JPH10502943A - １以上の血漿誘導体を含む、品質保証された薬物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、１以上の血漿誘導体を活性物質または不活性成分として含む薬物を記載し、ここで、出発原料、または該血漿誘導体の製造時に生ずる中間体は、１つまたはそれ以上の複製可能な血液原ウイルスにより汚染されていないか、または規定された限界値を越えないウイルス負荷を有する。最終血漿誘導体を製造するための、このようにして品質の確かめられた出発原料または中間体を、少なくとも１つのさらなる実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかける。本発明はさらに、この薬物を製造するための方法、さらにはまた、品質保証された出発原料または中間体を製造するための方法を記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 １以上の血漿誘導体を含む、品質保証された薬物 本発明は、１以上の血漿誘導体を活性物質または不活性成分として含む薬物に 関し、またそのような薬物の製造のための品質保証された出発原料に関し、さら にはまた、これらの薬物を製造するための方法に関する。本発明はまた、品質保 証された出発原料、特に品質保証された血漿プールの製造方法にも関する。 ヒト血漿は、特に先天的または後天的な血漿成分の欠乏の場合における代替療 法に対する、医薬品製剤として、または血漿誘導体の製造のための出発原料とし て特に優れた臨床的重要性を有するものである。しかし、ヒト血漿を使用する場 合、医薬品製剤によって、または血漿誘導体によって運搬され得る、感染物質が 含まれていないことに注意しなければならない。恐らく血中に存在し得るであろ う感染物質には、とりわけ、ＨＩウイルスまたは肝炎ウイルス(Ａ型、Ｂ型、Ｃ 型または非Ａ非Ｂ型肝炎)といったような、血液によって運搬され得るウイルス( 血液原ウイルス)が含まれるが、血液により伝達され得るパルボウイルスもまた 含まれる。 血漿誘導体を含む薬物が非常に必要であることから、これらの薬物の経済的な 製造は、工業規模でのみ可能である。 血漿をドナーから得て、医薬品製剤の製造のためにプールする。従来のプール サイズは、約２,０００〜６,０００個の献血漿(plasma donations)である。たっ た１つの、ウイルスで汚染された献血漿により、血漿プール全体が汚染される危 険がある。 ２０世紀前半の後期という早い時期に、ヒトアルブミンが加熱により首尾よく ウイルス不含有製剤とされた。このことは最初、それらの熱感度から、血漿から 得ることができる他の薬物全てに対して不可能であった。今までのところ、適切 に製造されたアルブミンが何百万という場合において使用されている；それにも かかわらず、ヒト血液が有するウイルスが原因となる感染はいまだかつてなかっ た。対照的に、ウイルス感染、特に肝炎ウイルスによるウイルス感染、また１９ ８０年代以来、ＡＩＤＳウイルスによる大規模なウイルス感染もまた、血漿から 製造された多くの他の薬物に関して報告されている。 １９８０年ごろ、ウイルス汚染物質を不活性化する目的で、適切に安定化され た第VIII因子濃縮物に対して加熱処理が初めて行われた。しかし、最初に、第VI II因子活性の多大な損失が認めざるを得ず、実際の不活性化の可能性は未知のま まであった。 加熱処理方法を改良することにより、また他の新たな不活性化方法によって、 最終的には、血漿から薬物を製造することが可能となり、これは大抵の場合、レ シピエントにおけるウイルス感染をもたらさなかった。この開発に付随して、ウ イルス血症の疑いがあり、従って、血漿がウイルスを含む疑いのあるドナーおよ び献物(donations)を排除することを目的とした、ドナーおよび献物の選択にお ける改良もまたあった。 今しばらくの間、陽性の結果を与える献物を排除しようと、また血液製剤の製 造のための出発原料として使用すべき、より大きな血漿プールに、それらを取り 入れまいと、血中の幾つかのウイルス抗原または抗体の検出が利用されている。 疾患の症状またはあらゆる検査での異常検査結果を有していないが、それにもか かわらず、彼らの血中には幾つかのウイルスが長期間にわたり高濃度でも匿われ ている個々のドナーの場合、ある特定のウイルスによる、そのようなウイルス血 症の発生は現在、増幅方法の助けをもって、はっきりと検出することができる。 血漿ユニットをプールした後、ウイルスで汚染された、たった１つの献血漿は 、当然ながら希釈される；しかし、増幅反応の助けによるウイルスゲノム配列の 検出は非常に鋭敏なので、そのような希釈物中においてすら、ウイルスゲノムま たはそれらの配列をはっきりと検出することができる；また上述のように、それ らが一定の検出限界以下に落ち込むなら、感染の可能性という意味では、それら には、もはや臨床的関連はない。 Ｔhe ＥＥＣ Ｒegulatory Ｄocument Ｎote for Ｇuidance，Ｇuidelines for Ｍedicinal Ｐroducts Ｄerived from Ｈuman Ｂlood and Ｐlasma(Ｂiologica ls １９９２、２０：１５９−１６４)は、血漿ドナーおよび献血漿を調べるため の品質保証システムを提唱している。従って、各々の献血漿を、Ｂ型肝炎抗原ま たはＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２抗体といったようなウイルスマーカーの不在に 関する確認試験で分析しなければならないが、これは、これらが血漿ドナーの対 応するウイルス感染を示すからである。Ｃ型肝炎の感染を排除するための試験も また行うべきである。 欧州薬局方に従って、Ｂ型肝炎表面抗原およびＣ型肝炎ウイルスおよびＨＩＶ 抗体を測定するために、特別な試験を各々の献物に対して行うべきである（欧州 薬局方、第２版、第II部、１９９４年、８５３〜８５４頁)。 １９９５年３月１４日付のＦＤＡガイドラインは、付加的安全因子としての最 終産物(免疫グロブリン産物)のＰＣＲ試験を提供している。 提唱された試験にもかかわらず、これらのウイルスマーカーを単に調べるだけ では、個々の献血漿の安全性は十分に保証されないことがＥＥＣガイドラインに おいて力説されている。血漿試料中での該マーカーの不在が確認されたとしても 、ドナーのウイルス血症を排除することはできない。ウイルス抗原および対応す る抗体は、感染後すぐには検出することができないので、ウイルス感染の最初の マーカーは、感染源と接触してから数週間または数カ月後にしか発生しないこと が多い。感染後および抗体発生前の、この重要な期間は、通例、「ウィンドウ期 間(window period)」と呼ばれている。しかし、感染後、最初のウイルスマーカ ーを検出することができる時間ポイントは、ウイルスによって様々である。 さらに、血漿から製造される幾つかの薬物に関して、ウイルスを製造過程の途 中で消失させる、または不活性化すること、またそのような製品自体が非常にウ イルスに関して安全であることもまた知られるに至っている。 血漿誘導体のウイルス不活性化は、工業的規模で非常に上手く行われているが 、それにもかかわらず、ＡＩＤＳ、Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルスといった ような血液原ウイルスが稀に伝達されていることから、製造業者は、一定の製造 方法を利用しているにもかかわらず、ウイルスで汚染された製品のバッチが幾つ か生じたと仮定しなければならなかった(Ｌancet ３４０、３０５〜３０６（１ ９ ９２）；ＭＭＷＲ ４３（２８）、５０５〜５０９（１９９４）、Ｔhromb.Ｈaem ost．６８、７８１（１９９２）)。このことは恐らく、幾つかの出発バッチの過 度の汚染から起こった。血漿を回収する間に、ウイルスで汚染された献血漿を排 除するのには、間接法が利用できるだけであることから、出発原料は非常にひど く汚染されているので、他の上手く利用されるウイルス不活性化およびウイルス 消失方法が、もはやウイルスに関して安全な最終産物を製造するには十分でない ということが起こり得る。 ＨＩＶ、ＨＣＶおよびＨＢＶに関するヒト感染用量は知られておらず、また今 のところ測定することはできない。従って、組織培養における感染用量（ＴＣＩ Ｄ₅₀：組織培養感染用量)または動物モデルにおける感染用量(ＣＩＤ₅₀：チンパ ンジー感染用量)の測定では、概算のヒト感染用量しか得られない。さらに、幾 つかの場合、人々は、それらにさらされているにもかかわらず、ＨＩＶ、ＨＣＶ またはＨＢＶで感染されない。従って、そのようなウイルスのヒト感染用量は、 必ずしも感染するとは限らない。 Ｐiatakら(Ｓcience １９９３、２５９：１７４９−１７５４)は、ＨＩＶのＴ ＣＩＤ₅₀が、１ ＴＣＩＤ₅₀／ＨＩＶ ＲＮＡの１０⁴コピーであることを測定し た。Ｓhimizu,Ｙ.Ｋ.ら(ＰＮＡＳ.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ １９９３、９０： ６０３７−６０４１)は、ＨＣＶ株のＣＩＤ₅₀が、１ ＣＩＤ₅₀／ＲＮＡの１コピ ーであることを測定した。 Ｅderら(Ｔhe Ｒole of the Ｃhimpanzee in Ｒesearch、Ｓymp.Ｖienna １９ ９２、１５６〜１６５)は、ＨＢＶ ＤＮＡの２０コピー／血漿のmlがＣＩＤ₅₀ １に対応することを示すことができた。 血漿プールまたは他の血漿出発原料の場合、ウイルス負荷(ウイルス汚染)は出 来るだけ低く、必要ならば、付加的ウイルス不活性化工程により、またはウイル スを消失させる方法により、ウイルス汚染を少なくとも感染用量以下まで低下さ せることができるように注意することが特に必要である。出発原料のウイルス汚 染は、ウイルス核酸のコピー数が既にチンパンジーの感染用量以下程度であるの が望ましいであろう。 本発明の目的は、幾つかの出発バッチの過度の汚染から起こる、複製可能な血 液原ウイルスでのウイルス汚染の危険がもはや全くない、１以上の血漿誘導体を 含む薬物を提供することである。 さらに具体的な目的は、ウイルス負荷が指定された最大値を越えてはならない 、品質保証された出発原料または中間体を提供することである。 本発明により、この目的は、出発原料または血漿誘導体の製造中に生ずる中間 体がウイルスにより汚染されておらず、または１つまたはそれ以上の複製可能な 血液原ウイルスの負荷が規定された限界値を越えていない、１以上の血漿誘導体 を活性物質または補助成分として含む薬物により成し遂げられ、 − 幾つかの複製可能な血液原ウイルスのウイルス負荷の不在を、出発原料もし くは中間体中の過剰のウイルス中和抗体により、または献血漿時の血漿ドナーの 防御免疫により測定し、 − あるいは、出発原料もしくは中間体中の問題の各々のウイルスのゲノム当量 (equivalents)を、核酸の検出または測定のための、定量可能な、制御された、 非阻害的方法により測定し、最終血漿誘導体の製造のための、品質保証された出 発原料または中間体を、少なくとも１つの実質的なウイルス消失またはウイルス 不活性化工程にかけて、得られた品質保証された最終血漿誘導体を既知の方法に より後処理して、薬物とする。 該目的の達成は、出発原料中に存在する汚染またはウイルス負荷の程度の測定 を含んでなり、このウイルス負荷をもはや、ウイルスを不活性化する、または消 失させる方法により排除することができない。従って、出発原料中のウイルス汚 染の可能性を測定し、こういった高度の汚染が実在する限り、それらの出発原料 をさらに処理しないことにより、すなわち、それらを処理から排除することによ り、その問題を解決する。 この目的のために、ウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかけるべきで ある、各血漿由来の出発原料、およびあるいは血漿誘導体の製造で生ずる中間体 を、並びに最終血漿誘導体を、血液血漿から製造された薬物がもはや、時々です らなくも、複製可能な血液原ウイルスを伝達することができないということを確 かな方法で確実なものとする方法で試験して処理すべきである。そのようにする 際は、可能なウイルス負荷の上限を測定するために、出発原料を、選択された増 幅技術の利用により試験し、血液原ウイルスの伝達を起こさないであろう薬物と するために、この出発原料または中間体をさらに、少なくとも１つの実質的なウ イルス不活性化またはウイルス消失工程にかけるであろう。 本発明により、ゲノム当量の測定の間に検出されるべき標的核酸は、血液中、 血漿中、血清中、または血漿画分中での様々な増幅方法により増幅することがで きる。しかし、好ましくは、ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)または特殊型のＰＣＲ を、各々、検出または測定方法として使用する。特定のウイルスゲノム配列の検 出の場合には、増幅方法が、増幅すべき核酸配列に対して選択的でなければなら ない。本発明の血漿プール中の核酸の増幅は、文献に記載されている一連の増幅 方法により達成することができる。 特定のウイルスゲノム配列の増幅は、それらを複製して、それらを検出可能と するために、個々のゲノム、さらに非常に様々なウイルスのゲノムに関する知識 を必要とする。 核酸の様々な増幅方法は、ＰＣＲに基づいている。ＰＣＲ増幅方法は、Ｍulli sら(米国特許第４,６８３,１９５号および同第４,６８３,２０２号)に初めて記 載された。ウイルスゲノム配列はまた、「ネステッド(nested)ＰＣＲ」（Ｍulli sら、Ｍethods Ｅnzymol．１９８７、１５５：３３５−３５０)またはＲＴ−Ｐ ＣＲ(Ｐowell,Ｌ.Ｍ.ら、Ｃell １９８７、５０：８３１−８４０；Ｋawasakiら 、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ １９８８、８５：５６９８−５７０２)によ っても増幅することができる。 ＲＮＡの増幅および検出では、まず最初に、ＲＮＡをＤＮＡに転写しなければ ならない。この方法は、いわゆるＲＴ−ＰＣＲとして、ＷＯ ９１／０９９４４ に記載されており、また逆転写酵素の使用を必要とする。 次いで、伸長工程において、また後のハイブリダイジングまたはその産物のゲ ル電気泳動による分離において、標識化ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド プライマーを使用することにより、その増幅産物を分析することができる。 ＰＣＲに対する他の方法もまた記載されている。 核酸を増幅するための、これらの方法の１つは、欧州特許第０ ３２０ ３０８ 号、並びに欧州特許第０ ３３６ ７３１号、並びにＷuおよびＷallace(Ｇenomic s １９８９、４：５６０〜５９６)による、ＬＣＲ(リガーゼ鎖反応)である。 他の酵素的方法は、欧州特許第０ ３１０ ２２９号、およびＧuatelli,Ｊ.Ｃ. ら(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ １９９０、８７：１８７４〜１８７８)に よる、ＮＡＳＢＡ(核酸配列に基づく増幅)、３ＳＲ(自己支持配列複製)、または 欧州特許第０ ３７３ ９６０号、およびＫwoh,Ｄ.Ｙ.ら(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓc i．ＵＳＡ １９８９、８６：１１７３〜１１７７)によるＴＡＳ(転写に基づく増 幅システム)である。これらの方法では、増幅において、例えば、ＤＮＡポリメ ラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼといったような一連の酵素を同時に、または段 階的に使用する。 他の増幅方法は、欧州特許第０ ３６１ ９８３号、およびＬizardiら(ＴＩＢ ＴＥＣＨ １９９１、９：５３〜５８)による、ＲＮＡバクテリオファージＱβの レプリカーゼの使用に基づく。 Ｕrdea,Ｍ.Ｓ.ら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.Ｓymp.Ｓer．２４ Ｏxford １９９ １、Ｐachl,Ｃ.Ａ.ら、XXXII Ｉnterscience Ｃonference on Ａntimicrobial Ａgentsand Ｃhemotherapy．Ａnaheim，１９９２年１０月(アブストラクト １２ ４７)により、さらなる方法は、抽出される核酸に代わって、分枝鎖状ＤＮＡオ リゴヌクレオチドによるシグナル増幅(分枝鎖状ＤＮＡシグナル増幅)を記載して いる。 欧州特許第０ ５９０ ３２７ Ａ２号は、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ 、またはＢ型肝炎ウイルスのウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの測定を提供する、血 液試料の分析方法を開示している。Ｂ型肝炎ウイルスゲノムを測定するための試 験に対する検出限界は、その評価を、ゲルを染色した後で電気泳動により行うな ら、１,５００コピー(１５０,０００コピー／ml)である。血液試料は一部が、血 液の乾燥スポットである。分析後、試料のさらなる処理のための準備はしない。 幾つかのウイルスに対する高度免疫グロブリン製剤を製造するための方法は、 能動的に免疫されているドナー、または既に疾患を克服していることから、防御 免疫を示すドナーに由来する血液および血漿から出発する。病原性ウイルスに対 して予防接種されている血漿ドナーの血液は、対応する抗体タイターを含む。Ｈ ＩＶ抗体のような、ウイルス血症を示す抗体とは対照的に、これらの抗体が望ま しい。 従って、本発明の薬物を製造するために使用する、品質保証された出発原料ま たは中間体は、問題のウイルスに対するウイルス中和抗体を過剰に含むか、また は存在する可能性のある複製可能な血液原ウイルスのゲノムもしくはゲノムフラ グメントを検出不可能な量で、もしくは限界値以下の量で含む。 血漿誘導体は、薬物中、活性物質として、または補助成分としてもまた含まれ 得る。活性物質には、例えば、凝固因子、免疫グロブリン、繊維素溶解因子、酵 素阻害剤または血漿中に存在する他の酵素もしくはチモーゲンもしくはそれらの 混合物が含まれる。補助成分には、アルブミンまたは他の安定剤、様々な阻害剤 、補因子等が含まれる。 原則的には、血漿プール、クリオプアー(cryopoor)血漿、またはＣohn II ＋ IIIペーストといったような、ある特定の製造方法を開始する物質を全て、出発 原料としてみなすべきである。一連の可能な出発原料は、Ｈeideら（「Ｔhe Ｐl asma Ｐroteins」中の「Ｐlasma Ｐrotein Ｆractionation」、Ｆrank Ｗ.Ｐutn am編、Ａcademic Ｐress Ｎew Ｙork、Ｓan Ｆrancisco、Ｌondon １９７７、５ ４５〜５９７頁）による論文で引用されている。 中間体は、与えられた製造工程により得られている、ある特定の製造方法で出 発原料から誘導される産物、例えば、出発原料として血漿またはクリオプアー血 漿を用いての第IX因子の製造におけるプロトロンビン複合体である。 慣例の製造方法で薬物に後処理される最終血漿誘導体は、該製品に特異的な製 造方法により、場合によっては中間体を経て、出発原料から製造される。勿論、 この後処理の間に、２つまたはそれ以上の最終血漿誘導体を一緒に合わせること ができる。 好ましくは、ＨＩＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ、また特にＨＩＶおよびＨ ＣＶよりなる群から選択される、少なくとも２つのウイルスに関して、ウイルス 汚染が存在しないか、または規定された限界値を越えないウイルス汚染が存在す ることが好ましい。 さらに、本発明は、上述のウイルスに限定されない；むしろ、存在しないか、 または規定された限界値を越えないウイルス汚染を、血液により、または血液か ら得られた産物により伝達され得、またヒトにとって危険の高いウイルスである ことが判明している、あらゆる血液原ウイルス、例えば、パルボウイルス、非Ａ 非Ｂ型肝炎ウイルスに関して、および新たに発見されたウイルスに関して測定す ることができる。好ましくは、これらのウイルスの薬物中での存在が患者に危険 を示すならば、存在しないか、または規定された限界値を越えないウイルス汚染 を、血液原ウイルス全てに関して測定するであろう。 いずれの場合でも、この値を越えてはならないという、複製可能な血液原ウイ ルスによる許容可能な汚染の限界値は、主として、検出反応の能力に、また出発 原料および中間体を評価するのに適当な手段に依存する。例えば、検出限界は、 検出反応に使用される試料の体積に依存する。例えば、ウイルスゲノム当量を、 たった１つの献物の試料２０μl中で検出することができず、また使用する検出 方法が、たった１つのゲノム当量を試料中で検出することが可能なら、個々の献 物の最大汚染は、血漿１ml当たり５０ゲノム当量より少ないと結論することがで きる。陰性の検出結果を得て、さらに試料２０μlを試験して、再びウイルスゲ ノム当量が検出されないなら、その単一の献物の最大負荷は、血漿１ml当たり２ ５ゲノム当量より少ないと結論することができる。 出発原料または中間体１ml当たり、最大値５００ゲノム当量、特に最大値２０ ０ゲノム当量、好ましくは最大値１００ゲノム当量、またとりわけ最大値５０ゲ ノム当量は、複製可能な血液原ウイルスによる許容可能な汚染に関する実際的な 限界値であることが証明されている。 本発明の好ましい保証された出発原料または中間体の場合には、少なくとも４ つのリダクション(reduction)因子を与える、少なくとも１つの方法により成し 遂げられるウイルス不活性化またはウイルス消失が、品質保証された、この出発 原料または中間体起源の薬物の製造において成し遂げられる。 本発明の血漿タンパク質含有薬物は、出発原料となる血漿タンパク質の、１つ またはそれ以上の複製可能な血液原ウイルスによる、確かめられた、限定された 汚染を基にして、ウイルスを不活性化する、または消失させるためのタンパク質 保存方法が、血漿タンパク質をウイルスに安全な形で得るのに十分であるという 利点を有する。好ましくは、存在する可能性のある複製可能な血液原ウイルスの ウイルス負荷をいずれも不活性化する、または排除するために、４つ未満のリダ クション因子を有するタンパク質保存方法を行う。あるタンパク質保存方法は、 血漿タンパク質の活性および完全性を出来る限り最も広い範囲で維持することが 可能である。回収されるべきタンパク質の(特異的)活性を５０％またはそれ以上 、また好ましくは８０％またはそれ以上維持する、ある方法は、タンパク質保存 性と見なされる。本発明の薬物の製造方法中での、たった１つのウイルス活性化 またはウイルス消失は、存在する可能性のあるウイルスをいずれも完全に不活性 化する、または排除するのに十分である。 血漿誘導体または薬物の製造に使用され、また試験ウイルスが加えられている 出発原料または中間体の場合には、与えられたウイルス不活性化工程に先立つウ イルス消失により、ウイルス負荷を大いに減少させることができることが示され ている(例えば、ＥＰ−Ａ−０ ５０６ ６５１)。該消失は、ナノ(nano)濾過、沈 降反応、透析、遠心分離、クロマトグラフ精製工程等といったような、既知の方 法により行うことができる。ウイルスを不活性化するために、一連の物理的、化 学的、または化学的／物理的方法が知られており、これらは、例えば、ＥＰ−Ａ −１５９ ３１１またはＥＰ−Ａ−０ ６３７ ４５１でのような加熱処理、ＥＰ −Ａ−０ ２４７ ９９８による加水分解酵素処理、例えば、ＥＰ−Ａ−０ １３ １ ７４０でのような放射線処理または有機溶媒および／または界面活性剤での 処理を含んでなる。血漿画分および薬物を製造する間の、さらに適当なウイルス 不活性化工程は、ＥＰ−Ａ−０ ５０６ ６５１またはＷＯ ９４／１３３２９に 記載されている。様々な不活性化方法が、Ｅur.Ｊ.Ｅpidermal．３（１９８７） 、１０３−１１８において分析されている；そのリダクション因子は、ＥＣ委員 会 (Ｃommission)のＥＣIII／８ １１５／８９−ＥＮガイドラインにおいて扱われ ている。 本発明の方法により、プールした出発原料、特に血漿プール、または中間体を 各々、群を抜いて安全性の増加した品質とすることが可能である。 好ましくは、例えば、適当な予防接種により、１つまたは幾つかのウイルスに 対して、能動的に免疫されているか、または免疫性であることから、防御免疫を 示す血漿ドナーを、本発明の品質保証された血漿プールの製造のために選択する 。血漿ドナーは、肝炎ウイルスに対して、特にＡ型肝炎ウイルスに対して、対応 する血漿の感染の可能性を排除するために予防接種されているのが好ましい。 血漿が出発原料であるなら、本発明による品質保証の好ましい態様は、 − ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、パルボウイルスおよびＨＡＶ群の全てのウイルス のゲノム当量を測定する、 − ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびパルボウイルス群の全てのウイルスのゲノム 当量、さらにはまた過剰のＨＡＶ抗体を測定する、 − ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはま た過剰のＨＡＶおよびパルボウイルス抗体を測定する、 − ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはま た過剰のＨＡＶ抗体を測定する、 − ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはま た過剰のパルボウイルス抗体を測定する、 − ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量を測定する、 − ＨＩＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量を測定する、 − ＨＩＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはまた過剰の ＨＢＶ抗体を測定する ということにある。 本発明の品質保証された血漿プールは、例えば、Ａ型肝炎およびＢ型肝炎ウイ ルスに対して予防接種されており、それ故、抗感染免疫性により、血中に抗体タ イターを有し得る血漿ドナーを選択することによっても得ることができる。これ らの抗体は、能動免疫化により形成されており、それ故、ウイルス血症を示すも のではない。対応するウイルス血症を示すマーカーの不在に関して、献血漿を個 々に試験する。この目的のために、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス抗体、また場合に より、ＨＩＶ抗体を測定するための試験を、有効とされるＥＬＩＳＡ試験システ ムの助けをもって行う。ＡＬＴおよびＧＰＤ値といったような、幾つかの肝臓値 もまた、Ｃ型肝炎ウイルスのマーカーである。ドナー血漿中のウイルスマーカー の不在を確かめるのなら、個々の献血漿の血漿プール中のＡＩＤＳウイルス(Ｈ ＩＶ−１)、また場合により、Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムまたはゲノムフラグメ ントの不在の証拠を、さらなる選択基準として用意する。この献血漿が、ウイル ス感染を示す、ＨＩＶに対する抗体を何ら含まないという確認にもかかわらず、 この方法が推奨される。ＨＩＶウイルスで感染させてから、対応する抗体が検出 可能となるまでの時間は、とりわけ、これらのウイルスの場合には、数カ月であ り得る。従って、ＨＩＶ抗体の不在に関してのみ試験した血漿プールを、複製可 能な感染ウイルスを何ら含まない、またはそれらを規定された限界値以下で含む 、制御された血漿プールとして利用可能とすることはできない。 複製可能な血液原ウイルスによる限定された汚染を確かめるための本発明の方 法の１つは、核酸を検出する、または測定する、定量可能な、制御された、およ び非阻害的方法は別として、本発明の血漿プール中のウイルス中和抗体の検出を 含んでなる。例えば、適当な酵素免疫試験のような、有効とされる試験システム もまた、抗体タイターを測定するのに使用すべきである。該方法に使用される試 料は、場合により、凍結乾燥した後、再構築することができる。 血漿プールの他に、低温型沈降物または他の初期の中間体が本発明の出発原料 と考えられる。初期の中間体は、薬物の製造においてヒト血漿から得られる中間 体であり、これらはさらに、ウイルス消失またはウイルス不活性化にかけられる であろう。血漿プール、特に、同様に保証された少量のものを、より多量なもの に合わせる可能性に関して本明細書中で述べられていることはまた、可能である 限り一本発明により、他の出発原料にも適用される。従って、同じ種類の、品質 保証された出発原料または中間体を、各々、品質保証された出発原料または中 間体の、より大きなプールへと混合することを、本発明により提供する。 出発原料または中間体に対する、そのような高い品質基準は、まだ満たされて いない。一方では、ウイルスで汚染された血漿プールにより引き起こされるウイ ルス血症を完全に排除することが必要であるとは考えられていない。血漿プール は、主として、血漿誘導体の製造、すなわち、血漿タンパク質に基づいた医薬品 製剤の製造に使用される。しかし、この製造では、存在する可能性のあるウイル スを不活性化する、および／または消失させるための付加的方法を行わなければ ならず、このことは、最終生成物による病原性ウイルスの伝達の危険を倍数的に 減少させるので、先行技術により指示された通常のアッセイが適しているとみな される。 本発明により、過剰のウイルス中和抗体、または確かめられた、限定された負 荷のウイルスゲノム配列を示す、それらの出発原料または中間体のみを、生成物 のさらなる後処理に使用する。それにもかかわらず、核酸増幅方法で測定される ゲノム当量の量は、複製可能なウイルスによる汚染の上限しか与えないことから 、本発明の要件を満たさず、また本発明の範囲内の薬物への、さらなる処理には 不適な出発原料を、感染性として証明できるように記載することはできない。従 って、測定されるゲノム当量の量は、全てのゲノム当量が活性なウイルスに由来 する場合にのみ、複製可能なウイルスの負荷の「真の値」を与える。 本発明により保証された幾つかの出発原料から、混合することにより、より多 量のものを得ることができるが、これは、同じ安全基準に従う。 血漿プールの場合、後者を、約２〜約２０個の献血漿からなる小さなプールと して与えるのがよい。少なくとも１０の小さなプールを合わせて、約２０〜２０ ０、また好ましくは約２００個の献血漿からなるミニプールとすることができる 。大きさの次のオーダーは、約２００〜２,０００、また好ましくは約２,０００ 個の献血漿からなるマクロプールであり、これは、場合により、少なくとも１０ のミニプール単位で混合することにより製造される。幾つかのマクロプールを合 わせて、２００,０００個までの献血漿からなるマルチマクロプールとすること ができる。 本発明により、ウイルスゲノムまたはゲノムフラグメントに関する証拠を、こ れらのプールサイズ各々に用意することができる。小さなプールを試験した後、 調べた小さなプールを合わせて、より大きなプール、例えば、ミニプールとする ことにより、かつて記載されたことのない品質が、より大きなプールでも得られ る。 従って、本発明の特別の態様は、好ましくは約２００個の献血漿からなるミニ プールを混合して、好ましくは約２,０００個の献血漿からなるマクロプールと することにより得られる血漿プールにある。 さらに好ましい態様は、マクロプールを、いずれかの所望の数の他のマクロプ ールと混合することにより合わせて、２００,０００個までの献物からなるマル チマクロプールとすることを特徴とする、血漿プールからなる。 また別の好ましい態様は、そのミニプールが、２〜約２０個の献物からなる小 さなプールを混合することにより得られる、血漿プールにある。 血漿画分または最終血漿誘導体を各々製造するための、および薬物を製造する ための、血液血漿の分画に対する出発原料を選択する際には、経済的な理由から 、比較的多量のものが好まれるべきである。しかし、今までは、ウイルスゲノム またはゲノムフラグメントの検出により、ウイルスで汚染されていないとみなす ことができたマクロプールの、またはマルチマクロプールの大きさの血漿プール を利用することができなかった。２,０００個以上の献血漿を一緒に混合するこ とから生ずる希釈効果が大きすぎ、また検出すべきゲノムの数が試験方法の検出 限界より小さいことが非常に多いことから、マルチマクロプールのみに関しての 証拠を用意するには十分ではない。小さなサブユニットを試験した後、合わせて 、より大きなユニットとすることにより、こういった検出能力の問題を克服し、 また経済的に重要な量が得られる。 本発明の品質保証された出発原料は、血漿タンパク質を中間体として含む画分 の製造に、または最終薬物の製造に、群を抜いて適当である。 出発原料、特に血漿プールに与えられた方法は、勿論、全ての種類の血漿画分 に対して同様に利用することができる。従って、さらなる態様により、本発明は また、品質保証された最終血漿誘導体にも関し、この血漿誘導体の複製可能な血 液原ウイルスによる汚染は、品質保証された出発原料の使用によって安全に限定 される。 さらに、本発明は、勿論、本発明により品質保証された出発原料からの、また は本発明により品質保証された１つまたは幾つかの中間体からの製造方法により 得られる最終的な血漿誘導体にも関する。 本発明により製造される最終血漿誘導体から医薬的調合によって製造される薬 物もまた、本発明に含まれる。 さらに、本発明は、品質保証された出発原料からの、または血漿誘導体の製造 中に得られる品質保証された中間体からの、１以上の血漿誘導体を含む薬物の製 造方法に関し、その品質保証された出発原料または中間体は、１つまたはそれ以 上の複製可能な血液原ウイルスで汚染されていないか、または規定された限界値 を越えない量で汚染されており、またその規定された限界値は、１つまたはそれ 以上の、以下の基準による核酸の検出または測定のための、定量可能な、制御さ れた、および非阻害的方法により、各々のウイルスのゲノム当量を測定する場合 において選択される： − 少なくとも１０,０００コピーの選択された核酸配列の核酸増幅方法の検出 限界； − 出発原料または中間体１ml当り、ある一定数のゲノム当量、特に５００以下 のゲノム当量、好ましくは２００以下のゲノム当量、さらに好ましくは１００以 下のゲノム当量、またとりわけ好ましくは５０以下のゲノム当量。 本発明により、限界値に関する他の許容可能な選択基準は： − 細胞培養試験によって測定される限界値、好ましくは、１ml当りのあるＴＣ ＩＤ₅₀(ａ ＴＣＩＤ₅₀)、またはこの量で含まれるゲノム当量、 − 動物モデルによって測定される限界値、好ましくは、１ml当りのあるＣＩＤ₅₀ (ａ ＣＩＤ₅₀)、またはこの量で含まれるゲノム当量 である。 これらの限界値は、それらの実用的関連(試験方法の検出能力に依存する)、お よびそれらの生物学的関連（特に、ＴＣＩＤおよびＣＩＤ値）から好ましい。 非常に鋭敏なＰＣＲ法は、試験物質中に混入し得る非常に僅かな量の幾つかの 不純物でさえもまた増幅されて、誤った陽性の結果を生じ得るという不利な点を 有する。 本発明の方法の好ましい態様は、１つ以上の検出システムの使用により特徴付 けられ、または測定を核酸に対して利用する場合、１つのシステムが誤った陽性 の結果を排除して、他のシステムが誤った陰性の結果を排除するよう、その検出 または測定システムを選択するのが好ましい。 好ましくは、少なくとも２つの異なったＰＣＲ法を利用し、少なくとも１つの 方法をスクリーニングに使用して、少なくとも１つの方法を確認に使用する。 ＤＴＳ−ＰＣＲ(二重標的化(Ｄual Ｔargeting)サザンブロットＰＣＲ)の場合 、抽出された核酸の増幅に続いて、合成された核酸をアガロースゲル電気泳動に より分離した後、ジゴキシゲニン(ＤＩＧ)標識化プローブとハイブリダイゼーシ ョンさせた後、サザンブロットにかける。その評価は、バンド強度のデンシトメ ーター測定によって行う。配列の不均一性から、ＰＣＲプライマーとテンプレー トとの間のミスプライミングにより引き起こされ得る誤った陰性の結果を排除す るために、核酸抽出物を増幅して、最初のプライマー対とは異なる、さらなるプ ライマーを用いての第２のＰＣＲにおいて再度分析する。合成核酸を内部標準と して加えることにより、ＤＴＳ−ＰＣＲを調べて、誤った陰性の結果を排除する 。 例えば、ＤＴＳ−ＰＣＲにおいて得られた結果をさらに確かめるために、ＬＩ Ｆ−ＰＣＲ(レーザー誘起蛍光ＰＣＲ)をさらなる方法として使用するのが好まし い。 非放射能標識化プライマー(好ましくは、蛍光染料で標識化されたプライマー) を使用することにより、ＰＣＲ産物をＬＩＦ−ＰＣＲにより検出することができ る。しかし、増幅産物の検出はまた、伸長反応の間に、非放射能標識化ヌクレオ チドアナログを、新しく合成された核酸に組み込むことにより簡易化することも できる。ＬＩＦ−ＰＣＲでは、核酸を蛍光標識化プライマーの存在下に増幅した 後、その増幅産物をＰＡＧＥにより分離する。ＬＩＦ−ＰＣＲの各々の試料に関 して、さらなる陰性および陽性の対照を行う。ＰＣＲ産物の検出および定量は、 遺伝子スキャナーによって達成される。特に、誤った陰性の結果を排除して、陽 性の結果をＬＩＦ−ＰＣＲの内部二重標準化法により確認する。 本発明により、陽性および陰性の対照を使用することによって、誤った陽性の 結果または誤った陰性の結果を排除することができる。記載した、２つの異なっ たＰＣＲ法の組み合わせ、特にＤＴＳ−ＰＣＲとレーザー誘起蛍光ＰＣＲ(ＬＩ Ｆ−ＰＣＲ)との組合せは、多数の試料を慣例の対照で試験することを可能とす ることから、主として、誤った陰性の結果を排除することができ、また誤った陽 性の結果を回避することができる。 本発明のさらなる態様は、試験試料を濃縮することに存し、それによって、よ り低い負荷のウイルスゲノム配列でさえも検出することができる。本発明の方法 の感度は、血漿試料またはその中に含まれるゲノム当量を濃縮することによる、 さらなる方法により、増大させることができ、感度を１０倍〜１００倍増大させ るのが好ましい。 従って、本発明の方法の好ましい態様では、出発原料(例えば、個々の献血漿 または試料プール)もしくは中間体起源の試料、またはその中に含まれるゲノム 当量を、好ましくは凍結乾燥、吸着、または遠心分離により濃縮する。 本発明により、ゲノム配列を検出する、または測定するための、定量可能な、 制御された、および非阻害的方法を与える方法を利用する。しかし、血漿プール 中の限定された負荷の複製可能なウイルスをウイルスゲノムまたはゲノム配列の 検出により測定する場合、検出方法の幾つかの阻害物質が試料中に存在すること が起こり得るので、非阻害増幅は、直ちには不可能である。 ＰＣＲ法により測定される血漿プールのウイルス汚染は、過小評価され得るこ とが証明されている。ＰＣＲ測定法の感度にかなり影響を与え得る因子が血漿プ ール中に存在することがある(Ｎucleic Ａcids Ｒesearch １６（２１）、１０ ３５５（１９８８）)。これらの、いわゆるＰＣＲ反応の阻害物質は、検出反応 の前に、本発明の方法により除去するか、またはゲノム標準を使用することによ り、検出反応の間に排除する。プール中、内部標準が適当な割合で増幅可能であ り、また検出可能であるなら、そのような阻害物質の存在は排除される。 ヘパリンのような血漿中に存在する物質、高塩濃縮物およびポリエチレングリ コールが、ＰＣＲ反応を阻害し得ることは周知である(Ｂio Ｔechniques ９（２ ）、１６６（１９９０）、およびＪournal of Ｃlinical Ｍicrobiology ２９（ ４）、６７６−６７９（１９９１）)。 従って、本発明の方法の好ましい態様は、存在する可能性のある増幅の阻害物 質を、個々の献血漿中、または試料プール中から除去する、または消失させるこ とを特徴とする。 血液、血漿または血清中の増幅阻害物質を除去する、または中和するための、 これらのさらなる方法は、例えば、試料の超遠心分離、およびその中に含まれる 阻害物質を含む上清をデカントすること、および核酸の抽出、さらにはまたヘパ リナーゼ、ポリアミンを用いての試料の処理、またはＨＰＬＣによる核酸の予備 精製を含んでなる。核酸の無制限増幅を、より高い純度の核酸により確実なもの とする。 該方法の好ましい変更態様により、幾つかのウイルスに特異的なプライマー対 を増幅試験に使用し、その結果、幾つかの種類のウイルスの存在を同時にアッセ イすることができる。特に好ましい試験では、ＨＩＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶおよびＨ ＣＶの群から選択される、２つまたはそれ以上のウイルスがアッセイされる。 特に、ＲＮＡウイルスは、この変異体または既知の株のサブタイプが大変迅速 に発生し得、そのゲノム配列が野生型配列のものとは幾分異なる結果として、高 い変異率を受けやすい。しかし、例えば、ＰＣＲのような、鋭敏な増幅方法の場 合には、試料中に実在するコピーを測定するために、特に高い増幅効率が、非常 に少ないコピー数のウイルスゲノム配列の検出および定量測定に欠くことができ ない。プライマーのテンプレートとの不十分なアニーリングは、それらの効率を 減少させる。従って、プライマーを選択する際の適当な注意を確実なものとしな ければならない。 好ましいプライマー対は、それらがアッセイすべき個々の血液原ウイルスの保 存されたゲノム配列をコードするよう選択され、そのプライマーの適合性は、調 査すべきウイルスの典型的な試料横断切片(cross section)の適当な試料におい て確立される。 以前同定された、ＨＩＶ、ＨＣＶおよびＨＢＶの既知のゲノム配列の他に、そ れらのサブタイプもまた、増幅反応のためのプライマーを選択することにより検 出することができる。本発明により、このことは、使用するプライマーを各々の ウイルスの高度に保存されたゲノム領域から選択することで達成される。従って 、全ての関連あるサブタイプに対する特異性が確認されているプライマーのみが 、ＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによる本発明の出発原料または中間体の 選択に使用されるであろう。 疫学モニターの範囲内では、標的ウイルスの、新たに発生したウイルス株をア ッセイして、それらが対応するテンプレートを含むかどうかを調べ、使用するプ ライマーを、これに対して配向する。次いで、既知のウイルス株群内で見い出さ れる変化を基に、新規ウイルス性株に関して実在するコピーの定量的な検出に適 当な新規プライマーを合成することが可能であろう。そこで、新たに合成された プライマーが有するアッセイの感度は、既に試験されているプライマーの感度と 少なくとも同等でなければならない。 保存された核酸配列のための新規プライマーを、新たに発生する標的ウイルス のために開発しなければならない。 試料中の核酸を検出する、または測定する方法を調べるために、好ましくは、 該方法を行う前または間に、１つまたはそれ以上の内部標準または標準品を試料 に加え、その標準物質は、全く同じアッセイ容器中、存在し得る全てのウイルス ゲノムまたはゲノム配列と同時に検出され、または測定される。 この方法は、特に、内部標準を各々の増幅反応の検出限界に近い量で使用する ならば、ウイルス核酸の含量の一層正確な定量または増幅方法の検出限界の一層 良好な評価の可能性を提供する。 本発明により合わせて、品質保証された血漿プールとした個々の献物を、さら なる同様に品質保証された血漿プールと合わせることができるので、品質保証さ れたミニプール、マクロプールまたはマルチマクロプールが提供される。品質保 証された、より小さなプールから製造される、より大きなプールの利点は、既に 十分記載した。 さらなる態様により、本発明は、血漿プールを、２つまたはそれ以上の個々の 献物から、複製可能なウイルスによる、確かめられた、限定された汚染を伴う、 品質保証された出発原料として製造する方法であって、以下の工程： − 試料をｎ個の献物から採取し、 − 個々の献物試料を合わせて、ｍの試料プールとし、 − この試料プール中に存在するウイルスゲノムまたはゲノム配列の量を、核酸 の検出または測定のための、定量可能な、制御された、および非阻害的方法によ っ て検出する により特徴付けられる方法に関し、 その方法においては、試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出 量が、ある一定の限界値以下にある、個々の献物(ｎ_g)を合わせて、品質保証さ れた血漿プールとして、試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出 量が、限界値より大きいか、または限界値に等しい、個々の献物(ｎ_a)を、さら なる処理にかけるか、または排除する(ｎおよびｍは正の整数である)。例えば、 ウイルスゲノム当量を消失させることにより、またはウイルス中和抗体含有画分 を混合することにより、個々の献物のさらなる処理を行うことができる。 さらなる方法の工程では、排除されるｎ_a個の献物のさらなる処理に関しても また、試料を再び採取するのがよく、またこれらの個々の献物試料を合わせて、 ｍ_aの試料プールとするのがよい(ｎ_aおよびｍ_aは、ｍ_a ＞２の正の整数であって 、ｍ_a：ｎ_aの割合は、ｍ：ｎの割合より大きい)。この試料プール中のウイルス ゲノムまたはゲノム配列の量を、核酸の検出または測定のための、定量可能な、 制御された、および非阻害的方法によって再び検出することができ、ここで、試 料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出量が、ある一定の限界値以 下にある、個々の献物を合わせて、品質保証された血漿プールとして、ウイルス ゲノムまたはゲノム配列の検出量が、限界値に等しいか、限界値より大きい、個 々の献物を、さらなる処理にかけるか、または排除する。さらに処理すべき、ま たは排除すべき個々の献物の数が、ある一定数に達するか、または一定数以下と なるまで、この方法を繰り返すことができる。 これらの方法により、許容不可能なほど高い負荷の複製可能なウイルスを含む 可能性のある全ての個々の献血漿を、ほぼ無限に大きな血漿プールから幾つかの 試験で排除することを可能とするための、簡単な方法を提供する。他方では、ウ イルスで汚染された個々の献物と一緒に、今までに利用した方法により排除され てきた適当な個々の献物は、合わせて分析するなら、簡単な方法の工程により認 識され、また最終血漿誘導体へと処理することができる。 従って、本発明のさらなる目的、すなわち、大きな血漿プール中でさえも、た っ た１人の感染したドナーを、さらなる献物から排除して、直ちに医療処置に付す ために、簡単かつ低コストの方法で発見することを達成することができる。その ことで、ドナー集団の安全性が増大する。 本発明の方法を受ける血漿プールにより含まれてなる個々の献物の数は、通常 、２〜２００,０００(ｎ＝２〜２００,０００)、また好ましくは２０〜２０,０ ００、さらに好ましくは２００〜２,０００、またとりわけ２００に達する。数 字ｍは、特に、１〜１００,０００の間、また好ましくは２〜１,０００の間にあ る。さらに処理すべき、または事実上、排除すべき個々の献物に対して決められ た数は、１００、好ましくは１０、また特に好ましくは１に達する。従って、最 後の場合、ウイルスで汚染された個々の献物は、それ相当に同定される。しかし 、実際、このことは、血漿ドナーを同定するという理由でのみ示される；従って 、その数は、通常、１０〜１００の間で決められる。 必要ならば、核酸の検出または測定に加えて、アッセイすべきウイルスに対す るウイルス中和抗体に関して、血漿プールをアッセイすることができる。 概して、ウイルスに対する抗体が見い出された試料プールを用いて、各々の個 々の献物を合わせて、さらに使用する。次いで、試料プール中、抗体が全く検出 されていない個々の献物をさらなる処理に回すか、または排除する。 さらに、本発明は、本発明の方法の範囲内で製造される、品質保証された出発 原料または中間体、特に血漿プールに関し、さらにはまた、好ましくは、ウイル スゲノム当量に関して、またはウイルス中和抗体の存在に関して、各々、一度以 上アッセイされている、品質保証された最終血漿誘導体に関する。 本発明はまた、医薬品製剤化工程により、ヒト血漿起源の品質保証された最終 血漿誘導体から得ることができる薬物をも含んでなる。 さらなる態様により、本発明は、複製可能な様々な血液原ウイルスを含まない 、１以上の血漿誘導体を含む薬物の製造方法に関し、この方法は、以下の方法の 工程により特徴付けられる： − 血漿誘導体の製造中に生じ、またヒト血漿から誘導される出発原料または中 間体を与え、 − 複製可能な血液原ウイルスによるウイルス汚染の不在を実証することにより 、またはそのような汚染が、ある特定の限界値を越えない量で存在することを測 定することにより、出発原料または中間体の品質を保証し、 − 出発原料または中間体各々の中の過剰のウイルス中和抗体により、または献 血漿時の血漿ドナーの防御免疫により、幾つかの複製可能な血液原ウイルスによ る汚染の不在を検出し、 − あるいは、問題の各々のウイルスのゲノム当量を、出発原料中、または中間 体中、各々、測定し、 − このようにして品質保証された出発原料または中間体を各々、少なくとも１ つのさらなる実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかけて、血漿 誘導体を完成し、 − このようにして得られた品質保証された最終血漿誘導体を、公知の方法によ り後処理して、薬物とする。 ヒト血漿から薬物を製造するための好ましい方法では、その製造方法中、品質 保証工程を少なくとも１つの中間体に用いる。 好ましい態様により、該品質保証工程は、実質的なウイルス消失またはウイル ス不活性化工程にかける中間体に対して行う。最も好ましくは、実質的なウイル ス消失またはウイルス不活性化工程にかけるべき、各々の中間体の品質保証であ る。 本発明を以下の実施例により記載するか、これは、本発明を限定しようとする ものではない。 実施例： １．ＰＣＲの通則 １.１．ＤＴＳ−ＰＣＲ(二重標的化サザンブロット)の通則 第１の特異的プライマー対によって、核酸をＰＣＲで増幅した後、そのＰＣＲ 産物をアガロースゲルでの電気泳動により分離して、フィルターにブロットさせ る。フィルターに結合させたＰＣＲ産物をジゴキシゲニン(ＤＩＧ)標識化プロー ブとハイブリダイズさせると、これが増幅されたゲノム配列内に結合し、発生反 応後に検出する。デンシトメーターによって、バンド強度を定量的に測定する。 第１のプライマーとは異なる第２のプライマー対を使用する、さらなるＰＣＲで は、核酸を増幅して、サザンブロット分析によってもまた検出する。ゲノム配列 の２つの異なる領域のＰＣＲ、およびハイブリダイゼーションによる、それらの 視覚化により、誤った陰性の結果を減らすことができ、また陽性の結果を確かめ ることができる。 １.２．ＬＩＦ−ＰＣＲ(レーザー誘起蛍光標識化)の通則 蛍光基を有するプライマーを使用するＰＣＲによって、様々な起源の核酸を増 幅した。レーザー誘起蛍光測定装置を備えた自動ＤＮＡシークエンサー(Ａpplie d Ｂiosystems製のＧene Ｓcan(商標)ソフトウェアを備えたＤＮＡ Ｓequencer ３７３Ａ)の助けをもって、得られた増幅産物の分析および定量を行った。この 装置により、変性条件下、ポリアクリルアミドゲル中でのゲル電気泳動によって 、蛍光標識化ＰＣＲ産物をサイズにより分離して、それらの量を定量的に測定す ることができる。試料中の幾つかの配列のコピー数を、定量すべき核酸、および 少なくとも２つの内部標準に関して得られた強度に基づいて測定する。 １.２.１．ウイルス粒子のＤＮＡの抽出 超遠心分離機中、試料５００μlを７０,０００rpmで２０分間遠心分離した。 ペレットを、１０mＭトリス／ＨＣl(pＨ８.０)５００μl、およびプロテイナー ゼＫ(Ｂoehringer Ｍannheim、２０mg／ml)１０μl、さらにはまた２０％ ＳＤ Ｓ １０μlに溶解する。３７℃で一晩インキュベーションするか、または５６℃ で４時間インキュベーションした後、既知量の標準核酸を加え、試料をフェノー ルおよびクロロホルムで順次抽出した後、グリコゲン(Ｂoehringer Ｍannheim、 ２０mg／ml)１０μlを加える。続いて、生成物をエタノールで沈殿させ、遠心分 離して、ペレットを洗浄して、最終的には、水に溶解する。 １.２.２．残留ウイルスＤＮＡの抽出 試料５００μlを、１０mＭトリス／ＨＣl(pＨ ８.０)５μl、およびプロテイ ナーゼＫ(２０mg／ml)１０μlに溶解する。３７℃で一晩インキュベーションす るか、または５６℃で４時間インキュベーションした後、既知量の標準核酸を加 え、試料をフェノールおよびクロロホルムで順次抽出して、グリコゲン(２０mg ／ml)１０μlを加える。続いて、生成物をエタノールで沈殿させ、遠心分離して 、ペレットを洗浄して、最終的には、水に再び溶解する。 １.２.３．ＰＣＲのためのＲＮＡの抽出 血漿またはＰＢＳで希釈した血漿１mlを７０,０００rpmで２０分間遠心分離す る。上清を吸引により取り除いた。ペレットを、イソチオシアン酸グアニジウム 溶液(ＢiotexのＲＮＡzol)１ml、および酵母由来の１mg／ml tＲＮＡ５μlにと って、２０μlのような、予め決められた量の標準ＲＮＡを加えた。４００およ び１,２００コピーといったような、指定された数の(−)ＲＮＡ標準および(＋) ＲＮＡ標準を加えて、渦流する(vortexed)。その溶液を７０℃で１０分間加熱し 、１／１０体積のクロロホルムを加えた後、その混合物を氷上で１０分間インキ ュベートする。次いで、卓上遠心分離機中、これを５分間遠心分離して、上清を 新しい管に移す。イソプロパノール５００μlを加えて、温度を−８０℃で１５ 分間維持する。次いで、これを１０分間遠心分離し、７０％エタノールで２回洗 浄して、ペレットを水５０μlにとる。ＲＴ−ＰＣＲの場合には、５μlを使用し た。 １.２.４．ＤＮＡの検出のためのＰＣＲ ＰＣＲ製剤は、抽出された核酸のアリコート、ＰＣＲ緩衝液(Ｂoehringer Ｍa nnheim)、ＭgＣl₂、dＮＴＰs)プライマー、Ｔaqポリメラーゼ(Ｂoehringer Ｍann heim、５.０ユニット／μl)および水を既知の方法で含む。緩衝液および酵素の 製造業者の指示に従って、また従来の方法に従って、ＰＣＲを行う(Ｍullisら、 Ｍethods in Ｅnzymology １５５：３３５、１９８７)。 １.２.５．ＨＩＶ ＲＮＡの検出のためのＲＴ−ＰＣＲ ＲＴ−ＰＣＲ製剤は、Ｐerkin−Ｅlmer製のＲＴ緩衝液中の抽出された核酸の アリコート、ＭgＣl₂、dＮＴＰs、ＲＴプライマー、およびrＴ.th．ポリメラー ゼ(Ｐerkin-Ｅlmer、２.５ユニット／μl)および水を通常の方法で含む。緩衝液 および酵素の製造業者の指示に従って、また従来の方法に従って、ＲＴをＰＣＲ 装置(Ｐerkin−ＥlmerのＧeneＡmp ＰＣＲ Ｓystem ９６００)で行う(Ｍullisら 、Ｍethods in Ｅnzymology １５５：３３５、１９８７)。 ＰＣＲの場合には、ＭgＣl₂、キレート緩衝剤、および第２のプライマーをさ らに加える。次いで、ＰＣＲを上記のように行う。 １.２.６．生成物の分析 ＰＣＲ産物の測定および定量のために、０.５〜１.０μlをＰＣＲ溶液から採 取して、製造業者の指示に従って、Ａpplied Ｂiosystems ３７３Ａ装置で分析 する。 １.３．サザンブロットおよびＤＴＳ−ＰＣＲ産物の検出 各々の生成物に意図された濃度でのＰＣＲ産物のゲル電気泳動分離のために、 アガロースゲルを調製した。ゲル操作は、電気泳動用の１×操作用(running)緩 衝液中で行った。ＰＣＲ産物試料を、０.５×操作用緩衝液中のフィコール／ブ ロモフェノールブルーと混合して、調製したゲルスロットを変えた。ゲル操作後 、そのゲルを０.５Ｍ ＮaＯＨ／１.５Ｍ ＮaＣl中で１時間インキュベーション することにより、ＰＣＲ産物を変性させた後、中和した。ＤＮＡをフィルター( Ｄuralon^TM、Ｓtratagene、Ｌa Ｊolla、Ｃalifornia)に移して、核酸をＵＶ架橋( cross Iinking)より膜に結合させた。プレハイブリダイゼーション緩衝液(６× ＳＳＣ、０.５％ ＳＤＳ、５×Ｄenhardt's、１００μg／ml変性ＤＮＡ)中、そ の膜を６８℃で１時間インキュベートした。ハイブリダイゼーションでジゴキシ ゲニン標識化ＤＮＡプローブで起こした後、アルカリ性ホスファターゼがコンジ ュゲートした抗体、ニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)、および５−ブロモ− １ −クロロ−３−インドールホスフェート(ＢＣＩＰ)によって、免疫染色によるバ ンドの視覚化を成し遂げた。ブロットをデンシトメトリーにより評価した。 １.４．使用したプライマー ＬＩＦ−ＰＣＲに使用したプライマーを表１.１.および表１.２.に要約する。 ＤＴＳ−ＰＣＲに使用したプライマーは、ＨＩＶの場合には、ＳＫ３８、ＳＫ ３９、ＳＫ１４５およびＳＫ４３１(Ｒatnerら、１９８５)；ＨＣＶの場合には 、３２、Ｒ３、ＣＨＡＡ、Ｒ１、ＣonＡ１、ＣonaＡ２およびＣonＡ(Ｃhironか ら入手可能)；およびＨＢＶの場合には、ＨＢＶ１ａおよびＨＢＶ１ｂ(Ｋaneko ら、１９８９)、さらにはまたＨＢＶ４ａおよびＨＢＶ４ｂ(Ｃarmanら、１９８ ９)である。 実施例２： ２.１．ＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによる、ドナー由来の血漿試料 中のＨＩＶ ＲＮＡの定量 献血漿を、ＨＩＶ 血清(−)の健康な被験者、およびＨＩＶ 血清(−)、p２４ 抗原(＋)の一次感染した被験者から採取した。ドナーの血漿試料をＬＩＦ−ＰＣ ＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによって試験した。ＤＴＳ−ＰＣＲによる試料試験を、 プライマー対 ＳＫ１４５／４３１(プライマー対 １)およびＳＫ３８／３９(プ ライマー対 ２)(表１.１.)で行った；正のハイブリダイゼーションシグナルを有 する試料をＬＩＦ−ＰＣＲによってさらに試験した。ＬＩＦ−ＰＣＲによって定 量する場合には、ＨＩＶ−１のcＤＮＡ配列に結合し、野生型ＲＮＡのＲＴ−Ｐ ＣＲによって１１５bpのＰＣＲ産物を与える、プライマーＳＫ３８およびＳＫ３ ９(表１.１)を使用した。標準プラスミド、pgag１、pgag−１５およびpgag＋ １２(表１.２.)を使用した結果、１１５bp(pgag１)、１００bp(pgag−１５)およ び１２７bp(pgag＋１２)のＲＴ−ＰＣＲ産物が生じた。標準プラスミドを共増幅 し(coamplified)、Ｇene Ｓcan(商標)で共分析して(coanalyzed)、コピー数／ml を測定した。定量的評価の結果を表２に要約する。 ＨＩＶ血清(−)、p２４抗原(＋)の血漿ドナーでは、最小汚染は２.８×１０⁵ 、最大汚染は２.３×１０⁷コピー／mlであることが測定された。 ２.２．ＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによる、ドナー由来の血漿試料 中のＨＣＶ ＲＮＡの定量 献血漿を、ＨＣＶ 血清(−)の健康な被験者、およびＨＣＶの一次感染した被 験者から採取した。ドナー由来の血漿試料をＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣ Ｒによって試験した。試料のＤＴＳ−ＰＣＲ試験を、プライマー対 ３２／Ｒ３( プライマー対 １)およびＣＨＡＡ／Ｒ１(プライマー対 ２)(Ｃhiron)で行った； 正のハイブリダイゼーションシグナルを有する試料を、ＬＩＦ−ＰＣＲによって さ らに試験した。ＬＩＦ−ＰＣＲにより定量する場合には、ＨＣＶのcＤＮＡ配列 に結合して、ＲＴ−ＰＣＲにより野生型ＲＮＡから誘導される１１４bpの産物を 与える、プライマー ＨＣＶ３２およびＨＣＶＰＴ４(表 １.１)を使用した。標 準プラスミドとして、pＨＣＶwt、pＨＣＶ−７およびpＨＣＶ＋８(表１.２.)を 使用した結果、長さ１１４bp(pＨＣＶwt)、１０７bp(pＨＣＶ−７)および１２２ bp(pＨＣＶ＋８)のＲＴ−ＰＣＲ産物が生じた。標準プラスミドを試料で共増幅 し、Ｇene Ｓcan(商標)で共分析して、コピー数／mlを測定した。定量的測定の 結果を表３に要約する。 ＨＣＶ 血清(−)の一次感染した血漿ドナーでは、最小汚染は２.２×１０⁴コ ピー／ml、最大汚染は１.６×１０⁶コピー／mlであることが測定された。 ２.３．ＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによる、ドナー由来の血漿試料 中のＨＢＶ ＤＮＡの定量 献血漿を、ＨＢＶ 血清(−)の健康な被験者、並びに一次感染した、ＨＢsＡg( ＋)、抗ＨＢsＡg 血清(−)、およびＨＢsＡg(＋)、抗ＨＢsＡg 血清(＋)の被験 者から採取した。ドナーの血漿試料をＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによ ってアッセイした。ＤＴＳ−ＰＣＲによる試料試験を、プライマー対 ＨＢＶ１ ａ／ＨＢＶ１ｂ(プライマー対 １)およびＨＢＶ４ａ／ＨＢＶ４ｂ(プライマー対 ２)で行った(Ｃarmanら、１９８９)；正のハイブリダイゼーションシグナルを 有する試料をＬＩＦ−ＰＣＲによってさらに試験した。ＬＩＦ−ＰＣＲにより定 量する場合には、ＨＢＶゲノムのcＤＮＡ配列に結合して、ＲＴ−ＰＣＲにより 野生型ＲＮＡから誘導される１８２bpのＰＣＲ産物を与える、プライマーＨＢＶ ＋１７８０ＢおよびＨＢＶ−１９５０Ｂ(表１.１.)を使用した。標準プラスミド 、pＨＢＶwt、pＨＢＶ−９およびpＨＢＶ＋１２(表１.２.)を使用したが、これ らは、１８２bp(pＨＢＶwt)、１７３bp(pＨＢＶ−９)および１９４bp(pＨＢＶ＋ １２)のＲＴ−ＰＣＲ産物を与える。標準プラスミドを試料で共増幅し、Ｇene Ｓcan(商標)で共分析して、コピー数／mlを測定した。定量的評価の結果を表４ に要約する。 ＨＢＶ 血清(−)の一次感染した血漿ドナーでは、最小汚染は１.４×１０⁵コ ピー／ml、また最大汚染は１.３×１０⁸コピー／mlであることが各々測定された 。 実施例 ３： ３.１．ＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡに関する様々なサイズの血漿プールのアッセイ １０、５０、１００、５００、１,０００および２,０００のＨＩＶ 血清(−) 、p２４抗原(−)の健康な個々のドナー由来の血漿試料を、試料プール中に混合 した。各々の個々のプールサイズを、実施例１でのように測定された２.３×１ ０⁷コピー／ml(試料)という高いウイルス負荷で一次ＨＩＶ感染したドナー由来 の１つの血漿試料と、実施例１でのように測定された２.８×１０⁵コピー／ml( 試料 ２)という最小汚染で一次ＨＩＶ感染したドナー由来の１つの血漿試料と、 また対照として、１×１０⁴コピー／ml(試料 ３)、および１×１０³コピー／ml( 試料 ４)であるＨＩＶ ＲＮＡの規定された製剤と混合した。各々のプールサイ ズに関する定量可能なウイルスのコピー数／mlを、ＬＩＦ−ＰＣＲによって測定 した。ＰＣＲ評価の結果を表５.１.に要約する。 結果： 表５.１.は、高い負荷(２.３×１０⁷コピー／ml)を有する、さらにはまた最小 汚染(３.８×１０⁵コピー／ml)を有する、一次感染した、抗−ＨＩＶ 血清(−) 、p２４抗原(＋)の個々の献物でのウイルス汚染を、１０、５０、１００および ５００の個々の献物の血漿プール中、ＰＣＲによって検出することができること を示す。ＨＩＶ−ＲＮＡで高度に汚染された献物はまた、１,０００および２,０ ００の個々のドナー由来の血漿プール中でも検出することができた；他方、最小 汚染を伴う献物はもはや、このサイズのプールでは検出することができなかった 。個々の献物中、１×１０⁴コピー／mlでの汚染により引き起こされるＨＩＶ− ＲＮＡ負荷は、１０個までの献物のプール中で検出することができた。試験した プールサイズではいずれも、個々の献物中、１×１０³コピー／mlの汚染レベル でウイルスゲノム配列を検出することは不可能であった。 ３.２．試料を濃縮することによる感度の増大 ＨＩＶ−ＲＮＡのコピーを検出することができなかったプールサイズでの検出 感度を増大させるために、プールした血漿の１０倍濃縮した試料をＰＣＲに使用 した。この目的のために、実施例３.１.で使用した、試料２、３および４の個々 の血漿プールの各々の場合における試料体積の１０倍体積を遠心分離により濃縮 し、１／１０の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲに使用した 。ＰＣＲ評価の結果を表５.２.に要約する。 ＰＣＲの初期試料体積を１０倍濃縮することにより、１つの一次ＨＩＶ感染し た献物を含む２,０００の個々のドナー由来のプールの最小汚染を検出すること が可能であった(２.８×１０⁵コピー／ml)。同様に、たった１つの献物中に１× １０⁴コピー／mlのウイルス汚染を伴う、５０および１００の個々のドナー由来 の血漿プール中での検出の感度を増大させることが可能であった。たった１つの 献物中の１×１０³コピー／mlでのウイルス汚染は、１０の個々のドナー由来の 最も小さなプールサイズでしか検出することができなかった。 次に大きいプールサイズでのウイルスゲノムの検出を改良するために、１００ 倍の初期体積の、実施例３.１.で使用した試料３および４を、さらなる実験にお いて濃縮し、１／１００の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲ に使用した。ＰＣＲ評価の結果を表５.３.に要約する。 血漿試料を１００倍濃縮することにより、たった１つの献物中の１×１０⁴コ ピー／mlのウイルスＨＩＶゲノム汚染をさらに、５００、１,０００および２,０ ００の個々のドナー由来の血漿プール中で検出することができた。 実施例 ４ ４.１．ＨＣＶ−ＲＮＡに関する様々なサイズの血漿プールの試験 １０、５０、１００、５００および１,０００のＨＣＶ 血清(−)の健康な個々 のドナー由来の血漿試料を混合して、試料プールとした。各々の個々のプールサ イズを、実施例１でのように測定された１.６×１０⁶コピー／ml(試料 １)とい う高い汚染を有する、一次ＨＣＶ感染したドナーの献血漿に由来する１つの血漿 試料と、実施例１でのように測定された２.２×１０⁴コピー／ml(試料 ２)とい う最小汚染で一次感染したドナー由来の１つの血漿試料と、また対象として、１ ×１０³コピー／ml(試料 ３)、および５×１０²コピー／ml(試料 ４)であるＨＣ Ｖの規定された製剤と混合した。各々のプールサイズに関する、定量可能なコピ ー数／mlを、ＰＣＲによって測定した。ＰＣＲ評価の結果を表６.１.に要約する 。 結果： 表６.１.は、１.６×１０⁶コピー／mlという高い汚染を有する、一次感染した 献物でのウイルス汚染を、１０、５０、１００、５００、および１,０００個の 献物からなる血漿プール中で検出することができることを示す。１００、５００ および１,０００の個々のドナー由来のプールでは、たった１つの、最小限度に 汚染された献物(２.２×１０⁴コピー／ml)により引き起こされるＨＣＶ−ＲＮＡ はもはや、検出することができなかった。ＨＣＶゲノム当量の検出は、１０およ び５０までのドナー由来のプール中、たった１つの献物における２.２×１０⁴コ ピー／mlの汚染で可能である。たった１つの献物における約１×１０³または５ ×１０²コピー／mlという、より少ない数のＨＣＶコピーでのウイルスゲノム当 量汚染は、試験したプールサイズではいずれも検出することができなかった。 ４.２．試料を濃縮することによる感度の増大 ＨＣＶ−ＲＮＡのコピーを検出することができなかったプールサイズでの感度 を増大させるために、プールした血漿の１０倍濃縮した試料をＰＣＲに使用した 。この目的のために、実施例４．１．で使用した、試料２、３および４の個々の 血漿プールの各々の場合における試料体積の１０倍体積を遠心分離により濃縮し 、１／１０の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲに使用した。 ＰＣＲ評価の結果を表６.２.に要約する。 ＰＣＲの初期試料体積を１０倍濃縮することにより、１つの一次ＨＣＶ感染し た献物を含む１０、５０および５００の個々のドナー由来のプールの最小負荷を 検出することが可能であった(２.２×１０⁴コピー／ml)。同様に、１０の個々の ドナー由来の血漿プール中、たった１つの献物における１×１０³または５×１ ０²コピー／mlという、各々のウイルス汚染の検出の感度を増大させることが可 能であった。 次に大きいプールサイズでのウイルスゲノムの検出を改良するために、１００ 倍の初期体積の、実施例４.１.で使用した試料３および４を、さらなる実験にお いて濃縮し、１／１００の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲ に使用した。ＰＣＲ評価の結果を表６.３.に要約する。 血漿試料を１００倍濃縮することにより、たった１つの献物中の１×１０³お よび５×１０²コピー／mlのウイルスＨＣＶゲノム汚染をさらに、１００の個々 のドナー由来の血漿プール中で検出することができた。 実施例 ５： ５.１．ＨＢＶ−ＤＮＡに関する様々なサイズの血漿プールの試験 １０、５０、１００、５００、１,０００および２,０００のＨＢＶ 血清(−) の健康な個々のドナーの血漿試料を混合して、試料プールとした。そのプールを 、実施例１でのように測定された１.３×１０⁸コピー／ml(試料 １)という高い 汚染を有する、一次ＨＢＶ感染したドナー由来の血漿試料と、実施例１でのよう に測定された１.４×１０⁴コピー／ml(試料 ２)という最小汚染で一次感染した ドナー由来の血漿と、また対象として、５×１０³コピー／ml(試料 ３)、および １×１０³コピー／ml(試料 ４)であるＨＢＶの規定された製剤と混合した。各々 のプールサイズに関する、定量可能なコピー数／mlを、ＰＣＲによって測定した 。ＰＣＲ評価の結果を表７.１.に要約する。 表７.１.は、高いゲノム汚染を有する、一次ＨＢＶ感染した献物でのウイルス 汚染を、１０、５０、１００、５００、１,０００および２,０００個の献物から なる血漿試料プール中で検出することができることを示す。５００、１,０００ および２,０００の個々のドナー由来のプールでは、たった１つの、最小限度に 汚染された献物(１.４×１０⁴コピー／ml)により引き起こされるＨＢＶ−ＤＮＡ はもはや、検出することができなかった。ＨＢＶゲノム当量の検出は、１０およ び５０までのドナー由来のプール中、たった１つの献物における５×１０³コピ ー／mlの汚染で、また１０までのドナー由来のプール中、たった１つの献物にお ける１×１０³コピー／mlの汚染で可能であった。 ５.２．試料を濃縮することによる感度の増大 ＨＢＶ−ＤＮＡのコピーを検出することができなかったプールサイズでの感度 を増大させるために、プールした血漿の１０倍濃縮した試料をＰＣＲに使用した 。この目的のために、実施例５.１.で使用した、試料２、３および４の個々の血 漿プールの各々の場合における試料体積の１０倍体積を遠心分離により濃縮し、 １／１０の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲに使用した。Ｐ ＣＲ評価の結果を表７.２.に要約する。 ＰＣＲの初期試料体積を１０倍濃縮することにより、１.４×１０⁴コピー／ml という、１つの一次ＨＢＶ感染した献物を含む５００の個々のドナー由来のプー ルの最小負荷を検出することが可能であった。同様に、１００および５００の個 々のドナー由来の血漿プール中、たった１つの献物に由来する５×１０³コピー ／mlのウイルス汚染を、また５０および１００の個々のドナー由来の血漿プール 中、たった１つの献物に由来する１×１０³コピー／mlの汚染を検出する感度を 増大させることが可能であった。 次に大きいプールサイズでのウイルスゲノムの検出を改良するために、１００ 倍の初期体積の、実施例５.１.で使用した試料３および４を、さらなる実験にお いて濃縮し、１／１００の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲ に使用した(表７.３.)。 結果： 血漿試料を１００倍濃縮することにより、たった１つの献物中の１×１０³コ ピー／mlのウイルスＨＩＶゲノム汚染をさらに、５００および１,０００の個々 のドナー由来の血漿プール中で検出することができた。 実施例 ６：ＨＩＶおよびＨＣＶＲＮＡに関する様々なサイズの血漿プールの 試験 １０、５０、１００、５００、１,０００および２,０００のＨＩＶ 血清(−) およびＨＣＶ 血清(−)の健康な個々のドナー由来の血漿試料を混合して、血漿 試料プールとした。各々の個々のプールサイズを、実施例２.１.および２.２.で のように測定された２.３×１０⁷コピー／mlという高いＨＩＶ負荷、および１. ６×１０⁶コピー／ml(試料 １)というＨＣＶ負荷、並びに実施例２.１.および２ .２.でのように測定された２.８×１０⁵コピー／mlという最小ＨＩＶ負荷、およ び２.２×１０⁴コピー／ml(試料 ２)というＨＣＶ負荷を有する、一次ＨＩＶ感 染したドナー由来の血漿試料、および一次ＨＣＶ感染したドナー由来の血漿試料 、また対照として、１×１０⁴コピー／mlであるＨＩＶ、および１×１０³コピー ／ml(試料 ３)であるＨＣＶの規定された製剤、並びに１×１０³コピー／mlであ るＨＩＶ、および２×１０²コピー／ml(試料 ４)であるＨＣＶの製剤と混合した 。ＨＩＶおよびＨＣＶに特異的な核酸の存在に関して、各々のプールサイズを、 ＨＩＶおよびＨＣＶに特異的なプライマーを用いてのＬＩＦ−ＰＣＲによって試 験した。１,０００の個々のドナー由来のプールサイズまでの、たった１つの献 物による２.３×１０⁷ＨＩＶコピー／mlおよび１.６×１０⁶ＨＣＶコピー／mlと いう最大汚染を伴う汚染で、ＨＩＶに特異的なゲノム配列およびＨＣＶに特異的 なゲノム配列を検出することが可能であった。ＨＩＶゲノム当量はさらに、僅か に汚染された献物で汚染された５００個の献物のプール中で見い出されたが、Ｈ ＣＶゲノム当量は、５０の個々のドナー由来のプール中でしか見い出すことはで きなかった。従って、試験したプール中でのＨＣＶゲノム配列の検出に対する感 度は、ＨＩＶゲノム配列に対する感度より対数減衰的に(log step)低い。 ７．プール中のＨＡＶウイルス汚染に対する、ＨＡＶ免疫化献物の中和効果の 検出 ＨＡＶ免疫化ドナー由来の献血漿の中和能力は、インビトロにおける中和試験 により示すことができる。 血漿中に存在するＡ型肝炎ウイルスに対するＨＡＶ抗体の中和効果を検出する ために、防御免疫を有する１００の予め免疫化されたＨＡＶドナー由来の血漿プ ールを試験して、そのプールをＨＡＶ(タイター １０^6.4ＴＣＩＤ₅₀／ml)と混合 した。３７℃で１時間インキュベーションした後、ＨＡＶタイターを測定した。 血漿プール中に存在するＨＡＶ抗体により、ＨＡＶ感染力を対数減衰的に＞４. ６まで減少させることができた。このことは、免疫されたドナー由来の血漿中に 存在する防御抗体が、より大きな血漿プール中でのウイルス汚染を中和すること ができることを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/576 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｚ (72)発明者 イーゲル，ヘルヴィッヒ オーストリア、アー−1190ヴィーン、ハル トガッセ33番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１以上の血漿誘導体を活性物質または補助成分として含む薬物であって、 出発原料または血漿誘導体の製造中に生ずる中間体が、ウイルスにより汚染され ておらず、またはその１以上の複製可能な血液原ウイルスのウイルス負荷が規定 された限界値を越えておらず、 − 幾つかの複製可能な血液原ウイルスによる汚染の不在を、出発原料もしくは 中間体中の過剰のウイルス中和抗体により、または献血漿時の血漿ドナーの防御 免疫により測定し、 − あるいは、出発原料もしくは中間体中の問題の各々のウイルスのゲノム当量 を、核酸の検出または測定のための、定量可能な、制御された、および非阻害的 方法により測定し、 最終血漿誘導体の製造のための、このようにして品質が確かめられた出発原料ま たは中間体を少なくとも１つの実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工 程にかけて、得られた品質保証された最終血漿誘導体を既知の方法により後処理 して、薬物とする ことを特徴とする薬物。 ２．請求項１に記載の薬物であって、好ましくはＨＩＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶおよ びＨＣＶ、また特にＨＩＶおよびＨＣＶよりなる群から選択される、少なくとも ２つのウイルスに関して、ウイルス汚染が全く存在しないか、またはウイルス負 荷の規定された限界値を越えないことを特徴とする薬物。 ３．請求項１または２に記載の薬物であって、越えてはならない、複製可能な 血液原ウイルスによる出発原料または中間体のウイルス負荷の規定された限界値 が、出発原料または中間体１ml当たり、最大５００ゲノム当量まで、特に最大２ ００ゲノム当量まで、好ましくは１００ゲノム当量まで、またとりわけ好ましく は５０ゲノム当量まで限定されることを特徴とする薬物。 ４．請求項１〜３のいずれかに記載の薬物であって、品質保証された出発原料 または品質保証された中間体から薬物を製造する間に、少なくとも４つのリダク ション因子を用いる、少なくとも１つの方法によって、ウイルス不活性化または ウイルス消失を行うことを特徴とする薬物。 ５．請求項１〜４のいずれかに記載の薬物のための、品質保証された出発原料 であって、場合により、好ましくは約２００個の献物からなる、品質保証された ミニプールを混合して、好ましくは約２,０００個の献物からなる、品質保証さ れたマクロプールとすることにより製造される、品質保証された血漿プールであ ることを特徴とする、品質保証された出発原料。 ６．請求項５に記載の、品質保証された出発原料であって、品質保証されたマ クロプールを、多数の、さらなる品質保証されたマクロプールと混合することに より合わせて、２００,０００個までの献物からなる、品質保証されたマルチマ クロプールとすることを特徴とする、品質保証された出発原料。 ７．請求項５または６に記載の、品質保証された出発原料であって、２〜約２ ０個の献物からなる、品質保証された小さなプールを混合することにより、品質 保証されたミニプールを得ることを特徴とする、品質保証された出発原料。 ８．請求項１〜７のいずれかに記載の薬物のための、品質保証された出発原料 であって、ウイルス負荷の不在、または規定された限界値を越えないウイルス負 荷が、 − ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、パルボウイルスおよびＨＡＶ群の全てのウイルス のゲノム当量を測定すること、 − ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびパルボウイルス群の全てのウイルスのゲノム 当量を測定すること、さらにはまた過剰のＨＡＶ抗体を測定すること、 − ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量を測定するこ と、さらにはまた過剰のＨＡＶおよびパルボウイルス抗体を測定すること、 − ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量を測定するこ と、さらにはまた過剰のＨＡＶ抗体を測定すること、 − ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量を測定するこ と、さらにはまた過剰のパルボウイルス抗体を測定すること、 − ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量を測定するこ と、 − ＨＩＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量を測定すること、また は − ＨＩＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量を測定すること、さら にはまた過剰のＨＢＶ抗体を測定すること により達成されることを特徴とする、品質保証された出発原料。 ９．請求項１に記載の、２つまたはそれ以上の最終血漿誘導体から調合により 製造される薬物。 １０．品質保証された出発原料からの、または血漿誘導体の製造中に生ずる品 質保証された中間体からの、１以上の血漿誘導体を含む薬物の製造方法であって 、その方法においては、その品質保証された出発原料または中間体は、１つまた はそれ以上の複製可能な血液原ウイルスで汚染されていないか、または規定され た限界値を越えないレベルでウイルス負荷を有し、核酸の検出または測定のため の、定量可能な、制御された、および非阻害的方法により、各々のウイルスのゲ ノム当量を測定する場合、１つまたはそれ以上の以下の基準： − 少なくとも１０,０００コピーの選択された核酸配列の核酸増幅方法の検出 限界； − 出発原料または中間体１ml当り、ある一定数のゲノム当量、特に５００以下 のゲノム当量、好ましくは２００以下のゲノム当量、さらに好ましくは１００以 下のゲノム当量、またとりわけ好ましくは５０以下のゲノム当量 に従って、規定された限界値を選択することを特徴とする方法。 １１．請求項１０に記載の方法であって、１より大きい検出または測定システ ムを核酸に対して使用し、その検出または測定システムを、１つのシステムが誤 った陽性の結果を排除して、他のシステムが誤った陰性の結果を排除するよう、 好ましくは選択することを特徴とする方法。 １２．請求項１１に記載の方法であって、少なくとも２つの異なったＰＣＲ法 を利用し、少なくとも１つの方法はスクリーニングに役立ち、少なくとも１つの 方法は確認に役立つことを特徴とする方法。 １３．請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法であって、出発原料もしくは 中間体、またはその中に含まれるゲノム当量を、好ましくは凍結乾燥、吸着、ま たは遠心分離により濃縮することを特徴とする方法。 １４．請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法であって、存在する可能性の ある増幅の阻害物質を、出発原料中、または中間体中から除去する、または消失 させることを特徴とする方法。 １５．請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法であって、幾つかのウイルス に特異的なプライマー対を増幅において使用し、幾つかの異なったウイルスの存 在を同時にアッセイすることができることを特徴とする方法。 １６．請求項１０〜１５のいずれかに記載の方法であって、該プライマー対を 、それらがアッセイすべき個々の血液原ウイルスの保存されたゲノム配列をコー ドするよう選択し、それらの適合性が、アッセイすべきウイルスの典型的な試料 横断切片の適当な試料において確立されることを特徴とする方法。 １７．請求項１０〜１６のいずれかに記載の方法であって、試料中の核酸を検 出する、または測定する方法を調べるために、該方法を行う前または間に、１つ または幾つかの内部標準または標準品を試料に加え、その標準物質が、全く同じ 試験容器中、存在する可能性のあるウイルスゲノムまたはゲノム配列と同時に検 出される、または測定されることを特徴とする方法。 １８．２つまたはそれ以上の個々の献物から、１つまたはそれ以上の複製可能 な血液原ウイルスの、確かめられた、限定された負荷を伴う、品質保証された出 発原料として血漿プールを製造する方法であって、ゲノム当量を測定するための 以下の工程： − 試料をｎ個の献物から採取し、 − 個々の献物試料を合わせて、ｍの試料プールとし、また − これらの試料プール中に存在するウイルスゲノムまたはゲノム配列の量を、 核酸の検出または測定のための、定量可能な、制御された、および非阻害的方法 によって検出し、 ここで、試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出量が、ある一 定の限界値以下にある、個々の献物(ｎ_g)を合わせて、品質保証された血漿プー ルとして、試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出量が、限界値 より大きいか、または限界値に等しい、個々の献物(ｎ_a)を、さらなる処理にか けるか、または排除する(ｎおよびｍは正の整数である) ことにより特徴付けられる方法。 １９．請求項１８に記載の方法であって、 − 排除されるｎ_a個の献物のさらなる処理のために、試料をもう一度採取して 、これらの個々の献物試料を合わせて、ｍ_aの試料プールとし(ｎ_aおよびｍ_aは、 ｍ_a ＞２の正の整数であって、ｍ_a：ｎ_aの割合は、ｍ：ｎの割合より大きい)、そ して − これらの試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の量を、核酸の検 出または測定のための、定量可能な、制御された、および非阻害的方法によって 、もう一度検出し、 ここで、試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出量が、ある一 定の限界値以下にある、個々の献物を合わせて、品質保証された血漿プールとし て、ウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出量が、限界値より大きいか、または 限界値に等しい、個々の献物を、さらなる処理にかけるか、または排除し、そし てさらに処理すべき、または排除すべき個々の献物の数が、ある一定数に達する か、または一定数以下となるまで、該方法を繰り返すことができることを特徴と する方法。 ２０．請求項１８または１９に記載の方法であって、ｎが２〜２００,０００ 、好ましくは２０〜２０,０００、特に好ましくは２００〜２,０００、またとり わけ２００に等しく、ｍが１〜１００,０００、好ましくは２〜１,０００である こと、また請求項１１に従って、最終的に排除すべき個々の献物のセット数が、 １００、好ましくは１０、また特に好ましくは１であることを特徴とする方法。 ２１．請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法であって、合わせて、品質保 証された血漿プールとした個々の献物を、さらなる品質保証された血漿プールと 合わせ、品質保証されたミニプール、マクロプールまたはマルチマクロプールを 提供することを特徴とする方法。 ２２．請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法であって、核酸の検出または 測定に加えて、アッセイすべきウイルスに対するウイルス中和抗体に関して、血 漿プールをアッセイすること、またその試料プール中、対応するウイルスに対す るウイルス中和抗体を検出することができない個々の献物をさらなる処理にかけ るか、または排除することを特徴とする方法。 ２３．請求項２２に記載の方法であって、さらなる処置に関して、個々の献物 を、請求項１０に記載の方法と同様に、より小さなサブグループでもう一度分析 することを特徴とする方法。 ２４．請求項１０〜２３のいずれかに記載の方法により得ることができる、品 質保証された出発原料または中間体。 ２５．請求項１８〜２３のいずれかに記載の方法により得ることができる、品 質保証された血漿プール。 ２６．実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工程により、請求項２４ に記載の品質保証された出発原料または中間体から得ることができる、品質保証 された最終血漿誘導体であって、好ましくは、ウイルスゲノム当量またはウイル ス中和抗体に関して、もう一度アッセイされている血漿誘導体。 ２７．医薬品製剤化工程により、ヒト血漿起源の品質保証された最終血漿誘導 体から得ることができる薬物。 ２８．複製可能な様々な血液原ウイルスを含まない、１以上の血漿誘導体を含 む薬物の製造方法であって、以下の工程： − ヒト血漿に由来する出発原料、または血漿誘導体の製造中に生じる中間体を 与え、 − 複製可能な血液原ウイルスによるウイルス汚染の不在を検出することにより 、またはそのような汚染が、ある特定の限界値を越えない量で存在することを検 出することにより、出発原料または中間体の品質を確かめ、 − 出発原料または中間体中の過剰のウイルス中和抗体により、または献血漿時 の血漿ドナーの防御免疫により、幾つかの複製可能な血液原ウイルスによるウイ ルス負荷の不在を測定し、 − あるいは、問題の各々のウイルスのゲノム当量を、出発原料において、また は中間体において測定し、 − このようにして品質の確かめられた出発原料または中間体を、少なくとも１ つのさらなる実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかけて、血漿 誘導体を完成し、また − 得られた品質保証された最終血漿誘導体を、公知の方法により後処理して、 薬物とする ことにより特徴付けられる方法。 ２９．請求項２８に記載の方法であって、品質保証を、実質的なウイルス消失 またはウイルス不活性化工程にかけるべき、各々の中間体に対して行うことを特 徴とする方法。 ３０．請求項１〜４のいずれかに記載の薬物のための、品質保証された出発原 料または中間体を混合した後、さらに処理して、品質保証された出発原料または 品質保証された中間体プールとすることにより得ることができる、品質保証され た出発原料または中間体。 ３１．請求項１または２に記載の薬物であって、存在する可能性のある複製可 能な血液原ウイルスを不活性化する、または排除するために、ウイルス不活性化 またはウイルス消失を、４つ未満のリダクション因子を有するタンパク質保存方 法によって行うことを特徴とする薬物。 ３２．請求項３１に記載の薬物であって、唯一のウイルス不活性化またはウイ ルス消失が、存在する可能性のある複製可能な血液原ウイルスを不活性化する、 または排除するのに十分であることを特徴とする薬物。