ES2313787T3 - Metodo para la determinacion del virus de la hepatitis c. - Google Patents
Metodo para la determinacion del virus de la hepatitis c. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para determinar la presencia del antígeno nuclear del VHC y anticuerpos contra el antígeno nuclear del VHC en una muestra, al mismo tiempo, usando (1) una sonda para la detección del antígeno nuclear del VHC y (2) un epítopo de VHC o un compuesto que sustituya al epítopo de VHC, en el que la sonda usada para la detección del antígeno nuclear y el epítopo de VHC o el compuesto que sustituye el epítopo de VHC no son las entidades que se unen a través del reconocimiento mutuo, comprendiendo las etapas de: (a) poner en contacto la muestra (1) con un anticuerpo o anticuerpos para la detección del antígeno nuclear del VHC y (2) con el epítopo de VHC o el compuesto que sustituye al epítopo de VHC para la detección de anticuerpos contra el antígeno nuclear del VHC, y (b) detectar (1) el antígeno nuclear del VHC mediante un anticuerpo o anticuerpos para la detección del antígeno nuclear del VHC, y (2) los anticuerpos contra el antígeno nuclear del VHC.
Description
Método para la determinación del virus de la
hepatitis C.
La presente invención se refiere a un método
para la detección del virus de la hepatitis C (VHC), y más
específicamente se refiere a un método para la medida del antígeno
nuclear del VHC o para la medida simultánea del antígeno nuclear
del VHC y anticuerpos contra el antígeno nuclear del VHC. El método
es particularmente eficaz para rastrear múltiples muestras de
sangre y otros similares.
La hepatitis causada por la infección del VHC
(virus de la hepatitis C) se vuelve crónica con alta incidencia y,
como el período de infección es prolongado, a menudo progresa hasta
la cirrosis hepática y el carcinoma hepatocelular. Sin embargo, ya
que la infección por VHC ocurre principalmente a través de la sangre
y componentes derivados de la sangre, es posible identificar y
eliminar la fuente de infección para bloquear la ruta de infección.
Los métodos actuales para la identificación de las fuentes de
infección son principalmente métodos que detectan anticuerpos
frente a polipéptidos del VHC, pero se están buscando métodos que
puedan identificar fuentes de infección con mayor exactitud.
Tales métodos se están buscando debido a la
existencia de un período de tiempo, conocido como el "período de
seroconversión" después de la infección por VHC durante el cual
el antígeno está presente pero los anticuerpos aún no se han
producido. El análisis de los anticuerpos no puede ser determinado
si el suero tomado durante este período está o no infectado. Por lo
tanto, hay un riesgo de infección secundaria por los componentes
derivados de la sangre, tales como la donación de sangre,
componentes de la sangre, factores de la sangre, muestras
contaminadas en el período de seroconversión, porque el donante de
sangre es seleccionado por el ensayo de anticuerpos que no puede
excluir tales muestras. Por esta razón es necesario detectar al
propio VHC, es decir, partículas de VHC, en vez de anticuerpos
contra polipéptidos de VHC para reducir el riesgo.
La detección y la medida del propio VHC son
posibles detectando los antígenos o el genoma (ARN) en las
partículas de VHC. En este documento, un antígeno en las partículas
de VHC podría ser el antígeno nuclear o un antígeno de superficie
(E1, E2).
Mucho variantes han sido descritas en la región
antigénica de la proteína de superficie tal como la región
hiper-variable. Además, han sido publicadas
heterogeneidades de secuencias entre genotipos. Para detectar todas
estas variantes y secuencias heterogéneas, es necesario usar sondas
que se unan a varias regiones respectivamente.
En este documento, "sonda" será usado para
referirse a una molécula que se una específicamente a un antígeno,
por ejemplo, una molécula que reconozca y se una a una molécula de
antígeno, tal como un receptor, anticuerpo, anticuerpo
recombinante, molécula funcional o estructura funcional.
Las secuencias de aminoácidos del antígeno
nuclear eran más conservadas que las de los antígenos de superficie.
Seleccionando regiones bien conservadas entre varios genotipos de
VHC, podría ser obtenida una sonda que reconociera al antígeno
nuclear de todo el genotipo. Por consiguiente, será construido un
método cuyos resultados no deben ser afectados por los
genotipos.
Sin embargo, debe ser considerado un punto en la
construcción de sistemas para la detección de antígenos.
Específicamente, es altamente posible que los anticuerpos en las
muestras del sujeto compitan con la sonda que detecta el antígeno
por los sitios de unión, causando la reducción de la detección de la
sensibilidad para el antígeno interfiriendo en la unión de sonda.
Será construido un método usando sondas que reconozcan las regiones
que no podrán ser unidas o interferidas por los anticuerpos en las
muestras. Sin embargo, es difícil preparar sondas que cumplan estas
condiciones para las moléculas mencionadas al tener múltiples sitios
que se unen al anticuerpo, tal como el antígeno nuclear del
VHC.
Así, la detección de moléculas de antígeno
requiere la eliminación de los anticuerpos que inhiban la unión de
la sonda. Los métodos de eliminación incluyen los métodos de
eliminación basados en principios físicos, por ejemplo, métodos que
utilizan diferencias en el peso molecular para la separación y el
fraccionamiento de partículas de VHC y anticuerpos. Los ejemplos de
tales métodos incluyen la filtración de gel, ultracentrifugación,
centrifugación con gradiente de densidad y fraccionamiento de pesos
moleculares usando membranas, tales como las membranas de
ultrafiltración. Sin embargo, ya que los anticuerpos a menudo forman
complejos con otras biomoléculas mediante las que se vuelven
entidades de alto peso molecular, su separación a partir de
partículas de VHC es difícil por los métodos basados en principios
físicos. Estos métodos también emplean un equipo especial durante
las etapas de tratamiento, lo que hace su aplicación difícil para el
rastreo en masa, tal como el rastreo de sangre.
Las partículas de VHC preferencialmente son
precipitadas por la diferencia de su solubilidad en una solución a
base de agua que contiene PEG (polietilenglicol), que cambia el
microambiente del agua. Sin embargo, será muy difícil separar
anticuerpos y su complejo con antígenos a partir de partículas de
VHC, porque estos componentes precipitan en las mismas fracciones.
Además, las partículas de VHC forman a menudo complejos inmunes
entre los antígenos en las partículas de VHC y los anticuerpos que
los reconocen, y es difícil de separar sólo los anticuerpos o
antígenos de los complejos inmunes.
Los métodos puestos en práctica son, por lo
tanto, aquellos por los cuales las sustancias (anticuerpos, etc.)
que inhiben las funciones de la sonda son eliminadas destruyendo sus
funciones. Un tal método para vencer las funciones del anticuerpo
es un método en el cual la proteína del anticuerpo es
desnaturalizada por la exposición a condiciones que desnaturalizan
la estructura de la proteína, pero es esencial en este caso destruir
la función del anticuerpo eliminando la función del antígeno
objeto, es decir, la función de unión con la sonda, lo que
significa no perder el epítopo o permitir que el epítopo se exponga
de nuevo, si la sonda es un anticuerpo.
La función objetivo de un método para determinar
la infección por VHC se diferenciará dependiendo del objetivo.
El análisis de anticuerpos es un método sólo
para determinar la muestra que contiene los anticuerpos contra VHC.
Cuando los anticuerpos contra VHC están presentes en una muestra,
hay casos en los que el donante de la muestra contiene realmente
VHC debido a la inyección activa del VHC, mientras que hay otros
casos en los que la muestra no contiene VHC debido a la eliminación
del VHC del cuerpo por tratamientos o la recuperación del material
es difícil para distinguir a estos causantes casos basado en la
presencia o la ausencia de los anticuerpos.
La importante función del ensayo del antígeno es
determinar si realmente el VHC está presente en una muestra o
indicar el nivel de VHC cuando está presente. Esto no depende de la
cuestión de si realmente están presentes los anticuerpos.
Para el tratamiento, los ensayos de anticuerpos
de VHC proporcionan una información importante para determinar si
el VHC está tras la causa principal de la hepatitis. Sin embargo, el
ensayo del propio VHC requiere un diagnóstico definido. La
determinación de si VHC ha sido eliminado del cuerpo es importante
en la valoración de la eficacia del tratamiento. La información del
nivel de antígeno es esencial para tomar tal decisión de
tratamiento. Es decir, para el tratamiento es importante saber si
realmente está presente el antígeno y en qué nivel,
independientemente de la presencia o la ausencia de anticuerpos.
Para el tratamiento, entonces, los métodos de ensayo más
importantes son los que indican la presencia o la ausencia de
antígeno y su nivel.
Para la sangre y los componentes derivados de la
sangre, prevenir la infección secundaria es de mayor importancia. Y
para este fin, los métodos de análisis que evalúan el riesgo de la
infección por VHC. Los ensayos de anticuerpos son usados
actualmente como el método de ensayo principal en este campo.
Sin embargo, como se explica anteriormente, el
ensayo con anticuerpos no puede determinar si el suero está
infectado durante el período de seroconversión después de la
infección por el VHC. Por consiguiente, cuando las sustancias
derivadas de la sangre, tales como la transfusión y los componentes
de la sangre, preparaciones de sangre, etc. son utilizadas para
rastrear el ensayo de anticuerpos, hay un riesgo de infección
secundaria por muestras en el período de seroconversión.
La unión de esto con las pruebas de antígenos es
deseado para reducir este riesgo, pero las pruebas de antígeno
todavía no han sido puestas en práctica para el rastreo en masa para
la donación de sangre.
Si existiera un método de ensayo que pudiera
determinar la presencia o la ausencia del antígeno con una exactitud
teórica (sensibilidad, especificidad) del 100%, este método podría
ser usado como método de ensayo exclusivo. Sin embargo, cualquier
método tiene un límite de sensibilidad de detección y no puede medir
niveles por debajo de esta sensibilidad de detección. Así, no
existe ningún método de ensayo que pueda discriminar con una
exactitud del 100%. Queda la posibilidad de omitir la fuente de
infección por el ensayo del antígeno solo y es, por esta razón, que
la medida tanto del anticuerpo como del antígeno es necesaria para
reducir el riesgo de infección secundaria. Si el ensayo del
antígeno, que tiene una alta sensibilidad y la especificidad
suficiente para el rastreo en masa, está disponible, se requieren
tanto el ensayo del antígeno como del anticuerpo para el rastreo.
Este requerimiento causará un alto coste del rastreo, porque el
número de análisis realizados con las muestras aumentaría respecto
a los presentes.
Es, por lo tanto, claro que si la medida del
antígeno y del anticuerpo por el mismo método se hace posible, esto
permitirá una reducción del número de análisis realizados en campo,
proporcionando así un efecto de gran impor-
tancia.
tancia.
Como se ha mencionado anteriormente, a pesar del
desarrollo de métodos que detectan anticuerpos y métodos que
detectan antígenos, cuando se intenta detectar el antígeno en
condiciones para detectar anticuerpos como se menciona
anteriormente, el antígeno no puede ser detectado de manera
eficiente debido a la presencia de los anticuerpos que inhiben la
unión de las sondas que detectan al antígeno. Incluso en condiciones
para la detección de antígenos, sin embargo, los métodos adoptados
eliminan los anticuerpos que compiten contra la detección del
antígeno, como se explica anteriormente, y, por lo tanto, los
anticuerpos no pueden ser detectados. Los métodos actualmente
mencionados, por lo tanto, no permiten la detección de antígenos y
anticuerpos por un solo método.
Con el objetivo de reducir la infección
secundaria utilizando la sangre y los materiales derivados de la
sangre, no es necesario distinguir entre personas infectadas y
personas previamente infectadas, ya que es suficiente ser capaces
de determinar si realmente el anticuerpo o el antígeno están
presentes. La presente invención proporciona por lo tanto un método
para detectar antígenos en muestras durante períodos en los cuales
no contienen ningúno anticuerpo, tal como durante los períodos de
seroconversión, y para detectar antígenos y anticuerpos en muestras
durante períodos en los cuales los anticuerpos están presentes; esto
proporciona por lo tanto un nuevo método de ensayo que es deseable
para analizar la sangre y sustancias derivadas de la sangre.
La presente invención proporciona por lo tanto
un método como se define en las reivindicaciones, para medir el
antígeno nuclear del VHC midiendo también el anticuerpo contra el
antígeno nuclear de VHC por su unión con una sonda.
Preferiblemente, el método está caracterizado por medir el antígeno
nuclear del VHC por su unión con una o varias sondas en presencia
de uno o varios detergentes con una o varias cadenas de alquilo y
una o varias aminas de secundarias a cuaternarias o uno o varios
detergentes no iónicos, o ambos.
La Figura 1 es un gráfico que muestra una
comparación del título del anticuerpo del anticuerpo monoclonal
C11-15 con los títulos de anticuerpos de otros
anticuerpos monoclonales C11-3,
C11-7, C11-10 y
C11-14.
La Figura 2 es un gráfico que muestra un
resultado de ELISA para medir la muestra positiva del ARN de VHC
usando como antígeno primario inmovilizado sobre una fase sólida
cada uno de varios anticuerpos monoclonales solos, o su mezcla.
El método para detectar la infección por VHC
proporcionado según la presente invención es un método mediante el
cual el antígeno es detectado en una muestra durante un período en
el cual ningún anticuerpo está presente, tal como durante un
período de seroconversión, y mediante el cual tanto el anticuerpo
como el antígeno son detectados durante períodos en los cuales
están presentes los anticuerpos. En otras palabras, durante períodos
de seroconversión en los cuales ningún anticuerpo está presente, el
hecho de que ningún anticuerpo esté presente significa que no hay
ninguna necesidad de eliminar los anticuerpos durante la detección
del antígeno. Por consiguiente, el proceso previo para la detección
del antígeno ya no es necesario.
Sin embargo, las regiones sobre el antígeno, que
son reconocidas por la sonda, deben permanecer expuestas durante la
detección, porque los antígenos nucleares están empaquetados en las
partículas del virus. Las partículas del VHC, según se piensa,
tienen una estructura en la que los complejos están formados entre
el ARN genómico y el antígeno nuclear, formando partículas que
están revestidas de membranas lipídicas externas que comprenden
proteínas de superficie. También, según se piensa, existen en la
sangre en forma de complejos con lipoproteínas de baja densidad
(LDL) y o anticuerpos anti-VHC. La sonda no puede
reconocer y unirse al antígeno nuclear cuando está en las
partículas virales presentes en la sangre. Así, la detección del
antígeno nuclear requiere que el tratamiento elimine la estructura
que envuelve al antígeno nuclear para permitir el reconocimiento
del antígeno nuclear por la sonda.
Las realizaciones preferidas de la presente
invención definen, por lo tanto, condiciones de reacción mediante
las cuales el antígeno nuclear en partículas de VHC contenidas en
una muestra es expuesto de modo que pueda ser reconocido por una
sonda para el reconocimiento del antígeno nuclear.
Durante los períodos en los cuales los
anticuerpos están presentes en un nivel suficiente, los anticuerpos
contra el antígeno nuclear que compiten por el sitio de unión de la
sonda están a veces presentes en la muestra, y esto puede reducir
la sensibilidad de detección para el antígeno nuclear. También,
cuando el antígeno nuclear es expuesto para permitir que la sonda
se una en presencia de los anticuerpos para competir con la sonda
por la unión, los niveles de los anticuerpos que se unen al
antígeno para el anticuerpo de ensayo se reducirán por su absorción
al antígeno nuclear expuesto de las partículas del virus. Como
resultado, aumenta la sensibilidad del ensayo del anticuerpo, que
mide la cantidad de immuno-complejo de anticuerpos
con los antígenos para el anticuerpo de ensayo.
Por consiguiente, mientras que el antígeno usado
para la detección de anticuerpos de VHC puede ser uno que consista
únicamente en el epítopo del antígeno nuclear, éste es
preferiblemente un péptido o polipéptido incluyendo un epítopo de
VHC distinto al antígeno nuclear. Éste también puede ser un péptido
o polipéptido, o un compuesto, distinto del péptido o polipéptido
incluyendo el epítopo de VHC, que imita al epítopo de VHC.
En los métodos de la invención, la sonda usada
para la detección del antígeno nuclear y el epítopo de VHC o el
compuesto que sustituye al epítopo de VHC no son elementos que se
unan por reconocimiento mutuo.
El anticuerpo usado como sonda para el antígeno
nuclear del VHC o el anticuerpo marcado para la detección del
antígeno nuclear del VHC puede ser un anticuerpo policlonal obtenido
por la inmunización de un animal de laboratorio tal como un ratón,
conejo, pollo, cabra, oveja, vaca, etc.; un anticuerpo monoclonal
producido por un hibridoma obtenido separando células de bazo de un
individuo inmunizado y fusionándolo con células de mieloma; un
anticuerpo monoclonal producido por células de bazo o leucocitos de
sangre que han sido inmortalizados con el virus de EB; o un
anticuerpo monoclonal producido por un humano o chimpancé infectado
por VHC; un anticuerpo recombinante producido por células
transformadas por un gen de anticuerpo recombinante construido
combinando un fragmento del gen de la región constante de
inmunoglobulina con un fragmento del gen de la región variable
obtenido a partir del cADN de inmunoglobulina o ADN cromosómico de
un ratón, ser humano, etc., un fragmento del gen de la región
variable construido combinando una parte del cADN de inmunoglobulina
o ADN cromosómico con una secuencia creada artificialmente, un
fragmento de gen de la región variable construido usando una
secuencia génica artificial o un fragmento del gen de la región
variable creado por un método de recombinación génica usando a
éstos como materiales; un anticuerpo de fago creado fusionando
cualquiera de los fragmentos génicos de la región variable
anteriormente mencionados con la proteína estructural del
bacteriófago, por ejemplo; o un anticuerpo recombinante producido
por células transformadas por un gen del anticuerpo recombinante
construido combinando cualquier fragmento del gen de la región
variable anteriormente mencionado con otro fragmento génico
apropiado, tal como una parte del gen myc.
Las sondas producidas por la introducción
artificial de regiones variables en moléculas de tripsina, sondas
obtenidas modificando artificialmente las moléculas que se unen
específicamente a proteínas tales como receptores, y otras sondas
preparadas por técnicas de química combinatoria, pueden ser usadas
siempre que exhiban una alta especificidad y afinidad hacia el
antígeno nuclear.
Los anticuerpos monoclonales anteriormente
mencionados pueden ser preparados fácilmente por los expertos en la
técnica. La preparación de anticuerpos monoclonales a partir de
hibridomas es bien conocida. Un ejemplo de esto es la inmunización
periódica de ratones BALB/c o intraperitonealmente o
intradermalmente de forma similar usando el polipéptido o el
polipéptido fusionado (llamado de aquí en adelante en este documento
"el presente antígeno") como un antígeno solo o unido a BSA,
KLH o similar, en la forma simple o en mezcla con un adyuvante tal
como un adyuvante completo de Freund. El presente antígeno se
administra por la vena caudal como una inmunización de refuerzo una
vez que ha aumentado el título del anticuerpo de la sangre, y
después de la extracción antiséptica del bazo, la fusión de células
se lleva a cabo con una línea celular de mieloma de ratón apropiada
para obtener los hibridomas. Este método puede ser llevado a cabo de
acuerdo con el método de Kohler y Milstein (Nature
256: 495-497, 1975).
Las líneas celulares de hibridoma obtenidas
según el procedimiento anterior son cultivadas en una solución de
cultivo adecuada, y luego se selecciona y se clona una línea celular
de hibridoma que produce los anticuerpos que exhiben la reacción
específica con el presente antígeno. La clonación del hibridoma que
produce el anticuerpo puede ser lograda por un método de dilución
limitante, o método de agar suave (Eur. J. Immunol. 6:
511-519, 1976). El anticuerpo monoclonal producido
se purifica por un método tal como cromatografía en columna usando
la Proteína A, etc.
Puede prepararse una molécula que se use como
una sonda en vez del anticuerpo monoclonal anteriormente mencionado.
Por ejemplo, los anticuerpos recombinantes son discutidos
detalladamente en un ámbito general por Hoogenboon (Trends in
Biotechnology, 15: 62-70, 1997).
De acuerdo con la invención, el antígeno usado
como sonda para anticuerpos contra el antígeno nuclear de VHC en
una muestra o el antígeno usado para la producción de los
anticuerpos contra el antígeno nuclear de VHC es, específicamente,
un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada,
por ejemplo, por SEQ. ID. No. 1 o No. 2, o un polipéptido fusionado
incluyendo una de las secuencias de aminoácidos presentadas como
SEQ. ID. Nos. 3 a 6, y éste puede ser obtenido por la expresión
recombinante del ADN que lo codifica.
El principio para la detección en este caso
puede ser un método comúnmente usado para el inmunoensayo, tal como
el método de anticuerpo marcado con enzima, el método de marcación
fluorescente, el método de marcación con radioisótopos, etc., y el
principio para la detección de enzimas en el método del anticuerpo
marcado con enzimas es el método colorimétrico, método
fluorescente, método quimiluminiscente, etc. El método usado para
la detección del anticuerpo puede ser uno que comúnmente se emplea
para la detección de anticuerpos, tal como el método sándwich de
antígeno doble, y el sistema sándwich de un etapa puede ser usado de
la misma manera para la detección del antígeno también.
Los métodos de la invención pueden emplear el
sistema de reacción descrito más abajo. (1) Una sonda para el
antígeno nuclear del VHC, por ejemplo, anticuerpos para el antígeno
nuclear del VHC, y (2) un compuesto que comprende los epítopos de
VHC, por ejemplo, péptidos, compuestos de péptidos o polipéptidos
que comprenden los epítopos de VHC, o su mezcla, son inmovilizados
en un vehículo usado para el inmunoensayo, tal como una placa de
microtítulo. Para capturar los antígenos nucleares y anticuerpos de
VHC en la muestra, el vehículo inmovilizado se hace reaccionar con
las muestras en la solución que contiene los compuestos para exponer
el antígeno nuclear en las partículas de virus o complejos con las
partículas y no inhibir la función de los anticuerpos de VHC para
unirse a los epítopos de VHC.
Después de eliminar entonces los componentes
desunidos en la muestra, por ejemplo, lavando el vehículo con una
solución tampón adecuada, se hace reaccionar con una solución de
reacción que contiene las sondas que reconocen el antígeno nuclear
unido al vehículo, por ejemplo, los anticuerpos marcados con enzimas
para el antígeno nuclear, y las sondas que reconocen un anticuerpo
para el epítopo de VHC unido al vehículo, por ejemplo, un
anticuerpo monoclonal de ratón de anticuerpo antihumano marcado con
enzima, que causa la unión específica con el antígeno nuclear y los
anticuerpos a los epítopos de VHC capturados al vehículo. Después de
la reacción, el vehículo se lava con una solución tampón adecuada
para eliminar los componentes no reaccionados, y la detección del
marcador por un método apropiado permitirá la detección del antígeno
nuclear y los anticuerpos al epítopo de VHC, que están presentes en
la muestra.
Será evidente fácilmente para los investigadores
en el campo relevante que esto puede ser aplicado también a métodos
de separación de B/F que pueden ser usados para métodos de
inmunoensayo comunes, tal como la inmunocromatografía.
El sistema de reacción adecuado para la
detección de antígenos en el sistema proporcionado según la presente
invención es un sistema con condiciones suaves que no destruirá la
función del anticuerpo frente a los epítopos de VHC, siempre que
también estén bajo condiciones que expongan suficientemente la
región reconocida por la sonda del anticuerpo que debe reconocer el
antígeno de VHC entre las partículas de VHC que existen como una
estructura compleja en la muestra.
Se ha demostrado que el antígeno nuclear puede
ser detectado si las partículas virales han sido separadas por la
ultracentrifugación (Takahashi et al., 1996, J. Gen.
Virol., 73:667-672) o las partículas de
VHC que han sidas agregadas y precipitadas con polietilenglicol son
tratadas con un detergente no iónico tal como Tween 80 o Triton
X100 (Kashiwakuma et al., 1996, J. Immunological
Methods 190:79-89); en el último caso,
sin embargo, la sensibilidad de detección es insuficiente y es
dudoso si se expone suficientemente el antígeno. En el último caso,
otros agentes de tratamiento distintos a los detergentes fueron
añadidos para inactivar los anticuerpos. Además nada se menciona
sobre el efecto real del detergente.
Las condiciones fueron estudiadas primero
respecto al detergente, y preparando soluciones de reacción con
composiciones basadas en detergentes, y se ha hecho posible detectar
de manera eficiente el antígeno en partículas de VHC simplemente
diluyendo la muestra con la solución de reacción sin aplicar
tratamientos previos que impliquen procedimientos tales como la
centrifugación y el calentamiento como en los sistemas de detección
de antígenos de VHC hasta ahora mencionados.
Es necesario extraer eficazmente el antígeno
nuclear de las partículas virales, suprimir la interacción entre
las diversas sustancias en el suero, y proporcionar condiciones que
permitan la reacción eficiente entre la sonda y el antígeno. Como
detergentes que son eficaces para este fin, pueden ser mencionados
detergentes con grupos alquilo y aminas de secundarias a
cuaternarias en la misma molécula, y detergentes no iónicos.
En los detergentes que comprenden cadenas de
alquilo y aminas de secundarias a cuaternarias, la cadena de
alquilo es preferiblemente una cadena de alquilo lineal, siendo el
número de átomos de carbono preferiblemente 10 o más y, más
preferiblemente 12-16. La amina es preferiblemente
una amina terciaria o amina cuaternaria (amonio). Como detergentes
específicos, pueden ser mencionados el ácido
dodecil-N-sarcosínico, sales de
dodeciltrimetilamonio, sales de cetiltrimetilamonio, ácido
3-(dodecildimetilamonio)-1-propanosulfónico,
ácido
3-(tetradecildimetilamonio)-1-propanosulfónico,
sales de dodecilpirimidio, sales de cetilpirimidio,
decanoil-N-metilglucamida
(MEGA-10),
dodecil-N-betaína y otros
similares. El ácido
dodecil-N-sarcosínico y las sales de
dodeciltrimetilamonio son los preferidos.
El detergente no iónico anteriormente mencionado
es preferiblemente uno con un equilibrio
hidrófilo-lipófilo de 12 a 14, siendo preferidos
los éteres de polioxietileno de isooctil-fenilo
tales como Triton X100, Triton X114, etc. y éteres de
polioxietileno de nonil-fenilo tales como Nonidet
P40, Triton N101, Nikkol NP, etc.
Los dos tipos de detergentes anteriormente
mencionados pueden ser usados solos, pero sus combinaciones son más
preferibles ya que pueden ser logrados efectos sinérgicos.
Los presentes inventores encontraron que un
vehículo, que fue inmovilizado con antígenos que contenían epítopos
de VHC para la detección de anticuerpos de VHC y anticuerpos frente
a antígenos de VHC para la detección del antígeno de VHC, es capaz
de capturar de manera eficiente el antígeno de VHC, anticuerpos de
VHC en las muestras sin anticuerpos de VHC, o el antígeno de VHC,
respectivamente. Los inventores también encontraron que el vehículo
captura de manera eficiente tanto antígenos de VHC como anticuerpos
en muestras que contienen antígenos de VHC y anticuerpos, y dio
señales más altas derivadas por su unión. Basado en estas
conclusiones, los inventores han completado la presente
invención.
Un método para detectar simultáneamente un
antígeno viral y anticuerpos frente a la parte asociada del virus
ya ha sido documentado para el VIH (Weber et al., J.
Clinic. Microbiol., 36: 2235-2239, 1998).
En el caso del VIH, es eficaz detectar p24 que es la proteína Gag
para un ensayo del antígeno viral. Por otra parte, para analizar un
anticuerpo contra el antígeno viral, es eficaz detectar los
anticuerpos contra la proteína de superficie y p19 que es una
proteína Gag. Por lo tanto, un método para detectar simultáneamente
un antígeno viral y un anticuerpo contra el antígeno viral es
establecido combinando un ensayo del antígeno que detecta g24 que
es una proteína Gag, y un ensayo del anticuerpo que detecta los
anticuerpos contra la proteína de superficie y p19 que es una parte
de la proteína Gag.
En tal caso en el que los epítopos usados para
la detección de antígenos virales son diferentes de los epítopos
reconocidos por los anticuerpos en una muestra usada para la
detección de anticuerpos virales, es relativamente fácil construir
un método para detectar simultáneamente antígenos virales y
anticuerpos contra antígenos virales. Esto es porque, por ejemplo,
en el caso del ensayo de VIH, el antígeno p24 reconocido por una
sonda para la detección del antígeno, por ejemplo, un anticuerpo
monoclonal contra el epítopo de VIH, y antígenos reconocidos por
anticuerpos contenidos en una muestra de un paciente, que son la
proteína de superficie y p19 que es una parte de la proteína Gag
son diferentes proteínas, y por lo tanto la sonda usada para el
ensayo del antígeno no puede reconocer la proteína de superficie y
el p19 que es una parte de la proteína Gag. En consecuencia, no hay
ninguna interferencia entre el sistema de detección de antígenos y
el sistema de detección de anticuerpos, por ejemplo una reacción no
específica, que disminuye la sensibilidad causada por la reacción
competitiva entre la sonda y el epítopo de VIH usado para la
detección del anticuerpo.
Sin embargo, para la detección de anticuerpos
contra epítopos de VHC, la detección de anticuerpos contra el
antígeno nuclear es altamente útil desde un punto de vista clínico
(Chiba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
4641-4645, 1991; Bresters et al., Vox
Sang, 62: 213-217, 1992). Por lo tanto,
es esencial para la detección del anticuerpo detectar los
anticuerpos contra los epítopos del antígenos nuclear. Por otra
parte, para la detección de antígenos, la detección del antígeno
nuclear es lo más útil en la detección de antígenos de VHC, porque,
de los antígenos que forman las partículas virales, la velocidad de
mutación del antígeno nuclear es inferior que las de otros
antígenos tales como E1 y E2. Es decir, para construir un sistema
de ensayo que detecte simultáneamente el antígeno de VHC y los
anticuerpos de VHC, el mismo antígeno, es decir, el antígeno
nuclear debe ser usado tanto para el sistema de detección del
antígeno como para el sistema de detección del anticuerpo.
Por lo tanto, si se usa el antígeno nuclear sin
ninguna mejora, los siguientes problemas son generados: un
anticuerpo monoclonal contra el antígeno nuclear usado para la
detección del antígeno se une al antígeno nuclear usado para la
detección del anticuerpo, causando la disminución de la sensibilidad
para la detección del antígeno nuclear en una muestra; el
anticuerpo monoclonal se une al antígeno usado para las detecciones
del anticuerpo causando la reacción no específica en el ensayo del
antígeno; y el epítopo de VHC para el anticuerpo de ensayo se
enmascara causando la disminución en la sensibilidad.
Para solucionar los problemas anteriormente
mencionados, los presentes inventores encontraron que tanto el
antígeno como los anticuerpos pueden ser detectados de manera
eficiente simultáneamente distinguiendo los epítopos reconocidos
por el anticuerpo monoclonal en la detección del antígeno a partir
de los epítopos del antígeno nuclear para los anticuerpos presentes
en la muestra, y han completado la presente invención.
Se muestra una combinación de epítopos adecuados
para la detección simultánea del antígeno y anticuerpos
detalladamente en los Ejemplos descritos a continuación.
En cuanto a los epítopos para anticuerpos en una
muestra contra el antígeno nuclear, los diversos análisis del
epítopo muestran que las regiones más importantes están presentes en
la región del extremo N-terminal del antígeno
nuclear, especialmente desde la posición 1 a la posición 40 del
polipéptido de VHC (Okamoto et al., Hepatology
15: 180-186, 1992; Sallsberg et al.
J. Clinical. Microbiol., 30:
1989-1994, 1992; Sallsberg et al., J.
Med. Vilol. 43: 62-68, 1994). Además, un
epítopo que reacciona específicamente con el genotipo está presente
en la región desde la posición 60 a la posición 80 del polipéptido
de VHC (Machida, Hepatology, 16:
886-891, 1992; Solicitud de Patente Japonesa
9-209522). Por lo tanto, es importante que un
antígeno para la detección de anticuerpos contra los epítopos de VHC
tenga una secuencia desde la posición 1 a la posición 40 y desde la
posición 66 a la posición 80 del polipéptido de VHC. En
consecuencia, el Ejemplo describe un polipéptido de antígeno
"CEPM" que tiene la secuencia desde la posición 1 a la posición
42 y desde la posición 66 a la posición 80 del polipéptido de VHC
como un antígeno para la detección de anticuerpos de VHC. Nótese
que el CEPM es un antígeno que tiene una secuencia artificial que
comprende las siguientes regiones del polipéptido de VHC en el
orden descrito, y un procedimiento para su construcción se describe
en la Solicitud de Patente Japonesa Nº. 9-209522.
Su secuencia se describe en SEQ ID NO:10.
La ligación de los epítopos de VHC de CEPM
es:
- (1238-1312) - (1363-1460) - (1712-1751) - (66-80) - (1686-1704) - (1716-1751) - (66-80) - (1690-1713) - (1-42)
Por otra parte, para la detección del antígeno,
los anticuerpos monoclonales que reconocen y se unen a la región
desde la posición 100 a la posición 130 del polipéptido de VHC, los
anticuerpos contra los cuales la región es relativamente rara en
muestras, se usan como anticuerpos primarios, y para detectar el
antígeno nuclear capturado por el anticuerpo primario, un
anticuerpo monoclonal que reconoce una región desde la posición 40
a la posición 50 del polipéptido de VHC, cuya región no se usa para
la detección del anticuerpo, se usa como anticuerpo secundario.
Ambos anticuerpos monoclonales anteriormente
mencionados no se unen a la región antigénica desde la posición 1 a
la posición 42 del polipéptido de VHC, que se usa para la detección
de anticuerpos de VHC, y por lo tanto usando los anticuerpos
anteriormente mencionados y el antígeno, no ocurre ninguna
interferencia en la reacción en el sistema de detección del
antígeno y el sistema de detección del anticuerpo, y ambos sistemas
de detección pueden funcionar simultáneamente.
La invención será explicada a continuación
detalladamente mediante los Ejemplos siguientes.
Un plásmido de expresión correspondiente a la
región nuclear de VHC fue construido de la manera siguiente. Un
microgramo cada uno de ADN de los plásmidos
pUC\cdotC11-C21 y
pUC\cdotC10-E12 obtenidos incorporando el clon
C11-C21 y el clon C10-E12
(Publicación de Patente Japonesa no examinada Nº
6-38765) en el plásmido pUC119 fueron digeridos a
37ºC durante una hora con 20 \mul de una solución de reacción con
enzimas de restricción [Tris-HCl 50 mM (pH 7,5),
MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM, NaCl 100 mM, 15 unidades de EcoRI y 15
unidades de enzima CLAI] y [Tris-HCl 10 mm (pH
7,5), MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM, NaCl 50 mM, 15 unidades de ClaI y
15 unidades de KpnI], respectivamente, y esto fue seguido de la
electroforesis en gel de agarosa del 0,8% para purificar un
fragmento de aproximadamente 380 bp de EcoRI-ClaI y
un fragmento de aproximadamente 920 bp de
ClaI-KpnI.
A estos fragmentos de ADN y un vector obtenido
digiriendo pUC119 con EcoRI y KpnI fueron allí añadidos 5 \mul de
una solución de tampón de ligasa 10x [Tris-HCl 660
mM (pH 7,5), MgCl_{2} 66 mM, ditiotreitol 100 mM, ATP 1 mM], 1
\mul de ligasa T4 (350 unidades/\mul) y agua hasta 50 \mul, y
esto fue seguido de la incubación de una noche a 16ºC para la
reacción de ligación. El plásmido fue usado para transformar JM109
de E. coli, obteniendo el plásmido
pUC\cdotC21-E12.
Una parte de 1 ng de ADN de este plásmido
pUC\cdotC21-E12 fue sometida a PCR usando dos
cebadores (5'-GAATT
CATGGGCACGAATCCTAAA-3' (SEQ. ID. No. 7) y 5'-TTAGTCCTCCAGAACCCGGAC-3' (SEQ. ID. No. 8)). La PCR fue llevada a cabo usando el kit de GeneAmp® (kit de reactivo de amplificación de ADN, producto de Perkin Elmer Cetus) en las condiciones de desnaturación del ADN a 95ºC durante 1,5 minutos, templando a 50ºC durante 2 minutos y síntesis de ADN a 70ºC durante 3 minutos, y el fragmento de ADN resultante fue separado en electroforesis de gel de agarosa del 0,8% y fue purificado por el método del polvo cristalino (GenClean).
CATGGGCACGAATCCTAAA-3' (SEQ. ID. No. 7) y 5'-TTAGTCCTCCAGAACCCGGAC-3' (SEQ. ID. No. 8)). La PCR fue llevada a cabo usando el kit de GeneAmp® (kit de reactivo de amplificación de ADN, producto de Perkin Elmer Cetus) en las condiciones de desnaturación del ADN a 95ºC durante 1,5 minutos, templando a 50ºC durante 2 minutos y síntesis de ADN a 70ºC durante 3 minutos, y el fragmento de ADN resultante fue separado en electroforesis de gel de agarosa del 0,8% y fue purificado por el método del polvo cristalino (GenClean).
Separadamente, fue digerido pUC19 con la enzima
de restricción SmaI, y el fragmento de ADN obtenido por PCR fue
añadido a 5 \mul de una solución de tampón de ligasa 10x
[Tris-HCl 660 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 66 mM,
ditiotreitol 100 mM, ATP 1 mM] y 1 \mul de ligasa T4 (350
unidades/\mul) con agua hasta 50 \mul, después de lo cual fue
realizada una incubación de una noche a 16ºC para la reacción de
ligación. El plásmido fue usado para transformar JM109 de E.
coli, obteniendo el plásmido
pUC19\cdotC21-E12-SmaI.
Un microgramo de este ADN de plásmido fue
digerido a 37ºC durante una hora con 20 \mul de una solución de
la reacción de enzima de restricción [NaCl 150 mM,
Tris-HCl 6 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 6 mM, 15 unidades
de EcoRI y 15 unidades de enzima BamHI], y esto fue seguido de la
electroforesis de gel de agarosa del 0,8% para separar un fragmento
de aproximadamente 490 bp de EcoRI-BamHI, que
entonces fue purificado por el método del polvo cristalino.
Una parte de 1 \mug del ADN del vector de
expresión Trp\cdotTrpE (Publicación de Patente Japonesa no
examinada Nº 5-84085) entonces fue digerida a 37ºC
durante una hora con 20 \mul de una solución de la reacción de
enzima de restricción [NaCl 150 mM, Tris-HCl 6 mM
(pH 7,5), MgCl_{2} 6 mM, 15 unidades de EcoRI y 15 unidades de la
enzima de BamHI], y después de la agregación de 39 \mul de agua a
la solución de reacción y el calentamiento de ello a 70ºC durante 5
minutos, fue añadido 1 \mul de fosfatasa alcalina bacteriana
(BAP) (250 unidades/\mul) antes de la incubación a 37ºC durante
una hora.
Fue añadido fenol a la solución de reacción para
la extracción con fenol, y el ADN en la capa acuosa resultante fue
precipitado con etanol y fue secado. Una parte de 1 \mug del ADN
del vector tratado con EcoRI-BamHI obtenido y el
fragmento nuclear anteriormente mencionado fueron añadidos a 5
\mul de una solución de tampón ligasa 10x
[Tris-HCl 660 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 66 mM,
ditiotreitol 100 mM, ATP 1 mM] y 1 \mul de ligasa T4 (350
unidades/\mul) con agua hasta 50 \mul, y esto fue seguido de la
incubación de una noche a 16ºC para la reacción de ligadura.
Una parte de 10 \mul de esta solución de
reacción fue usada para transformar HB101 de E. coli. Una
cepa de E. coli competente para la transformación puede ser
preparada por el método del cloruro de calcio [Mandel, M. y Higa,
A., J. Mol. Biol., 53, 159-162
(1970)]. La E. coli transformada fue extendida en una placa
LB (1% de triptona, 0,5% de NaCl, 1,5% de agar) conteniendo 25
\mug/ml de ampicilina, y fue incubado de la noche a la mañana a
37ºC. Un bucle de colonias formadas en la placa fue tomado y
transferido al medio LB conteniendo 25 \mug/ml de ampicilina para
el cultivo de la noche a la mañana a 37ºC.
Después de la centrifugación de 1,5 ml de la
solución del cultivo celular y la recuperación de las células, la
minipreparación del ADN del plásmido fue llevada a cabo por el
método de álcali [Manniatis et al., "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual", 1982)]. Una parte de 1 \mug del ADN de
plásmido obtenido fue digerida a 37ºC durante una hora con 20
\mul de una solución de la reacción de enzima de restricción [NaCl
150 mM, Tris-HCl 6 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 6 mM, 15
unidades de EcoRI y 15 unidades de enzima BamHI] y fue sometido a
la electroforesis de gel de agarosa, y fue seleccionado un plásmido
de expresión nuclear Trp\cdotTrpE 160 que produce un fragmento de
aproximadamente 490 bp de EcoRI-BamHI.
El HB101 de E. coli que lleva el núcleo
160 del plásmido de expresión Trp\cdotTrpE fue inoculado en 3 ml
de medio 2YT (1,6% de triptona, extracto de levadura del 1%, 0,5% de
NaCl) conteniendo 50 \mug/ml de ampicilina, y cultivado a 37ºC
durante 9 horas. Un mililitro de la solución de cultivo fue
subcultivado a 37ºC en 100 ml de medio M9-CA (0,6%
de Na_{2}HPO_{4}, 0,5% de KH_{2}PO_{4}, 0,5% de NaCl, 0,1%
de NH_{4}Cl, CaCl_{2} 0,1 mM, MgSO_{4} 2 mM, 0,5% de ácido
casamino, 0,2% de glucosa) conteniendo 50 \mug/ml de ampicilina.
Fue añadido ácido indoleacrílico a una concentración final de 40
mg/l en el punto cuando OD600 = 0,3, y el cultivo fue seguido
durante 16 horas. La solución del cultivo fue sometida a la
separación con centrifugación para recoger las células.
Las células fueron suspendidas por la adición de
20 ml de la solución tampón A [Tris-HCl 50 mM (pH
8,0), EDTA 1 mM, NaCl 30 mM], y la posterior centrifugación
proporcionó 2,6 g de células. Estas células obtenidas fueron
suspendidas en 10 ml de la solución tampón A, y después de la
ruptura de las membranas de E. coli por la ruptura
ultrasónica fueron centrifugadas para obtener una fracción insoluble
que contenía un polipéptido fusionado del polipéptido codificado
por cADN de VHC y TrpE. A esta fracción fueron añadidos 10 ml de la
solución tampón A que contiene urea 6 M para la solubilización y
extracción del polipéptido fusionado. El extracto solubilizado fue
sometido a cromatografía de columna de intercambio iónico usando
S-Sepharose para la purificación del polipéptido
fusionado.
El polipéptido fusionado (TrpC11) preparado por
el método descrito anteriormente fue disuelto en urea 6 M y luego
fue diluido en una solución de tampón fosfato 10 mM (pH 7,3)
conteniendo NaCl 0,15 M hasta una concentración final de 1,0 mg/ml
y fue mezclado con una cantidad igual de TiterMax para hacer una
suspensión de TrpC11. La suspensión fue ajustada a una
concentración de TrpC11 de 0,01 a 0,05 mg/ml y fue usada para la
inyección intraperitoneal en ratones BALB/c de 4 a 6 semanas.
Después de aproximadamente 8 semanas, a los animales inmunizados se
les inyectadó después por la vena caudal una solución salina
fisiológica preparada a una concentración de TrpC11 de 0,005 a 0,03
mg/ml.
Durante el tercer día después de la inmunización
de refuerzo final, los bazos de los animales inmunizados fueron
extraídos asépticamente, fueron cortados con tijeras, rotos en
células de bazo individuales usando una malla, y fueron lavados 3
veces con medio RPMI-1640. Una línea celular de
mieloma de ratón en etapa de crecimiento logarítmico PAI que había
sido cultivada durante unos días en presencia de
8-azaguanidina y tenía los revertantes
completamente eliminados fue lavada de la misma manera descrita
anteriormente, después de lo cual 1,8 x 10^{7} de estas células y
1,0 x 10^{8} de las células de bazo fueron colocadas en un tubo de
centrifuga de un volumen de 50 ml y fueron mezclados. Esto fue
sometido a la separación por centrífuga a 200 x g durante 5
minutos, el sobrenadante fue eliminado y fue añadido 1 ml de medio
RPMI-1640 que contenía polietilenglicol del 50%
(PEG) 4000 (producto de la compañía Merck) calentado a 37ºC para la
fusión de las células.
Después de quitar el PEG de las células
fusionadas por centrifugación (200 x g, 5 minutos), fue usada una
placa de 96 pocillos para su cultivo durante 1 a 2 semanas en medio
RPMI-1640 que contenía hipoxantina, aminopterina y
timidina (a continuación abreviado "HAT"), para permitir el
crecimiento de sólo los hibridomas. Entonces fueron cultivados en
medio sin HAT, y después de aproximadamente 2 semanas fue usado el
método ELISA para buscar los clones que producían el anticuerpo
objetivo, sobre el cual fueron obtenidos los hibridomas que
produjeron el anticuerpo monoclonal de la invención que tiene la
especificidad de reacción deseada.
Un procedimiento de dilución limitante
convencional fue seguido para buscar y monoclonar las cepas que
producían los anticuerpos objetivo entre los hibridomas obtenidos,
y los hibridomas fueron denominados como HC11-14,
HC11-10, HC11-3 y
HC11-7. Estos cuatro hibridomas diferentes fueron
depositados en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología
Humana el 4 de Julio de 1997 como FERM BP-6006, FERM
BP-6004, FERM BP-6002 y FERM
BP-6003.
Los hibridomas obtenidos por el método descrito
en el Ejemplo 2 fueron trasplantados a abdómenes de ratones
tratados con pristano, etc., y los anticuerpos monoclonales que
gradualmente fueron producidos en la ascitis fueron recogidos. Los
anticuerpos monoclonales fueron purificados separando la fracción de
IgG con una columna de Sepharose unida a Proteína A.
\newpage
El isotipo de los anticuerpos monoclonales
producidos por los cuatro diferentes hibridomas anteriormente
mencionados, C11-14, C11-10,
C11-7 y C11-3, fueron identificados
por el método de inmunodifusión doble que usa cada anticuerpo del
isotipo de IG antiratón de conejo (producto de la compañía Zymed), y
fue encontrado que C11-10 y C11-7
eran IgG2a, y C11-14 y C11-3 eran
IgG1. Como consecuencia del análisis del epítopo de estos cuatro
anticuerpos monoclonales usando 20 péptidos sintetizados por
secuencias derivadas de la región de VHC/núcleo, se mostró que eran
anticuerpos monoclonales que específicamente reconocían las partes
de la secuencia nuclear como se muestra en la Tabla 1.
Una muestra que contenía partículas de VHC fue
diluida en una solución de reacción que contenía detergentes para
determinar la eficacia con la cual el antígeno nuclear del VHC era
detectado.
La detección del antígeno nuclear del VHC fue
realizada por inmunoensayo enzimático sándwich (EIA) usando
anticuerpos monoclonales para el antígeno nuclear del VHC. De los
anticuerpos monoclonales obtenidos en el Ejemplo 3,
C11-3 y C11-7 fueron usados como
anticuerpos para capturar el antígeno nuclear, y
C11-10 y C11-14 fueron usados como
anticuerpos para la detección del antígeno nuclear capturado.
El EIA fue realizado básicamente en las
condiciones siguientes. Las soluciones de los anticuerpos
monoclonales C11-3 y C11-7 en
soluciones tampón de acetato diluidas a 4 \mug/ml cada una fueron
añadidas a placas de microtítulo e incubadas de la noche a la
mañana a 4ºC. Entonces fueron lavadas con una solución de tampón
fosfato y fueron sometidas a un procedimiento de bloqueo por la
adición de una solución de tampón fosfato que contenía BSA del 1%.
Después de añadir 100 \mul de la solución de reacción y 100 \mul
de la muestra a esto y mezclar, la reacción fue llevada a cabo a
temperatura ambiente durante 1,5 horas. Después de quitar los
materiales no reaccionados lavando con una solución de tampón
fosfato que contenía una concentración baja de detergente, los
anticuerpos monoclonales C11-10 y
C11-14 marcados por fosfatasa alcalina fueron
añadidos para su reacción a temperatura ambiente durante 30
minutos. Después de la terminación de la reacción, los materiales
no reaccionados fueron eliminados lavando con una solución de tampón
fosfato que contenía una concentración baja de detergentes, y una
solución de sustrato (CDP-Star/emerald11) fue
añadida para la reacción a temperatura ambiente durante 15 minutos,
después de lo cual fue medida la luminiscencia.
Fueron añadidos diferentes detergentes a la
solución de reacción primaria y sus efectos fueron examinados. El
suero positivo de antígeno de VHC con un título de anticuerpo
anti-VHC por debajo del nivel de detección y aunque
no contenía prácticamente ningún anticuerpo anti-VHC
fue usado, y las sensibilidades de detección del antígeno nuclear
fueron determinadas basado en el grado de luminiscencia y fueron
expresadas como relaciones de reacción en relación con 1,0 como
luminiscencia para el suero sano humano. Se muestran los resultados
en las Tablas 2 y 3 siguientes.
Estos resultados demostraron que la adición de
detergentes no iónicos que exhibían valores de HLB de 12 a 14, como
se representa por Triton X100, aumentaba la luminiscencia e
incrementaba la sensibilidad de detección en el suero positivo de
antígeno de VHC respecto al suero sano humano. También fue
demostrado que la adición de detergentes tanto con cadenas de
alquilo lineales como con aminas de secundarias a cuaternarias en
sus estructuras, como se representa por el
dodecil-N-sarcosinato de sodio y
dodeciltrimetilamonio, también incrementaba la sensibilidad de
detección en el suero positivo de antígeno de VHC. Ningún tal efecto
de aumento de la sensibilidad fue encontrado con los tensioactivos
que tienen grupos alquilo de 8 o menos átomos de carbono. También se
demostró que la adición de una mezcla de estos dos tipos de
tensioactivos (la mezcla del 2% de
dodecil-N-sarcosinato de sodio + 2%
de Triton X100 en la Tabla 2) aumentaba la sensibilidad de detección
en el suero positivo de antígeno de VHC.
Un panel de seroconversión de PHV905 disponible
en el comercio (BBI Inc.) fue medido de acuerdo con el Ejemplo 4
con la adición de Triton X100 del 2% y
dodecil-N-sarcosinato de sodio del
2% en la solución de reacción. El panel PHV905 usado en este
Ejemplo exhibió una conversión positiva en el ensayo del anticuerpo
anti-VHC (Ortho EIA. 3.0) el 21 día después de
observación inicial (Suero Nº PHV905-7), siendo
representado el título de anticuerpo por el índice de corte (S/CO),
con 1,0 o mayor valorado como positivo. La actividad del antígeno
nuclear del VHC (lu-
miniscencia) fue representada como una relación (S/N) respecto a 1,0 como luminiscencia para el suero sano humano.
miniscencia) fue representada como una relación (S/N) respecto a 1,0 como luminiscencia para el suero sano humano.
Como se muestra en la Tabla 4, la actividad del
antígeno nuclear fue encontrada hasta antes de la positividad del
anticuerpo anti-VHC, confirmando así que la adición
del tensioactivo causaba la exposición del antígeno nuclear de las
partículas virales, permitiendo así su reacción con los anticuerpos
inmovilizados monoclonales y su detección.
Una muestra (suero humano) fue usada que
contenía un anticuerpo para un epítopo de VHC pero prácticamente
ningún antígeno de VHC, y fue usado el método siguiente para
confirmar que era posible para el anticuerpo para el epítopo de VHC
unirse con el polipéptido de VHC en la solución de reacción primaria
que contenía el detergente sin inactivación y por ello ser
detectado por la adición del anticuerpo antihumano en una solución
de reacción secundaria, y confirmar que era posible detectar el
antígeno nuclear cuando el antígeno nuclear estaba presente, el
anticuerpo cuando el anticuerpo para el epítopo de VHC estaba
presente, y ambos cuando ambos estaban presentes.
El EIA fue realizado básicamente en las
condiciones siguientes. El antígeno recombinante CEPM que contenía
un epítopo de VHC fue diluido en una solución de tampón fosfato que
contenía urea, y luego fue añadido a una placa de microtítulo e
incubado de la noche a la mañana a 4ºC. Después del lavado con una
solución de tampón fosfato, fue añadida una solución preparada
diluyendo los anticuerpos monoclonales C11-3 y
C11-7 en una solución de tampón acetato a la placa
y fue incubada de la noche a la mañana a 4ºC. El método para
preparar el antígeno recombinante CEPM está descrito en la
Solicitud de Patente Japonesa Nº 9-209522. Después
de la eliminación de la solución de anticuerpo, esto se lavó con
una solución de tampón fosfato y se sometió a un procedimiento de
bloqueo por la adición de una solución de tampón fosfato que
contenía 1% de BSA.
Después de añadir 100 \mul de una solución de
reacción primaria que contenía Triton X100,
dodecil-N-sarcosinato de sodio y
urea y 100 \mul de la muestra en aquel orden y agitando, la
reacción fue llevada a cabo a temperatura ambiente durante 1,5
horas. Después de quitar la materia no reaccionada lavando con una
solución de tampón fosfato que contenía una concentración baja del
tensioactivo añadido, fue añadida una solución de reacción
secundaria que contenía el anticuerpo monoclonal del antígeno
nuclear anti-VHC C11-14 marcado con
peroxidasa de rábano picante y el anticuerpo monoclonal de IgG
antihumano de ratón para la reacción a temperatura ambiente durante
30 minutos.
Después de la terminación de la reacción, la
materia no reaccionada fue eliminada lavando con una solución de
tampón fosfato que contenía una concentración baja del tensioactivo
añadido, y fue añadida una solución de sustrato
(orto-fenilendiamina) para su reacción a temperatura
ambiente durante 20 minutos, después de lo cual fue medida la
luminiscencia.
El suero positivo de anticuerpo de VHC humano
que había sido confirmado que no contenía prácticamente ningún
antígeno nuclear del VHC fue diluido con suero de caballo y fue
usado para las muestras para confirmar la detección de anticuerpos
para el epítopo de VHC, por lo cual fue encontrado que reaccionaba
de una manera dependiente de la concentración y el anticuerpo fue
confirmado que se detectaba sin inactivación en la solución de
reacción primaria.
Separadamente, fue añadido un antígeno nuclear
recombinante al suero de caballo y fue diluido con suero de caballo
para su uso como muestras, que fueron medidas para confirmar que el
antígeno nuclear recombinante podía ser detectado de una manera
dependiente de la concentración.
Cuando las muestras que contienen las cantidades
apropiadas del antígeno nuclear añadido y el suero humano eran
usadas como muestras, fue obtenida una señal para el antígeno
nuclear recombinante cuando sólo el antígeno nuclear recombinante
estaba presente, una señal para sólo el anticuerpo de VHC fue
obtenida cuando sólo el suero positivo de anticuerpo de VHC humano
estaba presente, y una señal sumada de ambas señales fue obtenida
cuando ambos estaban presentes, como se muestra en la Tabla 4. Así
se mostró que tanto el sistema de detección de antígeno como el
sistema de detección de anticuerpo funcionaban correctamente sin
interferir el uno con el otro, permitiendo así la detección del
antígeno de VHC y el anticuerpo para el epítopo del polipéptido de
VHC.
Una muestra humana sana, una muestra de paciente
y una muestra del panel de conversión positivo de suero (BBI, Inc.)
fueron usadas para su medida simultánea de antígeno y anticuerpo de
acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 6. El suero del panel
fue usado para la comparación con los resultados determinados usando
un reactivo para la detección del anticuerpo de VHC suministrado
por la agencia de distribución.
Se muestran los resultados de la medida de 18
muestras de humanos sanos en la Tabla 6, y se confirma que ninguna
reacción ocurrió en las personas sanas. Basado en la distribución
para las personas sanas, el valor crítico entre reacción positiva y
negativa fue determinado que era 0,1.
Los valores positivos fueron exhibidos para
todas las muestras positivas de VHC, como se muestra en la Tabla
7.
Sin embargo, como se muestra en la Tabla 8, a
los puntos de 1 a 6 para los cuales la positividad no podía ser
determinada en las pruebas del anticuerpo de los sueros del panel se
les dio valoraciones positivas. Estos puntos se les dio
valoraciones positivas en los resultados del ensayo de VHC de
Amplicor, y corresponden al período de seroconversión, y por lo
tanto la positividad también fue confirmada con las muestras del
período de seroconversión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con el método descrito en el Ejemplo
3, fue construido otro hibridoma designado como
HC11-15. Este hibridoma fue depositado en el
Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana el 16 de Julio
de 1999 como FERM BP-9782. El anticuerpo monoclonal
producido por este hibridoma fue purificado y su isotipo fue
identificado como IgG1. Como consecuencia de un análisis de epítopo
usando 20 péptidos sintetizados sobre la base de la secuencia de la
región nuclear, dicho anticuerpo monoclonal fue encontrado que
reconocía específicamente a ^{15}Thr-^{30}Ile
(SEQ ID NO:9).
El antígeno nuclear recombinante (Trp C11) fue
diluido en tampón fosfato 10 mM (pH 7,3) conteniendo urea 6 M a una
concentración final de 2 \mug/ml, y 100 \mul de la solución
fueron añadidos a cada pocillo de la microplaca. Después de
permitir estar a 4ºC de la noche a la mañana, la solución fue
aspirada, y los pocillos fueron lavados dos veces con tampón
fosfato 10 mM (pH 7,3). 350 \mul de tampón fosfato 10 mM (pH 7,3)
conteniendo caseína del 0,5% fueron añadidos a cada pocillo, y
después de la incubación a temperatura ambiente durante una hora,
el tampón fue aspirado. Cada anticuerpo monoclonal
(C11-3, C11-7,
C11-10, C11-14 o
C11-15) secuencialmente diluido con una mezcla de
reacción fue añadido a cada pocillo, y se hizo reaccionar durante
una hora. Después del lavado, fue añadido un anticuerpo antiratón
marcado con peroxidasa, se hizo reaccionar durante 30 minutos, y
después del lavado, una reacción enzimática fue llevada a cabo
añadiendo una solución de sustrato que comprendía
ortofenilendiamina y peróxido de hidrógeno. Después de la reacción a
temperatura ambiente durante 30 minutos, fue añadido ácido
sulfúrico 2 N para terminar la reacción enzimática, y fue medida la
absorbancia a 492 nm mediante un lector de microplaca.
El C11-15 exhibió el título del
anticuerpo más alto, revelando que si este anticuerpo es usado como
antígeno secundario puede ser obtenida una detección con una alta
sensibilidad.
El anticuerpo monoclonal (C11-3,
C11-5, y C11-15;
C11-3 y C11-7; C11-3
y C11-15; C11-3 solo;
C11-7 solo; o C11-15 solo) fue
diluido en tampón fosfato 10 mM (pH 7,3) a una concentración final
de 6 \mug/ml, y 100 \mul de la solución fueron añadidos a cada
pocillo de la microplaca. Después de permitir estar a 4ºC de la
noche a la mañana, el tampón fue aspirado, y los pocillos fueron
lavados dos veces con tampón fosfato 10 mM (pH 7,3). Fueron
añadidos 350 \mul de tampón fosfato 10 mM (pH 7,3) conteniendo
caseína del 0,5%, y después de una incubación a temperatura
ambiente durante dos horas, el tampón fue aspirado. Fueron añadidos
a cada pocillo 100 \mul de una muestra que era positiva a
VHC-ARN y negativa con el anticuerpo
anti-VHC y 100 \mul de una solución de reacción,
y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante una hora.
Después del lavado, fue añadido un anticuerpo monoclonal de
antígeno anti-nuclear marcado con peroxidasa (una
mezcla de C11-14 y C11-10), y se
hizo reaccionar durante 30 minutos, y después del lavado, fue
llevada a cabo una reacción enzimática añadiendo una solución de
sustrato que comprendía ortofenilendiamina y peróxido de hidrógeno.
Después de la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos,
fue añadido ácido sulfúrico 2 N para terminar la reacción
enzimática, y fue medida la absorbancia a 292 nm mediante un lector
de microplaca. Se muestran los resultados en la Figura 2.
Fue revelado que aunque la sensibilidad de
detección fuera baja si sólo era inmovilizado
C11-15, la sensibilidad de detección aumentaba
inmovilizando una mezcla de C11-15, y
C11-3 o C11-7 etc.
Fue cultivado el transformante CEPM/HB101 de
E. coli en un medio LB que contenía 100 \mug/ml de
ampicilina a 37ºC de la noche a la mañana. El cultivo fue inoculado
a M9-CA que contenía 100 \mug/ml de ampicilina
por un tamaño de inócolo de concentración del 1%, y fue cultivado a
37ºC de la noche a la mañana. Después del final del cultivo, las
células microbianas fueron recogidas por centrifugación, y fueron
resuspendidas en 50 ml de una solución de lisis
[Tris-HCl 50 mM (pH 8,5), NaCl 30 mM, EDTA 5 mM), y
después de añadir 1 ml de una solución de lisozima (Lisozima 10
mg/ml), fueron inoculados a 37ºC durante una hora. Esta suspensión
fue sometida a ultrasonicación (150 W, 90 segundos, dos veces) para
romper las células. Una fracción insoluble fue recuperada por
centrifugación a 15000 revoluciones por minuto, 4ºC durante 30
minutos. La fracción insoluble fue resuspendida en 50 ml de una
solución [Tris-HCl 50 mM (pH 8,5)] conteniendo 1% de
NP40, y fue homogenizada (1500 revoluciones por minuto, 5 golpes).
La suspensión fue centrifugada a 1500 revoluciones por minuto, 4ºC
durante 30 minutos para recuperar una fracción insoluble. La
fracción insoluble fue resuspendida en 50 ml de la solución A
conteniendo urea 2 M, y fue homogeneizada (1500 revoluciones por
minuto, 5 golpes). La suspensión fue centrifugada a 15000
revoluciones por minuto, 4ºC durante 30 minutos para recuperar una
fracción insoluble. La fracción insoluble fue resuspendida en 50 ml
de la solución A que contenía urea 6 M, y fue homogeneizada (1500
revoluciones por minuto, 5 golpes). La suspensión fue centrifugada a
15000 revoluciones por minuto, 4ºC durante 30 minutos para
recuperar una fracción soluble.
El antígeno quimérico de epítopo fue purificado
de la solución de antígeno preparada por solubilización con la
solución que contenía urea 6 M, por un intercambio iónico utilizando
una columna de S Sepharose HP (Pharmacia) y filtración de gel
usando Superdex 75 pg (Pharmacia).
Nótese que una secuencia de nucleótidos de ADN
que codifica dicho antígeno quimérico se muestra en SEQ ID NO:10, y
que se muestra la secuencia de aminoácidos del antígeno quimérico en
SEQ ID NO:11.
Referencia a los microorganismos depositados
conforme la norma 13-2 de PCT y el Instituto
Depositario.
\vskip1.000000\baselineskip
Instituto Depositario
- Nombre: Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana
- Dirección: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón
\vskip1.000000\baselineskip
Microorganismos
- (1)
- Identificación: HC11-3
- \quad
- Nº de depósito: FERM BP-6002
- \quad
- Fecha de depósito: 4 de Julio de 1997
\vskip1.000000\baselineskip
- (2)
- Identificación: HC11-7
- \quad
- Nº de depósito: FERM BP-6003
- \quad
- Fecha de depósito: 4 de Julio de 1997
\vskip1.000000\baselineskip
- (3)
- Identificación: HC11-10
- \quad
- Nº de depósito: FERM BP-6004
- \quad
- Fecha de depósito: 4 de Julio de 1997
\vskip1.000000\baselineskip
- (4)
- Identificación: HC11-11
- \quad
- Nº de depósito: FERM BP-6005
- \quad
- Fecha de depósito: 4 de Julio de 1997
\vskip1.000000\baselineskip
- (5)
- Identificación: HC11-4
- \quad
- Nº de depósito: FERM BP-6006
- \quad
- Fecha de depósito: 4 de Julio de 1997
\vskip1.000000\baselineskip
- (6)
- Identificación: HC11-15
- \quad
- Nº de depósito: FERM BP-6782
- \quad
- Fecha de depósito: 16 de Julio de 1999.
<110> Tonen Corporation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para la detección del virus
de la hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> G902
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150>
JP-10-216094
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-07-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 160
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<230>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> Sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<230> ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<230> ADN sintético
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<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<230>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1197
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<230> Secuencia de nucleótidos que
codifica el antígeno quimérico
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 396
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<230> Secuencia de aminoácidos del
antígeno quimérico
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\hskip1cm
Claims (5)
1. Un método para determinar la presencia del
antígeno nuclear del VHC y anticuerpos contra el antígeno nuclear
del VHC en una muestra, al mismo tiempo, usando (1) una sonda para
la detección del antígeno nuclear del VHC y (2) un epítopo de VHC o
un compuesto que sustituya al epítopo de VHC, en el que la sonda
usada para la detección del antígeno nuclear y el epítopo de VHC o
el compuesto que sustituye el epítopo de VHC no son las entidades
que se unen a través del reconocimiento mutuo, comprendiendo las
etapas de:
(a) poner en contacto la muestra (1) con un
anticuerpo o anticuerpos para la detección del antígeno nuclear del
VHC y (2) con el epítopo de VHC o el compuesto que sustituye al
epítopo de VHC para la detección de anticuerpos contra el antígeno
nuclear del VHC, y
(b) detectar (1) el antígeno nuclear del VHC
mediante un anticuerpo o anticuerpos para la detección del antígeno
nuclear del VHC, y (2) los anticuerpos contra el antígeno nuclear
del VHC.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dichos anticuerpos para la detección del antígeno nuclear
del VHC son anticuerpos que reconocen y se unen a una región desde
la posición 100 a la posición 130 del antígeno nuclear del VHC.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que los anticuerpos que reconocen y que se unen a una región
desde la posición 40 a la posición 50 del antígeno nuclear del VHC
se usan como anticuerpos secundarios.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha muestra se pone en contacto
con dichos anticuerpos para la detección del antígeno nuclear del
VHC y dicho epítopo de VHC o un compuesto que sustituye al epítopo
de VHC en presencia de uno o varios detergentes con una o varias
cadenas de alquilo de al menos 10 átomos de carbono y una o varias
aminas de secundarias a cuaternarias, o uno o varios tensioactivos
no iónicos con un valor de HLB de 12 a 14.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4,
en el que dicha cadena de alquilo detergente tiene de 12 a 16
átomos de carbono y dicha amina de secundaria a cuaternaria es una
amina de terciaria a cuaternaria.
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