CN1099798A

CN1099798A - 甲型肝炎病毒疫苗

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Publication number: CN1099798A
Application number: CN93117633A
Authority: CN
Inventors: R·A·阿布德; B·C·布克兰; A·J·海根; B·曾克; J·G·欧宁斯; P·A·迪菲利斯; 小·J·P·亨尼赛; J·A·路易斯; C·N·奥利弗; C·J·奥雷拉; R·D·西特林
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1992-08-07
Filing date: 1993-08-06
Publication date: 1995-03-08
Also published as: JPH0748277A; SK18495A3; EP0583142A3; EP0583142A2; ZA935723B; WO1994003589A3; AU4450093A; FI950567A0; MX9304803A; SI9300421A; PL307402A1; CA2103515A1; NO950483L; WO1994003589A2; FI950567A; CZ34795A3; HUT70982A; DZ1706A1; NO950483D0; HU9500417D0

Abstract

一种完整的，商用规模可高度再现的生产稳定甲型肝炎病毒(HAV)的方法，包括最佳的生长、收获和抗原纯化条件，以产出以蛋白质为基大于95％的纯 HAV。进一步的加工步骤产出失活的HAV疫苗配制剂，该配制剂是致免疫的、有良好耐药能力的，并针对致病力强的HAV感染起有效防护作用。产物的蛋白质、碳水化合物、脂类、DNA和RNA含量作为其特征。

Description

本发明涉及一种高纯化甲型肝炎病毒疫苗的生产。

1973年Feinstone等人（Science 182，p1026）已经使用免疫电子显微镜发现传染性肝炎病原体，就是后来所说的甲型肝炎病毒。

Provost等人（P.S.E.B.M.160，p2113，1979）首先报导按照一种方法在活体外培养甲型肝炎病毒（HAV），该方法将被HAV感染的狨肝用作肝外植体培养物和胎儿恒河猴肾（FRhK6）细胞培养物（US-4164566）的接种物。在一个后来的发明中，直接接种HAV，这种不预先经过一种非人灵长类而进行的方法已成功地开始用于在活体外繁殖HAV（Provost等人，P.S.E.B.M.167，p201（1981）;US-5021348）。

从该工作已证实，通过在活体外培养使HAV减毒。此外已证实，在活体外重复的继代移种中，因为病毒变得适应被培养的细胞，HAV的培养物成为多产，并加速复制速度。进一步的研究证明在非人灵长类中活的减毒病毒（Provost等人，J.Med Voil.20，p165（1986））和福尔马林失活的HAV（US-4164566，US-5021348，Provost et.al.，in Viral Hepatitis and Liver Disease，p83-86，1988-Alan R.Liss，Inc.）两者的防护效能。从上述工作，可清楚看出，或者失活的致免疫HAV或者减毒的致免疫HAV是可接受的疫苗候选者。但是，如果一种用于人的安全的HAV疫苗在市场上是可以买到的，那末就需要一种可再现的工业规模生产高纯度抗原的方法。

已经公开了用于部分纯化整个HAV病毒粒子的各种方法，该方法是为了研究和描述起始病毒粒子性能。例如参见Hornbeck，C.L.等人，Intervirology 6，309-314（1975）;Locarnini，S.A.等人，Intervirology 10，300-308（1978）;Siegl，G.等人，J.Virol.26，40-47（1978）;Siegl，G.等人，J.Gen.Virol.57，331-341（1981）;Siegl.G.等人，Interrirology 22，218（1984）;Hughes，J.V.等人，J.Virol.52，465（1984）和 Wheeler，C.M.等人，J.Virol.58，307（1986）。

所有这些方法是难以操作、不实用的，并使用极昂贵的步骤，例如蔗糖梯度离心或CsCl-密度梯度离心。此外，这些方法适合于较小的生产规模，而尽管一些著作已报道其制品是高纯化的，但制品的精确分析已证实，检测出不足以支持关于纯度的任何最高水平要求的参数。因此，Lewis等人（欧洲专利申请0302692，1989年2月8日公布）揭示一种方法，它包括（a）分裂、萃取和浓缩HAV感染的细胞;（b）液流以高盐浓度经过阴离子交换色谱分离除去核酸污染物;（c）凝胶过滤色谱分离。在后来的著作中，Lewis等人（欧洲专利申请0468702，1989年7月8日公布）通过包括去除污染的碳水化合物的离子交换吸附/解吸步骤来改进这种方法。在发表的这两篇著作中，生该HAV的规模是较小的，并且，不会遇到大规模以至工业规模的本发明提出的问题。此外，通过凝胶电泳制品的考马斯（coomassie）或银染色法评定制品的纯度。这种鉴定方法是一种测量蛋白质纯度的方法，但它不是定量的，而且它不能提供关于其他污染物，例如类脂、碳水化合物、核酸或低分子量有机物存在或不存在的信息。

在两篇EP 0468702A2和EP 0302692A2公开说明书中曾指出，已有方法为了获得和纯化HAV使用一个或多个步骤，这些步骤由于使用去污剂和外源酶可能不被食品医药管理局批准。在本发明中，虽然去污剂和外源酶都使用，但本发明揭示了用于去除这些有效试剂的方法，并且证实，该制品含有低于这些添加物的检验极限值，同时是纯的或比在上述公开文献中报道的HAV制品更纯的制品。

此外，Lewis，Moritsugu等人（欧洲专利申请0339668，1989年11月2日公布）描述一种方法，它包括：

（a）加溶、萃取、浓缩、DNase/RNase及蛋白酶处理;

（b）蔗糖密度分离（它分离含有和缺少衣壳的RNA）;以及

（c）凝胶过滤色谱分离。

再者，这种方法在生产规模上，尤其是在蔗糖密度分离步骤上受到限制。此外，难以确定制品的纯度，并且在这些公开文献中在任何绝对意义上没有报道产品的纯度。

Lino等人（Vaccine，vol＃10，p5-10（1992））报道了关于Moritsugu方法的改进。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和密度测定法检测该方法的制品，结果表明，在其纯化的HAV中残留外源蛋白质低于1.9%。还可以断定，在其0.5μg的纯化HAV中，存在低于5pg的残留宿主细胞核酸。然而，由于其生产过程的局限性，大规模生产HAV是不现实的，并且没有通过大量参数报道绝对纯度。

在另一报告中，Kusov等人（Vaccine，9，540（1991））在类似活体内的细胞中培养HAV，并且通过有机萃取、DNase处理和在多孔硅胶颗粒上进行色谱分离来纯化病毒。此外，未指出制品的绝对纯度，而只有可测量性的某种指示。

尽管在这些公开文献中关于HAV疫苗纯度的不可靠性，但对于疫苗制品来说，根据表明其生产者报道的不同制品中的相当数量HAV的相对抗原性，与本发明相比较还是可能的。

本发明的制品是一种免疫原，它具有在这种表示HAV纯度水平和在此之前只有热切期望的生产规模的揭示中所描述的绝对纯度特性。本发明使所报道的离小规模很远的用于生产HAV疫苗的中间试验过程，使工业生产一种能再现高质量、高纯化、安全的HAV疫苗第一次成为现实。

一种提供能再现的，以工业规模方式生产具有HAV蛋白质纯度大于95%的稳定的HAV疫苗制品的方法，该方法包括在一个大尺度的静态表面生物反应器中培养HAV、去污剂收获病毒、核酸酶处理、浓缩、有机溶剂萃取、离子交换色谱分离和凝胶过滤色谱分离。DNA、碳水化合物、RNA和类脂的含量表征疫苗的特性。

图1是用于临床试验用甲型肝炎病毒疫苗生产的主要过程的组合流程图。左分路代表用于阶段Ⅰ/Ⅱ临床试验的已有技术方法，该临床试验应用一种辊式瓶生产过程。用于门罗（Monroe）效能研究（New England J.of Med.，327;453-457 1992）的新方法是在右分路，并且在中部代表本发明的生产过程。

图2是在过程内分析中使用以磷酸盐缓冲的盐水（PBS）洗脱的HPSEC TSK PW 4000柱的分析测量结果。这种分析已相对于高分子量标准物进行校准，并呈现一种具有甲型肝炎病毒稀释物的线性面积应答。这种分析在以后的纯化步骤中是特别有用的。在图中出现四个来自生产过程的最后四个步骤的色层分离谱。分别利用二种紫外光（UV）在214nm（上跟踪）和260nm（下跟踪）监测色谱分离。在PEG小片再悬浮后，利用这种分析首次看到对应于甲型肝炎病毒的峰值（图幅A）。氯仿萃取步骤去除大量的高分子量的紫外光（UV）吸收物质（图幅B）。阴离子交换色谱分离用于浓缩病毒（图幅C），而色谱分离提供高纯化病毒制备（图幅D）。纯化的甲型肝炎病毒在260或280nm范围显示差的吸收率，这样仅有214nm跟踪出现。在这种分析条件下，HAV制品是一个单一的对称峰值，并因而这种分析提供一种测量HAV纯度的方法，与使用SDS PAGE的分析无关。

图3表示MRC-5细胞在玻璃、聚苯乙烯和316不锈钠上生长。以时间函数绘制出细胞表面浓度。以大约10000/cm²密度将细胞接种在各种材料试片上，并且试片每天为细胞计数服务。玻璃条状盖板和316不锈钢试片上的细胞在含90ml培养基（0.6ml/cm²）的150cm²陪替氏培养皿中培养;用7.5ml培养基（0.3ml/cm²）培养生长在25cm²T-烧瓶中的细胞。

图4表示MRC-5细胞生长和在316不锈钢试片上生长细胞的残留葡萄糖浓度。对于在25cm²不锈钢试片上生长的细胞，以时间函数绘制出细胞表面浓度（细胞/cm²）和葡萄糖浓度（mg/cm²）。

图5是在不锈钢网上MRC-5细胞生长的光学显微照片。以5000-10000细胞/cm²接种细胞并培养超过两周。放大倍数40X。

图6是生长在316不锈钢网上的MRC-5细胞的能生存和不能生存的染色。细胞用荧光素二乙酸酯（FDA）和溴化乙锭（EB），按照在实施例14的材料和方法部分中所描述的方案进行染色，然后用扫描激光共焦显微镜观察;材料以57μm处加强的方式被扫描。图6A对应于来自荧光素的荧光，并表示能生存的细胞。图6B是由于溴化乙锭染色DNA而造成的荧光，表示细胞接近完整的生存能力。对溴化乙锭的正控制示于图7。

图7表示溴化乙锭染色的不能生存的MRC-5细胞。生长在316不锈钢网上的细胞通过用甲醇处理成为无生存力的。在用PBS充分漂洗和使之干燥后，用FDA/EB染色细胞至对FDA起负控制作用及对溴化乙锭起正控制作用（用图表示）。对于负控制没有观察到由于荧光素产生的荧光。

图8表示对在一个网状静态混合反应器中的每个单元绘制出种植功效，使用重力沉积或培养基再循环方案。单元编号为1-5，1是顶部单元，4或5是底部单元（单元4用于重力沉积试验，单元5用于再循环试验）。这里所表示的种植功效是全部被种值的百分数;全部种植功效约为90%。再循环数据是3个试验的平均值，而重力沉积的数据是取自单个试验。再循环速度大约是6cm/h。

图9表示对于包括固体钛和网状316不锈钢单元的反应器，作为时间函数的葡萄糖摄入率（GUR）。示于图9A中的GUR是根据时间（d）以每cm²为基准（μg/cm²-d），而以每个反应器容积为基准的GUR绘制在图9B中。图9A中的数据取决于单元的预测的表面积，而图9B由于两个反应器是相同容积没有具体预测。

图10表示对于实心和网状静态混合器，在连续溶胞产生中观察到的总蛋白质百分数。对于溶胞产物1-4的记录在下文中描述。通过显微镜观察，固体单元没有细胞碎片，而网状单元在第四次溶解后含有大量细胞碎片。

图11表示对于316不锈钢静态混合反应器，作为时间函数的葡萄糖摄入率。该反应器在第7天时用MOI1进行感染，并在第28天收获。

图12表示对于在图11中所示的网状静态混合反应器，在连续溶胞产物中的总蛋白质和HAVAg的百分数。对于溶胞产物1-4的记录在下文中描述。由于用低效的PBS洗涤，溶胞产物1的总蛋白质是人为的高。

图13表示MOI对细胞生长和葡萄糖消耗的影响。细胞用含HAV CR326F P28的MOI 0.1和10感染。对于该系统直到感染后第8天未观察到细胞密度（13A）和残留葡萄糖（13B）的差别。在8天时进行全部培养基的再供入。

图14示出根据BSA标准测定的细胞蛋白质与细胞数的关系曲线。用等式Y（10⁴）＝-0.09+0.42X，r＝0.99描述最适合的线。该图证明，一单个曲线提供通过总蛋白质测量MRC-5细胞数目的方法，而与细胞“状态”无关。

图15是图14的重画曲线，指出每个数据点的时间。

图16表示总蛋白质转换成细胞数接近使用Coulter计数器得到的细胞密度，可以认为，这种偏差是由于在收获T-25s（为了一致性使用2×0.08ml/cm²）中使用少量体积的溶解缓冲液造成的。

图17表示经过溶剂萃取步骤纯化，HPSEC处形图（一致性批量生产）。

图18表示经过溶剂萃取步骤纯化，HPSEC外形图（中间规模批量）。

图19表示混合时间对Hep A/杂质比例的影响。

图20表示混合时间对Hep A和杂质面积的影响（振动器，50ml瓶，6分钟）。

图21表示混合时间对Hep A和杂质面积的影响（振动器，500ml容器，2分钟）。

图22表示混合时间和试管体积对Hep A和杂质面积的影响（振动器）。

图23表示溶剂/含水比例对Hep A/杂质比例的影响。

图24表示溶剂/含水比例对Hep A和杂质面积的影响（振动器）。

图25表示混合时间和型式对Hep A/杂质比例的影响。

图26表示用HPSEC确定的甲型肝炎病毒样的稳定性。

图27表示盐对甲型肝炎病毒溶解度的影响（以4次方）。

图28表示盐对甲型肝炎病毒溶解度的影响（以4次方）。

图29表示分子量校准曲线，PW4000xl。

图30表示对数甲型肝炎病毒峰值面积V.对数Hep A浓度。

图31表示甲型肝炎病毒校准曲线。

图32表示过滤的溶胞产物和核酸酶处理的溶胞产物样品的对比，紫外光214nm。

图33表示过滤的溶胞产物和核酸酶处理的溶胞产物样品的对比，紫外光260nm。

图34表示PEG小片再悬浮样品。紫外光在214nm。

图35表示氯仿萃取的含水相样品，该样品来自Rx2011008。

图36表示阴离子交换产物样品，该样品出自Rx2009854。紫外光214nm。

图37表示大小排阻色谱法产物。紫外光214nm。

图38表示出自Rx2011008的SEC产物样品。紫外光214nm。在约49分钟可看到残留峰值。

图39表示11组样品的EIA和HPSEC结果的相关性。

图40表示13个甲型肝炎病毒组中的4个样品的面积百分值。

本发明的工业上适用的纯化过程包括纯化任何甲型肝炎病毒（HAV），不管是由减毒的或强毒的HAV衍生的，还是在任何细胞株、细胞系，对HAV感染敏感的培养物中产生的。此外，所有HAV衣壳，不管空的（没有病毒核酸）还是完整的（包含病毒核酸）都包括在本发明的方法中。

传代28的HAV（P28CR326F′;涉及由CR326产生的变种的分类学，例如CR326F和CR326F′，以及这种术语与绝对传代水平的相互关系，参见Provost等人，J.Med.Virol.，20：165-175，1986）在本发明中仅为所述目的用于感染MRC-5细胞，并且用P29.P28CR326F′培养产生的物质是一种减毒的HAV系。其他被本发明包括的HAV系包括可以用普通技术减毒的HAV系。对HAV繁殖合适的其他细胞系包括Vero、FL、WI-38、BSCI和FRhK6细胞。在细胞培养物中用于HAV繁殖的这些和其他体系在下述文献中已描述：Gerety，R.J.“Active Immunization Against Hepatitis A”，Gerety，R.J.（ed.）Hepatitis A Academic Press 1984，pp.263-276，及Ticehurst，J.R.，Seminars in Liver Disease6，46-55（1986）。原则上任何细胞系，例如任何人的二倍体成纤维细胞系，只要是对HAV感染敏感，都可以用作HAV的宿主细胞。用于疫苗生产的优选细胞系是MRC-5。

本发明的工业规模方法包括下述步骤：

（a）在合适的培养容器和培养基中培养大量甲型肝炎病毒（HAV）：

达到此目的优选方式包括，但不限于，使用适合在人二倍体肺细胞中生长的HAV，该肺细胞适合于疫苗生产。W138细胞或MRC-5是合格的。这些细胞已生长在微型载体上或作为在烧瓶或者辊式瓶中的细胞片生长。本发明的方法使用大表面积、多层生物反应器，如NUNC CELL FACTORY、COSTAR CUBE静态表面反应器（SSR），或者静态混合器反应器，例如在US-4296204和4415670中所述的反应器，或者如本文中在不锈钢、网、静态表面混合器中描述的另一种反应器，这取决所要求的生产规模。因此，在本发明的一种优选的实施方案中，MRC-5细胞生长在85000cm²COSTAR CUBE SSR中的细胞片中，或者甚至更大表面积的网状SSR中的细胞片中，以足以达到使有效的细胞培养物感染的大量HAV的感染物（MOI）进行感染。约0.01-10的MOI是满意的。通过使用来自培养约28天的SSR上清液部分的HAV可方便产生原种。

在一种优选的具体方案中，HAV在生长在不锈钢网上的MRC-5细胞上培养（见实施例14）。按照这种实施方案，使用一种生物反应器，在该反应器中使用由任何合适的无毒材料（细胞能在其上生长）制成的网状单元。上述单元可由不锈钢、钛、塑料或类似材料制，它们可以提供规则三维排列。最好是使用购自Sulzer Biote chSystems（尤其是SMV，SMX，E-PACK EX、DX、BX、CY）的316不锈钢网状单元。每个单元由一个细胞在其上能生长的均匀排列的网层组成。规则网子的每个单元在无菌反应器系统中相互以0-90°角取向排列。结构形状可以是直线圆柱或任何其他适合容纳网状单元并且能形成良好使用容积的几何形状。然后接种细胞，并使之固定在网提供的大表面积上。一旦细胞在培养物中很好定居，就可以足以保持养分交换和消除废产物的灌注速率喂养细胞。在合适的细胞密度下，如下面进一步所述用HAV感染细胞。

网状单元的优点是，纤维床使每单位容积有更大的表面积。几何形状准确的网允许成纤维细胞穿过表面生长至已知和恒定深度，并能控制养分供给。网的均匀性也在纤维之间提供预测的接触点，使细胞迅速迁移以覆盖纤维网。静态混合器的形状控制生长面相互接近，以便防止自然生物生长和反应器“变脏”。这是在任选的填充床反应器中碰到的一个重要问题，在这种反应器中，填充的不均匀性使细胞在局部范围生长，以后这会引起养分减少并接着发生细胞饿死。

应当理解的是，除了HAV的CR326F品系的传代18、p18、p28、p29、p72外，本发明的范围包括任何其他HAV变体或品系，不管减毒的还是强毒的。可以通过细胞、动物中的系列传代，或者其他方法分离减毒的变体或品系。例如参见Provost，P.J.等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.170，8（1982）;Provost，P.J.等人，J.Med.Virol.20，165（1986），US-4164566和US-5021348关于减毒的说明。，本发明的纯化方法是容易的，并且易于适合减毒或强毒HAV品系。

HAV允许在SSR中复制至产生病毒峰值。对于减毒来说，细胞的培养适合HAV品系，例如CR326FP28，细胞培养进行7-35天，这取决于最初的MOI和细胞密度，在这个时间内营养素培养基通过供气体交换的环路连续循环。细胞培养基可以是任何维持MRC-5细胞活性生长和HAV复制的培养基。最好，细胞培养基以约0.010-0.3ml/cm²/天之间的速率补充和去除。因为细胞群的产生速率是完全暴露在培养基之中，这种比率是可变通的。

因此，在本发明的一个优选实施方案中，MRC-5细胞在一个340000cm²SSR（例如使用4个85000cm²的单元）或者甚至更大表面积的网状SSR中的细胞片上生长，以约0.1-1.0HAV的感染物（MOI）的多种性感染细胞，并且HAV允许复制至产生病毒抗原的峰值。这进行大约28天，在这个期间内营养素培养基通过培养容器和提供气体交换的环路补充和循环。培养基可以是任何支持生长或维持MRC-5细胞和HAV复制的培养基。我们已发现，含一种基本培养基，例如威廉培养基E（William′s Medium E），并添加合适的生长因子的培养基是优先选用的。作为生长因子源，我们已发现，优先选用添加铁的小牛血清。

（b）收获培养的HAV

应当指出，收获培养的HAV的方法在某种程度上借助培养容器的几何形状。一般，在用补充营养培养约28天后，取出培养基并收获HAV。在过去，对于小规模生产病毒来说，这是通过刮削，接着冻融和任选的声处理至最佳释放受细胞约束的病毒来完成的。在本发明方法中，受细胞约束的HAV释放到最小体积的收获溶液中。最好收获溶液含有使细胞可向HAV渗透起作用的组分。这样的组分在现有技术中是已知的。最好，将一种去污剂，如TritonX-100、NP-40或一种等效物以最低有效的允许浓度供给，以便以后容易去除。已经发现，供给约0.05-0.5%，而最好是0.1%TritonX-100就足以达到有效地从细胞中萃取HAV，所述细胞是在NUNC细胞制造、COSTAR立方体或者任何其他细胞片培养物中培养的。使用去污剂萃取，尤其是从SSR，如COSTAR CUBE萃取的优点是，这样一种培养容器的几何形状不允许用机械方法收获，除了在能被取出的培养物上清液中发现HAV和HAV被浓缩和回收的情况之外。但是，存在培养上清液中的HAV份数一般仅是从细胞回收的整个HAV的一小部分。从培养的细胞中去污剂收获HAV是高效的。

（c）处理收获的HAV

一旦HAV从培养基上清液、从细胞，或者从两者以基本上无细胞的形式被收获时，最好是将HAV浓缩至便于下游加工和纯化。在已有技术的纯化HAV的方法中，HAV用机械方法收获并且只有少量物质被纯化，用有机试剂，例如二氯甲烷或二氯甲烷∶异戊醇（24∶1，v/v）萃取HAV，接着通过加入水溶性合成聚合物，如聚乙二醇浓缩含水相。现在已经发现，去污剂和外源酶可以用于工业规模分离全部HAV的方法以制备完整的疫苗，并同时将添加物质去除至在纯化制品中不可觉察的微量。

在本发明的一种实施方案中，一种在收获HAV中使用的去污剂，例如Triton X-100，通过浓缩/全过滤来去除，接着例如用AMBERLITE非离子聚合吸附剂，例如XAD去除残留的去污剂。用于所述的去除Triton X-100的有效方法，将其降到约10μg/ml，Hurni，W.M.，和Miller W.J.（Journal of Chromatography，559，337-343（1991））已有报道。通过这种分析，在本发明的这种实施方案的制品中未发现在收获HAV中使用的去污剂。此外，去除许多其他污染物，形成特别纯化的HAV制品。

在本发明的另一个实施方案中，在获得去污剂后，与其进行浓缩/全过滤，不如接着进行XAD处理，在核酸酶处理后接着为了浓缩使用一种阴离子交换俘获步骤。

在这种实施方案中，最好使用一种非特性的、高比活度和高度均匀的核酸酶。非特性保证劈开DNA和RNA，而酶的均匀性保证只有一种酶被加入，而不加入其他蛋白质的污染物。而且更好的是，在本发明方法中，由于是抗去污剂的核酸酶，因此它可以直接加入去污剂收获的HAV。许多核酸酶的任一种都可以满足这上结要求。但是，按照Nycomed Pharma A/S（丹麦）制备的BENZONASE作为一种重组蛋白已显示对此目的是特别优先选用的。已经发现，加入0.1μg-100μg/L之间的，最好是约10μg/L的收获的HAV，对于去除污染的游离核酸是合适的。

添加最低量的酶对于在下游处理步骤中促进随后去除酶是重要的，以产出具有不可觉察的残留酶水平（低于约10pg/ml）的制品。

因为核酸酶处理发生在较稀的溶液中，所以我们业已发现，通过在一种稀的（90-150mmol）盐溶液中进行阴离子交换色谱分离，并随后通过一个添加约1.5柱容积的较高离子强度（≥约0.3mol）溶液的步骤进行洗脱HAV，对于俘获HAV是合适的。通过这种俘获步骤浓缩HAV，而且此外，大量去污剂、BENZONASE和许多其他污染物流过这个柱。因此，自俘获柱洗脱出的HAV是部分纯化的。在已有技术中已知的许多离子交换树脂中的任一种都可以用于这个步骤，包括那些列举在EP-0468702A2中的。我们已发现，一种为此目的特别优选的树脂是使用DEAETOYOPEARL 650M（Tosohaas）。

（d）HAV浓缩

在HAV收获和浓缩/全过滤/XAD或核酸酶处理/俘获后，用一种对浓缩蛋白质有效的水溶性合成聚合物浓缩HAV。分子量在约2000道尔顿和12000道尔顿之间的聚乙二醇（PEG）对此目的是有效的。典型的是，将NaCl加入部分纯化的HAV中至最终浓缩在约150mmol和500mmol之间。然后加入PEG，至最终浓缩在约2%（v/v）和10%（v/v）之间，最好是约4%。离心分离所产生的4%PEG沉淀的部分纯化的HAV，排出上清液并为进一步处理而再悬浮该小片。我们已发现，在该步骤排出的上清液中的主要污染物被去除。去除蛋白酶以提高经过提纯残余物的HAV制品的产量、稳定性和纯度。再悬浮的PEG小片任选地进行声处理，以促进在如下所述的有机萃取之前溶解。

（e）有机萃取

来自上述的再悬浮PEG小片通过加入含1-6个碳原子的卤代低级烷烃，例如二氯甲烷、氯仿、四氯乙烷、或其他同类的东西等，以及消泡剂，例如异戊醇进行萃取。卤代低级烷烃与消泡剂的体积之比在约15∶1和50∶1之间，最好是在约20∶1和30∶1之间。申请人已发现，有机萃取显著提高最终HAV制品的纯度。对于该步骤的有机萃取来说，氯仿胜过二氯甲烷。

这样的萃取去除了其他污染物中的类脂和类似脂类的物质。因此，再悬浮的PEG小片用各种缓冲液中的任一种进行稀释，该缓冲液包括磷酸盐缓冲盐水、TRIS、碳酸盐、碳酸氢盐或乙酸盐缓冲液。因为HAV衣壳在弱酸性条件下是稳定的，所以缓冲液在微酸性pH范围是允许的。一种优先选用的缓冲液是TNE（10mmol TRIS-HCl，pH7.5，150mmol NaCl，1mmol EDTA）。磷酸盐可以用来TRIS-HCl。

最好，再悬浮的PEG小球通过加入氯仿/异戊醇（24∶1，v/v）并且有机物与水的比在约0.5∶1和3∶1之间，用强涡流进行有机萃取。然后萃取液通过在20、4000g离心分离10分钟进行澄清。保留水相，用某一体积的TNE或相当于约0.3和0.6之间的有机样品体积的缓冲液再萃取界面和有机相，并合并两个水相，产生萃取的PEG小片。

溶剂萃取步骤在甲型肝炎病毒纯化过程中起关键作用，这种纯化过程是通过在界面上沉淀蛋白质杂质以及将类脂萃取到溶解相中来进行的。在一致性的批量生产期间，通过这种萃取达到的相当大的纯化可以从图17中的HPSEC色谱分离得知，在该图中在23分的杂质峰值是研究通过这种步骤去除杂质的一个有用标志。相反，当在较小规模的中间批量时，这个峰值的大部分保留在萃取出的制品中（图18）。为了了解和控制在按比例扩大时的这一步骤，研究了一些可变因数：即在不同尺寸的管和瓶中研究溶剂与水的体积比、振动类型、混合时间和混合强度（参见实施例15）。

（f）离子交换色谱分离

上面所述的萃取液在树脂、凝胶或基体上经受阴离子交换色谱分离。典型的阴离子交换基体包括（但不限于）：

DEAE纤维素，

DEAE琼脂糖，

DEAE凝胶过滤剂，

DEAE葡聚糖，

DEAE交联葡聚糖凝胶，

DEAE琼脂糖凝胶，

氨己基琼脂糖凝胶，

Ecteola纤维素，

TEAE纤维素，

QAE纤维素，

单Q，或

苯甲酰化二乙氨乙基纤维素。

一种优选的阴离子交换基体是DEAE TOYOPEARL 650M（Tosohaas）。关于离子交换色谱分离的一般基本知识报导例如可以在E.A.Peterson，“Cellulosic Ion Exchangers”，在Work，T.S.等人，Laboratoy Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Volume 2，Part Ⅱ，Pages 223 et seq.North-Holland 1970中找到。

稀释有机萃取的再悬浮PEG小片，如果需要，使用10mmol TRIS，1mmol EDTA，pH7.5，或等效的缓冲液，如果需要去除污染的游离核酸，添加形成NaCl浓度约为0.3mol和0.35mol之间的NaCl。在这些条件下，HAV以过滤方式通过柱。但是，如果HAV的制剂预先用核酸酶进行处理，则在下个步骤的预处理中，用0.1mol和0.15mmol之间的NaCl，优先选用0.12mol NaCl进行有机萃取。

在上述NaCl摩尔浓度下，HAV衣壳粘附于阴离子交换基体，而中心保留的污染物，例如碳水化合物通过基体。用几个柱体积的0.12mol NaCl洗涤柱，以进一步去除保留的污染物。然后用约1柱体积加0.35mol NaCl的有机样品体积洗脱来自阴离子交换柱的HAV衣壳。任意地并且最好是借助梯度洗脱将HAV洗脱达约1mol NaCl或等效盐，并且HAV在约0.3mol NaCl洗脱。

（g）凝胶过滤

在阴离子交换色谱分离后跟着进行凝胶过滤色谱分离的最后步骤。典型的是使用琼脂糖凝胶CL-4B（Pharmacia），但是许多其他种类的凝胶过滤基体可以代用。例如参见Fischer，L.，“Gel Filtration Chromatography”，in Work，T.S.等人，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Elsevier（1980）。我们已发现，在该步骤中为了纯化HAV使用一种特别优选的方法，大小排阻色谱法。这包括在TOYOPEARL HW555和HW655串联柱上洗脱尽可能小的阴离子交换纯化的HAV样品体积。

虽然在阴离子交换色谱分离步骤的特有顺序之后再加上凝胶过滤是在本发明中用于纯化HAV衣壳的典型记录，但应当理解这个顺序是可以改变的。例如凝胶过滤可以在阴离子交换步骤之前。我们已发现，前面的顺序是优先选用的。

（h）HAV沉淀

在大规模生产HAV过程中的一个完全意想不到的发现涉及作为按照本发明生产的大量HAV的结果而存在的病毒的溶解度。我们已发现，在0.25-0.3mol盐浓度下（以此浓度由离子交换柱洗脱HAV），如果HAV浓度在约10-20μg/ml以上，就出现病毒沉淀。这是通过代表性样品的HPSEC分析发现的，这种代表性样品表明，氯仿萃取的水相（AQX）和大小排阻产物（SEC）在4℃储藏是极稳定的，但是阴离子交换产物（IEX）却显示在4℃储藏时显著损失甲型肝炎病毒。

为了证实这个发现，用第二组样品进行稳定性研究。AQX、IEX产物和SEC产物一产生就马上用HPSEC分别进行分析（重复三次）。然后通过所产生的峰的面积与SEC甲型肝炎病毒校准标准物进行对照测定甲型肝炎病毒浓度。此外，IEX产物的一个等分部分用磷酸盐缓冲盐水（0.12mol NaCl，6mmol磷酸钠，pH7.2）稀释到1∶5，并且立即进行测定。用HPSEC在整个几天内监测这4种样品在4℃的稳定性。

下面给出最初甲型肝炎病毒浓度和4-5天后所得数值，这些数值是关于几个甲型肝炎病毒纯化流程样品的。

样品最初Hep A 4天Hep A

浓度(μg/ml) 浓度(μg/ml)

AQX 23 21

IEX产物 59 50

IEX产物稀释成1:5 12 10

SEC产物 12 12

全部结果包括各中间时间点示于（图）26中。

正如所看到的第一组情况那样，IEX产物显示显著的甲型肝炎病毒损失，储藏过夜发生约25%的损失（甲型肝炎病毒浓度从59μg/ml降至45μg/ml）。

稀释的IEX产物和AQX显示更大的稳定性，经过第一个100小时储藏，甲型肝炎病毒仅损失约10%。SEC产物显示设有甲型肝炎病毒损失，基本上得到与第一组相同的结果。

这两组之间的一个差别是第二组形成明显的沉淀物。沉淀物的出现以在SEC步骤之前离心分离全部IEX产物为条件。这种离心分离导致沉淀的甲型肝炎病毒大量损失;在离心分离后浓度是29μg/ml。下面示出由HPSEC数据计算出的数据表。

样品 Hep A总mg 步骤产率取样后HepA,mg

AQX产物 12.9 11.7

IEX产物 12.3(最初量) 105% 8.7

离心分离的IEX产物 4.2 48% 4.2

SEC产物 2.0 49% 1.4

意想不到的低SEC产率暗示，聚集或沉淀可以发生在SEC柱上。实际上某些聚集物通过HPSEC可观察到。在较小一组的串联SEC柱上色谱分离（在完成预备的IEX之后立即进行）的IEX产物的7ml样品显示于71%的甲型肝炎病毒回收率，这对于该步骤是比较典型的。因为这个样品在离心分离时不遭受甲型肝炎病毒损失（因为它还没有沉淀），71%的产率是以现有的从IEX到SEC产物的生产规模所得到的产率的约3倍。较小规模的串联SEC造成大得多的稀释因素，这可导致较高的产率。

意外地发现，在纯化与病毒损失相符的这些组的期间通过HPSEC得到的沉淀物可溶于低离子强度的水溶液（例如6mmol磷酸钠），使得这种沉淀是可逆的。通过添加6mmol磷酸钠沉淀物重新溶解，沉淀物发生迅速溶解。与此相反，沉淀物在120mmol氯化钠和6mmol磷酸钠中或较高离子强度溶液中的再悬浮几乎没有变化。根据HPSEC的保留时间，溶解在6mmol磷酸钠中的沉淀物作为单体甲型肝炎病毒是相同大小的，而具有银染色斑点的SDC-Page表示溶解的沉淀物在最终SEC产物中具有可见的相同蛋白频带。根据这个数据甲型肝炎病毒的纯化已改进到包括稀释离子交换产物，以防止沉淀物损失（见实施例16），使得1∶1的稀释造成盐浓度达到约0.15mol或更低。更且最好是达到低于20μg/ml的HAV浓度。

（i）HPSEC一致性测定

高效大小排阻色谱法（HPSEC）测定已扩大到测量取自甲型肝炎病毒纯化进程的样品中的甲型肝炎病毒浓度和杂质含量。

已经分析了按照本发明制备的整个14组的甲型肝炎病毒处理过的样品，所得的基本数据已用于表征每个纯化步骤的甲型肝炎病毒含量和污染物的图形。HPSEC与EIA数据相比，有效数据证实这种检定的精确性和正确性，HPSEC检测条件和取自10组HPSEC的分析结果示于实施例17和图29-46。

（j）疫苗失活和配制

为了疫苗应用，传统的和众所周知特性的附加处理步骤对于制备纯化的HAV衣壳是需要的或可能是需要的。例如，用福尔马林处理、无菌过滤和吸附至载体或辅助剂上是制备福尔马林失活疫苗的典型基本步骤。例如，参见Provost，P.J.等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.160，213（1979）;Provost，P.J.等人，J.Med Virol.19，23（1986）。HAV可以通过加热、改变pH、照射、用有机溶剂，例如福尔马林或仲甲醛处理而失活。典型的是，以1/4000比例的福尔马林进行HAV失活。我们已发现，在四倍标准浓度下福尔马林失活进行得更快和有效，而1/1000的福尔马林失活进行得更快和有效，而1/1000的福尔马林浓度在设有相反作用的免疫原性下失活时间减少四倍。然后吸附失活的HAV或用提供辅助剂和载体作用的氢氧化铝共沉淀失活的HAV。

因为为了这种制品的免疫功效所需的剂量是极少的，所以易于配合纯化的HAV或命名其吸附到载体上。已经发现，氢氧化铝对于形成含HAV的牢固配合物及防止容器壁上的病毒损失的目的是非常满意的。

因此，本发明揭示一种工业规模制备大于95%HAV蛋白质纯度的甲型肝炎病毒的方法，该方法包括下列步骤：

a）在大表面积的静态表面反应器中的细胞片上培养大量甲型肝炎病毒，

b）在基本上不去除、溶解或破坏细胞片培养物的情况下，通过去污剂渗透细胞片，以使甲型肝炎病毒从细胞培养物释出，使甲型肝炎病毒从细胞片放出，

c）或者通过核酸处理或者通过离子交换吸附核酸，任选地在该步骤中从收获的HAV中去除非甲型肝炎病毒特性核酸，

d）使用薄膜和全过滤，或者通过离子交换俘获浓缩由细胞培养物分离出的甲型肝炎病毒，

e）通过有机萃取、PEG沉淀、离子交换、接着是作为最终精加工步骤的凝胶渗透色谱分离的结合，去除来自步骤d）的浓缩甲型肝炎病毒的残留的非甲型肝炎病毒特性的蛋白质，如果在步骤c）中未预先完成的话，上述离子交换包括去除污染的核酸，以及

f）回收来自步骤e）的纯化甲型肝炎病毒。

在本发明的一种优选的实施方案中，用于工业规模生产失活的甲型肝炎病毒菌苗的方法包括下列步骤：

（a）在NUNC CELL FACTORIES、COSTAR CUBES，或甚至更大表面积的静态表面生物反应器中大量培养甲型肝炎病毒（HAV），在该生物反应器中MRC-5细胞的细胞片已固定在规则排列的实体不锈钢、钛上或钛不锈钢网上，

（b）通过去除培养基和添加含有约0.05-0.5%、最好是0.1%的Triton X-100的收获溶液来收获已培养的HAV，

（c）用核酸酶处理收获的HAV，以消化污染的细胞核酸。

（d）通过在离子交换柱上俘获，用约0.35mol NaCl洗脱俘获的HAV和接着用聚乙二醇沉淀来浓缩核酸酶处理过的HAV，

（e）在伴随强烈搅拌下，用氯仿/异戊醇（24∶1，v/v）萃取浓缩的HAV，并进行分离和保留水相，

（f）在离子交换基体上，以约0.12mol NaCl色谱分离来自有机萃取的水相，并用达较高NaCl浓度（1mol是合适的）梯度洗脱HAV，并且立即稀释洗脱的HAV的汇集物，使盐深度约为0.15mol或更低，最好HAV浓度约为20μg/ml或更低，

（g）在大小排阻色谱分离树脂上、最好是在串联排列的TOYOPEARL HW55S和HW65S上色谱分离来自离子交换的HAV，在该色谱分离中HAV进入基体所包含的体积，

（h）通过用1/1000的福尔马林处理，使凝胶过滤的HAV失活，接着无菌过滤，与氢氧化铝共沉淀，并配制成相当于每剂量约25ng-100ng失活纯化HAV的单位剂量。

在本发明中所得到的HAV是高纯化的，而且是高抗原的。该制品是纯化的甲型肝炎病毒制剂，根据SDS PAGE和银染色法分析，在该病毒中大于95%的蛋白质是甲型肝炎病毒特性物，而低于0.1%制剂物质是非HAV核酸，低于4%的是类脂。在制品的水解样品中作为葡萄糖可觉察的碳水化合物是所存在蛋白质物质的约0%和200%，而非葡萄糖碳水化合物是以低于蛋白质物质的15%存在。在优选的实施方案中，葡萄糖和非葡萄糖碳水化合物，例如核糖，以低于约蛋白质物质的20%存在。当制剂是福尔马林失活时，这种制剂保持其免疫原性。

少量失活病毒足以引出保护性免疫应答。最好是在几个月期间内一次、两次或三次按25-100ng的剂量给药，这对于增加抗HAV免疫应答的高滴定度是需要的。

纯化的甲型肝炎病毒制剂具有下述性质，同时根据以每μg蛋白质为基准报道各种性质，圆括号内的方法用于测定各特性：

a）类脂含量（气相色谱法）：＜0.1μg

b）由葡萄糖确定的碳水化合物：（TFA

水解，Dionex）＜0.1μg-2.5μg

c）非葡萄糖碳水化合物：＜0.2μg

（TFA水解，Dionex）

d）甲型肝炎病毒特性蛋白质：＞0.95μg

（氨基酸分析和西方印迹）

e）甲型病毒特性RNA： 0.1-0.2μg

f）污染的DNA：＜0.0004μg

在制品中存在的含有原葡萄糖的碳水化合物，从失活的配料疫苗的耐受性、免疫原性和保护性功效来看，认为是无意义的。但是，在制品中非葡萄糖碳水化合物含量（多半是来自HAV特性RNA降解的核糖）是很低的，这却是有意义的。而且值得注意的是，由于生产大量足够允许进行相应检定的制品的方法的发展，解释本文可报道的性质仅仅成为是可能的。

在本发明的一个特定的配制剂中，甲型肝炎病毒疫苗具有下述额定组分（每25-100单位/0.1-1ml剂量）：

组分	含量
		氯化钠	900-9000μg
铝	50-500μg
		四硼酸钠	3.8-38μg
甲醛	＜0.4μg
		葡萄糖（聚合物）	0-1000ng
蛋白质	25-100ng
		氯仿	＜44ng
HAV RNA	2-20ng
		非葡萄糖碳水化合物	0-20ng
脂肪酸	220ng
		新霉素	＜4ng
MRC－5 DNA	＜0.03ng
		牛血清清蛋白	＜0.1ng
BENZONASE	＜0.0001ng

在另一个特定配制剂中，甲型肝炎病毒疫苗具有下述额定组分（每25单位/0.5ml剂量）：

组分	含量
		氯化钠	4500μg
铝	250μg
		四硼酸钠	19μg
甲醛	＜200ng
		葡萄糖（聚合物）	＜20ng
蛋白质	25ng
		氯仿	＜22ng
HAV RNA	5ng
		非葡萄糖碳水化合物	4ng
脂肪酸	＜1ng
		新霉素	＜0.5ng
MRC－5 DNA	＜0.005ng
		牛血清清蛋白	＜0.02ng
BENZONASE	＜0.00002ng

已经发现，本发明的纯化失活甲型肝炎病毒，当给药25ng（相当于上述配制剂之一的25单位剂量）的样品时，根据EIA分析与特点在于氨基酸分析的参考标准比较，对预防感染是有效的。在认为是与疫苗相关的健康成年人、青年人或儿童中未观察到一系列不利的体验，从6至50单位范围的剂量已给药与成年人、青年人和儿童。由于提高给药剂量，更快、更高的血清转化率已在成年人中观察到。这种现象在儿童中不明显。

一个单独的25单位剂量给药后一个月，83%的成年人（≥18岁）和97%的儿童及青年人（2-17岁）血清转化。25单位的两个剂量给药两周间隔时，在达93%的成年中提高了血清转化率。在第二或第三个25单位剂量给药后七个月的血清转化导致两个年龄组中大于99%的血清转化。在两个年龄组中，血清阳性的持久性是约100%达到直到12个月和36个月。因此，显然一个单独的25单位剂量，在免疫接种的一个月内就足以在任何接种人群的至少80%中达到血清转化。用更大剂量进行免疫接种，在更高的接种者百分数中诱发血清转化。

按照25ng的剂量，一个单独COSTAR CRBE可按照本发明的方法收获，产生约5000和10000个之间或更多个的剂量。该方法也适合于同时收获和操作几个COSTAR CUBES。具有或不具有增加表面积网的单独SSR使得在每个生产运转期产生极大量的剂量。

下述实施例供举例说明本发明的特定实施方案，但是这些实施例不应解释为实施本发明各步骤的唯一模式。

实施例1

甲型肝炎病毒母种的生产

生产病毒种的大规模方法包括在6000cm²的NUNC CELL FACTORIES中感染MRC-5细胞单细胞层。MRC-5细胞在生产装置中生长至会合的单细胞层，然后以约0.1的MOI病毒感染。在感染后细胞用每周更换一次的含10%（v/v）的胎小牛血清的培养基培养28天。已经发现，2-10%（v/v）的高浓度血清比用低含量的0.5-2%（v/v）能产生更多的病毒。在这个周期结束时，上清液流体含有大量有传染性的病毒，在本实施例中每毫升有10^7.3TCID50，它是直接从NCF收获的，没有细胞溶胞，用作病毒母种源。以这种方式，为生产所必须的大量有传染性的病毒由比辊式瓶或烧瓶或用机械收获细胞更可再现和更容易的大规模方法得到。

实施例2

疫苗生产的按比例扩大

为了支持阶段Ⅲ（PhaseⅢ）的临床研究，实验室过程的按比例扩大成为甲型肝炎病毒疫苗生产需要考虑的重要问题。为了便于按比例扩大生产过程，需要改进以前已知的HAV繁殖和纯化过程。两种主要的细胞繁殖方法是使用NUNC CELL FACTORISE和静态表面反应器，例如COSTAR CUBE。本实施例叙述NUNC CELL FACTORY方法。实施例3叙述COSTAR CUBE SSR方法。

Nunc细胞装置用于Monroe功效研究

已研究一种修改的生产过程，它使比以前已知方法更大量生产减毒甲型肝炎病毒的改进的按比例扩大的方法成为可能。这最初是用NUNC CELL FACTORIES（NCF）代表标准辊式瓶完成的。NUNC CELL FACTORY（NCF）的基本单元是培养面积为600cm²的浅盘。构成NCF的浅盘是由聚苯乙烯制成的，为了最佳的细胞附着和扩展进行了处理（Maroudas，1976，J.Cell Physiol.Vol.90，pp.511-520）。本文所述的10个浅盘单元具有10个相同的培养单元（浅盘），其总表面积是6000cm²。在两角有专门设计的形成垂直管的开孔，该管将浅盘连接在多层中。这些垂直管结尾于两个接收空气过滤器的转接器和一个专门设计的聚四氟乙烯（Teflon）连接器。所有单元经照射消毒并随时可以供生产使用。

在NCF中的MRC-5细胞环境十分类似于在滚动瓶中存在的环境。这些细胞在静培养物中生长，这种静态培养物具有细胞附着在被液体培养基覆盖的固态基质上，并且向细胞供给营养素和氧气是借助扩散。尽管与在滚动瓶生产中的条件极为相似，但NCFs提高操作再现性。但是，如下面进一步所述那样，收获和下游处理方法是不同的。

实施例3

COSTAR CUBE静态表面反应器用于工业规模生产方法

在整个生物反应器具有良好环境控制之后，进一步按比例扩大的任务是每个反应器尽可能达到更大的表面积。NUNC CELL FACTORIES向该任务提供一种不完全溶液。较好的溶液由COSTAR CUBE和STATICMIXER静态表面反应器（SSRs）供给。前者由在一个灭菌塑料管（COSTAR CS2000）中的致密填充聚苯乙烯塑料片构成。在单个管中可达到总量为85000cm²的有用生长表面（与10个浅盘NUNC CELL FACTORY的6000cm²相比）。在US-4296204和4415670所述的后来的反应器中，金属、陶瓷、玻璃或塑料的静态混合单元形成致密填充的生长表面;这些单元可以制成和布置成比在用于大生产过程中的单个反应器中的COSTAR CUBE提供更大的表面积。已经成功地在两种类型的反应器中培养HAV。SSR有一个循环回路，它允许培养基循环，并通过一个为了调节培养基中的pH和溶解的气体含量的充气器补充营养素，以满足培养物对氧气的需求，并使培养基充满。这种最佳化在辊式瓶或在NCF中是不可能的。此外，为了改进大量主要原材料的利用率可以改变培养基。添加铁的小牛血清（Cat.A-2151，Hycolone Laboratories，Inc.，Logan，UT or equivalent）已经成功地用于代替胎牛血清。

实施例4

利用Triton溶胞从NUNC CELL FACTORIES或静态表面反应器收获甲型肝炎病毒

NUNC CELL FACTORY和静态表面反应器都不适合于机械刮削分离MRC-5感染的细胞片。使用Triton细胞溶解有效地回收联结细胞的甲型肝炎病毒，并且用新方法进行纯化。用Triton溶胞方法得到的溶液比从滚动瓶的机械刮削得到的制备液更稀。通过全过滤浓缩Triton收获物，接着用吸附剂XAD进行处理，以去除残留的Triton。使用毛细区带电泳在过程中的检定已证实Triton消除至低于10μg/ml。然后用聚乙二醇（PEG）沉淀HAV，用氯仿：异戊醇萃取。使用DNA过滤柱，接着利用阴离子交换和大小排阻色谱分离去除污染的DNA。包括NCF繁殖和Triton溶解两者的方法都不会有害地影响纯化的福尔马林失活的甲型肝炎病毒疫苗的免疫原性。

实施例5

核酸酶处理和俘获色谱分离

该方法的可测量性、生产能力和一致性通过用核酸内切酶处理Triton收获物，接着通过阴离子交换的俘获色谱分离使病毒浓缩来提高（见图1）。这种改进避免了对浓缩全过滤步骤、XAD处理和DNA过滤柱的需求。

选择一种有效地既抗RNA又抗DNA的非特性核酸内切酶。这种核酸内切酶，即BENZONASE是从萎谢沙雷菌（Serratia marcescens）离析出的，并在大肠埃希杆菌（Escherichia coli.）中克隆。它是以极高纯度生产的，按照Nycomed Pharma A/S（丹麦）很好表征了重组蛋白质。选择这种特殊核酸内切酶，部份地是因为它有很高的特殊活性并可以很小的量（10mcg BENZONASE/L收获物）直接加入未加工的Triton收获物中。已经开发出使用用于BENZONASE特性蛋白质的西方印迹和用于酶活性动态测定的试验方法，以测量通过纯化过程去除的酶。对于在洗涤中和在阴离子交换色谱分离俘获步骤的流过部分中添加的核酸内切酶活性的大部份（＞90%）可以计算（下面叙述）。BENZONASE含量比在俘获柱产物中减少到小于1%。

实施例6

附加的工艺步骤

a）俘获步骤

来自核酸酶处理的Triton收获物中的甲型肝炎病毒，在以低离子强度填充的阴离子交换柱上浓缩，用0.3～0.5mol氯化钠溶于磷酸盐缓冲液中的溶液来分级洗脱。甲型肝炎病毒由该俘获步骤浓缩30倍，而Triton降至不可检测的含量，这由处理过程中的CIE测定来测定。

b）PEG沉淀和氯仿萃取

由浓缩/全过滤/XAD或从俘获柱洗脱得到的甲型肝炎病毒用聚乙二醇（PEG）沉淀。在适当的条件下，该步骤是高选择性的，并且主要的污染物（它用另外的方法与病毒共纯化）保持可溶性，并在上清液部分中被去除。将含有病毒的PEG沉淀物再悬浮，然后用氯仿∶异戊醇（24∶1）萃取，以去除被氯仿变性的可溶性类脂和蛋白，它们存留在水相和有机相之间的界面处。

c）阴离子交换色谱法和大小排阻色谱法

将氯仿萃取步骤的含水萃取物加到低盐的阴离子交换柱上，随后用梯度至1.1mol盐的NaCl洗脱。最终大小排阻色谱法步骤产出高纯化的病毒制品（见图2）。

d）失活

为了抗原浓度接近剂量含量，已经预先用93μg甲醛/毫升（1∶4000的甲醛水），在37℃下进行甲型肝炎病毒的甲醛失活。在这些条件下，病毒的失活遵循一级衰变动力学，具有约2小时的半存活期，这相应于每天丧失约3.5log₁₀ ^TCID ₅₀（50%组织培养基感染剂量）。在两天后可达到病毒感染性降低7logs，但失活时间延长到20天，以保证病毒已完全失活的大安全极限。

小规模的实验表明，增加甲醛的浓度提高失活率，按照ICID₅₀损失来测量失活率。失活率与甲醛的浓度按比例地变化，如对失活的伪一级动力学所预料的那样。对二百剂量当量的组织培养试验证明，在37℃用370μg/ml甲醛（1∶1000甲醛水）培育病毒5天，则完全失活。因此，这些修改的失活条件像以前使用的那些条件一样提供安全限度。这一点已经由在相同条件下产生三种大的实验性规模（pilot-scale）的失活，随后用氢氧化铝吸附以产生用于临床试验的疫苗而得到证明。该失活率约是先前以较低浓度甲醛观测到的失活率的4倍，这与小规模研究符合的非常好。将这两次氢氧化铝吸附的疫苗样品在小鼠中作免疫原性试验，对每个小鼠ED₅₀类似于以前的疫苗（小于2ng）。

e）氢氧化铝吸附

通过将甲醛水失活的病毒与氢氧化铝共沉淀而将其吸附到氢氧化铝之上。用于临床制备的所有方法基本相同，而仅有的改变是在甲醛水失活的本体溶液中病毒的浓度。将失活的病毒直接沉淀到氢氧化铝上是通过首先把硫酸铝钾加入甲醛水失活的本体溶液中而进行的。最后，加入氢氧化钠形成沉淀。通过去除浮在悬浮液上面的液体层而除掉甲醛和残余的盐，并且用生理盐水来代替。

实施例7

HAV制品的纯化

在纯化过程监测中使用分析大小排阻色谱法（HPSEC）、EIA和蛋白以及SDS-PAGE，以保证始终产出高纯度疫苗。HPSEC提供了在核酸酶处理过程中监测核酸损失以及在该过程后来的步骤中对纯度评定的手段。图2中的色谱表明，在PEG沉淀物中相应于甲型肝炎病毒的峰是明显的。在溶剂萃取步骤中甲型肝炎病毒富集，并然后在离子交换步骤中浓缩。最后的凝胶过滤形成高纯化的（＞95%，通过SDS-PAGE和银着色得出）甲型肝炎病毒的制备。当独立的测量纯度时，HAV制品在HPSEC分析中是一个单独包括的对称峰（见图2、37和38）。

Ⅱ.杂质的清除

处理过程中试样的CZE分析表明，Triton通过Monroe方法中的浓缩完全过滤步骤和制备过程中的俘获柱而被去除。在阴离子交换制品中存在的BENZONASE量低于可探测的量（＜18fg BENZONASE活性并小于13pg BENZONASE质量/25单位剂量甲型肝炎病毒;在该检测中的探测极限是12.5pg）。

实施例8

通过Triton溶解：Monroe试验纯化由NUNC CELL FACTORIES或静表面生物反应器得到的甲型肝炎病毒

基本上如实施例2中所述，用NCFs繁殖HAV。于37℃，MRC-5细胞在一组60个的6000cm²NCF's中，用含有10（v/v）胎牛血清和新霉素硫酸盐补充的William's培养基E的培养基生长7天。在第7天，用含有足量病毒的新鲜培养基喂养该细胞，以0.1MOI来感染该培养物，并将其转移到32℃环境。于32℃，每周喂养一次进一步培养该培养物21天。通过用含0.1%TritonX-100、10mmol TRIS、1mmol MgCl₂的pH7.5的溶解缓冲液处理细胞片来收获HAV。将由NCF's得到的溶胞产物汇集，并在进一步加工之前冷冻。

将通过用TRITON X-100处理而由NUNC CELL FACTORY培养物得到的4升冷冻的甲型肝炎病毒于20-30℃水浴中解冻4小时，然后过滤。在Pellicon装置上用300，000分子量的切断膜将过滤的溶胞产物浓缩10倍。随后将约400ml浓缩的溶胞产物逆着含150mmol NaCl和1mmol EDTA的10mmol Tris-HCl缓冲液（pH7.5）完全过滤。通过以每毫升溶胞产物使用30毫克AMBERLITE XAD-4（Rohm和Hass公司产）聚合树脂的批量处理将Triton去除。在过滤去除XAD-4后，将溶胞产物调整到510mmol NaCl，然后通过加入聚乙二醇（PEG8000，Sigma）而沉淀为5%（v/v）最终浓度。将混合物用力摇动，于4℃培养1小时，然后在4℃，以1000xg离心分离10分钟。离心分离后将上清液去除并废弃。

然后将沉淀物溶于含120mmol NaCl和1mmol EDTA的6.2mmol磷酸钠缓冲液（pH7.2）中。然后用等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1，v/v）混合物萃取再悬浮的片状物。将混合物用力摇动，然后在20℃，以3000xg离心分离10分钟。使用30%初始体积的相同有机溶剂混合物反萃取含不溶物的界面。在离心分离后，合并两种水相。然后将氯仿萃取物调整到350mmol NaCl，在DEAE-Sepharese（琼脂糖凝胶）CL6B（Pharmacia）上以过滤方式进行色谱分离，以吸附DNA。收集含HAV的柱的流过级分，并用6.2mmol磷酸钠缓冲液（pH7.5）洗脱3次，并在TOYOPEARL DEAE 650mmol（Toso Haas）上色谱分离，用梯度洗脱至1mmol NaCl。以15-30%的1mol缓冲液洗脱的甲型肝炎病毒相当于10-30mS。由该区域汇集的级分随后在Sepharose CL4B（Pharmacia）上，以具有120mmol NaCl的6.2mmol磷酸钠缓冲液进行色谱分离。对该柱的装填设计为大于1%，但小于5%的柱体积。洗脱得到为产物在46%和64%总柱体积之间。

将最终纯体物进行0.22微米的无菌过滤，并在37℃用1∶4000甲醛水试剂（甲醛水是37-40%重量的甲醛）失活20天。这些条件呈现具有2小时半存活期和约3.5log10 TCID₅₀/24小时损失的一级衰变动力学。该失活期延长至20天，以保证大的安全限度。将硫酸铝钾加到失活甲型肝炎病毒中，然后该溶液通过加入氢氧化钠至pH6.6-6.8而沉淀。通过离心分离去除甲醛和残余盐，在离心分离中去除上清液并用生理盐水代替。

实施例9

甲型肝炎病毒的纯化，用Triton X-100从COSTAR CUBES收获，用核酸酶处理和俘获色谱法：生产规模的工艺过程

使用用于病毒繁殖的SSR方法来制备生产规模的物质。在该方法中，COSTAR CUBE用作细胞生长面;将CUBE用外部环路和驱动培养基流动的泵与COSTAR CS2000曝气器连接，如实施例3所示。将MRC-5细胞接种到COSTAR CUBE SSR中，并于37℃生长7天。在细胞引种两天后开始灌注。用补充有10%（v/v）加铁的小牛血清和新霉素硫酸盐的William's培养基E连续灌注反应器。反应器的pH控制在6.9和7.6之间，反应器中溶解的氧在培养基中空气饱和度的15%和100%之间变化。允许细胞生长7天整，以约0.1MOI将病毒引种到反应器中，使用按照实施例1方法制得的病毒毋种。将SSR温度降至32℃，并连续喂养21天。然后使SSR排出培养基，再注入0.1%（w/v）TRITON

、10mmol TRIS 、pH7.5缓冲液，以释放HAV。在COSTAR CUBE系统中用这种方法制备的4组病毒如在实施例10中所示，根据表面积，HAVAg制品平均2.8倍于在NCF反应器中用Monroe繁殖方法而得到的以往平均值。增加SSR生产率可以容易地将繁殖过程按比例地扩大为生产规模。

用BENZONASE处理该原溶胞产物，以从核酸加合物中稀放出病毒，随后用阴离子交换色谱法俘获病毒。该BENZONASE处理省去了所需的浓缩/完全过滤步骤、XAD-4处理及DNA过滤柱（见实施例8）。

在有1mmol MgCl₂存在下，用每升溶胞产物5-25μg BENZONASE处理25升COSTAR CUBE Triton X-100收获物，然后通过0.22微米过滤器过滤。于25℃将该混合物培养18小时。将酶处理的溶胞产物加到TOYOPEARL DEAE 650M阴离子交换柱上，该柱用含90mmol NaCl的4.7mmol磷酸钠缓冲液（pH7.2）平衡。用含0.35mmol NaCl和1mmol EDTA的6.2mmol磷酸钠缓冲液洗脱甲型肝炎病毒（约800ml）。将利用酶活性动力学检定的试验方法发展成在该方法中监测酶的去除。结果表明，在俘获柱洗涤和流过的级分中大于90%的核酸内切酶活性可以计算出。另外，在俘获柱产物中总核酸酶活性，包括加入的BENONASE，与开始存在于溶胞产物中的量相比降低＞1/100。

将由俘获柱得到的甲型肝炎病毒产物的NaCl浓度调至420mmol，该病毒用最终4.5%浓度的聚乙二醇（PEG8000，Sigma）进行沉淀。将混合物用力搅拌，然后在4℃培养1小时。培育之后，在4℃，通过以1000xg离心分离10分钟收集沉淀物。去除上清液并废弃。将PEG沉淀悬浮在含120mmol NaCl和1mmol EDTA的6.2mmol磷酸钠缓冲液（pH7.2）中。通过加入1.5体积的氯仿∶异戊醇（24∶1，v/v）完成悬浮的PEG沉淀物的有机萃取。于20℃，以3000xg离心分离10分钟增强相分离，并保留上部的水相。用30%原体积的有机混合物反萃取该界面，离心分离，并将第二次水相与第一次水相合并。

将水提物在TOYOPEARL DEAE 650M（Toso Hass）阴离子交换基体上进行色谱分离并用梯度洗脱至1mol NaCl。以15-30%的1mol梯度洗脱的甲型肝炎病毒相当于15-30mS。汇集由该区得到的级分并进行大小排阻色谱分离。该大小排阻步骤一前一后使用两个柱：TOYOPEARL HW 55S和HW65S。在这种条件下，甲型肝炎病毒在两个基体所包括的体积中，前后柱排列是用于溶解甲型肝炎病毒中高和低分子量的两种杂质。该柱用含120mmol NaCl的6.2mmol磷酸钠缓冲液（pH7.2）平衡。将以对称峰洗脱的甲型肝炎病毒和产物部分汇集。

将由大小排阻色谱分离得到的经0.22微米无菌过滤的产物于37℃，用30μg/ml（1∶1000稀释的甲醛水，它是37-40%（重量）的甲醛）、以约500单位/ml（一个单位相当于约1ng病毒蛋白）失活5天。将失活的甲型肝炎病毒经0.22微米无菌过滤。通过首先加入硫酸铝钾然后再用氢氧化钠滴定至pH6.6～6.8而进行与氢氧化钠共沉淀。通过沉清/滗析方法去除残留的盐和甲醛，在该方法中将上清液去除并用生理盐水代替。

实施例10

对由上述方法制得的产物进行下列分析：用氨基酸分析进行蛋白质分析（气相水解，随后作PTTC标记和反相高性能液相色谱法）;用HAV抗原固相酶免疫测定进行HAV抗原分析（使用人体多克隆抗体制品进行抗原，随后用小鼠单克隆抗体和山羊抗小鼠（goat-anti-mouse）抗体/过氧化物酶共轭物检测）;用高pH阴离子交换色谱法和脉冲电流测定（HPAEC-PAD，用2N TFA的酸性水解，随后进行HPLC分析）进行碳水化合物分析（包括葡糖和非葡糖碳水化合物测定，非葡糖碳水化合物在产物中以每μg产物蛋白质小于约0.1μg的含量存在）;用DNA杂交进行宿主细胞DNA分析（使用Alu DNA片段作为杂交探针的斑点印迹（dot-blot）方法）;用气相色谱法进行脂肪酸分析（脂肪酸的甲基脂化，随后进行毛细管气相色谱法）;用核苷酸的水解和反相HPLC分析进行RNA分析。

除了按照上述方法得到的下面出现的数据之外，SDS-PAGE分析及通过银色斑或通过用抗HAV抗体的Western印迹的蛋白检测表明，当加载50-300ng蛋白质时，仅存在HAV特定蛋白质。另外，通过HAV特定RNA分析、蔗糖密度梯度分析和反相HPLC分析证明存在全HAV衣壳，其中的HAV特定RNA分析通过与HAV特定DNA探针杂交进行的。发现HAV特定RNA在产物中以每μg蛋白质约0.1-0.2μg的量存在。HAV特定RNA的这一含量是恒定的，具有约1/3全HAV衣壳与约2/3空HAV衣壳的比例。最后，根据示于图2的检定，使用HPLC分析，提供HAV纯度的独立测量，它表明单个HAV产物峰值。

蛋白质、碳水化合物、类脂和DNA的绝对浓度示于下面A节。通过蛋白质的微克标准化将A节数据变换在下面的B节中，而在C节中按照蛋白质的重量百分数表示（指碳水化合物存在的质量，例如，和蛋白质存在的质量比，乘以100）。

按照本发明的工业规模方法制得的8种HAV制品的这些分析结果示于下面。

A.组成分析

组号蛋白质 RNA 总碳水化合物 DNA* 脂肪酸

(mcg/ml) (mcg/ml) (mcg/ml) (mcg/ml) (mcg/ml)

1 14.7 2.4 3.4 <0.0045 <0.3

2 8.0 1.1 3.7 <0.0003 <0.3

3 18.9 2.1 0.9 <0.0003 <0.3

4 17.0 1.5 2.5 <0.0003 <0.3

5 16.6 2.5 2.2 <0.0003 <0.3

6 8.4 1.5 1.1 <0.0003 <0.3

7 14.5 1.4 1.5 <0.0003 <0.3

8 14.6 1.8 1.2 <0.0003 <0.3

蛋白质的重量%

组号 RNA 碳水化合物 DNA 脂肪酸

1 16 23 <0.036 <2.0

2 14 46 <0.004 <3.8

3 11 5 <0.002 <1.6

4 9 15 <0.002 <1.8

5 15 13 <0.002 <1.8

6 18 13 <0.004 <3.6

7 10 10 <0.002 <2.1

8 12 8 <0.002 <2.

＊对于第一个试样的检测极限（LOD）是0.0045μg/ml。

对于后续的试样，灵敏度提高，因而LOD是0.003μ/ml。

上述数据表示本发明产物特性，在失活和氢氧化铝共沉淀之前，作为HAV制品具有下述特性，根据每微克蛋白质（通过SDS PAGE和银染色分析，蛋白质大于95%纯HAV蛋白）：

葡萄糖组成的碳水化合物 0.1-2.5μg

非葡萄糖碳水化合物＜0.2μg

DNA ＜0.004μg

类脂＜0.1μg

HAV RNA 0.1-0.2μg

最好，当HAV制品为非常浓缩时，在失活和配制之前，这些分析以本发明的纯化的HAV制品进行。然而，提供足够量的失活的或最终配制的疫苗，这些分析可预示得到基本类似的结果。在一个特别优选的实施方案中，本发明的疫苗具有下面的公称组分，每25单位/0.5ml剂量：

组分	含量
		氯化钠	4500μg
铝	250μg
		四硼酸钠	19μg
甲醛	＜200ng#
		葡萄糖（聚合物）	＜20ng*#
蛋白质	25ng*#
		氯仿	＜22ng*#
HAV RNA	5ng*#
		非葡萄糖碳水化合物	4ng*#
脂肪酸	＜1ng*#
		新霉素	＜1ng*#
MRC－5 DNA	＜0.005ng*
		牛血清清蛋白	＜0.02ng*#
BENZONASE	＜0.00002ng*#&

＊由纯化病毒体分析而外推的。

＃来自实验批量样品的分析。

&根据活性检定。

实施例11

不同HAV制品的比较

本发明的纯化HAV制品与由其制造者所描述的其他HAV制品的说明进行比较。比较结果示于表1。

表1

失活甲型肝炎病毒疫苗的比较

疫苗总蛋白质病毒蛋白质蛋白质纯度

(ng/剂量) (ng/剂量)

本发明 25^b-100 25^c-100 >95^e,f

Smithkline 2000^b300-500^d≤25^f

Beecham

Japan^a---- 1000^d>95^e

a.由Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute、Chiba Serum Institute和Denka Bio-Research Institute共同研制。

b.根据氨基酸分析（AAA）数据。

c.由HAV抗原酶免疫测定法确定;校准标准是纯化病毒，由SDS-PEG/银色斑分析纯度＞90%，蛋白质由AAA确定。

d.由HAV抗原酶免疫测定法确定，校准标准未定。

e.由SDS-PAGE分析而确定。

f.由HAV抗原与总蛋白质的比率确定。

由这些数据和上述实施例10中所提供的数据可明显地看出，本发明的制品比以前所报道的可获得分析数据的任何制品更纯（根据HAV抗原与总蛋白质的比率和氨基酸分析）、更完全特征化、以及含有最低量的影响达到血清转化和保护的病毒蛋白质。

实施例12

菌苗效能-Monroe研究

通过用CR326F HAV感染在NUNC CEU FACTORISE中培养的MRC-5细胞片而制得疫苗。将培养物通过常规喂养保持几周。在合适的时间，通过去污剂处理收获感染的MRC-5单层细胞，并用示于图1的用于NCF's的本发明方法纯化HAV。将水相中的病毒吸附到氢氧化铝上并于2-8℃贮存。每一0.6ml剂量含有25单位甲型肝炎病毒抗原（根据对纯化病毒参照标准的放射免疫测定）和300μg氢氧化铝。安慰剂，含300μg氢氧化铝和以1∶20，000稀释的乙基汞硫代水杨酸钠。有益健康的是，以感染HAV传染高危险性的血清阴性疫苗接受者要么接受单个0.6ml剂量的安慰剂要么接受疫苗。在接种的那天和一个月后采集血样。注意在50天等候期之后几乎100%的疫苗接受者无HAV感染，以此单独筛选出在接种之前已感染HAV传染的接受者。另一方面，在50天筛选期之后，大量的安慰剂接受者感染了HAV传染。这种研究的人数是足够多的，因此疫菌苗接受者的保护作用是统计意义的。

实施例13

在静混合器反应器中病毒的生产

在包括由外环路和泵系统而连接到曝气器上的静混合器柱的SSR中繁殖甲型肝炎病毒（Charles River Biologcal Systems CRBS 5300）。该静混合器反应器由钛金属元件构成，总计约260000cm²表面积，柱的直径为8英时，长40英时。将MRC-5细胞引入反应器中并于37℃在William's培养基E中生长7天，该培养基E补充有10%（v/v）胎牛血清和新霉素硫酸盐。可允许细胞继续生长7天，而培养基部分每周换三次，以使喂养速率等同于NCF Monroe方法。以约0.1MOI将病毒引入反应器中。将SSR温度降至32℃，并如上所述连续喂养22天。然后从SSR中排出培养基，并充入0.1%（w/v）Triton

缓冲液，以释放出HAV。根据表面积，该反应器所产生的HAVAg比T形烧瓶约多50%，该烧瓶使用相同的试剂控制接种，并且以相似方式进行喂养、繁殖和收获。该反应器的HAV制品也比实施例2的Nunc细胞装置良好。

实施例14

在不锈钢丝网静混合物中HAV的生产

14.1原料和方法

细胞培养

在所有研究中使用MRC-5细胞，以PDL≤40。于37℃在含有10%富铁的小牛血清、2mmol谷氨酰胺和50mg/L新霉素硫酸盐的William's E培养基中培养细胞。在研究中使用喷射搅拌罐反应器将0.1%Pluronic F-68加入到培养基中。10000细胞/cm²的细胞密度用于接种新培养物表面。用Coulter计数器和/或具有台盼蓝染色的血球计数计进行细胞计数，以试验生存力。

在金属取样管上培养细胞

将实心或丝网金属取样管（约5cm×5cm）置于玻璃的150cm²的培替氏培养皿中并无菌处理。在冷却后，将90ml培养基置于该培养皿中，然后加入细胞接种物。培养基的量达到完全覆盖该金属表面。于37℃一天后，用无菌镊子取走金属片，并放在新的无菌培替氏培养皿中（以降低细胞在玻璃表面的生长），该培养皿含有90ml培养基。通过用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，并向金属片加2ml胰蛋白酶使该实心片受胰蛋白酶作用。在观察到细胞释放出后，在表面将胰蛋白酶温和地吸取几次，以保证完全被去除。

病毒母种和传染

在所有研究中使用具有滴度为10⁸TCID₅₀/ml的甲型肝炎病毒母种。在此所报告的MOI是以TCID₅₀/细胞，而不是以PFU/细胞计算的。通过加入病毒母种到新鲜培养基中并将其加入到培养物中而传染培养物。传染之后，于32℃培养该培养物。

在丝网取样管上进行生存力染色法

用荧光素二乙酸酯（FDA）和溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓（EB）染色法来监测细胞生存力。在可生存细胞中，FDA被胞质中的酯酶裂开，产生发绿荧光的游离荧光素。EB快速插入不能生存细胞的核DNA中并发红荧光。同时用这两种染料标记细胞。染色溶液含有于50ml PBS中的100μl FDA原料（在丙酮中5mg/ml）和200μl EB原料（在PBS中10mg/ml）。然后将丝网件在5ml这种溶液中培养5-6分钟。标记之后，将基底在PBS（每次冲洗20ml）中冲洗两次，并装在载片和条状盖板之间。然后用BioRad MRC-600共焦显微镜观察试样。

静混合器反应器

从Koch Engineering（Wichita，KS）购得丝网（通称“E-部件”）和实心片316不锈钢静混合器元件（SMV构型）。所有元件均由316型不锈钢或钛制成，尺寸约为2×2英寸。实心元件的表面积估计为1300cm²，而丝网元件的表面积估计为2300cm²。这些后一种元件的表面积与液体体积的比约为26cm²/ml（根据总反应器体积计算约为24cm²/ml）。5个元件放入带有PTFE端部配件的刻纹的5cm×26.5cm玻璃柱中。在连续元件中元件以与混合方向垂直排列放置。带有这种元件的柱包含用于细胞生长的反应器。连接到电子控制仪上的搅拌罐辅助容器用于控制培养基的pH为7.2-7.3和DO为80-90%。用蠕动泵将培养基从搅拌罐循环到反应器中。

通过提供使细胞附着的低循环速率而完成反应器种植。将接种物放入体系中，并典型地以100ml/分钟循环5分钟，以便细胞和培养基混合。在这种快速循环期间内产生非常少的细胞附着。然后将流速降至约2ml/分钟，这就达到通过反应器的表面速度大约等于细胞的沉积速度。已发现在靠近细胞沉积速率的速度对于细胞附着速率以及甚至细胞通过反应器的分配是最佳的。

细胞溶解步骤

将细胞溶解在含有0.1%Triton X-100、10mmol TRIS和1mmol MgCl₂的Triton溶解缓冲液中。用0.3ml/cm²PBS冲洗T-烧瓶两次，并用0.1ml/cm²溶解缓冲液溶解两次，持续1小时。关于溶解反应器的方案在本文中有描述。

分析方法

用kodak Ektachem DT60分析仪测量细胞代谢物。根据酶免疫测定法，使用单克隆抗体测定甲型肝炎病毒抗原（HAVAg）。对照牛血清清蛋白标准，使用Coomassie Blue Bio-Rad蛋白测定（Cat.＃500-0001）确定细胞溶胞产物中的总蛋白质量。

结果和讨论

MRC-5细胞在实心金属取样管上的生长

在该研究之前，在钛元件上进行静混合工作。最好是研究细胞在不同合金表面上的生长，除这些合金比钛便宜之外，并提供便于静混合器产生更大的延展性。研究了两个级别的各种不锈钢和哈斯特洛伊耐蚀镍基合金（Hastelloy）：316和316L不锈钢，HastelloyB和C。用约10，000细胞/cm²接种金属取样管。4天之后，使细胞受胰蛋白酶作用，并记录最终细胞密度：

材料细胞/cm²

钛 1.4×10⁵

316不锈钢 1.6×10⁵

316L不锈钢 1.2×10⁵

Hastelloy B 2.2×10³

Hastelloy C 1.3×10⁴

在两个级别不锈钢上的生长类似于钛;细胞在Hastelloy B上不生长而在Hastelloy C上生长不良。不锈钢和钛所记录的细胞密度的差异不应看作某一个是优良的证据，这种差异是合理的，因为是测定细胞的生存力。

对于细胞在塑料基底上（例如聚苯乙烯组织培养烧瓶）生长来说，已获得有关甲型肝炎病毒生产的大量数据。为了比较，将MRC-5细胞在聚苯乙烯、玻璃和316不锈钢上的生长曲线示于图3。细胞在所有这些表面上不相上下地生长。最大的比生长速率是相似的（塑料为0.034h^-1，玻璃为0.032h^-1，316不锈钢为0.039h^-1）。对于塑料得到较低的最终细胞密度是合理的，因为营养受到限制。在塑料上生长是在T形烧瓶中进行的，而在玻璃和不锈钢上生长是在培替氏培养皿上进行的。由于在每一个体系中每平方厘米所用培养基的体积不同，因而所得到的营养也会不同。对于不锈钢取样管，细胞的生长和葡萄糖的消耗示于图4。

MRC-5细胞在丝网金属取样管上的生长

为了获得每单位体积最大的表面积，研究用于MRC-5细胞生长的培替氏培养皿中的金属丝网材料。对于丝直径和间隔的某种组合，具有与实心取样管相同设计面积的一块丝网可提供用于细胞生长的更大总面积。于是可以每单位反应器体积得到最大表面积的这种方式将丝网片组装在或装配在反应器中。为试验细胞在丝网表面的生长，用材料和方法一节中所述方法来进行MRC-5培养。

说明了MRC-5细胞在或者由316型不锈钢或者由钛制成的丝网上的生长。研究了具有丝直径范围为100μm～400μm、每英寸编成14×100、120×110、40×200和107×59丝的丝网取样管。细胞在所有试样上较大或较小程度上均生长。在早期阶段，细胞在丝表面生长。之后很短时间，细胞开始跨越间隔，尤其是在角落。随时间推移，细胞完全充满间隔并形成多层。通过目检，该丝网承载着非常高的细胞密度，这比按表面积计算的要多。直接的细胞表面浓度没有得到，因为在丝网上的多层生长不适于受胰蛋白酶作用。初步的数据表明，间隔的尺寸是一个重要的考虑问题，因为细胞不能跨越大的间隔，而具有小间隔的丝网在极限情况下降低至与平板相同的表面。构造的材质不影响细胞生长，并断定任何能编织成丝网片的生物适应的材料均适于使用。如下所述，使用金属丝网具有的优点是易于清洗并可重复用于细胞生长的许多周期中。

从这一点，仅例举具有每英寸编成107×59丝、丝直径为160μm的316不锈钢丝网（由此得到丝的间隔为77μm×270μm）。下面讨论的丝网静混合器元件由这种材料制成。除了提供增加的表面积之外，该丝网允许细胞以多层生长。在该丝网上多层细胞生长的显微照片示于图5。所关心的是，确定整个层中的细胞是否全存活，或者是细胞在多层中心的是否坏死。如在材料和方法一节中所述，荧光素二乙酸酯和溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓用于这种目的。通过用激光共焦显微镜扫描丝网截面，根据溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓没有插入核DNA和荧光素二乙酸酯分解产生游离的荧光素的事实，证明绝大多数细胞是存活的。图6A示出一系列穿过细胞层的横截面的荧光素信号。图6B示出同一截面的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓信号。在这些实验中，用甲醇处理使细胞不存活的个别取样管作为溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的正调节和荧光素二乙酸的负调节。这种调节示于图7。

在丝网静混合器元件上种植细胞

对于进行最佳培养以及对于保持低的、均匀的生物学生产中的细胞倍增水平来说，均匀种植是重要的。得到由上述研究的相同材料制的丝网静混合器元件。圆柱形反应器的取向是其中心线为垂直的。尽管早期研究已用水平中心线的促进细胞沉降到生长表面上的反应器进行，但已发现附着到垂直表面是高效的，并且是优选的操作方式。在整个这种操作中，以约10，000cm²种植细胞。细胞被种植在多个元件的反应器中，其中各个元件的混合轴线是彼此平行或90°之间的任一角度。为了液态混合和最佳反应器操作的目的，优选垂直构形。

在早期研究中，不使用可产生5cm/分钟表面速度的循环速率来种植细胞。通过填充反应器和使细胞通过重力沉降2小时种植可增加种植效率。这常常提供大于90%的种植效率（种植效率＝种植的细胞数/接种细胞总数×100%），但这种种植是不均匀的。如图8所示，底部元件含有大多数细胞，而顶部元件含的很少。由这些数据，MRC-5细胞生产中的平均沉降速度计算为6cm/h。在另一个实验中使用4个元件，用于种植的培养基以约等于该沉降速度的速率循环。在这种条件下可重复地获得种植效率大于90%的均匀的种植（图8）。上述结果表明，通过反应器的培养基的表面速度影响反应器中的附着率和细胞最终分布的两者比例。

细胞在实心片和在丝网静混合器元件上生长的比较

装配两个反应器并同时运转，以说明实心片和丝网元件之间的差异。该实心元件是由钛制成的，而丝网元件是由不锈钢制成的。估计表面积是：实心元件为1300cm²，而丝网元件为2300cm²，结果丝网与实心元件的表面积比为1.8。实心片元件同丝网元件一起操作，以对所有实验提供对比。将约10，000～20，000个细胞/cm²种植到反应器中。反应器以间歇方式运转直至葡萄糖浓度降至低于120mg/dl，在此时开始灌注培养基。两个反应器用相同收获期的MRC-5细胞接种，并喂给来自公共储藏器中的培养基，以清除这些易变因素的任何差别。

每个反应器的葡萄糖吸收率（GUR）示于图9。图9A以cm²比较这两个反应器，使用上面指出的面积，这些表面积认为是近似的。图9B以反应器培养基容积为基来比较这两个体系，因为每个反应器都是相同尺寸，即5个2×2英寸元件，和1个1L的辅助培养基容器。图9B不包括任何与表面积有关的近似值。葡萄糖吸收率被用作测量细胞生长并用于估计固定阶段的开始。图9中最后的点表示通过triton溶解反应器收获的时间。用肉眼观察，细胞汇合在实心基体上，在丝网元件上网格的间隔几乎被填满，这就可以假定更多的生长是可能的。在这一点，以0.19L/h的速率向实心反应器灌注培养基，而此时培养基中的葡萄糖浓度为1.16g/L。对于丝网反应器的灌注速率为0.26L/h，面培养基中的葡萄糖浓度为0.69g/L。这些结果表明，对于细胞生长阶段，丝网反应器比实心反应器可达到更优越的代谢活性。

将反应器排干，并用去污剂缓冲液溶解细胞，以萃取细胞蛋白质，测量反应器中的细胞质量。对于这些实验，从每个反应器中收获细胞缔合的蛋白质的溶解步骤是相同的：将2L室温PBS以100ml/分钟循环通过反应器5分钟，然后排出。为去除培养基中蛋白质的这种洗涤重复两次。紧接着，将原料和方法一节中所述的1L溶解缓冲液在37℃、以400-500ml/分钟、循环通过反应器1小时。这样再重复一次（溶胞产物1和2），而后来的溶胞产物循环更长的时间一对于溶胞产物3为2小时，对于溶胞产物4为4小时。在每个溶胞产物中所去除的蛋白质的百分数示于图10。当用附录1所给出的对应关系将总蛋白质计算值换算成细胞密度时，该实心静混合器元件含3×10⁵细胞/cm²，而丝网元件含6×10⁵细胞/cm²。对于实心片反应器来说，前一个数值认为是有代表性的，因为所有的细胞在溶解过程都被去除了，这已由用拭子擦拭元件并在显微镜下观察该拭子所证明。然而，当用显微镜观察时，并非所有的细胞碎片都已从丝网元件上去除，因而可以断定这后一个数据是低的。根据一个反应器，丝网元件承载的细胞浓度大于3倍的实心元件。假如表面积的计算是准确的，总蛋白质数量上的这种差别超过了表面积的比率，并且是多层细胞生长的证据。

在丝网静混合器元件上的HAVAg的制备

以使用丝网静混合器元件的反应顺说明HAVAg的制备。本实验的目的是确定是否病毒的繁殖发生在支承多层生长的不锈钢丝状元件上，这不是HAVAg制备的最佳化体系。对于该实验，使用整个培养基的替代物而不是培养基灌注。本实验的GUR曲线示于图11;该图的GUR的计算基于在培养基重新喂给之后那天所得到的葡萄糖值。用约1的MOI传染细胞7天。对于MOI的细胞密度的计算是根据传染时葡萄糖的消耗率确定的。如用如实施例9的方法观察到的那样，在传染后葡萄糖吸收率平稳的时期很短，随后即下降，与细胞传染相一致。在图10中所观察到的下降比用实施例9中方法所观察到的更陡峭，这是可能的，因为有更均匀的传染度（实施例9用0.1的MOI）。在传染21天后，通过Triton去污剂溶解来收得病毒抗原。溶解细胞的方案下面叙述。

溶胞产物1：于37℃将溶解缓冲液循环通过静混合器1小时。

溶胞产物2：于37℃将溶解缓冲液循环通过静混合器1小时。

溶胞产物3：在含0.7L溶解缓冲液的Branson近程声波定位浴器中声处理1小时。

溶胞产物4：将元件在1L溶解缓冲液中冷冻12小时，解冻、并声处理1小时。

在这些洗涤物中释放出的总蛋白质和HAVAg的百分数示于图12中。前2种溶胞产物所用的循环对于从细胞中去除HAVAg是非常有效的。这个实验在溶解之前仅用2次PBS洗涤，而且并不是非常有效的，因此溶胞产物1的总蛋白质百分数是人为的高，而溶胞产物2、3和4的总蛋白质百分数是低的。在冷冻之前，对单个收集的样品用EIA测定了HAVAg。根据后来确定的每个溶胞产物的百分数，这与每单位表面积的抗原产量两倍于实施例9有关。这个实验的目的是认识到，病毒的繁殖如所述可通过产生HAVAg而发生。这个实验说明丝网静混合反应器在HAV生产中的应用。

尽管该反应器根据GUR曲线可能收获较晚，但是抗原产量是较高的，这表明了多细胞层对传染的敏感性。这个数据也表明了MOI在HAV生产中的重要性;以MOI为1进行传染，好像该过程的持续时间应减少一个多星期，并在20天收获。根据数据的变化，传染的时间和MOI对生产过程是重要的变量;这些参数在降低培养物长度方面是重要的。细胞生长实验表明，传染的细胞以类似于未传染细胞的生长速率而连续生长，甚至对用CR326F P28以高MOI传染的培养物也是一样（图13）。这是不管传染和温度至32℃，对这种病毒株来说，生长温度是随意的。由这些曲线计算的最大比生长速率是0.015h^-1，约是未传染细胞于37℃时生长速率的一半。事实上在反应器生产中，在HAV传染的第一周内细胞具有相似的表现是重要的，因为人们可能注意到最高的细胞浓度而可能忽视传染时间和MOI。这个实验表明，细胞生长持续时间、传染时间和MOI的最佳化是相互制约的。

静混合器元件的清洗

希望有用于生物生产的可重复使用的生长表面，以避免废物处理，并能使反应器过程自动化，以及增加培养物的重现性。通常，用蒸馏水冲洗丝网元件，以去除培养基盐类（以500ml/分钟，冲洗1小时），置于1L5%（w/v）NaOH溶液中，并高压灭菌45分钟。冷却后，再用蒸馏水冲洗元件直到不存在NaOH（用冲洗后的pH来确定）。通过显微镜观察，对于去除细胞碎片是非常有效的。可以推测出，不太苛刻的处理也产生相同的清洗，而且更适合于原位清洗生产中的反应器。经这种方法处理的丝网元件至少可以重复使用10个循环而不改变细胞生长性能。上述病毒生长研究中所用的元件以这种方式制成，说明所使用的清洗过的元件对HAV繁殖的应用。

结论

这些研究已表明，由不锈钢丝网构成的静混合器元件能够承载MRC-5细胞的多层生长。证明多细胞层是能存活的，而没有发现坏死。传染研究表明这些多细胞层对甲型肝炎病毒传染是敏感的，并且在非最佳体系中产生超过目前使用如实施例9的实心承载物所获得的抗原。用微载体进行培养，细胞丛将产生不定的多层，丝网静混合器提供清晰的多层，这是因为它的精巧制作的几何结构，因此养分限制和废物积聚将不成为问题。细胞在网格的间隔中生长将阻塞间隔，并产生类似于填满塞子的型式的实心片元件。因此，该体系得到静混合器技术的混合益处，并将可预测的和均匀的养分供给细胞。这是与其它填充床反应器类型，例如纤维任意填充床、玻璃珠填充床，空心丝反应器，或陶瓷整体反应器相反的。在这些类型反应器中，细胞生长造成培养基流动方式变坏并产生营养不良的细胞囊。总之，包含不锈钢丝网静混合器元件的可重复使用的反应器，用于MRC-5细胞培养和甲型肝炎病毒抗原制备巨大潜力。

实施例14-附录1

总结

对MRC-5细胞溶胞产物中的总蛋白质定量并直接与细胞计数（用血球计数器和Coulter计数器）相比较。在早期指数、后期指数和平稳生长阶段中的健康细胞以及在传染1、2和3周后的细胞证明，由每个培养物溶胞产物中测量的总蛋白质数通过用单个曲线可直接对应于细胞密度。这种简单的对应关系提供了估计反应器中细胞密度的手段，这不适合于直接计数技术。

讨论

蛋白质测定及样品制备

Bio-Rad蛋白质测定法（Cat.＃500-0001）是一种快速、灵敏的用于定量总蛋白质的方法。早期实验表明，目前的溶解缓冲液（0.1%Triton X-100、10mmol Tris-HCl、0.1mmol MgCl₂）不影响Coomassie Blue基本测定。为了稠度，全部稀释，包括那些标准蛋白质（牛血清清蛋白）在Triton缓冲液中进行。Triton细胞溶胞产物实际上经常是絮凝的这样一个事实表明，在进行测定之前样品需要进一步处理。大量的絮凝物导致高的蛋白质滴度。然而，在两个快速冷冻（在-70℃乙醇中）和解冻循环之后，絮凝物尺寸降至能获得均匀悬浮液的程度。另外，通过测定几个单个样品的稀释液，可容易地确定可能由制备不好的样品所产生的无关点。也将样品离心分离，并使用澄清的上清液;这种处理提供相似的结果，但认为是不必要的。这里所给出的数据是指在测定之前细胞溶胞产物最少冷冻两次并被充分涡流。

细胞密度函数的蛋白质浓度

对于允许总蛋白质转换成比细胞数的单个标准曲线，整个方法中的细胞必须包括大约等量的蛋白质。为试验这一点，用等数目的细胞接种T形烧瓶。在本方法中以特定的间隔，将两个烧瓶破碎。一个烧瓶受胰蛋白酶作用并用血球计数器和Coulter计数器对细胞计数，而另一个烧瓶则用去污剂溶解，即：用0.3m/cm²PBS冲洗两次，用0.08ml/cm²溶解缓冲液溶解两次。这适合于在早期指数生长阶段、后期指数生长阶段和平稳阶段中的培养物，以及在传染后第1、2和3周的培养物。这些实验的累积数据示于图14。最吻合线由等式y（10⁴）＝-0.09+0.42x表示。该图证明，单个曲线提供了通过总蛋白质测量结果来估计细胞数的手段，而不考虑细胞的“状态”。

本实验中的细胞用HAV CR326FP28、以MOI为1进行传染。在传染后3周，证明胰蛋白酶作用对收获的细胞无效。然而，因为由传染后1和2周得到的细胞密度大致相同，并且在3周可见的细胞溶解看来好像不存在，因而对3周所用的细胞密度根据在2周时所得到的数据。将图14重新绘制，以表明每个特定数据点的时刻。由于不考虑传染后3周的数据，曲线的斜率和截距没有大的影响（见图15）。

利用上面的对应关系，如在实施例9中制备的几个培养物的溶胞产物的总蛋白质数据得出平均490μg/ml蛋白质。这换算成约3.3×10⁵细胞/cm²，并且大体上与在对比T形烧瓶上用血球计数器所测定的细胞密度相一致。总之，相信Triton细胞溶胞产物的总蛋白质量提供了病毒收获时的有用的细胞密度近似值。

实施例15

溶剂萃取步骤的混合研究

概要

在甲型肝炎病毒纯化过程中，在去除直至在PEG片状物阶段还存在的杂质中，溶剂萃取步骤是关键的。为了全面理解和控制这一步骤，进行一系列实验以确定溶剂萃取的重要参数。两个关键变量被确定为：混合持续时间和搅动强度，以所用瓶子的尺寸来确定。溶剂与水相的体积比在整个研究范围内不是主要的因素，不论是使用与手摇动不同的机械摇动器或者是使用涡流。

材料和方法

将悬浮的PEG沉淀样品与从0.5∶1至3∶1（溶剂与水相的比率）的不同比例的氯仿和异戊醇溶液（24∶1CHCl₃∶IAA）混合。通过用力手摇、涡流（对于15ml试管）或者在3D机械摇动器上（Glas-Col.Terre Haute，Ind）以马达速度100（对于15ml和50ml试管，对试管在水平方向轻敲）进行混合。混合时间范围从20秒至1小时。

混合后，将样品离心分离至各相分离。对于50ml试管和500ml瓶，使用带有JS4.2摆动叶片旋转器的Beckman J6-MI，以3800rpm离心分离10分钟。对于小试管，开始使用DynacⅡ离心机，以1000rpm离心分离5分钟，然后为了后续实验，将样品转到50ml试管中，如上进行离心分离。

用玻璃吸移管将水相去除并用大小HPLC在下述条件下进行分析：依次用两个TSK P4000×1的柱（Toso Hass），流动相以0.32ml/分钟的RCM8（也称作CM563，它是在6.2mmol磷酸盐缓冲液中溶入150mmol NaCl，pH7.2），在214和260nm处监测（80分钟运转时间）。结果以峰面积或基于214nm uv吸光度的峰面积比率来表示。对于在15ml试管中的初始实验，使用单个的TSK柱（40分钟运转时间）。随后，建立两个柱，以在甲型肝炎病毒和杂质峰之间获得较好的分辨。

在15ml试管中于2-6ml刻度上进行初始实验，用手摇或涡流进行混合样品。当得到最初少量几组的分散的结果时，在机械摇动器上用较大体积（于50ml试管中，装入量最大至24ml）来进行混合。在批量生产过程中，样品也可取自500ml瓶中。该瓶短时摇动（例如20秒）。通过放置约1分钟将该相分离并从上部的相中取走600μl样品。该瓶再经另外的短时摇动，然后再次取样。这些样品后来在微离心机中以最大速度向下旋转2分钟。

结果

1.混合时间

由在15ml试管中初始的小规模实验可看出混合时间是重要的变量，随着混合时间的延长导致较好的杂质的去除。由图6可清楚地看出，经过较长的混合时间，甲型肝炎病毒与杂质的比率增加。另外，在图20中，可以看出杂质峰的面积随着混合时间的增加而显著降低。

对于50ml试管来说，混合时间的确是重要的，在这种样品中需3分钟的混合时间来最高程度地去除杂质（图20）。在这种情况下，为了较好的分辨用串联柱进行分析，并且仅观察到甲型肝炎病毒峰面积稍微减小。

也研究了在用于制备过程的500ml瓶中的混合时间的作用。在2分钟总混合时间的过程中每20秒取一次样品。该实验以两种不同的溶剂比：2∶1和3∶1来进行，这也相应于瓶中的两种不同的水相体积（约60ml和90ml，溶剂体积保持恒定在180ml）。图21表明杂质含量随混合时间延长而降低，在1分40秒后被完全去除。用于制备过程中的时间是2分钟，这保证了基本上去除杂质。为了更完全去除，可延长至3分钟。体积和溶剂比率的差别在整个所用范围内看来似乎具有很小的作用。

在50ml和15ml两个试管中将该实验延长至更长的混合时间。图22表明在所有使用的试管中基本上可达到相同的纯化程度，但在较小试管中需要6-8分钟，而在500ml离心瓶中需要时间小于2分钟。这些差别将在第3节中进一步讨论。为了确定病毒是否受到延长摇动的影响，将50ml试管用机械摇动器混合1小时。HPSEC结果表明，甲型肝炎病毒峰面积没有进一步减小，并且EIA结果（表1）表明，1小时如同2分钟混合一样，抗原性是相同的。同组的生产过程的液流的结果表现出相似的EIA值。因此，为了保证在生产过程中完全去除杂质，如在图上看到的最短混合时间可以延长而不降低病毒的产量。

表1 通过HPSEC和EIA说明延长摇动对甲型肝炎病毒的影响（50ml试管）

混合延续时间	甲型肝炎病毒／杂质之比	EIA（μ/ml)
			2分钟	0.74	23800
1小时	∝（杂质未检测出）	24500
			生产过程的液流（2分钟，500ml瓶）	8.6	20000±16%

2.体积比

对于比较组，用于简单萃取的溶剂与水相的体积比为1.5（在单个瓶中用磁搅拌棒搅拌），而对实验组的上述体积比为2-3（在500ml瓶中搅拌）。因此测定在0.5和3之间体积比对纯度的影响。用4个不同生产批次的原始PEG沉淀物进行最初的小规模实验（在15ml试管中，混合1分钟）。图23表明，溶剂与水相体积比和杂质去除之间没有明显的对应关系。数据分散可能是由于原料变化和摇动的不一致造成的。将样品的体积按比例扩大至50ml试管，并用机械摇动器与水平安置的试管一起摇动2分钟。结果示于图24。尽管数据仍然分散，还没有基于溶剂与水相体积比的明显变化趋势。这一点可以由在具有2∶1和3∶1溶剂比的500ml瓶中进行的表明在杂质去除方面很小差别的混合时间实验（图21）所证明。因此，似乎溶剂比不是重要的变量，而且增加溶剂比并不有助于改进所观察的同组的纯度。

3.混合的类型和容器的尺寸

在小试管（15ml）中，看不出手摇动与涡流之间的影响趋势，因为对于不同生产批次的实验结果是分散的（图23）。图19中简单的数据点也表明手摇动和涡流之间好的吻合。在较大试管中，对手摇动和机械摇动进行比较。在图25中，对于相同尺寸和装入量的试管，可以看出手摇动的结果仅稍微不同于摇动器。表2示出了在500ml瓶中的实验结果。这些结果来自一批6个瓶的实验，一个用手摇混合，而其他用机械摇动。对每一类型的混合均取样，HPLC分析表明它们的实验结果非常近似，都得到高纯度，证明了摇动类型不是关键的，但所用瓶的尺寸是很重要的，对于在摇动器上相同的混合时间，500ml的瓶优于50ml试管。这也由图22中的数据所说明。

表2 不同类型的混合对甲型肝炎病毒/杂质之比的影响（2分钟 )

混合类型	甲型肝炎病毒／杂质比
		机械摇动	2.47
手摇	2.69

也要考虑到试管的装入量。50ml试管装入10.5ml（溶剂+水）的量可得到很近似于典型装入21ml所得到的结果。类似地，500ml瓶装入240或275ml出现相同量的杂质被去除（图21）。在所有的混合实验中，15ml试管装入其满容量的或者0.13或者0.4。对于50ml试管，大多是装入其满容量的0.53（一个实验是0.26），而500ml瓶装其满容量的0.48和0.57之间。因为对于三种类型的试管使用相似的量并且所得结果与装入量无关，所以这在整个该范围内不可能有强的影响。然而，如果试管被完全装满，不存在上部空间，并且很难将其混合，则是很可的。结果这会降低杂质去除的效率。

另一个变化的并是重要的因素是试管的宽度与高度比：对15ml试管为0.13，对50ml试管为0.26，而对500ml瓶为0.58。较大的宽度与高度比有助于较好的混合是可能的，因为所形成的摇动模式会产生较大的界面面积。

也检验了来自先前的比较组的数据，在这些比较组中存在于PEG片中的杂质相同。4组样品在装有磁搅拌棒或旋转器的单个烧瓶中用溶剂萃取1分钟。然后将该溶液分配到离心瓶中，以通过离心分离进行相分离。溶剂与水相的比为1.5。所得的甲型肝炎病毒与杂质的比在0.48-2.7范围。附加的比较组在250ml锥形离心瓶中（溶剂与水相之比为1）摇动1分钟。所得纯度比（甲型肝炎病毒/杂质）是0.87。这些结果都可比得上在相似条件下在15或50ml试管中所得结果，但比在全规模实验组中所得的典型范围为4-21的结果（对于8批样品）低的多。这与在生产规模中为混合使用更长的混合时间和更大的瓶是一致的。

结论

由这些数据我们可以得出结论，全规模实验组和先前的比较组之间的纯度的差别是因为在较大（500ml）瓶中进行摇动更长时间（2分钟与1分钟相比）。由于在这些瓶中摇动时产生较大的界面面积，体积的影响是可能的。500ml一般装入量小于300ml，就形成大的上部空间面积，在混合过程中该空间被充满，则产生扩大的溶剂/水相/空气之间的界面面积。减小的界面面积很可能引起在小试管中得到的溶剂萃取产物纯度较低。然而，由于混合时间也是重要的变量，因此在50ml试管中的纯度最终达到了与在500ml瓶中相同的水平。

研究的其他变量，即溶剂与水相的比和摇动类型，在整个研究范围内发现不是重要的。

实施例16

甲型肝炎病毒的溶解度

如前面所述，根据来自生产组的生产过程的液流的HPSEC分析，观察到了甲型肝炎病毒的显著损失。在纯化过程中，用HPSEC定量方法来估计其损失量，在纯化过程的离子交换和大小排阻色谱步骤之间病毒-夜损失大于50%。这与通过离心分离去除的沉淀物所表现出的损失相吻合。

假定沉淀物是甲型肝炎病毒，并且沉淀是由用于洗脱来自离子交换柱上的病毒的缓冲液的高离子强度所引起。试图用氯化钠和磷酸钠的水溶液来溶解该沉淀物。基于病毒损失，用HPSEC测定沉淀物（实际上是沉淀物浆）的浓度测定为几mg/ml。将沉淀物浆的等分样品或者与6mmol磷酸钠、0.15N氯化钠在6mmol磷酸钠中形成的溶液、0.3N氯化钠在6mM磷酸钠中形成的溶液、0.5N氯化钠在6mM磷酸钠中形成的溶液，或者与1N氯化钠在6mol磷酸钠中形成的溶液混合。

甚至当与很少量的6mmol磷酸钠混合时，该沉淀物也在几秒钟之内溶解。然而，当与含氯化钠的溶液混合时，没有观察到外表上的明显区别（除非显著的稀释）。通过用5.65ml的6mmol磷酸钠溶液溶解0.35ml料浆而制备甲型肝炎病毒储液。应注意的是，在加入仅约0.5ml磷酸钠溶液后，就发生可见的颗粒完全溶解。将该储液的样品与不同量的1N氯化钠在6mmol磷酸钠中形成的溶液混合，以达到0.15N、0.3N或0.5N氯化钠的目标浓度（表Ⅰ）。

表16-Ⅰ

储液体积	在磷酸钠中形成的溶液的体积	抗原稀释度	氯化钠的重量摩尔浓度
				1.51.51	0.270.651	1.21.432	0.150.300.50

然后这些溶液的浓度用HPSEC定量，两周之后再用HPSEC定量。这些数据示于表Ⅱ并绘制在图27和28中。

图27表示在加入盐之后约1天在溶液中测量的甲型肝炎病毒的初始浓度。用HPSEC测定该储液具有约100mcg/ml的浓度。这相当于沉淀物浆中的约2mg/ml。（该浆中的甲型肝炎病毒的量大致相应于在生产过程观测到的损失量。因为该沉淀物在仅加入少量磷酸钠后就观察到溶解，因此估计在含少量盐水的溶液中的溶解度大于或等于约1mg/ml。）在含氯化钠溶液中抗原的浓度比用盐水稀释的储液稀释液的计算浓度低的多。另外，含盐水的溶液的HPSEC分析表明，在这些含盐水的溶液中存在大比例的聚集体物质（表Ⅱ）。

表16-Ⅱ

盐水溶液中甲型肝炎病毒的HPSEC结果（第1天）

氯化钠浓度抗原(单体形式) 聚集体:单体(面积比)

0(储液) 106mcg/ml 0

0.15N 64 0.05

0.30 11 0.52

0.50 6.6 0.52

这表明了甲型肝炎病毒甚至当在盐水中浓度低于50mcg/ml时也聚集然后由溶液中沉淀。图27还示出了由离子交换柱上洗脱的产物的近似组成（由点IEP代表）。它显然高于能保持在溶液中甚至1天的抗原含量，并因而在它由离子交换柱上洗脱后需要立即稀释产物的纯化过程中没有显著的改变。为了使稀释最小，并使然后填充到制备大小排阻柱上的体积最小，应当用6mM的磷酸钠进行稀释，以保持额定的pH控制值同时减小离子强度和抗原浓度。1对1的稀释估计将抗原浓度降低到一个点，使得它在磷酸盐中氯化钠为约25mcg/ml和150mM时低于图27中IEP^＊所代表的曲线。在这些数据的基础上，实现了将该稀释加进到纯化过程中。

图28示出了在第1天和第14天在上述溶液中测量的浓度。显然抗原的浓度在第1天和第14天之间的全部时间内下降，并且1对1的稀释不将抗原稀释到溶解度曲线之下，但仅使病毒溶液稳定，并减慢聚集和沉淀的开始进行。可能的是，对稀释进一步优化将导致产物产量的进一步提高。

最后，为检验该储液含甲型肝炎病毒而不含会在HPSEC上共同洗脱的某些其它物质，对该储液进行SDC-PAGE和银染色法。当与SEC产物比较时，同样的蛋白质频带是明显的。

实施例17

用于监测甲型肝炎病毒纯化试样的高效大小排阻色谱法引言

已经研究了一种在甲型肝炎病毒纯化过程中表征和监测过程效能的方法。使用UV在214nm和260nm进行检测的分析用高效大小排阻色谱法（HPSEC）使得能够分析过程样品中甲型肝炎病毒和关键杂质（聚集体、核酸-甲型肝炎病毒加合物、以及660kDa杂质）的相对量。此外，HPSEC被用于测定由最后三个纯化阶段（萃取、离子交换和制备SEC）所取样品中甲型肝炎病毒的浓度值。这种测定方法用于监测BENZONASE的消化效能，并提供每一操作阶段甲型肝炎病毒杂质外形的独特标记，以用于后步试验作参考。

取自10个生产组的甲型肝炎病毒过程样品通过HPSEC分析以提供所有各纯化阶段的过程效能数据。这些分析所得的数据和另外的稳定性及掺料研究一起，使得能确认该HPSEC试验，并清楚的指明甲型肝炎过程的一致性。

本实施例既说明了HPSEC测定确认的数据，又说明了10个生产组分析的结果。本报告被编制进下列章节：

第Ⅰ节仪器和色谱法条件

叙述HPSEC柱和HPLC的仪器和操作条件。

第Ⅱ节测定和校准步骤

叙述校准标准物的制备和测定步骤。

第Ⅲ节线性度、精确度，以及再现性

统计计算。

第Ⅳ节结果分析

示出取自1个组的一组色谱，同时叙述每个过程样品所得数据的类型，以及推荐的报警极限

第Ⅴ节样品的贮存条件

对每种过程试样进行贮存研究，以确定4-6℃下的稳定性。

第Ⅵ节对EIA和HPSER结果进行比较

第Ⅶ节过程效能的一致性

附录A 对取自10个组的过程样品进行HPSEC的结果。

第Ⅰ节仪器和色谱法条件

物料和试剂

含有6mM磷酸钠，120mM氯化钠的CM80（MMD）磷酸盐缓冲盐水，pH7.2

仪器

（除使用柱以外可作等功能的替代）

HPLC系统：配有10ml盐洗涤头的RAININ Rabbit泵

自动取样器：配有循环冷却器的RAININ AI-1，以保持试样架温度为2-6℃

检测器：RAININ UV-M双通道UV检测器

数据采集系统：Dynamax HPLC法管理系统，输到Apple Macintosh SE上的Verson1.1

柱：TosoHaas TSK PW 4000xl，7.8x300mmL

HPLC微型瓶-玻璃或聚丙烯。

色谱法条件

柱：Tosohaas TSK PW 4000xl，7.8x300mmL

流动相：CM80（6mM磷酸钠，120mM氯化钠，pH7.2）

流量：0.32ml/分

检测：UV214nm和260nm@1V检测器输出

注射体积：50μl

注射之间的运转时间：55分钟

TSK PW 400xl柱

所用的柱是TSK PW 4000xl，它包括一个甲基丙烯酸酯基的5μm载体。以下示出了由聚环氧乙烷（PEO）标准物绘制的校准曲线。虚线表示所关心的3种溶质，即甲型肝炎病毒聚集体、甲型肝炎病毒和660kDa污染物的保留时间。还用虚线表明了2种低分子量疏水化合物，即维生素B12和丙酮的保留时间。两种化合物均位于校准曲线的右边;这些化合物的保留表明该聚合物载体的疏水性质。在几个过程试样中观察到保留的峰（见图29）。它们通常在盐的峰值附近洗脱，并假定是低分子量的化合物。

第Ⅱ节测定和校准步骤

制备校准用标准物

使用6条水平的校准曲线测量甲型肝炎病毒的值。通过稀释纯化的甲型肝炎病毒产物制备校准标准物。浓度为12μg/ml的SEC产物已被用作标准物。复盖浓度范围0.75-12μg/ml的6种校准标准物通过用CM80稀释SEC产物而制备，如下表所示。

校准用标准物甲型肝炎病毒浓度 μl甲型肝炎病毒 μlCM80

(μg/ml)

1 12 250μl9854SEC产物 0

2 9 180μl9854SEC产物 60

3 6 250μl9854SEC产物 250

4 3 250μl校准标准物3 250

5 1.5 250μl校准标准物4 250

6 0.75 250μl校准标准物5 250

通过将甲型肝炎病毒溶液和CM80直接加入HPLC微型瓶制备标准物。甲型肝炎病毒的校准曲线经绘制甲型肝炎病毒峰值面积的常用对数值对浓度的常用对数值的图而制备。典型的校准曲线示于图30。

进行校准曲线数据的10g-10g转换，以减小校准曲线对高浓度校准标准物的依赖性。对于生物的微小分子的色谱法而言，数据的差别随浓度的增大而趋于增大。因而对于HPLC校准曲线，回归线的斜率应由也是最易变化的最高浓度的标准物首先确定。

绘有13条甲型肝炎病毒校准曲线的图（如上所述在整2个月期间制得）示于图31。左面是13条曲线的线性图，右面是同样13条曲线的10g-10g转换图。该线性图由共用的坐标原点起各曲线呈现出明显的“嗽叭形”，清楚地证明甲型肝炎病毒的峰值面积随着浓度的增大其差别增大。其结果是曲线间斜率值变化。

这些校准曲线的10g-10g转换使得在整个浓度范围内差别（RSD）恒定。结果是如图31B所示减小了曲线间的斜率变化。

试样的制备步骤

A.甲型肝炎病毒的过程试样：

测定取自下列各阶段的过程试样：

1.过滤的溶胞产物

2.核酸酶处理的过滤的溶胞产物

3.PEG沉淀物再悬浮液

4.氯仿萃取的水相

5.阴离子交换产物

6.大小排阻产物

过滤的溶胞产物，核酸酶处理的过滤的溶胞产物，以及大小排阻产物的各个试样在注入前不应稀释。PEG沉淀再悬浮的试样应离心（10000xg5分钟）除去残留的颗粒然后注入。PEG沉淀物再悬浮的试样在注入前用CM80按1∶4（v/v）稀释。氯仿萃取的水相和阴离子交换产物分为未稀释测定和在注入前用CM80按1∶1（v/v）稀释测定，以使浓度落在校准曲线的范围内。对全部试样均重复测定三次并将三个测定结果平均。各试样于2-6℃贮存在自动取样器中同时等待注入。

少量的Triton残留在TSK PW 4000xl柱上，需要附加洗脱液将其去除。因而含有Triton的各试样（过滤的溶胞产物，以及核酸酶处理的过滤的溶胞产物）应接着注入CM80空白剂以保证在注入另外试样之前去除。各试样可以用SEC产物开始以相反的次序进行，以避免后期的洗脱影响峰值。

测定步骤

1.将6种校准标准物各注入50μl。甲型肝炎病毒的保留时间应为19.0+/-1分钟。

2.按上述方法制备试样。注射50μl。每个试样测定三次。

第Ⅲ节线性度、精确度和再现性

整个0.75-12.0μg/ml范围的13条校准曲线在5周时间内于不同天里制作。对每条曲线得到的回归方程用于计算包括该曲线的各校准标准物的浓度。与这6种校准标准物的标定浓度相比较的由13条曲线计算的结果列于下表1。

表17-1

纯甲型肝炎病毒的测量浓度与标定

浓度的比较，以回归线为基础计算

校准曲线甲型肝炎病毒校准标准物的标定浓度

(数据mm/dd)12μg/ml9μg/ml6μg/ml 3μg/ml1.5μg/ml0.75μg/ml

曲线1(10/6) 11.91 8.93 6.03 3.03 1.54 0.73

曲线2(10/7) 11.88 8.88 6.00 3.04 1.52 0.74

曲线3(10/8) 12.26 8.81 5.95 3.00 1.49 0.76

曲线4(10/10) 11.97 9.04 6.00 3.04 1.45 0.76

曲线5(10/13) 11.89 8.97 6.06 3.02 1.52 0.74

曲线6(10/14) 11.75 9.08 6.07 3.06 1.47 0.75

曲线7(10/20) 11.94 8.98 5.96 2.98 1.60 0.72

曲线8(10/21) 11.99 8.95 5.99 3.01 1.53 0.74

曲线9(10/22) 11.98 8.94 5.90 2.97 1.45 0.70

曲线10(10/26) 12.08 - 6.00 2.98 1.48 0.76

曲线11(10/28) 12.01 9.05 6.00 2.95 1.51 0.75

曲线12(11/18) 11.48 9.23 6.14 3.00 1.52 0.73

曲线13(12/3) 11.88 8.90 6.10 3.04 1.50 0.74

平均 11.92 8.98 6.02 3.01 1.51 0.74

标准方差 0.17 0.10 0.06 0.03 0.04 0.02

RSD 0.01 0.01 0.01 0.01 0.03 0.03

对于全部6个校准水平，各天之间的再现性很好，同时在整个浓度范围内RSD值小于3%。精确度也很好;对于12、9、6、3、1.5μg/ml和0.75μg/ml的标准物，全部被测量浓度均在标定浓度的5%之内。

掺料研究

为进一步估价HPSEC测定的特性和精确性，进行了掺料试验。

向阴离子交换产物和氯仿萃取的水相试样掺入等体积的取自同一组的SEC产物。结果列于以下表2。全部试样均重复测定3次。

表17-2

掺入过程试样的甲型肝炎病毒的回收

测量浓度理论浓度回收的掺

试样 (μg/ml) (μg/ml) 入物,%

氯仿萃取的水相 7.27

阴离子交换产物 8.87

SEC产物 5.40

被掺入的试样

氯仿萃取的水相 1:1 W/SEC 6.40 6.33 101

阴离子交换产物 1:1 W/SEC 7.18 7.14 101

对于两种试样均实现了掺料的完全回收，证实了HPSEC浓度检测的特性和精确性。

第Ⅳ节分析结果

概述

作为一个系列，色谱法提供了甲型肝炎病毒纯化过程图。过滤的溶胞产物和核酸酶处理的该溶胞产物的比较使得能证实BENZONASE的活度对于这些试样，在214nm和260nm处均获得色谱并将其综合。

比较最后4个过程试样，即PEG小片重悬浮试样、氯仿萃取的水相试样、阴离子交换产物试样和SEC产物试样，表明清除了2种主要的过程污染物，即聚集物和660kDa蛋白质污染物。对这些试样计算甲型肝炎病毒峰面积百分数使得有把握认为每个过程阶段被设计成起着去除这些污染物的作用。最后，HPSEC测定被用于计算最后3个过程阶段中甲型肝炎病毒的浓度。

已用HPSEC测定了取自MMD生产的10个组甲型肝炎病毒的以下各试样：过滤的溶胞产物试样、核酸酶处理的溶胞产物试样、PEG小片再悬浮试样、氯仿萃取过的水相试样、阴离子交换产物试样和SEC产物试样。对于每个过程试样而言色谱的图形在这10个组中是十分可再现的。

在本节中，说明该6个过程试样每一个的色谱，同时叙述由各试样获得的信息，以及三次测定的典型结果。

过滤的溶胞产物和核酸酶处理过的溶胞产物

在波长214nm和260nm处获得了取自每个组的过滤的溶胞产物试样和核酸酶处理的溶胞产物试样的色谱。对于这些试样中的每一个，在214nm获得的色谱图形完全不同于在260nm获得的图形。对这些色谱的比较分析反映出对这些试样进行HPSEC测定的目的，即要找到过滤的溶胞产物和核酸酶处理过的溶胞产物之间的差别，该差别能表明BENZONASE消化的完整性。因而本节中对过滤的溶胞产物与核酸酶处理过的溶胞产物的图形作比较，首先在214nm比较，然后在260nm作同样比较。列出由每个试样获得的特征数据，推荐用于BENZONASE活度完整性的定量值。

在214nm的过滤的溶胞产物和核酸酶处理的溶胞产物

在214nm的过滤的溶胞产物和核酸酶处理的溶胞产物的色谱图示于图32。在214nm，两个试样都显示出一系列部分分辨的峰。由于这些试样所得到的低分辨率，在甲型肝炎病毒区域内综合各个峰是不可能的，在214nm，由这些试样可获得的信息仅为所有峰的总UV面积。还将试样的三次分析的结果示于图32。该总UV214nm面积不包括在36分钟时的保留峰。作为BENZONASE消化的结果核酸酶处理的溶胞产物试样的总UV214nm面积比过滤的溶胞产物试样的低15%，并且两个色谱图（图32）的目测比较表明了甲型肝炎病毒区域内的吸收度的损失。但是因为所包括峰的低分辨率，所以对该消化的准确测量是不可能的。已对9个组测得了总的UV214nm面积，这些数值在附录A中给出。这些总的UV214nm面积未提供任何直接的或单独的过程效能信息，它们的用途只是监测试样的稳定性，因而常规的报告中不必计算总的UV214nm面积。

（A）过滤的溶胞产物

过滤的溶胞产物总UV面积214nm（μV）

1 27248238

2 26404744

3 26782947

平均 26811976

标准方差 344966

（B）核酸酶处理的溶胞产物

核酸酶处理的溶胞产物总UV面积214nm（μV）

1 22728263

2 22841564

3 22784419

平均 22784749

标准方差 46256

在260nm的过滤的溶胞产物和核酸酶处理的溶胞产物

在260nm的过滤的溶胞产物和核酸酶处理的溶胞产物的色谱图示于图33。在260nm，过滤的溶胞产物显示出具有5-6个可分辨峰的截然不同的图形。保留时间为17.2分和19.1分的前两峰包括甲型肝炎病毒-核酸加合物和甲型肝炎病毒。由于两个峰都在某种程度上有与其伴随的核酸，因此它们在260nm HPSEC图形中占支配地位。

过滤的溶胞产物试样与核酸酶处理的溶胞产物在260nm的比较（图33A和33B）提供了BENZONASE活度的清楚而明显的证明。过滤的溶胞产物试样的凸出的峰已经由于BENZUNASE的消化而完全去除，图33B在17-19分钟时看不出有可辨别的峰值。

BENZONASE消化作用的证实

对取自9个组的过滤的溶胞产物和核酸处理的溶胞产物试样所进行的分析示于以下表17-3。这些试样在17和19分钟峰的UV260nm面积表明，对于所有的试验组而言，加入BENZONASE导致这些峰的完全消除。因而对于该试样而言，证实BENZONASE活度所推荐的判据，应当是将核酸酶处理的滤胞产物中的17+19分钟峰UV260nm减小至小于过滤的溶胞产物中的17+19分钟峰值UV260nm的10%。

表17-3

对9个组用BENZONASE减小UV260nm面积

过滤的溶胞产物(A) 核酸酶处理的溶胞残余的

17+19分钟产物(B) A260

峰的面积 17+19分钟

峰的面积

组号# (260nm) (260nm) (B/A×100)

984 1240987 0 0

985 947988 0 0

1047 1085719 0 0

102 708663 0 0

101 831179 0 0

108 1060441 0 0

100 895005 0 0

139 1377974 0 0

236 1281608 0 0

平均= 1018495 0 0

标准方差=205034

图33(A) 过滤的溶胞产物

过滤的溶胞 17+19分钟峰(UV)的面积总UV面积(VV)260nm

产物

1 1192597 3193055

2 1259216 3034891

3 1271147 3094820

平均 1240987 平均 3107589

标准方差 34562 标准方差 65198

图33（B）核酸酶处理的溶胞产物

核酸酶处理的溶胞产物 17+19分钟峰（VU）的面积

1 0

2 0

3 0

平均和标准方差＝0

PEG小片再悬浮试样

下面图34示出了PEG小片再悬浮试样在214nm的色谱图。该试样的特征图形由以下几部份分辨的峰组成：聚集的物料、甲型肝炎病毒、660kDa污染物、其它低分子量污染物、以及盐的峰。

对该试样计算了甲型肝炎病毒的峰面积百分数（甲型肝炎病毒峰面积/总峰面积×100），该总面积不包括盐的峰面积。下面示出对PEG小片再悬浮试样三次分析的结果。

PEG小片再悬浮试样甲型肝炎病毒峰面积百分数

1 25.9

2 27.0

3 27.4

平均 26.8

标准方差 0.7

该试样的典型图形具有作为主要组分的660kDa污染物，并且聚集体的量是最可变的组分。典型组中聚集体的量小于所看到的量。对取自10个组的PEG小片再悬浮试样进行HPSEC分析的结果示于附录A的表A2。甲型肝炎病毒的峰面积百分数数值范围是18.5%-32.0%，全部由下述过程阶段成功地纯化。

因此对该试样不需要严格的报警极限，面积百分数值大于18%无疑是可接受的，但是直到在甲型肝炎病毒过程中遇到它们为止，将不会知道具有较低面积百分数值的作用。

氯仿萃取的水相试样

所取的氯仿萃取的水相试样的色谱图示于以下图35。甲型肝炎病毒的峰在该试样中是主要的峰（除了盐的峰之外），并且它与660kDa污染物和少量聚集体很好地分辨。

对该试样确定了甲型肝炎病毒的浓度，并计算了甲型肝炎病毒峰的面积百分数。面积百分数的计算不包括盐的峰。下面示出对氯仿萃取的水相试样三次分析的结果。

氯仿萃取的水相甲型肝炎病毒浓度(μg/ml) 甲型肝炎病毒峰面积分数

1 28.64 61.0

2 29.76 62.8

3 30.65 61.2

平均 29.68 平均 61.7

标准方差 0.82 标准方差 0.8

对取自10个组的氯仿萃取的水相试样进行HPSEC分析的结果示于附录A的表A2。全部组的甲型肝炎病毒峰面积百分数值的范围为60.0-72.8%，两个取一半的组显著较高，其峰面积百分数值分别为79.4和85.2%。甲型肝炎病毒的浓度是比较可变的，范围为14.4-29.7μg/ml。甲型肝炎病毒浓度的可变性可能与贯穿各连贯组的上游试样的变化有关。

PEG小片（图34）与氯仿萃取的水相（图35）的HPSEC图形的比较清楚地表明该萃取步骤对甲型肝炎病毒生产过程的重要性，该步骤选择性地去除了大量660kDa污染物而没有显著的使甲型肝炎病毒产量损失。虽然在两个顺次的色谱法步骤中能够去除660kDa污染物，但在二者的情况下如果660kDa是所供溶液的主要组分，那么就需要会降低甲型肝炎病毒产量的峰修整对策。此外，扩大的优化试验已经表明，萃取效率对混合时间的变化是相当灵敏的（见实施例15）。对于氯仿萃取的水相而言甲型肝炎病毒峰的面积百分数值使得能够在过程中对完全萃取和杂质的去除作定量的检验。

因而，对于氯仿萃取的水相试样推荐将＞60%作为甲型肝炎病毒峰面积百分数值的报警极限。面积百分数值小于60%应被看作是可能表明操作有问题（例如过程的混合装置问题），特别是如果经常发生这种情况的时候。

阴离子交换产物

图36示出了阴离子交换产物试样。甲型肝炎病毒峰是试样的主要组分，同时还存在少量聚集体、660kDa污染物、以及低分子量的污染物。

对于该试样确定了甲型肝炎病毒的浓度，以及该甲型肝炎病毒峰的面积百分数，但不包括盐的峰和残留峰。对取自R×2009854的阴离子交换试样三次分析的结果列于下面。

1 31.98 82.8

2 32.63 81.4

3 32.37 81.6

平均 32.32 平均 81.6

标准方差 0.27 标准方差 0.6

对取自10个组的阴离子交换产物试样进行HPSEC分析的结果列于附录A的表A2。所得的面积百分数值对全部组而言均在78.6-87.4%的范围内，同时半组的值大于90%。鉴于这些组供料纯度的增高，半组的面积面分数值的增加是在意料之中。

这些组的浓度值明显地分布在两倍的范围内，象对萃取步骤所观察到的那样，这种不同是可能的，因为对这些组的取样不同。

在甲型肝炎病毒生产过程中，阴离子交换色谱法起着作为抛光步骤的作用，它去除了一些660kDa污染物和其它低分子量的化合物，但阴离子交换产物的纯度取决于该步骤供料的纯度，它不能去除大量660kDa，但不因峰修整造成产量损失。因而该步骤不能对上一步操作的破坏给予补偿。一般情况下，整个阴离子交换色谱法步骤中甲型肝炎病毒峰面积百分数增加10-20%，供料纯度越高则所得产物的纯度越高。对于该试样，推荐的报警极限为面积百分数值＞75%，并推荐在该整个步骤中面积百分数的增加＞10%。当这两个判据均被满足时，生产过程和阴离子交换步骤就都起到了进展的作用。如果上一步骤失效，那么离子交换步骤自身要达到面积百分数值＞75%是可能失败的，而为达到面积百分数增加12%遇到失败则似乎表明阴离子交换步骤的很具体的过程中的问题，例如峰收集故障或柱中形成沟流。

大小排阴色谱法（SEC）产物

如SEC产物的图37所示，SEC产物的图形显示出高度纯化的甲型肝炎病毒。

对于该试样确定了甲型肝炎病毒的浓度。下面示出SEC产物重复分析的结果。

试样测定甲型肝炎病毒浓度（μg/ml）

1 17.34

2 16.34

平均 16.84

标准方差 0.50

对于取自10个组的SEC产物作HPSEC分析结果示于附录A的表A2。未对该试样计算面积百分数值。图37示出的图形清楚地显示出高纯的产物，没有可察觉量的聚集体和660kDa的污染物。但是，在整个60分钟内的SEC产物测定表明，在约49分钟晨存在有如图38所示的小的保留峰。该峰的大小由组与组不同而改变，同时所示出的组（图38）是观察数据的最高数量。该保留峰的鉴别应在该试样面积百分数值的计算之前进行，该计算表现出其纯度。直到进行这种鉴别为止，该试样的百分数值仅包括不计入的值和计入的值（保留时间16-32分钟）之间的峰值。由于这些限制，全部试验组的面积百分数值均为100%。

第Ⅴ节试样的稳定性

已证实通过HPSEC和EIA测量，过程试样可在达几个月的时间内保持稳定。在离子交换步骤可观察到少量的损失，一般在两周内小于10%。但是在这种初始的下降之后，这些试样甚至更保持稳定。此外，最终的SEC产物在长达至少一年的期间内是稳定的。

第Ⅵ节 EIA和HPSEC结果的比较

对取自11个组（组2至12）的各3个试样（氯仿萃取的水相、阴离子交换产物和SEC产物）所得到的EIA和HPSEC结果进行了比较。

标绘出这33个试样HPSEC浓度10g值与EIA浓度10g值之间关系的曲线示于图45。适合于该数据的回归线的斜率为0.88，相关系数（r）为0.94。接近于1的斜率和为0.94的r值表明在两种测定法间存在很好的相关性，特别是考虑到每次测量的固有差异则更是如此。

第Ⅶ节过程效能的一致性

对组2-14的HPSEC分析显示出十分稳定的和可再现的过程。在对取自生产中产出的组的过程试样进行扩展的HPSEC分析基础上，该纯化过程保证了为清除主要污染物的优良再现性。图46提供了一这样的测定，其中对各组标绘出了单体病毒的面积%。对纯化过程最后4个步骤流动组合物的测定显示出整个这些料的极大的一致性。在萃取和阴离子交换步骤显示出较高纯度的组10和11都是一半大小（half-size）的组。

实施例17：附录A

表17-A1

对溶胞产物试样核酸酶处理过的溶胞产物试样进行综合的数据。对全部试样均测定3次，并将三个检测结果平均。

过滤的溶胞产物试样

组号总面积,(214nm) 总面积,(260nm) 面积17+19分钟

(260nm)

1 26811976 3107589 1240987

2 22032023 2722501 947988

3 24322218 2696138 1085719

4 19934567 1588166 708663

5 23633378 1657484 831179

6 26311501 2590678 1060441

7 20336561 2225138 89505

8 27019891 3195019 1377974

9 25671116 2804591 1281608

平均= 23800264 2472839 1018495

标准方差= 2648361 565612 205034

核酸酶处理的溶胞产物试样

组号总面积,(214nm) 面积17+19分钟,(260nm)

1 22784749 0

2 21417391 0

3 22658768 0

4 17766458 0

5 17984377 0

6 23280554 0

7 17231064 0

8 23218865 0

9 21797999 0

平均＝20904469

标准方差＝2491146

表17-A2

对PEG小片再悬浮试样，氯仿萃取的水相试样，阴离子交换产物试样，以及SEC产物试样数据的综合。全部试样均测定三次，对三次测定的结果取平均值。

实施例18

临床研究结果

本发明的纯化疫苗已被接种给健康人。没有发现一系列与疫苗相关的不利影响。

单个的25单位剂量的疫苗的效力已在Monroe研究中在儿童身上得到证实，其结果公开在1992年8月13日出版的New England Journal of Medicine中[Werzberger等人，NEJM 327（no.7）;453-457，（1992年8月13日）]。都作为构成本发明一部份的Monroe研究的物质和生产的物质之间的区别在图1中突出出来，并将二者与在辊式瓶中生产的并用机械方法收获的阶段Ⅰ/Ⅱ研究的物质对照、（在该过程中具有不言而喻的附带的生产规模的限制）。本发明的甲型肝炎病毒的25单位剂量（25ng HAV蛋白质）的纯化制剂足够使2-16岁的儿童和青年在4周的免疫期内达到超过95%的血清转化。该同样的剂量已显示出能对儿童和青年在接种单剂量疫苗后早至21天开始提供100%的防护。

现已证实，体重和年龄是成年人的应答变量。在接种单个25单位剂量后一个月内，83%的成年人（≥18岁）和97%的儿童和青年（2-17岁）血清转化。间隔两周施用两个25单位剂量使成年人血清转化率提高到93%。在这两个年龄组中，施用第2或第3个25单位剂量之后血清转化七个月均导致大于99%的血清转化。血清阳性的持续性两个年龄组均为约100%达到12个月和36个月。因此显然单个的25单位剂量足以达到任何受体人群的至少80%在1个月免疫期内血清转化。该数据综合列于表18-1（“方式”栏表明在0和24周或0，2和24周施用25单位剂量;GMT＝几何平均的抗HAV抗体滴定度）。使用较大剂量能使较高百分数的受体血清转化。

表18-1

在初始免疫后指定周的血清转化

方式年令 4 24 28

0和24 18-29 83% 87% 100%

(100/120) (33/38) (24/24)

GMT-

应答者 21 41 2132

0,2,24 18-29 98% 100% 100%

(115/118) (33/33) (24/24)

GMT-

应答者 33 90 4379

0和24 30-89 72% 80% 100%

(265/370) (111/138) (71/71)

GMT-

应答者 22 34 1332

0,2,24 30-89 85% 89% 100%

(321/380) (118/132) (75/75)

GMT-

应答者 28 59 1976

除了以上数据外，在4周时呈血清阴性的一组患者（总共23例）在24周重新试验，并在28周引导回忆应答（在抗体滴定度增加＞10倍）。两个个体在投药6个月后的滴定度呈现近似6倍的增长。剩下的21个个体中，91%显示出血清转化和回忆应答。因此这些个体尽管在免疫后延长期内明显地呈血清阴性，但却是隐蔽的血清转化者，并且看来是通过本发明疫苗的免疫作用而受到防护。

Claims

1、一种商用规模的制备甲型肝炎病毒的方法，该病毒的纯度就SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色分析的蛋白质而言大于95%，该方法包括以下步骤：

a)在大表面积静态表面反应器(SSR)内于细胞片上大量培养甲型肝炎病毒；

b)通过使除垢剂渗透被感染的细胞片而由细胞片培养物上去除甲型肝炎病毒，使得甲型肝炎病毒从细胞培养物中放出；

c)通过核酸酶处理，在本阶段中任意地从收获的甲型肝炎病毒中去除非甲型肝炎病毒的特性核酸；

d)浓缩由细胞培养物通过膜或完全过滤去除的或由离子交换俘获的甲型肝炎病毒；

e)通过以下的联合步骤从步骤D)浓缩的甲型肝炎病毒中去除非甲型肝炎病毒特性的蛋白质：有机萃取、PEG沉积、离子交换(如果步骤C未予先完成，则包括去除污染的游离核酸)、和凝胶渗透色谱法步骤；以及

f)回收由步骤e)纯化的甲型肝炎病毒。

2、通过权利要求1的方法得到的纯化的甲型肝炎病毒。

3、权利要求1的方法，其中步骤a）包括将由HAV上清液感染的SSR取得的甲型肝炎病毒接种到静表面反应器，在其中于细胞片上培养MRC-5细胞，并且培养基通过静态表面反应器和一个回路恒定地循环，在该回路中完成反应器的控制、通气和培养物组分的补足。

4、权利要求1的方法，其中步骤b）包括通过用约0.05%-1%的Triton-X100溶液处理甲型肝炎病毒感染的细胞片以放出甲型肝炎病毒的方法收获甲型肝炎病毒。

5、权利要求1的方法，其中步骤c）包括用BENZONASE消化。

6、一种以商用规模生产失活的甲型肝炎病毒疫苗的方法，该疫苗以蛋白质为基，纯甲型肝炎病毒大于95%，该方法包括：

a）在包括有一台SSR的NUNC CELL FACTORIES、COSTAR CUBES、或STATIC SURFACE REACTORS （SSRs）中培养大量的甲型肝炎病毒（HAV），该SSR有常规的网元件，细胞可在其上以每单位体积高密度地生长，在其中MRC-5细胞的细胞片已被确立;

b）通过去除培养基并加入含0.1%TritonX-100的收获溶液收获被培养的HAV;

c）用BENZONASE处理收获的HAV，以消化污染的游离核酸;

d）通过在离子交换柱上俘获来浓缩BENZONASE处理的HAV，并用约0.35M NaCl洗脱俘获的HAV，继而用聚乙二醇沉淀;

e）再悬浮PEG沉淀的HAV并在剧烈搅拌下用氯仿/异戊醇（24∶1，v/v）萃取该浓缩的HAV，分离并保留水相;

f）对由DEAE TOYOPEARL 650M阴离子交换基质上以约90-150mM NaCl有机萃取的水相进行色谱分析，并用梯度达约1M NaCl洗脱HAV，稀释汇集的峰值HAV馏份至盐浓度小于约150mM而HAV浓度小于约20μg/ml，使得HAV沉淀变得最小或消除;

g）收集由步骤f）得到的峰值HAV馏分，并在串列式大小排阴柱TOYOPEARL HW55S和HW65S上的HAV进行色谱分析;

h）通过用1/1000浓度的富尔马林处理5天使凝胶过滤的HAV失活，继而无菌过滤，吸附到氢氧化铝上或与氢氧化铝共沉淀，再配制成相当于每剂量25-100ng失活的纯化HAV的单位剂量。

7、一种防止HAV感染的方法，该方法包括用免疫有效量的权利要求6方法的产物免疫。

8、按照权利要求6所述方法制备的HAV疫苗。

9、一种培养HAV的方法，该方法包括使HAV在任意包括钛和不锈钢网的常规网元件的COSTAR CUBE或STATIC SURFACE REACTOR中生长。

10、权利要求9的方法，该方法包括生产约5000-50000剂量每剂量25ng的取自单个COSTAR CUBE培养容器的含大于95%纯HAV的失活HAV疫苗。

11、一种甲型肝炎病毒的纯化制剂，其中大于95%的蛋白质是甲型肝炎病毒特性物，该制剂小于7%的蛋白质物质是非HAV核酸或脂类，而制剂的约0-180%是葡萄糖的碳水化合物。

12、权利要求11的制剂，其中甲型肝炎病毒被福尔马林失活。

13、权利要求12的制剂，它是由以含约100-1000μg氢氧化铝的蛋白质为基的25-100ng剂量的HAV配制的。

14、一种甲型肝炎病毒的纯化制剂，它含有下列特性物，其中各种特性物均按每μg蛋白质为基础给出，并且括弧中的方法用于确定该特性物：

a）脂类含量（气相色谱法）：＜0.1μg

b）由葡萄糖确定的碳水化合物 0.1-2.5μg

非葡萄糖碳水化合物＜0.1μg

（TFA水解，Dionex）

c）甲型肝炎病毒特性蛋白质＞0.95μg

（氨基酸分析和Western印迹）

d）甲型肝炎病毒特性RNA 0.1-0.2μg

e）污染的DNA ＜0.001μg。

15、权利要求14的制剂，其中甲型肝炎病毒被福尔马林失活。

16、权利要求15的制剂，该制剂被吸收在氢氧化铝之上。

17、一各失活甲型肝炎病毒的纯化制剂，使相当于约25ng氨基酸分析为基的甲型肝炎病毒蛋白质的单个25单位剂量足以使2-16岁的儿童和青年在4周免疫期内达到95%或更大的血清转化。

18、一种失活甲型肝炎病毒的纯化制剂，使相当于约25ng-100ng氨基酸分析为基的甲型肝炎病毒的1-3个25-100单位剂量足以使受体人群在4-28周免疫期内达到80-95%的血清转化。

19、权利要求1的方法，该方法包括在静态表达反应器中培养甲型肝炎病毒，并以约0.010-0.3ml/cm²/日的速率补充和去除适当的培养基。

20、权利要求1的方法，该方法包括在静态表面反应器中培养甲型肝炎病毒，并以恒定的速率补充和去除培养基。

21、一种甲型肝炎病毒病菌，该疫苗每25-100单位/0.1-1ml的剂量中含有下列额定组分：

组分含量氯化钠 900-9000μg 铝 50-500μg 四硼酸钠 3.8-38μg 甲醛＜0.4μg 葡萄糖（聚合物） 0-1000ng 蛋白质 25-100ng 氯仿＜44ng HAV RNA 2-20ng 非葡萄糖碳水化合物 0-20ng 脂肪酸＜20ng 新霉素＜4ng MRC－5 DNA ＜0.02ng 牛血清清蛋白＜0.1ng BENZONASE ＜0.0001ng

22、一种甲型肝炎病毒疫苗，该疫苗每25单位/0.5ml剂量含有下列额定组分：

组分含量氯化钠 4500μg 铝 250μg 四硼酸钠 19μg 甲醛＜200ng 葡萄糖（聚合物）＜20ng 蛋白质＜25ng 氯仿＜22ng HAV RNA 5ng 非葡萄糖碳水化合物＜4ng 脂肪酸＜1ng 新霉素＜1ng MRC－5 DNA ＜0.005ng 牛血清清蛋白＜0.02ng BENZONASE ＜0.00002ng

23、一种失活甲型肝炎病毒的纯化制剂，使相当于约25ng氨基酸分析为基的甲型肝炎病毒蛋白质的单个25单位剂量足以使2-16岁的儿童和青年在免疫后早至21天达到95%或更高的防护作用。