZV特异性OD(ΔOD)值。

2.制做测定抗原量的标准曲线：

将标准曲线ΔOD值相对于已知抗原浓度(VZV单位数/ml)制图。将数据输入合适的制图程序(例如：Cricket Graph version 1.3，Cricket Software，Malvern，PA)，鉴别曲线的线性部分(必须包含至少4个点)，得到“直线拟合公式”(Y＝a+bx)。

3.计算受试样品中的抗原量：

由直线拟合公式得出a和b的值，而y(ΔOD)是已知的。然后可计算出剩下的代表单位/ml抗原的未知数x，并用相同的样品稀释液进行校正，得到未稀释样品的抗原浓度。示范性的一般计算方法如下：

样品抗原稀释度 ΔOD 单位/ml抗原单位/ml

稀释液 (由直线公式计算) (校正)

A 1∶2 Y x＝(y-a)/b

(x)(稀释因子)

所报道的抗原浓度是用ΔOD值在标准曲线的线性部分内的稀释度最小的样品得到的。

实施例12

VZV抗原ELISA以及与VZV PFU产量的比较：

根据实施例11所述的VZV抗原ELISA法分析实施例7中得到的无细胞VZV样品，该样品的PFU/ml产量示于图1中。该分析的结果示于图2中。

值得注意的是，根据图1的数据，PFU/ml在下降，但即使如此，在96小时VZV抗原也继续上升。也应注意，在SRFE-2+大豆+蔗糖中的VZV抗原量无论如何也没有接近EMEM中抗原量的16倍(图2)，而活的无细胞VZV PFU/ml却接近(图1)。从这一比较看来，蔗糖的作用是在感染后72小时维持活VZV的主要因素。

实施例13

利用SRFE-2培养基和大豆类脂添加剂促进MRC-5细胞的生长

在25cm²T形瓶中的12.5ml体积的EBME中以53,000个细胞/ml浓度接种MRC-5细胞，并在35℃培养。EBME中含有10％FCS、50μg/ml新霉素和2mM L-谷氨酰胺。2-3天后，除去培养基，并用12.5ml的新鲜培养基或含10％FCS、50μg/ml新霉素、2mM L-谷氨酰胺以及不同量大豆类脂的SRFE-2培养基代替(替换2)。未稀释的大豆类脂含有20mg/ml类脂和100mg/ml牛血清白蛋白。

在细胞开始植入后6天移出培养基，并用12.5ml体积含2％FCS、50μg/ml新霉素、2mM L-谷氨酰胺的EMEM，或补充了不同量大豆类脂的SRFE-2培养基代替。通过胰蛋白酶处理打散选定培养瓶中的细胞，并用血球计算器计数。在35℃继续培养2天后测定剩余培养物中的细胞数，结果概括于表5中。

表5

利用SRFE培养基和大豆类脂提高MRC-5细胞的密度

实验1 实验2

培养基

EMEM(E) 2.3 1.5

SRFE(S) 4.0 3.8

S+1∶100大豆未测 7.6

S+1∶200大豆 7.9 7.6

S+1∶500大豆 5.9 3.7

S+1∶2000大豆 5.0 3.8

培养基替换1＝在细胞植入后2-3天用补充了10％FCS的指定培养基代替原培养基。

培养基替换2＝在细胞植入后6天用补充了2％FCS的指定培养基代替原培养基。

结论：使用未补充类脂的SRFE-2可使细胞数比只用EMEM提高约2倍。用大豆类脂补充培养基可使细胞产量以剂量依赖性方式进一步提高。SRFE-2培养基与约200-400μg/ml类脂结合使用获得最大细胞产量。

实施例14

按照本发明方法培养WI-38细胞

以53,000个细胞/ml浓度将WI-38细胞接种于25cm²T形瓶中的12.5ml体积的EBME中，该培养基含10％FCS、50mg/ml新霉素、和2mM L-谷氨酰胺，并在35℃下培养。2天后，移出培养基，用12.5ml补充了50mg/ml新霉素、2mM L-谷氨酰胺和1∶200稀释的大豆类脂的SRFE-2培养基代替。对照组加入不含类脂添加剂的培养基。在35℃培养5天后，移出培养基，用胰蛋白酶处理法打散培养瓶中的细胞，并用血球计数器计数。其余的培养瓶再保持3天，然后计数细胞。结果概括如下：

表6

细胞系类脂添加剂细胞数/瓶×10^-6

5天后 8天后

1 - 4.2 4.8

+ 9.5 10.2

3 - 4.1 4.9

+ 9.3 12.5

结论：用大豆类脂补充加富培养基使WI-38细胞产量提高约2倍。因而预计利用该细胞系生产VZV可达到与用MRC-5细胞类似的效果。

实施例15

评价MRC-5细胞生长促进作用的步骤：

以约53,000个细胞/ml将MRC-5细胞植入25cm²T形瓶中的12.5ml体积的EBME中，该培养基含有10％FCS、50μg/ml硫酸新霉素(neo)和2mM谷氨酰胺(Gln)。在35℃培养3天后，通常细胞单层达到约50-75％会合。移出培养基，用10-12.5ml含有10％FCS、50μg/ml neo和2mM Gln±大豆类脂或其他类脂的SRFE-2培养基代替，并再将培养物在35℃培养。在不同时刻用胰蛋白酶处理细胞(2.5ml体积的0.25％柠檬酸盐胰蛋白酶溶液)，并用血球计数器计数，从而测定细胞数。用0.2％锥虫蓝以细胞排除法监测细胞存活率。利用细胞计数推算出细胞浓度，根据该浓度和细胞悬液总体积，计算出每瓶中细胞产量。在某些实验中，在培养基替换后3-4天将培养物移至含2％FCS的培养基中，再培养2天后测定细胞数。

实施例16

延长培养细胞与类脂添加剂接触时间的影响

将MRC-5细胞植入T25培养瓶中，3天后加培养基(第一次更换培养基)，再培养3天后测定细胞数。更换培养基±类脂(第二次更换)使其他T25瓶继续生长2天。用胰蛋白酶回收细胞。在EBME中植入并在EMEM中培养的细胞产量是2.6×10⁶，而在SRFE-2+1∶100稀释的大豆类脂中培养的细胞达到6.6×10⁶和7.7×10⁶。在EBME/EMEM中培养的细胞继续生长2天后的细胞数为每T25瓶2.76×10⁶，而在不添加大豆类脂的EBME/SRFE-2中继续生长2天后的细胞数为每T25瓶9.2×10⁶和7.88×10⁶。在EBME/SRFE-2+1∶100大豆类脂中培养的细胞产量仅为2.48和2.28×10⁶个细胞。这些数据表明，可能是由于细胞死亡，延长与高浓度类脂接触时间(第二次更换培养基后约5天)最终可能会导致细胞产量降低。因而一般是给细胞更换不添加类脂的加富培养基。在病毒生长期起动后换用不含类脂的加富培养基尤其重要，因为类脂对病毒生长或在病毒进攻下细胞的继续存活可能有毒。

实施例17

在加富培养基和基本培养基中不同类脂

浓度对细胞生长的影响：

按照与实施例16所述基本相同的用于MRC-5培养物的基本上相同的更换培养基/细胞定量操作，获得如下的细胞产量(注意：培养基描述后的“+”和“-”符号表示在第二次更换的培养基中存在或不存在所述量(mg/ml)的大豆类脂(sl.)添加剂)：

总的T25瓶中

培养基 MRC-5细胞产量×10⁶

第二次更换培养基后天数

3 5

--------------- ----------

EBME/EMEM(3次实验) 4.3；2.46；1.52 2.94；3.50

EBME/SRFE-2 3.80

EBME/SRFE-2-0.4sl. 13.69；11.09

EBME/SRFE-2+0.4sl. 11.7 11.65

EBME/SRFE-2-0.2sl. 5.10 8.51；6.27

EBME/SRFE-2+0.2sl 7.62；9.7 9.66

EBME/SRFE-2-0.1sl. 3.52

EBME/SRFE-2+0.1sl， 4.94

EBME/SRFE-2-0.04sl. 3.10

EBME/SRFE-2+0.04sl. 3.16

EBME/SRFE-2-0.01sl， 2.90

EBME/SRFE-2+1.01sl. 3.82

上面总结的数据通常与在实施例16中观察的结果相一致，即延长细胞与高浓度类脂接触时间不是很有利的，尽管实施例16中观察到的毒性效应在这些数据中较不明显。在较低类脂浓度时，细胞与类脂接触较长的时间危害较小，可能有利于提高每cm²生长表面的细胞产量。

实施例18

胎牛血清浓度对细胞产量的影响：

在本实验中测试在类脂添加剂存在时加入2％或10％胎牛血清的影响。将MRC-5细胞植入EBME中，3天后换用补充了不同量大豆类脂的SRFE-2培养基，2天后再换用与第一次更换的培养基含相同浓度类脂的SRFE-2。对于补充了0.1、0.2和0.4mg/ml类脂的培养物，10％FCS中细胞产量分别是9.5、11.3和12.2×10⁶。如果加入2％FCS，细胞产量分别是6.5、8.8和3.2×10⁶。该实验指出了提供FCS添加剂以及类脂添加剂对细胞生长都有有益影响。提供足够的FCS添加剂可以减弱在较高的类脂浓度下细胞受到的任何毒性作用。

实施例19

不同的类脂添加剂对MRC-5细胞生长的影响：

将MRC-5细胞植入T25瓶中的EBME。在第3天，给细胞换用含有10％FCS并添加了不同类脂添加剂的SRFE-2培养基。以所指出的浓度提供Boehringer Mannheim大豆类脂、Sigma来源于成年牛血清的富含胆固醇的类脂、或Miles/Pentex EX-CYTE I或Very Low Endotoxin牛脂蛋白。更换培养基后细胞数为1.19×10⁶。五天后测定细胞数。在EMEM中细胞数为2.97×10⁶；在SRFE-2或SRFE-2+0.4mg/ml、0.2mg/ml和0.1mg/ml大豆类脂中分别得到4.83、10.44、8.67和8.04×10⁶个细胞。在1∶50、1∶100、1∶200的浓度下，EX-CYTE I分别得到5.37、4.80和4.74×1 0⁶个细胞。1∶25、1∶50、1∶100的EX-CYTE VLE分别得到5.49、7.23和7.92×10⁶个细胞。1∶25、1∶50、1∶100的Sigma高胆固醇类脂分别得到6.87、7.56和7.65×10⁶个细胞。Boehringer Mannheim大豆类脂使细胞产量提高最多，但EX-CYTE VLE和Sigma类脂几乎同样有效。因此提高效果不是大豆类脂所独有的。

实施例20

利用高浓度的大豆类脂促进MRC-5细胞生长

将MRC-5细胞接种在25cm²培养瓶中，并按实施例13方法在第3天和第6天更换培养基。EBME/EMFM、SRFE-2+1/100大豆类脂或SRFE-2+1/50大豆类脂培养物第6天时每个瓶中细胞产量分别为4.3×10⁶、9.7×10⁶和11.7×10⁶。所有培养物的细胞存活率都大于99％(由锥虫蓝排除法判断)。换用培养基±大豆类脂，再培养2天，测定细胞产量。这些培养物每瓶的细胞回收量为：二个平行的EBME/EMEM培养物为2.9和3.5×10⁶；换用同样培养基的SRFE-2+1/50大豆类脂时为11.65×10⁶，而换用不含大豆类脂的SRFE-2培养基的SRFE-2+1/50大豆类脂培养物(二个平行培养物)的产量为13.69和11.09×10⁶个细胞；换用同样培养基的SRFE-2+1/100大豆类脂为9.66×10⁶，而换用不含类脂的SRFE-2的二个平行培养物的产量为8.51和6.27×10⁶个细胞。

由该实验可见，提高大豆类脂量可提高MRC-5细胞产量。利用1/50稀释的大豆类脂(所测试的最高浓度)获得最大细胞产量。在第二次更换的培养基中加入类脂能适度地提高细胞产量。但是，该数据表明，在第一次更换的培养基中使用1/50类脂可获得最大细胞产量。于是，第二次更换的培养基中可以不加类脂添加剂。由于高浓度的类脂对病毒生产可能有害，因而在病毒生长期间最好不加类脂。

Claims

1.减毒水痘-带状疱疹病毒在制备用于预防水痘的药物中的应用，其中水痘-带状疱疹病毒缩写为VZV，所述减毒病毒是用如下方法制备的：

a.培养选自人二倍体细胞的VZV易感染细胞，使之汇合成单层培养物，并供给不能脂代谢的二糖；

b.在接近汇合点时，感染步骤a培养的细胞，得到高感染复数的VZV感染细胞；

c.将VZV感染培养物在高营养状态下维持22-96小时，并在感染性VZV产量达到峰值时收集；

d.在收集VZV感染细胞前，用含有或不含有溶酶体营养剂的生理溶液洗涤VZV感染培养物；

e.将VZV感染细胞收集到稳定溶液中，并且或者立即破碎细胞，或者冷冻这些细胞供以后破碎；

f.破碎VZV感染细胞以释放细胞结合的VZV，并除去细胞碎片，以提供无细胞VZV制备物；

其中VZV易感染细胞是MRC-5细胞，减毒VZV是水痘-带状疱疹病毒的Oka株，培养温度是在30-37℃之间，二糖是以20-60mM提供的蔗糖，感染复数是1∶25和1∶625之间，溶酶体营养剂是以20-50mM提供的氯化铵或以230μM提供的氯喹。

2.权利要求1的应用，其中培养温度是35℃。

3.减毒水痘-带状疱疹病毒在制备用于预防水痘的药物中的应用，其中所述减毒病毒是用如下方法制备的：

a.培养VZV易感染细胞至汇合，其中所说培养包括：

1)细胞植入期；

2)在基本培养基或高营养培养基中进行的细胞生长期；

3)感染前期，包括使细胞与无毒的不能代谢的二糖接触；

b.在接近汇合点时，感染步骤a培养的细胞，得到高感染复数的减毒VZV感染细胞；

c.将VZV感染培养物维持于基本培养基或加富培养基中22-96小时，达到峰值VZV产量；

d.在收集前用含有或不含有溶酶体营养剂的生理溶液洗涤VZV感染培养物；

e.用以下方法收集VZV感染培养物：

1)移出液体；

2)加入稳定剂溶液；

3)刮落或用化学方法释放VZV感染细胞；

4)将释放出的VZV感染细胞在-70℃下冷冻，或不进行冷冻；

f.破碎释放出的VZV感染细胞以释放细胞结合的VZV，并除去细胞碎片，并冻干无细胞VZV或以液体冷冻形式贮存，或者不冻干无细胞VZV或以液体冷冻形式贮存；

4.权利要求3的应用，其中培养温度是35℃。

5.权利要求1的应用，其中高营养培养基是添加或不添加0.02-0.4mg/ml大豆类脂的SRFE-2，并且病毒是通过声波处理或SOUNCE匀浆或两者并用而从细胞中释放出来的。

6.减毒水痘-带状疱疹病毒在制备用于预防水痘的药物中的应用，其中所述减毒病毒是用如下方法制备的：

a.培养MRC-5细胞至汇合，其中所述培养包括：

1)在EBME中的细胞植入期；

2)在添加了0.2mg/ml大豆类脂的SRFE-2中于细胞植放3天后开始的细胞生长期；

3)感染前期，包括在感染前24-96小时使MRC-5细胞与20-50mM蔗糖接触；

b.在接近汇合点时，感染步骤a培养的细胞，得到高感染复数的减毒VZV感染的MRC-5细胞；

c.将VZV感染培养物维持37-96小时，并在VZV产量峰值时收集；

d.用添加或不添加1-100mM NH₄Cl或氯喹的磷酸盐缓冲盐水洗涤培养物；

e.用以下方法收集VZV感染MRC-5细胞：

1)除去液体；

2)加入含有或不含有1-100mM NH₄Cl或230μM氯喹的稳定剂；

3)刮落或用化学方法释放细胞；

4)将释放出的VZV感染细胞冷冻于-70℃，或不进行冷冻；

f.用以下方法破碎释放出的VZV感染细胞：

1)DOUNCE匀浆；

2)沉淀细胞碎片，保留上清液；

3)声波处理沉淀并再次沉淀；

4)合并步骤f-2)和f-3)的上清液；

g.将步骤f的上清稀释于稳定剂中并将产品分装成单位剂量供冻干并于4℃或更低温度贮存，以便在以后使用时能达到每剂量不低于1000PFU。

7.一种培养单层细胞的方法，该方法包括：

b.从步骤a的培养物中移出培养基，并用添加了类脂并含有或不含有血清添加剂的新鲜加富培养基代替；

c.在补充了类脂的加富培养基中培养细胞；

d.在培养24-72小时后，用或不用不添加类脂的新鲜培养基代替步骤c的培养基；

其中加富培养基是SRFE-2，类脂添加剂的浓度为0.02mg/ml至0.4mg/ml，细胞是MRC-5或WI-38。

⑧-⑥.用于培养细胞单层培养物的组合物，该组合物包含补充了0.02-0.4mg/ml类脂的SRFE-2培养基。