CH633019A5

CH633019A5 - Verfahren zur herstellung einer serum-albumin-fraktion.

Info

Publication number: CH633019A5
Application number: CH905477A
Authority: CH
Inventors: Charles Jun Lewis; James Michael Schuck
Original assignee: Monsanto Co
Priority date: 1976-07-22
Filing date: 1977-07-21
Publication date: 1982-11-15
Also published as: FR2358886A1; HU175972B; ATA528677A; FR2358886B1; AT362068B; SE7708406L; JPS6034521B2; RO72952A; CA1069820A; SE442589B; US4097473A; GB1543111A; DE2732998A1; BE856991A; AU513473B2; SU736861A3; AU2720177A; JPS5315414A; IT1081299B; DE2732998C2

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Serum-Albumin-Fraktion in hoher Ausbeute und Reinheit aus einer Mischung mit anderen Blut-Protein-Kompo-nenten.

Albumin hat den grössten Anteil am Blutplasma und findet weiter Verwendung in medikamentöser Therapie, z.B. in Fällen von Schock und als Plasmaersatz.

Die Fraktionierung von Blut mit verschiedenen Verfahren, um Albumin und andere abgetrennte Komponenten zu gewinnen, ist etablierte Praxis. Eine Hauptalbuminfraktion des Handels, als Normal-Serum-Albumin bekannt, ist eine osmotisch stabile Lösung einer hoch gereinigten Plasmafraktion mit einem Gehalt an mindestens 96% Albumin. Seine Erhältlichkeit wurde besonders durch die Arbeit von Cohn u. Mitarb. ermöglicht, und seine Herstellung ist in den U.S. Patenten 2 390 074 und 2 469193; J. Amer. Chem. Soc. 68, 469-75 (1946); Kirk-Othmer, Encycl. of Chem. Tech. 3, 584-88 (2. Ed. 1964), beschrieben. Die übliche Methode der Wahl zur Herstellung von Normal-Serum-Albumin ist in den Vereinigten Staaten die sogenannte Methode 6 von Cohn.

Eine andere Hauptalbuminfraktion des Handels ist die sogenannte Plasmaproteinfraktion (PPF), welche eine Lösung der Plasmafraktion mit einem Gehalt an mindestens 83% Albumin, zusammen mit einer Mischung von nicht mehr als 17% ß- und a-Globulinen, ist. Die übliche Methode der Wahl zur Produktion von PPF ist jene von Hink, wie in U.S. Patent 2 958 628 und in Vox Sang 2,174 (1957) beschrieben.

Die erwähnten Verfahren zur Gewinnung des höher konzentrierten Normal-Serum-Albumins und des weniger konzentrierten PPF benützen kalten Ethanol als Fällungsmittel in der Fraktionierung. Verschiedene andere bekannte Methoden zur Herstellung von Albuminfraktionen benützen andere Fällungsmittel, wie Ether, Methanol oder Ammoniumsulfat, oder beinhalten Adsorption an Gele oder Ionen-austausch-Chromatografie.

Neuerdings wurden verschiedene polymere Materialien zur Fraktionierung von Blut, einschliesslich Abtrennung von Albumin, entwickelt, z.B. Polyethylenglycol («PEG, Car-bowax»), wie in U.S. Patent 3 415 804 beschrieben; Copoly-mere von Ethylenoxid und Polyoxypropylenpolymeren («Pluronics»), wie in U.S. Patent 2403 065 erschlossen; und gewisse einzigartige Polyelektrolyte, z.B. vernetzte Ethylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymerderivate, wie in U.S. Patent 3 554 985 und 3 555 001 definiert. Ein Vorteil in der Verwendung dieser polymeren Materialien ist, dass sie bei normaler Raumtemperatur anwendbar sind und so die Tieftemperaturerfordernisse der Cohn'schen Ethanolfraktionierung vermeiden. Während die verschiedenen, auf Polymeren basierenden Fraktionierungsmethoden nützlich zur Herstellung von PPF sind, haben sie im allgemeinen nicht die optimalen Ausbeuten und Reinheiten der Normal-Serum-Albumin-Fraktion geliefert, wie sie mittels der kalten Ethanolmethode erhalten werden.

Noch eine andere Methode zur Gewinnung von gereinigtem Serumalbumin umfasst die selektive Denaturierung von Serumglobulinen ohne Denaturierung des Serumalbumins durch Erhitzen in Gegenwart von Caprylat- oder anderen Fettsäureanion-Stabilisatoren, wie in U.S. Patent 2 705 230 und 2 765 299; J. Biol.Chem. 162,181-198(1946); und Blut 30,121-134 (1975) beschrieben. Während diese Methode zur Herstellung von PPF-Typ-Albuminfraktionen Nützlichkeit hat, ist sie nicht allgemein anwendbar zur Herstellung von höher gereinigtem Normal-Serum-Albumin mit hohen Ausbeuten, ohne die wertvollen gamma-Globuline zu zerstören. Sie wird üblicherweise als Pasteurisierungsschritt ausgeführt, um ein virusfreies Albuminprodukt zu liefern.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung einer Serum-Albumin-Fraktion in hoher Ausbeute und Reinheit aus einer Mischung mit anderen Blutproteinkomponenten durch Kontaktieren mit einem wasserunlöslichen harzartigen polymeren Material ist dadurch gekennzeichnet, dass das polymere Material ein vernetztes Polyelektrolyt-Copolymer aus Ethylen- und Maleinsäureanhydrid-Einheiten mit seitlichen funktionellen Dimethylaminopropylgruppen ist, und dass man das Kontaktieren während 1-4 h bei einem pH von 5,0 bis 5,5 und einer Temperatur von 65 bis 72°C vornimmt, dann die Mischung auf einen pH von 3,5 bis 4,5 einstellt und das gewünschte Albumin daraus selektiv eluiert.

Die Kombination der Wärmebehandlung und der Adsorp-tions-Eluierungs-Schritte mit diesen Polyelektrolyt-Copoly-

2

s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<0

65

meren liefert ein Albuminprodukt in wesentlich höherer Reinheit und Ausbeute als jenes, das durch entweder den Wärmebehandlungsschritt oder die Adsorptions-Eluierungs-Schritte getrennt erhalten werden kann.

Das gemäss dieser Erfindung hergestellte Serumalbumin kann aus Gesamtblut, Blutplasma und Serum, oder aus Albumin enthaltenden Fraktionen davon hergestellt werden. Weil die hier angewandte Wärmebehandlung zur Denaturierung der im zu behandelnden Material vorhandenen Globuline tendiert, ist es oftmals nützlich, vor der Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens, zuerst gewisse gewünschte Globulinfraktionen, wie gamma-Globuline, zu isolieren. Andere wertvolle Blutfraktionen, wie Gerinnungsfaktoren, AHF und Prothrombin-Komplex, können ebenfalls vor der Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens aus dem Ausgangsplasma-Material abgetrennt werden. Diese Fraktionen können durch bekannte Verfahren abgetrennt werden.

Die wasserunlöslichen, im erfindungsgemässen Verfahren verwendeten, vernetzten Polyelektrolyt-Copolymere bestehen im wesentlichen aus Ethylen- und Maleinsäureanhydrid-Einheiten und enthalten funktionelle, seitliche Dimethylaminopropylgruppen. Das Basis-Copolymer aus Ethylen und Maleinsäureanhydrid (EMA) kann beispielsweise durch Umsetzung von Ethylen mit Maleinsäureanhydrid in Gegenwart eines Peroxidkatalysators in einem geeigneten Lösungsmittel hergestellt werden. Das Copolymer enthält vorzugsweise praktisch äquimolare Mengen an Ethylen-anteil und Anhydridanteil. Das EMA-Copolymer kann dann mit Methyliminobispropylamin, das zwei primäre Amino-gruppen aufweist, umgesetzt werden und führt zu vernetztem EMA-Copolymer. Die gewünschten funktionellen, seitlichen Dimethylaminopropylgruppen können dann in das vernetzte Copolymer durch Umsetzung von Dimethylaminopropy-lamin mit Anhydridgruppen des EMA-Copolymers einverleibt werden. Das Polyelektrolyt-Copolymer kann, um bessere Handhabungsmerkmale zu erlangen, falls gewünscht, auch in das HCl-Salz umgewandelt werden. Weitere Details über die Herstellung und Struktur dieser Polyelektrolyt-Copolymere können dem U.S. Patent 3 554985 entnommen werden.

Die Verwendung dieser Polyelektrolyt-Copolymere zur Blutfraktionierung ist in U.S. Patent 3 555 001 beschrieben.

Ein bevorzugtes Polyelektrolyt-Copolymer, wie es hier verwendet werden kann, enthält etwa 5 Methyliminobispropyl-amin-Vernetzungsgruppen und etwa 90 seitliche Dimethyl-aminopropylamin-Funktionsgruppen pro 100 Maleinsäureanhydrid-Einheiten.

Es wurde unerwarteterweise gefunden, dass diese Polyelek-trolyt-Copolymere im Verhältnis zu anderen Polyelektrolyt-Copolymeren mit anderen seitlichen Amin-Funktions-gruppen hohe Kapazität für die Adsorption von Albumin haben. So ist das hier definierte Copolymer fähig, praktisch vollständig alles Albumin in der Blutfraktion zu adsorbieren, welches dann in grösseren Ausbeuten als 90% und 94% Reinheit nach der Hitzebehandlung und selektiven Eluierung isolierbar ist. Im Vergleich adsorbierte ein ähnliches Polyelektrolyt-Copolymer mit jedoch 2-(Aminoethyl)-l-ethylpyrro-lidin-Seitengruppen nur 22% Albumin und vom adsorbierten Material ergab die anschliessende Eluierung nach der Hitzebehandlung ein Produkt mit einer Reinheit von nur 67%. Ein anderes Polyelektrolyt-Copolymer mit jedoch seitlichen 3-(Di-n-butylamino)-propyl-amingruppen adsorbierte einen Hauptteil des Albumins, aber nach der Hitzebehandlung konnte kein Albumin eluiert werden.

Bei der Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird das Polyelektrolyt-Copolymer mit Blutplasma oder -serum, oder mit Albumin enthaltenden Blutfraktionen, vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 1 bis 5% Copo-

633019

lymer, vermischt. Durch Einstellen des pH der Harz-Protein-Mischung auf verschiedene Grade, können zuerst selektiv Proteine entfernt werden. Bei einem pH von 5,5 bis 7,5 werden Albumin, a- und ß-Globuline und Fibrinogen vom Harz adsorbiert, während ein Hauptteil des gamma-Globu-lins unadsorbiert bleibt und aus der überstehenden Lösung für therapeutische Zwecke gewonnen werden kann. Diese anfängliche Abtrennung von gamma-Globulin wird vorzugsweise bei einem pH von etwa 6 durchgeführt. Eine Portion der adsorbierten a- und ß-Globuline und Fibrinogen kann dann durch Einstellen der Harz-Protein-Mischung auf einen pH von etwa 4,7 gewonnen und die überstehende Lösung gesammelt werden.

Die Harz-Protein-Mischung wird dann auf einen pH im Bereiche von 5,0 bis 5,5 eingestellt und während 1-4 h auf eine Temperatur von 65 bis 72°C erwärmt. Vorzugsweise wird der pH auf 5,2 bis 5,3 eingestellt und die Harz-Protein-Mischung während etwa 1 h auf etwa 70°C erhitzt.

Im Laufe des Hitzebehandlungsschrittes werden die verbleibenden Globuline, hauptsächlich die a- und ß-Globuline, denaturiert, während gleichzeitig das Albumin nicht denaturiert wird und leicht isolierbar ist.

Anschliessend an die Hitzebehandlung wird der pH in einen Bereich von 3,5 bis 4,5 eingestellt, um das gewünschte Albumin aus der Harz-Protein-Mischung zu eluieren. Die Harz-Protein-Mischung wird vor Einstellung des pH vorzugsweise gekühlt, und der pH wird dann auf etwa 4 gestellt.

Die Isolierung des Albumins kann durch verschiedene Trennungsmethoden, wie Sedimentierung, Filtrierung oder Zentrifugierung, aber vorzugsweise durch Filtrierung der pH adjustierten Harz-Protein-Mischung und Sammeln des Filtrats als gewünschte hochgereinigte Albuminfraktion, durchgeführt werden.

Das Einstellen des pH auf den gewünschten Grad während der vorangehenden Aufbereitung kann durch Behandlung mit sauren oder alkalischen Puffermaterialien, welche als klinisch akzeptierbar gelten, erfolgen; beispielsweise durch Anwendung von Natriumacetat-Essigsäure-Puffer oder Citronensäure für Ansäuerung, oder durch Anwendung von Natriumbikarbonat oder Natriumhydroxid für die Erhöhung der Alkalität.

Es ist auch vorteilhaft, während der Hitzebehandlung, bekannte Albumin-Stabilisatoren, wie Natriumacetyltrypto-phanat und Natriumcaprylat wegen ihrer bekannten Stabilisierungseigenschaften, der Harz-Protein-Mischung zuzusetzen.

Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen zur besseren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

In diesem Beispiel besteht das Polyelektrolyt-Copolymer aus dem harzartigen Reaktionsprodukt aus praktisch äqui-molaren Mengen an Ethylen und Maleinsäureanhydrid (EMA), vernetzt mit Methyliminobispropylamin (MIBPA) und dann weiter umgesetzt mit Dimethylaminopropylamin (DMAPA), derart, dass etwa 5 MIBPA vernetzende Gruppen und etwa 90 DMAPA Seitengruppen pro 100 Maleinsäureanhydrid-Einheiten im EMA-Copolymer vorhanden sind, und dann in die HCl-Salzform übergeführt. Das Polyelektrolyt-Copolymer wurde zuerst in 0,04 molarer NaCl-Lösung gewaschen. Plasma aus gesammeltem Menschenblut wurde mit etwa 3 Teil Wasser auf 1 Teil Plasma verdünnt und dann mit 2 Gewichtsprozent des gewaschenen Polyelektroly-Copoly-mers (2 g/100 ml) versetzt. Die Harz-Plasma-Mischung wurde auf einen pH von 6,0 eingestellt, während 30 min gemischt, filtriert, und dann mit 0,002 molarer NaCl-Lösung gewaschen. Das Filtrat, das vorwiegend gamma-Globuline, ß-Globuline, Fibrinogen und vergesellschaftete Blutfaktoren

3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

633019

enthielt, wurde vom hinterbleibenden Harz-Protein-Filter-kuchen, welcher das adsorbierte Albumin enthielt, entfernt. Der Filterkuchen wurde auf pH 5,2 angesäuert. Genügend Natriumcaprylat-Stabilisator wurde zum harzadsorbierten Protein gemischt, um eine 0,012 molare Konzentration zu geben und NaCl wurde zugemischt, um eine 0,002 molare Konzentration zu geben. Das Erhitzen des harzadsorbierten Proteins wurde dann während 1 h bei 70°C durchgeführt, nach welcher Zeit das Material filtriert und das Filtrat verworfen wurde. Das Albumin wurde vom verbleibenden Harz-Protein-Filterkuchen durch Ansäuern mit Citronensäure auf pH 4,0 in 0,002 molarer NaCl-Lösung, Mischen während 30 min, und Filtrieren eluiert. Das Filtrat wurde als gewünschte Albuminfraktion mit einer Ausbeute von 96,6% (Basis: Konzentration des Albumins im Originalplasma) und einer Reinheit von 98,5% zurückbehalten. Die Albuminreinheit des vom Harz eluierten Produkts wurde durch Agarose-Gel-Elektrophoresis in Barbitalbuffer bei pH 8,6 mit einem «Corning ACI»-Elektrophoresisapparat bestimmt. In dieser Bestimmung wurde eine «Coomassie Brilliant Blue R250» (C.I.42 660) Fleckentestmethode angewandt in wesentlicher Übereinstimmung mit der von Fazekas de St. Groth u. Mitarb., Biochim. Biophys. Acta 71,377-391 (1963) beschriebenen Methode, und die Ablesungen wurden mit einem «Gelman ACD-15»-Densitometer bei 600 nm vorgenommen. «Coomassie Brilliant Blue R250» gibt einen Proteinflecken von grosser Empfindlichkeit, welcher dem Beer'schen Gesetz bis zu 20 ng/cm Weite gehorcht und empfindlich bis hinunter zu 0,5 jig/cm Weite ist.

Beispiel 2

Die Arbeitsweise in Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass das Ausgangsplasma ein AHF-entzogenes

Plasma war. Die Ausbeute und Reinheit waren praktisch gleich wie die im Beispiel 1 erhaltenen.

s Beispiel 3

Die Arbeitsweise in Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass nach der ersten Filtrierung vor der Hitzebehandlung ein Zwischenschritt eingeschaltet wurde, um zusätzlich Globuline und Fibrinogen vom Plasma zu ent-o fernen. Bei diesem intermediären Schritt wurde der Harz-Protein-Filterkuchen von der ersten Filtrierung mit Citronensäure auf pH 4,7 in 0,002 molarer NaCl-Lösung eingestellt und während 30 min gemischt. Die Mischung wurde filtriert, gewaschen und dann einer Hitzebehandlung und nachfol-s genden Schritten des Beispiels 1 unterworfen. Das Filtrat von der Behandlung bei pH 4,7 enthielt a- und ß-Globuline und Fibrinogen, welches für verschiedene bekannte therapeutische und diagnostische Verwendungen aufbewahrt werden kann. Das End-Albumin-Produkt wurde in praktisch gleicher o Ausbeute und Reinheit wie in Beispiel 1 erhalten.

Anschliessend an die Gewinnung von gereinigtem Albuminprodukt gemäss dieser Erfindung, kann das Albumin zum gewünschten Grad konzentriert werden, und das konzentrierte Produkt kann auf einen physiologisch akzeptier-5 baren pH und Elektrolytgehalt eingestellt, zur Zerstörung von Virus weiter erhitzt und durch Filtrieren oder andere Methoden geklärt werden, um den Erfordernissen der Gesundheitsbehörden für ein Normal-Serum-Albumin zu entsprechen.

o Beispiele für nützliche Konzentrationsmethoden, welche hier angewandt wurden, sind (1) Lyophilisation, gefolgt von Wiederauflösen zu einem gewünschten Gehalt, wie z.B. 5 oder 25%, und (2) Ultrafiltrierung.

B

Claims

633019 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung einer Serum-Albumin-Frak-tion in hoher Ausbeute und Reinheit aus einer Mischung mit anderen Blutproteinkomponenten durch Kontaktieren mit einem wasserunlöslichen, harzartigen polymeren Material, dadurch gekennzeichnet, dass das polymere Material ein ver-netztes Polyelektrolyt-Copolymer aus Ethylen- und Malein-säureanhydrid-Einheiten mit seitlichen funktionellen Dime-thylaminopropylgruppen ist, und dass man zwecks Hitzede-naturierung der in der Mischung verbleibenden Globuline das Kontaktieren während 1 bis 4 Stunden bei einem pH von 5,0 bis 5,5 und einer Temperatur von 65 bis 72°C vornimmt, dann die Mischung auf einen pH von 3,5 bis 4,5 einstellt und das gewünschte Albumin daraus selektiv eluiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Polyelektrolyt-Copolymer in einer Konzentration von 1 bis 5 Gewichtsprozent der Mischung verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyelektrolyt-Copolymer mit Methyliminobispro-pylamin vernetzt ist.

4. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyelektrolyt-Copolymer 5 Methylimino-bispropylamin-Vernetzungsgruppen und 90 Dimethylamino-propyl-Seitengruppen pro 100 Maleinsäureanhydrid-Ein-heiten enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass während der Hitzebehandlung der pH 5,2 bis 5,3 beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass während der Eluierung der pH etwa 4,0 beträgt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Hitzebehandlung bei etwa 70°C vornimmt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung Gesamtblutplasma ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung eine AHF-entzogene Blutplasma-Fraktion ist.

10. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 auf eine Mischung, welche aus einem Blutplasma besteht, das vorher zum Entfernen von gamma-Globulin fraktioniert wurde.

11. Anwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das vorherige Entfernen von gamma-Globulin ein Kontaktieren der Mischung mit dem Polyelektrolyt-Copolymer bei einem pH von 5,5 bis 7,5 und Abtrennen des unadsorbierten Materials als gamma-Globulin umfasst.

12. Anwendung nach Ansprüchen 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass man die Anfangsfraktionierung bei einem pH von etwa 6,0 vornimmt.

13. Anwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man als zusätzlichen Schritt a- und ß-Globu-line entfernt durch Einstellen der adsorbierten Albumin-Protein-Mischung auf einen pH von etwa 4,7 und Abtrennen der desorbierten überstehenden Flüssigkeit.