DE2442059C2 - Verfahren zur Konzentrierung und Reinigung von Suspensionen von Viruspartikeln - Google Patents

Verfahren zur Konzentrierung und Reinigung von Suspensionen von Viruspartikeln

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DE2442059C2 DE19742442059 DE2442059A DE2442059C2 DE 2442059 C2 DE2442059 C2 DE 2442059C2 DE 19742442059 DE19742442059 DE 19742442059 DE 2442059 A DE2442059 A DE 2442059A DE 2442059 C2 DE2442059 C2 DE 2442059C2
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren, Die Patentansprüche 2 bis 7 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.
Die Konzentrierung von Virussuspensionen erfolgt üblicherweise nach mehreren Verfahren, die auch zur Konzentrierung von Proteinen und allgemeiner von biologischen Makromolekülen angewendet werden, Insbesondere
a) durch Präzipltation durch Senkung der Dielektrizitätskonstante der Virussuspension, durch Zusatz von organischen Lösungsmitteln, die mit Wasser mischbar sind, z. B. Äthylalkohol und Methylalkohol, usw.,
■;b) durch Präzipltation durch Veränderung der Salzkon-■ zentration der Virussuspension, Indem entweder Salze wie Ammoniumsulfat zugesetzt oder beispiels-
''£ weise durch Dialyse gegen ein Medium der Ionenkraft Null entfernt werden,
•>'c) durch Verteilung in einem Zweiphasensystem von Lösungsmitteln, das Hochpolymere enthält, z. B. in dem System Dextran/Polyäthylenglykol,
d) durch Präzlpitatlon durch Zusatz von Polyäthylenglykol zur Virussuspension und
e) nach anderen Verfahren, z. B. Ultrafiltration und Sedimentation in einem sehr hohen Schwerkraftfeld durch Ultrazentrifugatlon.
Viele dieser Verfahren führen zu einer Denaturierung der Viruspanikel und damit zu Verlusten und ergeben geringe Konzentrierungsfaktoren. Die anderen Verfahren eignen sich nicht zur Behandlung großer Mengen von Viruspräparaten.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Konzentrierung und Reinigung von Suspensionen von Viruspartikeln zu finden, das diese Nachteile vermeidet. Diese Aufgabe wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelöst.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man zunächst unlösliche Viruskomplexe, die durch Assoziation zwischen den Viruspartikeln und dem aus Calciumion und Äthylenoxidpolymerisat bestehenden Träger gebildet werden.
Diese Viruskomplexe werden mit Hilfe von Komplexbildnern für Calciumionen, z. B. Äthylendiamintetraesslgsäure (EDTA) und ihren Salzen oder Citronensäure und ihren Salzen, löslich gemacht, wobei man eine Virussuspension gewinnt, deren Konzentration bis zu lOOOmal höher ist als die der Ausgangssuspension ohne wesentlichen Verlust an Viruspartikeln in Lösung. Nach dem beanspruchten Verfahren kann man in vorteilhafter Weise auch Suspensionen von inaktivierten Viren konzentrieren und erzeugen.
Das Verfahren ermöglicht außerdem die selektive Trennung zwischen vollständigen Viruspartikeln und Virus-Subpartikeln.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht auch die Gewinnung von vollständigen Maul- und Klauenseuche-Viruspartlkeln, die auf BHK-Zellen, die für das Rind heterolog sind, gezüchtet werden, und fast vollständig von zellulären Antigenen, insbesondere sensibilisierenden Antigenen, befreit sind.
Für die Zwecke der Erfindung werden Äthylenoxidpolymere mit einem Molgewicht von 100 000 bis 300 000 verwendet. Diese Polymerisate enthalten selbst eine nicht unbeachUiche Menge von zweiwertigen Kationen. Beispielsweise wurden für diese Polymerisate die folgenden Konzentrationen an zweiwertigen Kationen gefunden:
Ungefähres
Molekulargewicht
Konzentration an zweiwertigen Kationen
Polymer 1 100 000
Polymer 2 200 000
Polymer 3 300 000
0,133 X 10"3 Mol/g 0,112 X 10"3 Mol/g 0,110 X ΙΟ"3 Mol/g
Ein unlöslicher Komplex, der aus zweiwertigen Kationen und einem Äthylenoxidpolymerisat besteht, kann beispielsweise wie folgt hergestellt werden: Man führt 4 g Äthylenoxidpolymerisat Polymer 1 in 100 ml 0,02molal'ren tris-HCI-Puffer ein, der einen pH-Wert von 7,6 hat. :Öas Gemisch wird gerührt und dann zentrifugiert. Hierdbel wird ein Überstand und ein Sediment 1 erhalten. In i?Üer gleichen Welse werden 4 g Polyäthylenoxid-Polymer :J| in 100 ml einer Magnesiumsulfatlösung von 2XlO"3 iMol/l eingeführt (dieses Magnesium kann selbstverständlich anstelle des im Anspruch 1 genannten CaIcI- -surns verwendet werden). Das Gemisch wird gerührt und zentrifugiert, wobei ein Überstand und ein Sediment 2 erhalten werden. Die quantitative Bestimmung der zweiwertigen Kationen in den Sedimenten durch Komplexornetrie hat die folgenden Ergebnisse:
Sediment 1
Sediment 2
0,22 X 10-·' Mol
0,47 X \Q-} Mol
Ein solches unlösliches Mateiial, das durch Komplexbindung zwischen zweiwertigen Kationen und einem Äthylenoxydpolymeren gebildet wird, wird durch Einwirkung von Chelatbildnern für zweiwertige Kationen in genügender Konzentration löslich gemacht. Ebenso wird kein unlöslicher Komplex gebildet, wenn 4 g Äthylenoxydpolymerisat Polymer 1 in eine Lösung eingeführt wird, die ein Chelal von zweiwertigen Kationen, z. B. Äthylendlamlntetraesslgsäure (EDTA) enthält.
Für die Durchführung des Verfahrens ist es vorteilhaft, ein Äthylenoxydpolymerlsat mit einem Molekular-
-) gewicht von 100 000 zu verwenden, wie In Beispiel 1 veranschaulicht.
Bei gewissen Viruskulturen kann es vorteilhaft sein, der zu konzentrierenden Suspension Calcium zuzusetzen, wie In den Beispielen 3 und 4 veranschaulicht. Als allge-
Hi meine Regel Ist die zur Bildung eines Komplexes aus Viruspartikeln, Calcium und Äthylenoxydpolymerisat führende Adsorption der Viruspartikel um so vollständiger, je größer die am Polymerisat gebundene Menge des Calciums ist. Dies wird durch die Beispiele 1, 2 und 3
ι j veranschaulicht.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert, wobei verschiedene Beispiele nur Teile des erfindur.ssgemäßen Verfahrens zeigen. Die Beispiele zeigen, daß das Verfahren ganz allgemein auf die verschle-
>o densten Gruppen von Viren und Viruspartikeln anwendbar ist:
Gruppe der Plcornaviren
Gruppe der Myxoviren
Gruppe der Rabdhoviren
(Maul- und Klauenseuche-Virus
und Polyomyelitis-Virus)
(Grippevirus und Newcastle-Virus)
(Tollwutvirus)
Beispiel
Zu 1 I einer Kultur des MKS-Virus Typ C, gebildet auf dem Lingualepithel des Rindes, werden 40 g Äthylenoxydpolymerisat gegeben. Die Suspension wird 15 Minuten gerührt und bei 3000 g zentrifugiert. Der Überstand wird auf Infektiosität und Komplementbindungseinheiten untersucht. Durch Komplexometrie wird die im Sediment enthaltene Menge an zweiwertigen Kationen quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.
KBE/I **) IDGK/ml **) Zweiwertige Sediment 1 *)
Kationen, Mol Sediment 2 *)
Ausgangskultur 8000 1O5·5 Sediment 3 *)
Überstand 1 *) 0 10" 4,84 XlO-3
Überstand 2 *) 100 103·1 4,04 XlO-3
Überstand 3 *) 6000 105·1 1,70 XlO"3
*) 1: Molekulargewicht dss verwendeten Äthylenoxydpolymerisats: 100000 2: Molekulargewicht des verwendeten Äthylenoxydpolymerisats: 200000 ,3: Molekulargewicht des verwendeten Äthylenoxydpolymerisats: 300000
♦*) KBE: Komplementbindungseinheiten
IDGK: Infektiöse Dosen auf Gewebekulturen
Dieses Beispiel zeigt, daß Uer mit dem Polymerisat 60 A) 4 g/l Äthylenoxydpolymerisat vom Molekularge-
vom Molekulargewicht 100 000 gebildete Komplex die Viren am besten adsorbiert hat.
Beispiel 2
Zu drei Proben von je 11 einer Kultur des MKS-Virus Typ C, gebildet auf Lingualepithel von Rindern, gibt man
wicht 100 000;
B) 3 g/100 ml Äthylenoxydpolymerisat vom Molekülargewicht 100000;
C) 2 g/100 ml Äthylenoxydpolymerisat vom Molekulargewicht 100 000.
Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt, worauf zentrifugiert wird und die Überstände von den Sedimenten
abgetrennt werden. Der Überstand wird auf Komplementblndungselnhelten und Infektlosltät untersucht. Die In den Sedimenten enthaltene Menge an zweiwertigen Kationen wird quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind In der folgenden Tabelle genannt.
KBE/I IPGK/ml Zweiwertige Sediment A
Kationen, Mol Sediment h
Ausgangskultur 8200 10" Sediment C
Überstand A 0 10« 4,94 ΧΙΟ"3
Überstand B 600 10« 3,76 XlO-3
Überstand C 2000 104·7 2,30 X10-J
Durch Zusatz von 4% des Polymerisats konnte somit die beste Adsorption dei Viren am unlöslichen Komplex erzielt werden.
Beispiel 3
Zu zwei Proben von je I I einer Kultur des MKS-Virus ,Typ O, gebildet auf Llngualepithel von Rindern, gibt,, „mam
"A) 4 g/l Äthylenoxydpolymerisat vom Molekulargewicht 100 000,
B) 1,2 g CaCl2-2H2O und dann 4 g/100 ml des gleichen Polymerisats wie bei (A).
Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt, worauf die Suspensionen zentrifugiert und die Überstände von den Sedimenten abgetrennt werden. Der Überstand wird zur Ermittlung der Komplementbindungselnhelten und der Infektlosltät titriert. Ferner wird die Menge der in den Sedimenten enthaltenen zweiwertigen Kationen bestimmt.
25
KBE/1
IDGK/ml Zweiwertige
Kationen, Moi
Ausgangskultur 8000 105·3 4,67 X10-J Sediment A
Überstand A 2000 7,15 X1O-J Sediment B
Überstand B 0 I03·1
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Adsorption der Viruspärtikel am unlöslichen Komplex um so vollständiger ist, je höher die Konzentration an Ca^-Ionen ist.
40 Beispiel 4
A) Zu 100 ml einer Kultur des im Brutei gezüchteten Grippevirus Typ AO PR8 gibt man 2 g/100 ml Äthylenoxydpolymerisat. Die Suspension wird 3 Minuten gerührt und zentrifugiert. Der Überstand und das Sediment werden getrennt.
B) Zu 100 ml der gleichen Kultur gibt man 120 mg CaCl2 · 2H2O und dann 2 g/100 ml Polymerisat. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt und zentrifugiert. Der Überstand wird abgetrennt.
Der Überstand wird zur Ermittlung der Hämaglutinationseinheiten (HE) titriert. Die folgenden Ergebnisse werden erhalten:
Beispiel 5 HE/ml
Ausgangskultur 512
Überstand A 64
Überstand B 0
Konzentrierung einer Suspension des auf Lingualepithel von Rindern gezüchteten MKS-Virus:
Zu einem Volumen Keiner Kultur des auf Lin^-jalepithel von Rindern gezüchteten MKS-Virus gibt man 4 g/100 ml Äthylenoxydpolymerisat vom Molekulargewicht 100 000. Die Suspension wird 15 Minuten gerührt und dann bei 3000 g zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Sediment in einem Dreißigstel des Volumens von 0,15molarem EDTA-Puffer von pH 7,4 aufgenommen. Das Gemisch wird eine Stunde gerührt und dann zur Entfernung einer geringen Menge unlöslichen Materials zentrifugiert. Das Volumen des Eluats V ~würd gemessen. Der Konzentrierungsfaktor beträgt 11= V/v. Eine Fraktion dieses Eluats wird in physiologischem Puffer auf das «-fache verdünnt. Für diese Verdünnung (Eluat Mti) wird der Titer an Väruspartikein in Komplementbindungseinheiten und in infektiösen Dosen auf Gewebekulturen bestimmt. Die Ergebnisse für die drei europäischen Antigentypen des MKS-Virus sind in der folgenden Tabelle genannt.
KBE/ml IDGK/ml Konzentration η Ausbeute an KBE
Ausgangskultur
Eluat l/n
Ausgangskultur
Eluat l/n
Ausgangskultur
Eluat l/n
6
6
4
4
I06.i
105·9
105·7
105·7
105·7
25,7 100% Typ O
24,7 100% Typ A
25.0 100% Typ C
Beispiel 6
Konzentrierung von auf BHK-Zellen in Suspension gezüchteten MKS-Viren mit anschließender Reinigung j5 ,durch eine Behandlung mit halogenierten Kohlenwasserstoffen nach dem französischen Patent 6917 270. Die Behandlung hat den Zweck, allergisch machende Substanzen, die aus dem Abbau der Zellen stammen, zu entfernen. 2p
Zu einem Volumen V der Viruskultur, die gegebenenfalls von Zelltrümmern befreit worden ist, werden 4 g/100 ml Äthylenoxydpolymerisat vom Molekulargewicht 1Ö0 000 gegeben. Die Suspension wird 30 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Sediment in V10 Volumen EDTA-Puffer, der 0,15 Mol/l NaCl enthält, suspendiert. Die Suspension wird 1 bis 2 Stunden gerührt und dann mit einem Chloroformvolumen von 5,2 χ IO~3 χ V versetzt, worauf weitere 10 bis 30 Minuten gerührt wird. Eine schwere und voluminöse Fällung wird sehr schnell gebildet. Das Gemisch wird zur Entfernung der Fällung bei 3000 g zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen. Dieser Überstand stellt das Eluat dar, dessen Volumen ν gemessen wird. Eine Fraktion wird in einem physiologischen auf das «-fache (η= Viν) verdünnt. Für diese Verdünnung (Eluat Mn) werden der Titer an Viruspartikeln, an Komplementbindungseinheiien und die infektiösen Dosen von Gewebekulturen sowie der Prozentsatz an mit Säure ausfällbarem Material, bezogen auf die AusgangskuJtur, bestimmt. Die Ergebnisse für die drei europäischen Antigentypen des MKS-Virus sind in der folgenden Tabelle genannt.
KBE/ml IDGK/ rnl Konzen
tration π		 Ausbeute
KBE		 Durch Säure
ausfallbare
Substanz		 Mol zweiwertiges
Kation pro/1
Virussuspension
Kultur
Eluat l/n		 6
5		 1Q6.7
1Q6.7 		25,5 83% 7,8% Typ O 5,88 X 10-J
Kultur
Eluat l/n		 4
4		 106.7
103·5 		30,8 100% 7,0% Typ A 4,87 X 10-3
Kultur
Eluat l/n		 4
3		 107·1
107J 		30,6 75% 7,0% Typ C 4,90 X 10-J
Beispiel 7
Konzentrierung des auf dem Brutei gezüchteten Newcastle-Virus (Stamm Texas).
Die Arbeitsweise ist die gleiche wie in Beispiel 5. Die Ergebnisse der Bestimmungen am Eluat Mn sind In der folgenden Tabelle genannt.
HE/ml *) Infektiöser
Titer
Konzentration η Ausbeute
HE*)
Mol zweiwertiges
Kation pro/I
Virussuspension
Kultur
Eluat l/n
256
256
107·1
1Q6.9
*) = Härnaglutinationseinheiten
17,4 100%
8,62 X 10
i-J
Beispiel 8
Konzentrierung des Tollwutvirus CVS, gezüchtet auf dem Hirn von jungen Mäusen.
Zu 100 ml einer Suspension des zerriebenen Hirns von mit dem Tollwutvirus infizierten jungen Mäusen werden 1,2 g CaCIj · 2HiO und 2 g Äthylenoxidpolymerisat gegeben. Das Gemisch wird 30 min gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Sediment In 3,3 ml einer Lösung suspendiert, die pro Liter 0,15 Mol EDTA und 0,2 MoI PO4(NH.,), enthält. Das Gemisch wird 1 h gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand (1) wird für die Titration aufbewahrt und das Sediment erneut in dem gleichen Volumen der Lösung suspendiert, die pro Liter 0,15 Mol EDTA und 0,2 Mol PO4(NH4)J enthält. Das Gemisch wird 1 Stunde gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand (2) wird für die Titration aufbewahrt und das Sediment entfernt. Die infektiöse Dosis wird an der Maus nach dem Habel-Test ermittelt (DLjo). Die Ergebnisse sind nachstehend genannt.
DL50
Konzentration η
Mol zweiwertiges Kation pro/1 Virussuspension
Anfangs- 106·2
Suspension
Eluat 1 l/n *04·8
Eluat 2 l/n iO6·8
hler den Prozentsatz des Virus an, der an dem das Sediment bildenden unlöslichen Komplex adsorbiert worden ist. Die für die drei Antigentypen des Poliomyelitis-Virus erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.
27
29
Beispiel 9
5,55 X 10"3 3,53 X ΙΟ"3
IDGK/in! Ausbeute Mol zweiwer
(% adsorbierte tiges Kation
Viren) pro/I Virus-
IO suspension
Konzentrierung des Grippevirus A entsprechend zwei Miami, gezüchtet auf dem Brutei.
Zu 11 virulenter Allantoisflüsslgkelt werden 1,2 g ji CaCI2 · 2H2O und dann 29o Äihylenoxydpölymerlsat vom Molekulargewicht 100 000 gegeben. Die Suspension wird 30 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Sediment in 33 ml einer Lösung suspendiert, die pro Liter 0,2 Mol EDTA, 0,2 Mol (NH4)3PO4 und 1% Trinatrlumcitrat enthält. Die Suspension wird 1 Stunde gerührt und dann zur Entfernung unlöslicher Bestandteile zentrifugiert. Der Überstand wird auf Hämagglutinatlonseinheiten titriert. Die Ergebnisse sind nachstehend genannt.
Kultur
Überstand
Kultur
Überstand
10"
107·1
109·3
108·3
Kultur 109·5
Überstand 106·'
100%| Typ 1 5,2 XlO"3
90% J Typ 2 4,95 X 10"3
100%} Typ 3 4,7 X KT3
HE/ml Infektiöser Konzen-Titer tration η
Ausbeute He
Ausgangs- 320
kultur
Eluat l/n 320
108.3
30
24,3
Beispiel 10
100%
Konzentrierung des auf dem Brutei gezüchteten Grippevirus A2HK.
Die Arbeitsweise ist die gleiche wie in Beispiel 9. Die folgenden Ergebnisse werden erhalten:
35
HE/ml Infektiöser Konzen- Ausbeute Titer tration η He
Ausgangs- 400
kultur
Eluat l/n 320 ΙΟ7-8
80%
40
45
Beispiel
Konzentrierung des Grippevirus A equi 1, gezüchtet auf Schweinenlerenzellen. Die Arbeitsweise ist die gleiche wie in Beispiel 9. Die folgenden Ergebnisse werden erhalten:
HE/ml IDGK/ml η Ausbeute HE
Ausgangs- 320
kultur
Eluat l/n 240
24 75%
IO6·5
Beispiel 12
60
Adsorption des auf Heia-Zellen gezüchteten Poliomyelitls-Virus.
Zur Viruskultur werden 436 Äthylenoxydpolymerisat gegeben. Die Suspension wird 15 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird auf infektlöse Dosen von Gewebekulturen titriert. Die Ausbeute gibt Beispiel 13
Selektive Trennung zwischen vollständigen MKS-Viruspartikeln und Subpartikeln des MKS-Virus und Konzentrierung der kompletten Partikel um einen Faktor von etwa 1000.
Bekanntlich können bei Kulturen des MKS-Virus zwei Typen von antigenen Viruspartikeln auftreten: Die kompletten Virionen mit einer Sedimentationskonstante von 140 S und die Capsomeren mit einer Sedimentationskonstante von 12 bis 14 S. Es ist ferner bekannt, daß allein die kompletten Virionen gute Antigene für die Impfung gegen die Maul- und Klauenseuche sind.
Die selektive Trennung dieser beiden Typen von Partikeln nach dem Verfahren gemäß der Erfindung auf dem Unterschied der Stabilität zwischen den Komplexen, die jeweils durch das Virus, das an dem aus zweiwertigen Kationen und Äthylenoxydpolymerisat bestehenden Träger adsorbiert ist, und durch die am gleichen Träger adsorbierten Capsomeren gebildet werden. Der erste Komplex ist viel stabiler als der zweite Komplex. Das folgende Beispiel veranschaulicht den Vorteil einer solchen Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung.
Zu 3200 ml der MKS-Viruskultur (Typ C) werden 3 g/100 ml Äthylenoxydpolymerisat vom Molekulargewicht 100 000 gegeben. Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand (Nr. 1) wird verworfen und das Sediment In 75 rnl 0,15molarem EDTA-P iffer suspendiert. Die Suspension wird 1 Stunde gerührt und dann zur Entfernung unlöslicher Stoffe zentrifugiert. Der Überstand (Eluat Nr. 1) hat ein Volumen von 110 ml (entsprechend einem Konzentrierungsfaktor von 29, bezogen auf das Volumen der Ausgangskultur). Es wird festgestellt, daß dieses Eluat kein freies EDTA enthält (in diesem Fall ergibt eine Probenahme In Gegenwart der Kohle »Noir Eriothrom T« in ammoniakalischem Puffer Weinrotfärbung). Die zugesetzte EDTA-Menge wird vorher in Abhängigkeit von der Menge zweiwertiger Kationen festgelegt, die durch komplexometrlsche Bestimmung im Sediment gefunden wurde.
Zu 70 ml Eluat Nr. 1, entsprechend 70x29 = 2030 ml Ausgangskultur, werden 3 g/100 ml Äthylenoxydpolymerisat gegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde gerührt und dann zentrifugiert. Hierbei werden erneut ein Überstand (Nr. 2) und ein Sediment erhalten, das in 2 ml 0,15molarem EDTA-Puffer, der 1% Trlnatriumcitrat enthält, suspendiert wird. Die Suspension wird 1 Stunde gerührt und dann zur Entfernung einer geringen Menge unlöslicher Stoffe zentrifugiert. Der Überstand (Eluat
Nr. 2) hat ein Volumen von 2,4 fnl (entsprechend einem Konzentrierungsfaktor von 850).
An den Eluaten Nr. 1 und Nr. 2 und am Überstand Nr. 2 wird die Verteilung der Partikel 140S und 12 bis 14 S durch Ultrazentrifugation mit linearem Gradienten von Saccharose von 15 bis 45% bestimmt (Rotor MSE 3 χ 23 ml, 30 000 U/Min, für 3 Stunden; Temperatur bei 8° C gehalten). Die Prozentsätze der Parikel 140 S und 12 bis 14 S werden in Abhängigkeit von den relativen Mengen von komplementbindenden Einheiten jedes Peaks bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.
KBE/ml IDGK/ml
Partikel Partikel HOS 12-14S
Ausgangskultur 6 105·5
Überstand Nr. 1 0 103·5
Eluat Nr. 1, Ver- 6 105·7 51% 49%
'"■' dünnung 1/29
„Überstand Nr. 2 2 1O3·8 0% 100%
Verdünnung
1/29
Eluat Nr. 2, Ver- 4 105·5 77% 23%
dünnung 1/850
Die Ergebnisse zeigen, daß die 850fache Konzentration quantitativ an kompletten Virionen ist, da das Eluat Nr. 1 6x0,51 =3,06 KBE/ml an Partikeln 140S und das Eluat Nr. 2 hiervon 4x0,77 = 3,08 KBE/ml enthält (Eluat Nr. 1 bei der Verdünnung 1/29 und Eluat Nr. 2 bei der Verdünnung 1/850).
Beispiel 14
Reinigung des MKS-Virus und Konzentrierung auf das lOOOfache durch drei Zyklen von selektiver Adsorption mit anschließenden Desorptionen nach dem Verfahren gemäß der Erfindung.
Zu 93 I MKS-Viruskultur (Typ C), gezüchtet auf BHK-Zellen in Suspension und durch Zentrifugieren und Filtration geklärt, werden 3,72 kg (4%) Äthylenoxydpolymerisat vom Molekulargewicht 100 000 gegeben. Das Gemisch wird 20 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand (Nr. 1) wird verworfen und das Sediment in 1,321 eines Puffers suspendiert, der l,15molar an EDTA-Na2, 0,20molar an TrIs und Q,15molar an NaCI ist und einen pH-Wert von 7,8 hat. Die Suspension wird 2 Stunden gerührt und dann zur Entfernung eines unlöslichen Stoffs zentrifugiert. Der Überstand hat ein Volumen von 1,681 (entsprechend einem volumetrischen Konzentrierungsfaktor von 55). Es wird festgestellt, daß dieses Eluat (Nr. 1) kein freies EDTA enthält.
Zur Gesamtmenge des Eluats Nr. 1 werden 3 g/100 ml Äthylenoxydpolymerisat gegeben. Das Gemisch wird 40 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Hierbei wird ein Überstand (Nr. 2), der verworfen wird, und ein Sediment erhalten, das in 340 ml 0,018molarem EDTA-Puffer suspendiert wird. Die Suspension wird 2 Stunden gerührt und dann zur Entfernung einer geringen Menge eines unlöslichen Stoffs zentrifugiert. Der Überstand (Eluat Nr. 2) hat ein Volumen von 340 ml (entsprechend einem volumetrischen Konzentrierungsfaktor von 272). Nach quantitativer Bestimmung des freien EDTA in diesem Eluat durch Komplexometrie wird die für die Komplexbildung notwendige äquimolare Calciummenge zugesetzt. Diese Menge ist gering und bewirkt keine Senkung des pH-Werts, die es erforderlich macht, ihn neu einzustellen.
Zu 336 ml Eluat Nr. 2, in dem die Gesamtmenge des EDTA in dieser Weise komplexgebunden ist, entsprechend 0,336x272 = 91,41 Ausgangskultur, werden erneut 3 g/100 ml Äthylenoxydpolymerisat gegeben. Das Gemisch wird 40'Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Hierbei wird ein Überstand (Nr. 3), der verworfen wird, und ein Sediment erhalten, das In 60 ml des vorstehend genannten Puffers suspendiert wird. Die Suspension wird 2 Stunden gerührt und zur Entfernung eines . unlöslichen Stoffs zentrifugiert. Der Überstand (Eluat Nr. 3) hat ein Volumen von 60 ml entsprechend einem Konzentrierungsfaktor von 1520.
An den Eluaten Nr. 1, Nr. 2 und Nr. 3 und an den Überständen Nr. 2 und Nr. 3 wird auf die in Beispiel 13 beschriebene Weise die Verteilung an Partikeln 140S und 12 bis 14 S bestimmt. Ferner wird das mit Säure Füllbare (5%ige Trichloressigsäure) in der Kultur und im Eluat Nr. 3 bestimmt, ausgedrückt in ug/ml Rindereiweiß. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.
KBE/ml Partikeln Partikeln Durch Säure Mol zweiwertiges
140S 12-14S fällbares Kation pro/1
μg/ml % Virussuspension
Ausgangskultur 8 540 100
Überstand Nr. 1 0
Eluat Nr. 1 8 50% 50% 2,73 X 10-J
Verdünnung 1/55
Überstand Nr. 2 2 0% 100%
Verdünnung 1/55
Eluat Nr. 2 6 67% 33% 4,50 X 10"3
Verdünnung 1/272
Überstand Nr. 3 2 0% 100%
Verdünnung 1/272
Eluat Nr. 3 4 100% 0% 5 0,9 4,15 X ΙΟ"3
Verdünnung 1/1520
10
15
Die Ergebnisse zeigen, daß die Konzentrierung auf das 1520fache quantitativ an kompletten Virionen ist, und daß durch diese Operation die nicht kompletten Partikel 12 bis 14 S allmählich entfernt werden.
Das UV-Spektrum des Eluats Nr. 3 ist charakteristisch für ein Ribonucleoprotein, z. B. MKS-Virus, und hat ein Absorptionsmaximum bei 259 πιμ und ein Minimum bei 245 πιμ. Dies bestätigt ebenso wie die quantitative Bestimmung des durch Säure Fällbaren den hohen Grad der erzielten Reinigung.
Einen weiteren Nachweis für die Reinigung dieses Viruspräparats liefern die nachstehend beschriebenen Invivo-Tests.
Reinigung eines rohen Impfstoffs
Zu 1 I Ausgangskultur v/ird Alurniniumoxyd in ausreichender Menge gegeben. Das Gemisch wird gerührt und dann bei 4° C absitzen gelassen. Dann wird ein Teil des .Überstandes so abgehebert, daß 0,56 I Gemisch zurück-'-bleiben. Nach Zugabe von Saponin und Einstellung auf pH 8,3 wird das Präparat abgeschwächt, indem Glycidaldehyd zugesetzt und das Gemisch 16 Stunden bei 25" C gerührt wird.
Herstellung eines gereinigten Impfstoffs
Zu 0,65 ml Eluat Nr. 3 entsprechend 1 I Ausgangskultur werden Aluminiumoxyd und Saponin in den vorstehend genannten Mengen gegeben. Das Gemisch wird mit einem Puffer von pH 8,3 auf 0,561 aufgefüllt. Die "Abschwächung wird unter den oben genannten Bedingungen vorgenommen.
Die beiden Impfstoffe enthalten die gleiche Menge von abgeschwächten kompletten Viruspartikeln. Ihre Unschädlichkeit für junge Mäuse wird kontrolliert.
Herstellung eines zellulären Test-Antigens
Die Zellen einer BHK 21-Kultur in Suspension werden dreimal in einem physiologischen Puffer gewaschen und abschließend in einem solchen Volumen des Puffers aufgenommen, daß die Konzentration an Zellen etwa 2xl0Vml beträgt. Die Zellsuspension wird dann der Einwirkung von Ultraschall unterworfen (22 kHz/Sek. ■für 10 Minuten; Temperatur bei etwa 8° C gehalten). Durch Beobachtung unter dem Mikroskop wird festgestellt, daß fast sämtliche Zellen aufgelöst sind. Das Präparat wird anschließend durch Zentrifugieren und Filtration geklärt und dann auf eine Konzentration an mit Säure Ausfällbarem von 7 mg/ml verdünnt.
1 ml zelluläres Antigen und die Tiere der Gruppe 2 1 ml gereinigtes Antigen. An jedem Meerschweinchen wird beobachtet, ob es allergische Erscheinungen des anaphy-Iaktischen Typs und des Typs der verzögerten Überempfindlichkeit zeigt. Insbesondere werden in der Reihenfolge zunehmender Schwere die folgenden Erscheinungen beobachtet:
a) Kutane Allergie: Kratzen am Maul, an den Ohren usw.
b) Respiratorische Spasmen: schnelles und stoßweises Atmen, Husten.
c) Cyanose der Ohren
d) Tod, der im allgemeinen in den 30 Minuten nach der Injektion des Test-Antlgens eintritt.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt, die die Zahl der iVi&mcVvc^hen von 10 Tieren angibt, die eine dieser Erscheinungen zeigten.
Herstellung des gereinigten Test-Antigens
50
In dem gleichen physiologischen Puffer wird ein aliquoter Teil des Eluats Nr. 3 so verdünnt, daß seine volumetrische Konzentration im Verhältnis zur Ausgangskultur 30 beträgt (im vorliegenden Fall Verdünnung auf das 50fache).
Versuche an Meerschweinchen
Als Versuchstiere werden Albinomeerschweinchen von etwa 400 g verwendet. 20 Meerschweinchen erhalten Intramuskulär 1 ml des rohen Impfstoffs und werden dann in 2 Gruppen zu je 10 Tieren geteilt (Gruppe 1 und Gruppe 2). 10 Meerschweinchen erhalten intramuskulär 1 ml des gereinigten Impfstoffs (Gruppe 3).
Die drei Gruppen von Meerschweinchen werden 3 Wochen beobachtet (Futter und Wasser »ad libitum«). Die Tiere der Gruppen I und 3 erhalten dann Intravenös Diese Ergebnisse zeigen zweifach, daß der gereinigte Impfstoff, der die gleiche Menge an immunogenem Antigen wie der rohe Impfstoff enthält, beim Meerschweinchen keine Sensibilisierung hervorruft.
Eine Anwendung dieses Reinigungsverfahrens gemäß der Erfindung ist die Herstellung eines kein Sensibillsierungsvermögen aufweisenden MKS-Impfstoffs aus Viruskulturen auf BHK 21-Zellen.
Beispiel 15
SelektiveTrennung zwischen kompletten MKS-Viruspartikeln und MKS-Virus-Subpartikeln.
Zu einer Kultur des MKS-Virus des Typs A, gezüchtet auf Lingualepithel von Rindern, gibt man jeweils
A) 4 g/100 mi Äthyienoxydpoiymerisat vorn Molekulargewicht 100 000
B) 3 g/100 ml des gleichen Polymerisats
C) 2 g/100 ml des gleichen Polymerisats.
Die Gemische werden 15 Minuten gerührt, worauf die Suspensionen zentrifugiert werden und der Überstand (Nr. 1) vom Sediment abgetrennt wird. Die Überstände v/erden in einem 0,15molraen EDTA-Puffer vom pH-Wert 7,4 aufgenommen. Die Gemische werden 1 Stunde gerührt und dann zur Entfernung eines unlöslichen Stoffs zentrifugiert. Das Volumen der hierbei erhaltenen Eluate (Nr. 1) wird gemessen, worauf ihre volumetrlschen Konzentrationen (n) bestimmt werden.
Zum Überstand Nr. 1 (B und C) gibt man 1 3/IOOnil bzw. 2 g/100 ml Äthylenoxydp&lymerisat. Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt, worauf die Suspensionen zentrifugiert und die Überstände (Nr. 2) von den Sedimenten abgetrennt werden. Die Sedimente worden in der oben beschriebenen Weise behandelt, wobei Eluate (Nr. 2) erhalten werden, deren volumetrische Konzentrationen (n) bestimmt werden.
An jedem Eluat und an jedem Überstand wird der Titer an Viruspartikeln In Komplementbindungseinhei-
Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 J
Kutane Allergie 10 0 0 ;
Respiratorische 10 0 0
Spasmen
Cyanose 9 0 0 ;
Tod 7 0 0 f
ten und die infektiösen Dosen bei Gewebekulturen bestimmt. Für die Eluate wird außerdem der Anteil an kompletten Viruspartikeln (140S) und Vlrus-Subpartikeln (12 bis 14S) auf die In Beispiel 13 beschriebene Weise bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.
KBE/ml IDGK/ml Partikeln
140S		 Partikeln
12-14S		 A Mol zweiwertiges
Kation pro/1
Virussuspension
Ausgangskultur 8 ΙΟ6·3 B
Überstand 1
Eluat Nr. 1 l/n		 0
8		 103·9
106·5 		40% 60% C 4,60 X 10-·>
Überstand 1
Eluat 1 l/n
Überstand 2
Eluat 2 l/n		 2
6
0
2		 103·9
106·'
103·5
1O3·7 		50%
0%		 50%
100%		 3,6 X 10"3
<io-}
Überstand 1
Eluat 1 l/n
Überstand 2
Eluat 2 l/n		 6
2
0
6		 105·7
105·9
10J·5
105·9 		100%
20%		 0%
80%		 2,1 X 10-J
<2 X1O-J
Dieses Beispiel zeigt, daß eine Konzentration des Poly- der beiden Eluats (1 und 2) wird bestimmt,
merisats von 3% g/100 ml) genügt, um die gesamten Die Überstände und die Eluate werden zur Ermittlung
kompletten Partikel 140 S zu adsorbieren, und daß diese von Komplementbindungseinheiten und Infektiosität ti-
Partikel bevorzugt vor den nicht kompletten Partikeln 30 triert, und der Titer an kompletten Viruspartikeln wird adsorbiert werden.
Beispiel 16
Dieses Beispiel soll die wesentliche Rolle des Calciumions bei der Adsorption des MKS-Virus veranschaui|ichen:
Bekanntlich bildet EDTA mit Calcium einen stabileren Komplex als mit Magnesium. Dies kann durch die folgende Gleichung dargestellt werden:
40 auf die in Beispiel 13 beschriebene Weise bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.
KBE/ml IDGK/ml KBE/ml Mit Säure 140S Fällbares
EDTA-Mg + Ca+
EDTA-Ca + Mg++
Hieraus folgt, daß der Komplex EDTA-Mg mit Calcium einen neuen Komplex zu bilden vermag: EDTA-
Ausgangs- 10 106·5
kultur
Überstände 0 103·9
Eluat 1 l/n 10 106·7
Eluat 2 l/n 10 106·5
100%
43%
21%
45
Die einzigen Kationen, die mit EDTA Komplexe zu bilden vermögen, sind in den Kulturen des MKS-Virus das in das Kulturmeaium eingeführte Calcium und Magnesium. Diese beiden Typen von ternären Komplexen können sich von vornherein gemäß dem folgenden Prozeß bilden:
1) Virus-Mg-Polymerisat
2) Virus-Ca-Polymerisat
Diese beiden Komplexe können mit EDTA löslich gemacht werden. Lediglich der zweite Komplex kann mit dem Komplex EDTA-Mg löslich gemacht werden.
Zu einer Kultur des MKS-Virus des Typs C, gezüchtet auf Lingualepithel von Rindern, werden 4 g/100 ml Äthylenoxydpolymerisat vom Molekulargewicht 100 000 gegeben. Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt, worauf die Suspension in zwei gleiche Teile geteilt wird, die getrennt zentrifugiert werden. Die Überstände werden beseitigt und die Sedimente (1 und 2) in je V10 des Volumens an 0,15molarem EDTA-Puffer bzw. 0,15molarer EDTA-Mg-Lösung suspendiert. Die Gemische werden 1 Stunde gerührt und zur Entfernung eines unlöslichen Stoffs zentrifugiert. Die volumetrische Konzentration (n) Es ist festzustellen, daß die gesamten Viruspartikel durch den EDTA-Mg-Komplex eluiert worden sind, während ein geringerer Prozentsatz an mit Säure Fällbarem (5%ige Trichloressigsäure) eluiert worden ist. Dies Sseweist, daß der bei diesem Verfahren gebildete ternäre Komplex zum Typ Viruspartikel-Ca-Polyäthylenoxyd gehört.
Beispiel 17
Herstellung eines unlöslichen Komplexes von Polyäthylenoxyd-zweiwertige Kationen-Viruspartikel.
Zu 51 einer Kultur von MKS-Virus Typ A weVden 4 g/100 ml Polyäthylenoxyd vom Molekulargewicht 100 000 gegeben. Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand (Nr. 1) wird entfernt und das Sediment in 166 ml 0,15molarem EDTA-Puffer vom pH-Wert 7,4 suspendiert. Die Suspension wird 1 Stunde gerührt und dann zentrifugiert. Hierbei werden 200 ml Überstand (Eluat Nr. 1) erhalten.
Zu 160 ml dieses Eluats entsprechend 41 Ausgangskultur werden 8 g/100 ml des gleichen Polymerisats gegeben. Das Gemisch wird 72 Stunden gerührt und dann zentrifugiert. Der überstand (Nr. 2) wird entfernt und das Sediment in der Mindestmenge von 0,02molarem
ί7
Tris-Puffer suspendiert, der einen pH-Wert von 7,6 hat und 2,4 g/l CaCI2 ■ 2H2O enthält. Auf diese Welse wird eine Paste erhalten, die ein Volumen von 8 ml und ein Gewicht von 8,6 g hat. Diese Paste enthält die gesamten Viruspartikel der Kultu«.
KBE/ml IDGK/ml Mol zweiwertiges Kation pro/1 Virussuspension
Beispiel 19
Kultur 8 106·3
Überstand Nr. 1 O 104·1
Eluat Nr. 1 8 106·5
Verdünnung 1/25
Überstand Nr. 2 O 103·5
Verdünnung 1/25
6,0 X ΙΟ"3
In einem physiologischen Puffer werden 1,1 g dieser .'■Paste (entsprechend 510 ml Kultur) suspendiert. Zur Suspension werden Aluminiumhydroxyd und Saponln In geeigneten Mengen gegeben. Das Gemisch wird mit dem Puffer auf 269 ml aufgefüllt.
Ferner wird zu 510 ml der Ausgangskultur die gleiche Menge Aluminiumhydroxyd gegeben, das man absitzen läßt. Der Überstand wird abgehebert, bis die Suspension ein Volumen von 269 ml hat, worauf Saponln in der gleicher. Konzentration wie vorher zugesetzt wird.
Die beiden Präparate werden mit Formol unter gleichen Bedingungen inaktiviert, worauf ihre Unschädlichkeit für junge Mäuse nachgeprüft wird.
Die Wirksamkeit der beiden in dieser Weise hergestellten Impfstoffe wird durch Ermittlung der Dosis, die 5096 der Tiere schützt (SD50) an Meerschweinchen bestimmt.
SD50
Impfstoff Nr. 1 15 μΐ
Impfstoff Nr. 2 20 μΐ
(Test-Antigen: MKS-Virus Typ A)
Beispiel 18
Konzentrierung von Viruspartikeln, die mit einem Inaktivierungsmittel abgeschwächt worden sind.
Eine Kultur von MKS-Virus Typ O wird mit Glycidaldehyd in einer Konzentration von 0,05% 16 Stunden bei 25° C abgeschwächt. Ein solches Präparat ist nicht mehr virulent. Zu 11 dieses Präparats werden 4 g/100 ml Äthylenoxydpolymerisat vom Molekulargewicht 100 000 gegeben. Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Sediment in 30 ml 0,15molarem EDTA-Puffer vom pK-Wert 7,4 suspendiert. Die Suspension wird 1 Stunde gerührt und dann zentrifugiert. Das Unlösliche wird entfernt und der Überstand, der das Eluat darstellt, zur Ermittlung der Komplementbindungseinheiten titriert. (Volumen des Eluats 35,6 ml).
KBE/ml
Unlöshchmachung von auf der Zellkultur gezüchtetem Tollwutvirus nach dem Verfahren gemäß der Erfindung. Zu 11 einer Kultur des Tollwutvirus, das auf der Zellkultur gezüchtet worden Ist, werden nach Inaktivierung der Infektionstüchtigkeit und Klärung durch Zentrifugleren 1,2 g CaCI2 und dann 20 g (2%) Polyäthylenoxyd vom Molekulargewicht 100 000 gegeben. Das Gemisch wird eine Nacht bei 4° C gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Sediment In 500 ml Phosphatpuffer (0,15molar, pH 7,6), der Ig CaCI2 · IW1OIX enthält, suspendiert. Die Suspension wird 30 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Dei Überstand wird entfernt und das Sediment In 100 ml isotonischem Phosphatpuffer suspendiert.
Der Vergleich der Antlgenltät der rohen Tollwutvlruskultur und des unlöslich gemachten Virus nach ZurückfUhrung der Suspension auf das ursprüngliche Volumen der Kultur wurde nach dem Test von Habel, beschrieben in »Laboratory
'durchgeführt.
Techniques in Rabies, WHO-1966«, -:.'
50%-Schutzindex
Ausgangskultur
Überstand
Eluat 1/28,1
Roher Impfstoff 5,55
Unlöslich gemachter Impfstoff 5,40
Die Ergebnisse zeigen, daß das In dieser Weise unlöslich gemachte Tollwutantigen sein Immunisierungsver-■rhögen bewahrt.
Beispiel 20
J5 Unlöslichmachung des auf Nervengewebe gezüchteten Tollwutvirus zur Herstellung eines »MKS-Tollwut-Mischimpfstoffs«.
Zu 41 einer 5% Nervengewebe enthaltenden Suspension von Tollwutantigen, das auf dem Hirnmaterial von neugeborenen Mäusen gezüchtet und abgeschwächt woräen ist. werden 4,8 g CaCl2 - 2H2O und dann 80 g (2%) Polyäthylenoxyd vom Molekulargewicht 100 000 gegeben. Das Gemisch wird eine Nacht bei 4° C gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Sediment in 2 1 Phosphatpuffer (0,15moiar, pH 7,6), der 1 g CaCl2 - 2H2O/I enthält, suspendiert. Die Suspension wird 30 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Sediment in 11 Phosphatpuffer, der Calcium enthält, suspendiert. Die Suspension wird, wie vorstehend beschrieben, gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Sediment wieder in 21 isotonischem Phosphatpuffer suspendiert. Diese Suspension stellt das Präparat von unlöslich gemachtem Tollwutantigen dar.
Die vorstehend beschriebenen Maßnahmen haben den Zweck,
a) die gesamten nicht am Träger (Polyäthylenoxydzweiwertige Kationen) adsorbierbaren Verunreinigungen des Tollwutvirus zu entfernen,
b) das Tollwutvirus am Träger zu binden (Unlöslichmachung) und
c) am Träger auch die adsorbierbaren Verunreinigungen, insbesondere die proteolytischen Enzyme, deren enzymatische Aktivität auf diese Weise teilweise blockiert wird, zu binden.
Zur Beurteilung der Wirksamkeit werden zwei Typen von MKS-Tollwut-Mischimpfstoffen hergestellt:
50%-Schutzindex
MischimpfstofTNr. 1
Mischimpfstoff Nr. 2
6,0 6,5
% Die Wertbemessungen des Immpnlslerungsyerrnögens gegen MKS "werden an Meerschwöinciien und (Rindern',"^ vorgenommen. \
a) Meerschweinchen:
?und Tabelle 2), der nach Alterung (3 Tage bei 37° C oder ?4>, Monate bei 4° C) vorgenommen wurde, zeigt, daß die ijvIKS-Antigene in dem hergestellten Misehimpfstoff Nr. 2 viel stabiler sind als im Impfstoff Nr. 1.
35 20
a) Ein Mischimpfstoff, In dem das Tollwutantlgen aus der Suspension des zerkleinerten ursprünglichen Hirnmaterials der Mause besteht (Impfstoff Nr. 1), und
b) ein Misehlmpfstoff, In dem das Tollwutantlgen aus der Suspension des unlöslich gemachten Tollwutvirus besteht (Impfstoff Nr. 2).
Die Wertbemessungen des Immunisierungsvermögens der beiden Mischimpfstoffe gegen Tollwut wird nach dem Habel-Test durchgeführt.
Tabelle 1
Qualitätskontrolle an Meerschweinchen und Rindern, die mit einem MKS-Virus Typ C infiziert wurden.
Wirksamkeitsmessung an
Rindern
Zahl generalisierter
Tiere von 5
Tage 3 Tage
bei 4° C bei 37° C
Wirksamkeitsmessung an Meerschweinchen
50%-Schutzdosis in μΙ
3 Tage 3 Tage bei 4° C bei 37° C
MKS-Impfstoff 1/5
allein
Mischimpf- 1/5
stoff Nr. 1
Mischimpf- 1/5
stoff Nr. 2
1/5
4/5
1/5
583
5»
266
1066
133
t\ Tabelle
Bestimmt wird die 50%-Schutzdosls (SD50) bei den Intramuskulär geimpften Tieren, ausgedrückt in μ) Impfstoff. ·
b) Rinder:
5 Rinder erhalten subkutan Ά Dosis Impfstoff, Notiert so fwird die Zahl der nach dem 3 Wochen nach der Impfung' durchgeführten Virulenztest »generalisierten« Tiere. ..< Der Vergleich der beiden Impfstofftypen (Tabelle 1 Wirksanikeitsmessung an Rindern, die mit MKS-Virus der drei Typen Ο,Ά und C infiziert wurden.
'Gesamtzahl generalisierter Tiere von 5 beim Typ
OAC
Impfstoff Nr. 2, 0/5 0/5 1/5
,. ZeitO
Impfstoff Nr. 2 0/5 \!Ϊ5 1/5
nach 6rnonatiger
Aufbewahrung :
bei 4°C

Claims (7)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Konzentrierung und Reinigung von Suspensionen von Viruspartikeln, die Insbesondere für die Herstellung von Impfstoffen geeignet sind, dadurch gekennzeichnet, daß man In einer ersten Stufe zur Suspension ein Polyäthylenoxid mit einem Molekulargewicht von 100 000 bis 300000 gibt, das mit Calciumlonen einen unlöslichen Kornplex zu bilden vermag, an dem die Viruspartikel absorbiert werden, wobei das Calclumlon im verwendeten Polyäthylen vorhanden 1st oder der Virussuspension außer dem Polyäthylenoxid Calciumlonen zugesetzt werden, daß man den gebildeten unlöslichen Komplex vom flüssigen Überstand durch Zentrifugleren abtrennt und in einer zweiten Stufe das in dieser Welse gebildete Präzipitat durch Zusatz eines Koniplexblldners für das Calciumion löslich macht und ·
acnach erneuter Zentrifuglerung zur Entfernung des ^unlöslichen Teils eine konzentrierte und gereinigte r Virussuspension gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man der Virussuspension 2 bis 4 g des 'Polyäthylenoxids pro 100 ml zusetzt.
: 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer ersten Stufe zur Suspension ein Polyäthylenoxid mit einem Molekulargewicht von 100 000 gibt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man von einer Virussuspension ausgeht, die eine flüssige Kultur des Maul- und Klauenseuche-Virus auf BHK-Zellen in Suspension ist, und daß man nach der Löslichmachung der in der ersten Stufe erhaltenen Fällung zusätzlich die erhaltene Suspension mit einem halogenierten Kohlenwas-
* serstoff in bekannter Welse einer Behandlung zur Entfernung von allergenen Substanzen unterwirft, und daß man die hiernach gebildete Fällung durch Zentrifugieren abtrennt und eine konzentrierte und gereinigte Virussuspension gewinnt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur selektiven Abtrennung von kompletten MKS-Virionen von den MKS-Capsomeren eine erste Adsorption an dem unlöslichen Komplex vornimmt und die Fällung mit einem ersten Komplexbildner löslich macht, anschließend eine zweite Adsorption der so erhaltenen Suspension an dem unlöslichen Komplex und eine erneute Löslichmachung mit einem zweiten Komplexbildner vornimmt und hierbei eine auf etwa das lOOOfache konzentrierte Suspension gewinnt, in der die Gewinnung der kompletten Virionen quantitativ ist, und gegebenenfalls eine dritte Adsorption der so konzentrierten Suspension an dem unlöslichen Komplex und eine erneute Löslichmachung des Komplexes vornimmt und hierbei eine etwa 1500fache konzentrierte Suspension gewinnt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die kompletten MKS-Virionen ■selektiv von dem MKS-Capsomeren einerseits und von den Antigenen der auf BHK-21-Zellen in Suspension gebildeten Viruskultur mit Sensibiljsierungsvermögen für das Rind andererseits durch drei aufeinanderfolgende Zyklen von Adsorption und Desorption abtrennt, wobei man die Adsorptionen an dem unlöslichen Komplex und die Desorption mit einem Komplexbildner vornimmt.
7. Verwendung der nach Anspruch 6 erhaltenen MKS-Vlrlonen zur Herstellung eines MKS-Impfstoffs.
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