FI116839B - Menetelmä virusturvallisen immunoglobuliinin valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä virusturvallisen immunoglobuliinin valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI116839B FI116839B FI20040145A FI20040145A FI116839B FI 116839 B FI116839 B FI 116839B FI 20040145 A FI20040145 A FI 20040145A FI 20040145 A FI20040145 A FI 20040145A FI 116839 B FI116839 B FI 116839B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- immunoglobulin
- solution
- virus
- protein
- filter
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Menetelmä virusturvallisen immunoglobuliinin valmistamiseksi
Esillä oleva keksintö liittyy immunoglobuliinien valmistukseen. Etenkin e; keksintö koskee sellaisen virusturvallisen immunoglobuliinikoostumuksen 5 joka koostumus sopii esim. parenteraaliseen annosteluun. Lisäksi keksintö virusturvallisia immunoglobuliinikoostumuksia ja immunoglobuliiniliuosti menetelmää, jossa käytetään nanosuodatusta.
Immunoglobuliineja eli vasta-aineita voidaan eristää veren plasmasta ja tu< 10 teknologialla ja rekombinantti-DN A-teknologialla. Laaja-alaisen biologise ansiosta immunoglobuliinit ovat arvokkaita terapeuttisia aineita.
Erilaisia vakavia sairauksia voidaan hoitaa ihmisen normaalista plasmasta immunoglobuliinilla suonensisäisesti annosteltuna. Farmaseuttista tuotetta 15 ’’suonensisäiseksi immunoglobuliiniksi” (ihmisperäinen suonensisäinen im tai normaali ihmisperäinen suonensisäisesti annosteltava immunoglobuliin jälkeen käytetään tässä kotimaista lyhennettä ”IVIG”. Johtuen suurista suo annoksista IVIG-tuotteiden turvallisuutta ja siedettävyyttä on tarkkailtava ( huolellisesti.
: 20 *·· * IVIG-tuotteiden vakavat haittavaikutukset on liitetty immunoglobuliinien £ muihin kontaminoiviin proteiineihin ja verivälitteisiin viruksiin. Immunogl «Il
polymeerit ja aggregaatit aktivoivat komplementinpa niiden poistaminen I
i on tärkeää. Luovutetun veren ja plasman virusmarkkereiden seulonta ja teh «a« • «
' · * · * 25 virusinaktivointimenetelmien käyttöönotto ovat parantaneet nykyisten IVK
turvallisuutta tuntuvasti. Virus tartuntariski on kuitenkin edelleen olemassa • ♦ * · · *l\/ erityisesti fysikaaliskemiallisesti resistantteja viruksia, kuten parvovirus B ] * * *·· nvstvtii tphnlfli-aacti innlrHvmmiian nvlrvicillä vinieinalrriwunti 2 annosteluun liittyvistä haittavaikutuksista. Tämän vuoksi yksittäiset valmisi liittäneet valmistukseen lisävaiheita, jotta aggregaatit ja muut kontaminanti poistettua ja virukset inakti voitua. Usean vaiheen lisääminen valmistukseer kuitenkin immunoglobuliinin saannon vähentymiseen ja lisää valniistuskusi 5 Samanaikaisesti IVIG-tuotteiden kasvava kysyntä on tehnyt saannosta kriitt
Nykyisin käytettävät virusinaktivointimenetelmät tehoavat lipidivaipallisiir mutta kuten edellä on esitetty, ne eivät inaktivoi vaipattomia viruksia, kutei hepatiitti-A-virusta. Ajatellen mahdollisten fysikaaliskemiallisesti resistantl 10 kuten parvoviruksen B19, esiintyvyyttä lähtöplasmassa (Schmidt et ai., Vo) 235,2001) valmistusmenetelmän pitäisi pystyä pienentämään vaipattomien erittäin suurta määrää, jotta tuloksena olisi todella virukseton tuote. Nykyisi valmistusmenetelmät eivät täytä tätä vaatimusta ja IVIG-tuotteet saattavat l· parvovirusta (Hayakaxa et ai., Br J Haematol. 118, 1187-1189, 2002).
15
Alalla on joitakin tunnettuja prosesseja, joilla voidaan tuottaa puhdistettua £ immunoglobuliinia. US-patentit 5 886154 ja 6 307 028 julkistavat aloitusli suurisaantoisen valmistusmenetelmän puhdistetulle, viraalisesti inaktiivisen ainevalmisteelle. Mainitulla menetelmällä on kuitenkin vain rajallinen kyky • « :.j : 20 fysikaaliskemiallisesti resistenttejä infektion aiheuttajia.
* ««·«
: Kansainvälinen hakemusjulkaisu WO 99/64462 liittyy immunoglobuliini G
***** * * · · * prosessiin, jossa immunoglobuliinia puhdistetaan sitä sisältävän plasmaprot • « « raakafraktiosta. Tunnetun prosessin vaiheissa käytetään kahdesti Saijaan kyl * « ***** 25 anioninvaihtokromatografiaa ja kationinvaihtokromatograiiaa. Ennen kromi . e proteiinisaostuma lisätään immunoglobuliinisuspensioon. Virusinaktivointi • · · ' * *, · S/D-käsittely llä.
* · * ♦ ·♦* * 3 pitää virusturvallisena. Lisäksi on yleistä, että mitä tehokkaampi viruksenj sitä pienempi kokonaissaanto prosessista saadaan.
Nanosuodatus (viruksenpoistosuodatus) on tehokas keino vaipattomien vii 5 miseen biologisesti aktiivisten proteiinien liuoksista. US-patenteissamme ( 6 326 473 kuvaamme prosessia, jota käytetään virusturvallisen apotransfei miseen ja joka sisältää mm. nanosuodatusvaiheen suodattimena, jonka kes reikäkoko on 10 - 30 nm. Olemme kuitenkin havainneet, että immunoglob vaikea suodattaa nanosuodattimella, koska suodatin tukkeutuu nopeasti.
10
Esillä olevan keksinnön yksi tavoite on välttää ainakin joitakin edellä mail ongelmista ja saada aikaan uusi, saantorikas immunoglobuliinin valmistus] voidaan tuottaa immunoglobuliinia, joka ei sisällä aggregaatteja ja viruksii 15 Keksinnön toinen tavoite on tarjota uusia, virusvapaita immunoglobuliinik
Keksinnön kolmas tavoite on tarjota uusi immunoglobuliiniliuosten pulidi: jossa hyödynnetään nanosuodatusta.
« · •t| · 20 Esitetty keksintö perustuu havaintoon, että aggregoituneita proteiineja ja v ,. I: * tehokkaasti saostaa, vaikka monomeerinen immunoglobuliini pidetään liut käyttämällä menetelmää, joka sisältää käsittelyvaiheen, jossa käytetään pk *** proteiinisakkaa tai adsorbenttia ja joka vaihe yhdistetään toiseen vaiheesee • » m • * · ϊ käsitellään kapryylihapolla. Proteiinisakka- tai adsorbenttivaiheenjakapry * · * * * · * 25 käsittelyn yhteisvaikutuksen ansiosta saadaan aikaan mm. tehokas virusten
Jos käytettäisiin esimerkiksi pelkästään proteiinin saostajaa, kuten polyety] • * · tarvittaisiin suurempi pitoisuus tehokkaaseen virusten poistamiseen, mikä1 * i *** immiinnolnhiiliinm cAnntna 4 C. immunoglobuliini puhdistetaan anioninvaihtokromatografi D. aggregaattivapaa immunoglobuliiniliuos suodatetaan viruk suodattimella.
5 Vaiheet B ja C voidaan suorittaa valinnaisessa järjestyksessä kuitenkin siter suoritetaan vaiheen A jälkeen ja ennen vaihetta D.
Edellä esitettyjen prosessointivaiheiden tuloksena saadaan virusvapaata imr liuosta, missä ei ole havaittavia määriä polymeerejä tai aggregaatteja. Liuos 10 konvertoida immunoglobuliinikoostumukseksi, joka sisältää suuria immune määriä (immunoglobuliinipitoisuuteen 250 g/1 asti). Lisäksi käsittelyvaiheis yllättäen immunoglobuliiniliuos, joka voidaan suodattaa viruksenpoistosuot käyttämällä suurta immunoglobuliinimäärää suodatuksen virtauksen pysyes voimakkaana.
15 Täsmällisemmin sanottuna esillä olevan keksinnön mukaiselle menetelmälli sesti tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkk
Immunoglobuliinikoostumukselle on tunnusomaista se, mikä on esitetty pat . 20 sen 16 tunnusmerkkiosassa, ja suodatusmenetelmä se, mikä on esitetty patei "V 17 tunnusmerkkiosassa.
• «* **#·
Esitetyllä keksinnöllä saavutetaan huomattavia etuja. Esillä olevan keksinne • · menetelmällä voidaan siis valmistaa virusvapaata immunoglobuliiniliuosta: * ]···. 25 ihmisplasmasta saatava saanto säilyy suurena. Tämä perustuu yhdistelmään.
• ^ * kapryylihapolla tehtävän viruksen inaktivointivaiheen ja kaksi viruksenpoisi : missä kummallakin vaiheella voidaan poistaa jopa fysikaaliskemiallisesti re: ** 9 * • “ ·. viruksia. Näistä ensimmäinen viruksenpoistovaihe poistaa myös aggregoitui • · # 5
Usean vaiheen hyödyntäminen ja jopa fysikaaliskemiallisesti resistanttier poistaminen muodostavat suuren eron esillä olevan keksinnön prosessin j 5 886 154 ja 6 307 028 kuvaamien prosessien välille.
5 Keksintöä ryhdytään seuraavassa lähemmin tarkastelemaan yksityiskohta avulla muutamaan sovellutusesimerkkiin viitaten.
Kuviossa 1 on esitetty esillä olevan menetelmän edullinen sovellutusmuo 10 Esitetyn keksinnön yhteydessä termillä ”immunoglobuliini” tarkoitetaan -ryhmän monoklonaalisia tai polyklonaalisia immunoglobuliineja. Seuraa keksintöä yksityiskohtaisemmin käyttäen esimerkkinä ihmisperäistä poly] IgG:tä. Keksintö soveltuu kuitenkin myös muille polyklonaalisille ja mor vasta-aineille, joita voidaan tarvittaessa muunnella huomioiden immimog 15 alkuperä ja terapeuttinen käyttötarkoitus.
Esitettyä menetelmää voidaan käyttää tuotettaessa virusturvallista immun muista immunoglobuliinin lähteistä kuin plasmasta. Sitä voidaan soveltaa eläinsoluviljelmistä ja siirtogeenisista eläimistä peräisin olevien immunoj 20 tuottamiseen.
* · · • · · ··· · ****, Kuten edellä on kuvattu, esillä oleva keksintö käsittää yleensä neljä täikei ... ensimmäisen menetelmävaiheen aikana immunoglobuliinin raakaliuosta j • » "kapryylihappokäsittelyyn pH:n ollessa pienempi kuin 5 ja edullisesti 4,0 -25 happokäsittelyn seurauksena vaipalliset virukset inaktivoituvat. Kapryylil ♦ jälkeen supematanttiliuos sisältää mahdollisia vaipattomia viruksia ja joit : , aggregaatteja, jotka ovat peräisin lähtöaineesta ja ensimmäisistä prosesso: f*· *
. · · \ poistetaan käyttämällä proteiinin saostajaa, kuten polyetyleeniglykolia (P
6 suodatus. Virusvapaa immunoglobuliiniliuos konsentroidaan ja diasuodatet ultrasuodatusta. Näin saatu immunoglobuliiniliuos on stabiili sen jälkeen, k loidaan nestemuotoon tai pakastekuivatetaan jauheeksi.
5 Menetelmän päävaiheet esitetään myös kuvion 1 sovellutuksessa. Prosessi; maila tislattuun veteen tai vesipuskuriin saostunutta immunoglobuliinia, ku fraktioiden II+III massaa. Fraktioiden II+III massa, joka ei sisällä suodatuk kannattaa liuottaa 8-kertaiseeen tilavuuteen vettä (w/v), vaikka suurempiak voidaan käyttää. Suspension pH säädetään pienempään arvoon kuin 5, edul 10 arvoon 4,8 (esim. 0,2 mol/1 etikkahapolla). Suspensio sekoitetaan noin 5°C kunnes immunoglobuliini on liuennut, minkä jälkeen liuos lämmitetään 20-Kapryylihappoa lisätään hitaasti lopulliseen pitoisuuteen, joka on 15-60 mi edullisesti 20-50 mmol/1. Suspensiota sekoitetaan käsittelyn aikana. Perusi inaktivoitumisen arviointiin, erään edullisen sovellutuksen mukaisesti, kapi 15 vastaava kaprylaattisuola) lisätään kokonaisuudessaan aikavälillä, joka kest minuutista 2 tuntiin. Kokonaiskäsittelyn aika kapryylihapolla kestää 15 min tuntiin. Pidempiä inkubaatioaikoja (esim. noin 16 tuntiin saakka) voidaan k tämän seurauksena saanto jää jonkin verran pienemmäksi. Saostuneet prote poistetaan sentrifugoimalla tai suodattamalla.
: 20 n# « „*·* Aggregoituneiden proteiinien ja virusten poistamiseksi, liuoksen pH nosteta tai suuremmaksi, edullisesti noin arvoon 5,4. Polyetyleeniglykolia lisätään j joka on 10-50 g/1, edullisesti 20-40 g/1 ja erityisesti noin 30 g/1. Suurempie; ..i: pitoisuuksien käyttö vähentää immunoglobuliinin saantoa, kun taas pieneni] • * ***** 25 pitoisuuksien käyttö vähentää virusten ja aggregaattien poistumista. Käytett molekyylipaino on yleensä 3 000-8 000 Da, ja erityisen edullisesti se on 3 : « t i
Alla esitetyissä esimerkeissä on käytetty PEG 4 000:ää. PEG-käsittelyn aika # · *·;** riippuen PEG:n pitoisuudesta ja lähtöaineen laadusta. Tyypillisesti PEG-käi 7 selektiivisesti ne erottavat proteiiniepäpuhtauksia niin, että samalla IgG:n s suurena ja IgG:n alaluokkakoostumus säilyy. Riittävä puhdistus saavutetaa käyttämällä ANX Sepharose FF -geeliä. Pylväästä läpivirrannut IgG:tä sisä otetaan talteen. IgA jää kolonniin, ja se voidaan eluoida lisäämällä eluointi] 5 konduktiivisuutta natriumkloridilla. Ulos virtaavan nesteen pH säädetään e arvojen 4,2 ja 5,0 välille.
Anioninvaihtohartsi voi perustua erilaisten materiaalien käytölle siten, että massa että siihen liittyneet varautuneet ryhmät otetaan huomioon. Voidaan 10 käyttää agaroosi-, selluloosa-, dekstraani- tai silikapohjaisia massoja tai syi polymeereihin perustuvia massoja, joiden materiaalit voivat olla suuremma pienemmältä osaltaan silloitettuja. Kovalenttisesti massaan sitoutuneita, va ryhmiä voivat olla esim. dietyyliminopropyyli (ANX), dietyyliaminoetyyli kvatemaarinen aminoetyyli (QAE) ja/tai kvatemaarinen ammonium (Q). K 15 anioninvaihtohartsia tai useampia hartseja voidaan yhdistää.
Näin saatu aggregaateista vapaa immunoglobuliiniliuos suodatetaan viruks suodattimella. On edullista käyttää suodatinta, joka kykenee tehokkaasti po pieniä vaipattomia viruksia, kuten parvoviruksia. ’Tehokkaasti viruksia po • * i, * : 20 tarkoittaa tässä käytettynä virustiitterin vähentymistä ainakin 3 log-yksiköll ..I:* edullisimmin noin 4 log-yksiköllä tai enemmän. ’’Aggregaateista vapaa liu( * ·«* * * * liuokseen, joka ei sisällä havaittavia määriä proteiinipolymeerejä tai aggreg • ·· • · * * * * * määritys tehdään geelisuodatuskromatograiialla.
*·* «·« *···* 25 Virussuodatettu liuos konsentroidaan ultrasuodatuksella. Polyetyleeniglyko , # vähennetään diasuodatuksen avulla niin paljon, että sen pitoisuus lopullises • · » • · · globuliiniliuoksessa on pienempi kuin 2 g/1. Suurin osa polyetyleeniglykoli; • · « * V nltraciijvfatiilfQAlla vailrlrn iotiVin vprran ΡΡ/τίλ iää cpn rr 8 vähintään 98 % vyöhyke-elektroforeesilla analysoituna eikä sisällä havaitu polymeerejä tai aggregaatteja geelisuodatuskromatografialla analysoituna. Geelisuodatuskromatografian detektioraja on noin 0,1 p-%.
5 Yllättävä hyöty, joka saadaan yhdistämällä kapryylihappokäsittely ja saosu proteiinin saostajalla, on se, että aggregoituneiden proteiinien ja virusten m tehokkaasti. Aggregoituneiden proteiinien määrä vähenee niin paljon, että i vaihtokromatografisen puhdistuksen jälkeen immunoglobuliiniliuos voidaa pienireikäisen virussuodattimen läpi suurella kapasiteetilla. Aggregaattien ] 10 välttämätön esitoimenpide, j otta immunoglobuliiniliuos voidaan suodattaa' timen läpi tehokkaasti, koska proteiiniaggregaatit tukkivat suodattimen reiä seurauksena virtaus heikkenee ja virukset poistuvat huonommin (Hirasaki < 20, 135 - 142,1995). Intaktien immunoglobuliinien suodattaminen pienire viruksenpoistosuodattimien läpi tehokkaasti on ollut mahdotonta näihin päi 15 reikäkoko” tarkoittaa tässä sitä, että suodatinkalvo poistaa vähintään 3 log-; sista, joiden partikkelikoko on noin 20 nm, kuten parvoviruksen. ’’Tehokas tarkoittaa tässä sitä, että vähintään 5 kg immunoglobuliinia voidaan johtaa pinta-alan läpi siten, että suodatinvirtaus heikkenee vähemmän kuin 50 %. listaa kustannustehokkaan virussuodatuksen teollisuusmittakaavassa. Virus • * : 20 reikäisellä viruksenpoistosuodattimella on hyödyllinen valmistusvaihe, kosi virusten lisäksi se poistaa myös fysikaaliskemiallisesti resistantteja infektoi « * · kuten prioneja.
• · • · ·*«·’ Esimerkissä 3 kuvataan erityisen aggregaatinpoistovaiheen tärkeyttä onnisti • * *···* 25 virussuodatukselle. Esitetty keksintö yhdistää virussuodatusvaiheeseen pol> glykolisaostusvaiheen ja käsittää siten kaksi tehokasta vaihetta resistanttien • · » virusten poistamiseksi. Tätä kuvataan esimerkissä 2.
• · • » 9 1 vähintään 7,5 kg immunoglobuliinia voidaan johtaa 1 m2:n suodatinalan iä suodatinvirtaus heikkenee alle 70 % ja erityisesti, se heikkenee alle 50 %.
Esillä olevan keksinnön käyttötarkoitusta varten voidaan laskea viruksenpc 5 keskimääräinen reikäkoko perustuen Hagen-Poiseullen kaavaan, missä san lieriömäisten reikien yhtenäinen jakautuminen oletetaan vakioksi.
D» = 2.0 x (Jdn/ΔΡα)10 missä 10 Dav[nm] keskimääräinen reikäkoki J [ml/min/m2] veden virtausnopeus (virt d [pm] seinämän paksuus η [senttipoisi] veden viskositeetti ΔΡ [mmHg] suodatuspaine 15 a[-] huokoisuus
Yleisesti ottaen voidaan hyödyntää mitä tahansa viraksenpoistosuodatinta, reikäkoko tai vastaava viruksenpoistotehokkuus. Olemme havainneet, että tuloksia saavutetaan käyttämällä sen tapaista yhdyssuodatinta, joka on esite * * :·: : 20 patentissa 5 096 637 (jonka sisältö liitetään tähän viitteen omaisesti). Tällai ...: suodattimilla on tyypillisesti epäsymmetrinen yhdyskalvorakenne. Niissä o * * ominaisuudet omaava pintakerros, huokoinen substraatti ja pintakerroksen ***** * ·** * väliin jäävä huokoinen väli vyöhyke.
««« • · * * * 25 Suodattimia, joita voidaan käyttää virussuodatukseen esitetyn keksinnön m . . Viresolve NFP (Millipore), Planova 15N ja 20N (Asahi Kasei) sekä DV20 • · · • ♦ · rajoittumatta kuitenkaan näihin esimerkkeihin.
• S ··♦ ίο uudelleen pH-arvossa 4.2. Edullinen pH vaihtelee arvojen 4,2 ja 5,0 välilli tavan immunoglobuliinin mukaan.
Suodatus tehdään edullisesti 20-50 °C:n lämpötilassa ja transmembraanip 5 bar, edullisesti noin 0,5-5,5 bar. Mahdollisten partikkelien poistamiseksi i globuliiniliuos voidaan esisuodattaa käyttämällä suodatinta, jonka keskim reikäkoko on noin 0,05-2 pm. Nanosuodatus on edullista suorittaa virtauh kohotetussa lämpötilassa, kuten 30-40 °C. Kohotettu lämpötila ja alhainei 4,6) ovat virussuodatuksen suorittamisen lisäksi edullisia mahdollisen imi 10 liuoksen antikomplementaarisen aktiivisuuden vähentämisen kannalta, IV farmakopea-vaatimukseen viitaten.
Vaikka suodatus on edullista tehdä edellä kuvatuista prosessointivaiheista immunoglobuliiniliuokselle, esitetty suodatusmenetelmä sopii yleisesti ott 15 immunoglobuliiniliuokselle, joka sisältää polyetyleeniglykolia tai jota on ]
adsorbentilla ja joka vastaavalla tavalla ei sisällä proteiiniaggregaatteja. N
mahdollista muunnella esimerkiksi US-patenteissa 5 886 154 ja 6 307 028 tunnettuja immunoglobuliiniprosesseja siten, että näillä tuotettuihin immu liuoksiin lisätään prosessin sopivassa vaiheessa polyetyleeniglykolia prote ; .·, 20 poistamista varten, minkä jälkeen lopullinen immunoglobuliiniliuos johde • · · ··· * .;. poistosuodatukseen.
«*·« * · :. US-patentit 5 886 154 ja 6 307 028 kuvaavat erään puhdistusmenetelmän *·· • · · (immunoglobuliinille), jossa käytetään kapryylihapposaostusta ja kromato * · * · : ’ ‘ ; 25 olevassa keksinnössä kapryylihapposaostus tehdään edullisesti lisäämällä * * vapaana happona sen sijaan, että sitä lisättäisiin suolan muodossa, kuten e; natriumkapiylaattina, niin kuin US patenttien 5 886154 ja 6 307 028 kuva 2... · menetelmässä. Kapryylihappo lievästi alentaa liuoksen pH:ta toisin kuin n 11 voidaan kuitenkin suorittaa ’’kapryylihappokäsittely” myös käyttäen kapryl kuten viitatuissa US-patenteissa, niissä mainittuja olosuhteita käyttäen.
Kuten edellä on kerrottu, parvovirus B19 on edelleen nykyisten plasmatuot 5 riskitekijä, koska lähtöplasma voi sisältää parvovirusta jopa 1010 genomiek ml:aa kohden ja kyseinen virus on resistantti kemiallisille virusinaktivointil Esitetyn keksinnön mukaisessa valmistusprosessissa on edullista seuloa läh PCR:llä parvovirus B19 DNA:n suhteen ja jättää valmistuksesta pois plasir sisältävät > 104 IU/ml. Kansainvälisellä yksiköllä (IU) tarkoitetaan tässä W 10 kansainvälistä standardia parvovirus B19 DNA:lle. Koska parvoviruksen pi mahdollista suonensisäisen infuusion kautta tartuttavaa annosta ei tiedetä, λ prosessin pitäisi poistaa kaikki lähtöplasman mahdollisesti sisältämät parvc Soveltaen seulonnan lopetusrajana arvoa 104 IU/ml, parvoviruskuormite us litrojen teollisissa plasmavarannoissa on korkeimmillaan luokkaa 101 °— 1011 15 esillä olevan keksinnön mukainen valmistusprosessi pystyy poistamaan par jopa yli 12 log-yksikköä (esimerkki 2), sen avulla voidaan täydellisesti pois lähtöplasmassa mahdollisesti läsnä olevat parvovirukset.
Uudella menetelmällä valmistettu tuote siis todella on virusvapaa immunog ·,· · 20 Alan ammattilaiselle on selvää, että tätä laskutapaa voidaan soveltaa mille t vervälitteiselle virukseen, joka ei tehokkaasti inaktivoidu kemiallisilla inakl *·**· menetelmillä. Tällaisia viruksia ovat esimerkiksi hepatiitti A -virus ja mahc *,./ toistaiseksi tuntemattomat virukset. Parvovirusta käytetään tässä esimerkki! •«Γ yksi vaikeimmin plasmatuotteista täydellisesti poistettava virus.
·«· 25
Aikaisempiin prosesseihin verrattuna, eräs nykyisen prosessin lisäetu on sei « * · · keltaisuus. Prosessi voidaan aloittaa ihmisplasman fraktioiden II+III massa • * ·" voidaan korvata kaksi fraktiointivaihetta neljästä Cohn-Oncley’n prosessin 12 viruksia. Tämä on johtunut siitä, että IVlG:tä on pystytty suodattamaan v; määrä ennen kuin suhteellisen hintavat suodattimet ovat tukkeutuneet. N> avulla voidaan suodattaa jopa 10 kg IVIG:tä 1 m2:n viruksenpoistosuodatl että saanto pysyy suurena. Tämä vähentää valmistuskustannuksia huomat 5 1,3 ja 5).
Toinen esitetyn keksinnön mukainen menetelmä polymeerien poistamiset adsorbentilla, kuten pyrogeenisellä piidioksidilla (sovellettuna esimerkiks säätiön muodossa). Yleisesti ottaen voidaan käyttää mitä tahansa hienoja 10 piipohjaista hartsia, joka ei ole toksinen ja joka adsorboi proteiiniaggrega globuliiniliuoksen käsittely 0.05 - 0.5 % pyrogeenisellä piidioksidilla (ku 200:11a) poistaa tehokkaasti polymeerejä ja parantaaa immunoglobuliinin virussuodatuksen aikana, kuten esimerkissä 6 havainnollistetaan. Adsorbs suodattamalla tai sentrifugoimalla.
15
On yllättävää, että immunoglobuliiniliuos voi olla hyvin konsentroitunutt immunoglobuliinien saostamista. Olemme siis pystyneet valmistamaan ki joiden immunoglobuliinipitoisuudet ovat jopa 20-25 %. Tällaisista liuoks esim. annosteltaessa immunoglobuliinia ihon alle.
20 * · · ··· ·
Esitetyn keksinnön mukaisesti valmistetun IVIG-tuotteen farmaseuttinen soveltuu IVIG:n kaikille tunnetuille käyttötavoille (Knezevic-Maramica & ;,M: Transfusion 43, 1460-1480,2003). Koska koostumus ei sisällä edes fysik; *·* • * · resistantteja viruksia, kuten parvoviruksia, soveltuu se erityisesti potilaille ***l 25 parvovirus voi aihetttaa komplikaatioita. Tällaisia potilaita ovat esim. rasi * * * naiset, immunologisesti epävakaat potilaat ja potilaat, joilla on hemolyytti IJmuutoin lisääntynyt erytropoieesi. IVIG:n päiväannos on noin 10 mg - K erityisesti noin 100 mg - 1 g/kg. Hyperimmuuneilla globuliineilla, kuten a 13 annostelu, joista viimeksi mainittu sisältää transdermaalisen, oftalmisen, st bukkaalisen annostelun. Erityisesti esitetyt immunoglobuliinikoostumukse formuloida annettaviksi intravenoosisti, subkutaanisesti tai intramuskulaar 5 Yhteenvetona todettakoon, että esillä olevan keksinnön mukaisella valmisl on selvästi parempi kyky poistaa fysikaaliskemiallisesti resistantteja viruki semmin alalla kuvatuilla valmistusmenetelmillä. Esitetyn menetelmän vin misen päävaiheet ovat merkittävällä tavalla karkeita ja epäherkkiä virusten kemiallisten ominaisuuksien eroja kohtaan. Tämä vaikuttaa virusten tehokl 10 poistumiseen esim. anioninvaihtokromatografialla.
Yhden edullisen sovellutuksen mukaan esillä olevat immunogluliiniliuokst parenteraalisiksi koostumuksiksi lisäämällä IgG-liuokseen trehaloosia-joi tai seoksena yhdessä muiden, tavanomaisten stabilisoijien kanssa - ja liuol 15 säädetään tarvittaessa. Sen jälkeen liuos steriilisuodatetaan ja jaetaan asept säiliöihinsä, kuten ampulleihin. Nämä uudet farmaseuttiset kompositiot j ui yksityiskohtaisemmin yhteishaussa olevassa patenttihakemuksessamme FI "Farmaseuttiset koostumukset” (jonka sisältö liitetään tähän viitteen omais 14 1 ESIMERKKI 1 Tämä esimerkki kuvaa aggregaateista vapaan ja virusturvallisen immunog valmistamista ihmisen plasmasta, suurella saannolla.
5
Ihmisen plasmasta saatu fraktio H+III -massa fraktioitiin Cohn’in menetel Chemie en Techniek 25,193-196,1970). Sen jälkeen 500 g fraktio Π+ΙΙΙ 8-kertaiseen tilavuusmäärään tislattua vettä noin 5 °C:n lämpötilassa, ja pl arvoon 4,8 käyttämällä 0,2 mol/1 etikkahappoa. Suspensio saatettiin huone 10 (noin 22 °C). Sitten lisättiin kapiyylihappoa 1 tunnin ajan siten, että pitois 50 mM. Suspensiota sekoitettiin 1 tunnin ajan, ja saostuma poistettiin sent Liuoksen pH nostettiin arvosta 4,5 arvoon 5,4 käyttämällä 0,2 M NaOHra, lisättiin PEG 4 000:ää pitoisuudella 30 g/1, ja liuosta sekoitettiin 16 tuntia, piimaata ja liuos suodatettiin. Liuoksen konduktiivisuus säädettiin natriurr 15 puskurilla arvoon 2,0 mS/cm. Suodos laitettiin ANX Sepharose FF geelipä tasapainotettiin 20 mM nariumasetaatilla, pH 5,4. Lapivirrannut IgG-firakt talteen. Liuoksen pH säädettiiin arvoon 4,4 käyttämällä 0,5 M etikkahapp< Esisuodattimella (0,1 pm) suodattamisen jälkeen liuos suodatettiin Viresol virussuodattimen läpi 35 °C:n lämpötilassa ja 3,5 bar:n paineessa. Proteiin . e. 20 noin 8 g/1 ja suodatuspinta-alaa kohti käytetty IgG:n määrä oli noin 10 kg/ * * V suodatettiin noin 6 tuntia, ja IgG-saanto oli noin 98-100 %. Liuos konsent ultrasuodattamalla, minkä jälkeen se diasuodatettiin vedellä polyetyleenig] • * .···. poistamiseksi injektiota varten ja lopuksi konsentroitiin. Konsentroitu liuo % IgG-liuokseksi, pH 4,4. Liuos sisälsi glysiinia pitoisuudella 0,2 M.. Lisi **** ·'*. 25 toinen, 15 % IgG-formulaatio, jonka pH oli 5,2 ja joka sisälsi trehaloosia \ • · · M. Formuloidut liuokset steriilisuodatettiin lopullisiin säiliöihinsä.
» · « • « · ·*· ♦
Kaiken kaikkiaan liuotetusta massasta saatiin lopputuotteen saannoksi noii 15 1
Taulukko 1. IgG-saanto ja aggregaattien esiintyminen eri prosessivaili
IgG-saanto aggr prosessivaihe plasmaa, g/kg % lietetty II + III -massa 7,5 kapryylihappokäsittelyn j älkeen 6,8 91 PEG-saostuksen jälkeen 5,7 76 < kromatografian jälkeen 5,1 68 < virussuodatuksen jälkeen 5,0 67 < lopputuote 4,8 64 < 5 ESIMERKKI 2 Tämä esimerkki kuvaa parvovirus B19:n vähenemistä valmistusprosessissi esimerkissä 1.
10 Viruksen vähentymistä prosessin jokaisessa vaiheessa tutkittiin väkevöittäi aloitusliuosta korkeatiitterisellä parvovirus B19 -positiivisella plasmalla. N
• * : eristettiin lähtöliuoksesta ja prosessoidut näytteet liuotettiin parvovirus-neg m
Ml
• ··*e plasmaan Rochen MagNA Pure -metodia käyttämällä. Parvovirus B19 DN
* määritettiin reaaliaikaisella PCR:lIä käyttämällä Rochen LightCycler’ia ja • # ***** 15 Parvovirus B19 Quantitation Kit -määrityskittiä. Taulukko 2 esittää parvov *·· ·;:! vähentymistä prosessin eri vaiheissa.
« · • · o»» . . Taulukko 2. Parvoviruksen vähentyminen prosessin vaiheissa.
• * · _________________ ]·'*] prosessivaihe vähentymistekijä * 4 » 1 ESIMERKKI 3 Tämä esimerkki havainnollistaa erityisen polymeerien poistamisvaiheen ti 5 tehokkaassa virussuodatuksessa. Immunoglobuliinin raakaliuos saostettiin kapryylihapolla, kuten esimerkissä 1 kuvattiin. Supematanttiliuoksen pH i 5,4. Erillisiä koe-eriä käyttäen supematanttiliuokseen lisättiin erilaisia mä* lykolia (PEG 4 000:äa) tai sitä ei lisätty ollenkaan. Seosta sekoitettiin huoi 16 tunnin ajan, minkä jälkeen lisättiiin 2 % piimaata, ja liuos kirkastettiin i 10 Kirkastetulle liuokselle tehtiin anioninvaihtokromatografia käyttäen ANX geeliä, ja puhdisttetua IgG:tä sisältävä ulos virrannut neste otettiin talteen, liuoksen pH säädettiin arvoon 4,4. Esisuodatuksen jälkeen (0,1 μπκη suod suodatettiin Viresolve NFP (Millipore) -suodatinta käyttämällä 3,5 bar:n p °C:n lämpötilassa. Proteiinipitoisuus oli noin 8 g/1 ja suodatinpinta-alaa ke 15 määrä oli noin 10 kg/m2. Suodoksen virtausta tarkkailtiin rekisteröimällä s PEG-käsittely paransi huomattavasti seka suodoksen virtausta että IgG:n li (taulukko 3).
Taulukko3. PEG-käsittelyn vaikutus suodoksen virtaukseen ja IgG:n . , 20 virussuodatuksen aikana. *Kahden erillisen kokeen keskiarvot; n.a.= • « · • » i ··· « *«· [[[[· PEG-pitoisuus suodoksen IgG:n läpäisevyys (kg/m2) • 9 __ . lähtövirtaus virtaus 80% virtaus 50 % • Λ **# 2 (kg/m /h) lähtöarvosta lähtöarvosta ···♦ — .···. ilman PEG:tä 42 <1 <1 2 % PEG 141 23 5fi : 3 % PEG 223 Ϊ33 Ϊ83 «*· *.........- " 1 ' * - ^ * · • * 17 1 virranneen liuoksen pH säädettiin erilaisiin arvoihin arvojen 4,2 ja 5,2 väl Esisuodatuksen jälkeen (0,1 pm:n suodattimena) liuokset suodatettiin Vir suodattimia käyttäen, 3,5 bar:n paineessa. Lämpötila oli 23 °C liuokselle, ja 35 °C kahdelle muulle liuokselle. Suurin lähtövirtaus ja IgG:n läpäise^ 5 ulos virranneen liuoksen pH säädettiin arvoon 4,4 (Taulukko 4).
Taulukko 4. Immunoglobuliiniliuoksen pH;n vaikutus suodoksen virt IgG:n läpäisevyyteen virussuodatuksen aikana. ^Keskiarvotulokset k erillisestä valmistuserästä.
suodoksen IgG:n läpäisevyys (kg/] liuoksen pH lähtövirtaus virtaus 80% virtaus 50% (kg/m2/h) lähtöarvosta lähtöarvosta ~52 Ϊ92 <1 nl.
~4Ä* 223 1^2 18^8 ~42* 164 3^6 6Λ 10 ESIMERKKI 5 : Tämä esimerkki havainnollistaa immunoglobuliiniliuoksen virussuodatuki « « « • · « « ,:. 15 joka saavutetaan kun liuos valmistetaan esitetyn keksinnön mukaisesti ver ....: pepsiinikäsitttelyllä valmistettuun liuokseen.
• · 4 4 ·· * ··· Aggregaattivapaata IgG-liuosta valmistettiin ihmisplasmasta Cohn’in Irak : ’ * *: käyttäen kapiyylihappokäsittelyä, PEG-saostusta ja ioninvaihtokromatogrj 20 esimerkissä 1 kuvattiiin. Toinen puhdas IgG-liuos valmistettiin ihmisplasr j j j fraktiosta II käyttämällä DEAE-Sephadex-käsittelyä, ultrasuodatustajape *... i julkistetun kansainvälisen patenttihakemuksen WO 96/35710 mukaisesti.!
J
18
Taulukko 5. Valmistusprosessin vaikutus puhtaan immunoglobuliinili virussuodatukseen. * Kahden erillisen valmistuserän keskiarvotuloksel suodoksen IgG:n läpäisevyys (kj immunoglobuliinin lähtövirtaus virtaus 80 % virtaus 50 % valmistusprosessi (kg/m2/h) lähtöarvosta lähtöarvosta uusi prosessi* 223 13,2 18,8 pepsiinikäsittely 142 0,8 1,9 5 ESIMERKKI 6 Tämä esimerkki havainnollistaa pyrogeenisellä piidioksidikäsittelyllä aikai tuksia, polymeerien poistumista immunoglobuliiniliuoksesta ja liuoksen pa suodatustehoa. Ensimmäisessä koeasetelmassa immunoglobuliinin raakalii 10 kapryy lihapolla, kuten esimerkissä 1, ja supematanttiliuoksen pH nostettiir
Osaan liuosta lisättiin 0,2 % pyrogeenistä piidioksidia (Aerosil 200) ja susf sekoitettiin tunnin ajan. Sen jälkeen lisättiin 2 % piimaata ja suspensio suo< Toiselle osalle supematanttiliuosta tehtiin kirkastussuodatus pelkkää 2 % p käyttäen. Molemmat liuokset johdettiin anioninvaihtokromatografiaan käyt * · : 15 Sepharose*a, ja puhdistettua IgG:tä sisältävä ulos virrannut liuos otettiin tai ,.*·* Pyrogeenisellä piidioksidilla käsitelty immunoglobuliiniliuos ei sisältänyt \ 4 ‘·Μ· määriä polymeerejä, kun taas vertailuliuos sisälsi polymeerejä 0,4 %.
4 44 * # • · • · * ϊ Toisessa koeasetelmassa puhdasta IgG-liuosta saatiin liuotetusta ihmisplasi *··** 20 fraktiosta II käyttämällä DEAE-Sphadex-käsittelyä ja ultrasuodatusta, kutei WO 96/35710 kuvataan. Proteiinipitoisuus säädettiin määrään 10 g/I. Osa li 4 4 * käsiteltiin 0,2 % AerosiPllä, lisättiin 2 % piimaata ja suspensio suodatettiin 4 4 4 4 • 44 _ Π7Α ___1 ! i! T ! 1
Claims (16)
1. Menetelmä puhdistetun, olennaisesti virusturvallisen immunoglobuliini valmistamiseksi,tunnettu siitä,että 5. immunoglobuliinin raakaliuos saatetaan kapryylihappokäsittelyyn, joka arvossa 4,0 - 5,0 ja käyttämällä 15- 60 mmol kapryylihappoa/1, - proteiiniaggregaatteja ja viruksia poistetaan immunoglobuliiniliuoksest ensimmäisessä viruksenpoistovaiheessa proteiinisaostajaa tai proteiinia ainetta lisäämällä, 10. immunoglobuliiniliuos johdetaan aniomnvaihtokromatografiaan immui puhdistamiseksi, - näin saatu immunoglobuliiniliuos suodatetaan viruksenpoistosuodattimi viruksenpoistovaiheessa immunoglobuliinia sisältävän suodoksen tuotti - immunoglobuliini otetaan talteen* 15
2. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pr on polyetyleeniglykoli.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pc • * : : : 20 glykolia lisätään noin 2-4 p-%. • a • ·· a 4* Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pr • i aggregaatit ja virukset poistetaan lisäämällä proteiinia adsorboivana aineeni *· · 9 piidioksidia. • ψ • » 25 • β. e 5. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 4 mukainen menetelmä, tunnettu si • * * ,···* a) ainakin yksi virusinaktivointivaihe suoritetaan immunoglobuliin • ♦ 2» 1 d) ensimäinen eluaatti otetaan talteen, e) ensimmäinen eluaatti virussuodatetaan suodattimena, jonka kesi reikäkoko on noin 10-40 nm, jotta saadaan poistetuksi kaikki r vaipalliset ja vaipattomat virukset ja tuotetuksi toinen eluaatti, 5 f) toinen eluaatti otetaan talteen, ja g) se formuloidaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi, virusturvallist immunoglobuliinivalmisteeksi, joka ei sisällä polymeerisiä profc jolloin polymeeriset proteiinit poistetaan supematanttiliuoksesta, joka saadi tai eluaatista, joka saadaan vaiheesta d. 10
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että va suoritetaan lisäämällä kapryylihappoa.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että va 15 suoritetaan pH-arvossa 4,0-5,0.
8. Jonkin patenttivaatimuksen 5-7 mukainen menetelmä, tunnettu s liuos saadaan liuottamalla immunoglobuliinia sisältävä veriplasman fraktio pH-arvossa 4,0-5,0, ja edullisesti 4,5-5,0. • · » • * * “V 9. Jonkin patenttivaatimuksen 5 - 8 mukainen menetelmä, tunnettu s ♦ ”’\ vaiheesta b saadun supematanttiliuoksen pH aseteaan arvoon 5,3 tai suurem * · • · * m
10. Jonkin patenttivaatimuksen 5-9 mukainen menetelmä, tunnettu s t .···. 25 polymeeriset aineet poistetaan lisäämällä vaiheesta b saatuun supematanttili *** polyetyleeniglykolia. « * · • « i *·* » 1 Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että että vaihe e suoritetaan pH-arvossa 4,2 - 5,0.
14. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukainen menetelmä, tunnettu lähtöplasma sisältää parvoviruksen B19 DNA:ta vähemmän kuin 104 lU/ml 5
15. Jonkin patenttivaatimuksen 1-14 mukainen menetelmä, tunnettu lähtöliuos saadaan ihmisplasman Cohn’in fraktiosta II+I1I.
16. Virusturvallinen, vesipitoinen immunoglobuliiniliuos, joka on valmistel 10 patenttivaatimuksen 1-15 mukaisella menetelmällä ja joka ei sisällä havai polymeerejä tai aggregaatteja.
17. Menetelmä, jolla voidaan tehokkaasti suodattaa immunoglobuliiniliuoki virustenpoistosuodatinta, jonka reikäkoko on 10-40 nm, tunnettu silti 15. suodattimen läpi johdetaan pH-arvossa 4,2 - 5,0 pitoisuudeltaan \~* immunoglobuliiniliuos, joka ei sisällä havaittavia määriä polymeerii jolloin menetelmällä poistetaan vähintään 3 log-yksikköä viruksista. hiukkaskoko on noin 20 nm, ja jolloin - suodatettava immunoglobuliiniliuos on saatu immunoglobuliinin nu . 20 käsittelemällä immunoglobuliinin raakaliuosta pH-arvossa 4,0 - 5,0 * * · ”V kapryylihapolla, jonka määrä on 15 - 60 mmol/1, poistamalla proteii * * * * ., „· ja viruksia immunoglobuliiniliuoksesta polyetyleeniglykolin lisäyks * » .··*. saattamalla immunoglobuliiniliuos anioninvaihtokromatografiaan. ·** * «** ·*"· 25 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että li e · · taan noin 20 - 50 °C:n lämpötilassa ja noin 0,2 - 8 bar:n paine-erolla. • · ♦ · · • t * ·♦« a :***: 19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että li
21. Jonkin patenttivaatimuksen 17-20 mukainen menetelmä, t u n n e 11 immunoglobuliiniliuos suodatetaan viruksen poistamiseen tarkoitetulla yh< timella.
22. Jonkin patenttivaatimuksen 17-21 mukainen menetelmä, t u n n e 11 suodatuksen aikainen pH on noin 4,2-4,8.
23. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että globuliiniliuos sisältää 2-4 p-% polyetyleeniglykolia. 10 • · · « i t • 1· · ***« * • » *** • · • · · ···· * ♦ «·1 · • « · • I f ·· · • «e ! !
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI20040145A FI116839B (fi) | 2004-01-30 | 2004-01-30 | Menetelmä virusturvallisen immunoglobuliinin valmistamiseksi |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI20040145 | 2004-01-30 | ||
FI20040145A FI116839B (fi) | 2004-01-30 | 2004-01-30 | Menetelmä virusturvallisen immunoglobuliinin valmistamiseksi |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI20040145A0 FI20040145A0 (fi) | 2004-01-30 |
FI20040145A FI20040145A (fi) | 2005-07-31 |
FI116839B true FI116839B (fi) | 2006-03-15 |
Family
ID=30129471
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI20040145A FI116839B (fi) | 2004-01-30 | 2004-01-30 | Menetelmä virusturvallisen immunoglobuliinin valmistamiseksi |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
FI (1) | FI116839B (fi) |
-
2004
- 2004-01-30 FI FI20040145A patent/FI116839B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI20040145A0 (fi) | 2004-01-30 |
FI20040145A (fi) | 2005-07-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20070244305A1 (en) | Process for The Manufacture of Virus Safe Immunoglobulin | |
US4216205A (en) | Process of preparing a serum protein composition for intravenous application | |
CN1150004C (zh) | 用辛酸钠作分离剂的低温白蛋白分级分离法 | |
CN106414476B (zh) | 用于纯化免疫球蛋白的方法 | |
BRPI0508096B1 (pt) | Método de preparação de um preparado de anticorpo seguro purificado contra vírus e vírus inativado | |
SK287633B6 (sk) | Spôsob výroby humánneho gamaglobulínu G a humánny gamaglobulín G s inaktivovanými vírusmi | |
JP2002517516A (ja) | 静脈投与用免疫グロブリン及び他の免疫グロブリン生成物の製造法 | |
EP2725033B1 (en) | Method for producing protein preparation | |
ZA200601206B (en) | Process for preparing an alpha-1-antitrypsin solution | |
US4017360A (en) | Method for purifying hepatitis B antigen | |
CN107849086B (zh) | 用于制备源自血浆的乙型肝炎免疫球蛋白的方法 | |
EP0727226A2 (de) | Entfernen von Viren durch Ultrafiltration aus Proteinlösungen | |
US20130172536A1 (en) | Intravenous Cytomegalovirus Human Immune Globulin and Manufacturing Method Thereof | |
WO2002030983A2 (de) | Bikunin enthaltende plasmafraktion, verfahren zu ihrer herstellung und ihrer verwendung | |
WO2000067789A1 (en) | High concentration immunoglobulin preparation and method for its production | |
FI116839B (fi) | Menetelmä virusturvallisen immunoglobuliinin valmistamiseksi | |
EP3154597B1 (en) | Preparation methods for a novel generation of biological safe klh products used for cancer treatment, for the development of conjugated therapeutic vaccines and as challenging agents | |
EP3154578B1 (en) | Preparation methods for a novel generation of biological safe klh products used for cancer treatment, for the development of conjugated therapeutic vaccines and as challenging agents | |
DE69012903T2 (de) | Verfahren zur herstellung und reinigung von hepatitis b-impfstoff. | |
RU2492176C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ IgG, IgM И IgA ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ | |
BR112021005273A2 (pt) | composição de anticorpo anti-tfpi altamente eficiente | |
CA2943328A1 (en) | Method for the preparation of immunoglobulins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FG | Patent granted |
Ref document number: 116839 Country of ref document: FI |
|
MM | Patent lapsed |