JP2008247913A - 1以上の血漿誘導体を含む、品質保証された薬物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】最終血漿誘導体を製造するための、このようにして品質の確かめられた出発原料または中間体を、少なくとも1つのさらなる実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかける。本発明はさらに、この薬物を製造するための方法、さらにはまた、品質保証された出発原料または中間体を製造するための方法を記載する。
【選択図】なし
Description
The EEC Regulatory Document Note for Guidance,Guidelines for Medicinal Products Derived from Human Blood and Plasma(Biologicals 1992、20:159−164)は、血漿ドナーおよび献血漿を調べるための品質保証システムを提唱している。従って、各々の献血漿を、B型肝炎抗原またはHIV−1およびHIV−2抗体といったようなウイルスマーカーの不在に関する確認試験で分析しなければならないが、これは、これらが血漿ドナーの対応するウイルス感染を示すからである。C型肝炎の感染を排除するための試験もまた行うべきである。
− 幾つかの複製可能な血液原ウイルスのウイルス負荷の不在を、出発原料もしくは中間体中の過剰のウイルス中和抗体により、または献血漿時の血漿ドナーの防御免疫により測定し、
− あるいは、出発原料もしくは中間体中の問題の各々のウイルスのゲノム当量(equivalents)を、核酸の検出または測定のための、定量可能な、制御された、非阻害的方法により測定し、最終血漿誘導体の製造のための、品質保証された出発原料または中間体を、少なくとも1つの実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかけて、得られた品質保証された最終血漿誘導体を既知の方法により後処理して、薬物とする。
他の酵素的方法は、欧州特許第0 310 229号、およびGuatelli,J.C.ら(Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1990、87:1874〜1878)による、NASBA(核酸配列に基づく増幅)、3SR(自己支持配列複製)、または欧州特許第0 373 960号、およびKwoh,D.Y.ら(Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1989、86:1173〜1177)によるTAS(転写に基づく増幅システム)である。これらの方法では、増幅において、例えば、DNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼといったような一連の酵素を同時に、または段階的に使用する。
欧州特許第0 590 327 A2号は、例えば、C型肝炎ウイルス、HIV、またはB型肝炎ウイルスのウイルスRNAまたはDNAの測定を提供する、血液試料の分析方法を開示している。B型肝炎ウイルスゲノムを測定するための試験に対する検出限界は、その評価を、ゲルを染色した後で電気泳動により行うなら、1,500コピー(150,000コピー/ml)である。血液試料は一部が、血液の乾燥スポットである。分析後、試料のさらなる処理のための準備はしない。
原則的には、血漿プール、クリオプアー(cryopoor)血漿、またはCohn II + III ペーストといったような、ある特定の製造方法を開始する物質を全て、出発原料としてみなすべきである。一連の可能な出発原料は、Heideら(「The Plasma Proteins」中の「Plasma Protein Fractionation」、Frank W.Putnam編、Academic Press New York、San Francisco、London 1977、545〜597頁)による論文で引用されている。
− HIV、HBV、HCV、パルボウイルスおよびHAV群の全てのウイルスのゲノム当量を測定する、
− HIV、HBV、HCVおよびパルボウイルス群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはまた過剰のHAV抗体を測定する、
− HIV、HBVおよびHCV群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはまた過剰のHAVおよびパルボウイルス抗体を測定する、
− HIV、HBVおよびHCV群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはまた過剰のHAV抗体を測定する、
− HIV、HBVおよびHCV群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはまた過剰のパルボウイルス抗体を測定する、
− HIV、HBVおよびHCV群の全てのウイルスのゲノム当量を測定する、
− HIVおよびHCV群の全てのウイルスのゲノム当量を測定する、
− HIVおよびHCV群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはまた過剰のHBV抗体を測定する
ということにある。
− 出発原料または中間体1ml当り、ある一定数のゲノム当量、特に500以下のゲノム当量、好ましくは200以下のゲノム当量、さらに好ましくは100以下のゲノム当量、またとりわけ好ましくは50以下のゲノム当量。
− 細胞培養試験によって測定される限界値、好ましくは、1ml当りのあるTCID50(a TCID50)、またはこの量で含まれるゲノム当量、
− 動物モデルによって測定される限界値、好ましくは、1ml当りのあるCID50(a CID50)、またはこの量で含まれるゲノム当量
である。
− 試料をn個の献物から採取し、
− 個々の献物試料を合わせて、mの試料プールとし、
− この試料プール中に存在するウイルスゲノムまたはゲノム配列の量を、核酸の検出または測定のための、定量可能な、制御された、および非阻害的方法によって検出する
により特徴付けられる方法に関し、
その方法においては、試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出量が、ある一定の限界値以下にある、個々の献物(ng)を合わせて、品質保証された血漿プールとして、試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出量が、限界値より大きいか、または限界値に等しい、個々の献物(na)を、さらなる処理にかけるか、または排除する(nおよびmは正の整数である)。例えば、ウイルスゲノム当量を消失させることにより、またはウイルス中和抗体含有画分を混合することにより、個々の献物のさらなる処理を行うことができる。
− 血漿誘導体の製造中に生じ、またヒト血漿から誘導される出発原料または中間体を与え、
− 複製可能な血液原ウイルスによるウイルス汚染の不在を実証することにより、またはそのような汚染が、ある特定の限界値を越えない量で存在することを測定することにより、出発原料または中間体の品質を保証し、
− 出発原料または中間体各々の中の過剰のウイルス中和抗体により、または献血漿時の血漿ドナーの防御免疫により、幾つかの複製可能な血液原ウイルスによる汚染の不在を検出し、
− あるいは、問題の各々のウイルスのゲノム当量を、出発原料中、または中間体中、各々、測定し、
− このようにして品質保証された出発原料または中間体を各々、少なくとも1つのさらなる実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかけて、血漿誘導体を完成し、
− このようにして得られた品質保証された最終血漿誘導体を、公知の方法により後処理して、薬物とする。
本発明を以下の実施例により記載するが、これは、本発明を限定しようとするものではない。
1. PCRの通則
1.1. DTS−PCR(二重標的化サザンブロット)の通則
第1の特異的プライマー対によって、核酸をPCRで増幅した後、そのPCR産物をアガロースゲルでの電気泳動により分離して、フィルターにブロットさせる。フィルターに結合させたPCR産物をジゴキシゲニン(DIG)標識化プローブとハイブリダイズさせると、これが増幅されたゲノム配列内に結合し、発生反応後に検出する。デンシトメーターによって、バンド強度を定量的に測定する。第1のプライマーとは異なる第2のプライマー対を使用する、さらなるPCRでは、核酸を増幅して、サザンブロット分析によってもまた検出する。ゲノム配列の2つの異なる領域のPCR、およびハイブリダイゼーションによる、それらの視覚化により、誤った陰性の結果を減らすことができ、また陽性の結果を確かめることができる。
蛍光基を有するプライマーを使用するPCRによって、様々な起源の核酸を増幅した。レーザー誘起蛍光測定装置を備えた自動DNAシークエンサー(Applied Biosystems製のGene Scan(商標) ソフトウェアを備えたDNA Sequencer 373A)の助けをもって、得られた増幅産物の分析および定量を行った。この装置により、変性条件下、ポリアクリルアミドゲル中でのゲル電気泳動によって、蛍光標識化PCR産物をサイズにより分離して、それらの量を定量的に測定することができる。試料中の幾つかの配列のコピー数を、定量すべき核酸、および少なくとも2つの内部標準に関して得られた強度に基づいて測定する。
超遠心分離機中、試料500μlを70,000rpmで20分間遠心分離した。ペレットを、10mM トリス/HCl(pH 8.0)500μl、およびプロテイナーゼ K(Boehringer Mannheim、20mg/ml)10μl、さらにはまた20% SDS10μlに溶解する。37℃で一晩インキュベーションするか、または56℃で4時間インキュベーションした後、既知量の標準核酸を加え、試料をフェノールおよびクロロホルムで順次抽出した後、グリコゲン(Boehringer Mannheim、20mg/ml)10μlを加える。続いて、生成物をエタノールで沈殿させ、遠心分離して、ペレットを洗浄して、最終的には、水に溶解する。
試料500μlを、10mM トリス/HCl(pH 8.0)5μl、およびプロテイナーゼ K(20mg/ml)10μlに溶解する。37℃で一晩インキュベーションするか、または56℃で4時間インキュベーションした後、既知量の標準核酸を加え、試料をフェノールおよびクロロホルムで順次抽出して、グリコゲン(20mg/ml)10μlを加える。続いて、生成物をエタノールで沈殿させ、遠心分離して、ペレットを洗浄して、最終的には、水に再び溶解する。
血漿またはPBSで希釈した血漿1mlを70,000rpmで20分間遠心分離する。上清を吸引により取り除いた。ペレットを、イソチオシアン酸グアニジウム溶液(BiotexのRNAzol)1ml、および酵母由来の1mg/ml tRNA5μlにとって、20μlのような、予め決められた量の標準RNAを加えた。400および1,200コピーといったような、指定された数の(−)RNA標準および(+)RNA標準を加えて、渦流する(vortexed)。その溶液を70℃で10分間加熱し、1/10体積のクロロホルムを加えた後、その混合物を氷上で10分間インキュベートする。次いで、卓上遠心分離機中、これを5分間遠心分離して、上清を新しい管に移す。イソプロパノール500μlを加えて、温度を−80℃で15分間維持する。次いで、これを10分間遠心分離し、70% エタノールで2回洗浄して、ペレットを水50μlにとる。RT−PCRの場合には、5μlを使用した。
PCR製剤は、抽出された核酸のアリコート、PCR緩衝液(Boehringer Mannheim)、MgCl2、dNTPs、プライマー、Taq ポリメラーゼ(Boehringer Mannheim、5.0ユニット/μl)および水を既知の方法で含む。緩衝液および酵素の製造業者の指示に従って、また従来の方法に従って、PCRを行う(Mullisら、Methods in Enzymology 155:335、1987)。
RT−PCR製剤は、Perkin−Elmer製のRT緩衝液中の抽出された核酸のアリコート、MgCl2、dNTPs、RT プライマー、およびrT.th. ポリメラーゼ(Perkin−Elmer、2.5ユニット/μl)および水を通常の方法で含む。緩衝液および酵素の製造業者の指示に従って、また従来の方法に従って、RTをPCR装置(Perkin−ElmerのGeneAmp PCR System 9600)で行う(Mullisら、Methods in Enzymology 155:335、1987)。
PCRの場合には、MgCl2、キレート緩衝剤、および第2のプライマーをさらに加える。次いで、PCRを上記のように行う。
PCR産物の測定および定量のために、0.5〜1.0μlをPCR溶液から採取して、製造業者の指示に従って、Applied Biosystems 373A装置で分析する。
各々の生成物に意図された濃度でのPCR産物のゲル電気泳動分離のために、アガロースゲルを調製した。ゲル操作は、電気泳動用の1×操作用(running)緩衝液中で行った。PCR産物試料を、0.5×操作用緩衝液中のフィコール/ブロモフェノールブルーと混合して、調製したゲルスロットを変えた。ゲル操作後、そのゲルを0.5M NaOH/1.5M NaCl中で1時間インキュベーションすることにより、PCR産物を変性させた後、中和した。DNAをフィルター(DuralonTM、Stratagene、La Jolla、California)に移して、核酸をUV架橋(cross linking)より膜に結合させた。プレハイブリダイゼーション緩衝液(6×SSC、0.5% SDS、5×Denhardt's、100μg/ml 変性DNA)中、その膜を68℃で1時間インキュベートした。ハイブリダイゼーションでジゴキシゲニン標識化DNAプローブで起こした後、アルカリ性ホスファターゼがコンジュゲートした抗体、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、および5−ブロモ−1−クロロ−3−インドールホスフェート(BCIP)によって、免疫染色によるバンドの視覚化を成し遂げた。ブロットをデンシトメトリーにより評価した。
LIF−PCRに使用したプライマーを表1.1.および表1.2.に要約する。
DTS−PCRに使用したプライマーは、HIVの場合には、SK38、SK39、SK145およびSK431(Ratnerら、1985);HCVの場合には、32、R3、CHAA、R1、ConA1、ConaA2およびConA(Chironから入手可能);およびHBVの場合には、HBV1aおよびHBV1b(Kanekoら、1989)、さらにはまたHBV4aおよびHBV4b(Carmanら、1989)である。
2.1. LIF−PCRおよびDTS−PCRによる、ドナー由来の血漿試料中のHIV RNAの定量
献血漿を、HIV 血清(−)の健康な被験者、およびHIV 血清(−)、p24抗原(+)の一次感染した被験者から採取した。ドナーの血漿試料をLIF−PCRおよびDTS−PCRによって試験した。DTS−PCRによる試料試験を、プライマー対 SK145/431(プライマー対 1)およびSK38/39(プライマー対 2)(表1.1.)で行った;正のハイブリダイゼーションシグナルを有する試料をLIF−PCRによってさらに試験した。LIF−PCRによって定量する場合には、HIV−1のcDNA配列に結合し、野生型RNAのRT−PCRによって115bpのPCR産物を与える、プライマー SK38およびSK39(表 1.1)を使用した。標準プラスミド、pgag1、pgag−15およびpgag+12(表1.2.)を使用した結果、115bp(pgag1)、100bp(pgag−15)および127bp(pgag+12)のRT−PCR産物が生じた。標準プラスミドを共増幅し(coamplified)、Gene Scan(商標)で共分析して(coanalyzed)、コピー数/mlを測定した。定量的評価の結果を表2に要約する。
献血漿を、HCV 血清(−)の健康な被験者、およびHCVの一次感染した被験者から採取した。ドナー由来の血漿試料をLIF−PCRおよびDTS−PCRによって試験した。試料のDTS−PCR試験を、プライマー対 32/R3(プライマー対 1)およびCHAA/R1(プライマー対 2)(Chiron)で行った;正のハイブリダイゼーションシグナルを有する試料を、LIF−PCRによってさらに試験した。LIF−PCRにより定量する場合には、HCVのcDNA配列に結合して、RT−PCRにより野生型RNAから誘導される114bpの産物を与える、プライマー HCV32およびHCVPT4(表 1.1)を使用した。標準プラスミドとして、pHCVwt、pHCV−7およびpHCV+8(表1.2.)を使用した結果、長さ 114bp(pHCVwt)、107bp(pHCV−7)および122bp(pHCV+8)のRT−PCR産物が生じた。標準プラスミドを試料で共増幅し、Gene Scan(商標)で共分析して、コピー数/mlを測定した。定量的測定の結果を表3に要約する。
献血漿を、HBV 血清(−)の健康な被験者、並びに一次感染した、HBsAg(+)、抗HBsAg 血清(−)、およびHBsAg(+)、抗HBsAg 血清(+)の被験者から採取した。ドナーの血漿試料をLIF−PCRおよびDTS−PCRによってアッセイした。DTS−PCRによる試料試験を、プライマー対 HBV1a/HBV1b(プライマー対 1)およびHBV4a/HBV4b(プライマー対 2)で行った(Carmanら、1989);正のハイブリダイゼーションシグナルを有する試料をLIF−PCRによってさらに試験した。LIF−PCRにより定量する場合には、HBVゲノムのcDNA配列に結合して、RT−PCRにより野生型RNAから誘導される182bpのPCR産物を与える、プライマー HBV+1780BおよびHBV−1950B(表1.1.)を使用した。標準プラスミド、pHBVwt、pHBV−9およびpHBV+12(表1.2.)を使用したが、これらは、182bp(pHBVwt)、173bp(pHBV−9)および194bp(pHBV+12)のRT−PCR産物を与える。標準プラスミドを試料で共増幅し、Gene Scan(商標)で共分析して、コピー数/mlを測定した。定量的評価の結果を表4に要約する。
3.1. HIV−1 RNAに関する様々なサイズの血漿プールのアッセイ
10、50、100、500、1,000および2,000のHIV 血清(−)、p24抗原(−)の健康な個々のドナー由来の血漿試料を、試料プール中に混合した。各々の個々のプールサイズを、実施例1でのように測定された2.3×107コピー/ml(試料)という高いウイルス負荷で一次HIV感染したドナー由来の1つの血漿試料と、実施例1でのように測定された2.8×105コピー/ml(試料 2)という最小汚染で一次HIV感染したドナー由来の1つの血漿試料と、また対照として、1×104コピー/ml(試料 3)、および1×103コピー/ml(試料 4)であるHIV RNAの規定された製剤と混合した。各々のプールサイズに関する定量可能なウイルスのコピー数/mlを、LIF−PCRによって測定した。PCR評価の結果を表5.1.に要約する。
表5.1.は、高い負荷(2.3×107コピー/ml)を有する、さらにはまた最小汚染(3.8×105コピー/ml)を有する、一次感染した、抗−HIV 血清(−)、p24抗原(+)の個々の献物でのウイルス汚染を、10、50、100および500の個々の献物の血漿プール中、PCRによって検出することができることを示す。HIV−RNAで高度に汚染された献物はまた、1,000および2,000の個々のドナー由来の血漿プール中でも検出することができた;他方、最小汚染を伴う献物はもはや、このサイズのプールでは検出することができなかった。個々の献物中、1×104コピー/mlでの汚染により引き起こされるHIV−RNA負荷は、10個までの献物のプール中で検出することができた。試験したプールサイズではいずれも、個々の献物中、1×103コピー/mlの汚染レベルでウイルスゲノム配列を検出することは不可能であった。
HIV−RNAのコピーを検出することができなかったプールサイズでの検出感度を増大させるために、プールした血漿の10倍濃縮した試料をPCRに使用した。この目的のために、実施例3.1.で使用した、試料2、3および4の個々の血漿プールの各々の場合における試料体積の10倍体積を遠心分離により濃縮し、1/10の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、PCRに使用した。PCR評価の結果を表5.2.に要約する。
4.1. HCV−RNAに関する様々なサイズの血漿プールの試験
10、50、100、500および1,000のHCV 血清(−)の健康な個々のドナー由来の血漿試料を混合して、試料プールとした。各々の個々のプールサイズを、実施例1でのように測定された1.6×106コピー/ml(試料 1)という高い汚染を有する、一次HCV感染したドナーの献血漿に由来する1つの血漿試料と、実施例1でのように測定された2.2×104コピー/ml(試料 2)という最小汚染で一次感染したドナー由来の1つの血漿試料と、また対象として、1×103コピー/ml(試料 3)、および5×102コピー/ml(試料 4)であるHCVの規定された製剤と混合した。各々のプールサイズに関する、定量可能なコピー数/mlを、PCRによって測定した。PCR評価の結果を表6.1.に要約する。
表6.1.は、1.6×106コピー/mlという高い汚染を有する、一次感染した献物でのウイルス汚染を、10、50、100、500、および1,000個の献物からなる血漿プール中で検出することができることを示す。100、500および1,000の個々のドナー由来のプールでは、たった1つの、最小限度に汚染された献物(2.2×104コピー/ml)により引き起こされるHCV−RNAはもはや、検出することができなかった。HCVゲノム当量の検出は、10および50までのドナー由来のプール中、たった1つの献物における2.2×104コピー/mlの汚染で可能である。たった1つの献物における約1×103または5×102コピー/mlという、より少ない数のHCVコピーでのウイルスゲノム当量汚染は、試験したプールサイズではいずれも検出することができなかった。
HCV−RNAのコピーを検出することができなかったプールサイズでの感度を増大させるために、プールした血漿の10倍濃縮した試料をPCRに使用した。この目的のために、実施例4.1.で使用した、試料2、3および4の個々の血漿プールの各々の場合における試料体積の10倍体積を遠心分離により濃縮し、1/10の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、PCRに使用した。PCR評価の結果を表6.2.に要約する。
PCRの初期試料体積を10倍濃縮することにより、1つの一次HCV感染した献物を含む10、50および500の個々のドナー由来のプールの最小負荷を検出することが可能であった(2.2×104コピー/ml)。同様に、10の個々のドナー由来の血漿プール中、たった1つの献物における1×103または5×102コピー/mlという、各々のウイルス汚染の検出の感度を増大させることが可能であった。
5.1. HBV−DNAに関する様々なサイズの血漿プールの試験
10、50、100、500、1,000および2,000のHBV 血清(−)の健康な個々のドナーの血漿試料を混合して、試料プールとした。そのプールを、実施例1でのように測定された1.3×108コピー/ml(試料 1)という高い汚染を有する、一次HBV感染したドナー由来の血漿試料と、実施例1でのように測定された1.4×104コピー/ml(試料 2)という最小汚染で一次感染したドナー由来の血漿と、また対象として、5×103コピー/ml(試料 3)、および1×103コピー/ml(試料 4)であるHBVの規定された製剤と混合した。各々のプールサイズに関する、定量可能なコピー数/mlを、PCRによって測定した。PCR評価の結果を表7.1.に要約する。
表7.1.は、高いゲノム汚染を有する、一次HBV感染した献物でのウイルス汚染を、10、50、100、500、1,000および2,000個の献物からなる血漿試料プール中で検出することができることを示す。500、1,000および2,000の個々のドナー由来のプールでは、たった1つの、最小限度に汚染された献物(1.4×104コピー/ml)により引き起こされるHBV−DNAはもはや、検出することができなかった。HBVゲノム当量の検出は、10および50までのドナー由来のプール中、たった1つの献物における5×103コピー/mlの汚染で、また10までのドナー由来のプール中、たった1つの献物における1×103コピー/mlの汚染で可能であった。
HBV−DNAのコピーを検出することができなかったプールサイズでの感度を増大させるために、プールした血漿の10倍濃縮した試料をPCRに使用した。この目的のために、実施例5.1.で使用した、試料2、3および4の個々の血漿プールの各々の場合における試料体積の10倍体積を遠心分離により濃縮し、1/10の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、PCRに使用した。PCR評価の結果を表7.2.に要約する。
PCRの初期試料体積を10倍濃縮することにより、1.4×104コピー/mlという、1つの一次HBV感染した献物を含む500の個々のドナー由来のプールの最小負荷を検出することが可能であった。同様に、100および500の個々のドナー由来の血漿プール中、たった1つの献物に由来する5×103コピー/mlのウイルス汚染を、また50および100の個々のドナー由来の血漿プール中、たった1つの献物に由来する1×103コピー/mlの汚染を検出する感度を増大させることが可能であった。
次に大きいプールサイズでのウイルスゲノムの検出を改良するために、100倍の初期体積の、実施例5.1.で使用した試料3および4を、さらなる実験において濃縮し、1/100の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、PCRに使用した(表7.3.)。
血漿試料を100倍濃縮することにより、たった1つの献物中の1×103コピー/mlのウイルスHIVゲノム汚染をさらに、500および1,000の個々のドナー由来の血漿プール中で検出することができた。
HIVおよびHCV RNAに関する様々なサイズの血漿プールの試験
10、50、100、500、1,000および2,000のHIV 血清(−)およびHCV 血清(−)の健康な個々のドナー由来の血漿試料を混合して、血漿試料プールとした。各々の個々のプールサイズを、実施例2.1.および2.2.でのように測定された2.3×107コピー/mlという高いHIV負荷、および1.6×106コピー/ml(試料 1)というHCV負荷、並びに実施例2.1.および2.2.でのように測定された2.8×105コピー/mlという最小HIV負荷、および2.2×104コピー/ml(試料 2)というHCV負荷を有する、一次HIV感染したドナー由来の血漿試料、および一次HCV感染したドナー由来の血漿試料、また対照として、1×104コピー/mlであるHIV、および1×103コピー/ml(試料 3)であるHCVの規定された製剤、並びに1×103コピー/mlであるHIV、および2×102コピー/ml(試料 4)であるHCVの製剤と混合した。HIVおよびHCVに特異的な核酸の存在に関して、各々のプールサイズを、HIVおよびHCVに特異的なプライマーを用いてのLIF−PCRによって試験した。1,000の個々のドナー由来のプールサイズまでの、たった1つの献物による2.3×107 HIVコピー/mlおよび1.6×106 HCVコピー/mlという最大汚染を伴う汚染で、HIVに特異的なゲノム配列およびHCVに特異的なゲノム配列を検出することが可能であった。HIVゲノム当量はさらに、僅かに汚染された献物で汚染された500個の献物のプール中で見出されたが、HCVゲノム当量は、50の個々のドナー由来のプール中でしか見出すことはできなかった。従って、試験したプール中でのHCVゲノム配列の検出に対する感度は、HIVゲノム配列に対する感度より対数減衰的に(log step)低い。
HAV免疫化ドナー由来の献血漿の中和能力は、インビトロにおける中和試験により示すことができる。
血漿中に存在するA型肝炎ウイルスに対するHAV抗体の中和効果を検出するために、防御免疫を有する100の予め免疫化されたHAVドナー由来の血漿プールを試験して、そのプールをHAV(タイター 106.4TCID50/ml)と混合した。37℃で1時間インキュベーションした後、HAVタイターを測定した。血漿プール中に存在するHAV抗体により、HAV感染力を対数減衰的に>4.6まで減少させることができた。このことは、免疫されたドナー由来の血漿中に存在する防御抗体が、より大きな血漿プール中でのウイルス汚染を中和することができることを示す。
Claims (1)
- 再生できるある血液ウイルスによる汚染に関し品質保証された血漿プール(品質保証血漿プール)を製造する方法であって、以下のことを特徴とする方法:
(a)再生できるある血液ウイルスによる個別の献血漿の汚染の不存在を、対応するウイルス血症を示すマーカーの不存在により、または出発材料中における過剰のウイルス中和抗体により、または献血漿の時の血漿ドナーの保護免疫により測定し;
(b)ウイルスのゲノム当量の測定を以下のように行う;
−n個の個々の献物 (donation) から試料をとり、
−その個々の献物試料をm個の試料プールに集め、
−それぞれ核酸検出または測定方法によりこれらの試料プール中に存在するウイルスゲノムまたはゲノム配列の量を、1つまたは数個の内部標準を添加することによる内部標準を用いて検出し、その標準は、多分存在するウイルスゲノムまたはウイルスゲノム配列を1つの同じ試験管中で同時にそれぞれ測定または検出し、
それによって試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出された量が規定された限界値以下であるこれらの個々の献物(ng)を品質保証血漿プールに混合し、
試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出された量が該規定された限界値より大きい、または等しいこれらの個々の献物(na)をさらなる処理に付すか、または除去する(nおよびmは正の整数である)。
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