CN106367402B - 用于纯化体外产生的病毒的方法及对于病毒的清除测定 - Google Patents

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Abstract

本文提供了一种使用具有至少一种去垢剂的组合物纯化体外产生的无包膜病毒或假包膜病毒(pseudo‑enveloped virus)的方法。还提供了一种可使用多种去垢剂的纯化方法，以及一种确定样品中无包膜病毒或假包膜病毒的存在或水平的方法。

Description

用于纯化体外产生的病毒的方法及对于病毒的清除测定
描述
优先权和相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年7月23日提交的美国临时申请62/196,004的优先权的权益，其在此通过引用以其整体明确并入。
序列表的引用
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表作为命名为DURC6_007AUS_SEQLIST.txt的文件提供，该序列表大小为1,081字节，创建日期为2016年5月31日且最后修改日期为2016年5月31日。该电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入本文。
背景
领域
本发明涉及病毒学领域，更确切地，涉及纯化在细胞培养物中繁殖的及用于在病毒清除研究中使用的无包膜病毒或假包膜病毒诸如，戊型肝炎病毒(HEV)、甲型肝炎病毒(HAV)和猪细小病毒(PPV)的方法。
相关技术描述
所有的血液来源的产品和血浆来源的产品的临床使用携带感染性血源性病原体传播的潜在风险。风险的缓解可通过在血液来源的产品和血浆来源的产品的制造过程中实施病原体减少步骤来实现。为了开发和证明此类病原体减少步骤的效力，进行了病毒清除研究。在这些研究期间，已知量的病毒被掺入血液或血浆产品的中间体中，然后被掺入的样品使用实验室规模模式(按比例缩小的模式)的包括病原体减少步骤的制造过程来处理。在病原体减少步骤期间的病毒减少和/或清除通过比较在该步骤之前和之后的病毒的量来确定。
为了保证病毒清除数据的有效性，按比例缩小的模式必须准确地代表大规模单元操作，且病毒掺入物(virus spike)应该代表潜在的污染物。例如，病毒掺入物在体外的培养可能需要血清，且病毒掺入物中血清的存在可影响牵涉无血清产物中间体的清除研究。非病毒污染物，诸如外来宿主细胞膜、蛋白和核酸的存在也可能干扰下游步骤(其中产物中间体假定被高度纯化)期间病毒清除的准确评估。因此，去除可影响按比例缩小的模式的性能和相关性的病毒掺入物污染物是重要的。
概述
在一些实施方案中，本发明包括基于用去垢剂处理包含无包膜病毒或假包膜病毒的样品的方法，纯化在细胞培养物中繁殖的无包膜或假包膜病毒的方法。在该方法的一些实施方案中，在细胞培养物中繁殖的病毒是甲型肝炎病毒(HAV)。在该方法的一些实施方案中，在细胞培养物中繁殖的病毒是猪细小病毒(PPV)。在该方法的一些优选实施方案中，在细胞培养物中繁殖的病毒是戊型肝炎病毒(HEV)。在该方法的一些实施方案中，病毒在体外细胞培养物中产生。在该方法的一些实施方案中，体外细胞培养物包括建立的细胞系。在该方法的一些实施方案中，建立的细胞系选自由HepG2(ATCC号HB-8065)和HepG2/C3A(ATCC号CRL-10741)组成的组。在该方法的一些实施方案中，去垢剂选自由十二烷基硫酸锂、TritonX-100及其混合物组成的组。在该方法的一些实施方案中，Triton X-100的浓度为0.5％且十二烷基硫酸锂的浓度为0.1％。在该方法的一些实施方案中，处理的步骤进行1小时。在该方法的一些实施方案中，样品是从澄清的病毒感染的细胞裂解物悬液的超速离心获得的上清液。在该方法的一些实施方案中，任选地，样品是来源于澄清的病毒感染的细胞裂解物悬液的横向流过滤(transflow filtration)的滞留物。
提供了一种测量样品中无包膜病毒或假包膜病毒的水平的方法，该方法包括以下的步骤：a)向包含细胞系和培养基的混合物提供样品；b)孵育以允许该无包膜病毒或假包膜病毒的繁殖以获得孵育的部分，如果该无包膜病毒或假包膜病毒存在于样品中的话；c)用至少一种去垢剂处理以获得处理的部分；d)收集所处理的部分的一部分以获得收集的部分；以及e)测量所收集的部分中该无包膜病毒或假包膜病毒的水平。在该方法的一些实施方案中，样品从哺乳动物中获得。在该方法的一些实施方案中，样品包括血浆或血液。在该方法的一些实施方案中，该无包膜病毒或假包膜病毒是HAV。在该方法的一些实施方案中，该无包膜病毒或假包膜病毒是PPV。在该方法的一些优选的实施方案中，该无包膜病毒或假包膜病毒是HEV。在该方法的一些实施方案中，病毒在包含建立的细胞系的体外细胞培养物中繁殖。在该方法的一些实施方案中，细胞系选自由HepG2(ATCC号HB-8065)和HepG2/C3A(ATCC号CRL-10741)组成的组。在该方法的一些实施方案中，样品包括由通过膜横向流过滤所孵育的部分的一部分获得的第一滞留物。在该方法的一些实施方案中，任选地，样品包括由通过膜横向流过滤所孵育的部分的一部分以获得第一滞留物并离心该第一滞留物获得的第一上清液。在该方法的一些实施方案中，样品用至少一种去垢剂或任选地去垢剂的混合物来处理以获得第一溶液，该方法还包括：a)提供通过离心第一溶液获得的第一沉淀(pellet)；b)提供通过将该第一沉淀重悬于PBS(磷酸盐缓冲盐水)中获得的第二溶液；c)提供通过将第二溶液澄清获得的第三溶液；d)提供通过使用膜过滤第三溶液获得的第一滤液；以及e)提供通过超滤第一滤液获得的第二滞留物，其中该第二滞留物包含所处理的部分。在该方法的一些实施方案中，测量无包膜病毒或假包膜病毒的水平包括检测生物物质，其中该生物物质包括病毒的多核苷酸序列和/或多肽序列，并且其中该生物物质是HEV核糖核酸。在该方法的一些实施方案中，测量生物物质包括：a)提供通过将所处理的部分的一部分与裂解溶液混合获得的包含HEV核糖核酸的第一反应混合物；b)提供通过将第一试剂添加至第一反应混合物获得的第二反应混合物，其中该第二反应混合物包含与HEV核糖核酸互补的脱氧核糖核酸；c)将第二试剂添加至第二反应混合物，该第二试剂至少部分地与在该脱氧核糖核酸内的序列互补；d)将第三试剂添加至第二反应混合物，该第三试剂至少部分地与在该脱氧核糖核酸内的序列互补；e)扩增在该脱氧核糖核酸内被第二试剂和第三试剂包含的序列；以及f)测量所扩增的序列的浓度。在该方法的一些实施方案中，第二试剂和第三试剂包含选自由以下组成的组的寡核苷酸序列：
a)5’-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3’(SEQ ID NO:1)；
b)5’-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3’(SEQ ID NO:2)以及
c)5’-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3’(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方案中，本发明包括一种基于用至少一种阴离子去垢剂诸如十二烷基硫酸锂(LDS)、或至少一种非离子去垢剂诸如Triton X-100或两者的组合处理包含无包膜病毒或假包膜病毒的样品的方法，纯化在细胞培养物中繁殖的无包膜病毒或假包膜病毒的方法，允许获得在清除研究中其表现与可能潜在地存在于高度纯化的工艺流中的那些病毒的表现大概相同或接近相同的病毒。在一些实施方案中，通过该方法的以上描述的一些实施方案产生的病毒将是在血液来源的蛋白和/或血浆来源的蛋白的制造过程中测试下游步骤的病毒减少和/或清除能力的合适的掺入物。
在一些实施方案中，基于一种处理方法纯化在细胞培养物中产生的病毒的方法包括：澄清病毒感染的材料；通过膜横向流过滤混合物的至少一部分，以获得第一滞留物；以及离心该第一滞留物以获得第一上清液。该处理方法包括：用至少一种去垢剂处理第一上清液以获得第一溶液；其中该方法还包括：在所述处理之后，离心该第一溶液以获得第一沉淀；重悬该第一沉淀以获得第二溶液；使第二溶液澄清以获得第三溶液；使用膜过滤第三溶液以获得第一滤液；以及超滤第一滤液以获得第二滞留物，该第二滞留物提供待收集的所处理的部分的至少一部分；其中所述至少一种去垢剂选自由十二烷基硫酸锂、Triton X-100及其混合物组成的组；其中Triton X-100的浓度为0.5％且LDS的浓度为0.1％；其中所述用至少一种去垢剂处理第一上清液进行1小时。
在一些实施方案中，基于一种处理方法纯化在细胞培养物中产生的病毒的方法包括：澄清病毒感染的材料；通过膜横向流过滤混合物的至少一部分，以获得第一滞留物。该处理方法包括：用至少一种去垢剂处理第一滞留物以获得第一溶液；其中该方法还包括：在所述处理之后，离心该第一溶液以获得第一沉淀；重悬该第一沉淀以获得第二溶液；将第二溶液澄清以获得第三溶液；使用膜过滤第三溶液以获得第一滤液；以及超滤第一滤液以获得第二滞留物，该第二滞留物提供待收集的所处理的部分的至少一部分；其中所述至少一种去垢剂选自由十二烷基硫酸锂、Triton X-100及其混合物组成的组；其中Triton X-100的浓度为0.5％且LDS的浓度为0.1％；其中所述用至少一种去垢剂处理第一滞留物进行1小时。
附图简述
图1示出了根据本文公开的一些实施方案，横向流过滤HEV(TFF HEV)和TFF上清液(Supe)HEV病毒掺入物的制备。
图2示出了根据本文公开的一些实施方案制备的TFF HEV和TFF Supe HEV病毒掺入物的相对纯度。
图3示出了根据本文公开的一些实施方案的TFF HEV、Triton TFF HEV和Triton/LDS TFF HEV病毒掺入物的制备。
图4示出了引物和探针的核苷酸序列。
详述
用于产生无包膜病毒HEV的有效的细胞培养系统最近已被建立，且数据指示，细胞培养物来源的HEV类似于在血液中发现的HEV，在于它们两者均与脂类缔合。因此，未处理的澄清的细胞培养物裂解物或培养物上清液可以被用作以相对粗制产物中间体的上游步骤的清除研究中的病毒掺入物。然而，未处理的病毒掺入物的使用可能不适合于评价下游步骤(其中工艺流呈相对高的纯度)期间的HEV清除。
本发明涉及一种用于制备适合在用于下游制造过程步骤的病毒清除研究中使用的相对高纯度和高滴度的HEV掺入物的方法。
由于体外培养HEV中的困难，基于细胞培养物的HEV感染性测定在先前是不可容易地获得的。在本文公开的一些实施方案中，高滴度HEV在细胞培养物中的繁殖通过使用补充有聚凝胺的培养基是可能的。
尽管HEV在技术上被认为是无包膜病毒，在细胞培养物中繁殖的HEV当它从细胞释放时通常包含膜片段/脂类。这些膜组分可保护病毒免于杀病毒处理，诸如冻干的饼状物的液体加热或干燥加热。HEV可用去垢剂诸如吐温处理以去除膜碎片，但所处理的病毒通常保持对通过加热灭活的耐受性。
在一些实施方案中，与细胞培养物HEV缔合的脂类可通过用triton X-100的处理来去除。在一些实施方案中，与细胞培养物HEV缔合的脂类可通过用十二烷基硫酸锂(LDS)处理来去除。在一些实施方案中，与细胞培养物HEV缔合的脂类可通过用triton X-100和十二烷基硫酸锂(LDS)的组合处理来去除。在一些实施方案中，所得的病毒制品仍然是感染性的。在一些实施方案中，外来的非病毒污染物的浓度在病毒制品中被降低。在一些实施方案中，病毒也更易于被杀病毒处理诸如加热灭活。
HEV在细胞培养物中不产生细胞病变效应(CPE)。因此，HEV检测是基于最初由国立卫生研究院(National Institutes of Health)(NIH)开发的PCR测定。在一些实施方案中，该PCR测定被改良以增加灵敏度。在一些实施方案中，在该PCR测定中使用的引物中的一个被改变。在一些实施方案中，在该PCR测定中使用的反向引物被改变。在一些实施方案中，在该PCR测定中使用的探针被重新设计。一种全新的探针被设计以用于该PCR测定。在一些实施方案中，对于病毒滴度的确定，该PCR测定被用来将样品评分为阳性的或阴性的。
在一些实施方案中，本发明涉及包括以下的方法：通过使用补充有聚凝胺的培养基，在细胞培养物中繁殖高滴度HEV；用triton X-100/LDS处理细胞培养物HEV以去除膜脂类/碎片；以及通过灵敏PCR测定检测HEV。
在一些实施方案中，该方法可以是对HEV特异的。在一些实施方案中，用于病毒繁殖和纯化的方法可被应用于其他无包膜病毒。在一些实施方案中，用于病毒繁殖和纯化的方法可被应用于其他假包膜病毒。在一些实施方案中，用于病毒繁殖和纯化的方法可被应用于HAV。在一些实施方案中，用于病毒繁殖和纯化的方法可被应用于PPV。在一些优选的实施方案中，用于病毒繁殖和纯化的方法可被应用于HEV。
在一些实施方案中，本发明可用来进行评价多种制造步骤以及中间产品和最终产品的HEV去除/灭活能力的研究。在一些实施方案中，本发明可用来进行评价多种制造步骤以及中间产品和最终产品对于其他病毒的去除/灭活能力的研究。在一些实施方案中，其他病毒是无包膜病毒。在一些实施方案中，其他病毒是假包膜病毒。在一些实施方案中，其他病毒是HAV和PPV。
在一些实施方案中，本发明可提供对多种医学或临床产品诸如血液和/或血浆的来自HEV的安全性的保证。在一些实施方案中，本发明可提供对多种医学或临床产品诸如血液和/或血浆的来自其他病毒的安全性的保证。在一些实施方案中，其他病毒是HAV和PPV。
在一些实施方案中，本发明涉及一种纯化体外产生的无包膜病毒或假包膜病毒的方法。在一些实施方案中，本发明涉及一种纯化体外产生的HEV的方法。在一些实施方案中，纯化包括用包含至少一种阴离子去垢剂和/或一种非离子去垢剂，诸如十二烷基硫酸锂和/或triton X-100的组合物的去垢剂处理步骤。
在一些实施方案中，设想了在包含至少一种去垢剂的组合物中，该去垢剂是非离子去垢剂。在一些实施方案中，设想了在包含去垢剂的组合的组合物中，一种去垢剂是非离子的，且另一种去垢剂是阴离子的。在一些实施方案中，设想了在包含至少一种阴离子去垢剂的组合物中，该去垢剂是LDS。在一些实施方案中，设想了在包含至少一种非离子去垢剂的组合物中，该去垢剂是Triton X-100。在一个优选的实施方案中，组合物包含多于一种去垢剂。在一个优选的实施方案中，组合物包含至少两种去垢剂。在一个优选的实施方案中，组合物包含一种阴离子去垢剂和一种非离子去垢剂。在一个优选的实施方案中，阴离子去垢剂是LDS且非离子去垢剂是Triton X-100。
在一些实施方案中，至少一种去垢剂以足够使其发挥在本发明的纯化的方法中的功能的浓度来使用。在一些实施方案中，两种去垢剂各自以足够使其发挥在本发明的纯化的方法中的功能的浓度来使用。在一些实施方案中，Triton X-100的浓度在0.1％v/v至2.5％v/v的范围内。在一些优选的实施方案中，Triton X-100的浓度为0.5％v/v。在一些实施方案中，LDS的浓度在0.02％v/v至0.5％v/v的范围内。在一些优选的实施方案中，LDS的浓度为0.1％v/v。
在一些实施方案中，用包含一种或更多种去垢剂的组合物的处理被进行本领域普通技术人员所需要和确定的持续时间。在一些实施方案中，该处理进行5分钟至1天。在一些优选的实施方案中，该处理进行10分钟至3小时。在一些优选的实施方案中，该处理进行1小时。
在一个最优选的实施方案中，使用包含0.5％Triton X-100和0.1％LDS的组合物，且用该组合物的处理步骤进行1小时。在一些实施方案中，孵育在37℃进行1小时。
在一些实施方案中，作为进行本发明的纯化方法的起始材料，使用从病毒感染的细胞培养基或澄清的病毒感染的细胞裂解物悬液(两者均来源于病毒感染的细胞培养物)的超速离心获得的上清液。在一个优选的实施方案中，使用从澄清的病毒感染的细胞裂解物悬液的超速离心获得的上清液。
在一些实施方案中，作为进行本发明的纯化方法的起始材料，使用在横向流过滤病毒感染的细胞培养基或澄清的病毒感染的细胞裂解物悬液(两者均来源于病毒感染的细胞培养物)之后获得的滞留物。在一个优选的实施方案中，使用在横向流过滤澄清的病毒感染的细胞裂解物悬液之后获得的滞留物。
在第一实施方案中，纯化方法可包括以下步骤：
a)将起始材料澄清；
b)通过适当的膜横向流过滤步骤a)的溶液，以获得对应的滞留物；
c)超速离心步骤b)的滞留物，以获得对应的上清液；
d)用去垢剂或去垢剂的混合物处理所述步骤c)的上清液，以获得对应的溶液；
e)将步骤d)的溶液放置在30％蔗糖垫上，并以适当的速度和时间进行超速离心，以获得对应的沉淀；
f)将步骤e)的沉淀重悬于适当体积的PBS中，以获得对应的溶液；
g)将步骤f)的溶液澄清，以获得对应的溶液；
h)使用适当的膜超滤在步骤g)获得的溶液，以获得对应的滞留物；以及
i)过滤步骤h)的滞留物。
在一个优选的第一实施方案中，在步骤a)中，起始材料通过具有0.45μm孔径的过滤器来澄清。
在一个优选的第一实施方案中，在步骤b)中，用来进行横向流过滤的膜为300kDa膜。
在一个优选的第一实施方案中，在步骤c)中，超速离心以85,000xg进行1.5小时。
在一个优选的第一实施方案中，在步骤d)中，当使用去垢剂的混合物时，去垢剂的混合物包含0.5％Triton X-100和0.1％LDS。
在一个优选的第一实施方案中，在步骤e)中，超速离心以100,000xg进行8小时。
在一个优选的第一实施方案中，设想了，在步骤f)中，将沉淀重悬于PBS中。
在一个优选的第一实施方案中，在步骤g)中，步骤f)的溶液通过具有0.2μm孔径的过滤器来澄清。
在一个优选的第一实施方案中，在步骤h)中，在超滤中使用的膜为100kDa膜。
在一个优选的第一实施方案中，在步骤i)中，过滤通过0.2μm孔径的过滤器来进行。
在第二实施方案中，纯化方法可包括以下步骤：
a)将起始材料澄清；
b)通过适当的膜横向流过滤步骤a)的溶液，以获得对应的滞留物；
c)用去垢剂或去垢剂的混合物处理所述步骤b)的滞留物，以获得对应的溶液；
d)以适当的速度超速离心去垢剂处理的溶液并持续适当的时间，以获得对应的沉淀；
e)将步骤d)的沉淀重悬于适当体积的PBS中，以获得对应的溶液；
f)将步骤e)的溶液澄清，以获得对应的溶液；
g)使用适当的膜超滤在步骤f)获得的溶液，以获得对应的滞留物；以及
h)过滤步骤g)的滞留物。
在一个优选的第二实施方案中，在步骤a)中，起始材料通过具有0.45μm孔径的过滤器来澄清。
在一个优选的第二实施方案中，在步骤b)中，用来进行横向流过滤的膜为300kDa膜。
在一个优选的第二实施方案中，在步骤c)中，当使用去垢剂的混合物时，所述去垢剂的混合物为0.5％Triton X-100和0.1％LDS。
在一个优选的第二实施方案中，在步骤d)中，超速离心以85,000xg进行1.5小时。
在一个优选的第二实施方案中，在步骤e)中，沉淀被重悬于PBS中。
在一个优选的第二实施方案中，在步骤f)中，步骤e)的溶液通过具有0.2μm孔径的过滤器来澄清。
在一个优选的第二实施方案中，在步骤g)中，在超滤中使用的膜为100kDa膜。
在一个优选的第二实施方案中，在步骤h)中，过滤通过0.2μm孔径的过滤器来进行。
本发明涉及LDS和/或Triton X-100在用于纯化体外产生的无包膜病毒或假包膜病毒的方法中的使用。在一些实施方案中，病毒是无包膜的。在一些实施方案中，病毒是假包膜的。
在一个优选的实施方案中，体外产生的病毒是HEV。在一些实施方案中，体外产生的病毒可以是除了HEV以外的病毒。在一些实施方案中，体外产生的病毒是HAV。在一些实施方案中，体外产生的病毒是PPV。在最优选的实施方案中，体外产生的病毒是HEV。
在一些实施方案中，以上描述的体外产生在体外培养物中进行。在一些实施方案中，体外培养物是体外器官、组织或细胞培养物。在一个优选的实施方案中，体外产生在体外细胞培养物中进行。
在一些实施方案中，使用原代细胞培养物。在一些实施方案中，使用培养细胞系。原代细胞和培养细胞系可来源于任何生物体。例如，在一些实施方案中，设想了昆虫细胞的使用。在一些实施方案中，设想了哺乳动物细胞的使用。在一个优选的实施方案中，使用人培养细胞系。
在一个优选的实施方案中，肝细胞系被用于HEV产生和纯化。在另一个优选的实施方案中，肾细胞系被用于HEV产生和纯化。在一些实施方案中，肝细胞系可来源于健康的或患病的肝脏。在一些实施方案中，肝细胞系可以是恶性或良性细胞系。在一些实施方案中，肾细胞系可来源于健康的或患病的肾脏。在一些实施方案中，肾细胞系可以是恶性或良性细胞系。在一个优选的实施方案中，使用建立的细胞系。在一些实施方案中，该细胞是HepG2(ATCC号HB-8065)。在一些实施方案中，细胞是HepG2/C3A(ATCC号CRL-10741)。
在一些实施方案中，使用HEV感染性测定。在一些实施方案中，可制备具有～8log10感染性滴度的病毒掺入物。该测定呈相对短的持续时间(3-7天测定)。很少观察到或未观察到PCR背景，且可证明超过4log10的减少。因此，在一些实施方案中，使用基于PCR的病毒检测测定。在一些实施方案中，使用基于PCR的HEV检测测定。
另外的优选的实施方案-1
在一些实施方案中，提供了一种制备在细胞培养物中繁殖的无包膜病毒或假包膜病毒的方法，该方法包括：用包含一种或更多种去垢剂的组合物处理包含无包膜病毒或假包膜病毒的样品的步骤。在该方法的一些实施方案中，在细胞培养物中繁殖的病毒是HAV。在该方法的一些实施方案中，在细胞培养物中繁殖的病毒是PPV。在该方法的一些优选的实施方案中，在细胞培养物中繁殖的病毒是HEV。在该方法的一些实施方案中，病毒在体外细胞培养物中产生。在该方法的一些实施方案中，体外细胞培养物包括建立的细胞系。在该方法的一些实施方案中，建立的细胞系选自由HepG2(ATCC号HB-8065)和HepG2/C3A(ATCC号CRL-10741)组成的组。在该方法的一些实施方案中，去垢剂处理是用十二烷基硫酸锂和/或Triton X-100。在该方法的一些实施方案中，Triton X-100的浓度为0.5％且LDS的浓度为0.1％。在该方法的一些实施方案中，处理的步骤进行1小时。在该方法的一些实施方案中，样品是从澄清的病毒感染的细胞裂解物悬液的超速离心获得的上清液。在该方法的一些实施方案中，样品任选地是来源于澄清的病毒感染的细胞裂解物悬液的横向流过滤的滞留物。
另外的优选的实施方案-2
在一些实施方案中，提供了一种测量样品中无包膜病毒或假包膜病毒的水平的方法，该方法包括以下的步骤：
a)向包含细胞和培养基的混合物提供样品；
b)孵育以允许该无包膜病毒或假包膜病毒的繁殖以获得孵育的部分，如果该无包膜或假包膜病毒存在于样品中的话；
c)用至少第一去垢剂处理以获得处理的部分；
d)收集所处理的部分的一部分以获得收集的部分；以及
e)测量所收集的部分中该无包膜病毒或假包膜病毒的水平。
在该方法的一些实施方案中，样品从哺乳动物获得。在该方法的一些实施方案中，样品包括血浆或血液。在该方法的一些实施方案中，无包膜病毒或假包膜病毒是HAV。在该方法的一些实施方案中，无包膜病毒或假包膜病毒是PPV。在该方法的一些优选的实施方案中，无包膜病毒或假包膜病毒是HEV。在该方法的一些实施方案中，病毒在细胞培养物中产生。在该方法的一些实施方案中，细胞选自由HepG2(ATCC号HB-8065)和HepG2/C3A(ATCC号CRL-10741)组成的组。在该方法的一些实施方案中，样品包括由通过膜横向流过滤孵育的部分的一部分获得的第一滞留物。在该方法的一些实施方案中，样品任选地包括由通过膜横向流过滤孵育的部分的一部分以获得第一滞留物并离心该第一滞留物获得的第一上清液。在该方法的一些实施方案中，样品用至少第一去垢剂或任选地用去垢剂的混合物来处理，以获得第一溶液。在一些实施方案中，该方法还包括：
a)提供通过离心第一溶液获得的第一沉淀；
b)提供通过将该第一沉淀重悬于PBS中获得的第二溶液；
c)提供通过将第二溶液澄清获得的第三溶液；
d)提供通过使用膜过滤第三溶液获得的第一滤液；以及
e)提供通过超滤第一滤液获得的第二滞留物，其中该第二滞留物包含所处理的部分。
在该方法的一些实施方案中，测量无包膜病毒或假包膜病毒的水平包括检测生物物质。在该方法的一些实施方案中，生物物质包括病毒的多核苷酸序列和/或多肽序列。在该方法的一些实施方案中，生物物质是HEV核糖核酸。在该方法的一些实施方案中，测量生物物质包括：
a)提供通过将所处理的部分的一部分与裂解溶液混合获得的包含病毒核糖核酸的第一反应混合物；
b)提供通过将第一试剂添加至第一反应混合物获得的第二反应混合物，其中该第二反应混合物包含与病毒RNA互补的脱氧核糖核酸；
c)将第二试剂添加至第二反应混合物，该第二试剂与在该脱氧核糖核酸内的序列互补；
d)将第三试剂添加至第二反应混合物，该第三试剂与在该脱氧核糖核酸内的序列互补；
e)扩增在该脱氧核糖核酸内被第二试剂和第三试剂包含的序列；以及
f)测量所扩增的序列的浓度。
在该方法的一些实施方案中，第二试剂和第三试剂包含选自由以下组成的组的寡核苷酸序列：
a)5’-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3’(SEQ ID NO:1)；
b)5’-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3’(SEQ ID NO:2)以及
c)5’-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3’(SEQ ID NO:3)。
另外的优选的实施方案-3
在一些实施方案中，对于病毒的澄清，使用冷冻的粗制病毒贮备物。在一些实施方案中，当制备浓缩的和纯化的无包膜病毒贮备物时，将0.5％Triton X-100和0.1％LDS添加至解冻的粗制病毒贮备物并在37℃孵育1小时。
在一些实施方案中，解冻的粗制病毒贮备物的澄清通过在2℃至8℃下以3000x g至8000x g的速度离心15分钟至30分钟来进行。在一些实施方案中，上清液被取出并保留，且沉淀被弃去。在一些实施方案中，上清液通过0.45μm过滤器来过滤，然后通过300kDa膜横向流过滤，并收集TFF滞留物。
在一些实施方案中，对于超速离心，TFF滞留物在2℃至8℃下以约85000x g在浮桶式转头中在超速离心管中超速离心1.5小时。在一些实施方案中，来自超速离心的上清液被倾出并作为液体废弃物弃去。
在一些实施方案中，对于超滤，超速离心沉淀被重悬于不少于5mL的缓冲液，诸如PBS中。在一些实施方案中，沉淀悬液在2℃至8℃下以3000x g至4200x g澄清15分钟。在一些实施方案中，上清液被取出并放置进
Figure BDA0001054799860000141
UF过滤装置中以浓缩。在一些实施方案中，如需要，添加缓冲液诸如PBS以使终体积为约15mL(过滤器容量为15mL)。
在一些实施方案中，过滤装置在2℃至8℃下以约5000x g离心直到被保留的样品(浓缩和纯化的病毒贮备物)终体积不超过1mL。在一些实施方案中，大致的离心时间为约15分钟至约60分钟。
在一些实施方案中，浓缩和纯化的病毒贮备物被分成等份并冷冻在不高于-65℃下。
实施例
实施例1.TFF-HEV掺入物的制备。
切向流过滤(TFF)是用于分离和浓缩生物分子的熟知程序。关于TFF的另外的信息在，例如Larry Schwartz等人的“Introduction to Tangential Flow Filtration forLaboratory and Process Development Applications”(pall.com/main/laboratory/literature-library-details.page？id＝34212)中是容易可得的，其被通过引用以其整体并入本文。
HEV感染的HepG2或HepG2/C3A细胞被冷冻和解冻两次，并通过低速离心澄清，且通过0.45μm过滤器。澄清的溶液(～1L)通过两个300kDa膜通过TFF浓缩十倍，并且所得TFF滞留物(～100mL)在4℃以约85,000xg离心90分钟以沉淀病毒。收集超速离心上清液(～100mL)并保存以便处理为TFF-Supe HEV(实施例2)，同时将沉淀重悬于PBS中。重悬的沉淀然后通过0.2μm孔的过滤器过滤并通过100kDa膜超滤至约2mL的终体积。使该溶液通过0.2μm或0.1μm过滤器过滤灭菌，并储存在5℃直到准备用作TFF-HEV掺入物制品。
实施例2.TFF-上清液HEV(TFF-Supe HEV)掺入物的制备。
与细胞培养物来源的HEV缔合的脂类增加病毒浮力并从而降低通过超速离心沉淀病毒的效率。因此，在本发明的一些实施方案中，包含Triton X-100和十二烷基硫酸锂(LDS)的去垢剂混合物被添加至包含HEV的流体，以去除缔合的脂类并增加病毒回收率。
在37℃用0.5％Triton X-100和0.1％LDS处理约100mL由实施例1的澄清的HEV感染的细胞裂解物(～1L)的TFF和超速离心产生的超速离心上清液不少于30分钟，然后在5℃以100,000xg通过30％蔗糖垫超速离心8小时。所得的沉淀被重悬于PBS中，通过0.2μm孔过滤器过滤并通过100kDa膜超滤至约1mL的终体积。然后使该溶液通过0.2μm或0.1μm过滤器，并储存在5℃直到准备用作TFF-Supe HEV掺入物制品。
实施例3.比较根据实施例1和实施例2的方法产生的病毒掺入物的纯度。
SDS-PAGE被用来比较根据实施例1和实施例2的方法产生的病毒掺入物的相对纯度。如图2中所示，将以下样品的等分试样取出用于A280和定量PCR：初始粗制HEV、TFF滞留物、超速离心上清液、TFF-HEV和TFF-Supe HEV。如通过A280测量的，TFF滞留物和超速离心上清液具有比初始粗制HEV和TFF-HEV多10倍和比TFF-Supe HEV多40倍的蛋白(图2)。尽管蛋白浓度是不同的，HEV RNA在除了初始粗制样品以外的所有样品中的浓度为约9log10拷贝/mL(图2)。因此，由病毒(HEV RNA)与蛋白(A280)的比指示的相对纯度在TFF-Supe HEV和TFF-HEV中比在超速离心上清液和TFF滞留物中高得多。
样品的相对纯度可通过SDS-PAGE观察(图2)。将样品稀释或浓缩至约4AU，然后在包含DTT的样品缓冲液中加热，并上样到4％-20％梯度凝胶上。细胞培养基也被作为背景对照上样。在SDS-PAGE之后，将凝胶取出并用Instant Blue染色。结果与A280和PCR数据一致，示出了在TFF滞留物和超速离心上清液中最高的杂质水平。最丰富的蛋白在约70kDa处呈条带。由于它也存在于细胞培养基中，因此它最可能是胎牛血清(细胞和病毒繁殖必需的培养基补充剂以及可干扰下游清除研究的非病毒污染物)中存在的蛋白。在实施例1和实施例2描述的纯化方法期间，污染物的大部分被去除，且它的相对浓度在TFF Supe HEV中是最低的，随后是TFF HEV。
实施例4.比较根据实施例1和实施例2的方法产生的病毒掺入物的热稳定性。
进行了比较已根据实施例1或实施例2制备的TFF-HEV和TFF-Supe HEV掺入物的热稳定性的实验。将两种病毒制品掺入进PBS并在5℃、60℃、70℃或80℃孵育4小时。从每种测试溶液取出等分试样并如下滴定。制备样品的系列稀释液并添加至用HepG2或HepG2/C3A细胞接种的孔。病毒被允许在37℃吸附不少于1小时，并添加生长培养基。将板在37℃孵育不少于2天，然后从孔中吸出培养基，并用缓冲液(例如PBS)洗涤/吸打细胞不少于2x。板然后被使用
Figure BDA0001054799860000172
mRNA DIRECTTM微型试剂盒(Life Technologies)提取病毒RNA，或被储存在不高于-65℃下直到准备用于提取。在提取之后，洗脱液(聚A RNA)被立即处理用于PCR扩增或储存在不高于-65℃直到准备用于PCR扩增。
使用如先前讨论的以下引物和探针，使用一步RT-PCR来检测样品中的HEV RNA。用于每个反应的测定条件如下：
a)试剂：5.0μl 4x
Figure BDA0001054799860000173
Fast Virus 1-Step Master Mix(LifeTechnologies)、0.08μL 100mM引物F+R、0.04μL 100mM探针、0.4μL SUPERase In(LifeTechnologies)、4.4μL水和10μL模板(总计20μl)
b)反应：52℃持续10分钟、95℃持续30秒，以及95℃持续15秒、56℃持续45秒的40个循环。
PCR和循环阈值(Ct)值确定根据制造商的说明书使用AB 7500实时PCR系统(Applied Biosystems,Foster City,CA)和附带软件来进行。基于历史数据，阈值被手动设置在0.1，使得它通过所有标准曲线的指数期并确保每反应1RNA拷贝的检测。指示HEV RNA的存在的阳性PCR信号在与阈值相交的任何时间被记录。
在HEV滴定板中的所有的孔基于阳性PCR信号的存在或不存在被评分为阳性或阴性。然后使用适当的统计学方法：
Figure BDA0001054799860000174
MPN或泊松(Poisson)将病毒滴度被计算为TCID50/mL。
表1.从比较PBS中的病毒掺入物的热稳定性的实验获得的结果
Figure BDA0001054799860000171
*对数减少值(LRV)通过将从5℃下的log10HEV滴度减去60℃、70℃或80℃下的log10HEV滴度来计算
NT未测试
NA不适用
如表1中所示，当病毒掺入物根据本发明的方法的实施方案(实施例2)来制备时，病毒灭活达到60℃、70℃和80℃下的检测限值。另一方面，当使用根据实施例1(本领域的现有技术的方法，无去垢剂处理)获得的掺入物时，病毒在70℃或80℃加热4小时之后仍然存在。
来自公布的报告的数据表明，根据实施例1产生的病毒掺入物的热稳定性不同于自然界中发现的HEV的表现。例如，人肠道病毒是已知的最耐热病毒中的一些，且研究已显示被掺入进PBS的甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒和猫杯状病毒，在72℃加热18.35秒、5.44秒和7.39秒之后，90％被灭活(Suphachai N,Cliver DO.2002.J Virol Methods 104:217–225)。另外，60℃加热包含与人HEV密切相关的野猪HEV的肝悬液1小时，导致4.42log10病毒减少(Schielke A，等2011.Virol Jol 8:487-495)。因此，根据实施例1的方法(本领域的现有技术的方法，无去垢剂处理)产生的HEV掺入物不可以准确评估病毒清除研究中HEV的临床分离物的减少。
另一方面，根据本发明的方法(实施例2)产生的病毒掺入物被热处理完全失活，类似于在自然界中发现的HEV中观察到的。因此，根据本发明的方法制备的病毒可能是更适合在病毒清除研究中使用的掺入物。因此，在一些实施方案中，病毒掺入物根据实施例2的方法来制备。
实施例5.HEV制备方法和测定在干燥加热实验中的应用。
作为原理论证，TFF-HEV和TFF-Supe HEV掺入物按在实施例1和实施例2中所述来制备并在评价在因子VIII浓缩物制造过程的冷冻干燥/干燥加热(FD/DH)步骤期间的病毒减少和/或清除的实验中测试。FD/DH步骤是制造过程的最后步骤并在溶剂/去垢剂(S/D)处理步骤的下游。
对于FD/DH实验，掺有TFF-HEV或TFF-Supe HEV制品的因子VIII浓缩物被等分到小瓶中，并使用与在制造规模相同的冷冻干燥周期在实验室规模的冻干机中冷冻干燥。冷冻干燥的小瓶然后被放置于80℃烘箱中，并干燥加热持续多达75小时。
用于滴定的掺入病毒的产品的小瓶在冷冻干燥之前(初始)和之后且无干燥加热(FD/DH 0小时)、，在冷冻干燥随后干燥加热24小时(FD/DH 24h)之后和在冷冻干燥随后干燥加热75小时(FD/DH 75小时)之后取出。病毒掺入的FD/DH产品用高纯度水重构至其原始体积，连续稀释，并接种在被接种在96孔板内的HepG2或HepG2/C3A细胞上。病毒被吸附，添加最终的覆盖培养基，并将板放置在37℃培养箱中持续不少于3天。然后取出滴定板，吸出并提取病毒RNA或储存在-80℃下直到准备用于提取。从各个孔提取的RNA通过如在实施例3描述的PCR分析HEV。滴定孔被评分为HEV阳性或阴性，并确定病毒滴度。在该步骤期间，Log10HEV减少通过比较在初始和最终(FD/DH 75小时)小瓶中的log10病毒滴度来计算。
表2.从比较通过干燥加热处理的TFF-HEV和TFF-Supe HEV减少的实验获得的结果
Figure BDA0001054799860000191
*对数减少值(LRV)通过从初始log10HEV滴度减去75小时FD/DH处理的log10HEV滴度来计算。
如表2中所示，两种掺入物制品的滴度在冷冻干燥之前和之后是相似的，且通过冷冻干燥的减少是不显著的(小于1log10)。相比之下，通过80℃干燥加热处理的病毒灭活是显著的(大于1log10)且对于TFF-Supe HEV(LRV＝4.6)，比TFF HEV(LRV＝3.4)更大。根据实施例1的方法制备的TFF-HEV掺入物中高水平污染物的可能存在可保护病毒免于被加热灭活或可妨碍对衣壳化HEV RNA的有效破坏。
由于用于FD/DH处理的最后步骤的起始材料在倒数第二个步骤中被S/D处理，可能存在于因子VIII浓缩物制造工艺流中的任何潜在的病毒污染物将被脱脂化并可能比TFF-HEV(根据实施例1的方法制备的)更类似于TFF-Supe HEV(根据实施例2的方法制备的)。因此，对于TFF-Supe HEV的LRV最可能是对FD/DH处理步骤的HEV减少能力的更准确评估。
实施例6.去垢剂处理的TFF HEV掺入物的制备。
用于制备TFF-Supe HEV的过程相对耗时。因此，用于去垢剂处理的另外的方法被开发，用于TFF HEV掺入物制备。如在图3中所示，遵循与实施例1中相同的用于制备TFF-HEV的过程，例外是根据本发明的一些实施方案，用多种去垢剂处理TFF滞留物的步骤插入在5℃下以85,000xg超速离心1.5小时之前。将Triton TFF-HEV制品与0.5％Triton X-100在37℃孵育1.5小时，同时使用0.5％Triton X-100+0.1％LDS处理Triton/LDS TFF-HEV掺入物。在超速离心之后，仅沉淀被进一步加工成病毒掺入物。制备TFF-HEV和去垢剂处理的TFF-HEV的方法通过从纯化过程去除中间级分并如之前在实施例3中描述的滴定病毒来比较。结果示于表3中。
表3.制备TFF-HEV和去垢剂处理的TFF HEV的方法的比较
Figure BDA0001054799860000201
TFF-HEV和Triton/LDS TFF-HEV过程的病毒回收率是相当的，最终掺入物制品包含约8.3log10HEV。Triton TFF-HEV方法在沉淀病毒方面不太有效，因为输入病毒的大部分在超速离心上清液级分中丢失，并产生具有小于7log10HEV的掺入物。
实施例7.HEV制备方法和测定在液体加热实验中的应用。
巴氏消毒法是白蛋白制造过程中的最后步骤，并包括在60℃加热高度纯化的产品的小瓶不少于10小时。病毒如在实施例6中描述的来制备，并被掺入进25％白蛋白中，然后在5℃或60℃孵育7小时。然后取出样品用于病毒滴定，并且结果示于表4中。作为比较物，也展示了来自用掺入有TFF-Supe HEV(根据实施例2的方法制备的)的25％白蛋白的巴氏消毒法(10小时、60℃)的数据。
表4.从比较通过液体加热的TFF-HEV和去垢剂处理的TFF-HEV减少的实验获得的结果.
Figure BDA0001054799860000211
TFF-HEV是最耐热的测试病毒，且在热处理之后显示仅2.3log10的滴度减少。尽管Triton TFF-HEV的起始滴度比TFF-HEV低约一个log10，对于Triton TFF-HEV的LRV比对于TFF-HEV的高约一个log10。对于用Triton/LDS处理的TFF-HEV的LRV是三种TFF-HEV制品中最高的，并略微低于在用TFF Supe HEV(也是用Triton/LDS处理的一种病毒制品)掺入的白蛋白的巴氏消毒法之后实现的减少量。
实施例8.通过TFF、超速离心和超滤的病毒浓缩和纯化。
对于病毒的澄清，解冻冷冻的粗制病毒贮备物。当制备浓缩的和纯化的无包膜病毒贮备物时，将0.5％Triton X-100和0.1％LDS添加至解冻的粗制病毒贮备物并在37℃孵育1小时。澄清通过在2℃下至8℃以3000x g至8000x g的速度离心15分钟至30分钟来进行。取出并保留上清液，并弃去沉淀。上清液通过0.45μm过滤器过滤。
对于TFF，TFF系统被清洗并准备用于过滤。将过滤的病毒贮备物澄清。
对于超速离心，将TFF滞留物放置于超速离心管中。将管平衡直到重量在彼此的±0.05g内。将管装载进浮桶式转头并在2℃至8℃下以约85000x g离心1.5小时。在超速离心运行结束时，来自每个离心管的上清液被小心地倾出并作为液体废弃物弃去。将管倒置并允许在室温下在吸收巾上排水约5分钟。在排水之后，净化和处置巾。
对于超滤，超速离心沉淀被重悬于不小于5mL的PBS中。将沉淀悬液在2℃至8℃下以3000x g至4200x g澄清15分钟。取出上清液并放置进
Figure BDA0001054799860000221
UF过滤装置中以浓缩。如果需要，添加PBS以使终体积达到约15mL(过滤器容量为15mL)。将盖帽的过滤装置放置进离心机转头中并用平衡物(counterweight)平衡该转子。离心在2℃至8℃下以约5000x g来进行，直到被保留的样品(浓缩和纯化的病毒贮备物)终体积不超过1mL(大致离心时间为15分钟至60分钟)。
定义
HepG2：从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得的肝细胞癌细胞(ATCC号HB-8065)
DMEM：Dulbecco氏改良的Eagle培养基
FBS：胎牛血清
滴度：通过滴定确定的溶液中一种物质(病毒)的浓度或此类物质的强度
SK：Spearman-Karber是计算具有相对高浓度病毒的样品中的病毒滴度的统计学方法。当阳性孔在任何稀释度下的比例>25％时，使用该方法(图1)。
MPN：最大概率数是计算具有相对低浓度病毒的样品中的病毒滴度的统计学方法。当阳性孔在所有稀释度下的比例<25％时，使用MPN。
泊松：泊松是计算具有极低浓度病毒的样品中的病毒滴度的统计学方法。当未观察到阳性孔时，使用该方法。
ATCC：美国典型培养物保藏中心
HEV TFF滞留物：是已使用300kD TFF膜浓缩澄清的HEV细胞裂解物之后剩余的材料。HEV TFF滞留物被用来制备TFF HEV掺入物。
HEV TFF上清液是在将HEV TFF滞留物以约84780xg离心之后剩余的流出物。HEVTFF上清液被用来制备TFF Supe HEV掺入物。
TCID50对应于50％组织培养感染剂量(终点稀释测定)。它是对感染性病毒滴度的量度，定量出杀死50％的被感染的宿主或在50％的接种的组织培养细胞中产生细胞病变效应所需的病毒的量。
A280：在280nm处测量的吸光度，其指示蛋白浓度和/或量。
AU：吸光度单位。
病毒掺入物：具有已知病毒含量的病毒样品。
参考文献
1.Okamoto H(2011)Hepatitis E virus cell culture models.VirusResearch161:65–77.
2.Shukla P，等(2011)Cross-species infections of cultured cells byhepatitis E virus and discovery of an infectious virus–hostrecombinant.PNAS.108(6):2438–2443.
3.Shukla P，等(2012)Adaptation of a Genotype 3Hepatitis E Virus toEfficient Growth in Cell Culture Depends on an Inserted Human Gene SegmentAcquired by Recombination.J Virol 86(10):5697-5707
4.美国临时专利申请号61/431,377
5.美国临时专利申请号61/554,323
6.美国专利申请号13/978,839
7.国际PCT申请号PCT/US2012/020830
Figure IDA0001054799930000011
Figure IDA0001054799930000021

Claims (35)

1.一种纯化在细胞培养物中繁殖的戊型肝炎病毒(HEV)的方法，所述方法包括用去垢剂处理包含所述HEV的样品并且通过离心或超速离心与过滤或超滤两者纯化所述HEV的步骤，其中所述去垢剂是0.5％的Triton X-100与0.1％的十二烷基硫酸锂的混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒在体外细胞培养物中产生。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述体外细胞培养物包含建立的细胞系。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述建立的细胞系选自由ATCC号HB-8065的HepG2和ATCC号CRL-10741的HepG2/C3A组成的组。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述处理的步骤进行1小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是从澄清的病毒感染的细胞裂解物悬液的超速离心获得的上清液。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是来源于澄清的病毒感染的细胞裂解物悬液的横向流过滤的滞留物。
8.一种测量样品中HEV的水平的方法，所述方法包括以下的步骤：
a)向包含细胞系和培养基的混合物提供所述样品；
b)进行孵育以便如果所述HEV存在于所述样品中则允许所述HEV的繁殖以获得孵育的部分；
c)用0.5％的Triton X-100与0.1％的十二烷基硫酸锂的混合物处理以获得处理的部分；
d)收集所处理的部分的一部分以获得收集的部分；以及
e)测量所收集的部分中所述HEV的水平，
其中所述方法用于非诊断目的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述样品从哺乳动物获得。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述样品包括血浆或血液。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述病毒在包含建立的细胞系的体外细胞培养物中繁殖。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞系选自由ATCC号HB-8065的HepG2和ATCC号CRL-10741的HepG2/C3A组成的组。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述样品包括由通过膜横向流过滤所孵育的部分的一部分获得的第一滞留物。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述样品包括通过膜横向流过滤所孵育的部分的一部分以获得第一滞留物并离心所述第一滞留物获得的第一上清液。
15.根据权利要求8所述的方法，其中所述孵育的部分用去垢剂的混合物来处理，以获得第一溶液。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法还包括：
a)提供通过离心所述第一溶液获得的第一沉淀；
b)提供通过将所述第一沉淀重悬于PBS中获得的第二溶液；
c)提供通过将所述第二溶液澄清获得的第三溶液；
d)提供通过使用膜过滤所述第三溶液获得的第一滤液；以及
e)提供通过超滤所述第一滤液获得的第二滞留物，其中所述第二滞留物包含所处理的部分。
17.根据权利要求8所述的方法，其中测量所述HEV的水平包括检测生物物质。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述生物物质包括病毒的多核苷酸序列和/或多肽序列。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述生物物质是HEV核糖核酸。
20.根据权利要求19所述的方法，其中测量所述生物物质包括：
a)提供通过将所处理的部分的一部分与裂解溶液混合获得的包含所述HEV核糖核酸的第一反应混合物；
b)提供通过将第一试剂添加至所述第一反应混合物获得的第二反应混合物，其中所述第二反应混合物包含与所述HEV核糖核酸互补的脱氧核糖核酸；
c)将第二试剂添加至所述第二反应混合物，所述第二试剂至少部分地与在所述脱氧核糖核酸内的序列互补；
d)将第三试剂添加至所述第二反应混合物，所述第三试剂至少部分地与在所述脱氧核糖核酸内的序列互补；
e)扩增在所述脱氧核糖核酸内被所述第二试剂和所述第三试剂包含的序列；以及
f)测量所扩增的序列的浓度。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述第二试剂和所述第三试剂包含选自由以下组成的组的寡核苷酸序列：
a)5’-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3’(SEQ ID NO:1)；
b)5’-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3’(SEQ ID NO:2)以及
c)5’-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3’(SEQ ID NO:3)。
22.0.5％的Triton X-100与0.1％的十二烷基硫酸锂的混合物在制备用于测量样品中HEV的水平的组合物中的用途，其中当所述组合物被使用时，包括以下步骤：
a)向包含细胞系和培养基的混合物提供所述样品；
b)进行孵育以便如果所述HEV存在于所述样品中则允许所述HEV的繁殖以获得孵育的部分；
c)用0.5％的Triton X-100与0.1％的十二烷基硫酸锂的混合物处理以获得处理的部分；
d)收集所处理的部分的一部分以获得收集的部分；以及
e)测量所收集的部分中所述HEV的水平。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述样品从哺乳动物获得。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述样品包括血浆或血液。
25.根据权利要求22所述的用途，其中所述病毒在包含建立的细胞系的体外细胞培养物中繁殖。
26.根据权利要求22所述的用途，其中所述细胞系选自由ATCC号HB-8065的HepG2和ATCC号CRL-10741的HepG2/C3A组成的组。
27.根据权利要求22所述的用途，其中所述样品包括由通过膜横向流过滤所孵育的部分的一部分获得的第一滞留物。
28.根据权利要求22所述的用途，其中所述样品包括通过膜横向流过滤所孵育的部分的一部分以获得第一滞留物并离心所述第一滞留物获得的第一上清液。
29.根据权利要求22所述的用途，其中所述孵育的部分用去垢剂的混合物来处理，以获得第一溶液。
30.根据权利要求29所述的用途，其中当所述组合物被使用时，包括以下步骤：
a)提供通过离心所述第一溶液获得的第一沉淀；
b)提供通过将所述第一沉淀重悬于PBS中获得的第二溶液；
c)提供通过将所述第二溶液澄清获得的第三溶液；
d)提供通过使用膜过滤所述第三溶液获得的第一滤液；以及
e)提供通过超滤所述第一滤液获得的第二滞留物，其中所述第二滞留物包含所处理的部分。
31.根据权利要求22所述的用途，其中测量所述HEV的水平包括检测生物物质。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述生物物质包括病毒的多核苷酸序列和/或多肽序列。
33.根据权利要求32所述的用途，其中所述生物物质是HEV核糖核酸。
34.根据权利要求33所述的用途，其中测量所述生物物质包括：
a)提供通过将所处理的部分的一部分与裂解溶液混合获得的包含所述HEV核糖核酸的第一反应混合物；
b)提供通过将第一试剂添加至所述第一反应混合物获得的第二反应混合物，其中所述第二反应混合物包含与所述HEV核糖核酸互补的脱氧核糖核酸；
c)将第二试剂添加至所述第二反应混合物，所述第二试剂至少部分地与在所述脱氧核糖核酸内的序列互补；
d)将第三试剂添加至所述第二反应混合物，所述第三试剂至少部分地与在所述脱氧核糖核酸内的序列互补；
e)扩增在所述脱氧核糖核酸内被所述第二试剂和所述第三试剂包含的序列；以及
f)测量所扩增的序列的浓度。
35.根据权利要求34所述的用途，其中所述第二试剂和所述第三试剂包含选自由以下组成的组的寡核苷酸序列：
a)5’-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3’(SEQ ID NO:1)；
b)5’-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3’(SEQ ID NO:2)以及
c)5’-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3’(SEQ ID NO:3)。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210031000A (ko) 2018-01-29 2021-03-18 그리폴스 다이어그노스틱 솔루션즈 인크. 임상 시료 내의 파보바이러스 b19를 균질화하기 위한 방법
KR20210079543A (ko) 2019-12-20 2021-06-30 삼성전자주식회사 고대역폭 메모리 및 이를 포함하는 시스템
JP2023141423A (ja) * 2022-03-24 2023-10-05 国立大学法人 東京大学 ウイルスの精製方法
CN115181816B (zh) * 2022-08-10 2023-01-06 杭州纽创生物检测有限公司 一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4721675A (en) * 1982-02-01 1988-01-26 Abbott Laboratories Production of hepatitis A virus in vitro utilizing a persistently virus infected cell culture system
EP0593339A1 (fr) * 1992-10-14 1994-04-20 PASTEUR MERIEUX SERUMS ET VACCINS, Société Anonyme : Procédé de préparation d'antigènes et de vaccins de l'hépatite A (HAV)
CN1099798A (zh) * 1992-08-07 1995-03-08 麦克公司 甲型肝炎病毒疫苗
WO2003030624A2 (en) * 2001-10-12 2003-04-17 Chiron Corporation Hepatitis a virus nucleotide sequences, recombinant proteins and uses thereof
JP2008017777A (ja) * 2006-07-13 2008-01-31 Tottori Univ 肝炎の診断キット及び診断マーカー
CN101397335A (zh) * 1998-06-24 2009-04-01 基因创新有限公司 Hcv包膜蛋白颗粒:用于疫苗接种的用途
CN102892429A (zh) * 2010-03-17 2013-01-23 康奈尔大学 基于被破坏的腺病毒的抗滥用药物疫苗

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101018804A (zh) * 2004-07-27 2007-08-15 基诺美生物工程（制药）公司 纯化病毒包膜的方法
US7944468B2 (en) * 2005-07-05 2011-05-17 Northrop Grumman Systems Corporation Automated asymmetric threat detection using backward tracking and behavioral analysis

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4721675A (en) * 1982-02-01 1988-01-26 Abbott Laboratories Production of hepatitis A virus in vitro utilizing a persistently virus infected cell culture system
CN1099798A (zh) * 1992-08-07 1995-03-08 麦克公司 甲型肝炎病毒疫苗
EP0593339A1 (fr) * 1992-10-14 1994-04-20 PASTEUR MERIEUX SERUMS ET VACCINS, Société Anonyme : Procédé de préparation d'antigènes et de vaccins de l'hépatite A (HAV)
US5731187A (en) * 1992-10-14 1998-03-24 Pasteur Merteux Serums Et Vaccins Societe Anonyme Process for preparing hepatitis A (HAV) antigens and vaccines
CN101397335A (zh) * 1998-06-24 2009-04-01 基因创新有限公司 Hcv包膜蛋白颗粒:用于疫苗接种的用途
WO2003030624A2 (en) * 2001-10-12 2003-04-17 Chiron Corporation Hepatitis a virus nucleotide sequences, recombinant proteins and uses thereof
JP2008017777A (ja) * 2006-07-13 2008-01-31 Tottori Univ 肝炎の診断キット及び診断マーカー
CN102892429A (zh) * 2010-03-17 2013-01-23 康奈尔大学 基于被破坏的腺病毒的抗滥用药物疫苗

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Adaptation of a Genotype 3 Hepatitis E Virus to Efficient Growth in Cell Culture Depends on an Inserted Human Gene Segment Acquired by Recombination;P. Shukla et al.;《Journal of Virology》;20120307;第86卷(第10期);第5697-5707页 *
Development of a Novel Adenovirus Purification Process Utilizing Selective Precipitation of Cellular DNA;Aaron R. Goerke et al.;《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》;20050511;第91卷(第1期);第12-21页 *
Hepatitis E Virus (HEV) Strains in Serum Samples Can Replicate Efficiently in Cultured Cells Despite the Coexistence of HEV Antibodies: Characterization of HEV Virions in Blood Circulation;Masaharu Takahashi et al.;《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》;20100127;第48卷(第4期);第1112-1125页 *
Hepatitis E virus cell culture models;Hiroaki Okamoto et al.;《Virus Research》;20110221;第161卷;第65-77页 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016206243B2 (en) 2021-04-01
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CN106367402A (zh) 2017-02-01
US10336988B2 (en) 2019-07-02
ZA201604895B (en) 2021-04-28
BR102016016678A2 (pt) 2019-02-12
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JP6734137B2 (ja) 2020-08-05
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MX2016009266A (es) 2017-01-23

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