JPH0578257A - Ｃ型肝炎ウイルスに対する高度免疫グロブリン含有物およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ＨＣＶに対する予防薬として有効なＨＣＶに
対する充分強力な抗ＨＣＶ抗体力価を有し、かつ公知の
感染因子を実質的に含まない、ＨＣＶに対する改良され
た高度免疫グロブリンを提供する。 【構成】 Ｃ型肝炎ウイルスに対する高度免疫グロブリ
ン含有物の製造方法であって、(ａ)Ｃ型肝炎ウイルスに
対する抗体力価が少なくとも約１：５００の血漿をドナ
ーから得、(ｂ)該血漿をコンバインして血漿プールを
得、ついで(ｃ)該血漿プールからＣ型肝炎ウイルスに対
する高度免疫グロブリン含有物を調製することを特徴と
する方法、および高度免疫グロブリンが少なくとも約９
５％の単量体ＩｇＧからなる、抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体
の高度免疫グロブリン含有物およびその製剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は一般にＣ型肝炎ウイルス
(以下、「ＨＣＶ」ともいう)に対する高度免疫グロブリン
含有物に関する。さらに詳しくは、ＨＣＶに対する予防
薬として有効な充分強力なＨＣＶに対する抗体力価を有
する高度免疫グロブリン、および該高度免疫グロブリン
の製造方法に関する。

【０００２】

【従来技術および発明が解決しようとする課題】いわゆ
る非Ａ非Ｂ型肝炎(ＮＡＮＢＨ)因子は、米国で報告され
る輸血後肝炎の症例の約９０％を占めている[ホリンガ
ー(F.B.Hollinger)ら、ローズ(N.R.Rose)ら編、マニュ
アル・オブ・クリニカル・イミューノロジー(Mannual o
f ClinicalImmunology)、アメリカン・ソサイエティ・
フォア・マイクロバイオロジー(American Society for
Microbiology)、ワシントンＤＣ(１９８６)、５５８〜
５７２]。これら症例の約５０％で慢性感染および肝炎
が生じ、約２０％は肝硬変に進展する[ディエンスター
ク(J.L.Dienstag)ら、Sem.Liv.Disease６：６７〜８１
(１９８６)]。また、開発国で発症が報告されている散
発性肝炎の症例の約１５〜３０％がＮＡＮＢＨ因子によ
って起こる[同書]。ＮＡＮＢＨの慢性化が、ＮＡＮＢＨ
キャリヤー人口の増大の原因となっている。

【０００３】輸血後肝炎の予防は、慢性肝炎患者数を減
少させるためのみならず、キャリヤー数の増大因子を減
少させるためにも重要である。理論的にはＮＡＮＢＨの
予防は、病因の存在を検出する有効なスクリーニング
法、安全で有効な抗原刺激による病原感受性個体の能動
免疫、全血清かまたは主として免疫グロブリン(Ｉｇ)Ｇ
からなる断片化した濃縮免疫(ガンマ)グロブリンの形態
の抗体による暴露された個体またはその危険のある個体
の受動免疫、またはこれら方法および可能な他の方法の
組合せにより、供給血液から病因を取り除くことにより
達成することができる。

【０００４】輸血後の肝親和性感染の病因の幾つか、た
とえばＢ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)、サイトメガロウイル
ス(ＣＭＶ)、Ａ型肝炎ウイルス(ＨＡＶ)およびエプスタ
インバーウイルス(ＥＢＶ)などを検出するイムノアッセ
イを利用してこれら病原について可能な輸血をスクリー
ニングすることができるが、米国政府により認可され市
販されているイムノアッセイにはＮＡＮＢＨの臨床検出
に用いることができるものはない。ＮＡＮＢＨを検出す
ることの困難さは、その一部は、ＮＡＮＢＨ関連抗原を
正確に同定しようとする場合に直面する特殊な問題によ
っている[たとえば、ウォンズ(J.Wands)ら、米国特許第
４,８７０,０７６号明細書；ウォンズら、Proc.Nat'l.A
cad.Sci.USA83:６６０８〜６６１２(１９８６)；オーホ
リ(Ohori)ら、J.Med.Virol.１２：１６１〜１７６(１９
８３)；ブラッドリー(Bradley)ら、Proc.Nat'l.Acad.Sc
i.USA８４：６２７７〜６２８７(１９８７)；アカツカ
(T.Akatsuka)ら、J.Med.Virol.２０：４３〜５６(１９
８６)；セト(B.Seto)ら、米国特許出願第０７／２３４,
６４１号明細書(米国商務省国家技術情報局、スプリン
グフィールド、バージニア、Ｎｏ．８９１３８１６８よ
り入手可)；およびシーリッグ(R.Seelig)ら、ＰＣＴ国
際出願第ＰＣＴ／ＥＰ８８／００１２３号明細書参
照]。

【０００５】最近、慢性肝疾患のチンパンジーの血漿か
ら得られたｃＤＮＡライブラリーからＲＮＡ分子のｃＤ
ＮＡ配列が単離された。これら組換え配列を用いて上記
病因を検出するイムノアッセイがヨーロッパ特許出願公
開第０３１８２１６号公報に記載されている。これらｃ
ＤＮＡ配列は、ＮＡＮＢＨの感染患者に存在する抗体と
免疫学的に反応する抗原をコードしている。このように
して、現在はＣ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)と呼ばれている
上記病因がＮＡＮＢＨの病因として確立されるにいたっ
た[チュー(Choo)ら、Science２４４：３５９〜３６２
(１９８９)]。

【０００６】生きたまたは弱毒化した感染因子による感
受性個体の免疫は、ＨＢＶを含む種々の感染因子に対す
る予防手段として利用することができるが、ＨＣＶに対
しては利用できるワクチンは現在のところ存在しない。
ＨＣＶのイムノアッセイの開発を妨げている諸々の問題
もまた、ＨＣＶワクチンの製造の成功に対して悪影響を
与えている。

【０００７】感染の危険があるかまたは感染因子に暴露
されていて抗体を産生することのできない個体への特定
の高力価のガンマグロブリンの投与により、感染因子に
暴露する前または暴露後まもなくしてから該ガンマグロ
ブリンを投与したときに該個体を直ちに保護することが
できる。それゆえ受動免疫は、擬免疫(immunocompromis
ed)個体および正常人の両方に有用である[コーエン(S.
N.Cohen)、スタイツ(D.P.Stites)ら、ベーシック・アン
ド・クリニカル・イムノロジー(Basic＆Clinical Immun
ology)、第６版、アップルトンアンドラング(Appleton
＆Lange)、ノーウォーク、コネチカット(１９８７)６６
９〜６８９]。

【０００８】免疫グロブリン(ＩＧ)療法は、ＨＣＶ輸血
後感染の予防手段として評価されてきた。サンチェス−
キハーノ(Sanchez−Quijano)らは、輸血および心臓手術
を受けた患者に、輸血または手術前または輸血または手
術後１週間に免疫グロブリンを投与した場合にはその３
％しか輸血後肝炎を生じなかったことを報告している。
これとは対照的に、免疫グロブリンを投与せずに輸血を
受け心臓手術を行ったコントロール患者の１１％におい
て輸血後肝炎が発症した。ＮＡＮＢＨは、ＨＡＶ、ＨＢ
Ｖ、ＣＭＶ、ＥＢＶまたはヘルペスウイルス感染による
輸血後肝炎感染を排除した場合にのみ診断することがで
きた[サンチェス−キハーノら、Lancetｉ：１２４５〜
１２４９(１９８８)]。

【０００９】ＨＣＶに対する有効で特異的な高力価免疫
グロブリン(高度免疫グロブリンと呼ばれる)の製造は、
ＨＣＶに対して有効な充分な効能を有し、かつヒト免疫
不全ウイルス(ＨＩＶ)やＨＣＶなどの感染因子を含有し
ない高度免疫グロブリン調製物を提供する必要があるた
め面倒である。それゆえ、高度免疫グロブリンの製造に
は感染因子の不活化が重要である。

【００１０】主としてＩｇＧを含有する血漿のガンマグ
ロブリン分画は、当業者に公知の方法により得ることが
できる。そのような方法としては、ポリエチレングリコ
ール分画法[ポルソン(Polson)およびルイス−ブラボー
(Ruiz−Bravo)、Vox Sang２：１９７〜１１８(１９７
２)]および冷アルコール分画法[コーン(E.J.Cohn)ら、
J.Am.Chem.Soc.６８：４５９〜４７５(１９４６)および
オンクリー(J.L.Oncely)、J.Am.Chem.Soc.７１：５４１
〜５５０(１９４９)](これら文献を参照のため本明細書
に引用する)などが挙げられる。冷アルコール法では、
感染因子を含有しない血漿のガンマグロブリン分画を得
るために、冷エタノールの存在下、６.８〜７.３の中性
ｐＨで一連の分画工程を行う。ついで、分画した免疫グ
ロブリンは、所望なら低レベルのペプシンでさらにｐＨ
４にて処理することができる[ライド(Reid)ら、Vox San
g５５：７５〜８０(１９８８)]。

【００１１】免疫グロブリンを製造するために現在用い
られている方法は、必ずしも感染因子の適切な不活化を
提供するものでない。たとえば、ｐＨ４／温和ペプシン
法に従って調製した免疫グロブリン療法を投与した患者
は、該療法の結果としてＨＣＶ肝炎を発症したことが報
告されている[ウイリアムズ(Williams)ら、Vox Sang５
７：１５〜１８(１９８９)]。

【００１２】従って、ＨＣＶに対する予防薬として有効
なＨＣＶに対する充分強力な抗ＨＣＶ抗体力価を有し、
かつ公知の感染因子を実質的に含まない、ＨＣＶに対す
る改良された高度免疫グロブリンに対する必要性が存在
する。そのような高度免疫グロブリンの製造方法に対す
る必要性もまた存在する。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明は、抗ＨＣＶ抗体
の高度免疫グロブリン含有物を提供する。本発明はま
た、ＨＣＶに対する抗体力価が約１：２,０００〜約
１：２００,０００の範囲にあるＨＣＶに対する高度免
疫グロブリン製剤をも提供する。本発明の高度免疫グロ
ブリン製剤は、静脈内注射または筋肉内注射のいずれか
により投与することができる。

【００１４】本発明はまた、上記高度免疫グロブリン含
有物および高度免疫グロブリン製剤の両方の製造方法を
も提供する。本発明の方法は、(ａ)血漿のＨＣＶに対す
る抗体力価が少なくとも約１：５００であるヒトドナー
から血漿を得、(ｂ)かくして得られた血漿をコンバイン
して血漿プールを得、ついで(ｃ)該血漿プールから本発
明の含有物または製剤を調製する各工程からなる。

【００１５】上述したように、本発明は、抗ＨＣＶ抗体
の高度免疫グロブリン含有物、並びに該組成物に基づき
ＨＣＶに対する抗体力価が好ましくは約１：２,０００
〜約１：２００,０００の範囲にある高度免疫グロブリ
ン製剤を提供する。上記製剤中の抗ＨＣＶ抗体力価の範
囲は、約１：２,０００〜約１：１００,０００または約
１：２,０００〜約１：５０,０００の範囲であってもよ
い。本発明のＨＣＶに対する高度免疫グロブリン製剤
は、その有効量をＨＣＶに暴露しているかまたはＨＣＶ
に暴露する危険のある個体に静脈内または筋肉内投与し
て、該個体の血清中のＨＣＶに対する抗体力価を増加さ
せることができる。

【００１６】本発明の方法の実施には幾つかの工程が含
まれる。まず、有望なドナー血漿をスクリーニングして
該血漿中の抗ＨＣＶ抗体力価を決定する。ＨＩＶやＨＢ
Ｖなどの他の感染因子が存在しているかどうかを検出す
るために血漿をさらにスクリーニングしてもよい。つぎ
に、かくして得られたドナー血漿(ＨＣＶに対する許容
し得る抗体力価を有する)をコンバインすることにより
血漿プールを調製する。ついで、この血漿を分画化し、
ガンマグロブリン分画からなる血漿分画を得る。ポリエ
チレングリコール分画法や冷アルコール分画法などの上
記種々の血漿分画法を用いることができる。これら工程
はまた、公知感染因子の大部分を実質的に不活化するの
にも有効である。静注用製剤を所望する場合は、その後
にイオン交換クロマトグラフィーを用いてガンマグロブ
リン分画をさらに精製することができる。上記各工程を
以下でさらに詳しく説明する。

【００１７】本発明の実施に際して、ＨＣＶに対する許
容し得る抗体力価を有するヒトドナーの血漿からＨＣＶ
に対する高度免疫グロブリンを調製することができる。
ドナー血漿は、少なくとも約１：５００のＨＣＶ抗体力
価を有するのが好ましい。一般に本発明に有用なヒト血
漿は、上記ＨＣＶに対する許容し得る抗体力価を有する
選択ドナーから血漿搬出法により得ることもできるが、
胎盤組織からの単離または全血提供者からの血漿を含む
他の通常の方法を用いてドナー血漿を得ることもでき
る。本発明の目的に適したドナーは、たとえば、ＨＣＶ
に以前に暴露されるかまたは不活化ＮＡＮＢＨ因子を含
有する血漿タンパク質製剤で以前に刺激した結果として
ＨＣＶに対する許容し得る力価を有するものであってよ
い。そのような刺激は、適当な有効量の接種物をドナー
に注射することにより達成することができる。接種物
は、たとえば、血液タンパク質分画、ウイルスまたは組
換え抗原もしくはその断片または合成ＨＣＶペプチドで
あってよい。

【００１８】有望なヒトドナー血漿は公知方法によりＨ
ＣＶに対する抗体力価をスクリーニングすることがで
き、それゆえ、そのようなスクリーニングに用いる方法
は本発明を実施するに当たって重要なことではない。た
とえば、種々のイムノアッセイ法(抗原−抗体複合体の
生成および生成した複合体の検出が含まれる)を用いて
ＨＣＶ抗体力価を決定することができる。公知方法の例
としては、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)
法、または抗体「サンドイッチ」アッセイ法(第二の抗体
に結合させた酵素、放射性標識または他の検出可能な物
質を利用)を用いる他のアッセイ法が挙げられる。競合
アッセイ法もまた用いることができ、この方法では、Ｈ
ＣＶ抗原への結合に対して試料中の抗体が標識抗体と競
合する。種々のＣ型肝炎抗原を用いてドナーの抗ＨＣＶ
抗体力価を決定することができ、たとえば、クオ(Kuo)
らによってScience２４４；３６２〜３６４(１９８９)
に記載されたＣ１００−３タンパク質を利用することが
できる。

【００１９】許容し得る力価の抗ＨＣＶ血漿は、アラニ
ンアミノトランスフェラーゼ(ＡＬＴ)レベルとは関係な
しに有望なドナーの血漿中の抗ＨＣＶ抗体力価を測定す
ることによって得ることができるし、またＡＬＴレベル
の上昇した有望なドナーの血漿中の抗ＨＣＶ抗体力価を
測定することにより許容し得るドナーを選択することも
できる。

【００２０】上記のようにして同定した有望なドナー
は、ＨＩＶ抗原または抗体およびＨＢＶ抗原などの他の
感染因子の存在または兆候についてスクリーニングする
ことができる。これら抗原または抗体の検出方法は当業
者にはよく知られている。上記抗原または抗体が検出さ
れたドナーの血漿は、本発明に使用するのに好ましくな
い。上記基準によって許容し得ると決定された有望なド
ナーから得られた血漿をコンバインして、本発明に使用
するための血漿プールを形成するのが好ましい。

【００２１】他の汚染のおそれのあるウイルス、とりわ
け脂質でコーティングされたウイルスは、上記血漿プー
ルをジアルキルホスフェートまたはトリアルキルホスフ
ェートと接触させることにより血漿プール中で不活化す
ることができる。たとえば、好ましい不活化法として
は、米国特許第４,５４０,５７３号明細書(該文献を参
照のため本明細書中に引用する)に教示された方法に従
い、トリ(ｎ−ブチル)ホスフェート(ＴＮＢＰ)およびポ
リオキシエチレンソルビタン(フィッシャー・サイエン
ティフィック(Fisher Scientific)、ピッツバーグ、Ｐ
Ａからツイーン８０^TMの商品名で入手可能)などの非イ
オン性界面活性剤を使用することが含まれる。この方法
では、１％(wt/wt)ＴＮＢＰおよび１％(wt/wt)ツイーン
８０の溶液を血漿プールに加え、この血漿を３０±２°
Ｃにて約４時間加熱する。

【００２２】本発明の方法では、ついで血漿プールを分
画化し、主としてＩｇＧ分画を含有するガンマグロブリ
ン分画を得る。好ましい分画法は、上記で参照のため引
用し本明細書において修飾を加えたコーン−オンコリー
アルコール分画法である。この方法には一連の遠心分離
工程が含まれ、その際、アルコール濃度、ｐＨおよび温
度を制御することにより血漿からガンマグロブリン分画
が抽出される。

【００２３】血漿プールのｐＨはｐＨ４の酢酸緩衝液
(４.０Ｍ酢酸、０.８Ｍ酢酸ナトリウム)を用いてｐＨ
７.２に調節し、一方、血漿プールの温度は１〜５°Ｃ
に保持しておく。アルコール(９５％エタノールと５％
メタノールの混合物)を血漿中での最終アルコール濃度
が８％となるように加え、一方、血漿の温度は−１.５
°Ｃ〜−３.０°Ｃにさらに低くする。分画沈澱(分画
Ｉ；主としてフィブリノーゲンからなる)が生じる。分
画Ｉ沈澱を遠心分離により除去し、ついで廃棄し、一
方、分画Ｉの上澄み液は保持してさらに分画化する。

【００２４】上澄み混合物中での濃度が２０％となるよ
うにアルコールを上記分画Ｉ上澄み液に加える。つい
で、上記ｐＨ４の酢酸緩衝液を加えて混合物のｐＨを
６.６〜６.９に調節し、一方、混合物の温度は−３°Ｃ
〜−５°Ｃに低くする。ついで、この混合物を少なくと
も３時間反応させると、この間に混合分画沈澱物(分画
ＩＩおよび分画ＩＩＩ)が生成する。この混合沈澱物(ガ
ンマグロブリンおよび他の血漿タンパク質を含有する)
を遠心分離により除去する。

【００２５】上記混合分画ＩＩおよび分画ＩＩＩ沈澱物
を、沈澱物１ｋｇ当たり２.０Ｌの氷水(１.０±１.０°
Ｃ)中に再懸濁する。この混合物に酢酸ナトリウムを加
えて、沈澱物１ｋｇ当たり２.０Ｌの０.３３Ｍ酢酸ナト
リウム溶液(１〜５°Ｃ)中にさらに溶解する。上記ｐＨ
４の酢酸緩衝液で混合物のｐＨを５.２±０.１に調節
し、沈澱物１ｋｇ当たり１７.２Ｌの氷水を混合物に加
える。ついで、アルコールを混合物中での最終アルコー
ル濃度が１７％となるように加える。ついで、混合物の
温度を−３.５°Ｃ〜−７.０°Ｃに低くする。分画ＩＩ
Ｉ沈澱(同種凝集素、プラスミノーゲンおよびプロトロ
ンビンを含有する)を遠心分離によって除去し、ついで
廃棄する。ついで、分画ＩＩＩをデプスフィルター(dep
th filter)により濾過して清澄化する。

【００２６】ついで、分画ＩＩＩ濾液のｐＨを１Ｍ重炭
酸ナトリウム緩衝液を用いて６.８またはそれ以上に調
節する。ついで、最終アルコール濃度が２５％となるよ
うにアルコールを加え、一方、濾液混合物の温度を−
４.５°Ｃ〜−７.５°Ｃに低くする。ついで、混合物の
温度を−５°Ｃ〜−１０°Ｃの間に保持する。必要な
ら、１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液を用いて濾液混合物の
ｐＨを７.４±０.２に調節する。この混合物を最低６時
間反応させると、この間に分画ＩＩ沈澱物(ガンマグロ
ブリンを含有する)が生成する。この分画ＩＩ沈澱物を
遠心分離により除去する。

【００２７】高度免疫グロブリン含有物は、上記ＴＮＢ
Ｐ／ツイーン８０分画法と冷アルコール分画法の両方を
用いて調製するのが好ましい。しかしながら、残留ＴＮ
ＢＰ／ツイーン８０、および／または化学的不活化工程
の結果として生じる変性ＩｇＧが高度免疫グロブリン中
に存在するかもしれない。高度免疫グロブリンから変性
ＩｇＧおよび過剰の化学物質を除くため、下記に記載す
るようなイオン交換工程を行うのが好ましい。この最後
のイオン交換工程により、静脈内注射に最も適し、また
筋肉内注射にも適したＨＣＶに対する非変性高度免疫グ
ロブリンが得られる。最終的な高度免疫グロブリン含有
物は実質的に純粋な単量体ＩｇＧである。すなわち、該
含有物は、電気泳動法およびＨＰＬＣ法により少なくと
も約９５％の単量体ＩｇＧ、最も望ましくは１００％の
単量体ＩｇＧを含有する。

【００２８】アニオン交換体を用いたイオン交換クロマ
トグラフィーは、当業者に知られた方法により行う。幾
つかの因子がアニオン交換体用のゲルの選択に影響を及
ぼすが、そのようなものとしては、溶離緩衝液のｐＨお
よび緩衝液の塩濃度が挙げられる[たとえば、バウムス
ターク(J.S.Baumstark)ら、Arch.Biochem.Biophys.１０
８：５１４〜５２２(１９６４)；およびコンジー(R.M.C
ondie)ら、「プレパレーション・アンド・イントラビー
ナス・ユーズ・オブ・アンデターミンド・ヒューマンＩ
ｇＧ(Preparation and Intravenous Use of Undenature
d Human IgG)」、アービング(B.Alving)およびフィンレ
イソン(J.Finlayson)ら編、Immunoglobulins;Character
istics and Uses of Intravenous Preparations(米国政
府印刷局、ワシントンＤＣ、１９８０)参照]。

【００２９】上記分画ＩＩ沈澱物(いわゆる分画ＩＩペ
ースト)を、１.０±１.０°Ｃで撹拌しながら２５容量
の非発熱性の水および氷中に再懸濁する。ついで、分画
ＩＩペースト中に存在するタンパク質を濃縮し、ダイア
フィルトレーションにより緩衝液を交換する。緩衝液交
換の間に生成した肉眼で見えるタンパク質凝集物を遠心
分離により除去する。ついで、官能基としてジエチル
[２−ヒドロキシプロピル]アミノエチルを含有するイオ
ン交換カラム(ＱＡＥ−セファデックスゲルとして知ら
れる、ファルマシア、ピスカタウエイ、ニュージャージ
ーから入手可能)、およびイミダゾール緩衝液(ｐＨ６.
６)を用いて単量体ＩｇＧを溶離する。ＱＡＥカラムか
ら集めた溶出液を隔離濾過により０.９％塩水と置換す
る。緩衝液交換および濃縮の後、溶液を遠心分離にかけ
て肉眼で見える凝集物を除く。

【００３０】この高度免疫グロブリン含有物は、注射用
の等張塩化ナトリウム水溶液などの薬理学的に許容し得
る液体担体で約５％のタンパク質溶液に希釈し、高度免
疫グロブリン製剤とすることができる。薬理学的に許容
し得る保存剤もまた薬理学的に許容し得る量で高度免疫
グロブリン製剤に加えることができる。これら保存剤の
例としては、グリシン、マルトースおよびチメロサール
などが挙げられる。最後に、高度免疫グロブリン製剤を
濾過により滅菌する。場合により、高度免疫グロブリン
製剤を凍結乾燥することもできる。

【００３１】かくして調製したＨＣＶに対する高度免疫
グロブリン製剤は、静脈内注射または筋肉内注射により
有効量で投与することができる。免疫グロブリンの静脈
内注射による投与の結果、血中抗体力価が一層迅速に増
加することが知られている。製剤の投与経路および有効
量は、個体の体格、個体の身体条件、個体感染の進行段
階および個体の免疫段階を含む種々の因子に依存する。
製剤の有効量は、通常の実施者により決定することがで
きる。

【００３２】下記実施例は本発明の幾つかの好ましい態
様を示すものであるが、本発明はこれら実施例に限られ
るものではない。実施例１ 抗ＨＣＶ抗体の検出および定量：有望なドナーのＨＣＶ
に対する抗体力価を決定するため、酵素イムノアッセイ
(ＥＩＡ)を用いた。ＨＣＶの非構造遺伝子によりコード
される組換え抗原でビーズをコーティングした。抗原
は、クオ(Kuo)らのScience２４４：３６２〜３６４(１
９８９)に記載の方法に従い、３６３個のウイルスアミ
ノ酸およびヒトスーパーオキシドジスムターゼ(Ｃ１０
０−３)の融合ポリペプチドとして発現させた。正常ヒ
ト血漿中に希釈したドナー試料に上記コーティングビー
ズを接触させ、ついで４０±２°Ｃで約１時間インキュ
ベートして抗原−抗体複合体を生成させた。複合体を生
成しなかった物質を吸引除去し、ビーズを希釈水で洗浄
した。

【００３３】ついで、ビーズを西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ(ＨＲＰＯ)を結合させたヤギ抗ヒトＩｇＧと接触さ
せ、ビーズおよび抗ヒトＩｇＧを４０±２°Ｃで３０±
５分間インキュベートして複合体を生成させた。つい
で、ビーズを希釈水で洗浄した。過酸化水素を含有する
ｏ−フェニレンジアミン(ＯＰＤ)溶液をビーズに加え、
暗所で周囲温度にて約３０分間インキュベートすること
により発色シグナルを生成させた。１Ｎ−Ｈ₂ＳＯ₄(１
ｍｌ)を加えて反応を停止させた。分光光度計で４９２
ｎｍの吸光度を読み取った(Ａ₄₉₂)。生成した発色シグ
ナルの強度は、ドナー試料中に存在した抗ＨＣＶ抗体の
量に正比例した。カットオフ値は、陽性コントロールの
平均吸光度値を０.２５倍したものに陰性コントロール
の平均吸光度値を加えたものとして決定した。試料のＡ
₄₉₂値がカットオフ値よりも大きいかまたは等しい場合
に、抗ＨＣＶ抗体力価は最高の希釈であると決定した。

【００３４】実施例２ アラニンアミノトランスフェラーゼ(ＡＬＴ)レベルの検
出および定量：ロブルーウスキー(F.Wroblewski)および
ラデュー(J.S.LaDue)のP.Soc.Exp.M.９１：５６９〜７
１(１９５６)に記載された方法に従い、有望なドナーの
ＡＬＴレベルを試験した。有望なドナー試料を入手した
委託研究所でのデータでは、ＡＬＴ活性の正常範囲は０
〜７５国際単位(ＩＵ)／Ｌであった。正常範囲の上限の
２倍を越える場合にはＡＬＴレベルは上昇したものと評
価した。

【００３５】実施例３ ドナーの選択：２８７人のドナーから血漿試料を得、つ
いで実施例１に記載したＥＩＡ法により抗ＨＣＶ抗体力
価をアッセイした。下記第１表は、これらドナーから得
られた抗ＨＣＶ抗体力価を実施例２の方法により決定し
たＡＬＴレベルとの相関において示す。第１表に示すよ
うに、正常ＡＬＴレベルの３人のドナーが１：８００ま
たはそれ以上の抗ＨＣＶ抗体力価を有し、一方、上昇Ａ
ＬＴレベルの１６人のドナーが１：８００またはそれ以
上の抗ＨＣＶ抗体力価を示した。

【００３６】第１表 (有望なドナーの抗ＨＣＶ抗体力価およびＡＬＴレベル)ＡＬＴレベル ドナー数(Ｎ)＊ 抗ＨＣＶ抗体力価 ０＊＊ 0〜1:800 1:800〜1:1600 ＞1:1600 正常 １１７ ９５ １９ ３ ０ 上昇 １７０ ７７ ７７ １０ ６ (注)＊：Ｎ＝２８７； ＊＊：非希釈ドナー試料を試験したときに抗体が検出されなかった。

【００３７】ドナーの抗ＨＣＶ抗体産生刺激 抗ＨＣＶ抗体血漿の別の適当な入手源は、抗ＨＣＶ抗体
を産生するように刺激した健康なドナーである。現在の
ところＨＣＶに対して利用できるワクチンはないので、
そのようなドナーにおいて抗ＨＣＶ抗体産生を刺激する
ため、不活化ＨＣＶを含有する血液タンパク質断片を利
用することができる。そのような刺激に適した血液タン
パク質断片としては、血漿タンパク質断片、因子Ｖ、因
子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびフィブリノー
ゲンが挙げられる。これら断片の製造方法は当業者には
知られている。好ましい血液タンパク質は因子ＶＩＩＩ
である。別法として、不活化したＨＣＶのウイルス性ま
たは組換え抗原および合成ＨＣＶペプチドを刺激に用い
ることもできる。

【００３８】実施例４ ＨＣＶに対する高度免疫グロブリンの予防効果：上記の
ようにして調製した本発明のＨＣＶに対する高度免疫グ
ロブリン製剤は、以下のようにしてＨＣＶに対する予防
効果を試験することができる。抗ＨＣＶ抗体に対して血
清学的に陰性のチンパンジーに、上記で調製した高度免
疫グロブリン製剤を体重１ｋｇ当たり５０〜５００ｍｇ
の範囲の濃度に等しい量で注射する。注射１日後に、１
０〜１００チンパンジー感染投与量(ＣＩＤ)／ｍｌのハ
ッチンソン(Hutchinson)株(チンパンジー中で継代した
もの；この接種物の元のヒト入手源は、アルター(H.Alt
er)、国立衛生研究所(ＮＩＨ)、ベセスダ、メリーラン
ドで利用できる)からなる接種物で攻撃する。上昇ＡＴ
Ｌレベルおよび肝臓生検の両方によって上記接種量では
チンパンジーにＮＡＮＢＨを発症することが文献で示さ
れているので、疾患が発症しないことは高度免疫グロブ
リンの前暴露予防効果を示している。

【００３９】上記実施例で示した本発明の特定の態様の
他の変更ないし修飾は当業者には明らかであろう。従っ
て、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定さ
れるものである。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウイルスに対する高度免疫グロ
   ブリン含有物の製造方法であって、 (ａ)Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体力価が少なくとも約
   １：５００の血漿をドナーから得、 (ｂ)該血漿をコンバインして血漿プールを得、ついで (ｃ)該血漿プールからＣ型肝炎ウイルスに対する高度免
   疫グロブリン含有物を調製する ことを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 Ｃ型肝炎ウイルスに対する高度免疫グロ
   ブリン含有物の製造方法であって、 (ａ)Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体力価が少なくとも約
   １：５００の血漿をドナーから得、 (ｂ)該血漿をコンバインして血漿プールを得、ついで (ｃ)(i)該血漿プールをウイルス不活化し、さらに (ii)該血漿プールを分画化する ことにより該血漿プールからＣ型肝炎ウイルスに対する
   高度免疫グロブリン含有物を調製する ことを特徴とする方法。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の方法で調製し
   た高度免疫グロブリン含有製剤。
4. 【請求項４】 高度免疫グロブリン含有物が静注可能な
   ものである、請求項２に記載の方法。
5. 【請求項５】 Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体力価が約
   １：２,０００〜約１：２００,０００の範囲である、Ｃ
   型肝炎ウイルスに対する高度免疫グロブリン製剤の製造
   方法であって、 (ａ)Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体力価が少なくとも約
   １：５００の血漿をドナーから得、 (ｂ)該血漿をコンバインして血漿プールを得、ついで (ｃ)(i)該血漿プールをウイルス不活化し、さらに (ii)該血漿プールを分画化する ことにより該血漿プールからＣ型肝炎ウイルスに対する
   高度免疫グロブリン製剤を調製する ことを特徴とする方法。
6. 【請求項６】 工程(ｃ)において、分画化した血漿をイ
   オン交換クロマトグラフィーにより精製し、ついで製剤
   中の最終濃度が約５％となるまで該精製分画を希釈する
   工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 精製血漿が静注可能なものである請求項
   ５または６に記載の方法。
8. 【請求項８】 高度免疫グロブリンが少なくとも約９５
   ％の単量体ＩｇＧからなる、抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体の
   高度免疫グロブリン含有物。
9. 【請求項９】 抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体の高度免疫グロ
   ブリン含有物の水溶液からなる高度免疫グロブリン製剤
   であって、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体力価が約１：
   ２,０００〜約１：２００,０００の範囲にある製剤。
10. 【請求項１０】 静注可能な請求項９に記載の調製物。
11. 【請求項１１】 個体においてＣ型肝炎ウイルスに対す
    る抗体力価を刺激する方法であって、血液タンパク分
    画、ウイルス抗原または組換え抗原またはそれらの断片
    および合成Ｃ型肝炎ウイルスペプチドよりなる群から選
    ばれた接種物を有効量で個体に注射することを特徴とす
    る方法。