AT403477B

AT403477B - Biologisches material frei von viralen und molekularen pathogenen und verfahren zur herstellung

Info

Publication number: AT403477B
Application number: AT0078096A
Authority: AT
Inventors: Noel Barrett; Johann Dr Eibl; Friedrich Dorner; Gerhard Dr Poelsler; Thomas Dr Haemmerle
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1996-04-30
Filing date: 1996-04-30
Publication date: 1998-02-25
Also published as: CA2253300A1; JP2000510107A; ATA78096A; NO984979L; EP0900089A1; IL126810A0; NO984979D0; AU731048B2; WO1997040861A1; AU2561297A

Description

AT 403 477 B

Die Erfindung betrifft ein biologisches Material, das frei von bestimmten Pathogenen, insbesondere von viralen Pathogenen ist, sowie ein Verfahren zur Abreicherung von viralen und molekularen Pathogenen aus einem biologischen Material.

Die Herstellung von therapeutischen Proteinen und Präparationen durch Extraktion aus humanen oder tierischen Geweben oder Flüssigkeiten, wie Blut oder Plasma, sowie aus kontinuierlich wachsenden transformierten Säugerzellen ist häufig mit dem Risiko der potentiellen Kontamination durch Pathogene, wie Viren, virus-ähnliche Partikel oder Prionen behaftet. Es müssen daher Maßnahmen getroffen werden, daß möglicherweise vorhandene Pathogene nicht auf den Menschen übertragen werden.

Menschliches Blut bzw. Plasma z.B. kann Viren enthalten, die Krankheiten wie AIDS, Hepatitis B oder Hepatitis C verursachen. Bei Plasmaproteinen aus Plasmapools ist das Risiko, infektiöse Agenzien wie Viren zu übertragen, aufgrund der Selektion von Blut- oder Plasmaspenden und des Herstellungsverfahrens sehr gering. Geeignete Maßnahmen, wie der Ausschluß von Blutspendern, die ein erhöhtes Risiko aufweisen, von der Blutspende sowie Analysen von Blut- oder Plasmaspenden, die es ermöglichen, infektiöse Spenden zu erfassen und von der weiteren Verteilung auszuscheiden, erlauben zwar, die meisten infektiösen Spenden zu eliminieren, können aber zumeist nicht alle erfassen. Existierende Testsysteme zum Nachweis von infektiösen Viren in biologischen Materialien lassen Bedenken der potentiellen Übertragung der Pathogene nicht immer ausschließen, da es bei dem breiten Spektrum von infektiösen Pathogenen unmöglich ist, das Ausgangsmaterial auf alle Viren oder molekularen Pathogene, die in einer Probe vorhanden sein können, zu testen. Zudem erfassen die meisten Tests nicht das Virus, sondern gegen das Virus entwickelte Antikörper, so daß im Zeitraum des sogenannten "diagnostischen Fensters" kein Nachweis einer Kontamination erfolgen kann. Für einige Virusgruppen gibt es außerdem keine zuverläßige oder genügend sensitive Nachweismethode. Obwohl neuentwickelte Testverfahren, insbesondere Nukleinsäureamplifikationsverfahren, wie z.B. die PCR, sehr sensitiv und spezifisch sind, können sie nur auf Pathogene angewendet werden, deren Nukleinsäuresequenz bekannt ist. In Fällen, in denen zwar die Humanpathogene bekannt sind, jedoch keine sensitiven Verfahren zum Nachweis vorhanden sind, bleibt die Unsicherheit, daß ein negatives Resultat nur aufgrund eines zu geringen Virusgehalts, der unterhalb der Sensltivitätsgrenze des Testssytems liegt, erhalten wird.

Es wurden daher für die Herstellung von pharmazeutischen und therapeutischen Produkten spezifische Entfernungs- und/oder Inaktivierungsverfahren zur Abreicherung von Viren entwickelt, so daß im Endprodukt keine infektiösen Partikel mehr zu erwarten sind.

Verschiedene Inaktivierungsverfahren basieren auf einer physikalisch-chemischen Behandlung durch Hitze und/oder Chemikalien. Als Verfahren kommen insbesondere die thermische Behandlung, das Pasteurisieren, Behandeln der Proteinlösung mit ß-Propiolacton und UV-Licht, Behandeln mit einer Kombination eines Lösungsmittels und eines Detergens (sog. S/D-Verfahren) oder Belichten der Proteinlösung nach Zusatz einer photodynamischen Substanz zum Einsatz. Mit diesen Verfahren wurde eine Virusinaktivierung bis zu 106 log-Stufen erreicht. Die Effizienz des Inaktivierungsverfahrens kann jedoch, abhängig vom Virustyp variieren. Obwohl S/D-behandelte Blutprodukte als sicher in bezug auf die Übertragung von HCV, HBV oder HIV gelten, werden nicht-umhüllte Viren, wie HAV oder Parvovirus, durch dieses Verfahren nicht inaktiviert (Prowse C. 1994. Vox Sang. 67:191-196).

Die Art des Inaktivierungsverfahrens kann auch einen Einfluß auf die Produkte haben, und eine Stabilisierung zur Minimierung des Proteinverlustes ist daher oftmals notwendig. Zudem müssen einigen Inaktivierungsverfahren Reinigungsschritte folgen, um zugesetzte Chemikalien zu entfernen.

Verfahren zur Virusabreicherung umfassen insbesondere chromatographische Verfahren, Filtration von Proteinlösungen über einen Membranfilter oder Adsorption von Viren an eine feste Phase und anschließendes Entfernen der festen Phase, wie in der EP-0 679 405 beschrieben. Es wurde jedoch festgestellt, daß die Behandlung mit einer festen Phase, wie z.B. mit Aerosil®, zwar eine Entfernung von HIV bis zu 4 log-Stufen aus einer Immunglobulin-haltigen Lösung erlaubt, der Verlust von IgG jedoch bis zu 42% betragen kann (Gao et al. 1993. Vox Sang 64:204-209). Für den großtechnischen Ansatz ist bei diesen hohen Verlustraten ein solches Verfahren daher eher ungeeignet.

Bei der Ultrafiltration erfolgt die Virusabreicherung durch einen auf dem Größenunterschied von Viruspartikeln basierenden Effekt. Von Bechtel et al. (1988. Biomat., Art. Cells, Art. Org. 16:123-128) wurde gezeigt, daß für Viren verschiedener Größe (EMC: 30-50 nm, Sindbis Virus: 50-70 nm und VSV 80-100 nm) in allen Fällen eine Virusabreicherung von 3.3-3.5 log-Stufen erreicht wird und die Abreicherung durch Ultrafiltration damit unabhängig von der Virusgröße und nicht genügend selektiv ist. Konventionelle Membranfilter haben aufgrund der Ausschlußgröße von ungefähr 0,1 um- 0,2 um den Nachteil, daß die meisten Viren den Filter frei passieren können. Die Entwicklung von Nanofiltern mit verschiedener nominaler Ausschlußgrößen von 15-75 nm oder 70-160 kD haben zur Möglichkeit geführt, Viren bis zu einer Größen von 28 nm zurückzuhalten (DiLeo et al. (1991). Nature 351:420-421, DiLeo et al. (1992). 2

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Bio/Technology 10:182-188, Bumouf-Radosevich et al. (1994). Vox Sang 67:132-138, Hamamoto et al. (1989). Vox Sang 56:230-236).

Die Verwendung von Nanofiltern zur Virusabreicherung erlaubt es, eine schonende Methode anzuwenden, bei der keine Veränderungen der Endprodukte auftreten und auch Viren kleiner Größen aus einem 5 biologischen Material entfernt werden können. Hoffer et al. (1995. J. Chromatography B, 669:187-196) beschreiben ein Verfahren zur Virusabreicherung basierend auf Tangentialfluß-Filtration zur Herstellung eines Faktor IX-Konzentrates mit Viresolve® Membranen der Ausschlußgröße von 70 kD und fanden einen Reduktionsfaktor von 3,5 log-Stufen für umhüllte Viren und von 7,2 log-Stufen für nicht-umhüllte Viren. Sie stellen jedoch fest, daß hochmolekulare Produkte von diesen Filtern zurückgehalten werden. Blutfaktoren io mit geringem Molekulargewicht, wie etwa Faktor IX oder Faktor XI können Nanofilter mit einer Ausschlußgröße zwischen 15 und 35 nm frei passieren (Bumouf-Radosevich et al. (1994). Vox Sang 67:132-138, Feldman et al. (1995). Acta Haematol. 94:25-34). Produkte mit größerem Molekulargewicht, wie etwa Faktor VIII (350 kD) vWF (bis zu 2,000 kD) oder Immunglobuline (IgG 150 kD) können nur Filter mit größerer Ausschlußgröße passieren. Dabei besteht jedoch die Gefahr, daß Viren mit kleinem Durchmesser nicht vom 75 Filter zurückgehalten werden und ins Filtrat gelangen. Die Anwendung der Nanofiltration zur Herstellung virussicherer, therapeutisch anwendbarer Produkte, die insbesondere frei von kleinen Viren, wie HAV oder Parvovirus, sind, ist daher auf Produkte enthaltend Proteine mit geringer Molekülgröße, die auch einen Nanofilter mit kleiner Ausschlußgröße frei passieren können, beschränkt. Nur die Verwendung von Nanofiltern kleiner Ausschlußgröße von 15 nm sichert daher die Abreicherung und Entfernung von HAV und 20 Parvovirus B19 aus biologischen Produkten. Es besteht jedoch der Nachteil, daß die Nanofiltration mit Filtern dieser Ausschlußgröße nicht für die Herstellung von Produkten, enthaltend Proteine mit hohem Molekulargewicht, anwendbar ist, da diese den Filter nicht passieren können und wie die Viren zurückgehalten werden.

Daß für verschiedene Viren beschriebene Durchmesser nicht immer absolut sind, stellt ein mögliches 25 weiteres Problem bei der Nanofiltration dar. Die für HCV allgemein angegebene Größe beträgt 40-50nm (Murphy et al. (1995). Archives of Virology 10:424). Muchmore et al. ((1993). International. Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease. Tokyo) stellten jedoch fest, daß eine HCV-haltige Lösung, filtriert über einen 35 nm Nanofilter, zu einer HCV-lnfektion bei Schimpansen führt. Die mögliche Variabilität der Größe verschiedener Viren beschränkt daher den Einsatz der Nanofiltration zur Virusabreicherung und zur 30 Herstellung eines virussicheren Produktes bzw. birgt einen Unsicherheitsfaktor in sich.

Es besteht daher ein Bedarf nach industriell anwendbaren Methoden zur sicheren Abtrennung von Viren aus Proteinlösungen, um die Infektionsrisiken für Patienten zu vermindern, die mit pharmazeutischen oder therapeutischen Präparationen tierischen, humanen Ursprungs oder hergestellt über ein gentechnisches Verfahren aus Zellkulturen, behandelt werden. 35 Ebenso besteht Bedarf an virussicheren, pathogenfreien biologischen Produkten, bei denen durch das Herstellungsverfahren schon sichergestellt wird, daß kein Pathogen übertragen wird und das Verfahren schonend genug ist, damit die biologische Aktivität der Produkte weitgehend unbeeinträchtigt bleibt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein biologisches Material, das gegebenenfalls hochmolekulare pharmazeutisch relevante Proteine enthält, und frei von bestimmten viralen und molekula-40 ren Pathogenen ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines solchen biologischen Materials, zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein biologisches Material frei von bestimmten Pathogenen zur Verfügung gestellt wird, das dadurch erhältlich ist, daß ein biologisches Material mit mindestens einem Liganden oder Rezeptor, der mit einem Rezeptor oder Liganden eines bestimmten 45 Pathogens reagiert, versetzt wird, wodurch ein Ligand/Rezeptor-Komplex des kompiexierten Pathogens entsteht. Der Ligand/Rezeptor-Komplex wird anschließend durch ein Verfahren, das die teilweise oder vollständige Abtrennung des kompiexierten Pathogens erlaubt, aus dem biologischen Material entfernt.

Der dem biologischen Material zugesetzte Ligand oder Rezeptor ist dabei eine an den Liganden oder Rezeptor und damit an eine spezifische Bindungsstelle des Pathogens bindungsfähige Komponente, die in so der Lage ist, mit dem Pathogen einen Komplex, vorzugsweise einen hochmolekularen Komplex, zu bilden. Der Ligand oder Rezeptor des Pathogens kann dabei ein Antigen, ein Epitop oder eine antigene Determinante sein. Der reaktive, bindungsfähige Ligand oder Rezeptor, der dem biologischen Material zugesetzt wird, ist gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ein Antikörper oder ein Fragment eines Antikörpers. 55 Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße biologische Material dadurch erhältlich, daß als Ligand oder Rezeptor, der mit einem Ligand oder Rezeptor des Pathogens reagiert, ein Antikörper eingesetzt wird, und der Ligand oder Rezeptor des Pathogens ein Antigen ist, wodurch ein Antikörper/Antigen-Komplex als Ligand/Rezeptor-Komplex entsteht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Komplex anschließend aus 3

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Gemäß einem besonderen Aspekt der Erfindung ist das von bestimmten Pathogenen freie biologische Material dadurch erhältlich, daß der Liganden/Rezeptor-Komplex, vorzugsweise der Antikörper/Antigen-Komplex.vom biologischen Material durch Penetrieren der Lösung durch einen durchläßigen Filter abge-5 trennt wird. Die Abtrennung des Komplexes von der Lösung kann auch durch Sedimentation, vorzugsweise durch Dichte-Gradientenzentrifugation erfolgen.

Dem biologischen Material, das unter Verdacht steht, gegebenenfalls ein infektiöses Pathogen zu enthalten, werden dabei gemäß der vorliegenden Erfindung Antikörper gegen mindestens ein infektiöses Agens zugesetzt. Es können jedoch auch Antikörper gegen mehrere bekannte infektiöse Viren, wie z.B. 70 HAV, HBV, HCV, HDV, HEV, HGV, HIV, CMV oder Parvovirus, oder gegen molekulare Pathogene, wie z.B. Prionen, zugesetzt werden. Die Zugabe der Antikörper erfolgt gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise derart, daß eine Immunglobulin-haltige Lösung zu einer Proteinhaltigen Lösung im Überschuß zugesetzt wird, und damit in einer neutralisierenden Konzentration, so daß das Risiko, daß noch potentielle Pathogene in freier Form im biologischen Material vorliegen, ausgeschlossen werden kann. Es wurde 75 jedoch im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß auch die Zugabe von nicht-neutralisierenden Konzentrationen von Antiserum eine komplette Abreicherung von Pathogenen aus einem biologischen Material erlaubt.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird zur Verbesserung der Abtrennung des Li-gand/Rezeptor-Komplexes die Aggregation des Komplexes erhöht, indem neben Immunglobulin-haltigen 20 Lösungen weitere Aggregationsmittel zum biologischen Material zugesetzt werden, die entweder freie Pathogene weiter agglutinieren oder die Komplexierung des Liganden/Rezeptor-Komplexes erhöhen. Dies kann durch die Zugabe von Agglutininen, wie Lektine, Komplement-Komponenten oder andere aus dem Stand der Technik bekannte Agglutinationsmittel erfolgen.

Das erfindungsgemäße biologische Material ist besonders dadurch gekennzeichnet, daß es frei von 25 bestimmten viralen Pathogenen, sowohl aus der Gruppe der Lipid-umhüllten als auch der nichtumhüllten Viren ist. Dazu zählen insbesondere Viren wie HAV, HBV, HCV, HGV, HIV, HEV, HDV, CMV oder Parvovirus. Da der als Ligand oder Rezeptor vorzugsweise eingesetzte spezifische Antikörper die entsprechenden Antigene an der Oberfläche des jeweiligen Virus erkennt und an ihn bindet, kann jedes Virus, für das Antikörper zu Verfügung stehen oder gegen das spezifische Antikörper hergestellt bzw. aus einer 30 Immunglobulin-Lösung isoliert werden können, komplexiert werden und der Komplex gemäß der Erfindung aus dem biologischen Material entfernt werden. Dadurch ist es möglich, bekannte, aber auch noch nicht identifizierte Viren, gegen die Immunglobulin-haltige Lösungen zur Verfügung stehen, zu komplexeren, gegebenenfalls komplett zu neutralisieren, und den Antikörper/Antigen-Komplex aus dem biologischen Material abzutrennen. 35 Besondere Aufmerksamkeit wurde in den letzten Jahren auch der Übertragung von potentiell infektiösen molekularen Pathogenen, wie etwa Prionen, geschenkt. Derzeit stehen nur wenige, effektive Verfahren zur Reduktion von Verursachern der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit oder der BSE zur Verfügung. Pocchiari et al. (1991. Horm. Res. 35:161-166) schlugen eine Kombination von Ultrafiltration und 6 M Harnstoff zur Abreicherung von sog. "slow viruses" vor. Sie machen jedoch keine Angaben, inwieweit die biologische 40 Aktivität eines so behandelten Proteins in Mitleidenschaft gezogen wird. Durch die Behandlung mit hohen Konzentrationen des Protein-denaturierenden Harnstoffes ist jedoch davon auszugehen, daß Proteine in einer so behandelten Lösung zumindestens teilweise denaturiert und damit inaktiviert werden.

Gemäß einem weiteren Aspekt ist das erfindungsgemäße biologische Material daher auch frei von molekularen Pathogenen, insbesondere von Prionen, wie den Erregern der BSE oder der Creuzfeldt-Jakob-45 Krankheit. Gegen diese Pathogene können gezielt Antikörper hergestellt werden oder Immunglobulin-haltige Lösungen bereitgestellt werden, die insbesondere anti-ß-Amyloid-Antikörper enthalten. Durch Zusatz von anti-ß-Amyloid-haltigen Immunglobulinlösungen zu einem biologischen Material können daher auch potentielle molekulare Erreger in einem Komplex gebunden und der Komplex aus dem biologischen Material entfernt werden. so Da die Abtrennung des Liganden/Rezeptor-Komplexes und damit des komplexierten Pathogens unabhängig von den physiko-chemischen Eigenschaften eines Virus ist, wird ein virussicheres, pathogenfreies biologisches Material bereitgestellt, dessen physikochemische Eigenschaften durch das Abreicherungsverfahren nicht beeinflußt werden. Bekanntermaßen hat bei konventionellen Inaktivierungsverfahren die Zugabe von Chemikalien oder die thermische Behandlung, falls nicht geeignete Maßnahmen wie etwa die Zugabe 55 von Stabilisatoren vorgenommen werden, einen Einfluß auf die Produkte selbst. Eine Abreicherung der Pathogene durch Komplexierung mit einem Liganden oder Rezeptor und Abtrennung des Komplexes aus einem biologischen Material ohne physikalischchemische Behandlung bietet daher den großen Vorteil, daß die Pathogene effizient eliminiert werden, das Produkt jedoch in seiner nativen Form unbeeinträchtigt bleibt. 4

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Ein so erhaltenes biologisches Material enthält daher Proteine, die in ihren Eigenschaften denen der nativen Proteine im Ausgangsmaterial vor dem Abreicherungsschritt entsprechen und unveränderte Aktivität aufweisen. Auch wird vermieden, daS, wie etwa bei einigen Virusinaktivierungsverfahren, gegebenenfalls denaturierte Proteine entstehen, die in zusätzliche Reinigungsschritten aus der Proteinlösung wieder aufwendig abgetrennt werden müssen.

Nach der Abreicherung der Pathogene aus dem biologischen Material kann das erhaltene pathogenfreie Material natürlich weiteren Reinigungsschritten unterzogen werden, um eventuell nicht im Endprodukt erwünschte Begleitproteine zu entfernen. Dazu können alle im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie Chromatographie, insbesondere lonenaustauschchromatographie oder Affinitätschromatographie, oder Gelfiltration durchgeführt werden.

Die Abtrennung von Begleitproteinen aus dem erfindungsgemäßen biologischen Material, wie etwa die Abtrennung von Blutfaktoren aus einer für die Herstellung einer Immunglobulin-haltigen Präparation vorgesehenen Fraktion, kann auch vor der Virusabreicherung erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Abreicherung der Pathogene aus dem biologischen Material jedoch vor der chromatographischen Abtrennung von Begleitproteinen, da durch das chromatographische Verfahren neben dem Reinigungseffekt auch eine zusätzliche Abreicherung des komplexierten Pathogens sowie eventuell noch vorhandener Liganden oder Rezeptoren, die ursprünglich dem biologisohen Material zugesetzt wurden, erreicht werden kann.

Das erfindungsgemäß erhaltene biologische Material ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß es frei ist von bestimmten viralen und molekularen Pathogenen, wobei die Pathogene vorzugsweise zu 100% aus dem biologischen Material entfernt sind.

Da eine Antikörper-haltige Hyperimmunglobulinlösung dem biologischen Material vorzugsweise im Überschuß zugesetzt wird, um alle freien, infektiösen Pathogene zu komplexieren, enthält das erfindungsgemäße biologische Material gegebenenfalls auch nichtkomplexierte, in freier Form vorliegende Antikörper. Nach der Abtrennung des Antikörper/Antigenkomplexes aus dem biologischen Material, entweder durch Filtration oder Sedimentation, enthält das pathogenfreie biologische Material daher gegebenenfalls auch anti-HAV-, anti-HCV-, anti-HBV oder anti-Parvovirus spezifische Antikörper.

Da durch einen Überschuß an Liganden oder Rezeptoren, der dem biologischen Material zugesetzt wird und der an das Pathogen bindet und es so komplexiert keine freien Viren im biologischen Material vorliegen und die Abtrennung des komplexierten Pathogens entweder durch Filtration oder Sedimentation erfolgt, gelangen weder in freier Form vorliegende Pathogene noch mit dem Liganden/Rezeptor komplexierte Pathogene ins Filtrat. Das so erhaltene Filtrat, enthaltend biologisch aktive Proteine, ist daher gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur frei von nichtkomplexiert und frei vorliegenden Pathogenen, sondern auch frei von in einem Komplex mit einem Liganden, wie etwa einem Antikörper, vorliegenden Pathogenen.

Ein gemäß der vorliegenden Erfindung erhältliches pathogenfreies biologisches Material kann eine Plasmafraktion, eine Immunglobulin-haltige Plasmafraktion, eine Plasmaproteinhaltige Fraktion enthaltend Blutfaktoren wie etwa Faktor II, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI, Protein C, Protein S, vWF ein Konzentrat, enthaltend einen der genannten Blutfaktoren, ein Überstand einer Hybridoma-Zellinie, ein Zellkulturüberstand von transformierten oder infizierten Säugerzellen oder ein Extrakt eines tierischen oder humanen Gewebes sein.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Abreicherung von viralen und molekularen Pathogenen aus einem biologischen Material zur Verfügung gestellt. Dabei wird ein biologisches Material (mit Verdacht auf Anwesenheit eines bestimmten Pathogens) mit mindestens einem Rezeptor oder Liganden, der mit einem Rezeptor oder Liganden eines Pathogens reagiert, versetzt, wodurch gegebenenfalls ein Ligand/Rezeptor-Komplex eines komplexierten Pathogens entsteht. Der gegebenenfalls gebildete Ligand/Rezeptor-Komplex wird anschließend durch ein Verfahren, das die teilweise oder vollständige Abtrennung des komplexierten Pathogens erlaubt, aus dem biologischen Material entfernt. Durch die Komplexierung eines freien Pathogens mit einem Liganden in einem Komplex wird ein komple-xiertes Pathogenpartikel erhalten, das eine höhere Dichte oder einen höheren Sedimentationskoeffizienten aufweist als das freie Pathogen.

Auch weist der Komplex eine höhere Aggregierung auf als das freie Pathogen, wodurch aufgrund der erhöhten Aggregierung der Durchmesser des komplexierten Pathogens vergrößert wird und seine Durchlä-ßigkeit durch bestimmte Membranfilter verändert wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Abreicherung von Pathogenen aus einem biologischen Material erfolgt daher durch Komplexierung des Pathogens mit einem Liganden/Rezeptor zur Erhöhung seiner Dichte oder Sedimentationseigenschaften sowie der Vergrößerung des Durchmessers durch Erhöhung der Aggregation. Das komplexierte Pathogen kann anschließend aufgrund derart veränderter Eigenschaften aus dem biologischen Material abgetrennt werden. 5

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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens erfolgt das Ab trennen des Ligan-den/Rezeptor-Pathogen-Komplexes durch Penetrieren eines durchlässigen Filters, wobei der Komplex selektiv vom Filter zurückgehalten wird. Die Ausschlußgröße des Filters ist gemäß der vorliegenden Erfindung dabei so gewählt, daß auch hochmolekulare Proteine, wie etwa Faktor VIII, vWF oder Immunglobuline, den Filter frei passieren können und auch bei Verwendung einer hochkonzentrierten Proteinlösung keine Verstopfung der Filterporen zu erwarten ist. Die Filterausschlußgröße darf natürlich nicht die höchstmögliche Aggregationsgröße des Uganden/Rezeptor-Komplexes und insbesondere des Antikör-per/Antigen(Pathogen)-Komplexes übersteigen, da ansonsten auch hochmolekulare, dichte Patho-gen/Antikörper-Komplexe den Filter passieren und so ins Filtrat gelangen.

Zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens sind daher Nanofilter besonders bevorzugt. Besonders bevorzugt sind dabei Nanofilter mit einer nominellen Ausschlußgröße zwischen 35-100 nm. Diese Ausschlußgröße erlaubt es, daß hochmolekulare Proteine den Filter frei passieren können; jedoch halten sie auch freie, nicht-komplexierte Pathogene mit einem Durchmesser >100nm sowie Komplexe von Pathogenen dieser Größe zurück. Zudem wird bei der Verwendung von Filtern mittlerer Ausschlußgröße vermieden, daß die Filter durch höhermolekulare Proteine oder andere Bestandteile, die im biologischen Material vorhanden sein können, verstopft werden können und ihre Durchflußkapazität sinkt. Auch ist beim Einsatz der Tangentialfluß-Filtration gegebenenfalls ein geringerer Druck notwendig, um die Flüssigkeit über den Filter zu schicken, wodurch auch die Gefahr sinkt, daß durch den angelegten Druck der Filter in Mitleidenschaft gezogen wird und Risse erhält.

Es ist natürlich auch möglich, Filter mit einer Ausschlußgröße >100nm zur Durchführung des Verfahrens einzusetzen, wobei jedoch vorher sichergestellt werden muß, daß der komplexierende Ligand im Überschuß vorliegt, so daß sehr große Antikörper/Antigen-Aggregate gebildet werden können, und daß gegebenenfalls zusätzliche Agglutinationsmittel eingesetzt werden, damit der Ligand/Rezeptor-Komplex ausreichend groß ist, daß er den Filter nicht frei passieren kann. Die Bedingungen können dabei natürlich auch so gewählt werden, daß Antigen/Antikörper-Aggregate einer Größe entstehen, die sogar durch einen konventionellen Sterilfilter zurückgehalten werden. Grundsätzlich gilt, je kleiner die Ausschlußgröße eines Filters um so kostspieliger ist seine Herstellung. Die Verwendung von Nanofilter mit einer Ausschlußgröße £35 nm zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bietet daher neben der für das Endprodukt effizienten und schonenden Abreicherung von Pathogenen den Vorteil, daß die Kosten für die verwendeten Filter geringer sind als bei Nanofilter kleiner Ausschlußgröße. Dies macht das Verfahren insbesondere für den großtechnischen Ansatz interessant.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform erfolgt das Abtrennen des Ligand/Rezeptor-Komplexes durch Sedimentation. Bevorzugt ist dabei die Sedimentation durch Dichte-Gradientenzentrifugation.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ist der zum biologischen Material zugesetzte Ligand oder Rezeptor eine an den Liganden oder Rezeptor und damit an eine spezifische Bindungsstelle des Pathogens bindungsfähige Komponente, die in der Lage ist, mit dem Pathogen einem Komplex, vorzugsweise einen hochmolekularen Komplex, zu bilden. Der Ligand oder Rezeptor des Pathogens kann dabei ein Antigen, ein Epitop oder eine antigene Determinante sein. Der reaktive, bindungsfähige Ligand oder Rezeptor, der dem biologischen Material zugesetzt wird und mit dem Liganden oder Rezeptor des Pathogens reagiert, ist vorzugsweise ein Agglutin, ein Antikörper oder ein Fragment eines Antikörpers. Es kommen jedoch als Liganden oder Rezeptoren alle bekannten Komponenten in Betracht, die in der Lage sind, an einen Rezeptor oder Liganden eines Pathogens zu binden und mit dem Pathogen einen hochmolekularen Komplex zu bilden.

Durch die Zugabe eines an einen in einem biologischen Material möglicherweise vorkommenden Pathogen bindungsfähigen Rezeptors oder Liganden wird ein hochmolekularer Komplex aus Pathogen und Ligand/Rezeptor mit einer höheren Aggregätion erhalten.

Gemäß einem Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahren wird einem biologischen Material, vorzugsweise einer Protein-haltigen Lösung, eine Immunglobulin-haltige Lösung, enthaltend spezifische Antikörper, gerichtet gegen infektiöse Humanpathogene, zugesetzt, wodurch zwischen den möglicherweise im biologischen Material vorhandenen Pathogenen und den Antikörpern ein Antikörper/Antigen-Komplex entsteht.

Gemäß einem weiteren Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Aggregation des Ligan-den/Rezeptor-Pathogen-Komplexes noch weiter erhöht, wodurch Komplexe mit einer höheren Dichte und einem größeren Durchmesser entstehen. Dies erfolgt erfindungsgemäß durch die Zugabe von Agglutininen, insbesondere von Lektinen, wie etwa Concanavalin A, Ricin oder Phasin, oder von Komplement-Komponenten. Das Aggregationsmittel kann entweder gleichzeitig mit dem Liganden oder Rezeptor, der mit dem Pathogen reagiert, zum biologischen Material oder nach einer vorgegebenen Zeitspanne nach dessen Zugabe zugesetzt werden. Bevorzugt ist jedoch, daß das Agglutinationsmittel nach einer zeitlichen Verzögerung nach Zugabe der Immunglobulin-Lösung erfolgt. Dadurch wird gewährleistet, daß die Agglutinine nicht 6

AT 403 477 B mit den Antikörpern reagieren und diese aggregieren oder komplexieren, sondern erst schon gebildete Pathogen/Antikörper-Komplexe zu höhermolekularen Komplexen aggregieren. Dadurch wird gewährleistet, daß durch die weitere Aggregation eine höhere Komplexdichte erreicht wird, wodurch der Komplex mit verbesserter Effizienz aus dem biologischen Material entfernt werden kann. Durch die höhere Komplexierung der Antigen/Antikörper-Aggregate ist es möglich, bei der Abtrennung der Membranfilter, auch Filter mit einer größeren Ausschlußgröße von vorzugsweise £35 nm einzusetzen. Auch ist durch die höhere Dichte der aggregierten Partikel eine verbesserte Abtrennung durch Sedimentation möglich, da dadurch alle komplexierten Pathogene erfaßt werden können.

Durch die Zugabe von Immunglobulin-haltigen Lösungen oder Liganden oder Rezeptoren, die spezifisch mit den Pathogenen reagieren, ist es ebenfalls möglich, sowohl virale als auch molekulare Pathogene, unabhängig von ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften, aus einem biologischen Material abzureichern. Dies gilt insbesondere für Viren oder molekulare Pathogene, die mit konventionellen Verfahren bisher nicht abreicherbar oder inaktivierbar waren. So werden von dem erfindungsgemäßen Verfahren auch kleine nicht-Lipid-umhüllte Viren, wie Parvovirus oder HAV, erfaßt, die bisher weder durch physikalisch-chemische Inaktivierungsverfahren, wie die S/D-Behandlung, noch durch die Nanofiltration effizient aus hochkonzentrierten Proteinlösungen oder aus Lösungen, enthaltend hochmolekulare Proteine (>150 kD), entfernt oder inaktiviert werden konnten. Das Verfahren ist daher für die Abreicherung aller viralen und molekularen Pathogene, mit denen ein biologisches Material kontaminiert sein kann, anwendbar, insbesondere für die Abreicherung Lipid-umhüllter oder nicht-Lipid-umhüllter Viren, wie HAV, HBV, HCV, HIV, HEV, HDV, HGV, CMV oder Parvovirus aber auch für Prionen.

Gemäß einem besonderen Aspekt der Erfindung wird bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als Ligand ein Antikörper, erhalten aus einer Hyperimmunglobulin-Lösung oder einem Überstand einer Hybridoma-Zellinie, eingesetzt. Die Immunglobulin-haltige Lösung kann dabei von Plasmaspenden erhalten werden, die einen hohen Titer an Antikörper, gerichtet gegen ein bestimmtes Pathogen, enthalten. Dies sind insbesondere Immunglobulin-Lösungen von Spendern enthaltend anti-HCV-, anti-HAV-, antiHBV-, anti-HIV-,anti-HEV-, anti-HDV, anti-HGV-, anti-CMV- oder anti-Parvovirus-Antikörper. Die Antikörper-haltige Lösung kann auch durch biotechnologische Verfahren, wie die Hybridoma-Technik hergestellt werden. Dabei werden monoklonale Antikörper, gerichtet gegen ein Antigen eines bestimmten Pathogens von einer Hybridoma-Zellinie, in den Überstand des Kulturmediums sekretiert, aus dem dann die Antikörper in einer hochtitrigen Lösung isoliert werden können.

Aus Plasmaspenden gewonnene Immunglobulin-haltige-Lösungen können gegebenenfalls auch freie Viren, gegen die die in der Lösung enthaltenen Antikörper gerichtet sind, sowie andere Pathogene erhalten. Dies gilt im gleichen Maß auch für über Hybridoma-Technik hergestellte monoklonale Antikörper, bei denen eine mögliche Kontamination mit viralen Pathogenen nicht auszuschließen ist. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die zur Durchführung des Verfahrens eingesetzte Hyperimmunglobulinlösung gegebenenfalls einem Virusinaktivierungs- und/oder Virusabreicherungsverfahren unterzogen.

Falls der Antikörper in der Immunglobulin-haltigen Lösung mit einem niedrigen Titer vorliegt, kann der Antikörper gegebenenfalls angereichert und anschließend in einer hochkonzentrierten Lösung als Ligand oder Rezeptor eingesetzt werden.

Gemäß einem besonderen Aspekt wird zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als Antikörper ein anti-/9-Amyloid-Antikörper eingesetzt. Anti-/S-Amyloid-Antikörper erkennen vorzugsweise Strukturen an der Oberfläche von Prionen, können an diese binden und einen Prionen/Antikörper-Komplex bilden. Gemäß der vorliegenden Erfindung können gegen Prionen, insbesondere gegen den Erreger der Creuzfeldt-Jakob-Krankheit, gezielt Antikörper hergestelit oder anti-^-Amyloid-haltige Immunglobulin-Lösungen bereitgestellt werden und einem biologischen Material, das gegebenenfalls Prionen enthält, zugesetzt werden. Durch die Anlagerung von anti-ß-Amyloid-Antikörpern an die Prionen werden die niedermolekularen Prionen zu einem hochmolekularen Komplex aggregiert, der anschließend selektiv aus dem biologischen Material durch Filtration oder Sedimentation abgetrennt werden kann.

Gemäß einem weiteren besonderen Aspekt der Erfindung werden als Liganden oder Rezeptoren Antikörper, gerichtet gegen HAV, HBV, HCV, HIV, HGV, HEV oder Parvovirus, eingesetzt. Zur Durchführung des Verfahrens kann eine Immunglobulin-haltige Lösung, enthaltend gegen ein bestimmtes Virus gerichtete Antikörper, zum biologischen Material gegeben werden. Es kann jedoch auch eine Mischung von Antikörpern zugesetzt werden, die gegen verschiedene Pathogene, mit denen das biologische Material möglicherweise kontaminiert sein kann, gerichtet sind. Nach der Zugabe mindestens einer gegen ein bestimmtes Pathogen gerichteten Immunglobulinhaltigen Lösung oder einer Mischung aus gegen verschiedene Pathogene gerichteten Antikörper-haltigen Lösungen wird die Mischung aus biologischem Material und Immunglobulin-Lösung über einen Zeitraum, der es erlaubt, einen Komplex zwischen dem Antigen des Pathogens 7

AT 403 477 B und dem Antikörper zu bilden, inkubiert und der gebildete Komplex anschließend aus dem biologischen Material, wie oben beschrieben, abgetrennt.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Abreicherung von viralen und/oder molekularen Pathogenen in einem biologischen Material eingesetzt werden. Das biologische Material kann eine Piasmafraktion, eine Immunglobulin-haltige Plasmafraktion, eine Plasmaprotein-haltige Fraktion enthaltend Blutfaktoren wie etwa Faktor II, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI, Protein C, Protein S, vWF, ein Konzentrat, enthaltend einen der genannten Blutfaktoren, ein Überstand einer Hybridoma-Zelllinie, ein Zellkulturüber-stand von transformierten oder infizierten Säugerzellen oder ein Extrakt eines tierischen oder humanen Gewebes sein. Die Parameter zur Durchführung des Verfahrens werden dabei jeweils abgestimmt auf die Art und Beschaffenheit des biologischen Materials und der möglicherweise vorhandenen kontaminierenden Pathogene. So wird die Bildung des Liganden/Rezeptor-Komplexes zur Aggregierung des Pathogens unter Bedingungen durchgeführt, die eine optimale Komplexierung, insbesondere der Bindung zwischen Antikörper und Antigen des Pathogens, erlauben. Die optimalen Parameter, wie etwa pH, Temperatur, Zeitdauer der Inkubation zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, in Abhängigkeit von der Art des Pathogens, der Spezifität des zugesetzten Liganden oder Rezeptors (Antikörper) und der Beschaffenheit des biologischen Materials (Reinheit der Lösung, Proteinkonzentration in der Lösung), können von jedem Fachmann aufgrund seines allgemeinen Wissens ermittelt werden. Falls der Ligand/Rezeptor-Komplex aus dem biologischen Material durch einen Filtrationsschritt entfernt wird, wird ein Nanofilter mit einer Ausschlußgröße verwendet, der es ermöglicht, daß das biologische Material den durchläßigen Filter frei passiert und der Ligand/Rezeptor-Komplex vom Filter selektiv zurückgehalten wird.

Um sicher zu gehen, daß alle freien Pathogene im biologischen Material durch Antikörper komplexiert wurden, wird sowohl das Filtrat als auch das Konzentrat auf die Anwesenheit von Viren oder einem Überschuß an spezifischen Antikörpern getestet. Die Abreicherungsrate der Pathogene aus dem biologischen Material kann dabei über Methoden der Virustiterbestimmung oder über die Ermittlung der Genkopienzahl bestimmter Viren, z.B. durch quantitative PCR, wie von Dorner et al. (1994. 25. Hämophilie-Symposion. ed. Scharrer & Schramm S. 29-44) beschrieben, im Filtrat und Konzentrat erfolgen.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene biologische Material auf die Anwesenheit (eines Überschusses) des eingesetzten Liganden/Rezeptors, insbesondere eines spezifischen Antikörpers, getestet. Da bei Zugabe eines Überschusses eines gegen ein bestimmtes Pathogen gerichteten Antikörpers, nicht-gebundene und nicht-komplexierte Antikörper eine Dichte und molekulare Größe aufweisen, die unterhalb der des komplexierten Antikörpers liegt, ist das Vorhandensein von freien Antikörpern im biologischen Material ebenfalls ein Kriterium für die zur Komplexierung des freies Pathogens ausreichende Konzentration an Antikörpern in der Lösung. Die Anwesenheit eines Überschusses an eingesetzem Liganden oder Rezeptor wird dabei derart bestimmt, daß einer Probe des biologischen Materials vor und nach der Pathogenabreicherung eine bekannte Menge eines viralen oder molekularen Pathogens, der spezifische Liganden oder Rezeptoren für den Antikörper besitzt, zugesetzt wird, das so gewonnene biologische Material enthaltend den Antikör-per/Pathogen-Komplex erneut über einen durchlässigen Filter gefiltert wird und die Restmenge an Pathogen im Filtrat bestimmt wird. Dadurch kann ermittelt werden, ob die für die Abreicherung eingesetzte Immunglobulin-Lösung einen für die Komplexierung der Pathogene ausreichenden Antikörpergehalt aufweist, und ob nicht-komplexierte Antikörper im Filtrat und damit im Endprodukt vorliegen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Abreicherung von viralen und molekularen Pathogenen aus einem biologischen Material kann mit jedem bekannten Virusinaktivierungsverfahren, wie z.B. der Behandlung mit Hitze, Pasteurisieren oder dem S/D-Verfahren kombiniert werden. Vorzugsweise werden die Inaktivierungsverfahren vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angewendet, da so durch das Inaktivierungsverfahren nicht erfaßte Viren durch das erfindungsgemäße Verfahren abgereichert werden können.

Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine virusinaktivierte Immunglobulin-Lösung, enthaltend spezifische Antikörper gegen virale oder molekulare Pathogene zur Verwendung als Ligand zur Komplexierung von viralen oder molekularen Pathogenen, zur Verfügung.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Abreicherung von viralen und/oder molekularen Pathogenen kann insbesondere zur Herstellung eines biologischen Materials, das frei ist von bestimmten sowohl in freier, nicht-komplexierter als auch in gebundener, komplexierter und aggregierter Form vorliegenden Pathogenen, verwendet werden.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert, wobei sie jedoch nicht auf die Beispiele eingeschränkt ist. 8

AT 403 477 B

Beispiel 1:

Abreicherung von HAV durch HAV-spezifische Antikörper und anschließende Nanofiltration 5 98 ml einer 2%igen humanen Serumalbumin-Lösung, die frei von Antikörpern war, und eine 2%ige humane Immunglobulin-Lösung, die Hepatitis A Virus (HAV)-spezifische Antikörper enthielt, wurden mit hochtitrigem HAV beaufschlagt. Aus Aliquoten beider Lösungen wurde der Virustiter bestimmt. Die Lösungen wurden anschließend einer 4-stündigen Tangentialfluß-Filtration mit einem Eingangsdruck von 0,8 bar unterworfen. Es wurde ein 0,001 m2/35 nm- Filter (Planova 35N, Asahi) verwendet. Die HAV-Titration io erfolgte wie bei Barrett et al. (38. Jahrestagung der Gesellschaft für Thrombose- und Haemostaseforschung, München, Februar 1994, Abstract book, Seite 8).

Der Virustiter wurde nach erfolgter serieller £ log-Verdünnung in Zellkulturmedium bestimmt. Jeweils hundert ul jeder seriellen Verdünnung wurden in 8 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gegeben, die 1 x 104 FRhK-4-Zellen pro Vertiefung enthielten. Die Platten wurden anschließend 14 Tage bei 37 *C inkubiert. 75 Nach sieben Tagen erfolgte ein Medienwechsel. Nach dieser Inkubationszeit wurde der zelischädigende Effekt (cytopathic effect, cpe) mikroskopisch bestimmt. Die TCIDso wurde auf der Basis der Anzahl der Vertiefungen der Mikrotiterplatte, die einen positiven CPE zeigten, ermittelt. Die Effizienz des Prozesses der Virusabreicherung wurde als Reduktionsfaktor (R.F.) ausgedrückt, der nach der vom E.C. Committe for Proprietary Medicine (Commission of the European Communities (1991): Ad hoc Working Party on 20 Biotechnology / Pharmacology - Note for Guidance (Validation of Virus Removal and Inactivation Procedu-res) 111/8115/89-EN; Biologicals 19 (1991), 247-251) empfohlenen Formel berechnet wurde:

Probenvolumen vor Behandlung x Virustiter vor Behandlung 25 ioR*F·«--

Probenvolumen nach Behandlung x Virustiter nach Behandlung 30 Wie aufgrund der Virusgröße (Durchmesser 25-30 nm) zu erwarten war, wurde HAV in Abwesenheit eines HAV-spezifischen Antikörpers durch Filtration über die 35 nm Membran nicht zurückgehalten. Aus dem Ansatz, der Immunglobulin mit HAV-spezifischen Antikörpern enthielt, konnte hingegen eine vollständige Virusentfernung durch die Filtration durch die 35 nm Membran erreicht werden (R.F. > 5,2), wobei kein Virus im Filtrat nachgewiesen werden konnte und das Virus zu 100% im Konzentrat zurückgehalten wurde 35 (Tabelle 1).

Tabelle 1

Einfluß spezifischer Antikörper auf die Abreicherung von Hepatitis A Virus durch 35nm Nanofiltration Humanes Serum-Albumin Immunoglobulin Virus-Stock-Titer 107·9 107·9 Virus-Titer im Produkt 106·3 105'3 Virus-Titer im Konzentrat 105·7 105·9 Virus-Titer im Filtrat 105·7 A o © Reduktionsfaktor 0,6 >5,2

Beispiel 2:

Abreicherung von Parvoviren durch anti-Parvovirus-spezifische Antikörper und anschließende 55 Nanofiltration

Es wurde untersucht, ob ein Kaninchen-Antiserum gegen den Parvovirus "minute mouse virus" (MMV, ATCC VR1346) durch Bildung eines Komplexes mit dem Virus in der Lage ist, den Virus bei der Filtration 9

AT 403 477 B über eine 35 nm-Membran zurückzuhalten.

Das Kaninchenantiserum wurde durch Immunisierung der Tiere mit konzentrierten, Formalin-inaktivier-ten MMV-Präparationen und komplettem Freund'schen Adjuvans und einem anschließenden Booster mit inkomplettem Freund'schen Adjuvans, der 4 Wochen nach der Primärimmunisierung durchgeführt wurde, erhalten. Die Blutgewinnung zur Serumherstellung erfolgte 4 Wochen nach der Sekundärimmunisierung. 98 ml einer 2%igen humanen Immunglobulin-Lösung wurden mit 2 ml einer MMV-Suspension beaufschlagt. Nach Zugabe von 0, 0,005, 0,05, 0,5, 5,0 ml des anti-MMV Serums wurde jede Mischung einer Filtration, unter Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben, unterzogen.

Proben von Virus-beaufschlagtem Ausgangsmaterial, Konzentrat (verdünnt zum Originalvolumen) und Filtrat wurden nach dem Standard TCIDso-Test wie in Beispiel 1 beschrieben titriert, mit dem Unterschied, daß A9-Zellen (ATCC CRL6319) für die Virusvermehrung verwendet wurden und eine Inkubationszeit von 7 Tagen gewählt wurde.

Wie aufgrund der Virusgröße (Durchmesser 18-24 nm) zu erwarten war, wurde MMV ohne Zugabe des Antiserums durch die 35 nm Filtermembran nicht zurückgehalten, sondern wurde zu 100% im Filtrat wiedergefunden (R.F.: -0,1). Nach Zugabe von 5 ml MMV spezifischem Antiserum konnte die Virus-Infektiösität vollständig neutralisiert werden, so daß das Virus weder im Filtrat noch im Konzentrat nachgewiesen werden konnte. Aber auch bei Zugabe von nicht-neutralisierenden Konzentrationen des Antiserums (0,5 ml) wurde eine vollständige Entfernung des Virus durch die Filtration erreicht (R.F. >6,9), wobei kein Virus im Filtrat nachweisbar war. Noch niedrigere Konzentrationen des MMV-spezifischen Antiserums (0,05 ml) führten ebenfalls zu einer weitgehenden Entfernung des MMV durch die Filtration (R.F.: 4,4) (Tabelle 2).

Tabelle 2

Einfluß spezifischer Antikörper auf die Abreicherung von Parvovirus durch 35nm Nanofiltration igG 98 ml 98 ml 98 ml 98 ml 98 ml MMV 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml Anti-MMV-Serum aus Kaninchen 0 ml 0,005 ml 0,05 ml 0,5 ml 5 ml Virus-Stock-Titer 1082 107® 107® 1081 107® Virus-Titer im Produkt 1060 10® 9 10® 3 107° 10®'® Virus-Titer im Konzentrat 10®·4 10® 8 104® 1Q3 8 <1001 Virus-Titer im Filtrat 10®1 104® 10°·9 <10°’ <10°’ Reduktionsfaktor -0,1 1,3 4,4 >6,9 >5,4

Beispiel 3:

Abreicherung von HCV durch anti-HCV-Antikörper und anschließende Nanofiltration

Die Möglichkeit, die Viruspassage des Hepatitis C-Virus (HCV) durch eine 35 nm-Filtermembran durch Zugabe eines HCV-spezifischen Antikörpers zur Virussuspension zu verhindern, wurde untersucht. Ein anti-HCV-Antikörper-freies Plasma, das mit HCV hochkontaminiert war, diente als Ausgangsmaterial für den hochtitrigen Virus-Stock. Etwa 250 ml Plasma wurden in einer Beckmann-Zentrifuge (Rotor JA10) 20 min bei 10 000 rpm geklärt. Der Überstand wurde einer 2,5 stündigen Ultrazentrifugation bei 55 000 rpm in einem Ti 70-Rotor unterzogen. Nachdem das Pellet in PBS resuspendiert und gepoolt wurde (ca. 10 ml), wurde die HCV-Genom-Kopienzahl in einer quantitativen PCR-Analyse, wie von Dorner et al. (1994) beschrieben, bestimmt. 95 ml einer 2%igen humanen Immunglobulin-Lösung wurden mit 2,5 ml des konzentrierten Virus-Stocks beaufschlagt. 5 ml einer I0%igen humanen Immunglobulinlösung, die Antikörper gegen HCV aber keine HCV-Genom-Äquivalente enthielt (was durch quantitative PCR sichergestellt wurde) oder 5 ml PBS als Kontrolle wurden zugegeben. Beide Ansätze wurden einer Tangentialfluß-Filtration, unter Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben, unterzogen. In Proben des HCV-beaufschlagten Ausgangsmaterials, des Filtrates und des Konzentrates, das auf das ursprüngliche Volumen verdünnt wurde, wurden die HCV- 10

Claims

AT 403 477 B Genkopienzahlen, wie oben beschrieben, ermittelt. Es konnte gezeigt werden, daß nach Zugabe von anti-HCV-spezifischem Immunglobulin durch Filtration über eine 35 nm-Membran eine vollkommene Virusentfernung aus dem Filtrat erreicht wurde (R.F.: >3,0), während im Kontrollansatz keine wesentliche Abreicherung des HCV erzielt werden konnte (R.F.: 1,4) (Tabelle 3). Tabelle 3 Einfluß eines spezifischen Antikörpers auf die Abreicherung des Hepatitis C Virus durch 35nm Nanofiltration igG 95 ml 95 ml HCV 2.5 ml 2.5 ml Anti-HCV IgG 0 5 ml Virus-Stock-Titer (Genom-Kopien/ml) 107 107 Virus-Titer im Produkt (Genom-Kopien/ml) IO57 1057 Virus-Titer im Konzentrat (Genom-Kopien/ml) 1Q5 3 1057 Virus-Titer im Filtrat (Genom-Kopien/ml) 1043 <1027 Reduktionsfaktor 1.4 >3.0 Patentansprüche 1. Biologisches Material frei von bestimmten Pathogenen, dadurch erhältlich, daß ein biologisches Material mit mindestens einem Liganden oder Rezeptor, der mit einem Rezeptor oder Liganden des bestimmten Pathogens reagiert, versetzt wird, wodurch ein Ligand/Rezeptor-Komplex entsteht, und Abtrennen des Ligand/Rezeptor-Komplexesdurch ein Verfahren, das die teilweise oder vollständige Abtrennung des komplexierten Pathogens vom biologischen Material erlaubt.
2. Biologisches Material nach Anspruch 1, dadurch erhältlich, daß als Ligand oder Rezeptor, der mit einem Liganden oder Rezeptor des Pathogens reagiert, ein Antikörper eingesetzt wird, und der Ligand oder Rezeptor des Pathogens ein Antigen ist, wodurch ein Antikörper/Antigen-Komplex als Ligand/Rezeptor-Komplex entsteht.
3. Biologisches Material nach Anspruch 1 oder 2, dadurch erhältlich, daß das Abtrennen des Li-gand/Rezeptor-Komplexes durch Penetrieren durchlässiger Filter erfolgt.
4. Biologisches Material nach Anspruch 1 oder 2, dadurch erhältlich, daß das Abtrennen des Li-gand/Rezeptor-Komplexes durch Sedimentation erfolgt.
5. Biologisches Material nach Anspruch 4, dadurch erhältlich, daß die Sedimentation des Ligand/Rezeptor-Komplexes durch Dichte-Gradientenzentrifugation erfolgt.
6. Biologisches Material nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch erhältlich, daß zur Verbesserung der Abtrennung des Ligand/Rezeptor-Komplexes eine weitere Aggregation des Komplexes durch Agglutini-ne, insbesondere Lektine, oder Komplement-Komponenten erfolgt.
7. Biologisches Material nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es frei ist von viralen und molekularen Pathogenen sowie von Aggregaten oder Komplexen der Pathogene, vorzugsweise zu 100% frei.
8. Biologisches Material nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das virale Pathogen ein HAV, HBV, HCV, HIV, HEV, HDV, HGV, CMV und/oder Parvovirus ist. 11 AT 403 477 B
9. Biologisches Material nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es anti-HAV-, anti-HCV-, anti-HBV und/oder anti-Parvovirus spezifische Antikörper enthält.
10. Biologisches Material nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Plasmafraktion, eine Plasmaprotein-haltige Fraktion, enthaltend Blutfaktoren wie etwa Faktor II, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI, Protein C, Protein S, vWF, ein Konzentrat, enthaltend einen der genannten Blutfaktoren, eine Immunglobulin-haltige Plasmafraktion oder ein Überstand einer Hybridoma-Zellinie, ein Zellkulturüberstand von transformierten oder infizierten Säugerzellen oder ein Extrakt eines tierischen oder humanen Gewebes ist.
11. Verfahren zur Abreicherung von viralen und molekularen Pathogenen in einem biologischen Material, dadurch gekennzeichnet, daß ein biologisches Material mit mindestens einem Rezeptor oder Liganden, der mit einem Rezeptor oder Liganden eines Pathogens reagiert, versetzt wird, wodurch ein Ligand/Rezeptor-Komplex entsteht, und daß der Ligand/Rezeptor-Komplexgegegebenenfalls durch ein Verfahren, das die teilweise oder vollständige Abtrennung des komplexierten Pathogens vom biologischen Material erlaubt, abgetrennt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand/Rezeptor-Komplex eine höhere Dichte oder einen höheren Sedimentationskoeffizienten aufweist als das freie Pathogen.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand/Rezeptor-Komplex eine höhere Aggregierung aufweist als das freie Pathogen.
14. Verfahren nach Anspruch 11 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Abtrennen des Li-gand/Rezeptor-Komplexes durch Penetrieren eines durchlässigen Filters erfolgt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand/Rezeptor-Komplex selektiv vom durchlässigen Filter zurückgehalten wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß als durchlässiger Filter ein Nanofilter eingesetzt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Abtrennen des Li-gand/Rezeptor-Komplexes durch Sedimentation erfolgt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Sedimentation des Komplexes durch Dichte-Gradientenzentrifugation erfolgt.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand oder Rezeptor des Pathogens ein Antigen, ein Epitop oder eine antigene Determinante ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der mit dem Liganden oder Rezeptor des Pathogens reagierende Ligand oder Rezeptor ein Agglutin, ein Antikörper oder ein Fragment eines Antikörpers ist.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand/Rezeptor-Komplex ein Antikörper/Antigen-Komplex ist.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß durch Anwesenheit von Agglutininen, insbesondere von Lektinen, wie Concanavalin A, Ricin oder Phasin, oder von Komplement-Komponenten eine weitere Aggregierung des Komplexes erfolgt.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 22 , dadurch gekennzeichnet, daß durch die weitere Aggregation eine höhere Komplexdichte erreicht wird, wodurch der Komplex mit verbesserter Effizienz aus dem biologischen Material entfernt wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das virale oder molekulare Pathogen ausgewählt wird aus der Gruppe der Lipid-haltigen Viren, der nicht Lipidhaltigen 12 AT 403 477 B Viren oder der Prionen.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Pathogen ein HAV, HBV, HCV, HIV, HEV, HDV, HGV, CMV oder Parvovirus ist. s
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß als Ligand ein Antikörper, erhalten aus einer Hyperimmunglobulin-Lösung oder einem Überstand einer Hybridoma-Zellinie, eingesetzt wird. io
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper einem Virusinaktivierungs-und/oder Virusabreicherungsverfahren unterzogen wird und der Antikörper gegebenenfalls angereichert und als Ligand eingesetzt wird.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein J5 anti-ß-Amyloid-Antikörper ist.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit einem Prion reagiert und einen Komplex bildet.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein HAV-, HBV-, HCV-, HDV-, CMV-, HIV-, HGV-, HEV- oder Parvovirus-spezifischer Antikörper ist.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Material eine Plasmafraktion, eine Plasmaprotein-haltige Fraktion, enthaltend Blutfaktoren wie Faktor II, 25 Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI, Protein C, Protein S, vWF, ein Konzentrat, enthaltend einen der genannten Blutfaktoren, eine Immunglobulin-haltige Plasmafraktion oder ein Überstand einer Hybridoma-Zellinie, ein Zellkulturüberstand von transformierten oder infizierten Säugerzellen oder ein Extrakt eines tierischen oder humanen Gewebes ist.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 31, dadurch gekennzeichnet daß das biologische Material den durchlässigen Filter frei passiert und der Ligand/Rezeptor-Komplex zurückgehalten wird.
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Material auf die Anwesenheit eines Liganden, insbesondere eines Antikörpers, getestet wird. 35
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß dem biologischen Material eine bekannte Menge eines bestimmten viralen oder molekularen Pathogens, das spezifische Liganden oder Rezeptoren für den Antikörper besitzt, zugesetzt wird, das biologische Material, enthaltend den Antikör-per/Pathogen-Komplex, erneut über einen durchlässigen Filter gefiltert wird und die Restmenge an 40 Pathogen im Filtrat bestimmt wird.
35. Virusinaktivierte Immunglobulin-Lösung zur Verwendung als Ligand in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 34.
36. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 11 bis 34 zur Herstellung eines biologischen Materials frei von bestimmten Pathogenen, frei von Aggregaten oder Komplexen der Pathogene. so 13 55