WO1997040861A1 - Biologisches material frei von viralen und molekularen pathogenen und verfahren zur herstellung - Google Patents

Biologisches material frei von viralen und molekularen pathogenen und verfahren zur herstellung Download PDF

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WO1997040861A1
WO1997040861A1 PCT/AT1997/000075 AT9700075W WO9740861A1 WO 1997040861 A1 WO1997040861 A1 WO 1997040861A1 AT 9700075 W AT9700075 W AT 9700075W WO 9740861 A1 WO9740861 A1 WO 9740861A1
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ligand
biological material
pathogen
receptor
antibody
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PCT/AT1997/000075
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French (fr)
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Noel Barrett
Johann Eibl
Friedrich Dorner
Gerhard Pölsler
Thomas HÄMMERLE
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Immuno Aktiengesellschaft
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    • A61P31/12—Antivirals

Definitions

  • the invention relates to a biological material which is free of certain pathogens, in particular viral pathogens, and a method for depleting viral and molecular pathogens from a biological material.
  • Human blood or plasma can contain viruses that cause diseases such as AIDS, hepatitis B or hepatitis C. With plasma proteins from plasma pools, the risk of transmitting infectious agents such as viruses is very low due to the selection of blood or plasma donations and the manufacturing process. Appropriate measures, such as the exclusion of blood donors who have an increased risk from blood donation and analyzes of blood or plasma donations that make it possible to record infectious donations and to exclude them from further distribution, allow most infectious donations to be eliminated, but mostly cannot capture all of them.
  • test systems for the detection of infectious viruses in biological materials do not always exclude concerns about the potential transmission of the pathogens, since it is impossible with the broad spectrum of infectious pathogens to base the starting material on all viruses or molecular pathogens which may be present in a sample, to test.
  • most of the tests do not detect the virus, but rather antibodies developed against the virus, so that no contamination can be detected during the so-called "diagnostic window”.
  • diagnostic window For some virus groups there is also no reliable or sufficiently sensitive detection method.
  • newly developed test ver drive especially nucleic acid amplification, such as PCR, are very sensitive and specific, they can only be applied to pathogens whose nucleic acid sequence is known. In cases in which the human pathogens are known, but there are no sensitive methods for detection, the uncertainty remains that a negative result is only obtained due to an insufficient virus content, which is below the sensitivity limit of the test system.
  • inactivation methods are based on physico-chemical treatment using heat and / or chemicals.
  • the methods in particular include thermal treatment, pasteurization, treatment of the protein solution with ⁇ -propiolactone and UV light, treatment with a combination of a solvent and a detergent (so-called S / D method) or exposure of the protein solution after the addition of a photodynamic substance for use.
  • S / D method treatment with a combination of a solvent and a detergent
  • virus inactivation up to 10 6 log levels was achieved.
  • the efficiency of the inactivation process can vary depending on the type of virus.
  • S / D-treated blood products are considered safe for the transmission of HCV, HBV or HIV, non-enveloped viruses such as HAV or parvovirus are not inactivated by this procedure (Prowse C. 1994. Vox Sang. 67: 191 -196).
  • inactivation process can also have an impact on the products and stabilization to minimize protein loss is therefore often necessary.
  • some inactivation procedures must follow cleaning steps to remove added chemicals.
  • Virus depletion methods include, in particular, chromatographic methods, filtration of protein solutions through a membrane filter or adsorption of viruses onto a solid phase and then removing the solid phase as described in EP-0 679 405.
  • a solid phase such as Aerosil ®
  • IgG can be up to 42% ( Gao et al. 1993. Vox Sang 64: 204-209).
  • Such a method is therefore rather unsuitable for the large-scale approach at these high loss rates.
  • factor IX or factor XI can freely pass nanofilters with an exclusion size between 15 and 35 nm (Burnouf-Radosevich et al. (1994). Vox Sang 67: 132-138, Feldman et al. (1995). Acta Haematol. 94: 25-34).
  • Products with a larger molecular weight, such as factor VIII (350 kD) vWF (up to 2,000 kD) or immunoglobulins (IgG 150 kD) can only pass through filters with a larger exclusion size. However, there is a risk that viruses with a small diameter will not be retained by the filter and get into the filtrate.
  • nanofiltration for the production of virus-safe, therapeutically applicable products, which are in particular free of small viruses, such as HAV or parvovirus, is therefore restricted to products containing proteins with a small molecular size, which can also pass freely through a nanofilter with a small exclusion size . Therefore, only the use of nanofilters with a small cut-off size of 15 nm ensures the depletion and removal of HAV and parvovirus B19 from biological products. There is, however, the disadvantage that nanofiltration with filters of this exclusion size cannot be used for the production of products containing proteins with a high molecular weight, since these cannot pass through the filter and how the viruses are retained.
  • Another goal is to obtain a biological material that is safely virus-free and free of target viruses, whereby a reduction factor of> 10 7 is achieved - in analogy to bacteria-tight filters.
  • the object is achieved in that a biological material that is certainly free of certain pathogens is made available, which is obtained by at least one ligand or receptor contained in a biological material reacting with a receptor or ligands of a specific pathogen , is added, resulting in a ligand / receptor complex of the complexed pathogen.
  • the ligand / receptor complex is then removed from the biological material by a process which allows the partial or complete separation of the complexed pathogen.
  • the ligand or receptor that reacts with the receptor or ligand of the pathogen can already be contained in the starting material.
  • the biological material is preferably mixed with at least one ligand or receptor which reacts with the receptor or ligand of a specific pathogen. This is a targeted measure for optimal setting of the parameters, such as the amount of ligand or receptor, the selection of the ligand or receptor, or mixtures of different ligands or receptors, or optionally also the addition of further components which support the formation of the complex.
  • the point in time at which complexation is to take place can be specifically determined.
  • the ligand or receptor can only take place before the final step before the separation, in particular before the biological material is penetrated through a permeable filter.
  • the ligand or receptor is therefore preferably added to the biological material shortly before the filtration.
  • the ligand or receptor added to the biological material is a component which is capable of binding to the ligand or receptor and thus to a specific binding site of the pathogen and is capable of forming a complex, preferably a high-molecular complex, with the pathogen.
  • the ligand or receptor of the pathogen can be an antigen, an epitope or an antigenic determinant.
  • the reactive, bindable ligand or receptor which is added to the biological material according to the present invention is preferably a specific antibody, or a fragment of an antibody, which is still capable of binding to the ligand or receptor of the pathogen.
  • the biological material according to the invention is preferably obtained by using an antibody as the ligand or receptor which reacts with a ligand or receptor of the pathogen and the ligand or receptor of the pathogen being an antigen, as a result of which an antibody / antigen complex is used as the ligand / Receptor complex is formed. According to the present invention, the complex is then removed from the biological material.
  • the biological material free of certain pathogens is obtained by separating the ligand / receptor complex, preferably the antibody / antigen complex, from the biological material by penetrating the solution through a permeable filter.
  • the complex can also be separated from the solution by sedimentation tion, preferably by density-gradient centrifugation.
  • antibodies or parts of an antibody against at least one infectious agent which are still capable of binding are added to the biological material which is suspected of possibly containing an infectious pathogen.
  • antibodies to several known infectious viruses such as e.g. HAV, HBV, HCV, HDV, HEV, HGV, HIV, CMV or Parvovirus, or against molecular pathogens such as e.g. Prions.
  • the antibodies can be added in such a way that an immunoglobulin-containing solution is added to a protein-containing solution, whereby the immunoglobulins can also be added in excess (and thus in a neutralizing concentration), so that the risk of potential pathogens are present in free form in the biological material, can be excluded.
  • the addition of non-neutralizing concentrations of antiserum also allows a complete and complete depletion of pathogens from a biological material.
  • the ligand or receptor in particular an antibody, is therefore preferably added in a non-neutralizing concentration, the concentration being, however, sufficient to complex the existing pathogens so that they can be completely removed from the biological material by the separation step.
  • the aggregation of the complex is therefore increased in order to improve the separation of the ligand / receptor complex by adding, in addition to solutions containing immunoglobulin, further aggregating agents to the biological material are added which either further agglutinate free pathogens or increase the complexation of the ligand / receptor complex.
  • further aggregating agents to the biological material are added which either further agglutinate free pathogens or increase the complexation of the ligand / receptor complex.
  • agglutinins such as lectins, one or more complement components, conglutinin, rheumatoid factor, a non-toxic, water-soluble, synthetic polymer, in particular polyethylene glycol or albumin (at least 10%, preferably 20%) or others from the Agglutination agents known in the art are carried out.
  • the aggregating agent is added in such a way that preferably antigen / antibody complexes are formed up to a size visible in the light microscope.
  • the biological material according to the invention is particularly characterized in that it is certainly free from certain viral pathogens, both from the group of the lipid-enveloped and the non-enveloped viruses.
  • viruses include in particular viruses such as HAV, HBV, HCV, HGV, HIV, HEV, HDV, CMV or parvovirus.
  • the specific antibody preferably used as a ligand or receptor recognizes the corresponding antigens on the surface of the respective virus and binds to it, any virus for which antibodies are available or against the specific antibody can be prepared or contained in an immunoglobulin solution or can be isolated therefrom, complexed and the complex removed according to the invention from the biological material.
  • the biological material according to the invention is therefore also free from molecular pathogens, in particular from prions, such as the pathogens of BSE or Creuzfeldt-Jakob disease.
  • Antibodies against these pathogens can be produced in a targeted manner or solutions containing immunoglobulin can be made available, which in particular contain anti- ⁇ -amyloid antibodies.
  • anti-ß-amyloid-containing immunoglobulin solutions By adding anti-ß-amyloid-containing immunoglobulin solutions to a biological material, potential molecular pathogens can also be bound in a complex and the complex can be removed from the biological material.
  • a virus-safe, pathogen-free biological material is obtained, the physico-chemical properties of which are not influenced by the depletion process. It is known that in conventional inactivation processes, the addition of chemicals or the thermal treatment, if suitable measures, such as the addition of stabilizers, are not taken, have an effect on the products themselves.
  • the pathogens are depleted by complexation with a ligand or receptor and Separation of the complex from a biological material without physico-chemical treatment therefore has the great advantage that the pathogens are eliminated efficiently, but the product remains unaffected in its native form.
  • a biological material obtained in this way thus contains proteins whose properties correspond to those of the native proteins in the starting material before the depletion step and have unchanged activity. It is also avoided that, as in some virus inactivation processes, denatured proteins are possibly formed which have to be separated from the protein solution in a complicated manner in additional purification steps. After the pathogens have been depleted from the biological material, the pathogen-free material obtained can of course be subjected to further purification steps in order to remove any accompanying proteins which are not desired in the end product. For this purpose, all methods known in the prior art, such as chromatography, in particular ion exchange chromatography or affinity chromatography, or gel filtration can be carried out.
  • the separation of accompanying proteins from the biological material according to the invention can also be carried out before the virus is depleted.
  • the pathogens from the biological material are preferably depleted prior to the chromatographic separation of accompanying proteins, since the chromatographic method also achieves an additional depletion of the complexed pathogen and any ligands or receptors which may still be present and which were originally added to the biological material, in addition to the cleaning effect can be.
  • the biological material obtained according to the invention is particularly characterized in that it is certainly free from certain viral and molecular pathogens, the pathogens being substantially completely removed from the biological material.
  • complete means that the process in biological material depletes pathogens with a reduction factor of at least 7 log levels - in analogy to bacteria-proof filters.
  • the separation is preferably carried out with a capacity of> 7 log steps, preferably> 9 log steps, and particularly preferably> 10 log steps. According to the guidelines of the United States Pharmacopeia (1995, USP 23, NF 18: 1978-1980), the retention capacity of a filter is described by the log reduction value (RF).
  • the retention capacity of a 0.2 ⁇ m sterile filter that can retain 10 7 microorganisms is at least 7 log levels. This size is the complete separation of the viruses by the filter.
  • the biological material according to the invention optionally also contains non-complexed, free-form antibodies. After the antibody / antigen complex has been separated from the biological material, either by filtration or sedimentation, the pathogen-free biological material may also contain anti-HAV, anti-HCV, anti-HBV or anti-Parvovirus-specific antibodies.
  • a pathogen-free biological material obtainable according to the present invention can include a plasma fraction, an immunoglobulin-containing plasma fraction, a plasma protein-containing fraction containing blood factors such as factor II, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, protein C. , Protein S, vWF, a concentrate containing one of the blood factors mentioned, a supernatant of a hybridoma cell line, a cell culture supernatant of transformed or infected mammalian cells or an extract of an animal or human tissue.
  • blood factors such as factor II, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, protein C.
  • Protein S, vWF Protein S, vWF
  • a concentrate containing one of the blood factors mentioned a supernatant of a hybridoma cell line, a cell culture supernatant of transformed or infected mammalian cells or an extract of an animal or human tissue.
  • a method for the depletion of viral and molecular pathogens from a biological material and a method for obtaining biological material that is certainly free of viral and molecular pathogens are provided.
  • the Ver Driving is particularly characterized in that at least one receptor or ligand contained in a biological material (with the suspicion of the presence of a specific pathogen) reacts with a receptor or ligand of a pathogen, which may result in a ligand / receptor complex of a complexed pathogen.
  • a ligand or receptor which reacts with the receptor or ligand of the pathogen is preferably added to the biological material.
  • the ligand / receptor complex which may be formed is then removed from the biological material by a process which allows partial or complete separation of the complexed pathogen.
  • a complexed pathogen particle is obtained which is enlarged, has a higher density or a higher sedimentation coefficient than the free pathogen.
  • the complex also has a higher aggregation than the free pathogen, which due to the increased aggregation increases the diameter of the complexed pathogen and changes its permeability through certain membrane filters.
  • the method according to the invention for depleting pathogens and obtaining a pathogen-free biological material is therefore carried out by complexing the pathogen with a ligand / receptor to increase its density or sedimentation properties and to increase the diameter by increasing the aggregation.
  • the complexed pathogen can then be separated from the biological material on the basis of such changed properties.
  • the ligand / receptor-pathogen complex is separated off by penetrating a permeable filter, the complex being selectively retained by the filter.
  • the exclusion size of the filter is selected in accordance with the present invention such that even high molecular weight proteins, such as factor VIII, vWF or immunoglobulins, can freely pass the filter and, even when using a highly concentrated protein solution, no ver blockage of the filter pores is to be expected.
  • the filter exclusion size must of course not exceed the maximum possible aggregation size of the ligand / receptor complex and in particular the antibody / antigen (pathogen) complex, since otherwise high molecular weight, dense pathogen / antibody complexes also pass through the filter and thus get into the filtrate.
  • Nanofilters are therefore suitable for carrying out the present method.
  • Nanofilters with a nominal cut-off size of between 35-100 nm are particularly preferred. This cut-off size allows high-molecular proteins to pass freely through the filter; however, they also retain free, non-complexed pathogens with a diameter> 100nm and complexes of pathogens of this size.
  • the use of filters of medium size excludes the filters from being clogged by higher molecular weight proteins or other constituents that may be present in the biological material and their flow capacity being reduced.
  • a lower pressure may be necessary to send the liquid over the filter, which also reduces the risk that the filter will be affected and cracked by the applied pressure.
  • nanofilters with an exclusion size ⁇ 35 nm for carrying out the method according to the invention therefore offers, in addition to the efficient and gentle depletion of pathogens for the end product, the advantage that the costs for the filters used are lower than for nanofilters with a small exclusion size. This makes the process particularly interesting for large-scale production.
  • filters with an exclusion size> 100 nm for carrying out the method, but it must first be ensured that very large pathogen-ligand complexes or antibody / antigen aggregates are formed, or that additional agglutinating agents are used if necessary , so that the ligand / receptor complex is large enough that it cannot pass freely through the filter.
  • the conditions can of course also be chosen so that antigen / antibody aggregates are up to a visible size stand, which are even retained by a conventional sterile filter. Basically, the smaller the exclusion size of a filter, the more expensive it is to manufacture.
  • filters with a nominal exclusion size of 0.04 ⁇ m to 3 ⁇ m also allow a complete separation of pathogens complexed according to the present method from a biological material. It has thus been shown that, according to the present invention, ligand / receptor complexes are formed which reach a size in the visible range (for example in a light microscope).
  • the ligand / receptor complex is separated off by sedimentation. Sedimentation by density-gradient centrifugation is preferred.
  • the ligand or receptor added to the biological material is a component which is bindable to the ligand or receptor and thus to a specific binding site of the pathogen and which is capable of forming a complex, preferably a high molecular complex, with the pathogen.
  • the ligand or receptor of the pathogen can be an antigen, an epitope or an antigenic determinant.
  • the reactive, bindable ligand or receptor which is added to the biological material and which reacts with the ligand or receptor of the pathogen is preferably an antibody or a bindable fragment of an antibody.
  • the antibody can be an antibody of all subclasses, but the subclasses IgG and IgM are particularly preferred. However, all known components which are able to bind to a receptor or ligand of a pathogen and to form a high-molecular complex with the pathogen are suitable as ligands or receptors.
  • an immunoglobulin-containing solution containing specific antibodies directed against infectious human pathogens is added to a biological material, preferably a protein-containing solution, whereby an antibody / antigen between the pathogens possibly present in the biological material and the antibodies Complex arises.
  • the aggregation of the ligand / receptor-pathogen complex is increased still further, whereby complexes with a higher density and a larger diameter are formed.
  • this is done by adding further agglutinating agents, in particular lectins, such as concanavalin A, ricin or phasin, or one or more complement components, conglutinin, rheumatoid factor or a synthetic polymer, such as polyethylene glycol or albumin.
  • the aggregating agent can be added to the biological material either simultaneously with the ligand or receptor which reacts with the pathogen or after a predetermined period of time after its addition.
  • the agglutination agent occurs after a time delay after the addition of the immunoglobulin solution. This ensures that the agglutinins or conglutinins do not react with the antibodies and aggregate or complex them, but only aggregate pathogen / antibody complexes that have already formed to form higher molecular weight complexes. This also ensures that a higher complex density is achieved by the further aggregation, as a result of which the complex can be removed from the biological material with improved efficiency. Due to the higher complexation of the antigen / antibody aggregates, it is also possible to use filters with a larger exclusion size of preferably ⁇ 35 nm when separating the membrane filters. The higher density of the aggregated particles also enables improved separation by sedimentation, since all complexed pathogens can thereby be detected.
  • the method according to the invention also covers small, non-lipid-enveloped viruses, such as parvovirus or HAV, which have hitherto been efficiently isolated from highly concentrated protein solutions or from solutions neither by physico-chemical inactivation methods, such as S / D treatment, nor by nanofiltration containing high molecular weight proteins (> 150 kD) could be removed or inactivated.
  • small, non-lipid-enveloped viruses such as parvovirus or HAV, which have hitherto been efficiently isolated from highly concentrated protein solutions or from solutions neither by physico-chemical inactivation methods, such as S / D treatment, nor by nanofiltration containing high molecular weight proteins (> 150 kD) could be removed or inactivated.
  • the method is therefore applicable for the depletion of all viral and molecular pathogens with which a biological material can be contaminated, in particular for the depletion of lipid-enveloped or non-lipid-enveloped viruses, such as HAV, HBV, HCV, HIV, HEV, HDV, HGV, CMV or Parvovirus but also for prions.
  • the method according to the invention is particularly suitable for depleting pathogens in a biological material and obtaining biological material which contains high molecular weight proteins, such as immunoglobulins or vWF.
  • the present invention therefore also provides a pathogen-free, virus-safe plasma protein-containing composition in which the plasma proteins have at least 80% of the activity in the starting material, the composition being obtained by the process according to the invention.
  • an antibody obtained from a hyperimmunoglobulin solution or a supernatant from a hybridoma cell line is used as ligand when carrying out the method according to the invention.
  • the immunoglobulin-containing solution can be obtained from plasma donations that contain a high titer of antibodies directed against a specific pathogen. These are in particular immunoglobulin solutions from donors containing anti-HCV, anti-HAV, anti-HBV, anti-HIV, anti-HEV, anti-HDV, anti-HGV, anti-CMV or anti-parvovirus.
  • Antibody The antibody-containing solution can also be obtained by biotechnological processes, such as the Hybridoma-Tech nik be manufactured. Monoclonal antibodies directed against an antigen of a certain pathogen from a hybridoma cell line are secreted into the supernatant of the culture medium, from which the antibodies can then be isolated in a high-titer solution.
  • Immunoglobulin-containing solutions obtained from plasma donations can optionally also contain free viruses, against which the antibodies contained in the solution are directed, and other pathogens. This applies equally to monoclonal antibodies produced using hybridoma technology, in which possible contamination with viral pathogens cannot be excluded.
  • the hyperimmunoglobulin solution used to carry out the method is optionally subjected to a virus inactivation and / or virus depletion method.
  • the antibody can optionally be enriched and then used as a ligand or receptor in a highly concentrated solution.
  • an anti- ⁇ -amyloid antibody is used as the antibody to carry out the method according to the invention.
  • Anti-ß-amyloid antibodies preferentially recognize structures on the surface of prions, can bind to them and form a prion / antibody complex.
  • antibodies can be produced in a targeted manner against prions, in particular against the causative agent of Creuzfeldt-Jakob disease, or anti- ⁇ -amyloid-containing immunoglobulin solutions can be provided and added to a biological material which optionally contains prions. Due to the addition of anti-ß-amyloid antibodies to the prions, the low-molecular prions are aggregated to a high-molecular complex, which can then be selectively separated from the biological material by filtration or sedimentation.
  • antibodies, directed against HAV, HBV are used as ligands or receptors.
  • HCV, HIV, HGV, HEV or parvovirus used.
  • an immunoglobulin-containing solution containing antibodies directed against a specific virus can be added to the biological material.
  • a mixture of antibodies or other ligands directed against various pathogens with which the biological material may be contaminated can also be added.
  • the mixture of biological material and immunoglobulin solution becomes a complex between the antigen over a period of time that allows of the pathogen and the antibody, incubated and then the complex formed is separated from the biological material as described above.
  • the method according to the invention can be used for the depletion of viral and / or molecular pathogens in a biological material.
  • the biological material can be a plasma fraction, an immunoglobulin-containing plasma fraction, a plasma protein-containing fraction containing blood factors such as factor II, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, protein C, protein S, vWF, a concentrate containing one of the blood factors mentioned, a supernatant of a hybridoma cell line, a cell culture supernatant of transformed or infected mammalian cells or an extract of an animal or human tissue.
  • the parameters for carrying out the method are matched to the type and nature of the biological material and any contaminating pathogens that may be present.
  • the formation of the ligand / receptor complex for aggregating the pathogen is carried out under conditions which permit optimal complexation, in particular the binding between receptor and ligand or between antibody and antigen of the pathogen.
  • the optimal parameters such as pH, temperature, duration of the incubation for carrying out the method according to the invention, depending on the type of pathogen, the specificity of the ligand or receptor (antibody) added and the nature of the biological material (purity of the solution, protein concentration in the solution), can be determined by any specialist on the basis of his general knowledge.
  • a filter with an exclusion size is used which allows the biological material to pass freely through the permeable filter and the ligand / receptor complex is selectively retained by the filter .
  • both the filtrate and the concentrate are tested for the presence of viruses or an excess of specific antibodies.
  • the depletion rate of the pathogens from the biological material can be determined by methods of virus titer determination or by determining the gene copy number or genome equivalents of certain viruses, e.g. by quantitative PCR as described by Dorner et al. (1994. 25th Hemophilia Symposion. Ed. Scharrer & Schramm pp. 29-44), in the filtrate and concentrate.
  • the biological material obtained by the method according to the invention is tested for the presence (in excess) of the ligand / receptor used, in particular a specific antibody. Since, when an excess of an antibody directed against a specific pathogen is added, unbound and non-complexed antibodies have a density and molecular size which is below that of the complexed antibody, the presence of free antibodies in the biological material is also a criterion for the sufficient concentration of antibodies in the solution to complex the free pathogen.
  • the presence of an excess of ligand or receptor used is determined such that a sample of the biological material contains a known amount of a viral or molecular one before and after pathogen depletion
  • Pathogen which has specific ligands or receptors for the antibody, is added, the biological material thus obtained containing the antibody / pathogen complex is filtered again through a permeable filter and the remaining amount of pathogen in the filtrate is determined. This makes it possible to determine who whether the immunoglobulin solution used for depletion has an antibody content sufficient for complexing the pathogens, and whether uncomplexed antibodies are present in the filtrate and thus in the end product.
  • the method according to the invention for depleting viral and molecular pathogens and obtaining pathogen-free biological material can be carried out using any known virus inactivation method, e.g. treatment with heat, pasteurization or the S / D process.
  • the inactivation methods are preferably used before the method according to the invention is carried out, since viruses which have not been detected by the inactivation method can be depleted by the method according to the invention.
  • the invention provides a virus-inactivated immunoglobulin solution containing specific antibodies against viral or molecular pathogens for use as a ligand for complexing viral or molecular pathogens in the method according to the invention.
  • the method according to the invention for the depletion of viral and / or molecular pathogens can in particular be used to obtain and produce a biological material which is free from certain pathogens which are present both in free, non-complexed and in bound, complexed and aggregated form.
  • Example 1 (currently the best form of carrying out the invention in the view of the applicant)
  • HAV hepatitis A virus
  • the virus titer was determined after serial 1 ⁇ 2 log dilution in cell culture medium. Hundred ⁇ l of each serial dilution was added to 8 wells of a microtiter plate containing 1 x 10 4 FRhK-4 cells per well. The plates were then incubated at 37 ° C for 14 days. A change of media took place after seven days. After this incubation period, the cell-damaging effect (cytopathic effect, cpe) was determined microscopically. The TCID 50 was determined based on the number of wells in the microtiter plate that showed a positive CPE. The efficiency of the virus depletion process was expressed as a reduction factor (RF), according to that of the EC Committee for Proprietary Medicine
  • HAV virus size (diameter 25-30 nm)
  • HAV was not retained in the absence of a HAV-specific antibody by filtration through the 35 nm membrane.
  • RF> 5.2 immunoglobulin with HAV-specific antibodies
  • the rabbit antiserum was obtained by immunizing the animals with concentrated, formalin-inactivated MMV preparations and complete Freund's adjuvant and a subsequent one
  • Samples of virus-loaded starting material, concentrate (diluted to the original volume) and filtrate were titrated according to the standard TCID 50 test as described in Example 1, with the difference that A9 cells (ATCC CRL6319) were used for virus multiplication and an incubation time of 7 days was chosen.
  • MMV was not retained by the 35 nm filter membrane without adding the antiserum, but was found 100% in the filtrate (RF: -0.1).
  • RF -0.1
  • the virus infectiousness could be completely neutralized, so that the virus could not be detected either in the filtrate or in the concentrate.
  • RF concentration of the antiserum
  • complete removal of the virus was achieved by filtration (RF> 6.9), with no virus being detectable in the filtrate.
  • Even lower concentrations of the MMV-specific antiserum (0.05 ml) also led to extensive removal of the MMV by filtration (RF: 4.4) (Table 2).
  • HCV hepatitis C virus
  • a reduction factor of> 6 log levels is also possible with immunoglobulin solutions with a lower HAV antibody titer. With a solution that has an antibody titer about 10 times higher, no improvement in virus depletion can be achieved. It follows that, regardless of the specific antibody titer, at least within the range tested reproducible depletion of HAV is possible.
  • the filtrate obtained according to Example 4 was again subjected to HAV and the virus depletion capacity of the antibodies still present in the filtrate or the reduction factor was determined.
  • Table 5 summarizes the results of the HAV depletion in a re-loaded filtrate from a low- and high-titer immunoglobulin solution.
  • a virus depletion can be achieved with a total reduction factor of at least 11 log levels.
  • pParvo + 21 was obtained by duplicating bp 1468-1487 between nt 1453 and 1454. After amplification with the parvovirus-specific primers, the PCR products had a corresponding length of 177 bp (wt), 162 bp (-15) or 198 bp (+21). Each of the mixtures was subjected to filtration under conditions as described in Example 1. The titer was determined in samples of the virus-loaded starting material, the concentrate (diluted to the original volume) and the filtrate by means of a quantitative nucleic acid amplification method (PCR). The results of the titer determination are summarized in Table 6. An excellent depletion of about 6 log levels was achieved.
  • the filtrate obtained according to Example 6 was again exposed to parvovirus and the virus depletion capacity of the antibodies still present in the filtrate or the reduction factor was determined.
  • Table 7 shows the results of the parvovirus depletion in a again loaded filtrate of an immunoglobulin-containing solution with a 1: 400 antibody titer.
  • the method according to the invention achieves a reduction factor of at least 11 log steps, which corresponds to a complete removal of the pathogens from the biological material.
  • example 1 it could be shown that the addition of a non-neutralizing concentrate of antiserum and subsequent nanofiltration over a 35 nm membrane complete removal of pathogen is achieved.
  • filters with a higher cut-off size are suitable for depleting the antigen-antibody complex.
  • a number of depth filters with a nominal cut-off size between 0.04 ⁇ m and 3 ⁇ m were tested for their ability to parvovirus MMV
  • rheumatoid factor as agglutinin or conglutinin was added to the loaded immunoglobulin solution. 85 ml one
  • 5% of a high-titer poliovirus type 1-containing preparation was applied to 2% immunoglobulin solution.
  • 10 ml of a preparation containing human rheumatoid factor with a titer of 800 U / ml was added to the mixture.
  • 10 ml of buffer were added instead of the rheumatoid factor.
  • Both mixtures were filtered through a 35 N membrane, as described in Example 1, and the virus titer in the concentrate and filtrate was determined.
  • the virus titer was determined by a TCID 50 determination on VERO cells.
  • rheumatoid factor in combination with the specific anti-poliovirus antibody complexes the virus so that it can be effectively retained by nanofiltration through a 35 N filter. If no further agglutination agent (rheumatoid factor) is added, virus depletion is achieved with a reduction factor of 3.1 log steps, which can be increased to a reduction factor of> 7.6 by the presence of the rheumatoid factor. This is the first time that an effective and essentially complete separation of small, non-enveloped viruses from a protein solution is possible.
  • rheumatoid factor The ability of rheumatoid factor to influence the depletion of high-titer poliovirus using conventional depth filters was determined.
  • a filter type was used which had proven to be ineffective in the depletion of poliovirus - even in the presence of poliovirus-specific antibodies - to this was added 85 ml of a 2% Gammagio bulin solution with 5 ml of a high-titer poliovirus stock solution and 10 ml of a solution of rheumatoid factor with a titer of 800 units / ml added.
  • 10 ml buffer was added instead of rheumatoid factor.
  • the activity of two plasma factors was determined before and after virus depletion using the method according to the invention.
  • 100 ml of a solution containing factor VIII / vWF complex was filtered through a Cuomo ZA 90 depth filter at a flow rate of 50 ml / min.
  • Factor VIII activity and vWF antigen content were determined in samples of the starting material and the filtrate and a vWF multimer analysis was carried out.
  • the same material was exposed to the parvovirus "mouse minute virus" (MMV) and specific anti-MMV antiserum was added before the filtration.
  • MMV parvovirus "mouse minute virus”
  • specific anti-MMV antiserum was added before the filtration.
  • the virus titer was determined before and after filtration in the starting material and in the filtrate.
  • a cryogen supernatant from human plasma was spiked with a high-titer poliovirus preparation and subjected to depth filtration at a flow rate of 50 ml / min.
  • the activities of factor VII, factor IX, antithrombin III (ATIII) and Cl esterase inhibitor were determined before and after the filtration.
  • the results are summarized in Table 12 and show that the method described achieves a virus depletion of> 7 log levels and the activity of the blood factors is unaffected.

Abstract

Beschrieben wird ein biologisches Material, das frei von bestimmten Pathogenen, insbesondere von viralen Pathogenen ist, sowie ein Verfahren zur Abreicherung von viralen und molekularen Pathogenen aus einem biologischen Material, wobei ein biologisches Material mit mindestens einem Liganden oder Rezeptor, der mit einem Rezeptor oder Liganden des bestimmten Pathogens reagiert, versetzt wird, wodurch ein Ligand/Rezeptor-Komplex entsteht, und Abtrennen des Ligand/Rezeptor-Komplexes durch ein Verfahren, das die teilweise oder vollständige Abtrennung des komplexierten Pathogens vom biologischen Material erlaubt, und die Verwendung des Verfahrens zur Herstellung eines biologischen Materials.

Description

Biologisches Material frei von viralen und mole- kularen Pathogenen und Verfahren zur Herstellung
Die Erfindung betrifft ein biologisches Material, das frei von bestimmten Pathogenen, insbesondere von viralen Pathogenen ist, sowie ein Verfahren zur Abreicherung von viralen und molekularen Pathogenen aus einem biologischen Material.
Die Herstellung von therapeutischen Proteinen und Präparationen durch Extraktion aus humanen oder tierischen Geweben oder Flüssigkeiten, wie Blut oder Plasma, sowie aus kontinuierlich wachsenden transformierten Säugerzellen ist häufig mit dem Risiko der potentiellen Kontamination durch Pathogene, wie Viren, virus-ähnliche Partikel oder Prionen behaftet. Es müssen daher Maßnahmen getroffen werden, daß möglicherweise vorhandene Pathogene nicht auf den Menschen übertragen werden.
Menschliches Blut bzw. Plasma z.B. kann Viren enthalten, die Krankheiten wie AIDS, Hepatitis B oder Hepatitis C verursachen. Bei Plasmaproteinen aus Plasmapools ist das Risiko, infektiöse Agenzien wie Viren zu übertragen, aufgrund der Selektion von Blut- oder Plasmaspenden und des Herstellungsverfahrens sehr gering. Geeignete Maßnahmen, wie den Ausschluß von Blutspendern, die ein erhöhtes Risiko aufweisen, von der Blutspende sowie Analysen von Blut- oder Plasmaspenden, die es ermöglichen, infektiöse Spenden zu erfassen und von der weiteren Verteilung auszuscheiden, erlauben zwar die meisten infektiösen Spenden zu eliminieren, können aber zumeist nicht alle erfassen. Existierende Testsysteme zum Nachweis von infektiösen Viren in biologischen Materialien lassen Bedenken der potentiellen Übertragung der Pathogene nicht immer ausschließen, da es bei dem breiten Spektrum von infektiösen Pathogenen unmöglich ist, das Ausgangsmaterial auf alle Viren oder molekularen Pathogene, die in einer Probe vorhanden sein können, zu testen. Zudem erfassen die meisten Tests nicht das Virus, sondern gegen das Virus entwickelte Antikörper, so daß im Zeitraum des sogenannten "diagnostischen Fensters" kein Nachweis einer Kontamination erfolgen kann. Für einige Virusgruppen gibt es außerdem keine zuverläßige oder genügend sensitive Nachweismethode. Obwohl neuentwickelte Testver fahren, insbesondere Nukleinsäureamplifikationsverfahren, wie z.B. die PCR, sehr sensitiv und spezifisch sind, können sie nur auf Pathogene angewendet werden, deren Nukleinsäuresequenz bekannt ist. In Fällen, in denen zwar die Humanpathogene bekannt sind, jedoch keine sensitiven Verfahren zum Nachweis vorhanden sind, bleibt die Unsicherheit, daß ein negatives Resultat nur aufgrund eines zu geringen Virusgehalts, der unterhalb der Sensitivitätsgrenze des Testssytems liegt, erhalten wird.
Es wurden daher für die Herstellung von pharmazeutischen und therapeutischen Produkten spezifische Entfernungs- und/oder Inaktivierungsverfahren zur Abreicherung von Viren entwickelt, so daß im Endprodukt keine infektiösen Partikel mehr zu erwarten sind.
Verschiedene Inaktivierungsverfahren basieren auf einer physikalisch-chemischen Behandlung durch Hitze und/oder Chemikalien. Als Verfahren kommen insbesondere die thermische Behandlung, das Pasteurisieren, Behandeln der Proteinlösung mit ß-Propiolacton und UV-Licht, Behandeln mit einer Kombination eines Lösungsmittels und eines Detergens (sog. S/D-Verfahren) oder Belichten der Proteinlösung nach Zusatz einer photodynamischen Substanz zum Einsatz. Mit diesen Verfahren wurde eine Virusinaktivierung bis zu 106 log-Stufen erreicht. Die Effizienz des Inaktivierungsverfahrens kann jedoch, abhängig vom Virustyp, variieren. Obwohl S/D-behandelte Blutprodukte als sicher in Bezug auf die Übertragung von HCV, HBV oder HIV gelten, werden nicht-umhüllte Viren, wie HAV oder Parvovirus, durch dieses Verfahren nicht inaktiviert (Prowse C. 1994. Vox Sang. 67:191-196).
Die Art des Inaktivierungsverfahrens kann auch einen Einfluß auf die Produkte haben und eine Stabilisierung zur Minimierung des Proteinverlustes ist daher oftmals notwendig. Zudem müssen einigen Inaktivierungsverfahren Reinigungsschritte folgen, um zugesetzte Chemikalien zu entfernen.
Verfahren zur Virusabreicherung umfassen insbesondere chromatographische Verfahren, Filtration von Proteinlösungen über einen Membranfilter oder Adsorption von Viren an eine feste Phase und anschließendes Entfernen der festen Phase, wie in der EP-0 679 405 beschrieben. Es wurde jedoch festgestellt, daß die Behandlung mit einer festen Phase, wie z.B. mit Aerosil®, zwar eine Entfernung von HIV bis zu 4 log-Stufen aus einer Immunglobulin-haltigen Lösung erlaubt, der Verlust von IgG jedoch bis zu 42% betragen kann (Gao et al. 1993. Vox Sang 64:204-209). Für den großtechnischen Ansatz ist bei diesen hohen Verlustraten ein solches Verfahren daher eher ungeeignet.
Bei der Ultrafiltration erfolgt die Virusabreicherung durch einen auf dem Größenunterschied von Viruspartikeln basierenden Effekt. Von Bechtel et al. (1988. Biomat., Art. Cells, Art. Org. 16:123-128) wurde gezeigt, daß für Viren verschiedener Größe (EMC: 30-50 nm, Sindbis Virus: 50-70 nm und VSV 80-100 nm) in allen Fällen eine Virusabreicherung von 3,3-3,5 log-Stufen erreicht wird und die Abreicherung durch Ultrafiltration damit unabhängig von der Virusgröße und nicht genügend selektiv ist. Konventionelle Membranfilter haben aufgrund der Ausschlußgröße von ungefähr 0,1 μm- 0,2 μm den Nachteil, daß die meisten Viren den Filter frei passieren können. Die Entwicklung von Nanofiltern mit verschiedener nominaler Ausschlußgrößen von 15-75 nm oder 70-160 kD haben zur Möglichkeit geführt, Viren bis zu einer Größen von 28 nm zurückzuhalten (DiLeo et al. (1991). Nature 351:420-421, DiLeo et al. (1992). Bio/Technology 10:182-188, Burnouf-Radosevich et al. (1994). Vox Sang 67:132-138, Hamamoto et al. (1989). Vox Sang 56:230-236).
Die Verwendung von Nanofiltern zur Virusabreicherung erlaubt es, eine schonende Methode anzuwenden, bei der keine Veränderungen der Endprodukte auftreten und auch Viren kleiner Größen aus einem biologischen Material entfernt werden können. Hoffer et al. (1995. J. Chromatography B, 669:187-196) beschreiben ein Verfahren zur Virusabreicherung basierend auf TangentialflußFiltration zur Herstellung eines Faktor IX-Konzentrates mit Viresolve®-Membranen der Ausschlußgröße von 70 kD und fanden einen Reduktionsfaktor von 3,5 log-Stufen für umhüllte Viren und von 7,2 log-Stufen für nicht-umhüllte Viren. Sie stellen jedoch fest, daß hochmolekulare Produkte von diesen Filtern zurückgehalten werden. Blutfaktoren mit geringem Molekulargewicht, wie etwa Faktor IX oder Faktor XI können Nanofilter mit einer Ausschlußgröße zwischen 15 und 35 nm frei passieren (Burnouf- Radosevich et al. (1994). Vox Sang 67:132-138, Feldman et al. (1995). Acta Haematol. 94:25-34). Produkte mit größerem Molekulargewicht, wie etwa Faktor VIII (350 kD) vWF (bis zu 2,000 kD) oder Immunglobuline (IgG 150 kD) können nur Filter mit größerer Ausschlußgröße passieren. Dabei besteht jedoch die Gefahr, daß Viren mit kleinem Durchmesser nicht vom Filter zurückgehalten werden und ins Filtrat gelangen. Die Anwendung der Nanofiltra- tion zur Herstellung virussicherer, therapeutisch anwendbarer Produkte, die insbesondere frei von kleinen Viren, wie HAV oder Parvovirus, sind, ist daher auf Produkte enthaltend Proteine mit geringer Molekülgröße, die auch einen Nanofilter mit kleiner Ausschlußgröße frei passieren können, beschränkt. Nur die Verwendung von Nanofiltern kleiner Ausschlußgröße von 15 nm sichert daher die Abreicherung und Entfernung von HAV und Parvovirus B19 aus biologischen Produkten. Es besteht jedoch der Nachteil, daß die Nanofiltration mit Filtern dieser Ausschlußgröße nicht für die Herstellung von Produkten enthaltend Proteine mit hohem Molekulargewicht anwendbar ist, da diese den Filter nicht passieren können und wie die Viren zurückgehalten werden.
Daß für verschiedene Viren beschriebene Durchmesser nicht immer absolut sind, stellt ein mögliches weiteres Problem bei der Nanofiltration dar. Die für HCV allgemein angegebene Größe beträgt 40-50nm (Murphy et al. (1995). Archives of Virology
10:424). Muchmore et al. ((1993). International. Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease. Tokyo) stellten jedoch fest, daß eine HCV-haltige Lösung, filtriert über einen 35 nm Nanofilter, zu einer HCV-Infektion bei Schimpansen führt. Die mögliche Variabilität der Größe verschiedener Viren beschränkt daher den Einsatz der Nanofiltration zur Virusabreicherung und zur Herstellung eines virussicheren Produktes bzw. birgt einen Unsicherheitsfaktor in sich.
Es besteht daher ein Bedarf nach industriell anwendbaren Methoden zur sicheren Abtrennung von Viren aus Proteinlösungen, um die Infektionsrisiken für Patienten zu vermindern, die mit pharmazeutischen oder therapeutischen Präparationen tierischen, hu- manen Ursprungs oder hergestellt über ein gentechnisches Verfahren aus Zellkulturen, behandelt werden.
Ebenso besteht Bedarf an virussicheren, pathogenfreien biologischen Produkten, bei denen durch das Herstellungsverfahren schon sichergestellt wird, daß kein Pathogen übertragen ist und das Verfahren schonend genug ist, damit die biologische Aktivität der Produkte weitgehend unbeeinträchtigt bleibt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein biologisches Material, das gegebenenfalls hochmolekulare pharmazeutisch relevante Proteine enthält, und frei von bestimmten viralen und molekularen Pathogenen ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines solchen biologischen Materials, zur Verfügung zu stellen.
Ein weiteres Ziel ist, ein biologisches Material zu gewinnen, das sicher virusentfernt und frei von Zielviren ist, wobei ein Reduktionsfaktor von >107 erreicht wird - in Analogie zu bakteriendichten Filtern.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein biologisches Material, das sicher frei ist von bestimmten Pathogenen, zur Verfügung gestellt wird, das dadurch gewonnen wird, daß mindestens ein in einem biologischen Material enthaltener Ligand oder Rezeptor mit einem Rezeptor oder Liganden eines bestimmten Pathogens reagiert, versetzt wird, wodurch ein Ligand/Rezeptor- Komplex des komplexierten Pathogens entsteht. Der Ligand/Rezep- tor-Komplex wird anschließend durch ein Verfahren, das die teilweise oder vollständige Abtrennung des komplexierten Pathogens erlaubt, aus dem biologischen Material entfernt.
Der Ligand oder Rezeptor, der mit dem Rezeptor oder Liganden des Pathogens reagiert, kann dabei bereits im Ausgangsmaterial enthalten sein. Vorzugsweise wird das biologische Material jedoch mit mindestens einem Liganden oder Rezeptor, der mit dem Rezeptor oder Liganden eines bestimmten Pathogens reagiert, versetzt. Dadurch ist eine gezielte Maßnahme zur optimalen Einstellung der Parameter, wie beispielsweise die Menge an Liganden oder Rezeptor, die Auswahl des Liganden oder Rezeptors, oder Mischungen von verschiedenen Liganden oder Rezeptoren, oder gegebenenfalls auch eine Zugabe von weiteren Komponenten, die die Bildung des Komplexes unterstützen, möglich. Ebenso kann der Zeitpunkt zu dem eine Komplexierung erfolgen soll, gezielt bestimmt werden. So kann beispielsweise, falls mehrere Arbeitsgänge oder Reinigungsschritte vor der Pathogenabtrennung erfolgen, der Ligand oder Rezeptor erst vor dem finalen Schritt vor der Abtrennung, insbesondere vor dem Penetrieren des biologischen Materials durch einen durchlässigen Filter erfolgen. Der Ligand oder Rezeptor wird dem biologischen Material daher vorzugsweise kurz vor der Filtration zugegeben.
Der dem biologischen Material zugesetzte Ligand oder Rezeptor ist dabei eine an den Liganden oder Rezeptor und damit an eine spezifische Bindungsstelle des Pathogens bindungsfähige Komponente, die in der Lage ist, mit dem Pathogen einen Komplex, vorzugsweise einen hochmolekularen Komplex, zu bilden. Der Ligand oder Rezeptor des Pathogens kann dabei ein Antigen, ein Epitop oder eine antigene Determinante sein. Der reaktive, bindungsfähige Ligand oder Rezeptor, der dem biologischen Material zugesetzt wird, ist gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ein spezifischer Antikörper, oder ein Fragment eines Antikörpers, das noch fähig ist, an den Liganden oder Rezeptor des Pathogens zu binden.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße biologische Material dadurch gewonnen, daß als Ligand oder Rezeptor, der mit einem Ligand oder Rezeptor des Pathogens reagiert, ein Antikörper eingesetzt wird, und der Ligand oder Rezeptor des Pathogens ein Antigen ist, wodurch ein Antikörper/Antigen-Komplex als Ligand/-Rezeptor-Komplex entsteht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Komplex anschließend aus dem biologischen Material entfernt.
Gemäß einem besonderen Aspekt der Erfindung wird das von bestimmten Pathogenen freie biologische Material dadurch gewonnen, daß der Liganden/Rezeptor-Komplex, vorzugsweise der Antikörper/- Antigen-Komplex, vom biologischen Material durch Penetrieren der Lösung durch einen durchlässigen Filter abgetrennt wird. Die Abtrennung des Komplexes von der Lösung kann auch durch Sedimenta tion, vorzugsweise durch Dichte-Gradientenzentrifugation erfolgen.
Dem biologischen Material, das unter Verdacht steht, gegebenenfalls ein infektiöses Pathogen zu enthalten, werden dabei gemäß der vorliegenden Erfindung Antikörper oder noch bindungsfähige Teile eines Antikörpers gegen mindestens ein infektiöses Agens zugesetzt. Es können jedoch auch Antikörper gegen mehrere bekannte infektiöse Viren, wie z.B. HAV, HBV, HCV, HDV, HEV, HGV, HIV, CMV oder Parvovirus, oder gegen molekulare Pathogene, wie z.B. Prionen, zugesetzt werden. Die Zugabe der Antikörper kann derart erfolgen, daß eine Immunglobulin-haltige Lösung zu einer Protein-haltigen Lösung zugesetzt wird, wobei die Immunglobuline auch im Überschuß zugesetzt werden können (und damit in einer neutralisierenden Konzentration), so daß das Risiko, daß noch potentielle Pathogene in freier Form im biologischen Material vorliegen, ausgeschlossen werden kann. Es wurde jedoch im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß auch die Zugabe von nicht-neutralisierenden Konzentrationen von Antiserum eine komplette und vollständige Abreicherung von Pathogenen aus einem biologischen Material erlaubt.
Vorzugsweise wird daher der Ligand oder Rezeptor, insbesondere ein Antikörper in einer nicht-neutralisierenden Konzentration zugesetzt, wobei die Konzentration jedoch ausreichend ist, um die vorhandenen Pathogene zu komplexieren, so daß sie durch den Abtrennungsschritt vollständig vom biologischen Material entfernt werden können.
In manchen Fällen kann es vorkommen, daß Aggregate unterschiedlicher Größe entstehen können, wobei auch kleine Aggregate entstehen können, die noch in der Lage sind, das Filter frei zu passieren bzw. deren Sedimentationsdichte nicht ausreichend ist, um sie vom biologischen Material abzutrennen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird daher zur Verbesserung der Abtrennung des Ligand/Rezeptor-Komplexes die Aggregation des Komplexes erhöht, indem neben Immunglobulin-haltigen Lösungen weitere Aggregationsmittel zum biologischen Material zugesetzt werden, die entweder freie Pathogene weiter aggluti- nieren oder die Komplexierung des Liganden/Rezeptor-Komplexes erhöhen. Dies kann durch die Zugabe von Agglutininen, wie Lektine, einer oder mehrerer Komplement-Komponenten, Conglutinin, Rheumafaktor, einem nicht-toxischen, wasserlöslichen, synthetischen Polymer, insbesondere von Polyethylenglykol oder Albumin (mindestens 10 %, vorzugsweise 20 %) oder anderen aus dem Stand der Technik bekannten Agglutinationsmitteln erfolgen. Die Zugabe des Aggregationsmittels erfolgt dabei derart, daß vorzugsweise Antigen/Antikörper-Komplexe bis zu einer im Lichtmikroskop sichtbaren Größe entstehen.
Das erfindungsgemäße biologische Material ist besonders dadurch gekennzeichnet, daß es sicher frei von bestimmten viralen Pathogenen, sowohl aus der Gruppe der Lipid-umhüllten als auch der nicht-umhüllten Viren ist. Dazu zählen insbesondere Viren wie HAV, HBV, HCV, HGV, HIV, HEV, HDV, CMV oder Parvovirus. Da der als Ligand oder Rezeptor vorzugsweise eingesetzte spezifische Antikörper die entsprechenden Antigene an der Oberfläche des jeweiligen Virus erkennt und an ihn bindet, kann jedes Virus, für das Antikörper zu Verfügung stehen oder gegen das spezifische Antikörper hergestellt bzw. in einer Immunglobulin-Lösung enthalten oder aus ihr isoliert werden können, komplexiert werden und der Komplex gemäß der Erfindung aus dem biologischen Material entfernt werden. Dadurch ist es möglich, bekannte, aber auch noch nicht identifizierte Viren, gegen die Immunglobulinhaltige Lösungen zur Verfügung stehen, zu komplexieren, gegebenenfalls komplett zu neutralisieren, und den Antikörper/Antigen- Komplex aus dem biologischen Material abzutrennen und so sicher pathogenfreies biologisches Material zu gewinnen.
Besondere Aufmerksamkeit wurde in den letzten Jahren auch der Übertragung von potentiell infektiösen molekularen Pathogenen, wie etwa Prionen, geschenkt. Derzeit stehen nur wenige, effektive Verfahren zur Reduktion von Verursachern der Creutzfeldt- Jakob-Krankheit oder der BSE zur Verfügung. Pocchiari et al. (1991. Horm. Res. 35:161-166) schlugen eine Kombination von Ultrafiltration und 6 M Harnstoff zur Abreicherung von sog.
"slow viruses" vor. Sie machen jedoch keine Angaben, inwieweit die biologische Aktivität eines so behandelten Proteins in Mitleidenschaft gezogen wird. Durch die Behandlung mit hohen Konzentrationen des Protein-denaturierenden Harnstoffes, ist jedoch davon auszugehen, daß Proteine in einer so behandelten Lösung zumindestens teilweise denaturiert und damit inaktiviert werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt ist das erfindungsgemäße biologische Material daher auch frei von molekularen Pathogenen, insbesondere von Prionen, wie den Erregern der BSE oder der Creuzfeldt- Jakob-Krankheit . Gegen diese Pathogene können gezielt Antikörper hergestellt werden oder Immunglobulin-haltige Lösungen bereitgestellt werden, die insbesondere anti-ß-Amyloid-Antikörper enthalten. Durch Zusatz von anti-ß-Amyloid-haltigen Immunglobulinlösungen zu einem biologischen Material können daher auch potentielle molekulare Erreger in einem Komplex gebunden und der Komplex aus dem biologischen Material entfernt werden.
Da die Abtrennung des Liganden/Rezeptor-Komplexes und damit des komplexierten Pathogens unabhängig von den physiko-chemischen Eigenschaften eines Virus ist , wird ein virussicheres , pathogen- freies biologisches Material gewonnen, dessen physiko-chemische Eigenschaften durch das Abreicherungsverfahren nicht beeinflußt werden. Bekanntermaßen hat bei konventionellen Inaktivierungs- verfahren die Zugabe von Chemikalien oder die thermische Behandlung, falls nicht geeignete Maßnahmen wie etwa die Zugabe von Stabilisatoren vorgenommen werden, einen Einfluß auf die Produkte selbst. Eine Abreicherung der Pathogene durch Komplexie- rung mit einem Liganden oder Rezeptor und Abtrennung des Komplexes aus einem biologischen Material ohne physikalisch-chemische Behandlung bietet daher den großen Vorteil, daß die Pathogene effizient eliminiert werden, das Produkt jedoch in seiner nativen Form unbeeinträchtigt bleibt. Ein so erhaltenes biologisches Material enthält damit Proteine, die in ihren Eigenschaften denen der nativen Proteine im Ausgangsmaterial vor dem Abreicherungsschritt entsprechen und unveränderte Aktivität aufweisen. Auch wird vermieden, daß, wie etwa bei einigen Virusinaktivierungsverfahren, gegebenenfalls denaturierte Proteine entstehen, die in zusätzliche Reinigungsschritten aus der Proteinlösung wieder aufwendig abgetrennt werden müssen. Nach der Abreicherung der Pathogene aus dem biologischen Material kann das erhaltene pathogenfreie Material natürlich weiteren Reinigungsschritten unterzogen werden, um eventuell nicht im Endprodukt erwünschte Begleitproteine zu entfernen. Dazu können alle im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie Chromatographie, insbesondere Ionenaustauschchromatographie oder Affinitätschromatographie, oder Gelfiltration durchgeführt werden.
Die Abtrennung von Begleitproteinen aus dem erfindungsgemäßen biologischen Material, wie etwa die Abtrennung von Blutfaktoren aus einer für die Herstellung einer Immunglobulin-haltigen Präparation vorgesehenen Fraktion, kann auch vor der Virusabreicherung erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Abreicherung der Pathogene aus dem biologischen Material jedoch vor der chromatographischen Abtrennung von Begleitproteinen, da durch das chromatographische Verfahren neben dem Reinigungseffekt auch eine zusätzliche Abreicherung des komplexierten Pathogens sowie eventuell noch vorhandener Liganden oder Rezeptoren, die ursprünglich dem biologischen Material zugesetzt wurden, erreicht werden kann.
Das erfindungsgemäß erhaltene biologische Material ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß es sicher frei ist von bestimmten viralen und molekularen Pathogenen, wobei die Pathogene im wesentlichen vollständig aus dem biologischen Material entfernt sind. "Vollständig" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß durch das Verfahren im biologischen Material eine Abreicherung von Pathogenen mit einem Reduktionsfaktor von mindestens 7 log-Stufen erreicht wird - in Analogie zu bakteriendichten Filtern. Vorzugsweise erfolgt die Abtrennung mit einer Kapazität von >7 log- Stufen, vorzugsweise >9 log-Stufen, und besonders bevorzugt >10 log-Stufen. Gemäß den Richtlinien der United States Pharmacopeia (1995, USP 23, NF 18: 1978-1980) wird die Rückhaltekapazität eines Filters durch den log-Reduktionswert (RF) beschrieben. Beispielsweise ist die Rückhaltekapazität eines 0,2 μm-Steril- filters, der 107-Mikroorganismen zurückhalten kann, mindestens 7 log-Stufen. Diese Größe gilt dabei als vollständige Abtrennung der Viren durch das Filter. Da eine Antikörper-haltige Hyperimmunglobulinlösung dem biologischen Material gegebenenfalls im Überschuß zugesetzt wird, um alle freien, infektiösen Pathogene zu komplexieren, enthält das erfindungsgemäße biologische Material gegebenenfalls auch nicht- komplexierte, in freier Form vorliegende Antikörper. Nach der Abtrennung des Antikörper/Antigenkomplexes aus dem biologischen Material, entweder durch Filtration oder Sedimentation, enthält das pathogenfreie biologische Material daher gegebenenfalls auch anti-HAV-, anti-HCV-, anti-HBV oder anti-Parvovirus spezifische Antikörper.
Da durch einen Überschuß an Liganden oder Rezeptoren, die das biologische Material enthält bzw. zugesetzt werden, und die an das Pathogen binden und komplexieren, keine freien Viren mehr im biologischen Material vorliegen und die Abtrennung des komplexierten Pathogens entweder durch Filtration oder Sedimentation erfolgt, gelangen weder in freier Form vorliegende Pathogene noch mit dem Liganden/Rezeptor komplexierte Pathogene ins Filtrat. Das so erhaltene Filtrat enthaltend biologisch aktive Proteine ist daher gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur frei von nicht-komplexiert und frei vorliegenden Pathogenen, sondern auch frei von in einem Komplex mit. einem Liganden, wie etwa einem Antikörper, vorliegenden Pathogenen.
Ein gemäß der vorliegenden Erfindung erhältliches pathogenfreies biologisches Material kann eine Plasmafraktion, eine Immunglobu- lin-haltige Plasmafraktion, eine Plasmaprotein-haltige Fraktion enthaltend Blutfaktoren wie etwa Faktor II, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI, Protein C, Protein S, vWF, ein Konzentrat enthaltend einen der genannten Blutfaktoren, ein Überstand einer Hybridoma-Zellinie, ein Zellkulturüberstand von transformierten oder infizierten Säugerzellen oder ein Extrakt eines tierischen oder humanen Gewebes sein.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Abreicherung von viralen und molekularen Pathogenen aus einem biologischen Material sowie ein Verfahren zur Gewinnung von biologischem Material, das sicher frei von viralen und molekularen Pathogenen ist, zur Verfügung gestellt. Das Ver fahren ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein in einem biologischen Material (mit Verdacht auf Anwesenheit eines bestimmten Pathogens) enthaltener Rezeptor oder Ligand, mit einem Rezeptor oder Liganden eines Pathogens reagiert, wodurch gegebenenfalls ein Ligand/Rezeptor-Komplex eines komplexierten Pathogens entsteht. Vorzugsweise wird dem biologischen Material ein Ligand oder Rezeptor, der mit dem Rezeptor oder Liganden des Pathogens reagiert, zugesetzt. Der gegebenenfalls gebildete Ligand/Rezeptor-Komplex wird anschließend durch ein Verfahren, das die teilweise oder vollständige Abtrennung des komplexierten Pathogens erlaubt, aus dem biologischen Material entfernt. Durch die Komplexierung eines freien Pathogens mit einem Liganden in einem Komplex wird ein komplexiertes Pathogenpartikel erhalten, das vergrößert ist, eine höhere Dichte oder einen höheren Sedimentationskoeffizienten aufweist als das freie Pathogen.
Auch weist der Komplex eine höhere Aggregierung auf als das freie Pathogen, wodurch aufgrund der erhöhten Aggregierung der Durchmesser des komplexierten Pathogens vergrößert wird und seine Durchläßigkeit durch bestimmte Membranfilter verändert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Abreicherung von Pathogenen und Gewinnung eines pathogenfreien biologischen Materials erfolgt daher durch Komplexierung des Pathogens mit einem Liganden/Rezeptor zur Erhöhung seiner Dichte oder Sedimentationseigenschaften sowie der Vergrößerung des Durchmessers durch Erhöhung der Aggregation. Das komplexierte Pathogen kann anschließend aufgrund derart veränderter Eigenschaften aus dem biologischen Material abgetrennt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens erfolgt das Abtrennen des Liganden/Rezeptor-Pathogen-Komplexes durch Penetrieren eines durchlässigen Filters, wobei der Komplex selektiv vom Filter zurückgehalten wird. Die Ausschlußgröße des Filters ist gemäß der vorliegenden Erfindung dabei so gewählt, daß auch hochmolekulare Proteine, wie etwa Faktor VIII, vWF oder Immunglobuline den Filter frei passieren können und auch bei Verwendung einer hochkonzentrierten Proteinlösung, keine Ver stopfung der Filterporen zu erwarten ist. Die Filterausschlußgröße darf natürlich nicht die höchstmögliche Aggregationsgröße des Liganden/Rezeptor-Komplexes und insbesondere des Antikörper/ Antigen(Pathogen)-Komplexes übersteigen, da ansonsten auch hochmolekulare, dichte Pathogen/Antikörper-Komplexe den Filter passieren und so ins Filtrat gelangen.
Zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens sind daher Nanofilter geeignet. Besonders bevorzugt sind dabei Nanofilter mit einer nominellen Ausschlußgröße zwischen 35-100 nm. Diese Ausschlußgröße erlaubt es, daß hochmolekulare Proteine den Filter frei passieren können; jedoch halten sie auch freie, nicht-komplexierte Pathogene mit einem Durchmesser >100nm sowie Komplexe von Pathogenen dieser Größe zurück. Zudem wird bei der Verwendung von Filtern mittlerer Ausschlußgröße vermieden, daß die Filter durch höhermolekulare Proteine oder andere Bestandteile, die im biologischen Material vorhanden sein können, verstopft werden können und ihre Durchflußkapazität sinkt. Auch ist beim Einsatz der Tangentialfluß-Filtration gegebenenfalls ein geringerer Druck notwendig, um die Flüssigkeit über den Filter zu schicken, wodurch auch die Gefahr sinkt, daß durch den angelegten Druck der Filter in Mitleidenschaft gezogen wird und Risse erhält. Die Verwendung von Nanofilter mit einer Ausschlußgröße ≥35 nm zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bietet daher neben der für das Endprodukt effizienten und schonenden Abreicherung von Pathogenen den Vorteil, daß die Kosten für die verwendeten Filter geringer sind als bei Nanofilter kleiner Ausschlußgröße. Dies macht das Verfahren insbesondere für den großtechnischen Asatz interessant.
Es ist natürlich auch möglich, Filter mit einer Ausschlußgröße >100nm zur Durchführung des Verfahrens einzusetzen, wobei jedoch vorher sichergestellt werden muß, daß sehr große Pathogen-Liganden-Komlexe bzw. Antikörper/Antigen-Aggregate gebildet werden, oder daß gegebenenfalls zusätzliche Agglutinationsmittel eingesetzt werden, damit der Ligand/Rezeptor-Komplex ausreichend groß ist, damit er den Filter nicht frei passieren kann. Die Bedingungen können dabei natürlich auch so gewählt werden, daß Antigen/Antikörper-Aggregate bis zu einer sichtbaren Größe ent stehen, die sogar durch einen konventionellen Sterilfilter zurückgehalten werden. Grundsätzlich gilt, daß je kleiner die Ausschlußgröße eines Filters um so kostspieliger ist seine Herstellung.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß auch Filter mit einer nominalen Ausschlußgröße von 0,04 μm bis zu 3 μm eine vollständige Abtrennung von gemäß dem vorliegenden Verfahren komplexierten Pathogenen aus einem biologischen Material erlauben. Damit wurde gezeigt, daß gemäß der vorliegenden Erfindung Ligand/Rezeptor-Komplexe gebildet werden, die eine Größe im sichtbaren Bereich (etwa im Lichtmikroskop) erreichen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform erfolgt das Abtrennen des Ligand/Rezeptor-Komplexes durch Sedimentation. Bevorzugt ist dabei die Sedimentation durch Dichte-Gradientenzentrifugation.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ist der zum biologischen Material zugesetzte Ligand oder Rezeptor eine an den Liganden oder Rezeptor und damit an eine spezifische Bindungsstelle des Pathogens bindungsfähige Komponente, die in der Lage ist, mit dem Pathogen einem Komplex, vorzugsweise einen hochmolekularen Komplex, zu bilden. Der Ligand oder Rezeptor des Pathogens kann dabei ein Antigen, ein Epitop oder eine antigene Determinante sein. Der reaktive, bindungsfähige Ligand oder Rezeptor, der dem biologischen Material zugesetzt wird und mit dem Liganden oder Rezeptor des Pathogens reagiert, ist vorzugsweise ein Antikörper oder ein bindungsfähiges Fragment eines Antikörpers. Der Antikörper kann dabei ein Antikörper aller Subklassen sein, wobei jedoch die Subklassen IgG und IgM besonders bevorzugt sind. Es kommen jedoch als Liganden oder Rezeptoren alle bekannten Komponenten in Betracht, die in der Lage sind, an einen Rezeptor oder Liganden eines Pathogens zu binden und mit dem Pathogen einen hochmolekularen Komplex zu bilden.
Durch die Zugabe eines an einen in einem biologischen Material möglicherweise vorkommenden Pathogen bindungsfähigen Rezeptors oder Liganden wird ein hochmolekularer Komplex aus Pathogen und Ligand/Rezeptor mit einer höheren Aggregation erhalten. Gemäß einem Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird einem biologischen Material, vorzugsweise einer Protein-haltigen Lösung, eine Immunglobulin-haltige Lösung enthaltend spezifische Antikörper, gerichtet gegen infektiöse Humanpathogene, zugesetzt, wodurch zwischen den möglicherweise im biologischen Material vorhandenen Pathogenen und den Antikörpern ein Antikörper/Antigen-Komplex entsteht.
Gemäß einem weiteren Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Aggregation des Liganden/Rezeptor-Pathogen-Komplexes noch weiter erhöht, wodurch Komplexe mit einer höheren Dichte und einem größeren Durchmesser entstehen. Dies erfolgt erfindungsgemäß durch die Zugabe von weiteren Agglutinationsmitteln, insbesondere von Lektinen, wie etwa Concanavalin A, Ricin oder Phasin, oder ein oder mehrere Komplement-Komponenten, Conglutinin, Rheumafaktor oder einem synthetischen Polymer, wie beispielsweise Polyethylenglykol oder von Albumin. Das Aggregationsmittel kann entweder gleichzeitig mit dem Liganden oder Rezeptor, der mit dem Pathogen reagiert, zum biologischen Material oder nach einer vorgegebenen Zeitspanne nach dessen Zugabe zugesetzt werden. Bevorzugt ist jedoch, daß das Agglutinationsmittel nach einer zeitlichen Verzögerung nach Zugabe der Immunglobulin-Lösung erfolgt. Dadurch wird gewährleistet, daß die Agglutinine oder Conglutinine nicht mit den Antikörpern reagieren und diese aggregieren oder komplexieren, sondern erst schon gebildete Pathogen/Antikörper-Komplexe zu höhermolekularen Komplexen aggregieren. Dadurch wird ebenfalls gewährleistet, daß durch die weitere Aggregation eine höhere Komplexdichte erreicht wird, wodurch der Komplex mit verbesserter Effizienz aus dem biologischen Material entfernt werden kann. Durch die höhere Komplexierung der Antigen/Antikörper-Aggregate ist es möglich, bei der Abtrennung der Membranfilter, auch Filter mit einer größeren Ausschlußgröße von vorzugsweise ≥35 nm einzusetzen. Auch ist durch die höhere Dichte der aggregierten Partikel eine verbesserte Abtrennung durch Sedimentation möglich, da dadurch alle komplexierten Pathogene erfaßt werden können.
Durch die Zugabe von Immunglobulin-haltigen Lösungen oder Liganden oder Rezeptoren, die spezifisch mit den Pathogenen reagie ren, ist es ebenfalls möglich, sowohl virale als auch molekulare Pathogene, unabhängig von ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften, aus einem biologischen Material abzureichern. Dies gilt insbesondere für Viren oder molekulare Pathogene, die mit konventionellen Verfahren bisher nicht abreicherbar oder inaktivierbar waren. So werden von dem erfindungsgemäßen Verfahren auch kleine nicht-Lipid-umhüllte Viren, wie Parvovirus oder HAV, erfaßt, die bisher weder durch physikalisch-chemische Inaktivierungsverfahren, wie die S/D-Behandlung, noch durch die Nanofiltration effizient aus hochkonzentrierten Proteinlösungen oder aus Lösungen enthaltend hochmolekulare Proteine (>150 kD) entfernt oder inaktiviert werden konnten. Das Verfahren ist daher für die Abreicherung aller viralen und molekularen Pathogene, mit denen ein biologisches Material kontaminiert sein kann, anwendbar, insbesondere für die Abreicherung Lipid-umhüllter oder nicht-Lipid-umhüllter Viren, wie HAV, HBV, HCV, HIV, HEV, HDV, HGV, CMV oder Parvovirus aber auch für Prionen. Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Abreicherung von Pathogenen in einem biologischen Material und Gewinnen von biologischem Material, das hochmolekulare Proteine, etwa Immunglobuline oder vWF, enthält.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird daher auch eine pathogenfreie, virussichere Plasmaprotein-haltige Zusammensetzung, bei der die Plasmaproteine mindestens 80 % der Aktivität im Ausgangsmaterial aufweisen, bereitgestellt, wobei die Zusammensetzung durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnen wird.
Gemäß einem besonderen Aspekt der Erfindung wird bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als Ligand ein Antikörper, erhalten aus einer Hyperimmunglobulin-Lösung oder einem Überstand einer Hybridoma-Zellinie, eingesetzt. Die Immunglobulin-haltige Lösung kann dabei von Plasmaspenden erhalten werden, die einen hohen Titer an Antikörper, gerichtet gegen ein bestimmtes Pathogen, enthalten. Dies sind insbesondere Immunglobulin-Lösungen von Spendern enthaltend anti-HCV-, anti-HAV-, antiHBV-, anti-HIV-, anti-HEV-, anti-HDV, anti-HGV-, anti-CMV- oder anti-Parvovirus-Antikörper. Die Antikörper-haltige Lösung kann auch durch biotechnologische Verfahren, wie die Hybridoma-Tech nik hergestellt werden. Dabei werden monoklonale Antikörper, gerichtet gegen ein Antigen eines bestimmten Pathogens von einer Hybridoma-Zellinie, in den Überstand des Kulturmediums sekretiert, aus dem dann die Antikörper in einer hochtitrigen Lösung isoliert werden können.
Aus Plasmaspenden gewonnene Immunglobulin-haltige-Lösungen können gegebenenfalls auch freie Viren, gegen die die in der Lösung enthaltenen Antikörper gerichtet sind, sowie andere Pathogene erhalten. Dies gilt im gleichen Maß auch für über HybridomaTechnik hergestellte monoklonale Antikörper, bei denen eine mögliche Kontamination mit viralen Pathogenen nicht auszuschließen ist. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die zur Durchführung des Verfahrens eingesetzte Hyperimmunglobulinlösung gegebenenfalls einem Virusinaktivierungs- und/oder Virusabreicherungsverfahren unterzogen.
Falls der Antikörper in der Immunglobulin-haltigen Lösung mit einem niedrigen Titer vorliegt, kann der Antikörper gegebenenfalls angereichert und anschließend in einer hochkonzentrierten Lösung als Ligand oder Rezeptor eingesetzt werden.
Gemäß einem besonderen Aspekt wird zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als Antikörper ein anti-ß-Amyloid-Antikörper eingesetzt. Anti-ß-Amyloid-Antikörper erkennen vorzugsweise Strukturen an der Oberfläche von Prionen, können an diese binden und einen Prionen/Antikörper-Komplex bilden. Gemäß der vorliegenden Erfindung können gegen Prionen, insbesondere gegen den Erreger der Creuzfeldt-Jakob-Krankheit, gezielt Antikörper hergestellt oder anti-ß-Amyloid-haltige Immunglobulin-Lösungen bereitgestellt werden und einem biologischen Material, das gegebenenfalls Prionen enthält, zugesetzt werden. Durch die Anlagerung von anti-ß-Amyloid-Antikörpern an die Prionen werden die niedermolekularen Prionen zu einem hochmolekularen Komplex aggregiert, der anschließend selektiv aus dem biologischen Material durch Filtration oder Sedimentation abgetrennt werden kann.
Gemäß einem weiteren besonderen Aspekt der Erfindung werden als Liganden oder Rezeptoren Antikörper, gerichtet gegen HAV, HBV, HCV, HIV, HGV, HEV oder Parvovirus, eingesetzt. Zur Durchführung des Verfahrens kann eine Immunglobulin-haltige Lösung enthaltend gegen ein bestimmtes Virus gerichtete Antikörper zum biologischen Material gegeben werden. Es kann jedoch auch eine Mischung von Antikörpern oder anderen Liganden zugesetzt werden, die gegen verschiedene Pathogene, mit denen das biologische Material möglicherweise kontaminiert sein kann, gerichtet sind. Nach der Zugabe mindestens einer gegen ein bestimmtes Pathogen gerichteten Immunglobulin-haltigen Lösung oder einer Mischung aus gegen verschiedene Pathogene gerichteten Antikörper-haltigen Lösungen, wird die Mischung aus biologischem Material und Immunglobulin- Lösung über einen Zeitraum, der es erlaubt, einen Komplex zwischen dem Antigen des Pathogens und dem Antikörper zu bilden, inkubiert und der gebildete Komplex anschließend aus dem biologischen Material, wie oben beschrieben, abgetrennt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Abreicherung von viralen und/oder molekularen Pathogenen in einem biologischen Material eingesetzt werden. Das biologische Material kann eine Plasmafraktion, eine Immunglobulin-haltige Plasmafraktion, eine Plasmaprotein-haltige Fraktion enthaltend Blutfaktoren wie etwa Faktor II, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI, Protein C, Protein S, vWF, ein Konzentrat enthaltend einen der genannten Blutfaktoren, ein Überstand einer Hybridoma-Zelllinie, ein Zellkulturüberstand von transformierten oder infizierten Säugerzellen oder ein Extrakt eines tierischen oder humanen Gewebes sein. Die Parameter zur Durchführung des Verfahrens werden dabei jeweils abgestimmt auf die Art und Beschaffenheit des biologischen Materials und der möglicherweise vorhandenen kontaminierenden Pathogene. So wird die Bildung des Liganden/Rezeptor-Komplexes zur Aggregierung des Pathogens unter Bedingungen durchgeführt, die eine optimale Komplexierung, insbesondere der Bindung zwischen Rezeptor und Liganden bzw. zwischen Antikörper und Antigen des Pathogens, erlauben. Die optimalen Parameter, wie etwa pH, Temperatur, Zeitdauer der Inkubation zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, in Abhängigkeit von der Art des Pathogens, der Spezifität des zugesetzten Liganden oder Rezeptors (Antikörper) und der Beschaffenheit des biologischen Materials (Reinheit der Lösung, Proteinkonzentration in der Lösung), können von jedem Fachmann aufgrund seines allgemeinen Wissens ermittelt werden. Falls der Ligand/Rezeptor-Komplex aus dem biologischen Material durch einen Filtrationsschritt entfernt wird, wird ein Filter mit einer Ausschlußgröße verwendet, der es ermöglicht, daß das biologische Material den durchlässigen Filter frei passiert und der Ligand/Rezeptor-Komplex vom Filter selektiv zurückgehalten wird.
Um sicher zu gehen, daß alle freien Pathogene im biologischen Material durch Antikörper komplexiert wurden, wird sowohl das Filtrat als auch das Konzentrat auf die Anwesenheit von Viren oder einem Überschuß an spezifischen Antikörpern getestet. Die Abreicherungsrate der Pathogene aus dem biologischen Material kann dabei über Methoden der Virustiterbestimmung oder über die Ermittlung der Genkopienzahl bzw. Genomäquivalente bestimmter Viren, z.B. durch quantitative PCR, wie von Dorner et al. (1994. 25. Hämophilie-Symposion. ed. Scharrer & Schramm S. 29-44) beschrieben, im Filtrat und Konzentrat erfolgen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene biologische Material auf die Anwesenheit (eines Überschusses) des eingesetzten Liganden/Rezeptors, insbesondere eines spezifischen Antikörpers, getestet. Da bei Zugabe eines Überschusses eines gegen ein bestimmtes Pathogen gerichteten Antikörpers, nicht-gebundene und nicht-komplexierte Antikörper eine Dichte und molekulare Größe aufweisen, die unterhalb der des komplexierten Antikörpers liegt, ist das Vorhandensein von freien Antikörpern im biologischen Material ebenfalls ein Kriterium für die zur Komplexierung des freies Pathogens ausreichende Konzentration an Antikörpern in der Lösung. Die Anwesenheit eines Überschusses an eingesetzem Liganden oder Rezeptor wird dabei derart bestimmt, daß einer Probe des biologischen Materials vor und nach der Pathogenabreicherung eine bekannte Menge eines viralen oder molekularen
Pathogens, der spezifische Liganden oder Rezeptoren für den Antikörper besitzt, zugesetzt wird, das so gewonnene biologische Material enthaltend den Antikörper/Pathogen-Komplex erneut über einen durchlässigen Filter gefiltert wird und die Restmenge an Pathogen im Filtrat bestimmt wird. Dadurch kann ermittelt wer den, ob die für die Abreicherung eingesetzte ImmunglobulinLösung einen für die Komplexierung der Pathogene ausreichenden Antikörpergehalt aufweist, und ob nicht-komplexierte Antikörper im Filtrat und damit im Endprodukt vorliegen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Abreicherung von viralen und molekularen Pathogenen und Gewinnung von pathogenfreiem biologischen Material kann mit jedem bekannten Virusinaktivierungsverfahren, wie z.B. der Behandlung mit Hitze, Pasteurisieren oder dem S/D-Verfahren kombiniert werden. Vorzugsweise werden die Inaktivierungsverfahren vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angewendet, da so durch das Inaktivierungsverfahren nicht erfaßte Viren durch das erfindungsgemäße Verfahren abgereichert werden können.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine virusinaktivierte Immunglobulin-Lösung enthaltend spezifische Antikörper gegen virale oder molekulare Pathogene zur Verwendung als Ligand zur Komplexierung von viralen oder molekularen Pathogenen im erfindungsgemäßen Verfahren zur Verfügung.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Abreicherung von viralen und/oder molekularen Pathogenen kann insbesondere zur Gewinnung und Herstellung eines biologischen Materials, das frei ist von bestimmten sowohl in freier, nicht-komplexierter als auch in gebundener, komplexierter und aggregierter Form vorliegenden Pathogenen, verwendet werden.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert, wobei sie jedoch nicht auf die Beispiele eingeschränkt ist.
Beispiel 1: (nach Ansicht der Anmelderin derzeit die beste Form der Durchführung der Erfindung)
Abreicherung von HAV durch HAV-spezifische Antikörper und anschließende Nanofiltration
98 ml einer 2%igen humanen Serumalbumin-Lösung, die frei von Antikörpern war, und eine 2%ige humane Immunglobulin-Lösung, die Hepatitis A Virus (HAV)-spezifische Antikörper enthielt, wurden mit hochtitrigem HAV beaufschlagt. Aus Aliquoten beider Lösungen wurde der Virustiter bestimmt. Die Lösungen wurden anschließend einer 4-stündigen Tangentialfluß-Filtration mit einem Eingangsdruck von 0,8 bar unterworfen. Es wurde ein 0,001 m2/35 nm-Fil- ter (Pianova 35N, Asahi) verwendet. Die HAV-Titration erfolgte wie bei Barrett et al. (J. Med. Virol. (1996), Vol. 49: 1-6).
Der Virustiter wurde nach erfolgter serieller ½ log-Verdünnung in Zellkulturmedium bestimmt. Jeweils hundert μl jeder seriellen Verdünnung wurden in 8 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gegeben, die 1 x 104 FRhK-4-Zellen pro Vertiefung enthielten. Die Platten wurden anschließend 14 Tage bei 37°C inkubiert. Nach sieben Tagen erfolgte ein Medienwechsel. Nach dieser Inkubationszeit wurde der zellschädigende Effekt (cytopathic effect, cpe) mikroskopisch bestimmt. Die TCID50 wurde auf der Basis der Anzahl der Vertiefungen der Mikrotiterplatte, die einen positiven CPE zeigten, ermittelt. Die Effizienz des Prozesses der Virusabreicherung wurde als Reduktionsfaktor (R.F.) ausgedrückt, der nach der vom E.C. Committe for Proprietary Medicine
(Commission of the European Communities (1991): Ad hoc Working Party on Biotechnology / Pharmacology - Note for Guidance
(Validation of Virus Removal and Inactivation Procedures)
III/8115/89-EN) empfohlenen Formel berechnet wurde:
Figure imgf000023_0001
Wie aufgrund der Virusgröße (Durchmesser 25-30 nm) zu erwarten war, wurde HAV in Abwesenheit eines HAV-spezifischen Antikörpers durch Filtration über die 35 nm-Membran nicht zurückgehalten. Aus dem Ansatz, der Immunglobulin mit HAV-spezifischen Antikörpern enthielt, konnte hingegen eine vollständige Virusentfernung durch die Filtration durch die 35 nm Membran erreicht werden (R.F. > 5,2), wobei kein Virus im Filtrat nachgewiesen werden konnte und der Virus zu 100% im Konzentrat zurückgehalten wurde (Tabelle 1).
Figure imgf000024_0001
Beispiel 2:
Abreicherung von Parvoviren durch anti-Parvovirus-spezifische
Antikörper und anschließende Nanofiltration
Es wurde untersucht, ob ein Kaninchen-Antiserum gegen den Parvovirus "minute mouse virus" (MMV, ATCC VR1346) durch Bildung eines Komplexes mit dem Virus in der Lage ist, den Virus bei der Filtration über eine 35 nm-Membran zurückzuhalten.
Das Kaninchenantiserum wurde durch Immunisierung der Tiere mit konzentrierten, Formalin-inaktivierten MMV-Präparationen und komplettem Freund' sehen Adjuvans und einem anschließenden
Booster mit inkomplettem Freund' sehen Adjuvans, der 4 Wochen nach der Primärimmunisierung durchgeführt wurde, erhalten. Die Blutgewinnung zur Serumherstellung erfolgte 4 Wochen nach der Sekundärimmunisierung. 98 ml einer 2%igen humanen Immunglobulin-Lösung wurde mit 2 ml einer MMV-Suspension beaufschlagt. Nach Zugabe von 0, 0,005, 0,05, 0,5, 5,0 ml des anti-MMV Serums wurde jede Mischung einer Filtration, unter Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben, unterzogen.
Proben von Virus-beaufschlagtem Ausgangsmaterial, Konzentrat (verdünnt zum Originalvolumen) und Filtrat wurden nach dem Standard TCID50-Test wie in Beispiel 1 beschrieben titriert, mit dem Unterschied, daß A9-Zellen (ATCC CRL6319) für die Virusvermehrung verwendet wurden und eine Inkubationszeit von 7 Tagen gewählt wurde.
Wie aufgrund der Virusgröße (Durchmesser 18-24 nm) zu erwarten war, wurde MMV ohne Zugabe des Antiserums durch die 35 nm-Fil- termembran nicht zurückgehalten, sondern wurde zu 100% im Filtrat wiedergefunden (R.F.: -0,1). Nach Zugabe von 5 ml MMV-spezifischem Antiserym konnte die Virus-Infektiösität vollständig neutralisiert werden, so daß das Virus weder im Filtrat noch im Konzentrat nachgewiesen werden konnte. Aber auch bei Zugabe von nicht-neutralisierenden Konzentrationen des Antiserums (0,5 ml) wurde eine vollständige Entfernung des Virus durch die Filtration erreicht (R.F. >6,9), wobei kein Virus im Filtrat nachweisbar war. Noch niedrigere Konzentrationen des MMV-spezifischen Antiserums (0,05 ml) führten ebenfalls zu einer weitgehenden Entfernung des MMV durch die Filtration (R.F.: 4,4) (Tabelle 2).
Figure imgf000026_0001
Beispiel 3:
Abreicherung von HCV durch anti-HCV-Antikörper und anschließende
Nanofiltration
Die Möglichkeit, die Viruspassage des Hepatitis C-Virus (HCV) durch eine 35 nm-Filtermembran durch Zugabe eines HCV-spezifischen Antikörpers zur Virussuspension zu verhindern, wurde untersucht. Ein anti-HCV-Antikörper-freies Plasma, das mit HCV hochkontaminiert war, diente als Ausgangsmaterial für den hochtitrigen Virus-Stock. Etwa 250 ml Plasma wurden in einer
Beckmann-Zentrifuge (Rotor JA10) 20 min bei 10 000 rpm geklärt. Der Überstand wurde einer 2,5 stündigen Ultrazentrifugation bei 55 000 rpm in einem Ti 70-Rotor unterzogen. Nachdem das Pellet in PBS resuspendiert und gepoolt wurde (ca. 10 ml) wurde die HCV-Genom-Kopienzahl in einer quantitativen PCR-Analyse, wie von Dorner et al. ((1994), 25. Hämophilie-Symposium, ed. Scharrer & Schramm, S. 29-44) beschrieben, bestimmt.
95 ml einer 2%igen humanen Immunglobulin-Lösung wurden mit 2,5 ml des konzentrierten Virus-Stocks beaufschlagt. 5 ml einer 10%- igen humanen Immunglobulinlösung, die Antikörper gegen HCV aber keine HCV-Genom-Äquivalente enthielt (was durch quantitative PCR sichergestellt wurde) oder 5 ml PBS als Kontrolle wurden zugegeben. Beide Ansätze wurden einer Tangentialfluß-Filtration, unter Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben, unterzogen. In Proben des HCV-beaufschlagten Ausgangsmaterials, des Filtrates und des Konzentrates, das auf das ursprüngliche Volumen verdünnt wurde, wurden die HCV-Genkopienzahlen, wie oben beschrieben, ermittelt. Es konnte gezeigt werden, daß nach Zugabe von anti-HCV-spezifischem Immunglobulin durch Filtration über eine 35 nm-Membran eine vollkommene Virusentfernung aus dem Filtrat erreicht wurde (R.F.: >3,0), während im Kontrollansatz keine wesentliche Abreicherung des HCV erzielt werden konnte (R.F.: 1,4) (Tabelle 3).
Figure imgf000027_0001
B e i s p i e l 4 :
Abreicherung von HAV durch Immunglobulin-Lösungen mit unterschiedlichem anti-HAV-Antikörpertiter
Eine Reihe von verschiedenen Immunglobulin-haltigen Losungen (Lots) mit HAV-Antikörpertitern zwischen 1,5 Units/ml bis 11 Units/ml und als Kontrolle eine HSA-Losung, die keine HAV-spezifischen Antikörper enthielt, wurden mit hochtitrigem HAV beaufschlagt. Die Lösungen wurden anschließend, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit einem Gesamtvolumen von 250 ml einer Tangentialfluß-Filtration unterzogen und der Virustiter im Konzentrat und Filtrat bestimmt. Die Ergebnisse der HAV-Abreicherung sind in Tabelle 4 dargestellt.
Figure imgf000028_0001
* Der Reduktionsfaktor wurde entsprechend den CPMP-Richtlinien (CPMP/BWP/268/95) bestimmt.
Auch bei Immunglobulin-Lösungen mit geringerem HAV-Antikorpertiter ist ein Reduktionsfaktor von > 6 log-Stufen möglich. Mit einer Losung, die einen etwa 10-fach höheren Antikorpertiter aufweist, kann keine Verbesserung der Virusabreicherung erreicht werden. Daraus ergibt sich, daß unabhängig vom spezifischen Antikorpertiter zumindest innerhalb des getesteten Bereiches eine reproduzierbare Abreicherung von HAV möglich ist.
B e i s p i e l 5:
Virusabreicherungskapazität einer HAV-Antikörper-haltigen Lösung
Um die Abreicherungskapazität der Antikörper-haltigen Lösung zu testen, wurde das gemäß Beispiel 4 erhaltene Filtrat erneut mit HAV beaufschlagt und die Virusabreicherungskapazität der im Filtrat noch vorhandenen Antikörper bzw. der Reduktionsfaktor bestimmt.
In Tabelle 5 sind die Ergebnisse der HAV-Abreicherung in einem erneut beaufschlagten Filtrat aus einer niedrig- und hochtitrigen Immunglobulin-Lösung zusammengefaßt.
Figure imgf000029_0001
* Der Reduktionsfaktor wurde entsprechend den CPMP-Richtlinien (CPMP/BWP/268/95) bestimmt.
Es zeigt sich, daß auch bei einem Immunglobulin-haltigen Ausgangsmaterial mit geringem Antikorpertiter (1,5 U/ml) noch genügend Antikörper vorhanden ist und eine Abreicherung von nochmals mehr als 5 log-Stufen möglich ist. Die Virusabreicherungskapazität einer hochtitπgen Antikorperlösung ist demgegenüber nur un wesentlich erhöht.
Summiert man die Abreicherungsraten der 1. und 2. Virusbeaufschlagung, so kann eine Virusabreicherung mit einem Gesamt-Reduktionsfaktor von mindestens 11 log-Stufen erreicht werden.
B e i s p i e l 6 :
Abreicherung von Parvovirus mittels Anti-Parvovirus-Antikörperhaltigen Immunglobulin-Lösung
Eine Reihe von Immunglobulin-Präparationen (Lots) wurden auf Parvovirus B19-spezifische Antikörper getestet. In den verschiedenen Lots wurde mittels ELISA ein Antikorpertiter zwischen 1:400 bis 1:800 gefunden.
Zwei verschiedene Lots mit einem geringen B19-spezifischen Antikorpertiter von 1:400 wurden mit einem hochtitrigen Virusstock von Parvovirus B19 beaufschlagt und aus beiden Lösungen mittels quantitativer PCR der Titer bestimmt. Die Bestimmung mittels quantitativer PCR erfolgte gemäß der in der EP-0 714 988 beschriebenen Methode mit dem Parvovirus-spezifischen Primerpaar:
Parvo + 1353/FAM : 5' GGGGCAGCATGTGTTAAAGTGG 3' bp 1353-1374* Parvo-1529 : 5' CCTGCTACATCATTAAATGGAAAG 3' bp 1529-1506*
* Nummerierung gemäß der Mastersequenz PARPVBAU (EMBL-Datenbank)
Als Verifier wurde Plasmid pParvo-wt, enthaltend die Parvovirusspezifischen Sequenzen von nt 1127-1550 (gemäß der Nummerierung von Shade et al. (1986), J. Virol. 58:921) verwendet. Als interne Standards wurden Plasmid pParvo-15 und Plasmid pParvo+21 eingesetzt. pParvo-15 wurde durch Deletion eines 35 bp-Fragments zwischen nt 1455-1489 und Inserierung eines ds-Oligonukleotids generiert aus den Primern 5' GTT CCA GTA TAT GGC ATG GTT 3' und 5' ACC CAT GCC ATA TAC TGG AAC 3' hergestellt. pParvo+21 wurde durch Duplikation der bp 1468-1487 zwischen nt 1453 und 1454 erhalten. Die PCR-Produkte wiesen nach Amplifikation mit den Parvovirus-spezifischen Primern eine entsprechende Länge von 177 bp (wt), 162 bp (-15) oder 198 bp (+21) auf. Jede der Mischungen wurde einer Filtration, unter Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben, unterzogen. In Proben des Virusbeaufschlagten Ausgangsmaterials, des Konzentrats (verdünnt zum Originalvolumen) und des Filtrats wurde mittels einem quantitativen Nukleinsäureamplifikationsverfahren (PCR) der Titer bestimmt. Die Ergebnisse der Titerbestimmung sid in Tabelle 6 zusammenfaßt. Es wurde eine hervorragende Abreicherung von etwa 6 log-Stufen erreicht.
Figure imgf000031_0001
* Der Reduktionsfaktor wurde entsprechend den CPMP-Richtlinien (CPMP/BWP/268/95) bestimmt.
B e i s p i e l 7 :
Virusabreicherungskapazität der anti-Parvovirus Bl9-Antikörperhaltigen Lösung
Um die Abreicherungskapazität der Antikörper-haltigen Lösung zu testen, wurde das gemäß Beispiel 6 erhaltene Filtrat erneut mit Parvovirus beaufschlagt und die Virusabreicherungskapazität der im Filtrat noch vorhandenen Antikörper bzw. der Reduktionsfaktor bestimmt.
In Tabelle 7 sind die Ergebnisse der Parvovirus-Abreicherung in einem erneut beaufschlagten Filtrat einer Immunglobulin-haltigen Lösung mit einem 1:400-Antikörpertiter zusammengefaßt.
Figure imgf000032_0001
* Der Reduktionsfaktor wurde entsprechend den CPMP-Richtlinien (CPMP/BWP/268/95) bestimmt.
Es zeigt sich, daß im Filtrat noch genügend Antikörper vorhanden waren, um eine weitere Abreicherung um 5 log-Stufen zu erreichen. Summiert man die Abreicherungsrate und den Reduktionsfaktor nach der 1. und 2. Beaufschlagung, so wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Reduktionsfaktor von mindestens 11 log-Stufen erreicht, was einer vollständigen Entfernung der Pathogenen aus dem biologischen Material entspricht.
Daraus kann abgeleitet werden, daß das System für die industrielle Anwendung geeignet ist und sichert, daß Protein-haltige Lösungen frei von infektiösen Pathogenen erhalten werden können.
B e i s p i e l 8 :
Abreicherung von Parvovirus mit Filtern mit verschiedenen Ausschlußgrößen
In Beispiel 1 konnte gezeigt werden, daß schon durch Zugabe einer nicht-neutralisierenden Konzentratin von Antiserum und anschließender Nanofiltration über eine 35 nm-Membran eine vollständige Entfernung von Pathogen erreicht wird. Um zu testen, ob auch Filter mit einer höheren Ausschlußgröße für die Abreicherung der Antigen-Antikörper-Kompleκe geeignet sind, wurden eine Reihe von Tiefenfiltern mit einer nominalen Ausschlußgröße zwischen 0,04 μm und 3 μm, auf ihre Fähigkeit, Parvovirus MMV
"minute mouse virus" zurückzuhalten, getestet. 196 ml einer 2%igen IgG-Lösung wurden mit 4 ml einer MM-Virustiterpräparation beaufschlagt und anschließend mit 1 ml Kaninchen-anti-MMV-Serum versetzt. Als Kontrolle wurde eine beaufschlagte GammaglobulinLösung ohne spezifisches anti-MMV-Serum eingesetzt. Die Mischungen wurden über verschiedene Tiefenfilter mit einer nominalen Ausschlußgröße von 3 μm, 0,5 μm, 0,3 μm und 0,04 μm mit einer Durchflußrate von 50 ml/min bis zum Endpunkt filtriert. Der Virustiter wurde sowohl im Ausgangsmaterial als auch im Filtrat bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefaßt.
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Es zeigte sich, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren noch mit Filtern mit einer Ausschlußgröße von 3 μm eine Abreicherung um mehr als 5 log-Stufen möglich ist, während ohne Zugabe eines Liganden, der die Pathogene komplexiert, nur mit einem Filter mit etwa 0,4 μm ein signifikanter Reduktionsfaktor erreicht wurde.
Beispiel 9 :
Effekt von Rheumafaktor auf die Abreicherung von Poliovirus
Um den Einfluß der Zugabe von Agglutininen, die die Größe des Komplexes erhöhen können, auf die Effizienz der Abreicherung zu testen, wurde Rheumafaktor als Agglutinin bzw. Conglutinin der beaufschlagten Immunglobulin-Lösung zugesetzt. 85 ml einer
2%igen Immunglobulin-Lösung wurden mit 5 ml einer hochtitrigen Poliovirus Typ 1-haltigen Präparation beaufschlagt. 10 ml einer Präparation, enthaltend humanen Rheumafaktor mit einem Titer von 800 U/ml, wurden zu der Mischung gegeben. Als Kontrolle wurden anstatt des Rheumafaktors 10 ml Puffer zugesetzt. Beide Mischungen wurden über eine 35 N-Membran, wie in Beispiel 1 beschrieben, filtriert und der Virustiter im Konzentrat und Filtrat bestimmt. Die Virustiterbestimmung erfolgte durch eine TCID50-Bestimmung auf VERO-Zellen.
Die Resultate der Bestimmung sowie der ermittelte Reduktionsfaktor mit und ohne Zugabe von Rheumafaktor sind in Tabelle 9 dargestellt.
Tabelle 9: Effekt von Rheumafaktor auf die Abreicherung von
Poliovirus aus einer Immunglobulin-Lösung und Nano- filtration
Figure imgf000036_0001
Die Resultate zeigen, daß Rheumafaktor in Kombination mit dem spezifischen anti-Poliovirus-Antikörper das Virus so komplexiert, daß es effektiv durch Nanfiltration über einen 35 N-Filter zurückgehalten werden kann. Wird kein weiteres Agglutinationsmittel (Rheumafaktor) zugesetzt, so wird eine Virusabreicherung mit einem Reduktionsfaktor von 3,1 log-Stufen erreicht, der durch die Anwesenheit des Rheumafaktors auf einen Reduktionsfaktor von >7,6 erhöht werden kann. Damit ist erstmals eine effektive und im wesentlichen vollständige Abtrennung von kleinen, nicht-umhüllten Viren aus einer Proteinlösung möglich.
Beispiel 10 :
Effekt von Agglutininen bzw. Conglutininen auf die Abreicherung von Poliovirus mittels konventioneller Tiefenfiltration
Die Fähigkeit von Rheumafaktor, die Abreicherung von hochtitri- gem Poliovirus bei Verwendung von konventionellen Tiefenfiltern zu beeinflussen, wurde bestimmt. Dabei wurde ein Filtertyp verwendet, der sich als ineffektiv bei der Abreicherung von Poliovirus - selbst in Gegenwart von Poliovirus-spezifischen Antikörpern - erwiesen hatte, dazu wurden 85 ml einer 2%igen Gammagio bulin-Lösung mit 5 ml einer hochtitrigen Poliovirus-Stocklösung beaufschlagt und 10 ml einer Lösung von Rheumafaktor mit einem Titer von 800 Units/ml zugegeben. Als Kontrolle wurden anstatt Rheumafaktor 10 ml Puffer zugesetzt. Beide Mischungen wurden durch einen Seitz BKS-P-Tiefenfilter mit einer Durchflußrate von 50 ml/min filtriert. Der Virustiter wurde im Ausgangsmaterial vor und nach der Filtration bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 zusammengefaßt. Es zeigte sich, daß nur durch die Zugabe eines weiteren Aggregationsmittels, wie etwa Rheumafaktor, Poliovirus bei Verwendung eines konventionellen Tiefenfilters effizient abgereichert werden konnte. Dieses Verfahren resultiert in einer Abreicherung mit einem Reduktionsfaktor von > 7,7 log-Stufen, während ohne Zugabe von Rheumafaktor lediglich eine Reduktion von etwa 1,1 log-Stufen erreicht wurde. Dies zeigt deutlich, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren bei Zugabe von Lektinen oder Lektin-ähnlichen Proteinen, wie Conglutinine - auch bei Verwendung von konventionellen Tiefenfiltern - eine im wesentlichen vollständige Abtrennung der Pathogene erzielt wird.
Figure imgf000037_0001
Beispiel 11 :
Bestimmung der Aktivität von Faktor VIII und vWF vor und nach Virusabreicherung
Die Aktivität zweier Plasmafaktor wurde vor und nach Virusabreicherung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt. Dazu wurden 100 ml einer Faktor VIII/vWF-Komplex-haltigen Lösung durch ein Cuomo ZA 90-Tiefenfilter mit einer Durchflußrate von 50 ml/min gefiltert. In Proben des Ausgangsmaterials und des Filtrats wurden die Faktor VIII-Aktivität und der vWF-Antigengehalt bestimmt und eine vWF-Multimeranalyse durchgeführt. In einem Parallelexperiment wurde das gleiche Material mit Parvovirus "mouse minute virus" (MMV) beaufschlagt und spezifisches anti- MMV-Antiserum vor der Filtration zugesetzt. Der Virustiter wurde vor und nach Filtration im Ausgangsmaterial und im Filtrat bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammenfaßt und zeigen, daß unter diesen Bedingungen eine Abreicherung um > 6,5 log-Stufen erreicht wird. Die Faktor VIII-Aktivität bzw. der vWF-Antigengehalt bleiben durch das Verfahren im wesentlichen unbeeinflußt. Ebenso konnte gezeigt werden, daß das vWF-Multi- mer-Pattern im wesentlichen unverändert erhalten bleibt (Daten nicht gezeigt).
Figure imgf000038_0001
Beispiel 12 :
Bestimmung der Aktivität von Blutfaktoren aus einem Kryoüberstand nach Filtration
Ein Kryoüberstand von humanem Plasma wurde mit einer hochtitrigen Poliovirus-Präparation gespiked und einer Tiefenfiltration mit einer Durchflußrate von 50 ml/min unterzogen. Die Aktivitäten von Faktor VII, Faktor IX, Antithrombin III (ATIII) und Cl- Esterase-Inhibitor wurden vor und nach der Filtration bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengefaßt und zeigen, daß durch das beschriebene Verfahren eine Virus-Abreicherung von > 7 log-Stufen erreicht wird und die Aktivität der Blutfaktoren un- beeinträchtigt ist.
Figure imgf000039_0001

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e :
1. Biologisches Material frei von bestimmten Pathogenen, dadurch gewonnen, daß ein in einem biologischen Material enthaltener Ligand oder Rezeptor mit einem Rezeptor oder Liganden eines bestimmten Pathogens reagiert, wodurch ein Ligand/Rezeptor-Komplex entsteht, und Abtrennen des Ligand/-Rezeptor-Komplexes durch ein Verfahren, das die teilweise oder vollständige Abtrennung des komplexierten Pathogens vom biologischen Material erlaubt.
2. Biologisches Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein biologisches Material mit mindestens einem Liganden oder Rezeptor, der mit einem Rezeptor oder Liganden des bestimmten Pathogens reagiert, versetzt wird.
3. Biologisches Material nach Anspruch 1 oder 2, dadurch erhältlich, daß als Ligand oder Rezeptor, der mit einem Liganden oder Rezeptor des Pathogens reagiert, ein Antikörper eingesetzt wird, und der Ligand oder Rezeptor des Pathogens ein Antigen ist, wodurch ein Antikörper/Antigen-Komplex als Ligand/Rezeptor- Komplex entsteht.
4. Biologisches Material nach Anspruch 1 bis 3, dadurch erhältlich, daß das Abtrennen des Ligand/Rezeptor-Komplexes durch Penetrieren durchlässiger Filter erfolgt.
5. Biologisches Material nach Anspruch 1 bis 3, dadurch erhältlich, daß das Abtrennen des Ligand/Rezeptor-Komplexes durch Sedimentation erfolgt.
6. Biologisches Material nach Anspruch 5, dadurch erhältlich, daß die Sedimentation des Ligand/Rezeptor-Komplexes durch
Dichte-Gradientenzentrifugation erfolgt.
7. Biologisches Material nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch erhältlich, daß zur Verbesserung der Abtrennung des Ligand/Rezeptor-Komplexes eine weitere Aggregation des Komplexes durch ein Agglutinin, insbesondere ein Lektin, eine Komplement- Komponente, ein Conglutinin, ein Rheumafaktor oder ein nichttoxisches, wasserlösliches, synthetisches Polymer, insbesondere Polyethylenglykol, erfolgt.
8. Biologisches Material nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sicher frei ist von viralen und molekularen Pathogenen sowie von Aggregaten oder Komplexen der Pathogene.
9. Biologisches Material nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das virale Pathogen ein HAV, HBV, HCV, HIV, HEV, HDV, HGV, CMV und/oder Parvovirus ist.
10. Biologisches Material nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es anti-HAV-, anti-HCV-, anti-HBV und/oder anti-Parvovirus spezifische Antikörper enthält.
11. Biologisches Material nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Plasmafraktion, eine Plasmaprotein-haltige Fraktion enthaltend Blutfaktoren wie etwa Faktor
11, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI, Protein C, Protein S, vWF, ein Konzentrat enthaltend einen der genannten Blutfaktoren, eine Immunglobulin-haltige Plasmafraktion oder ein Überstand einer Hybridoma-Zellinie, ein Zellkulturüberstand von transformierten oder infizierten Säugerzellen oder ein Extrakt eines tierischen oder humanen Gewebes ist.
12. Verfahren zur Abreicherung von viralen und molekularen
Pathogenen und Gewinnen von biologischem Material, das sicher pathogenfrei ist, dadurch gekennzeichnet, daß ein in einem biologischen Material enthaltener Rezeptor oder Ligand mit einem Rezeptor oder Liganden eines Pathogens reagiert, wodurch gegebenenfalls ein Ligand/Rezeptor-Komplex eines komplexierten Pathogens entsteht, und gegebenenfalls Abtrennen des Ligand/Rezeptor- Komplexes durch ein Verfahren, das die teilweise oder vollständige Abtrennung des komplexierten Pathogens vom biologischen Material erlaubt und Gewinnen eines pathogenfreien biologischen Materials.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß ein biologisches Material mit mindestens einem Liganden oder Rezeptor, der mit einem Rezeptor oder Liganden des bestimmten Pathogens reagiert, versetzt wird, wodurch gegebenenfalls ein Ligand/ Rezeptor-Komplex entsteht.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand/Rezeptor-Komplex eine höhere Dichte oder höheren Sedimentationskoeffizienten aufweist als das freie Pathogen.
15. Verfahren nach Anspruch 12 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand/Rezeptor-Komplex eine höhere Aggregierung aufweist als das freie Pathogen.
16. Verfahren nach Anspruch 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Abtrennen des Ligand/Rezeptor-Komplexes durch Penetrieren eines durchlässigen Filters erfolgt.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand/Rezeptor-Komplex selektiv vom durchlässigen Filter zurückgehalten wird.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß als durchlässiger Filter ein Nanofilter eingesetzt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß als durchlässiger Filter ein Tiefenfilter eingesetzt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 12 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Abtrennen des Ligand/Rezeptor-Komplexes durch Sedimentation erfolgt.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Sedimentation des Komplexes durch Dichte-Gradientenzentrifugation erfolgt.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand oder Rezeptor des Pathogens, ein Antigen, ein Epitop oder eine antigene Determinante ist.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der mit dem Liganden oder Rezeptor des Pathogens reagierende Ligand oder Rezeptor ein Agglutinin, ein Antikörper, ein Fragment eines Antikörpers oder ein noch bindungsfähiger Teil eines Antikörpers ist.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand/Rezeptor-Komplex ein Antikörper/- Antigen-Komplex ist.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß durch Anwesenheit eines Agglutinationsmittels, insbesondere eines Lektins, wie etwa Concanavalin A, Ricin oder Phasin, oder von Komplement-Komponenten, von Conglutinin, von Rheumafaktor, einem nicht-toxischen, wasserlöslichen, synthetischen Polymer, wie etwa Polyethylenglykol, oder Albumin eine weitere Aggregierung des Komplexes erfolgt.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß durch die weitere Aggregation eine höhere Komplexdichte erreicht wird, wodurch der Komplex mit verbesserter Effizienz aus dem biologischen Material entfernt wird.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß das virale oder molekulare Pathogen ausgewählt ist aus der Gruppe der Lipid-umhüllten Viren, der nicht Lipidumhüllten Viren oder der Prionen.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Pathogen ein HAV, HBV, HCV, HIV, HEV, HDV, HGV, CMV, Parvovirus etc. ist.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß als Ligand ein Antikörper, erhalten aus einer Hyperimmunglobulin-Lösung oder einem Überstand einer Hybridoma- Zellinie, eingesetzt wird.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper einem Virusinaktivierungs- und/oder Virusabreiche rungsverfahren unterzogen wird und der Antikörper gegebenenfalls angereichert und als Ligand eingesetzt wird.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein anti-ß-Amyloid-Antikörper ist.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit einem Prion reagiert und einen Komplex bildet.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein HAV-, HBV-, HCV-, HDV-, CMV- , HIV-, HGV-, HEV- oder Parvovirus-spezifischer Antikörper ist.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Material eine Plasmafraktion, eine Plasmaprotein-haltige Fraktion enthaltend Blutfaktoren wie etwa Faktor II, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI, Protein C, Protein S, vWF, ein Konzentrat enthaltend einen der genannten Blutfaktoren, eine Immunglobulin-haltige Plasmafraktion oder ein Überstand einer Hybridoma-Zellinie, ein Zellkulturüberstand von transformierten oder infizierten Säugerzellen oder ein Extrakt eines tierischen oder humanen Gewebes ist.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Material hochmolekulare Proteine mit einem Molekulargewicht >150 kD enthält.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Material den durchlässigen Filter frei passiert und der Ligand/Rezeptor-Komplex zurückgehalten wird.
37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das gewonnene biologische Material auf die Anwesenheit eines Liganden, insbesondere eines Antikörpers, getestet wird.
38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß dem biologischen Material eine bekannte Menge eines bestimmten viralen oder molekularen Pathogens, der spezifische Liganden oder Rezeptoren für den Antikörper besitzt, zugesetzt wird, das biologische Material enthaltend den Antikörper/Pathogen-Komplex erneut über einen durchlässigen Filter gefiltert wird und die Restmenge an Pathogen im Filtrat bestimmt wird.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß ein virusentferntes biologisches Material gewonnen wird, das sicher frei ist von Zielviren, wobei ein Reduktionsfaktor von mindestens 7 log-Stufen erreicht wird.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß die vollständige Abtrennung des Pathogens aus dem biologischen Material durch Bestimmung der Abreicherungsrate, insbesondere durch die Bestimmung der Genom-Äquivalente des Pathogens, erfolgt.
41. Virusinaktivierte Immunglobulin-Lösung zur Verwendung als Ligand in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 40.
42. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 12 bis 40 zur Herstellung eines biologischen Materials, das sicher frei von bestimmten Pathogenen sowie frei von Aggregaten oder Komplexen eines Pathogens ist.
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