DE2463223C2

DE2463223C2 - Präzipitat von Polyäthylenoxid und Calcium- oder Magnesium-Ionen und daran adsorbierten Viruspartikeln und seine Verwendung zur Herstellung von Impfstoffen

Info

Publication number: DE2463223C2
Application number: DE19742463223
Authority: DE
Inventors: Philippe Adamowicz; Paul Azay le Rideau Prunet
Original assignee: Laboratoire Roger Bellon Sa Neuilly-Sur-Seine Fr
Current assignee: Laboratoire Roger Bellon Sa Neuilly-Sur-Seine Fr
Priority date: 1973-09-04
Filing date: 1974-09-03
Publication date: 1985-03-14
Also published as: FR2242463A1; FR2242463B1; ES429747A1; AR200354A1; DE2442059C2; DE2442059A1; GB1483222A

Description

Erfindungsgegenstand Ist das Im Patentanspruch 1 angegebene Präzlpltat. Die Ansprüche 2 bis 5 rinnen Ausgestaltungen der Erfindung. Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung eines oder mehrerer dieser Präzlpitate zur Herstellung von Impfstoffen.

2i> Die Konzentrierung von Virussuspensionen erfolgt Üblicherwelse nach mehreren Verfahren, die auch zur Konzentrierung von Proteinen und allgemeiner von biologischer Makromolekülen angewendet werden. Insbesondere

a) durch Precipitation durch Senkung der Dielektrizitätskonstante der Virussuspension, durch Zusatz von :5 organischen Losungsmitteln, die mit Wasser mischbar sind, z. B. Äthylalkohol und Methylalkohol, usw.,

b) durch Precipitation durch Veränderung der Salzkonzentration der Virussuspension, Indem entweder Salze wie Ammoniumsulfat zugesetzt oder beispielsweise durch Dialyse gegen ein Medium der Ionenkraft Null entfernt werden,

c) durch Verteilung In einem Zweiphasensystem von Losungsmitteln, das Hochpolymere enthalt,;.. B. In dem System Dextran/Polyathylenglykol,

d) durch Precipitation durch Zusatz von Polyflthylenglykol zur Virussuspension und

e) nach anderen Verfahren, z. B. Ultrafiltration und Sedimentation in einem sehr hohen Schwerkraftfeld durch Ultrazentrifugalion.

.<5 Viele dieser Verfahren führen zu einer Denaturierung der Viruspartikel und damit zu Verlusten und ergeben geringe Konzentrierungsfaktoren. Die anderen Verfahren eignen sich nicht zur Behandlung großer Mengen von Viruspräparaten.

Aufgabe der Erfindung Ist es, unlösliche Viruskomplexe zu schaffen, die eine quantitative Abtrennung und Gewinnung von Viruspartikeln erlauben, wobei die geschilderten Nachtelle vermieden werden.
... Diese Aufgabe wird gelöst durch die Präzlpitate gemäß den Patentansprüchen und die Verwendung dieser unlöslichen Viruskomplexe für die Herstellung von Impfstoffen.

Gegenstand der Erfindung Ist ein Präzlpltat bzw. Komplex bei dem Viruspartikel an einem unlöslichen Trager adsorbiert sind, der aus einem Komplex besteht, der aus einem Calcium- oder Magnesiumion und einem Polymerisat von Äthylenoxid der allgemeinen Formel HCMCHr-CHjO)_n-H mit einem Molekulargewicht von f, 100 000 bis 300 000 gebildet worden Ist (vgl. hierzu den Patentanspruch I).

Die unlöslichen Viruskomplexe werden durch Assoziation zwischen den Viruspartikeln und dem aus zweiwertigen Kation und Äthylenoxidpolymerisat bestehenden Träger gebildet durch Zugabe des PolyBthylenoxlds zu einer Suspension von Viruspartikeln, wobei die Viruspartikel an dem Komplex absorbiert werden und wobei die Calcium- oder Magnesiumionen Im verwendeten Polyäthylenoxid vorhanden sind oder der Virussuspension s» außer dem Polyäthylenoxid Calcium- oder Magnesiumionen zugesetzt werden und Abtrennen des gebildeten unlöslichen Komplexes vom flüssigen Überstand durch Zentrifugleren.

Die unlöslichen Viruskomplexe lassen mit Hilfe von Komplexbildnern für die zweiwertigen Kationen, z. B. Athylendlamlntetraesslgsäure (EDTA) und Ihren Salzen oder Citronensäure und Ihren Salzen löslich machen und können anschließend zur Gewinnung einer Virussuspension, deren Konzentration bis zu lOOOmal höher Ist i> als die der Ausgangssuspension, verwendet werden ohne wesentlichen Verlust an Viruspartikeln In Lösung.

Demgemäß können erflndungsgem&ße Präzlpitate durch wiederholtes Auflösen des abgetrennten unlöslichen Komplexes mittels In Lösung befindlicher Komplexbildner für die Calclumlonen oder Magnesiumionen, Abtrennen vom unlöslich gebliebenen Teil und anschließende erneute Zugabe von Polyäthylenoxid und Absorption der Viruspartikel an dem unlöslichen Komplex und Abtrennung vom flüssigen Überstand erhalten werden.

Die Präzlpitate oder Komplexe ermöglichen außerdem die selektive Trennung zwischen vollständigen Vlruspartlkeln und Vlrus-Subpartlkeln.

Zur Herstellung von Impfstoffen wird Insbesondere das Präzlpltat In der Mindestmenge eines Puffers vom pH-Wert 7,6, der Calcium- oder Magnesiumionen enthalt, unter Bildung einer Paste und dann In einem physiologischen Puffer suspendiert und die hierbei erhaltene Suspension In bekannter Welse zu Impfstoff aufgearbeitet. (.s Über die Präzlpitate Ist auch die Gewinnung von vollständigen Maul- und Klauenseuche-Vlruspartlkcln möglich, die auf BHK-Zellcn (Baby Hamster Kidney) oder auf beliebigen anderen Zellen, die für das Rind hclerelog sind, gezüchtet werden, und fast vollständig von zellularen antlgcncn, Insbesondere senslblllslcrcndcn Anllacncn befreit sind.

Für die Zwecke der Erfindung werden Äthylenoxidpolymere mit einem Molekulargewicht von 100000 bis 300000, Insbesondere von 100 000 verwendet. Diese sind Im Handel erhältlich. Diese Polymerisate enthalten selbst eine nicht unbeachtllche Menge von zweiwertigen Kationen. Beispielswelse wurden für diese Polymerisate die folgenden Konzentrationen an zweiwertigen Kationen gefunden.

	Ungefähres Molekulargewicht	Konzentration an zweiwertigen Kationsn
Polymer 1	100 000	0,133 X 10-³ Mol/g
Polymer 2	200 000	0,112 X 10-³ Mol/g
Polymer 3	300 000	0,11OX ΙΟ"³ Mol/g

ESn unlöslicher Komplex, der aus zweiwertigen Kationen und einem Äthylenoxldpolymerisat besteht, kann !5 beispielsweise wie folgt hergestellt werden: Man führt 4 g Äthylenoxidpolymerisat Polymer 1 In 100 ml 0,02 molaren tris-HCI-Puffer ein, der einen pH-Wert von 7,6 hat. Das Gemisch wird gerührt und dann zentrifugiert. Hierbei wird ein Überstand und ein Sediment 1 erhalten. In der gleichen Welse werden 4 g Polyäthylenoxid Polymer 1 In 100 ml einer Magnesiumsulfatlösung von 2x10° Mol/l eingeführt. Das Gemisch wird gerührt und zentrifugiert, wobei ein Überstand und ein Sediment 2 erhalten werden. Die quantitative Bestimmung der zweiwertigen Kationen In den Sedimenten durch Kompiexomeirie hat die folgenden Ergebnisse:

Sediment 1 0,22 χ 10-³MoI Sediment 2 0,47 χ 10³ Mol

Ein solches unlösliches Material, das durch Komplexblndung zwischen zweiwertigen Kationen 'md einem Äthylenoxidpolymeren gebildet wird, wird durch Einwirkung von Chelatbildner» für zweiwertige Kationen In genügender Konzentration löslich gemacht. Ebenso wird kein unlöslicher Komplex gebildet, wenn 4 g Äthylenoxldpolymerlslsat Polymer 1 In eine Lösung eingeführt wird, die ein Chelat von zweltwertlgen Kationen, z. B. Äthylendlamlntetraesslgsäure (EDTA) enthält.

Für die Gewlu.iung des Präzlpltats Ist es vorteilhaft, ein Äthylenoxldpolymerisat mit einem Molekulargewicht von 100 000 zu verwenden, wie Ir. Beispiel 1 veranschaulicht.

Bei gewissen Viruskulturen kann es vorteilhaft sein, der zu konzentrierenden Suspension Calcium zuzusetzen, wie In den Beispielen 3 und 4 veranschaulicht. Als allgemeine Regel ist die zur Bildung eines Komplexes aus Viruspartikeln, Calcium oder Magnesium und Äthylenoxldpolymerisat führende Adsorption der Viruspartikel M um so vollständiger, je größer die am Polymerisat gebundene Menge des Calciums oder Magnesiums 1st. Dies wird durch die Beispiele I, 2 und 3 veranschaulicht.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. Diese Beispiele zeigen, daß das Verfahren ganz allgemein auf die verschiedensten Gruppen von Viren und Viruspartikeln anwendbar äst:

Gruppe der Plcornavlren (Maul- und Klauenseuche-Virus und Polyomyelltls-Virus) Gruppe der Myxovlren (Grippevirus uad Newcastle-Vlrus) Gruppe der Rabdhovlren (Tollwutvirus) Beispiel 1

Zu 1 I einer Kultur des MKS-Virus Typ C, gebildet auf dem Llngualeplthel des Rindes, werden 40 g Äthylenoxldpolymerisat gegeben. Die Suspension wird 15 Minuten gerührt und bei 3000 g zentrifugiert. Der Überstand wird auf Infektlosltät und Komplementblndungselnhelten untersucht. Durch Komplexometrle wird die Im Sediment enthaltene Menge an zweiwertigen Kationen quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind In der folgenden 5" Tabelle genannt.

	KBE/1··)	MXJ K/ml")	Zweiwertige Kationen, Mol	Sediment 1*)
Ausgangskullur	8000	10"		Sediment 2*)
Überstand I*)	0	ΙΟ·¹-³	4,84 X 10-^J	Sediment 3*)
Überstund 2*)	100	IO¹'	4,04 X ΙΟ"³
Überstand 3*)	6000	IO⁵-¹	1,70 X 10"¹

·) 1 Mnlckuhiriicwichl des verwendeten Alhyknimdpiilyinerisals KK] IKM)
2: Molekulargewicht des verwendeten Athylenoxidpolymcrisais 20(IU(K)
3: Molekulargewicht des verwendeten Alhylenoxidpolynierisatv .1(H)(MK)
·') KHF: Komplenicntbindunnscinheilen

IDCiK. Inl'eklinsc Düsen auf liewehekullurcn

Dieses Beispiel zeigt, daß der mit dem Polymerisat vom Molekulargewicht 100 000 gebildete Komplex die Viren am besten adsorbiert hat.

Beispiel 2
Zu drei Proben von je 1 I Kultur des MKS-Virus Typ C, gebildet auf Llngualeplthel von Rindern, gibt man

j A) 40 g Äthylenoxidpolymerisat vom Molekulargewicht 100000;

B) 30 g Äthylenoxldpolymerisat vom Molekulargewicht 100 000; C) 20 g Äthylenoxldpolymerisat vom Molekulargewicht 100 000.

Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt, worauf zentrifugiert wird und die Überstände von den Sedimenten ίο abgetrennt werden. Der Überstand wird auf Komplementblndungseinhetten und Infektiosllät untersucht. Die in den Sedimenten enthaltene Menge an zweiwertigen Kationen wird quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.

	KBE/1	IDGK/ml	Zweiwertige Kationen, Mol	Sediment A
Ausgangskultur Überstand A	8200 0	10^5J 10¹·³	4,92 X 10-³	Sediment B
Überstand B	600	IO⁵·⁵	3,76 x ür³	Sedimeni C
Überstand C	2000	10⁴·⁷	2,30 X ΙΟ"³

Durch Zusatz von 4% des Polymerisats konnte somit die beste Adsorption der Viren am unlöslichen !Komplex erzielt werden.

Beispiel 3 Zu zwei Proben von je 1 1 Kultur des MK3-Vlrus Typ O, gebildet auf Llngualeplthel von Rindern, gibt man A) 40 g Äthylenoxldpolymerisat vom Molekulargewicht 100000, B) 1.2 g CaCl: - 2H₂O und dann 40 g des gleichen Polymerisats wie bei (A).

Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt, worauf die Suspensionen zentrifugiert und die Überstände von den Sedimenten abgetrennt werden. Der Überstand wird zur Ermittlung der Kompleme/itblndungselnhelteri! und der Infektlosltät titriert. Ferner wird die Menge der In den Sedimenten enthaltenen zweiwertigen Kationen bestimmt.

	KBE/I	IDGK/ml	Zweiwertige Kationen. MoI	Sediment A
Ausgangskultur	8000	10^5J		Sediment B
Überstand A	2000	10'-^:	4,67 X 10-³
Überstand B	0	10·'·'	7,15 X 10-'

Diese Ergebnisse zeigen, daß die Adsorption der Virusparllkel am unlöslichen Komplex um so vollständiger Ist, je höher die Konzentration an Ca~-Ionen Ist.

Beispiel 4

A) zu 100 ml einer Kultur des Im Brutel gezüchteten Grippevirus Typ AO PR8 gibt man 2 g Äthylenoxldpolymerisat. Die Suspension wird 3 Minuten gerührt und zentrifugiert. Der Überstand und das Sediment werden getrennt.

B) Zu 100 ml der gleichen Kultur gibt man 120 mg CaCIi · 2H,0 und dann 2 g Polymerisat. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt und zentrifugiert. Der Überstand wird abgetrennt.

Der Überstand wird zur Ermittlung der Hämaglutlnatlonselnhelten (HE) titriert. Die folgenden Ergebnisse werden erhalten:

HE/ml

Ausgangskultur 512
Überstand A 64

Überstand B 0 Beispiel 5 Konzentrierung einer Suspension des auf Llngualeplthel von Rindern gezüchteten MKS-Virus unter Verwen-

dung des Präzlpltats.

Zu einem Volumen V einer Kultur des auf Llngualeplthcl von Rindern gezüchteten MKS-Virus gibt man 4 g Äthylenoxidpolymerisat vom Molekulargewicht 100000/100 ml. Die Suspension wird 15 Minuten gerührt und dann bei 3000 g zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt. Das gewonnene Sediment wird dann In einem Dreißigstel des Volumens von 0,!5molarem EDTA-Puffer von pH 7,4 aufgenommen. Das Gemisch wird eine Stunde gerührt und dann zur Entfernung einer geringen Menge unlöslichen Materials zentrifugiert. Das Volumen des Eluats V wird gemessen. Der Konzentrlerungsfaktor betragt η - ~. Eine Fraktion dieses Eluals wird In physiologischem Puffer auf das «-fache verdünnt. Für diese Verdünnung (F.luat I//;) wird der Tltcr an Viruspartikeln In Komplementblndungselnhelten und In Infektlösen Dosen auf Gewebekulturen bestimmt. Die Ergebnisse für die drei europaischen Antlgentypen des MKS-Virus sind In der folgenden Tabelle genannt.

KBF./ml

IIXiK/nil

Konzentralion Ausheute an KBE
η

Ausgangskultur 6 Eluat Mn 6

10"·'

25,7

100% Typ 0

Ausgangskultur Eluat Mn

10^s

24,7

25,0

100% Typ A 100% Typ C

Beispiel 6

Konzentrierung von auf BHK-Zellen In Suspension gezüchteten MKS-Viren unter Verwendung des Präzlpltats mit anschließender Reinigung durch eine Behandlung mit halogenlerten Kohlenwasserstoffen nach dem französischen Patent 69 P 270. Die Behandlung hat den Zweck, allergisch machende Substanzen, die aus dem Abbau der Zellen stammen, zu entfernen.

Zu einem Volumen V der Viruskultur, die gegebenenfalls von Zelltrümmern befreit worden Ist, werden 4 g Äthylenoxidpolymerisat vom Molekulargewicht 100 000/100 ml gegeben. Die Suspension wird 30 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Sediment In 1/30 Volumen EDTA-Puffer, der 0,15 Mol NaCl/1 enthalt, suspendiert. Die Suspension wird 1 bis 2 Stunden gerührt und dann mit einem Chloroformvolumen von 5,2 χ 10-³x V versetzt, worauf weitere 10 bis 30 Minuten gerührt wird. Eine schwere und voluminöse Fallung wird sehr schnell gebildet. Das Gemisch wird zur Entfernung der Fallung bei 3000 g zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen. Dieser Überstand stellt das Eiuat dar, dessen Volumen ν gemessen wird. Eine Fraktion wird In einem physiologischen auf das η-fache (n = -^ verdünnt. Für diese Verdünnung (Eluat Mn) werden der Titer an Viruspartikeln, an Komplementblndungse'inheiten und die Infektiösen Dosen von Gewebekulturen sowie der Prozentsatz an mit Saure ausfallbarem Material, bezogen auf die Ausgangskultur, bestimmt. Die Ergebnisse für die drei europäischen Antlgentypen des MKS-Virus sind In der folgenden Tabelle genannt.

	KBE/ml	IDGK/ml	Konzentration π	Ausbeute an KBE	Durch Säure ausfa'Hbare Substanz	Mol zweiwertiges Kation pro/1 Virussuspension
Kultur Eluat Mn	4 5	10"-⁷ 10⁶·⁷	25,5	83%	7,8% Typ 0	5,88 X ΙΟ"³
Kultur Elual Mn	4 4	ΙΟ'·⁷ 1O⁵·⁵	30,8	100%	7,0% Typ A	4,87 x ΙΟ"³
Kultur Eluat Mn	4 3	ΙΟ⁷¹ ΙΟ⁷·³	30,6	75%	7,0% Typ C	4,90 X ΙΟ"³

Beispiel 7

Konzentrierung des auf dem Brutel gezüchteten Newcastle-Vlrus (Stamm Texas) unter Verwendung des mt Präzlpltats. Die Arbeitsweise Ist die gleiche wie In Beispiel 5. Die Ergebnisse der Bestimmungen am Eluat l/n sind In der folgenden Tabelle genannt.

HE/ml*) Infektiöser Konzentration Ausbeute Mol zweiwertiges

Tilcr η an Uli*) Kaiion pro/1

Virussuspension

Kultur 256 lü'¹ _ln . .„,,„, _O/i~ ·,. ι

_r. ,. __c, .,.,,„ 17,4 100% 8.62 x KH

Eluat Mn 256 ΙΟ*¹-⁹ ,;

*) ME - llamoglutinalionseinheilcn

Beispiel 8 jjjj

Ψ Konzentrierung des Tollwutvirus CVS, gezüchtet auf dem Hirn von Jungen Mäusen unter Verwendung des ^;I

Präzlpltats. | Zu 100 mi einer Suspension des zerriebenen Hirns von mit dem Tollwutvirus Infizierten jungen Mausen ;.j

werden 1,2 g CaCIj · 2H₂O und 2 g Äthylcnoxldpolymerlsat gegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt und Ί dann zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Sediment In 3,3 ml einer Lösung suspendiert, die pro

Liter 0,15 Mol EDTA und 0,2 Mol PCMNH,), enthält. Das Gemisch wird I Stunde gerührt und dann zentrlfu- j

giert. Der Überstand (1) wird für die Titration aufbewahrt und das Sediment erneut In dem gleichen Volumen 'i der Lösung suspendiert, die pro Liter 0,15 Mol EDTA und 0,2 Mol Po₄(NH₄)) enthält. Das Gemisch wird 1 ;

Stunde gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand (2) wird für die Titration aufbewahrt und das Sediment

entfernt. Die Infektiöse Dosis wird an der Maus nach dem Habel-Tcst ermittelt (DL™). Die Ergebnisse sind ^:

nachstehend genannt. :;

	ni.su	Konzentration η	Mol zweiwertiges Kation pro/1 Virussuspension
Ausgangssuspension	10*·²
Eluat 1, Mn	ΙΟ*·"	27	5,55 x 10-^J
Eluat 2. I η	10^6li	29	3,53 X 10-'
		Beispiel 9

Konzentrierung des urippevirus A entsprechend zwei Miami, gezüchtet auf dem Brutei unter Verwendung des Prflzlpltats.

Zu 1 1 virulenter Allantolsflüsslgkelt werden 1,2 g CaCI₂ - 2H₂O und dann 2% Äthylenoxidpolymerisat vom Molekulargewicht 100 000 gegeben. Die Suspension wird 30 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Sediment In 33 ml einer Lösung suspendiert, die pro Liter 0,2 Mol EDTA, 0.2 Mol (NH₄)jPO₄ und 1% Trlnatrlumcltrat enthalt. Die Suspension wird 1 Stunde gerührt und dann zur Entfernung unlöslicher Bestandteile zentrifugiert. Der Überstand wird auf Hämagglutlnatlonselnhelien titriert. Die Ergebnisse sind nachstehend genannt.

HE/mi Infektiöser Konzentration Ausheule an IiE

Titcr η

Ausgangskultur 320 10^HI> .,. , _lniW

Eluat Mn 320 10"⁴

Beispiel 10

Konzentrierung des auf dem Brutei gezüchteten Grippevirus A₂HK unter Verwendung des Präzlpitats. Die Arbeitsweise ist die gleiche wie in Beispiel 9. Die folgenden Ergebnisse werden erhalten:

HE/ml Infektiöser Konzentralion Ausbeute an HE

Tiler π

Ausgangskultur 400 10"·"

Eluat Mn 320 10'» ^Li

Beispiel 11

Konzentrierung des Grippevirus A 6qul I unter Verwendung des Präzlpitats, gezüchtet auf Schwelnenlerenzcllen. Die Arbeltswelse Ist die gleiche wie In Beispiel 9. Die folgenden Ergebnisse werden erhalten:

24 OJ 115

lli:/ml IIHiK/rnl η Ausheule an HE

Ausgangskultur 320 ΙΟ"·⁷ _

Eluat l/n 240 1 ()"·■' ^ ^n/"

Beispiel 12

Adsorption des auf liela-Zellen gezüchteten Pollomyelltls-Vlrus.

Zur Viruskultur werden. 4% Äthylenoxidpolymerisat gegeben. Die Suspension wird 15 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird auf Infektlöse Dosen von Gewebekulturen titriert. Die Ausbeute gibt hler den Prozentsatz des Virus an, der an dem das Sediment bildenden unlöslichen Komplex adsorbiert worden 1st. Die für die drei Antlgentypen des Pollomyelltls-Vlrus erhaltenen Ergebnisse sind In der folgenden Tabelle genannt.

	IDG K/ml	Ausbeute (adsorbiertes Virus in %)	Mol zweiwertiges Kation pro/1 Virussuspension
Kultur Überstand	ΙΟ'·⁷ ΙΟ⁷¹	100% Typ 1	5,2 X 10-^J
Kultur Überstand	!£	90% Typ 2
Kultur Überstand	lü"·⁵ 10⁶·¹	100% Typ 3
		Beispiel 13

Selektive Trennung zwischen vollständigen MKS-Vlruspartlkeln und Subpartikeln des MKS-Virus und Konzentrierung der kompletten Partikel um einen Faktor von etwa 1000 unter Verwendung des Prftzlpltats.

Bekanntlich können bei Kulturen des MKS-Virus zwei Typen von antlgenen Viruspartikeln auftreten: Die kompletten Vlrlonen mit einer Sedimentationskonstante von 140S und die Capsomeren mit einer Sedlmenta- ^;i tlonskonstante von 12-14 S. Es Ist ferner bekannt, daß allein die kompletten Vlrlonen gute Antigene für die impfung gegen die Mau!- und Klauenseuche slr.d.

Die selektive Trennung dieser beiden Typen von Partikeln unter Verwendung der erfindungsgemäßen Präzlpltate beruht auf dem Unterschied der Stabilität zwischen den Komplexen, die jeweils durch das Virus, das an dem aus zweiwertigen Kationen und Äthylenoxidpolymerisat bestehenden Träger adsorbiert 1st, und durch die **' am gleichen Träger adsorbierten Capsomeren gebildet werden. Der erste Komplex 1st viel stabiler als der.. velie Komplex. Das folgende Beispiel veranschaulicht den Vorteil einer solchen Verwendung.

Zu 3200 ml der MKS-Viruskultur (Typ C) werden pro 100 ml 3 g Äthylenoxidpolymerisat vom Molekulargewicht 100000 gegeben. Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand (Nr. 1) wird verworfen und das Sediment In 75 ml 0,15mo!arem EDTA-Puffer suspendiert. Die Suspension wird 1 ■>? Stunde gerührt und dann zur Entfernung unlöslicher Stoffe zentrifugiert. Der Überstand (Eluat Nr. 1) hat ein Volumen von 110 ml (entsprechend einem Konzentrierungsfaktor von 29, bezogen auf das Volumen der Ausgangskultur). Es wird festgestellt, daß dieses Eluat kein freies EDTA enthält (In diesem Fall ergibt eine Probenahme In Gegenwart der Kohle »Nolr ErlothromT« In ammonlakallschem Puffer Weinrotfärbung). Die zugesetzte EDTA-Menge wird vorher In Abhängigkeit von der Menge zweiwertiger Kationen festgelegt, die so durch komplexometrtsche Bestimmung Im Sediment gefunden wurde.

Zu 70 ml Eluat Nr. 1, entsprechend 70x29 = 2030 ml Ausgangskultur, werden pro 100 ml 3 g Äthylenoxidpolymerisat gegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde gerührt und dann zentrifugiert. Hierbei werden erneut ein Überstand (Nr. 2) und ein Sediment erhalten, das In 2 ml 0,15molarem EDTA-Puffer, der \% Trtnatrlumcitrat enthält, suspendiert wird. Die Suspension wird 1 Stunde gerührt und dann zur Entfernung einer geringen Menge ^;; unlöslicher Stoffe zentrifugiert. Der Überstand (Eluat Nr. 2) hat ein Volumen von 2.4 ml (entsprechend einem Konzentrierungsfaktor von 850).

An den Eluaten Nr. 1 und Nr. 2 und am Überstand Nr. 2 wird die Verteilung der Partikel 140S und 12-14 S durch Ultrazentrifugalion mit linearem Gradienten von Saccharose von 15 bis 45% bestimmt (Rotor MSE 3 χ 23 ml, 30 000 U/mln für 3 Stunden; Temperatur bei 8° C gehalten). Die Prozentsätze der Partikel 140 S und *> 12-14 S werden In Abhängigkeit von den relativen Mengen von komplementblndenden Einheiten jedes Peaks bestimmt. Die Ergebnisse sind In der folgenden Tabelle genannt.

	KBE/ml	24 63 223	Partikel 140 S	Partikel 12-14 S
	6 O	IDüK/ml
Ausgangskiiltur Überstand Nr. I	6	\0<" 10¹'	517»	49%
EliKit Nr. 1 Verdünnung 1/29	2	10^⁷	0%	100%
Überstand Nr. 2, Verdünnung 1/29	4	ΙΟ¹*	77%	23%
Eluat Nr. 2, Verdünnung 1/850	10"

Die Ergebnisse zeigen, daß die 850fache Konzentration quantitativ an kompletten Vlrlonen Ist, da das Eluat Nr. 1 υχΟ, η = 3,06 KBE/'itii an Pariikein 140 S und das Eiuai Nr. 2 hiervon 4xö,77 = 3,Ö8 KBE/mi enthalt (Eluat Nr. 1 bei der Verdünnung 1/29 und Eluai Nr. 2 bei der Verdünnung 1/850).

Beispiel !4

Reinigung des MKS-Virus und Konzentrierung auf das lOOOfache durch drei Zyklen von selektiver Adsorption mit anschließenden Desorptlonen unter Verwendung der Präzipllate gemäß der Erfindung.

Zu 93 I MKS Viruskultur (Typ C), gezüchtet auf BHK-Zellen In Suspension und durch Zentrifugleren und Filtration geklärt, werden 3,72 kg (4%) Äthylenoxidpolymerisat vom Molekulargewicht 100 000 gegeben. Das Gemisch wird 20 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand (Nr. 1) wird verworfen und das Sediment in 1,32 I eines Puffers huspendlert, der l,15molar an EDTA-Na_:, 0,20molar an TrIs und 0,15molar an NaCl ist und slnen pH-Wert von 7,.? hat. Die Suspension wird 2 Stunden gerührt und dann zur Entfernung eines unlöslichen Stoffs zentrifugiert. Der Überstand hat ein Volumen von 1,68 1 (entsprechend einem volumetrlschen Konzentrlerungsfaktor von 55). Es wird festgestellt, daß dieses Eluat (Nr. I) kein freies EDTA enthalt.

Zur Gesamtmenge des Eluats Nr. 1 werden 3 g/100 ml Äthylenoxidpolymerisat gegeben. Das Gemisch wird 40 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Hierbei wird ein Überstand (Nr. 2), der verworfen wird, und ein erflndungsgemäßes Sediment erhalten. Dieses wird dann In 340 ml 0,018molarcm EDTA-Puffer suspendiert. Die Suspension wird 2 Stunden gerührt und dann zur Entfernung einer geringen Menge eines unlöslichen Stoffs zentrifugiert. Der Überstand (Eluat Nr. 2) hat ein Volumen von 340 rnl {entsprechend einem voiurnetrtschen Konzentrlerungsfaktor von 272). Nach quantitativer Bestimmung des freien EDTA In diesem Eluat durch Komplexometrte wird die für die Komplexbildung notwendige äqulmolare Calcjmmenge zugesetzt. Diese Menge Ist gering und bewirkt keine Senkung des pH-Werts, die es erforderlich macht. Ihn neu einzustellen.

Zu 336 ml Eluat Nr. 2, In dem die Gesamtmenge des EDTA In dieser Welse komplexgebunden Ist, entsprechend 0,336x272 = 91,41 Ausgangskultur, werden erneut pro 100 ml 3 g Äthylenoxidpolymerisat gegeben. Das Gemisch wird 40 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Hierbei wird ein Überstand (Nr. 3), der V6*>vorfen wird, und ein Sediment erhalten, das In 60 ml des vorstehend genannten Puffers suspendiert wird. Die Suspension wird 2 Stunden gerührt und zur Entfernung eines unlöslichen Stoffs zentrifugiert. Der Überstand (Eluat Nr. 3) hat ein Volumen von 60 ml entsprechend einem Konzentrlerungsfaktor von 1520.

An den Eluaten Nr. 1, Nr. 2 und Nr. 3 und an den Überstanden Nr. 2 und Nr. 3 wird auf die In Beispiel 13 beschriebenen Weise die Verteilung an Partikeln 140S und 12-14 S bestimmt. Ferner wird das mit Säure Fällbare (5%lge Trichloresslgsäure) in der Kultur und Im Eluat Nr. 3 bestimmt, ausgedrückt In ng/ml Rinderelw»!ß. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.

KBE/ml Partikel Partikel Durch Säure Fällbares Mol zweiweri40S 12-14 S μg/ml % tiges Kation

pro/1 Virussuspension

Ausgangskultur	8	50%	50%
Überstand Nr. 1	O
Eluat Nr. 1,	8	0%	100%
Verdünnung 1/55
Überstand Nr. 2,	2	67%	33%
Verdünnung 1/55
Eluat Nr. 2,	6	OVo	100%
Verdünnung 1/272
Überstand Nr. 3,	2

540

100

2,73 X 10-³

4,50 x ΙΟ"³

Verdünnung 1/272

Fortsetzung

KBE/ml Partikel Partikel Durch Säure Fällbares Mol zweiwer-140 S 12-14 S μβ/ral % tiges Kation

pro/1 Virus- -

suspension

Eluat Nr. 3, 4 100% 0% 5 0,9 4,15 x 10-»

Verdünnung 1/1520

Die Ergebnisse zeigen, daß die Konzentrierung auf das 1520fache quantitativ an kompletten Virionen ist, und daß durch diese Operation die nicht kompletten Partikel 12-14 S allmählich entfernt werden.

Das UV-Spektrum des Eiuats Nr. 3 1st charakteristisch für ein Rlbonucleoproteln, z. B. MKS-Virus, und hat ein Absorptionsmaximum bei 259 ιτιμ und ein Minimum bei 245 πιμ. Dies bestätigt ebenso wie die quantitative Bestimmung des durch Säure Fällbaren den hohen Grad der erzielten Reinigung. is

Einen weiteren Nachwels für die Reinigung dieses Viruspräparats liefern die nachstehend beschriebenen In-vivo-Tests.

Reinigung eines rohen Impfstoffs

Zu 1 1 Ausgangskultur wird Aluminiumoxid Ir. ausreichender Menge gegeben. Das Gemisch wird gerührt und dann bei 4° C absitzen gelassen. Dann wird ein Teil des Überstandes so abgehebert, daß 0,561 Gemisch zurückbleiben. Nach Zugabe von Saponln und Einstellung auf pH 8,3 wird das Präparat abgeschwächt. Indem Glycldaldehyd zugesetzt und das Gemisch 16 Stunden bei 25° C gerührt wird.

Herstellung eines gereinigten Impfstoffs

Zu 0,65 ml Eluat Nr. 3 entsprechend 11 Ausgangskultur werden Aluminiumoxid und Saponln in den vorstehend genannten Mengen gegeben. Das Gemisch wird mit einem Puffer von pH 8,3 auf 0,561 aufgefüllt. Die Abschwächung wird unter den oben genannten Bedingungen vorgenommen. %

Die beiden Impfstoffe enthalten die gleiche Menge von abgeschwächten kompletten Viruspartikeln. Ihre Unschädlichkeit für junge Mäuse wird kontrolliert.

Herstellung eines zellulären Test-Antlgens

Die Zellen einer BHK-21-Kultur In Suspension werden dreimal in einem physiologischen Puffer gewaschen und abschließend In einem solchen Volumen des Puffers aufgenommen, daß die Konzentration an Zellen etwa 2 χ lO'/ml beträgt. Die Zellsuspenslon wird dann der Einwirkung von Ultraschall unterworfen (22 kHz/sec für 10 min; Temperatur bei etwa 8° C gehalten). Durch Beobachtung unter dem Mikroskop wird festgestellt, daß fast sämtliche Zellen aufgelöst sind. Das Präparat wird anschließend durch Zentrifugleren und Filtration geklärt und dann auf eine Konzentration an mit Säure Ausfällbarem von 7 mg/ml verdünnt.

Herstellung des gereinigten Test-Antlgens

In dem gleichen physiologischen Puffer wird ein aliquoter Teil des Eiuats Nr. 3 so verdünnt, daß seine volu- -■ metrische Konzentration Im Verhältnis zur Ausgangskultur 30 beträgt (Im vorliegenden Fall Verdünnung auf das 50fache).

Versuche an Meerschweinchen

Als Versuchstiere werden Albinomeerschweinchen von etwa 400 g verwendet. 20 Meerschweinchen erhalten intramuskulär 1 ml des rohen Impfstoffs und werden dann In 2 Gruppen zu je 10 Tieren geteilt ((Gruppe 1 und Gruppe 2). 10 Meerschweinchen erhalten Intramuskulär 1 ml des gereinigten Impfstoffs (Gruppe 3).

Die drei Gruppen von Meerschweinchen werden 3 Wochen beobachtet (Futter und Wasser »ad libitum«). Die Tiere der Gruppen 1 und 3 erhalten dann Intravenös 1 ml zelluläres Antigen und die Tiere der Gruppe 2 1 ml -" gereinigtes Antigen. An jedem Meerschweinchen wird beobachtet, ob es allergische Erscheinungen des anaphylaktlschen Typs und des Typs der verzögerten Überempflndllchkelt zeigt. Insbesondere werden In der Reihenfolge zunehmender Schwere die folgenden Erscheinungen beobachtet:

a) Kutane Allergie: Kratzen am Maul, an den Ohren usw. ^N

b) Resplratorlsche Spasmen: schnelles und stoßweises Atmen, Husten.

c) Cyanose der Ohren

d) Tod, der Im allgemeinen In den 30 Minuten nach der Injektion des Test-Antlgens eintritt.

Die Ergebnisse sind In der folgenden Tabelle genannt, die die Zahl der Meerschweinchen von 10 Tieren <>' angibt, die eine dieser Erscheinungen zeigten.

Gruppe Gruppe Gruppe
1 2 3

< Kutane Allergie 10 O O

Respiratorische Spasmen 10 0 0

Cyanose 9 0 0

Tod 7 0 0

Diese Ergebnisse zeigen zweifach, daß der gereinigte Impfstoff", der die gleiche Menge an Immunogenem Antigen wie der rohe Impfstoff enthalt, beim Meerschweinchen keine Sensibilisierung hervorruft.

Die Präzlpltate gemäß der Erfindung ermöglichen die Herstellung eines kein Senslblllsleningsvermögen aufweisenden MKS-lmpfsloffs aus Viruskulturen auf BHK-21-Zellen.

Beispiel IS

Selektive Trennung zwischen kompletten MKS-Vlruspartlkeln und MKS-Vlrus-Subpartlkeln unter Verwendung des rräzipiiäis.
'.« Zu einer Kultur des MKS-Virus des Typs A, gezüchtet auf Llngualcpilhcl von Rindern, gibt man jeweils

A) 4 g Äthylenoxidpolymerisat vom Molekulargewicht 100 000/100 ml, B) 3 g des gleichen Polymerisats/JOO ml, C) 2 g des gleichen Polymerisats/100 ml.

Die Gemische werden IS Minuten gerührt, worauf die Suspensionen zentrifugiert werden und der Überstand (Nr. 1) vom Sediment abgetrennt wird. Die Überstande werden In einem 0,15molarcn EDTA-Puffcr vom pH-Wert 7,4 aufgenommen. Die Gemische werden I Stunde gerührt und dann zur Entfernung eines unlöslichen Stoffs zentrifugiert. Das Volumen der hierbei erhaltenen Eluate (Nr. I) wird gemessen, worauf Ihre volumetrlschen Konzentrationen (n) bestimmt werden.

Zum Überstand Nr. 1 (B und C) gibt man I g bzw. 2 g Äihylenoxldpolymcrlsat pro 100 ml. Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt, worauf die Suspension zentrifugiert und die Überstande (Nr. 2) von den Sedimenten abgetrennt werden. Die Sedimente werden In der oben beschriebenen Welse behandelt, wobei Elualc (Nr. 2) erhalten werden, deren volumetrische Konzentrationen in) bestimmt werden.

An jedem Eluat und an jedem Überstand wird der Titer an Viruspartikeln In KomplemcntblndungsclnheUcn und die Infektlösen Dosen bei Gewebekulturen bestimmt. Für die Eluate wird außerdem der Anteil an kompletten Viruspartikeln (140S) und Vlrus-Subpartlkeln (12-14 S) auf die In Beispiel 13 beschriebene Welse bestimmt. Die Ergebnisse sind In der folgenden Tabelle genannt.

KBE/nil IIXiK/nil Partikel Partikel 140S 12-14 S

Mol zweiwertiges
Kaiion pro/1
Virussuspension

Ausgangskultur	8	10'··'	40%	60%
Überstand 1	O	10'·"
Elual Nr. 1. Mn	8	10'"	50%	50%
Überstand 1	2	10"'
Eluat Nr. 1, Mn	6	10"'	0%	100%
Überstand 2	O	10'·'
Eluat Nr. 2. Mn	2	H)¹-'	100%	0%
Überstand 1	6	10"·'
Eluat Nr. I, Mn	2	U)^s·"
Überstand 2	O	10¹^

4,60 X 10-

3,6 X 10-

Elual Nr. 2. Mn 6

20%

2,1 X 10"

<' 2,10 X 10-

Dleses Beispiel zeigt, daß eine Konzentration des Polymerisats von 3 g/100 ml) genügt, um die gesamten kompletten Partikel 140 S zu adsorbieren, und daß diese Partikel bevorzugt vor den nicht kompletten Partikeln adsorbiert werden

Beispiel Id

Dieses Beispiel soll die wesentliche Rolle des Calclurpions bei der Adsorption des MKS-Virus veranschaulichen.

Bekanntlich bildet EDTA mit Calcium einen stabileren Komplex als mit Magnesium. Dies kann durch die folgende Gleichung dargestellt werden:

EDTA-Mg + Ca¹

EDTA-Ca + Mg*'

Hieraus folgt, daß der Komplex EDTA-Mg mit Callum einen neuen Komplex zu bilden vermag: EDTA-Ca.

Die einzigen Kationen, die mit EDTA Komplexe zu bilden vermögen, sind In den Kulturen des MKS-Vtrus das Ir das Kulturmedium clngel'Ohrte Calcium und Magnesium. Diese beiden Typen von tcrnären Komplexen können sich von vornherein gemäß dem folgenden Prozeß bilden:

1) Vlrus-Mg - Polymerisat

2) Vlrus-Ca - Polymerisat

Diese beiden Komplexe können mil EDTA löslich gemacht werden. Lediglich der zweite Komplex kann mit dem Komplex EDTA-Mg löslich gemacht werden.

Zu einer Kultur des MKS-Virus des Typs C, gezüchtet auf Llngualepithel von Rindern, werden 4 g Äthylenoxldpolymerlsat vom Molekulargewicht 100 000 pro 100 ml gegeben. Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt, worauf die Suspension In zwei gleiche Teile geteilt wird, die getrennt zentrifugiert werden. Die Überstände werden beselig und die Sedimente (1 und 2) in je 1/20 des Volumens an 0,15molarem EDTA-Puffer bzw. 0,15mo!arer EDTA-Mg-Lösung suspendiert. Die Gemische werden 1 Stunde gerührt und zur Entfernung eines unlöslichen Stoffs zentrifugiert. Die volumetrische Konzentration (n) der beiden Eluaie (1 und 2) wird bestimmt.

Die Überstände und die Eluate werden zur Ermittlung von Komplementbindungseinheiten und Infektiosltät titriert, und der Titer an kompletten Viruspartikeln wird auf die In Beispiel 13 beschriebene Weise bestimmt. Die Ergebnisse sind In der folgenden Tabelle genannt.

	KUE/	IDGK/	KBE/ml	Mil Säure
	ml	ml	140 S	Fällbares
AusT'ingskultur	10	10"^s		100%
Überstände	I)	10'"
Eliiiil ;, Mn	10	10"·'	6	43%
Eluat 2. Mn	10	10"^s	6	21%

Es Ist festzustellen, dali die gesamten Viruspartikel durch den EDTA-Mg-Komplex eiuleri worden sind, wahrend ein geringerer Prozentsatz an mit Säure Fällbarem (5'Mge Trlchloresslgsäure) elulert worden Ist. Dies beweist, daß der bei diesem Verfahren gebildete ternäre Komplex zum Typ Vlruspartlkel-Ca-Polyäthylcnoxld gehört.

Beispiel 17

Herstellung eines unlöslichen Komplexes von Polyälhylenoxld-zwelwertlge Kallonen-Vlruspartikel.

Zu 5 I einer Kultur von MKS-Virus Typ A werden 4 g Polyälhylenoxld vom Molekulargewicht 100 000 pro 100 ml gegeben. Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand (Nr. 1) wird entfernt und das Sediment In 166 ml 0,15molarem EDTA-Puffer vom pH-Wert 7,4 suspendiert. Die Suspension wird I Stunde gerührt und Jann zentrifugiert. Hierbei werden 200 ml Überstand (Eluat Nr. 1) erhallen.

Zu 160 ml dieses Eluals entsprechend 41 Ausgangskultur werden 8 g des gleichen Polymerisats pro 100 ml gegeben. Das Gemisch wird 72 Stunden gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand (Nr. 2) wird entfernt und das Sediment in der Mlndcsimenge von 0,02molarem Trls-Pulfer suspendiert, der einen pH-Wert von 7,6 hat und 2,4 g CaCIj · 2HjO/l enthält. Auf diese Welse wird eine Paste erhalten, die ein Volumen von 8 ml und ein Gewicht von 8,6 g hat. Diese Paste enthält die gesamten Viruspartikel der Kultur.

	1	KISIi/	HKiK/	Mol /weiwcrliges
		ml	ml	K.ilion pro/!
	1/25			Virussuspension
Kultur	2.	H	K)"'
Überstand Nr.	1/25	0	H)"
Eluat Nr. I,	8	K)"'	6.0 X K)'
Verdünnung
Übersland Nr.	0	K)"
Verdünnung

Beispiel 18

Konzentrierung von Viruspartikeln, die mit einem Inaktlvlerungsmlttel abgeschwächt worden sind unter Verwendung des Präzlpltats.

Eine Kultur von MKS-Virus Typ 0 wird mit Glycldaldehyd In einer Konzentration von 0,05* Ϊ6 Stunden bei 25° C abgeschwächt. Ein solches Präparat 1st nicht mehr virulent. Zu 1 1 dieses Präparats werden 4 g Äthylenoxidpolymerisat vom Molekulargewicht 100000 pro 100 ml gegeben. Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Sediment In 30 ml 0,15molarem EDTA-PufTer vom pH-Wert 7,4 suspendiert. Die Suspension wird 1 Stunde gerührt und dann zentrifugiert. Das Unlösliche wird entfernt und der Überstand, der das Eluat darstellt, zur Ermittlung der Komplemcntblndungselnhelten titriert (Volumen des Eluats 35,6 ml).

KBE/ml

Ausgangskultur 4
Überstand 1

Eiuat 1/28,1 3

Beispiel 19

üniösiichmaehung von auf der Zellkultur gezüchtetem Toüwutvirus.

Zu 1S einer Kultur des Tollwutvirus, ciis auf der Zellkultur gezüchtet worden Ist, werden nach Inaktivierung der Infektionstüchtlgkelt und Klärung durch Zentrifugieren 1,2 g CaCl₂ und dann 20 g (2%) Polyäthylenoxid vom Molekulargewicht 100 000 gegeben. Das Gemisch wird eine Nacht bei 4° C gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Sediment In 500 ml Phosphatpuffer (0,l5molar, pH 7,6), der Ig CaCl₂ · 2H₂O/I enthält, suspendiert. Die Suspension wird 30 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Sediment In 100 ml Isotonischem Phosphalpuffer suspendiert.

Der Vergleich der Antigenltäi der rohen Tollwutviruskultur und des erfindungsgemäß unlöslich gemachten Virus nach ZurückfOhrung der Suspension auf das ursprüngliche Volumen der Kultur wurde nach dem Test von Habel, beschrieben In »Laboratory Techniques in Rabies, WHO-1966«, durchgeführt.

50*.-Schutzlndex

Roher Impfstofr 5,55

Unlöslich gemachter Impfstoff 5,40

Die Ergebnisse zeigen, daß das In dieser Welse unlöslich gemachte Tollwutantigen sein Immunisierungsvermögen bewahrt.

Beispiel 20

Unlösllchmachung des auf Nervengewebe gezüchteten »'ollwulvlrus zur Herstellung eines »MKS-Tollwut-Mlschlmpfstoffs«.

Zu 4 I einer 5% Nervengewebe enthaltenden Suspension von Tollwutantlgcn, das auf dem Hlrninalerlal von neugeborenen Mäusen gezüchtet und abgeschwächt worden ist, werden 4,8 g CaCIi ■ 2H₂O und dann 80 g (2%) Polyäthylenoxld vom Molekulargewicht 100 000 gegeben. Das Gemisch wird eine Nacht bei 4" C gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Sediment In 2 I Phosphaipulfcr (0,15molar, pH 7,6), der 1 g CaCI₂ · 2HjO/l enthält, suspendiert. Die Suspension wird 30 Minuten gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Sediment In 1 1 l'hosphatpuflcr, der Calcium enthalt, suspendiert. Die Suspension wird, wie vorstehend beschrieben, gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Sediment wieder In 11 Isotonischem Phosphatpuffcr suspendiert. Diese Suspension stellt das Präparat von unlöslich gemachten Tollwutantigen dar.

Die vorstehend beschriebenen Maßnahmen haben den Zweck,

a) die gesamten nicht am Träger (Polyäthylcnoxld-zwclwertlge Kationen) adsorblcrbarcn Verunreinigungen des Tollwutvirus zu entfernen.

b) das Tollwutvirus am Träger zu binden (UnlösUchmachung) und

c) am Träger auch die adsorbierbaren Verunreinigungen, Insbesondere die proieolyilschcn Enzyme, deren enzymatische Aktivität auf dices Welse teilweise blockiert wird, zu binden.

Zur Beurteilung tier Wirksamkeit werden zwei Typen von MKS-Tollwui-Mischimpfstofren hergestellt:

;i) ein MlschlmplsiolT, In dem d;is Tollwuluntlgcn aus der Suspension des zerkleinerten ursprünglichen lllrn-

materlals der Mause besteht (Impfstoff Nr. 1), und
b) ein Mlschlmpfsioff. In dem das Tollwutantlgcn aus der Suspension des unlöslich gemachten Tollwutvirus besteht (Iniplsioli Nr. 2).

öle Wertbemessungen des ImmunlslerunKSvermögcns der beiden Mlschlmpl'slolTc gegen Tollwut wird nach dem Habel-Test durchgeführt.

50%-Schui/lndex
MlschlmpfstolT Nr. I 6,0

Mischimpfstoff Nr. 2 6.5

Die Wertbemessungen des Immunlslerungsvermögens gegen MKS werden an Meerschweinchen und Rindern vorgenommen.

a) Meerschweinchen:

Bestimmt wird die 50'v,-Schutzdosls (SD™) bei den Intramuskulär geimpften Tieren, ausgedrückt In μΙ Impfstoff.

b) Rinder:

Rinder erhalten subkutan 'Λ Dosis Impfstoff. Notiert wird die Zahl der nach dem 3 Wochen nach der Impfung durchgeführten Virulenztest »generalisierten« Tiere.

Der Vergleich der beiden Impfstofftypen (Tabelle 1 und Tabelle 2), der nach Alterung (3 Tage bei 37^CC oder ό Monate bei 4° C) vorgenommen wurde, zeigt, daß die MKS-Antlgene In dem hergestellten MlschlmpfstolT Nr. 2 viel stabiler sind als Im Impfstoff Nr. I.

Tabelle 1

Qualitätskontrolle an Meerschweinchen und Rindern, die mit einem MKS-Virus Typ C Infiziert wurden.

	Wirksamkeits-	Wirksamkeils-
	messung an	:r.cssung an
	Rindern	Meerschweinchen
	Zahl generali	50%-Schutzdosis
	sierter Tiere	in μΙ
	von 5
	3 Tage 3 Tage	i Tage 3 Tage
	bei 4° C bei 37° C	bei 4°C bei 37°C
MKS-lmpfsloir	1/5 1/5	45 266
allein
MischimpfstofT	1/5 4/5	583 Ϊ060
Nr. 1
Mischimpfstoff	1/5 1/5	66 133
Nr. 2

Tabelle 2

Wirksamkeitsmessung anRindern, die mit MKS-Virus der drei Typen 0, A und C Infiziert wurden.

Gesamtzahl generalisierter Tiere von 5 beim Typ

0 A C

Impl'stoll Nr.	2, Zeit 0	0/5	0/5	1/5
Impfstoff Nr.	2 nach	0/5	1/5	1/5
6monatiger	Aulbewahrung
bei 4° C

13

Claims

Patentansprüche: ■

1. PräzlplUt, beziehungsweise Komplex, aus dem aus PoIyBthylenoxld mit einem Molekulargewicht von 100 000 bis 300 000 und Calcium· oder Magnesiumionen bestehenden unlöslichen Komplex und daran absorbierten Viruspartikeln.

2. Präzlpltat nach Anspruch 1 mit Plcornavlren, Insbesondere Maul- und Klauenseuche-Virus und PoIyomyelllis-Vlrus.

3. Präzlpltat nach Anspruch 1 mit Myxovlren, Insbesondere Grippevirus und Newcastle-Vlrus.

4. Präzlpitat nach Anspruch 1 mit Rabdhovlren, Insbesondere dem Tollwutvirus.

5. Präzlpitat nach Anspruch 1 mit Inaktivierten Viren.

6. Verwendung des Präzipltas nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung von Impfstoffen.