DE2732998C2

DE2732998C2 - Verfahren zur Herstellung von Serumalbuminfraktionen

Info

Publication number: DE2732998C2
Application number: DE2732998A
Authority: DE
Inventors: Charles Hazelwood Mo. Lewis jun.; James Michael Chesterfield Mo. Schuck
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1976-07-22
Filing date: 1977-07-21
Publication date: 1986-12-04
Also published as: SU736861A3; SE442589B; RO72952A; BE856991A; CH633019A5; US4097473A; FR2358886A1; SE7708406L; JPS6034521B2; CA1069820A; HU175972B; ATA528677A; AU513473B2; IT1081299B; NL7708005A; AU2720177A; JPS5315414A; MX4620E; FR2358886B1; DE2732998A1

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Serumalbuminfraktion mit hoher Ausbeute und großem Reinheitsgrad aus einem Gemisch mit anderen Blutproteinkomponenten gemäß Oberbegriff des Hauptanspruchs.

Die Blutfraktionierung mittels verschiedener Verfahren zur Gewinnung von Albumin und anderer abgetrennter Komponenten ist allgemein gebräuchlich. Eine wichtige handelsübliche Albuminfraktion, bekannt als normales Serumalbumin, ist eine osmotisch stabile Lösung einer stark gereinigten Plasmafraktion, die mindestens 96% Albumin enthält Seine Gewinnung wurde weitgehend durch die Arbeit von Cohn und seiner Mitarbeiter an der Harvard Medical School möglich gemacht und seine Herstellung ist in den US-PSen

ίο 23 90 074 und 24 69193, in J. Amer. Chem. Soc. 68, 469—475 (1946) und Kirk-Othmer, EncycL of Chem. Tech. 3, 584—588 (Z Auflage 1964) beschrieben; In den USA wird für die Herstellung von normalem Serumalbumin z. Zt vorzugsweise die sogenannte Methode 6 nach Cohn angewandt

Eine weitere wichtige handelübliche Albuminfraktion ist die sogenannte Plasmaproteinfraktion (PPF); sie ist eine Lösung einer Plasmafraktion, die mindestens 83% Albumin zusammen mit einem Gemisch von höchstens 17% oc- und ^-Globulinen enthält Die derzeit in den USA bevorzugte Methode zur Hersteilung von PPF ist das in der US-PS 29 58 628 und in Vox Sang. 2, 174 (1957) beschriebene Verfahren nach Hink.

Bei diesen Verfahren zur Gewinnung des höher konzentrierten normalen Serumalbumins und des weniger konzentrierten PPF wird als Fällungsmittel in den Auftrennungsverfahren kaltes Äthanol verwendet Im verschiedenen anderen bekannten Verfahren für die Herstellung von Albuminfraktionen werden andere Fäl-

lungsmittel wie Äther, Methanol oder Ammoniumsulfatsalz verwendet oder eine Adsorption an Gel: oder Ionenaustauschchromatografie angewandt.

In letzter Zeit wurden für die Blutfraktionierung, einschließlich der Abtrennung von Albumin, verschiedene polymere Stoffe entwickelt, z. B. Polyäthylenglycol (PEG, Carbowax) gemäß US-PS 34 15 804; Mischpolymere aus Äthylenoxid und Polyoxypropylenpolymer (Pluronics) gemäß US-PS 38 50 903 und deutsche Offenlegungsschrift 24 03 065; sowie bestimmte besondere

Polyelektrolyte wie vernetzte Äthylen/Maleinsäureanhydrid-Mischpolymerderivate gemäß US-PSen 35 54 985 und 35 55 001. Ein Vorteil bei der Verwendung dieser Polymere besteht darin, daß sie bei normaler Zimmertemperatur verwendet werden können, und die für das Cohn'sche Äthanolfraktionierungsverfahren notwendigen niedrigen Temperaturen vermieden werden. Die verschiedenen Polymer-Fraktionierungsverfahren sind zwar brauchbar für die Herstellung von PPF, sie erbrachten jedoch im allgemeinen nicht die

so optimale Ausbeute und Reinheit der mit dem kalten Äthanol-Verfahren gewonnenen normalen Serumalbuminfraktion.

Ein weiteres Verfahren zur Gewinnung eines gereinigten Serumalbumins verwendet die selektive Denaturierung von Serumglobulinen ohne Denaturierun.g des Serumalbumins durch Erhitzen in Gegenwart von Caprylat oder anderen Fettsäureanionenstabilisatoren, wie dies in den US-PSen 27 05 230 und 27 6!) 299, J. Biol. Chem. 162, 181-198 (1946) und Blut 30, 121-134 (1975) beschrieben ist.

Dieses Verfahren ist zwar für die Herstellung; von Albuminfraktionen des PPF-Typs brauchbar, es ist jedoch nicht allgemein für die Herstellung des stärker gereinigten Serumalbumins in hoher Ausbeute, und ohne daß die wertvollen Gammaglobuline zerstört werden, geeignet. Es wird im allgemeinen als Pasteurisationsstufe zur Erzeugung eines virusfreien Albuminpoduktes ausgeführt.

3 4

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Ein fü das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugte Herstellung einer Serumalbuminfraktion mit hoher Polyelektrolytmischpolymer enthält etwa fünf Methyl-Ausbeute und großem Reinheitsgrad aus einem Ge- iminobispropylamin-Vernetzungsgruppen und etwa 90 misch mit anderen Blutproteinkomponenten, wobei das anhängende funktionelle Dimethylaminopropylamin-Albumin-Proteingemisch mit einem Polymerharz, das 5 gruppen auf 100 Maleinsäureanhydrideinheiten in dem aus der Gruppe wasserunlöslicher vernetzter Polyelek- EMA-Mischpolymer.

trolytmischpolymere aus Äthylen und Maleinsäurean- Unerwarteterweise wurde gefunden, daß die obigen

hydrid, die anhängende funktionelle Dimethylamine- Polyelektrolytmischpolymere, verglichen mit bestimm-

propylgruppen enthalten, gewählt wird, bei einem pH ten anderen Polyelektrolytmischpolymeren, die andere

von 5,0 bis 5,5 in Kontakt gebracht wird, das dadurch io anhängende funktionelle Amingruppen besitzen, eine

gekennzeichnet ist, daß die Behandlung mit dem Poly- hohe Adsorptionskapazität für Albumin haben. So kann

merharz bei einer Temperatur von 65° C bis 72° C 1 bis das hier beschriebene Polyelektrolytmischpolymer das

4 Stunden lang erfolgt und das Gemisch dann auf einen gesamte in der Blutfraktion vorhandene Albumin prak-

pH von 3,5 bis 44 eingestellt wird, um das gewünschte tisch vollständig adsorbieren, das nach Wärmebehand-

Albumin selektiv daraus auszuwaschen. 15 lung und selektiver Auswaschung dann mit über 90%

Die im Rahmen dieser Erfindung verwendeten Poly- Ausbeute und 94% Reinheit zurückgewonnen werden

merharze sind wasserunlösliche, vernetzte Pclyelektro- kann. Vergleichsweise adsorbierte ein ähnliches PoIy-

lyt-Mischpolymere aus Äthylen und Maleinsäureanh- elektrolymischpolymer, das anhängende 2-{Amino-

ydrid, die anhängende funktionelle Dimethylaminopro- äthyl)-l-äthylpyrrolidingruppen besaß, nur etwa 22%

pylgruppen enthalten. Kombiniert man bei diesen Poly- 20 Albumin, und die Auswaschung des adsorbierten Stoffes

elektrolyt-MischpoIymeren die Wärmebehandlung und nach der Wärmebehandlung ergab ein Produkt mit nur

die Schritte der Adsorption und des Auswaschens, dann etwa 67% Reinheit Ein anderes ähnliches Polyelektro-

erhält man ein Albuminprodukt mit wesentlich höherer lytmischpolymer mit anhängenden 3-(Di-n-butylami-

Reinheit und Ausbeute, als man sie getrennt bei Anwen- no)-propylamingruppen adsorbierte einen größeren

dung entweder der Wärmebehandlung oder der Ad- 25 Anteil des Albumins, nach der Wärmebehandlung konn-

sorptions-Auswaschungsschritte erhält. te jedoch kein Albumin ausgewaschen werden.

Das erfindungsgemäß hergestelllte Serumalbumin Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verkann aus Vollblut, Blutplasma und Serum oder deren fahrens werden die oben beschriebenen Polyelektrolytalbuminhaltigen Fraktionen gewonnen werden. Da die mischpolymere mit Blutplasma oder Serum oder albuhier angev/andte Wärmebehandlung dazu tendiert, die 30 minhaltigen Blutfraktionen vermischt, und zwar vorin dem behandelten Material vorhandenen Globuline zu zugsweise in einer Konzentration von 1% bis 5% denaturieren, ist es häufig angezeigt, zunächst bestimm- Mischpolymer. Durch Einstellen des pH des Harz-Prote erwünschte Globulinfraktionen, wie z. B. die Gamma- teingemisches auf verschiedene Werte können ausgeglobuline, vor der Durchführung des erfindungsgemä- wählte Proteine zuerst entfernt werden. Bei einem pH Ben Verfahrens zu isolieren. Auch andere wertvolle 35 von 5,5 bis 7,5 werden Albumin, <x- und ^-Globuline und Blutfraktionen, wie z. B. Gerinnungsfaktoren, AHF und Fibrinogen von dem Harz adsorbiert, während ein grö-Prothrombinkomplex, können von dem Plasmaaus- ßerer Teil der Gammaglobuline nicht adsorbiert wird gangsmaterial abgetrennt werden, bevor das erfin- und aus dem Überstand für therapeutische Zwecke gedungsgemäße Verfahren begonnen wird. Diese Fraktio- wonnen werden kann. Diese anfängliche Abtrennung nen können mit den üblichen bekannten Verfahren ab- 40 von Gammaglobulin wird vorzugsweise bei einem pH getrennt werden. von 6 durchgeführt. Ein Teil der adsorbierten a- und

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren vei wende- /^-Globuline und des Fibrinogens kann durch Einstellen

ten wasserunlöslichen, vernetzten Polyelektrolytmisch- des pH des Harz-Proteingemisches auf 4,7 und Sam-

polymere sind Mischpolymere aus Äthylen und Malein- mein des desorbierten Überstandes gewonnen werden.

Säureanhydrid, die anhängende funktionelle Dimethyl- 45 Das Harz-Proteingemisch kann dann auf einen pH von

aminopropylgjuppen enthalten. Das Ausgangs-Misch- 5,0 bis 5,5 eingestellt und etwa eine bis vier Stunden auf

polymer aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid (EMA) 65⁰C bis 72° C erhitzt werden. Vorzugsweise wird der

kann z. B. durch Umsetzung von Äthylen und Malein- pH auf 5,2 bis 5,3 eingestellt und das Harz-Proteinge-

säureanhydrid in Gegenwart eines Peroxidkatalysators misch 1 Stunde auf TO⁰C erhitzt,

in einem geeigneten Lösungsmittel hergestellt werden. 50 Während der Wärmebehandlung werden die restli-

Das Mischpolymer sollte vorzugsweise praktisch äqui- chen Globuline, und zwar hauptsächlich die oc- und ß-

molare Mengen des Äthylenrests und des Anhydridre- Globuline, denaturiert, während das Albumin nicht de-

stes enthalten. Das EMA-Mischpolymer kann dann mit naturiert wird und leicht gewonnen werden kann.

Methyliminobispropylamin umgesetzt werden, das zwei Anschließend an die Wärmebehandlung wird der pH

primäre Amingruppen besitzt und zu einem vernetzten 55 auf 3,5 bis 4,5 eingestellt, so daß man das gewünschte

EMA-Mischpolymer führt Die erwünschten anhängen- Albumin aus dem Harz-Proteingemisch auswaschen

den funktionellen Dimethylaminopropylgruppen kön- kann. Vorzugsweise wird das Harz-Proteingemisch vor

nen dann in das vernetzte Mischpolymer durch eine der pH-Einstellung gekühlt und der pH wird dann auf 4

Reaktion von Dimethylaminepropylamin mit Anhydrid- eingestellt.

gruppen des EMA-Mischpolmers aufgenommen wer- 60 Die Albumingewinnung kann mit einer Reihe von

den. Das Polyelektrolytmischpolymer wird vorteilhaf- Trennverfahren erfolgen, so z. B. durch Sedimentierung.

terweise in das HCl-Satz ungewandelt, da es so besser Filtrierung oder Zentrifugierung, vorzugsweise jedoch

verarbeitet werden kann. durch Filtrieren des pH-eingestellten Harz-Proteinge-

Weitere Einzelheiten über Herstellung und Struktur misches, Waschen des Filterkuchens und Sammeln des dieser Polyelektrolytmischpolymere sind der US-PS 65 Filtrats in Form der stark gereinigten Albuminfraktion.
35 54 985 zu entnehmen. Die Verwendung dieser Poly- Die Einstellung des pH auf den gewünschten Wert elektrolytmischpolymere bei der Blutfraktionierung ist während des beschriebenen Verfahrens kann durch Bein der US-PS 35 55 001 beschrieben. handlung mit sauren oder alkalischen Puffern, die kli-

nisch verträglich sind, erfolgen, z. B. mit Natriumacetat-Essigsäurepuffer oder Zitronensäure zur Ansäuerung oder mit Natriumbicarbcnat oder Natriumhydroxid zur Erhöhung der Alkalinität

Vorzugsweise werden auch bekannte Albuminstabilisatoren wie Natriumacetyltryptophanat und Natriumcaprylat während der Wärmebehandlung in das Harz-Proteingemisch aufgenommen.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1

10

Das in diesem Beispiel verwendete Polyelektrolytpolymer bestand aus dem Harzreaktionsprodukt aus praktisch äquimolaren Mengen Äthylen und Maleinsäureanhydrid (EMA), war mit Methyliminobispropylamin (MIBPA) vernetzt und ferner mit Dimethylaminopropylamin (DMAPA) umgesetzt, so daß etwa fünf MIB-PA-Vernetzungsgruppen und etwa 90 anhängende DMAPA Gruppen pro 100 Maleinsäureanhydrideinheiten in dem EMA-Mischpolymer vorhanden waren; ferner war es in das HCl-SaIz umgewandelt Zunächst wurde das Polyelektrolytmischpolymer in 0,04 mol/1 NaCl gewaschen. Plasma aus konserviertem menschlichen Blut wurde mit 3 Teilen Wasser auf 1 Teil Plasma verdünnt und dann mit 2 Gew.% des gewaschenen PoIyefektrolytmischpolymers (2 g/100 ml) vermischt Das Harz-Plasmagemisch wurde auf den pH 6 eingestellt, 30 Minuten gemischt, gefiltert und dann mit 0,002 mol/1 NaCl gewaschen. Das Filtrat, das vorwiegend aus Ga:nmaglobulinen, ^-Globulinen, Fibrinogen und assoziierten Blutfaktoren bestand, wurde von dem verbleibenden Harz-Proteinfilterkuchen abgetrennt Dieser Harz-Proteinfilterkuchen, der das adsorbierte Albumin enthielt, wurde auf den pH 5,2 angesäuert. Dem vom Harz adsorbierten Protein wurde soviel Natriumcaprylatstabilisator zugemischt, daß eine 0,012 mol/1 Konzentration entstand, ferner wurde NaCl bis zu einer 0,002 mol/1 Konzentration zugegeben. Das vom Harz adsorbierte Protein wurde dann 1 Stunde auf 70° C erhitzt, anschließend wurde das Material filtriert und das Filtrat beseitigt. Das Albumin wurde aus dem verbliebenen Harz-Proteinfilterkuchen durch Ansäuern mit Zitronensäure auf pH 4,0 in 0,002 mol/1 NaCl, anschließendes halbstündiges Mischen und Abfiltriefen ausgewaschen. Das Filtrat bestand aus der Albuminfraktion, die Ausbeute betrug 96,6% (bezogen auf die Albuminkonzentration im Originalplasma), die Reinheit lag bei 98*5%. Die Reinheit des Albumins des aus dem Harz ausgewaschenen Produkts wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese in einem Veronal-Puffer bei pH 8,6 mit einem Corning ACI Elektrophoreseapparat bestimmt. Bei dieser Bestimmung wurde ein Coomassie Brilliant Blue R 250 (C. 1.42 660) Färbeverfahren praktisch in Übereinstimmung mit dem von Fazekas de St. Groth et al. in Biochim.Biophys.Acta 71, 377—391 (1963) beschriebenen Verfahren angewandt, und für die Ablesung wurde ein Gelman ACD-15 Densitometer bei 600 nm verwendet. Coomassie Brilliant Blue R 250 ist ein Proteinfärbemittel mit großer Sehsitivität, das sich bis zu 20 μg/cm Cuvettenbreite nach dem Lambert-Beer'schen Gesetz verhält und bis 0,5 μg/cm Cuvettenweite empfindlich ist. Aufgrund dieser Empfindlichkeit kann man Proteinverunreinigungen in dem Albuminprodukt in einem hohen Maß feststellen und die durchgeführte Messung bestätigt die Herstellung eines Albuminproduktes von großer

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde als Ausgangsplasma ein von AHF befreites Plasma verwendet Ausbeute und Reinheit des Albuminproduktes waren praktisch die gleichen wie in Beispiel 1.

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde nach dem ersten Filtrieren und vor der Wärmebehandlung eine Zwischenstufe zur Entfernung von weiteren Globulinen und von Fibrinogen aus dem Plasma eingefügt In dieser Zwischenstufe wurde der HarzrProteinfilterkuchen aus der ersten Filtrierung mit Zitronensäure auf einen pH von 4,7 in 0,002 mol/1 NaCl eingestellt und 30 Minuten gemischt Das Gemisch wurde filtriert gewaschen und anschließend der Wärmebehandlung und den nachfolgenden Schritten von Beispiel 1 unterzogen. Das Filtrat aus der Behandlung bei pH 4,7 enthielt λ- und /?-Globuline sowie Fibrinogen, die für verschiedene bekannte therapeutische oder diagnostische Zwecke zurückbehalten werden können. Ausbeute und Reinheit des endgültigen Albuminproduktes waren praktisch die gleichen wie in Beispiel 1.

Anschließend an die erfindungsgemäße Gewinnung des gereinigten Albuminproduktes kann das Albumin bis zu einem gewünschten Grad konzentrisch und das konzentrische Podukt kann auf einen physiologisch verträglichen pH und Elektrolytgehalt eingestellt werden; ferner kann es zur Viruszerstörung erhitzt und durch Filtrieren oder ähnliche Verfahren geklärt werden, so daß es klinisch brauchbar ist und die Bestimmungen des Bureau of Biologies für ein normales Serumalbuminprodukt erfüllt Beispiele für brauchbare Konzentrationsverfahren, die verwendet wurden, sind 1. Lyophilisierung, mit nachfolgender Wiederauflösung bis zu einem gewünschten Grad, wie 5% oder 25%, und 2. Ultrafiltration.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung einer Serumalbuminfraktion mit hoher Ausbeute und großem Reinheitsgrad aus einem Gemisch mit anderen Blutproteinkomponenten, wobei das Albumin-Proteingemisch mit einem Polymerharz, das aus der Gruppe wasserunlöslicher vernetzter Polyelektrolytmischpolymere aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid, die anhängende funktionell Dimethylaminopropylgruppen enthalten, gewählt wird, bei einem pH von 5,0 bis 5,5 in Kontakt gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung mit dem Polymerharz bei einer Temperatur von 65° C bis 72° C 1 bis 4 Stunden lang erfolgt und das Gemisch dann auf einen pH von 3,5 bis 4,5 eingestellt wird, um das gewünschte Albumin selektiv daraus auszuwaschen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerharz in einer. Konzentration von 1 bis 5 Gew.% des Albumin-Proteingemisches verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerharz mit Methyliminobispropylamin vernetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerharz etwa 5 Methyliminobispropylamin-Vernetzungsgruppen und etwa 90 anhängende Dimethylaminopropylgruppen pro 100 Maleinsäurehydrideinheiten enthält

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH während der Wärmebehandlung bei 5,2 bis 5,3 liegt

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH während des Auswaschens bei 4,0 liegt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wärmebehandlung bei einer Temperatur von 70° C durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Albumin-Proteingemisch Blutplasma ist, das zuvor zur Entfernung von Gammaglobu-Hn fraktioniert worden ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß bei der anfänglichen Fraktionierung zur Entfernung von Gammaglobulin das Albumin-Proteingemisch mit dem Polymerharz bei einem pH von 5,5 bis 7,5 in Kontakt gebracht und das nicht adsorbierte Material daraus als Gammaglobulinfraktion abgetrennt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die anfängliche Fraktionierung bei einem pH von 6,0 durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß in einem weiteren Schritt oc- und ß-Globuline entfernt werden, wobei das adsorbierte Albumin-Proteingemisch auf einen pH von 4,7 eingestellt und der desorbierte Überstand davon abgetrennt wird.