WO2000007023A1 - Procede pour la determination de l'hepatite a virus de type c - Google Patents

Procede pour la determination de l'hepatite a virus de type c Download PDF

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Katsumi Aoyagi
Chiharu Ohue
Kumiko Iida
Shintaro Yagi
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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting hepatitis C virus (HCV), and more particularly, to a method for measuring HCV core antigen or for simultaneously measuring HCV core antigen and HCV core antibody. This method is particularly effective for screening a large number of blood samples.
  • HCV hepatitis C virus
  • Hepatitis caused by infection with HCV hepatitis C virus
  • HCV infection can be caused mainly by blood and blood-derived components, it is possible to block the route of infection by identifying and eliminating the source of the infection.
  • the method of identifying the source of infection is mainly the method of detecting antibodies to HCV polypeptide, but a method that can identify the source of infection with higher accuracy has been required.
  • the required background is that there is a period after HCV infection in which antigens are present but antibodies are not produced, the so-called window period. Serum in this period cannot be used to determine the presence or absence of infection by antibody tests. Antibody tests cannot exclude samples in the period of the indo period; therefore, if blood-based substances such as blood transfusions and blood components or blood products that are screened by the antibody test are used, There is a risk of secondary infection by specimens in Therefore, HCV polypeptides It was necessary to detect HCV itself, that is, HCV particles, instead of antibodies.
  • the detection and measurement of HCV itself can be performed by detecting the antigen or gene (RNA) constituting the HCV particles.
  • the antigens that make up the HCV particles are considered to be the core antigen, the enveloping antigens (E1, E2).
  • the envelope antigen has a high degree of mutation in a highly antigenic region as represented by a hypervariable region (Hyper Variable Region). Differences between genotypes have also been reported. To detect all of these mutations and differences, it is necessary to use a probe that specifically binds to multiple regions.
  • a probe refers to a molecule that specifically binds to an antigen, such as a receptor, an antibody, a recombinant antibody, a functional molecule, or a functional structure that recognizes and binds to an antigen molecule.
  • the ko antigen has a conserved sequence at the amino acid sequence level, and by selecting the region, a probe that can detect any genotype antigen of HCV for which multiple genotypes have been reported can be obtained. Because of this, it is possible to construct a genotype-independent detection method.
  • a removal method there is a removal method according to a physical principle, for example, a method of separating and separating HCV particles and an antibody using a difference in molecular weight. Examples of this include gel filtration, ultracentrifugation, density gradient centrifugation, and molecular weight fractionation using membranes such as ultrafiltration membranes.
  • a removal method according to a physical principle, for example, a method of separating and separating HCV particles and an antibody using a difference in molecular weight. Examples of this include gel filtration, ultracentrifugation, density gradient centrifugation, and molecular weight fractionation using membranes such as ultrafiltration membranes.
  • these methods are difficult to apply to mass screening such as blood screening, because special equipment is used in the processing process.On the other hand, methods based on biochemical principles are used.
  • HCV particles by changing the water environment such as PEG (polyethylene glycol), the difference in chemical properties between HCV particles and other serum components, for example, the difference in solubility in water, although there is a method of fractionation by preferentially precipitating particles, the antibody or antibody complex often precipitates in the same fraction as the particles, making it difficult to fractionate.
  • HCV particles often form an immune complex of an antigen constituting the HCV particle and an antibody recognizing the same, and it is difficult to separate only the antibody or the antigen from the immune complex. .
  • a method that removes substances (such as antibodies) that inhibit the function of the probe by functionally destroying them is used.
  • a method of losing the function of the antibody a method of denaturing the antibody protein by exposing it to conditions for denaturing the protein can be considered. And ⁇ function of the antibody is lost, but the function of the antigen of interest, that is, the function of binding to the probe, that is, if the probe is an antibody, does not destroy the epitope, or restores the epitope. This is the condition for presentation.
  • Antibody testing is a method to determine whether antibodies to HCV are present in a sample. If antibodies to HCV are present in a sample, the donor of that sample is currently infected with HCV and In some cases, HCV is present, in other cases, HCV has already been eliminated from the body by treatment or spontaneous healing, and it is difficult to distinguish them depending on the presence or absence of antibodies.
  • the antigen test is an important function of notifying whether or not HCV is present in a sample or, if present, the amount of HCV, and whether or not an antibody is present at that time. Does not matter.
  • HCV antibody testing can provide important information to determine whether hepatitis is the primary cause of HCV, but ultimately the presence or absence of HCV antigens is Desired. In addition, it is important to determine whether or not HCV has been eliminated from the body in order to determine the therapeutic effect, and it is important to know the amount of antigen in determining whether HCV is eliminated from the body. In other words, it is important for treatment to know the presence and amount of the antigen regardless of the presence or absence of the antibody. In other words, in treatment, it is also important to have a test method that gives the presence or absence and amount of antigen.
  • test method determines whether or not there is a risk as a source of HCV infection.
  • antibody testing is used as the main test method in this field.
  • the window period after HCV infection Serum cannot determine the presence or absence of infection by an antibody test. Therefore, when blood-based substances such as blood transfusions, blood components, and blood products that are screened by antibody tests are used, there is a risk of secondary infection by samples in the window period. I do.
  • antigen screening has not yet been performed in mass screening such as blood tests such as blood donation.
  • test method that can determine the presence or absence of an antigen with a precision of 100% (sensitivity and specificity)
  • sensitivity is below the detection sensitivity, it cannot be measured. Therefore, there is no inspection method that can determine with an accuracy of 100%.
  • antigen testing alone may miss the source of infection, so in this field, measuring both antibodies and antigens would reduce the risk of secondary infection. is necessary.
  • an antigen detection method that can be applied to mass screening and shows high sensitivity and specificity has been used, it will be necessary to measure both antigen and antibody, and the number of tests for the same number of samples will be required. Will be added more than it is now, and it will be a cost-up factor.
  • the present invention provides a method for detecting an antigen in a sample at a time when an antibody is not present, such as a window period, and detecting an antigen or a antigen and an antibody in a sample at a time when an antibody is present. Provides a new test method required for testing blood and blood-derived substances.
  • the present invention relates to a method for measuring hepatitis C virus (HCV), which comprises a surfactant or non-ionic surfactant having an alkyl group and a secondary to quaternary amine. It is intended to provide a method characterized by measuring an HCV core antigen by binding to its probe in the presence of an activator or both.
  • HCV hepatitis C virus
  • the present invention further provides a method characterized by measuring the HCV core antigen by the above-mentioned method and measuring the HCV core antibody by binding to the probe.
  • Figure 1 compares the titers of the monoclonal antibodies C11-15 with those of the other monoclonal antibodies C11-3, C11-7, C11-10 and C11-14. It is a graph shown.
  • FIG. 2 shows the results of ELISA when HCV-RNA positive samples were measured using various monoclonal antibodies of the present invention alone or as a mixture and immobilized on a solid phase as a primary antibody. This is the Darafu. Embodiment of the practice
  • the HCV infection detection method provided by the present invention detects an antigen in a sample at a time when no antibody is present, such as a wind period phase, and detects an antigen at the time when an antibody is present, or detects both an antigen and an antibody. Is the way. That is, the antibody does not exist during the period when the antibody does not exist or during the window period, so that it is not necessary to remove the antibody when detecting the antigen. Therefore, it is not necessary to perform a pretreatment necessary for detecting the antigen.
  • HCV virus particles are thought to have a structure in which the nucleic acid that is the genome and the core antigen form a complex to form particles, and the particles are covered by an outer membrane consisting of a lipid membrane and an envelope protein. Have been. Furthermore, it is thought that it exists in the blood as a complex with low-density lipoprotein (LDL) and antibodies against HCV. Therefore, the probe cannot recognize and bind to the core antigen if the virus particles are present in the blood. Therefore, in order to detect the core antigen, it is necessary to perform a treatment such as removing these structures surrounding the core antigen so that the core antigen is recognized by the probe.
  • LDL low-density lipoprotein
  • a reaction method comprising exposing a core antigen in an HCV particle contained in a sample so that a probe for recognizing the core antigen can be recognized, a reaction method comprising a reaction system, Also provided are reagents, including systems for reacting.
  • the sample may contain an antibody against the core antigen that competes with the probe binding site, as described above. Low detection sensitivity May fall. If the core antigen is exposed so that it can bind to the probe, and if an antibody against the core antigen that competes with the probe is included, the antibody is absorbed by the exposed core antigen and the antibody is detected as an immune complex. The amount of antibody against the core antigen that binds to the antigen to be detected by the method may decrease, and the detection sensitivity may decrease.
  • the antigen used for antibody detection consists of only the core antigen epitope However, they are preferably peptides or polypeptides containing HCV peptides other than the core antigen. Further, a peptide or polypeptide other than the peptide or polypeptide containing HCV peptide, which mimics HCV peptide, or a compound may be used.
  • the probe for detecting the core antigen and the compound that replaces the HCV peptide or the HCV peptide do not bind by recognizing each other.
  • Antibodies as probes for the HCV core antigen or labeled antibodies to detect the HCV core antigen can be used to immunize experimental animals such as mice, egrets, nits, goats, sheep, and eggs.
  • variable region gene fragment obtained from cDNA or chromosomal DNA of immunoglobulin such as mouse or human, or a sequence of artificially produced cDNA or a part of chromosomal DNA of immunoglobulin.
  • Variable region gene fragment constructed by combining the above, a variable region gene fragment constructed by using an artificial gene sequence, or a variable region gene produced by using these as a material by genetic recombination techniques A recombinant antibody produced by a cell transformed with a recombinant antibody gene constituted by combining the fragment with an immunoglobulin constant region gene fragment; A phage antibody produced by fusing with a structural protein of a bacterial phage; a group formed by combining the above-mentioned variable hearing-range gene fragment with another applicable gene fragment, such as a part of the myc gene. Examples include a recombinant antibody produced by a cell transformed with the recombinant antibody gene.
  • Probes produced by artificially introducing a variable region into a trypsin molecule probes obtained by artificially modifying a molecule that specifically binds to a protein such as Receptor Yuichi, etc. Any molecule exhibiting high specificity and affinity for the core antigen, such as a probe produced by the combinatorial chemistry method, can be used.
  • the above monoclonal antibodies can be easily prepared by those skilled in the art.
  • the production of monoclonal antibodies by hybridomas is well known.
  • the fusion polypeptide or polypeptide (hereinafter referred to as “the present antigen”) alone or in combination with BSA, KLH or the like is intraperitoneally or intradermally in a BALBZc mouse or the like.
  • Regular immunization is performed by mixing with an adjuvant such as simple or Freund's complete adjuvant as an antigen.
  • an adjuvant such as simple or Freund's complete adjuvant as an antigen.
  • this antigen is administered to the tail vein as a booster, the spleen is removed aseptically, and the cell is fused with an appropriate mouse myeloma cell line. Get Puri Dorma.
  • This method can be performed according to the method of Kohler and Milstein (Nature 256: 495-497, 1975).
  • the hybridoma cell line obtained by the above method is cultured in an appropriate culture medium, and then a hybridoma cell line that produces an antibody showing a specific reaction to the antigen is selected and cloned. I do.
  • Cloning of antibody-producing hybridomas can be carried out by limiting a dilution method or by a soft agar method (Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976). Then, the produced monoclonal antibody is purified by a method such as column chromatography using protein A or the like.
  • Molecules to be used as probes other than the above-mentioned monoclonal antibodies can be prepared.
  • recombinant antibodies are described in detail in a review by Hoogenboon (Trends in Biotechnology, 15:
  • the antigen as a probe for the HCV core antibody in the sample or the antigen for producing the HCV core antibody is specifically, for example, an amino acid represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • a polypeptide having a sequence or a fusion polypeptide containing a plurality of amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 3 to 6, which can be obtained by recombinant expression of DNA encoding these. Can be.
  • the detection principle may be an enzyme-labeled antibody method, a fluorescent labeling method, a radioisotope labeling method, or any other method used in ordinary immunoassays. Examples include colorimetry, fluorescence, and chemiluminescence.
  • a method generally used for antibody detection such as a two-antigen sandwich method, may be used, and for antigen detection, a one-step sandwich method may also be used. It is also possible to use a method such as a system.
  • One embodiment of the present invention is the following reaction system.
  • a probe against the HCV core antigen for example, an antibody against the HCV core antigen
  • a compound containing the HCV epitope for example, an HCV polyantigen.
  • Peptides including peptide peptides, peptide compounds or polypeptides, and mixtures thereof, can be added to carriers used in immunoassays, such as microplates. Immobilize. A component that exposes the solid-phased carrier so that the probe can recognize the HCV core antigen from the HCV particles or particle complex, and does not inhibit the function of the antibody against the HCV epitope.
  • the reaction with the sample is carried out in a reaction buffer containing, and the core antigen and the antibody against the HCV epitope contained in the sample are specifically bound to the carrier.
  • unbound components in the sample are removed, for example, by washing the carrier with an appropriate buffer, and then labeled with a probe that recognizes the core antigen bound to the carrier, such as an enzyme for the core antigen.
  • a probe that recognizes the core antigen bound to the carrier such as an enzyme for the core antigen.
  • the labeled antibody By reacting the labeled antibody with a probe that recognizes the antibody to HCV epitope bound to the carrier, for example, a reaction solution containing an anti-human antibody mouse monoclonal antibody labeled with an enzyme or the like. Specifically, the antibody binds specifically to the core antigen bound to the carrier and an antibody against the HCV epitope.
  • the core antigen and HCV peptide contained in the sample are removed by removing the unreacted components, for example, by washing the carrier with an appropriate buffer and detecting the label by an appropriate method. It is possible to detect an antibody against one step.
  • the reaction system suitable for antigen detection in the system provided by the present invention refers to a complex structure present in a sample under mild conditions that does not impair the function of an antibody against HCV antigen epitope. From the body HCV particles, an antibody that is a probe that recognizes the HCV antigen is identified. It is a system consisting of conditions that sufficiently expose the region to be perceived.
  • Virus particles already separated by ultracentrifugation (Takahashi et al., 1996, J. Gen. virol, 73: 667-672), and HCV particles aggregated and precipitated with polyethylene glycol
  • a non-ionic surfactant such as Tween 800 or Triton X 100 (Kashiwakuma et al., 1996, J. Immunological methods 190: 79-89)
  • the core antigen was The former, which has been shown to be detectable, has insufficient detection sensitivity, and it is questionable whether the antigen is sufficiently exposed. In the latter, the antibody is inactivated by adding another treating agent, and the effect of the surfactant itself is not mentioned.
  • the conditions are examined on the basis of a surfactant, and the reaction solution is made to have a composition centered on the surfactant. It is now possible to efficiently detect antigens in HCV particles simply by diluting the sample in the reaction solution without applying a pretreatment method consisting of operations such as operation and heating. .
  • surfactants in this case include surfactants having an alkyl group and secondary to quaternary amines in the same molecule, or nonionic surfactants.
  • the alkyl group is preferably a straight-chain alkyl group, and preferably has 10 or more carbon atoms. More preferably, the 12- to 16-members are preferably the third or fourth members (ammonium).
  • Specific surfactants include dodecyl-N-sarcosine Acid, perdodecyl triammonium ammonium salt, cetyl trimethylammonium salt, 3 — (dodecyldimethylammonio) — 1 1-prosulfuronic acid, 3 — (tetradecyldimethylammonio) — 1 — punculsulfonic acid , Dodecyl bilidium salt, cetyl pyrimidium salt, decanoyl- ⁇ -methylglucamide (MEGA-10), dodecyl-1-N-betaine and the like. Dodecyl-N-sarcosinate and dodecyl trimethylampinium salt are preferred.
  • nonionic surfactant those having a hydrophilic-hydrophobic ratio of 124 are preferable, and polyoxyethyleneisooctylphenyl ethers such as Triton X100 Triton X11 4, or polyoxyethylene noniphenyl ethers such as Nonidetp 40, Triton NlOl. Nikko 1 NP are preferred.
  • the above two types of surfactants may be used alone, but they are preferably used in combination, and a synergistic effect can be obtained by using them in combination.
  • an antigen containing an HCV epitope, a carrier on which an antibody for detecting the HCV antigen is immobilized, and a reaction solution provided by the present invention are used so as to detect an antibody against the HCV epitope.
  • the antigen is efficiently detected in the sample containing HCV antigen without HCV antibody, and the antibody is efficiently detected in the sample containing only antibody without HCV antigen.
  • Antibody was detected, and it was found that in a sample in which an antigen and an antibody were present, a high signal was given by simultaneously detecting the antigen and the antibody.
  • a method for simultaneous detection of the virus antigen and an antibody against the virus antigen involves detecting p24, which is a gag protein, as an antigen test, and using an enve1 op protein and a part of the gag protein as an antibody test. This is achieved by combining methods for detecting an antibody against a certain p19.
  • the virus antigen and the antibody against the virus antigen are simultaneously detected.
  • Establishing a detection method is relatively easy. This is because, for example, in the case of an HIV test, a probe used for detecting an antigen, for example, an antigen p24 recognized by a monoclonal antibody against an HIV epitope, and an antibody contained in a subject sample in an antibody test.
  • the monoclonal antibody against the core antigen used for antigen detection binds to the core antigen used for antibody detection, is absorbed, and the detection sensitivity of the antigen in the sample is increased.
  • problems such as a decrease, binding to an antigen used for antibody detection, inducing a nonspecific reaction in an antigen test, and a decrease in sensitivity due to masking of an HCV epitope for an antibody test.
  • the inventors of the present invention divide the epitope of a monoclonal antibody used for antigen detection and the epitope of an antibody against a core antigen present in a subject into different types. As a result, they have found that an antigen and an antibody can be efficiently detected simultaneously, and have completed the present invention.
  • the results of various epitope analysis showed that the most important region was the N-terminus of the core antigen, especially from the first place of HCV polypeptide. It has been shown to be at position 0 (Okamoto et al, Hapatology 15: 180-186, 1992, Sallbe rg et al, J. Clinical. Microbiol., 30: 1989-1994, 1992, Sallsbe rg et al. , J Med. Vilol, 43: 62-68, 1994).
  • genotype-specific peptides are located at positions 66 to 80 of the HCV polypeptide (Machida Hepatology 16: 886-891 '92, Japanese Patent Application No. 9-200). 9 2 2). Therefore, it is important to have the sequence from position 1 to position 40 and from position 66 to position 80 of the HCV polypeptide as an antigen for detecting an antibody against the HCV polypeptide. It is. Therefore, as an antigen for detecting an HCV antibody, an antigen including a sequence from position 1 to position 42 and a sequence from position 66 to position 80 of HCV polypeptide CEPM is an antigen polypeptide having a suitable sequence. It is disclosed in the examples as peptides.
  • CEPM is an antigen consisting of a human sequence in which the following regions of the HCV polypeptide are arranged in the following order, and the construction method thereof is described in Japanese Patent Application No. 9-2095252. The sequence is set forth in SEQ ID NO: 10. List of CEPM HCV topologies:
  • a monoclonal antibody that recognizes and binds to a region where the antibody against the core antigen is not specifically present in the subject, that is, from position 100 to position 130 of the HCV polypeptide is first used.
  • the recognition site of the secondary antibody for detecting the core antigen bound to the primary antibody is a region not used for the antibody test, from position 40 to position 5 of the HCV polypeptide.
  • core antigens retained by antibodies to positions 100 to 130 of the HCV polypeptide are detected.
  • An expression plasmid corresponding to the core region of HCV was constructed by the following method.
  • a plasmid p UC obtained by incorporating C ll — C 21 clone and CIO — E 12 clone (Japanese Patent Laid-Open No. 6-388765) into p UC 119.
  • the 0RI-C1aI fragment and the approximately 920 bp C1aI-KpnI fragment were purified.
  • the two DNA fragments and pUCl19 were digested with EcoRI and KpnI in a 10X ligase buffer [660 mM Tr
  • PCR was performed using a GeneAmpTM (DNA Amplification Reagent Kit, manufactured by Perkin Elmer Cetus) DNA denaturation 95 ° C 1.5 minutes, annealing 50 ° C 2 minutes, DNA synthesis 70 ° C 3 minutes Under the conditions, the obtained DNA fragment was digested by 0.8% agarose gel electrophoresis, and purified by a glass powder method (Gene Clean).
  • GeneAmpTM DNA Amplification Reagent Kit, manufactured by Perkin Elmer Cetus
  • pUC19 was digested with the restriction enzyme SmaI, and the DNA fragment obtained by the PCR method was digested with a 10X ligase buffer [660 mM Tris-HC1 (pH 7. 5), 6 6 mM M g C 1 2, 1 0 0 mM Jichio Threshold Level preparative Ichiru, I mM ATP] 5 ii, of T 4 rigger Ichize 1 1 (3 5 0 units Z mu 1) in water
  • the temperature was adjusted to 50/1, and the temperature was maintained at 16 ° C overnight, and the coupling reaction was performed.
  • Escherichia coli JM109 was transformed using this plasmid to obtain a plasmid pUC19-C21-E12 ⁇ SmaI.
  • Ec0RI-BamHI-treated vector DNA (1 g) and the above-mentioned core 140 fragment were combined with a 10X ligase buffer [660 mM Tris-HC1 (pH 7.0. 5), 6 6 mM M g C 1 2, 1 0 0 mM Jichiosu Les preparative Lumpur, 1 mM ATP) 5 1, T 4 rigger Ichize (3 5 0 units Z l) was added with water 5 0 The mixture was incubated at 16 ° C. overnight, and ligation was performed. Using 101 of this reaction mixture, Escherichia coli HB101 was transformed. Sensitive E.
  • coli strains used for transformation are prepared by the calcium chloride method [Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159-162 (1970)].
  • the transformed E. coli was spread on an L-plate (1% tripton, 0.5% NaCl, 1.5% agar) containing 25 g Zml of ampicillin. Incubated at 37 ° C overnight.
  • One platinum loop of the bacterial colonies formed on the plate was taken, transferred to an LB medium containing 25 g Zml of ampicillin, and cultured at 37 ° C overnight.
  • 0 1 strain was inoculated into 3 ml of 2YT medium (1.6% tripton, 1% yeast extract, 0.5% NaC1) containing 50 / ig Zml of ampicillin. Incubate at 37 ° C for 9 hours.
  • This culture solution 1 ml 5 0 g / ml of ⁇ Npishi 1 including re down 0 O ml of M 9 - CA medium (0. 6% N a 2 HP_ ⁇ 4, 0. 5% KH 2 PO 4, 0 .5% NaCl, 0.1%
  • the cells were suspended in 2 O ml of buffer A (5 OmM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 30 mM NaC1), and centrifuged again. 2.6 g of the expressed cells were obtained. The obtained cells were suspended in 10 ml of buffer A, and the E. coli membrane was disrupted by sonication, followed by centrifugation. The fusion polypeptide of the polypeptide encoded by HCV cDNA and TrpE was synthesized. Was obtained. To the fraction was added 10 ml of buffer A containing 6 M urea to solubilize and extract the fusion polypeptide. The solubilized extract was subjected to ion-exchange column chromatography using S-Sephar0se to purify the fusion polypeptide.
  • buffer A 5 OmM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 30 mM NaC1
  • TrpC11 fusion polypeptide
  • the solution was terminated in 10 mM phosphate buffer (H7.3) containing 0.15 MNaCl. It was diluted to a concentration of 1.0 mgZml and mixed with an equal amount of evening Max to make a TrpC11 suspension.
  • the suspension prepared so that the T rp C 11 concentration is from 0.01 to 0.05 mgZml. was administered intraperitoneally to BALBZ c mice 4-6 weeks old. About 8 weeks later, the immunized animal was administered a saline solution prepared so that the TrpC11 concentration was 0.05 to 0.03 mgZml via the tail vein.
  • the spleen was aseptically removed from the immunized animal, sectioned with scissors, dissociated into individual cells using a mesh, and RPMI-1 Washing was performed three times with 64 medium. 8—Cultured in the presence of azaguadin for several days, and the mouse myeloma cell line PAI in the logarithmic growth phase from which the revertants were completely removed was washed in the same manner as described above. Seven and 1.0 ⁇ 10 8 spleen cells were placed in a 50 ml centrifuge tube and mixed.
  • the fused cells are treated with hypoxanthine, aminopterin and thymidine (hereinafter abbreviated as HAT) using 96-well plate.
  • HAT hypoxanthine, aminopterin and thymidine
  • the hybridomas were grown by culturing for 1-2 weeks in RPMI_164 medium containing Thereafter, the cells are grown in a medium containing no HAT, and after about two weeks, clones producing the desired antibody are searched by ELISA to produce the monoclonal antibody of the present invention having the desired reaction specificity. I got High Puri Doma.
  • the obtained hybridomas were searched for the target antibody-producing strain and subjected to single cloning in accordance with a standard limiting dilution method, and the obtained hybridomas were used as HC11--14. , HC11-1-10, HC11-3, and HC11-7.
  • the hybridoma obtained by the method described in Example 2 was transplanted into the abdominal cavity of a mouse treated with pristane or the like to obtain a monoclonal antibody produced in ascites.
  • an IgG fraction was separated using a Sepharose column to which protein A was bound.
  • Monoclonal antibodies produced from the above five hybridomas, C11-1-14, C11-1-10, C11-7 and C11-3 isotypes C11-11 and C11-7 were obtained by double immunodiffusion method using Egret anti-mouse Ig isotype antibodies (Zymed), and IgG2a, C11-1 14 and C 1 1 — 3 were found to be IgG 1.
  • Table 1 shows the results of an analysis of the four types of monoclonal antibodies obtained using 20 peptides synthesized from sequences derived from the HCV and core regions. As can be seen, it is a monoclonal antibody that specifically recognizes a part of the core region.
  • Example 4 Method for detecting antigen efficiently without pretreatment
  • a sample containing HCV particles is diluted in a reaction solution containing a surfactant.
  • the detection efficiency of the HCV core antigen was examined.
  • the detection of the HCV core antigen was performed by a sandwich enzyme immunoassay (EIA) using a monoclonal antibody against the HCV core antigen.
  • EIA sandwich enzyme immunoassay
  • C 11-3 and CI 1-7 were used as antibodies to supplement the core antigen, and CI 11-10 and C 11-14 were supplemented. It was used as an antibody to detect the extracted core antigen.
  • EIA was performed basically under the following conditions.
  • a solution prepared by diluting each of the monoclonal antibodies C11-3 and C11-17 to 4 g Zml in an acetate buffer was added to a microtiter plate, and incubated at 4 ° C overnight.
  • the cells were washed with a phosphate buffer and subjected to a blocking operation by adding a phosphate buffer containing 1% BSA.
  • the reaction solution 1001 and the sample 100 ⁇ 1 were added thereto, and the mixture was stirred and reacted at room temperature for 1.5 hours. After removing unreacted substances by washing with a phosphate buffer containing a low-concentration surfactant, the monoclonal antibody C111 labeled with alkaline phosphatase was used.
  • n-octyltrimethylammonium chloride 0.5 1.00 0.75 0.99
  • Nonionic MEGA- 10 0.5 3.38
  • Example 5 Detection of core antigen in a sample before HCV antibody emergence (wind period) after HCV infection
  • the sales outlet conversion panel PHV 905 (B.B.I. inc.) was mixed with 2% Triton X 100 and 2% dodecyl N-sarcosinate in the reaction mixture. The measurement was carried out according to Example 4 by adding sodium.
  • the PHV 905 panel used here showed positive conversion by anti-HCV antibody test (ortho EI A. 3.0) on day 21 (sera No. PHV 905-7) after the start of observation.
  • the antibody titer is expressed by a cut-off index (SZCO), and a value of 1.0 or more is determined to be positive.
  • the HCV core antigen activity was expressed as a ratio (SZN) to the light emission amount of healthy human serum as 1.0.
  • the core antigenic activity was observed before the anti-HCV antibody was still positive, and the addition of this surfactant exposed the core antigenicity from the virus particles and immobilized it. Reacted with monoclonal antibodies It was confirmed that detection was possible.
  • Example 6 Detection of HCV antibody contained in a sample and simultaneous detection with core antigen
  • Antibodies against HCV epitope were inactivated in the primary reaction solution containing surfactant using a sample (human serum) containing antibodies to HCV epitope and containing almost no HCV antigen. Without binding to the HCV polypeptide, and can be detected by adding an anti-human antibody to the secondary reaction solution.In addition, if a core antigen is present, the core antigen is detected. The following method was used to confirm that the antibody was detectable when an antibody against HCV epitope was included, and that the antibody was detectable when both were included.
  • EIA was basically performed under the following conditions. Dilute the recombinant antigen containing the HCV epitope, CEPM, in phosphate buffer containing urea, add it to a microtiter plate, and incubate at 4 ° C overnight. Wash with phosphate buffer Then, the monoclonal antibody C11-3, C11-7 is added to the plate with acetic acid ⁇
  • the solution diluted in the buffer was added, and the mixture was kept at 4 ° C overnight.
  • the method for preparing the recombinant antigen CEPM is described in Japanese Patent Application No. 9-209525. After removing the antibody solution, the cells were washed with a phosphate buffer and subjected to a blocking operation by adding a phosphate buffer containing 1% BSA.
  • HCV antibody-positive human serum which has been confirmed to contain almost no HCV core antigen, was diluted with sera and used as a sample to confirm that antibodies to HCV epitope were detected. As a result, it was confirmed that the antibody reacted in a concentration-dependent manner, and that the antibody was detected without being inactivated in the primary reaction solution.
  • Example 7 Method for measuring antigen and antibody in human serum Using a healthy human sample, a patient sample, and a seroconversion panel sample (BBI inc.), The antigen and antibody were simultaneously measured according to the method described in Example 6. For panel sera, comparisons were made with the results of determination using HCV antibody detection reagents provided by the vendor.
  • BBI inc. seroconversion panel sample
  • Table 6 shows the results of measurement using 18 samples from healthy subjects, and it was confirmed that there was no reaction to healthy subjects. Based on the distribution of healthy subjects, the discriminating value between positive and negative was set to 0.1.
  • Example 9 Monoclonal antibody titer assay
  • the recombinant core antigen (Trpc11) was diluted to a final concentration of 2 g Zml in 10 mM phosphate buffer (pH 7.3) containing 6 M urea, and each well of the microplate was diluted. Was added at a time. After allowing to stand at 4 ° C for a while, aspirated and washed twice with 10 mM phosphate buffer (pH 7.3). 350 mM phosphate buffer (pH 7.3) containing 0.5% casein was added in 3501 portions, and the mixture was incubated at room temperature for 1 hour, and then aspirated.
  • Each monoclonal antibody (C11-13, C11-7, C11-10, C11-14 or C11-14) serially diluted with the reaction solution is added to each well, and reacted for 1 hour.
  • a peroxidase-labeled anti-mouse antibody was added and reacted for 30 minutes.
  • a substrate solution containing ortho-phenylenediamine and hydrogen peroxide was added to carry out an enzyme reaction. After reacting at room temperature for 30 minutes, the enzyme reaction was stopped by adding 2 N sulfuric acid, and the absorbance at 492 nm was measured with a microplate reader.
  • Figure 1 shows the results.
  • C11-15 has the highest antibody titer, indicating that it can be detected with high sensitivity when used as a secondary antibody.
  • Monoclonal antibodies (C11-3 and C11-5 and C11-15; C11-3 and C11-17; C11-3 and C11-15; C11-3 alone; Dilute C11-17 alone; or C11-15 alone) in 10 mM phosphate buffer (pH 7.3) to a final concentration of 6 ⁇ l, and add to each well of the microplate. One hundred and one were added. After allowing to stand at 4 ° C, the mixture was aspirated and washed twice with 10 mM phosphate buffer (PH 7.3). 10 mM phosphate buffer (pH 7.3) containing 0.5% casein was added at 350/1 each, and the mixture was incubated at room temperature for 2 hours and aspirated.
  • HCV RNA positive Then, CV antibody-negative sample 1001 and reaction solution 1001 were added to each well, and reacted at room temperature for 1 hour. After washing, a peroxidase-labeled anti-core antigen monoclonal antibody (mixture of C11-14 and c11-10) is added and reacted for 30 minutes. After washing, orthopentadiamine and hydrogen peroxide are added. Is added and the enzyme reaction is performed. After reacting at room temperature for 30 minutes, 2N sulfuric acid was added to stop the enzyme reaction, and the absorbance at 492 nm was measured with a microplate reader. Figure 2 shows the results.
  • the E. coli transformant CEP MZH B101 strain was cultured at 37 ° C overnight in an LB medium containing 10 O ⁇ g Zml ampicillin. This was inoculated into M9-CA containing 100 ⁇ g Z ml ampicillin at 1% concentration, 37. C The cells were cultured overnight. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, and resuspended in 5 O ml Lysis solution [50 mM Tris-HC1 (pH 8.5), 30 mM NaC1, 5 mM EDTA]. 1 ml of lysozyme solution (10 mgZ ml Lysozyme) was added, and the mixture was treated at 37 ° C for 1 hour.
  • the suspension was subjected to sonication (150 W, twice for 90 seconds) to destroy the cells.
  • Insoluble fraction was collected by centrifugation at 1500 rpm at 4 ° C for 30 minutes.
  • the insoluble fraction was resuspended in 5 O ml of an A solution (50 mM Tris-HC1 (pH 8.5)) containing 1% of NP40 and homogenized (5 tubes at 150 O rpm). Rourke)
  • the suspension was centrifuged at 1500 rpm at 4 ° C for 30 minutes to collect the insoluble fraction.
  • the insoluble fraction was resuspended in 50 ml of A solution containing 2 M urea and homogenized (5 strokes at 150 O rpm). Suspension at 1500 O rpm so,?
  • the mixture was centrifuged at 4 ° C for 30 minutes to collect an insoluble fraction.
  • the insoluble fraction was resuspended in 50 ml of A solution containing 6 M urea and homogenized (5 strokes at 1500 rpm).
  • the suspension was centrifuged at 1500 rpm at 4 ° C. for 30 minutes to collect the soluble fraction.
  • nucleotide sequence of the DNA encoding the chimeric antigen is shown in SEQ ID NO: 10 and the amino acid sequence of the chimeric antigen is shown in SEQ ID NO: 11 Deposited under Rule 13bis of the Patent Cooperation Treaty References to deposited microorganisms and depository institutions

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Description

明 細 書
C型肝炎ウイ ルスの測定方法 発明の分野
本発明は、 C型肝炎ウィルス （H C V ) の検出方法に関し、 さ ら に詳し く は、 H C Vコア抗原を測定するか、 又は H C Vコア抗原と H C Vコア抗体を同時に測定するための方法に関する。 この方法は 多数の血液試料等のスク リ ーニングのために特に有効である。 背景技術
H C V ( C型肝炎ウィ ルス） の感染によって引き起こされる肝炎 は、 高い頻度で慢性化し、 感染期間が長期化するにつれ、 肝硬変、 肝ガンと しばしば移行する。 しかしながら H C Vの感染は、 主に血 液および血液由来成分によってもたらせることから、 感染源を特定 し、 排除する ことにより感染経路を遮断することが可能である。 現 在感染源を特定する方法と しては、 主に H C Vポリペプチ ドに対す る抗体を検出する方法が採られているが、 より高い精度で感染源を 特定できる方法が求められていた。
求められる背景と しては、 H C V感染後、 抗原は存在するが抗体 が産生されない、 いわゆるウィ ン ドピリ オ ド （Window period ) と 呼ばれる時期が存在する こ とにある。 この期間にある血清は、 抗体 検査により感染の有無を判別することができない。 抗体検査ではゥ イ ン ドピリオ ド期にある検体を排除できないため、 抗体検査により スク リ 一ニングを行っている輸血や血液成分、 血液製剤などの血液 由来物質を利用する場合は、 ウイ ン ドピリオ ドにある検体による二 次感染の危険性が存在している。 そのため H C Vポリペプチ ドに対 る抗体ではな く 、 H C Vそのもの、 つま り H C Vパーティ クルを 検出する必要があつた。
H C Vそのものを検出、 測定することは、 H C Vパーティ クルを 構成している抗原または遺伝子 （ R N A ) を検出する ことにより可 能となる。 こ こで H C Vパーティ クルを構成している抗原は、 コア 抗原、 ェンベロ一プ抗原 （ E 1， E 2 ) である と考えられている。
このうちエンベロープ抗原は、 超可変領域 （Hyper Variable Reg ion ) に代表されるように、 抗原性の高い領域で変異が多い。 また 遺伝子型間での違いも報告されている。 これらの変異、 違いを全て 検出するためには、 複数の領域に特異的に結合するプロ一ブを用い る必要がある。
なおこ こでプローブとは、 抗原に特異的に結合する分子、 たとえ ばレセプター、 抗体、 組換え抗体、 機能性分子、 または機能性構造 物の様に、 抗原分子を認識し結合する ものをいう。
一方コァ抗原はァ ミ ノ酸配列レベルで配列が保存されており、 領 域を選択する ことにより、 複数種類の遺伝子型が報告されている H C Vのいずれの遺伝子型の抗原も検出できるプローブを得る こ とが 出来るため、 遺伝子型に依存しない検出方法を構築する ことが可能 と る。
しかしながら抗原を検出する系を構築するためには留意しなけれ ばならない点がある。 すなわち、 被験者である検体中には抗体が存 在する可能性が高く 、 これらの抗体が、 抗原を検出するためのプロ —ブと結合部位を競合し、 プローブの結合を阻害することにより抗 原の検出感度を下げる。 そのため抗原を効率良く検出するためには 、 抗体の結合しない領域も し く は抗体の結合によりプローブの結合 が千渉されない領域を認識するプロ一ブを用いる方法が考えられる 。 しかしながら、 H C Vコア抗原のように複数の抗体結合部位が報 告^れている分子において、 前述の条件をみたすプロ—ブを作成す る ことは困難である。
そのため抗原分子を検出するためには、 プローブの結合を阻害す る抗体を除く必要がある。 除く方法と しては、 物理的な原理に従つ て除く方法、 例えば分子量の違いを利用して、 H C Vパーティ クル と抗体とを分離分別する方法がある。 この例と して、 ゲル濾過、 超 遠心分離法、 密度勾配遠心分離法、 限外濾過膜等の膜を利用した分 子量分画法がある。 しかし しばしば抗体は、 他の生体高分子と複合 体を形成し高分子量に変化するため、 物理的な原則にしたがった方 法では、 H C Vパーティ クルとの分別が困難になる。 またこれらの 方法は、 処理行程に特殊な機器を用いる こ となどから、 血液のスク リ 一ニングなどのマススク リ 一ニングに適用するこ とは困難である 一方生化学的な原理に基づいた方法、 例えば P E G (ポリ エチレ ングリ コール） などの水環境を変化させる こ とにより、 H C Vパ一 ティ クルと他の血清成分との化学的性質の違い、 例えば水に対する 溶解性の違いを利用して H C Vパーティ クルを優先的に沈澱させる こ とにより分別する方法もあるが、 抗体または抗体複合体はしばし ばパーティ クルと同様の分画に沈澱し、 分画するこ と自体が困難と なる。 また H C Vパーティ クルは、 しばしば H C Vパーティ クルを 構成している抗原とそれを認識する抗体との免疫複合体を形成して おり、 免疫複合体から抗体または抗原のみを分離するこ とは困難で ある。
そのためプローブの機能を阻害する物質 （抗体など） を機能的に 破壊するこ とによ り除く方法がと られる。 抗体の機能を失わせる方 法と しては、 夕 ンパク質を変性させる条件に露呈させることにより 抗体夕 ンパク質を変性させる方法が考えられるが、 ここで重要なこ と ^抗体の機能は失わせるが、 目的とする抗原の機能、 つま りプロ —ブと結合する機能、 すなわちプローブが抗体の場合にはェピ ト一 プを消失させない、 またはェピ トープを再提示させる条件である。
H C Vの感染の有無を判別する方法に求められる機能は、 その目 的によ り異なる。
抗体検査は検体中に H C Vに対する抗体が存在するか否かを判別 する方法であるが、 検体中に H C Vに対する抗体が存在した場合、 その検体の供与者が現在 H C Vに感染しており検体中に H C Vが存 在している場合もあれば、 すでに治療または自然治癒により H C V が体内から排除されている場合もあり、 抗体の有無により これらを 区別する ことは困難である。
抗原検査は、 H C Vが検体中に存在しているか否か、 または存在 している場合にはその量の多寡を-知らせる こ とが重要な機能であり 、 その際に抗体が存在しているか否かは問題とならない。
治療の際には、 肝炎が H C Vを主たる原因とするか否かを決定す るために、 H C Vの抗体検査が重要な情報を与えるが、 最終的には H C Vの抗原の有無が確定診断には求められる。 また治療効果判定 には、 H C Vが体内から排除されているか否かを判定する こ とが重 要であり、 判定には抗原の量の多寡を知る ことが重要である。 すな わち抗体の有無に関係な く 抗原の有無、 その量を知る こ とが治療に 重要である。 すなわち治療においては、 抗原の有無とその量を与え る検査方法がもつ と も重要な方法である。
一方血液および血液由来製剤においては、 二次感染の抑止がもつ と も重要であり、 そのためには H C Vの感染源と しての危険性の有 無を判別する こ とが検査方法に求められる。 現在この分野では主た る検査方法と して抗体検査が用いられている。
しかしながら前述のように、 H C V感染後のウイ ン ドピリ オ ドに る血清は、 抗体検査により感染の有無を判別する こ とができない 。 故に、 抗体検査により スク リ 一ニングを行つている輸血や血液成 分、 血液製剤などの血液由来物質を利用する場合は、 ウ ィ ン ドピリ ォ ドにある検体による二次感染の危険性が存在する。
危険性をより軽減させるためには抗原検査の併用が求められるが 、 献血などの血液検査のようなマススク リ 一ニングでは未だ抗原検 査は行われていない。
理論的には 1 0 0 %の精度 （感度、 特異度） で抗原の有無を判定 できる検査方法が存在すれば、 それを唯一の検査方法とすれば良い 力 いかなる検出方法でも検出感度が存在し、 検出感度以下のもの は測定できない。 故に 1 0 0 %の精度で判別できる検査方法は存在 しない。 また特殊な例においては抗原検査のみでは感染源を逃す可 能性が存在し、 そのためこの分野においては抗体と抗原の両者を測 定する こ とが、 二次感染の危険性を軽減させるために必要である。 マススク リ ーニングに適用でき、 高い感度、 特異性を示す抗原検出 方法が用いられるようになった場合、 抗原と抗体の両方を測定する こ とが求められるようになり、 同一検体数での検査数が現在より も 增加し、 コ ス ト ア ッ プ要因となる。
このよ うなこ とから、 抗原と抗体を同一方法で測定する ことが可 能となれば、 当該分野においては検査数の軽減をはかる ことが出来 、 多大な効果を与えるこ とが分かる。
すでに記したように抗体を検出する方法、 抗原を検出する方法は 開発されているが、 前述のごと く 抗体を検出する条件では、 抗原を 検出しょ う とすると、 抗原を検出するプローブの結合を阻害する抗 体が存在する こ とによ り抗原を効率良く検出できない。 一方抗原を 検出する条件でも、 前述のごと く 、 抗原の検出を競合阻害する抗体 を除く方法がと られるこ とから、 抗体を検出できない。 それゆえす でに報告されている方法では抗原と抗体を同一方法で検出する こと はできない。 発明の開示
血液および血液由来の物質を利用する際の、 二次感染軽減の目的 においては、 感染者、 感染既往者を区別する必要はなく 、 抗体また は抗原が存在するか否かを判別できればよい。 すなわち本発明は、 ウイ ン ドピリ オ ド期のように抗体の存在しない時期の検体では抗原 を検出し、 抗体の存在する時期の検体では抗原を、 又は抗原と抗体 を検出する方法を提供することにより、 血液および血液由来物質の 検査に求められる新しい検査方法を提供する。
上記の課題を解決するため、 本発明は、 C型肝炎ウィルス （H C V ) の測定方法において、 アルキル基と第 2〜第 4級ァ ミ ンとを有 する界面活性剤も し く は非ィォン界面活性剤、 又はこの両者の存在 下で、 H C Vコア抗原をそのプロ一ブとの結合により測定すること を特徴とする方法を提供する。
本発明はさ らに、 上記の方法による H C Vコア抗原の測定と共に 、 H C Vコア抗体を、 そのプローブとの結合により測定する ことを 特徴とする方法を提供する。 図面の簡単な説明
図 1 は、 モノ ク ローナル抗体 C 11一 15の抗体価を、 他のモノ ク ロ ーナル抗体 C 11— 3， C 11 - 7 , C 11— 10及び C 11— 14の抗体価と 比較して示すグラフである。
図 2 は、 本発明の種々のモノ ク ローナル抗体を単独で、 又は混合 して一次抗体と して固相に固定して使用し、 H C V— R N A陽性検 体を測定した場合の E L I S Aの結果を示すダラ フである。 発朋の実施の形態
本発明の提供する H C V感染検出方法は、 ウィ ン ドピリオ ド期の ように抗体の存在しない時期の検体では抗原を検出し、 抗体の存在 する時期は抗原を、 又は抗原と抗体の両者を検出する方法である。 すなわち抗体の存在しない時期、 ウイ ン ドピリ オ ド期においては抗 体が存在しないため、 抗原を検出する際に抗体を除く必要はないこ とになる。 故に抗原を検出するために必要な前処理を行う必要はな く なる。
しかしながら、 H C Vパーティ クルに含まれる抗原を検出するた めには、 検出のために用いるプロ一ブの認識部位を露呈させる こ と が重要である。 H C Vウィルスパーティ クルは、 ゲノムである核酸 と コア抗原が複合体を形成して粒子を形成し、 その粒子を脂質膜と エンベロープ夕 ンパク質からなる外膜が覆つた構造をしている と考 えられている。 さ らに血液中では低密度リ ポプロテイ ン （ L D L ) や H C Vに対する抗体などとの複合体を形成して存在している と考 えられている。 そのため、 血液中に存在するウィルスパーティ クル のままでは、 プローブはコア抗原を認識し結合する こ とが出来ない 。 故にコア抗原を検出するためには、 コア抗原を取り囲むこれらの 構造物を除去するなどの処理をして、 コア抗原がプロ一ブに認識さ れるようにする必要がある。
すなわち本発明においては、 検体中に含まれる H C Vパーティ ク ル中のコア抗原を、 コア抗原を認識するためのプロ一ブが認識でき るように露呈させる反応条件、 反応させる系からなる反応方法、 お よび反応させる系を含む試薬をも提供する。
一方抗体が十分に存在している時期においては、 前述のごと く 、 検体中にはプローブの結合部位と競合するコア抗原に対する抗体が 存在している場合があるが、 その場合にはコア抗原の検出感度が低 下 る可能性がある。 またコア抗原をプローブと結合できるように 露呈させた場合には、 プローブと競合するコア抗原に対する抗体が 含まれた場合、 抗体は露呈されたコア抗原に吸収され、 抗体を免疫 複合体を検出する方法によって検出するための抗原に結合するコア 抗原に対する抗体の量が減少し、 検出感度が低下する可能性がある そのため抗体の検出に用いる抗原は、 コア抗原のェピ 卜一プのみ からなる ものでもよいが、 好ま し く はコァ抗原以外の H C Vェピ ト —プを含むぺプチ ドまたはポリぺプチ ドである。 また H C Vェピ ト ープを模倣する、 H C Vェピ トープを含むペプチ ドまたはポリぺプ チ ド以外のぺプチ ドまたはポリ ペプチ ド、 または化合物であっても よい。
ただしコア抗原を検出するためのプローブと、 H C Vェピ ト一プ または H C Vェピ ト一プを代替する化合物とは、 互いに認識しあう こ とにより結合する ものでないことが好ま しい。
H C Vコア抗原のためのプローブと しての抗体又は H C Vコア抗 原を検出するための標識される抗体は、 マウス、 ゥサギ、 ニヮ ト リ 、 ャギ、 ヒッジ、 ゥシなどの実験動物を免疫して得られるポリ ク ロ —ナル抗体 ； 免疫した個体から、 脾臓細胞を分離し、 ミ エ口一マ細 胞と融合させるこ とによつて得られるハイ ブリ ドーマの産生するモ ノ ク ロ一ナル抗体 ； または脾臓細胞、 血中白血球を E Bウィルスに よって不死化させた細胞の産生するモノ ク 口一ナル抗体 ； H C Vに 感染している ヒ ト も し く はチンパンジーなどが産生しているモノ ク 口一ナル抗体 ；
マウス、 ヒ トなどのィムノ グロプリ ンの c D N Aも し く は染色体 D N Aから得られる可変領域遺伝子断片、 またはィムノ グロブリ ン の c D N Aも し く は染色体 D N Aの一部と人工的に作製した配列と を組み合わせる こ とによ って構成される可変領域遺伝子断片、 人工 的な遺伝子配列を用いて構成される可変領域遺伝子断片またはこれ らを材料に遺伝子組換え手法によつて作製される可変領域遺伝子断 片を、 ィ ム ノ グロブリ ン定常領域遺伝子断片を組み合わせるこ とに よつて構成される組換え抗体遺伝子によつて形質転換された細胞が 産生する組換え抗体 ； 上記の可変領域遺伝子断片と例えばバクテリ オフ ァ ージの構造蛋白質と融合させて作られるフ ァ ージ抗体 ； 上記 の可変聴域遺伝子断片を他の適用な遺伝子断片例えば m y c遺伝子 の一部などと組み合わせる こ とにより構成される組換え抗体遺伝子 によつて形質転換された細胞が産生する組換え抗体などである。
ト リ プシン分子に可変領域を人工的に導入するこ とによ つて産生 されるプローブ、 レセプ夕一などの蛋白質に特異的に結合する分子 を人工的に改変する こ とによって得られるプローブ、 その他コ ンビ ナ 卜 リ ァルケ ミ ス 卜 リ 一技術によって作製されたプローブなど、 コ ァ抗原に高い特異性、 親和性を示す分子であればそれを用いる こ と が出来る。
上記のモノ ク ロ一ナル抗体は、 当業者により容易に作製するこ と ができる。 ハイ プリ ドーマによるモノ ク ローナル抗体の作製は良く 知られている。 例えば、 B A L B Z c マウスなどの腹腔内あるいは 皮内に、 上記融合ポリぺプチ ドも し く はポ リぺプチ ド （以下、 本抗 原） を単独も し く は B S A , K L Hなどと結合させた抗原と して、 単純あるいはフロイ ン 卜完全アジュバン ト等のアジュバン 卜 と混合 して定期的に免疫する。 血中の抗体価が上昇した時点で、 追加免疫 と して本抗原を尾静脈内に投与し、 無菌的に脾臓を摘出した後、 適 当なマウ ス骨髄腫細胞株と細胞融合し、 ハイ プリ ドーマを得る。 本 方法は、 Kohlerと Mi lsteinの方法 （Nature 256 : 495-497， 1975 ) に従って行なう こ とができる。 記方法により得られたハイ プリ ドーマ細胞株を適当な培養液中 で培養し、 その後、 本抗原に対して特異的な反応を示す抗体を産生 するハイ プリ ドーマ細胞株を選択してク ローン化する。 抗体産生ハ イ ブリ ドーマのク ロ一ニングには限界希釈法のほか軟寒天法 （Eur. J. Immunol. 6 : 511 -519, 1976 ) などを利用するこ とができる。 そ して、 産生されたモノ ク ローナル抗体をプロテイ ン Aなどを用いた カラムク ロマ トグラフィ ーなどの方法によ り精製する。
上記のモノ ク 口 一ナル抗体以外にもプローブと して用いる分子は 作製する こ とが出来る。 例えば組換え抗体については Hoogenboonの 総説などに詳し く記載されている （Trends in Biotechnology, 15 :
62- 70 , 1997) 。
本発明において、 検体中の H C Vコア抗体のためのプローブと し ての抗原又は前記 H C Vコア抗体を製造するための抗原は、 具体的 には、 例えば配列番号 ： 1又は 2 に示すァ ミ ノ酸配列を有するポリ ペプチ ド、 あるいは配列番号 ： 3 〜 6 に記載の複数のァ ミ ノ酸配列 を含有する融合ポリペプチ ドであり、 これらは、 これらをコー ドす る D N Aの組換え発現により得る ことができる。
こ こで検出原理は、 酵素標識抗体方法、 蛍光標識方法、 ラ ジオァ ィ ソ 卜ープ標識方法など通常の免疫測定法に用いられる方法を用い てもよ く 、 酵素標識抗体法における酵素検出原理は、 比色法、 蛍光 法、 化学発光法などがある。 また抗体の検出には、 二抗原サン ドィ ツチ法のような、 抗体検出に一般的に用いられる方法を用いてもよ く 、 さ らに抗原の検出にも同様に一ステップサン ドィ ツチ系などの 方法を用いるこ と も出来る。
本発明の様態の一つは、 以下のような反応系である。 （ 1 ) H C Vコア抗原に対するプローブ、 たとえば H C Vコア抗原に対する抗 体と、 （ 2 ) H C Vェピ 卜一プを含む化合物、 たとえば H C Vポリ ぺヴチ ドのェピ ト一プを含むぺプチ ド、 ぺプチ ド化合物またはポリ ペプチ ド、 およびこれらの混合物を、 免疫測定法に用いられる担体 、 たとえばミ ク ロ夕イ タ一プレー トに固相化させる。 固相化させた 担体を、 H C Vパーティ クル、 またはパーティ クル複合体から H C Vコア抗原をプロ一ブが認識できるように露呈させ、 かつ H C Vェ ピ 卜一プに対する抗体の機能を阻害させないような成分を含む反応 緩衝液中で、 被検体と反応させ、 検体中に含まれる コア抗原および H C Vェピ 卜一プに対する抗体を担体に特異的に結合させる。
次に、 結合されなかった検体中の成分を、 たとえば担体を適当な 緩衝液で洗浄する こ とによって除いた後、 担体に結合したコア抗原 を認識するプロ一ブたとえばコア抗原に対する酵素などで標識され た抗体と、 担体に結合した H C Vェピ トープに対する抗体を認識す るプローブ、 たとえば酵素などで標識された抗ー ヒ ト抗体マウスモ ノ ク ロ一ナル抗体を含む反応液と反応させるこ とにより、 担体に結 合したコア抗原と H C Vェピ 卜一プに対する抗体に特異的に結合さ せる。 反応終了後、 未反応の成分を取り除く ため、 たとえば担体を 適当な緩衝液で洗浄した後、 標識を適当な方法で検出する こ とによ り、 検体中に含まれる コア抗原と H C Vェピ ト一プに対する抗体を 検出する こ とが可能となる。
またィムノ ク ロマ ト法などの一般的に免疫測定法に用いる こ との 出来る B Z F分離法にも適用可能であるこ とは、 当該分野の研究者 にとつては自明である。
抗原検出に適した反応条件
本発明が提供する系における抗原検出に適した反応系とは、 H C V抗原ェピ 卜ープに対する抗体の機能を失わせない程度のマイル ド な条件でありながら、 検体中に存在する複雑な構造体である H C V パーティ クルから、 H C V抗原を認識するプロ一ブである抗体の認 識する領域を十分に露呈させる条件からなる系である。
すでに超遠心法にて分離したウィルスパーティ クル （Takahashi et al . , 1996, J. Gen. vi rol , 73 : 667 - 672)、 ポリ エチレングリ コ一 ルによつて凝集沈殿させた H C Vパーティ クルを T w e e n 8 0 や T r i t o n X 1 0 0 の様な非イオン性の界面活性剤によって処理 する こ とにより ( Kashiwakuma et al. , 1996, J. Immunological me thods 190 : 79-89)、 コア抗原が検出可能である ことが示されている 力 前者においてはその検出感度が不十分であり、 十分に抗原が露 呈されているかは疑問である。 また後者においては他の処理剤を加 える こ とにより抗体を失活させており、 界面活性剤の効果そのもの については触れられていない。
本発明においては、 始めに界面活性剤を基本に条件を検討し、 反 応液を界面活性剤を中心と した組成にする こ とにより、 すでに報告 されている H C V抗原検出系のように、 遠心操作や加熱などの操作 からなる前処理法を適用する ことな く 、 単に反応液中で検体を希釈 する こ とのみにより、 H C Vパーティ クル中の抗原を効率良く検出 する こ とが可能となつた。
効果的にウィルス粒子中からコア抗原を抽出し、 かっ血清中の様 々 な物質との相互反応を抑制し、 効率よ く プローブと抗原とが反応 できる条件を与える こ とが必要である。 この際の効果的な界面活性 剤と しては、 アルキル基と第 2〜第 4級ア ミ ンを同一分子内に有す る界面活性剤、 又は非ィォン性界面活性剤が挙げられる。
前記アルキル基と第 2 〜第 4級ア ミ ンを有する界面活性剤におい て、 アルキル基に好ま し く は直鎖アルキル基であり、 その炭素原子 数は好ま し く は 1 0個以上、 さ らに好ま し く は 1 2 〜 1 6個である ァ ミ ンと しては第 3 ァ ミ ン又は第 4 ァ ミ ン （アンモニゥム） が好 ま しい。 具体的な界面活性剤と しては、 ドデシル— N —サルコシ ン 酸、 ί ドデシル 卜 リ メ チルア ンモニゥム塩、 セチル ト リ メ チルア ンモ ニゥム塩、 3 — ( ドデシルジメ チルア ンモニォ） — 1 一プロ °ンス ルホン酸、 3 — (テ トラデシルジメ チルアンモニォ） — 1 —プ ンスルホ ン酸、 ドデシルビ リ ミ ジゥム塩、 セチルピ リ ミ ジゥム塩、 デカノィル— Ν—メチルグルカ ミ ド （ M E G A— 1 0 ) 、 ドデシル 一 N—べタイ ン等が挙げられる。 ドデシル— N—サルコシ ン酸及び ドデシル 卜 リ メ チルアン乇ニゥム塩が好ま しい。
前記の非ィォン性界面活性剤と しては 1 2 1 4の間の親水疎水 比を有する ものが好ま し く 、 ポリ オキシエチレンイ ソォクチルフエ ニルエーテル類、 例えば T r i t o n X 1 0 0 T r i t o n X 1 1 4など、 あるいはポリ オキシエチレンノニフ ァニルエーテル類、 例えば N o n i d e t p 4 0 , T r i t o n N l O l . N i k k o 1 N P等が好ま しい。
本発明においては、 上記 2つのタイプの界面活性剤を単独で用い てもよいが、 併用するのがー層好ま し く 、 併用により相乗効果が得 られる。
さ らに H C Vェピ ト一プに対する抗体を検出するように、 H C V ェピ トープを含む抗原と、 H C V抗原を検出するための抗体を固相 化した担体と、 本発明が提供する反応液で希釈した検体と反応させ る こ とにより、 H C V抗体が存在せず H C V抗原を含む検体におい ては、 抗原を効率良く検出し、 H C V抗原が存在せず抗体のみが存 在する抗体においては効率良く 抗体を検出し、 さ らに抗原と抗体が 存在する検体では、 抗原と抗体を同時に検出する こ とにより高いシ グナルを与えているこ とを見いだし、 本発明を完成させるに至った ウィ ルスの抗原とウイ ルス抗原に対する抗体を同時検出する方法 は、 すでに H I Vで報告されている （Weber et al. , J. Clinic. Mic robaol. , 36:2235-2239， 1998)。 H I Vの場合には、 ウィルス抗原 検査と して g a g蛋白質である p 2 4を検出するこ とが有効である 。 一方ウイルス抗原に対する抗体検査では、 e n v e 1 o p蛋白質 と g a g蛋白質である p 1 9 に対する抗体を検出することが有効で ある。 そのためウィ ルスの抗原とウィ ルス抗原に対する抗体を同時 検出する方法は、 抗原検査と して g a g蛋白質である p 2 4を検出 し、 抗体検査と して e n v e 1 o p蛋白質と g a g蛋白質の一部で ある p 1 9 に対する抗体を検出する方法を組み合わせるこ とによ り 達成される。
このよ う にウィ ルス抗原検出に用いる抗原のェピ 卜一プと、 ウイ ルス抗体検出に用いる被検体中の抗体が認識するェピ トープが異な る場合、 ウィルス抗原とウィルス抗原に対する抗体を同時検出する 方法の構築は比較的容易である。 なぜならば、 たとえば H I V検査 の場合、 抗原検出に用いるプローブ、 たとえば H I Vェピ ト一プに 対するモノ ク ローナル抗体、 の認識する抗原 p 2 4 と、 抗体検査で 被験者の試料中に含まれる抗体の認識する抗原、 e n V e i 0 p蛋 白質と g a g蛋白質の一部である p 1 9 とは異なる蛋白質であり、 抗原検査に用いるプローブが e n V e 1 o p蛋白質と g a g蛋白質 の一部である p 1 9を認識することはない。 ゆえに、 プローブが抗 体検出に用いる H I Vェピ トープに結合する こ とによって起こる競 合反応による感度低下、 非特異反応など、 抗原検出系、 抗体検出系 が互いに他の系を干渉する ことが起こ り難いためである。
しかしながら、 H C Vェピ 卜一プに対する抗体検出においては、 コア抗原ェピ ト一プに対する抗体を検出する こ とが臨床的に非常に 有用である （Chiba et al, Pro Natl. Acad. Sci. USA 88:4641-4645 ， 1991, Bresters et al. , Vox Sang. , 62:213-217, 1992) 。 ゆえ に、 抗体検出においてコア抗原ェピ トープに対する抗体を検出する こ ^は必須の要件である。 一方抗原検出においては、 ウィルスパー ティ クルを構成する抗原のうち、 コア抗原は、 他の抗原、 E l , E 2 よ り も変異率が低いため、 コア抗原を検出するこ とは、 H C V抗 原検出においてもっ と も有効な方法である。 すなわち、 効果的な H C Vの抗原抗体同時測定を構築するためには、 抗原検出系と抗体検 出系で同じ抗原、 コア抗原を用いる必要がある。
そのため、 何の工夫も無く コア抗原を用いた場合、 抗原検出に用 いる コア抗原に対するモノ ク ローナル抗体が、 抗体検出に用いるコ ァ抗原に結合し、 吸収され被検体中の抗原の検出感度が低下する、 抗体検出に用いる抗原に結合し、 抗原検査の非特異反応を誘発する 、 抗体検査のための H C Vェピ ト—プがマスク され感度が低下する などの問題が起こる。
本発明者らはこの問題を解決するために、 抗原検出に用いるモノ ク ロ一ナル抗体のェピ トープと、 被検体中に存在するコア抗原に対 する抗体のェピ ト一プを分割させるこ とにより、 抗原と、 抗体を同 時に効率良く検出できる こ とを見出し、 本発明を完成させるに至つ た。
以下実施例を詳細に説明するこ とによ り、 抗原と抗体の同時測定 のための好適なェピ トープの組み合わせ例を示す。
コア抗原に対する被検体中の抗体のェピ ト一プについては、 様々 なェピ トープ解析の結果から、 最も重要な領域がコア抗原の N末、 特に H C Vポリべプチ ドの第 1位から 4 0位に存在することが示さ れている （Okamoto et al, Hapatology 15:180-186， 1992, Sallbe rg et al, J. Clinical. Microbiol.， 30 : 1989-1994, 1992, Sallsbe rg et al. , J Med. Vilol, 43:62-68， 1994) 。 また遺伝子型特異的 に反応するェピ 卜一プが H C Vポリペプチ ドの第 6 6位から第 8 0 位にある （Machida Hepatology 16:886-891 ' 92 、 特願平 9 ― 2 0 9 2 2 ) 。 そのため、 H C Vェピ ト一プに対する抗体を検出する ための抗原と して、 H C Vポリペプチ ドの第 1位から第 4 0位、 第 6 6位から第 8 0位の配列を持つこ とが重要である。 ゆえに、 H C V抗体を検出する抗原と しては、 H C Vポリペプチ ドの第 1位から 4 2位、 第 6 6位から第 8 0位の配列を含む抗原 C E P Mを好適な 配列を持つ抗原ポ リぺプチ ドと して実施例に開示する。 なお C E P Mは H C Vポリべプチ ドの下記に示す領域を、 下記の順に並べた人 口配列からなる抗原であり、 その構築方法は特願平 9 - 2 0 9 5 2 2 に記載されている。 また配列は配列番号 1 0 に記載されている。 C E P Mの H C Vェピ ト ープの並び ：
( 1238— 1313) ― ( 1363— 1460) - ( 1712 - 1751) - ( 66 - 80) 一 ( 1686 - 1704) 一 （1716 1751) ― ( 66— 80) - （ 1690 - 1713) - ( 1 - 42)
一方抗原検出においては、 被検体中にコア抗原に対する抗体が比 絞的存在しない領域、 すなわち H C Vポリペプチ ドの第 1 0 0位か ら 1 3 0位を認識し結合するモノ ク ローナル抗体を第一次反応に、 第一次抗体に結合したコア抗原を検出するための第二次抗体の認識 部位と しては、 抗体検査に用いていない領域、 H C Vポリぺプチ ド の第 4 0位から 5 0位を認識するモノ ク ローナル抗体を用いて、 H C Vポリペプチ ドの第 1 0 0位から 1 3 0位に対する抗体によって 保持されたコア抗原を検出する。
これらのモノ ク ローナル抗体はいずれも、 H C V抗体を検出する ために用いている H C Vポリべプチ ドの第 1位から 4 2位までを含 む抗原には結合しないこ とから、 上記のモノ ク ローナル抗体、 上記 の抗原を用いる こ と によ り 、 結合による抗原検出系、 抗体検出系へ の反応阻害が生じ得ず、 それぞれの測定系を同時に機能させる こ と が可能となつた。 実施例
、以下実施例によって本発明を詳細に説明する。
実施例 1 . H C V由来ポリペプチ ドの発現プラス ミ ドの発現およ び精製
( A) 発現ブラス ミ ドの構築
H C Vのコア領域に相当する発現ブラス ミ ドは以下の方法で構築 した。 C l l — C 2 1 ク ローンおよび C I O — E 1 2 ク ローン （特 開平 6 — 3 8 7 6 5 ) を p U C 1 1 9 に組み込んで得られたプラス ミ ド p U C ♦ C 1 1 — C 2 1 および p U C - C 1 0 — E 1 2 の各 D N A 1 11 gを制限酵素反応液 2 0 /i l ( 5 0 mM T r i s — H C 1 (pH 7 . 5 ) 、 1 0 mM M g C 1 2 、 1 mM D T T、 1 0 0 mM N a C 1 、 1 5単位の E c o R I および 1 5単位の C 1 a I 酵素〕 中、 および 〔 1 0 mM T r i s - H C 1 (pH 7 . 5 ) 、 1 0 mM M g C l 2 、 l mM D T T、 5 0 mM N a C l 、 1 5単位の C l a l および 1 5単位の K p n I 酵素〕 中で各々 3 7 °C 1 時間消化し、 そ の後 0 . 8 %ァガロースゲル電気泳動を行ない、 約 3 8 0 bpの E c
0 R I - C 1 a I 断片および約 9 2 0 bpの C 1 a I — K p n I 断片 を精製した。
この 2つの D N A断片と p U C l 1 9 を E c o R I および K p n I で消化したべク タ一に 1 0 X リ ガーゼ用緩衝液 〔 6 6 0 mM T r
1 s - H C 1 (pH 7 . 5 ) 、 6 6 mM M g C 1 2 、 1 0 0 mMジチォ ス レ トール、 1 mM A T P ] 5 1 、 T 4 リ ガ一ゼ 1 1 ( 3 5 0 単位 Z 1 ) に水を加えて 5 0 1 と し、 1 6 °Cで一晩保温し、 連 結反応を行なった。 このプラス ミ ドを用い大腸菌 J M 1 0 9 を形質 転換させ、 プラス ミ ド p U C · C 2 1 — E 1 2 を得た。
このプラス ミ ド p U C * C 2 1 — E 1 2 D N A 1 ngを 2つの プライマ— （ 5 ' - GAATTCATGGGCACGAATCCTAAA- 3 ' (配列番号 ： 7 )ί、 5 ' — TTAGTCCTCCAGAACCCGGAC — 3 ' (配列番号 ： 8 ) ) を V
用い P C Rを行なう。 P C Rは GeneAmpTM (DNA Amplification Rea gent Kit, Perkin Elmer Cetus製） のキッ 卜を用い D N A変性 9 5 °C 1. 5分、 アニー リ ング 5 0 °C 2分、 D N A合成 7 0 °C 3分の条 件で行ない、 得られた D N A断片を 0. 8 %ァガロースゲル電気泳 動により分解し、 グラスパウダー法 （Gene Clean) で精製した。
一方、 p U C 1 9を制限酵素 S m a I で消化し、 P C R法によつ て得られた D N A断片を 1 0 X リ ガーゼ用緩衝液 〔 6 6 0 mM T r i s — H C 1 (pH 7. 5 ) 、 6 6 mM M g C 1 2 、 1 0 0 mMジチォ ス レ ト 一ル、 I mM A T P ] 5 i i 、 T 4 リ ガ一ゼ 1 1 ( 3 5 0 単位 Z μ 1 ) に水を加えて 5 0 / 1 と し、 1 6 °Cで一晩保温し、 連 結反応を行なった。 このプラ ス ミ ドを用い大腸菌 J M 1 0 9 を形質 転換させ、 プラス ミ ド p U C l 9 - C 2 1 — E 1 2 · S m a I を得 た。
このプラ ス ミ ド D N A 1 μ gを制限酵素反応液 2 0 / 1 〔 1 5 0 mM N a C 1 、 6 mM T r i s H C 1 (pH 7. 5 ) 、 6 mM M g C 1 2 、 1 5単位の E c o R I および 1 5単位の B a mH I酵素 〕 中で 3 7 °C 1時間消化反応を行ない、 その後 0. 8 %ァガロース ゲル電気泳動を行ない、 約 4 9 0 bpの E c o R I - B a m H I 断片 を分離し、 これをグラスパウダー法で精製した。
次に発現べク タ一である T r p · T r p E (特開平 5 — 8 4 0 8 5 ) の D N A 1 μ gを制限酵素反応液 2 0 1 ( 1 5 0 mM N a C l 、 6 mM T r i s - H C 1 (pH 7. 5 ) 、 6 mM M g C l 2 、 1 5単位の E c o R I および 1 5単位の B a mH I 酵素〕 中で 3 7 °Cで 1時間消化し、 その反応液に水 3 9 1 を加え、 7 0 °Cで 5分 間熱処理した後にバクテリ アアルカ リ性ホスフ ァ ターゼ （ B A P ) 1 μ 1 ( 2 5 0単位 Ζ β 1 ) を加えて 3 7 °Cで 1時間保温した。 の反応液にフヱノ ールを加えてフヱノ ール抽出を行ない、 得ら
\
れた水層をエタノ一ル沈殿し、 沈殿物を乾燥した。 得られた E c 0 R I — B a m H I 処理べク タ一 D N A 1 g と上述のコア 1 4 0 断片を 1 0 X リ ガーゼ用緩衝液 〔 6 6 0 mM T r i s - H C 1 (pH 7 . 5 ) 、 6 6 mM M g C 1 2 、 1 0 0 mMジチオス レ ト ール、 1 mM A T P ) 5 1 、 T 4 リ ガ一ゼ ( 3 5 0単位 Z l ) に水 を加えて 5 0 1 と し、 1 6 °Cで一晩保温し、 連結反応を行なつた この反応液の 1 0 1 を用いて大腸菌 H B 1 0 1株を形質転換し た。 形質転換に用いる感受性大腸菌株は塩化カルシウム法 〔Mandel ， M. と Higa， A.， J. Mol. Biol. , 53, 159-162 (1970) 〕 により作ら れる。 形質転換大腸菌を 2 5 g Zmlのア ン ピシ リ ンを含む L Β プ レ一 卜 （ 1 % ト リ プ ト ン、 0 . 5 % N a C l 、 1 . 5 %寒天） 上 に塗布し、 3 7 °Cに一晩保温した。 プレー ト上に生じた菌のコロニ -を 1 白金耳取り、 2 5 g Zmlのァンピシ リ ンを含む L B培地に 移し、 一晩 3 7 °Cで培養した。
1 . 5 mlの菌培養液を遠心して集菌し、 プラス ミ ド D N Aの ミ ニ プレノヽ0レーシ ヨ ン ァノレカ リ法 〔 Manniatis らヽ Molecular Clonin g: A Laboratory Manual, (1982)) によ り行なった。 得られたプラ ス ミ ド D N A 1 μ gを制限酵素反応液 2 0 1 [ 1 5 0 mM N a C l 、 6 mM T r i s - H C 1 (pH 7 . 5 ) 、 6 mM M g C l 2 、 1 5単位の E c o R I および 1 5単位の B a m H I 酵素〕 中で 3 7 。C、 1 時間消化し、 ァガロースゲル電気泳動を行なって、 約 4 9 0 bpの E c o R I — B a m H I 断片が生じる T r p ' T r p E コア 1 6 0発現ブラス ミ ドを選別した。
( B ) ク ローンコア 1 6 0 でコー ドされるポリペプチ ドの発現お よび精製 発現ブラス ミ ド T r p ' T r p Eコア 1 6 0 をもつ大腸菌 H B 1
\
0 1株を 5 0 /i g Zmlのアンピシ リ ンを含む 3 mlの 2 Y T培地 （ 1 . 6 % 卜 リ プ ト ン、 1 %酵母エキス、 0. 5 % N a C 1 ) に接種 し、 3 7 °Cで 9時間培養する。 この培養液 1 mlを 5 0 g /mlのァ ンピシ リ ンを含む 1 0 O mlの M 9 — C A培地 （ 0. 6 % N a 2 H P〇 4 、 0. 5 % K H 2 P O 4 、 0. 5 % N a C l、 0. 1 %
N H 4 C 1、 0. 1 DiM C a C l 2 、 2 mM M g S O 4 、 0. 5 %カザミ ノ酸、 0. 2 %グルコース） に植え継ぎ、 3 7 °Cで培養し た。 O D 6 0 0 = 0. 3の時に終濃度 4 0 mg/ 1 になるようにイ ン ドールアク リ ル酸を加え、 さ らに 1 6時間培養した。 この培養液を 遠心分離して菌体を集めた。
菌体に 2 O mlの緩衝液 A 〔 5 O mM T r i s - H C l (pH8. 0 ) 、 l mM E D T A、 3 0 mM N a C 1 ) を加えて懸濁し、 再び遠 心分離を行なって発現菌体 2. 6 gを得た。 得られた菌体を緩衝液 A 1 0 ml中に懸濁し、 超音波破砕により大腸菌膜を破碎した後に 遠心分離を行ない、 H C V c D N Aでコー ドされるポリペプチ ド と T r p Eの融合ポリペプチ ドを含む不溶性画分を得た。 その画分 に 1 0 mlの 6 M尿素を含む緩衝液 Aを加えて融合ポ リべプチ ドを可 溶化抽出した。 可溶化した抽出物を S - S e p h a r 0 s eを用い たイオン交換カラムク ロマ 卜グラフィ 一にかけて、 融合ポリべプチ ドの精製を行なつた。
実施例 2. ハイ ブリ ドーマの作製法
前記方法により調製した融合ポリぺプチ ド （T r p C 1 1 ) を 6 M尿素溶解後、 0. 1 5 M N a C 1 を含む 1 0 mMリ ン酸緩衝液 （ H 7. 3 ) に終濃度が 1. 0 mgZmlとなるように希釈し、 等量の夕 イ タ一マッ クスと混和し、 T r p C 1 1懸濁液と した。 T r p C 1 1濃度が 0. 0 1〜 0. 0 5 mgZmlとなるように調製した該懸濁液 を 4〜 6週令の B A L B Z c系マウスに腹腔内投与した。 さ らに約 8週間後、 免疫化動物に T r p C 1 1濃度が 0. 0 0 5〜 0. 0 3 mgZmlとなるように調製した生理食塩水溶液を尾静脈内に投与した
最終追加免疫後 3 日目に、 この免疫動物より無菌的に脾臓を摘出 し、 ハサ ミ で切片と してさ らにメ ッ シュを用いて脾臓を個々の細胞 にほぐ し、 R P M I — 1 6 4 0培地で 3回洗浄した。 8 —ァザグァ 二ジ ン存在下で数日間培養し、 復帰突然変異体を完全に除いた対数 増殖期のマウ ス骨髄腫細胞株 P A I を前記と同様に洗浄後、 該細胞 1. 8 X 1 0 7 個と脾臓細胞 1. 0 X 1 0 8 個を 5 0 ml容の遠心管 に入れ混合した。 2 0 0 x g、 5分間遠心分離を行ない、 上清を除 去し、 3 7 °Cに保温した 5 0 %ポリ エチレングリ コール （ P E G) 4 0 0 0 (メ ルク社製） を含む R P M I — 1 6 4 0培地 1 mlを加え て細胞融合させた。
融合細胞は、 遠心分離 （ 2 0 0 X g、 5分間） によって P E Gを 除いた後、 9 6 ゥエルプレー トを用いて、 ヒポキサンチン、 ァ ミ ノ プテリ ンおよびチ ミ ジン （以下、 H A Tと省略） を含む R P M I _ 1 6 4 0培地中で 1〜 2週間培養してハイ ブリ ドーマのみを増殖さ せた。 その後、 H A Tを含まない培地で成育させ、 約 2週間後目的 の抗体を産生するク ローンを E L I S A法により検索し、 所望の反 応特異性を有する本発明のモノ ク ロ一ナル抗体を産生するハイ プリ ドーマを得た。
得られたハイ プリ ドーマについて、 常法の限界希釈法に従い、 目 的とする抗体の産生株の検索および単一ク ロー ン化を行ない、 得ら れたハイ プリ ドーマを H C 1 1 — 1 4， H C 1 1 — 1 0， H C 1 1 — 3、 および H C 1 1 — 7 と命名した。 該 4種類のハイ プリ ドーマ に関しては、 微生物工業技術研究所に平成 9年 7月 4 日付で F E R M > B P - 6 0 0 6 , F E RM B P - 6 0 0 4 , F E RM B P \
一 6 0 0 2及び F E RM B P— 6 0 0 3 と して寄託された。
実施例 3. モノ ク 口一ナル抗体の作製法
実施例 2 に記載の方法により得られたハイプリ ドーマをプリ スタ ン等で処理したマウス腹腔に移植し、 腹水中に産生されてく るモノ ク ロ一ナル抗体を取得した。 該モノ ク ローナル抗体の精製は、 プロ ティ ン Aを結合させたセフ ァ ロ一スカラムによ り I g Gフラ ク シ ョ ンを分離した。
前記 5種類のハイ ブリ ド一マから産生されたそれぞれのモノ ク ロ —ナル抗体、 C 1 1 — 1 4， C 1 1 — 1 0， C 1 1 — 7および C 1 1 — 3のアイ ソタイプは、 ゥサギ抗マウス I g各アイ ソタイプ抗体 (Zymed 社製） を用いた二重免疫拡散法により、 C 1 1 一 1 0及び C 1 1 — 7力く I g G 2 a， C 1 1 — 1 4及び C 1 1 — 3力く I g G 1 である こ とが明らかとなった。 得られた 4種類のモノ ク ロ一ナル抗 体について、 H C V · コァ領域由来の配列によつて合成した 2 0の ペプチ ドを用いてェピ 卜一プ解析を行なつた結果、 表 1 に示す如く コア領域の一部を特異的に認識するモノ ク ローナル抗体である こと がわかつャこ。
表 1
Figure imgf000024_0001
実施例 4. 抗原を前処理操作なしで効率的に検出させるための方
法 H C Vパ一ティ クルを含む検体を界面活性剤を加えた反応液に希
\
釈し、 H C Vコア抗原の検出される効率を検討した。
なお H C Vコア抗原の検出は、 H C Vコア抗原に対するモノ ク ロ —ナル抗体を用いたサン ドイ ッチ酵素免疫アツセィ （ E I A) で行 つた。 実施例 3 で得られたモノ ク ローナル抗体のうち、 C 1 1 — 3 と C I 1 — 7をコア抗原を補足する抗体と して用い、 C I 1 一 1 0 ， C 1 1 - 1 4を補足されたコア抗原を検出するための抗体と して 用いた。
E I Aは基本的には以下の条件で行った。 モノ ク ローナル抗体 C 1 1 — 3， C 1 1 一 7を酢酸緩衝液にそれぞれ 4 g Zmlとなるよ う希釈した溶液をミ ク ロタイ タープレー トに加え、 4 °C—夜保温し た。 燐酸緩衝液で洗浄し 1 % B S Aを含む燐酸緩衝液を加えるこ とによるブロ ッキング操作を施した。 そこに反応液 1 0 0 1 、 検 体 1 0 0 β 1 を加え、 撹拌後、 室温で 1. 5時間反応させた。 低濃 度の界面活性剤を加えた燐酸緩衝液で洗浄する こ とにより未反応物 を除いた後、 アル力 リ フ ォ スフ ァ タ一ゼで標識したモノ ク ロ一ナル 抗体 C 1 1 一 1 0 , C 1 1 一 1 4を加え、 室温 3 0分反応させた。 反応終了後、 未反応物を低濃度の界面活性剤を加えた燐酸緩衝液で 洗浄する こ とによ り除き、 基質液 （CDP- Star/emeraldll ) を加え 室温 1 5分反応後、 発光量を測定した。
一次反応液中に各種界面活性剤を加えその効果を検討した。 H C Vに対する抗体の力価が検出感度以下であり、 ほとんど H C Vに対 する抗体を含まないと考えられる H C V抗原陽性血清を用いて、 発 光量の多寡によ ってコア抗原の検出感度を調べ健常人血清の発光量 を 1. 0 と して、 それに対する反応比率で表わした。 結果を次の表 2および表 3 に示す。 表 2
健常人血清に対する各血清の反応比率 (SZN ratio)
No45 No46 No3 No7 Nol9 無 添 カロ 15.67 1.00 1.15 1.34 1.19 効果判定基準 >30.0 >2.0 >2.0 >2.0 >2.0 添 加 剤 HLB値 %
陰ィォン性 ドデシル硫酸ナトリウム 40.0 0.5
界面活性剤 2.0
ドデシル N- サルコシン酸ナトリゥム 0.5 2.70
2.0 7.27 3.83 3.70 6.71 パ一フルォロアルキルカルボン酸 S-113 0.5 1.27
(ASAHI GLASS製） 2.0 0.91
陽ィォン性 セチルトリメチルアンモニゥムブロミ ド 0.5 7.42 3.09 3.52 5.43 界面活性剤 2.0 5.35
ドデシノレピリジニゥムクロライ ド 0.5 4.70 2.05 1.52 2.33
2.0 2.49
n-ドデシル卜リメチルァンモニゥ厶 0.5 4.43 2.41 1.63 2.67
2.0 3.77
テトラデシルアンモニゥムブロミ ド 0.05 14.69
n-ォクチルトリメチルアンモニゥムクロライ ド 0.5 1.00 0.75 0.99
2.0
両イオン性 CHAPS 0.5
界面活性剤 2.0 1.63 1.82 2.42 パーフルォロアルキルべタイン S-132 0.5 1.61
(ASAHI GLASS製） 2.0 ：oi： oi cl ί— 1.49
o卜 ：
3- (ドデシルジメチルアンモニォ）-1- 0.5 oo卜卜oc
プロパンスルホン酸 2.0 4.57 3.44 5.26
表 3
健常人血清に対する各血清の反応比率 (S/N ratio)
No45 No46 No3 No7 Nol9 無 添 カロ 15.67 1.00 1.15 1.34 1.19 効果判定基準 >30.0 >2.0 >2.0 >2.0 >2.0 添 加 剤 HLB値 %
非イオン性 MEGA- 10 0.5 3.38
界面活性剤 2.0 3.53 1.97 1.87 2.84
T een 20 16.7 0.5
2.0
Tween 40 15.6 0.5 1.02 1.41
2.0 1.32 1.64
Tween 80 15.0 0.5 1.33 1.23 1.10
2.0
Nonidet P- 40 13.1 0.5 43.14 3.09 2.95 4.58 ォクチルグルコシド 0.5 0.90 0.60 0.97
Figure imgf000027_0001
： ：卜 ：
トリエチルァミ ン 0.5 3.89 0.97
界面活性剤 2%ドデシル -N-サルコシン酸ナトリウム
の M合 + 2¾ Triton X100 244. 13 6. 11 5.50 12. 71
： この結果から、 T r i t o n X l O Oに代表される よ う に、 H L B値が 1 2〜 1 4間を示す非ィォン性界面活性剤の添加により、 H C V抗原陽性血清では、 健常人血清と比較して発光量が増大し、 検 出感度が上昇するこ とが判明した。 また、 同様に ドデシルー N—サ ノレコ シ ン酸ナ 卜 リ ゥムゃ ドデシル ト リ メ チルア ンモニゥムに代表さ れるように、 直鎖アルキル基と第 2〜第 4級ア ミ ンを同時にその構 造にもつ界面活性剤の添加により、 H C V抗原陽性血清における検 出感度が上昇する こ と も判明した。 炭素数 8以下のアルキル基をも つ前記界面活性剤はこのよ うな感度上昇効果は認められなかつた。 また、 これらの 2種類の界面活性剤を混合 （表 2では 2 % ドデシル — N—サルコ シ ン酸ナ ト リ ウムと 2 % T r i t o n X 1 0 0を混合 ) 添加するこ とによ り、 さ らに H C V抗原陽性血清における検出感 度が上昇するこ と も判明した。
実施例 5. H C V感染後の H C V抗体出現前 （ウィ ン ドピリォ ド 期） の検体中のコア抗原検出
巿販セ口コ ンヴァージ ョ ンパネル P H V 9 0 5 ( B . B . I . in c. ) を、 反応液中に 2 %の T r i t o n X 1 0 0及び 2 %の ドデシ ルー N—サルコ シ ン酸ナ 卜 リ ゥム添加し、 実施例 4 に準じて測定し た。 こ こで用いた P H V 9 0 5パネルは、 観察開始後 2 1 日目 （血 清 No. P H V 9 0 5 - 7 ) に抗 H C V抗体検査 （オルソ E I A. 3 . 0 ) で陽転化を示したものであり、 その抗体価はカ ツ 卜オフイ ン デッ クス （ S Z C O ) で表されており、 1. 0以上が陽性と判定さ れる。 H C Vコア抗原活性 （発光量） は、 健常人血清の発光量を 1 . 0 と して、 それに対する比率 （ S ZN) で表した。
表 4に示したよ う に、 まだ抗 H C V抗体が陽性となる前にコア抗 原活性が認められ、 この界面活性剤の添加により、 ウィ ルス粒子か らコア抗原性が露呈し、 固相化されたモノ ク ローナル抗体と反応し 検出できているこ とが確認された。
表 4
Figure imgf000029_0001
実施例 6 . 検体中に含まれる H C V抗体の検出とコア抗原との同 時検出
H C Vェピ トープに対する抗体が含まれ、 かつ H C V抗原がほと んど含まれない検体 （ヒ ト血清） を用いて、 界面活性剤を含む一次 反応液中で H C Vェピ トープに対する抗体が失活せず H C Vポリべ プチ ドに結合し、 2次反応液中に抗ヒ ト抗体を加えることによ り検 出可能である こと、 さ らにコア抗原が存在する場合にはコア抗原を 検出し、 H C Vェピ トープに対する抗体が含まれるときには抗体を 、 その両者が含まれ時にはその両者を検出可能であることを、 以下 の方法により確認した。
E I Aは基本的には以下の条件で行った。 H C Vェピ ト一プを含 む組換え抗原 C E P Mを尿素を含む燐酸緩衝液に希釈して、 ミ ク 口 タイタープレー トに添加し、 4 °C一夜保温する。 燐酸緩衝液で洗浄 後、 ，プレー ト にモノ ク ロ一ナル抗体 C 1 1 — 3， C 1 1 - 7 を酢酸 \
緩衝液に希釈した溶液を加え、 4 °C一夜保温した。 なお組換え抗原 C E P Mの作成方法は特願平 9 — 2 0 9 5 2 2 に記載されている。 抗体溶液を除いた後、 燐酸緩衝液で洗浄し 1 % B S Aを含む燐酸 緩衝液を加えることによるブロ ッキング操作を施した。
そ こに T r i t o n X 1 0 0 , ドデシル— N —サルコ シ ン酸ナ ト リ ウム及び尿素を含む一次反応緩衝液 1 0 0 μ 1 、 検体 1 0 Ο μ 1 を順次加え、 撹拌後、 室温で 1 . 5時間反応させた。 低濃度の界面 活性剤を加えた燐酸緩衝液で洗浄する こ とにより未反応物を除いた 後、 ホースラディ ッ シュパ一ォキシダ一ゼで標識した H C Vコア抗 原に対するモノ ク ローナル抗体 C 1 1 — 1 4 と、 ヒ ト I g Gに対す るマウスモノ ク ローナル抗体を含む 2 次反応緩衝液を加え、 室温 3 0分反応させた。
反応終了後、 未反応物を低濃度の界面活性剤を加えた燐酸緩衝液 で洗浄する こ とにより除き、 基質液 （オル トフヱ二レンジァ ミ ン） を加え室温 2 0分反応後、 吸光度を測定した。
H C Vコア抗原をほとんど含まないこ とが確認されている H C V 抗体陽性ヒ ト血清を、 ゥマ血清によ り希釈したものを検体と して、 H C Vェピ トープに対する抗体が検出されていることを確認したと ころ、 濃度依存的に反応する こ とが確認され、 抗体が一次反応液中 で失活するこ となく検出されている こ とが確認された。
表 5 ： HCV抗原と HCV抗体の同時測定
Figure imgf000031_0001
(値は 0D492 / 0D690 ) 一方組換えコア抗原をゥマ血清に加え、 ゥマ血清により希釈した ものを検体と して、 測定したと ころ濃度依存的に組換えコア抗原が 検出できている こ とが確認された。
コア抗原と ヒ ト血清を適当量加えたゥマ血清を検体と して測定し たと ころ、 表 4 に示すごと く 、 組換えコア抗原のみを含む場合には 組換えコア抗原による シグナルが得られ、 ヒ ト H C V抗体陽性血清 のみを含む場合には H C V抗体のみのシグナルが得られ、 両者を含 む場合には両者のシグナルが加算されたシグナルが得られた。 故に 抗原検出系、 抗体検出系の両者が互いに他を干渉しあう ことな く機 能し、 H C V抗原と H C Vポリべプチ ドのェピ 卜一プに対する抗体 が検出できている こ とが分かった。
実施例 7 . ヒ ト血清中の抗原抗体測定法 健常人検体と患者検体、 および血清陽転化パネル検体 （BBI inc. ) を用いて、 実施例 6 に記載した方法に従い抗原と抗体の同時測定 を行った。 なおパネル血清については、 販売元が提供している H C V抗体検出試薬での判定結果との比較を行った。
健常人検体 1 8例を用いて測定した結果を表 6 に示すが、 健常人 には反応しないこ とが確認された。 健常人の分布から、 陽性と陰性 の判別値を 0 . 1 と設定した。
表 7 に示すごと く H C V陽性検体ではいずれも陽性の値を与えた 一方表 8 に示すごと く 、 パネル血清では抗体検査では陽性である こ とを判別できなかったボイ ン ト、 1 から 6 の間で陽性判定を与え た。 これらのポイ ン トは、 Ampl icor H C V testの判定結果は陽性 判定が与えられており、 いわゆるウィ ン ドピリ オ ドに相当するが、 ウィ ン ドピリ ォ ドの検体でも陽性判定を与えるこ とが確認された。
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nJO/66dT/X3d εζο腦 ο OAV 表 Ί 患者検体 吸光度
3 2.892 陽性
16 2.335 陽性
45 0.394 陽性
84 2.769 陽性 卜 表 8 パネル血清 吸光度 判定 抗体ァ ッセィ Amplicor HCV test
PHV907-1 陽性 陰性 陽性
2 陽性 陰性 陽性
3 0.357 陽性 陰性 陽性
4 陽性 陰性 陽性
5 0.192 陽性 陰性 陽性
6 陽性 陽性 陽性
7 2.414 陽性 陽性 陽性 実施例 8. モノ ク ロ一ナル抗体の作製
実施例 3に記載の方法により新たなハイ プリ ド一マを作製し、 H C 11- 15と命名した。 微生物工業技術研究所に平成 1 1年 7月 1 6 日付けで、 F E AM B P— 9 7 8 2 と して寄託された。 このハイ プリ ドーマから産生されてきたモノ ク ローナル抗体を精製し、 アイ ソタイプを検定したと ころ、 I g G 1である こ とが明らかとなった 。 このモノ ク ローナル抗体は、 コア領域の配列によって合成した 2 0 のペプチ ドを用いたェピ 卜一プ解析の結果、 15Thr— 3°Ile (配 列番号 9 ) を特異的に認識するモノ ク 口一ナル抗体である ことがわ かった。 実 >施例 9 · モノ ク ローナル抗体の抗体価検定
\
組み換えコア抗原 （Trp c 11) を、 6 M尿素を含有する 1 0 mMリ ン酸緩衝液 （pH 7. 3 ) に終濃度 2 g Zmlとなるように希釈し、 マイ ク ロプレー トの各ゥエルに 1 0 0 1 ずつ添加した。 4 °Cで一 晚静置した後、 吸引し、 1 0 mMリ ン酸緩衝液 （pH 7. 3 ) で 2 回洗 浄した。 0. 5 %カゼイ ンを含有する 1 0 mMリ ン酸緩衝液 （pH 7. 3 ) を 3 5 0 1 ずつ添加し、 室温で 1 時間ィ ンキュベ一 卜 した後 、 吸引 した。 反応液で連続的に希釈した各モノ ク ローナル抗体 （ C 11一 3 , C 11- 7 , C 11- 10, C 11一 14又は C 11— 15) を各ゥエル に添加し、 1 時間反応させた。 洗浄後、 ペルォキシダーゼ標識抗マ ウ ス抗体を添加し、 3 0分間反応させ、 洗浄後、 オル ト フ 二レ ン ジァ ミ ン と過酸化水素の入った基質液を添加し酵素反応させた。 室 温で 3 0分間反応させた後、 2 N硫酸を添加して酵素反応を停止さ せ、 マイ ク ロプレー ト リ ーダーで 4 9 2 nmの吸光度を測定した。 図 1 にその結果を示した。
C 11- 15が最も抗体価が高く 、 2 次抗体と して使用した場合感度 高く 検出できる こ とが示された。
実施例 10. 固相化モノ ク ロ一ナル抗体の違いによるサン ドイ ッチ
E L I S A検定
各モ ノ ク ロ一ナル抗体 （ C 11— 3 と C 11— 5 と C 11— 15 ; C 11- 3 と C 11一 7 ； C 11— 3 と C 11一 15 ; C 11— 3単独 ； C 11一 7単独 ； 又は C 11一 15単独） を 1 0 mMリ ン酸緩衝液 （pH 7. 3 ) に終濃度 6 μ mlとなるよ う に希釈し、 マイ ク ロプレー 卜の各ゥエルに 1 0 0 1 ずつ添加した。 4 °Cでー晚静置した後、 吸引し、 1 0 mMリ ン酸緩衝液 （PH 7. 3 ) で 2 回洗浄した。 0. 5 %カゼイ ンを含有 する 1 0 mMリ ン酸緩衝液 （pH 7. 3 ) を 3 5 0 / 1 ずつ添加し、 室 温で 2 時間イ ンキュベー ト した後、 吸引 した。 H C V— R N A陽性 で ί¾Η C V抗体陰性検体 1 0 0 1 と反応液 1 0 0 1 を各ゥエル に添加し、 室温で 1時間反応させた。 洗浄後、 ペルォキシダ一ゼ標 識抗コア抗原モノ ク ローナル抗体 （ C 11一 14& c 11— 10の混合物） を添加し、 3 0分間反応させ、 洗浄後、 オル トフヱ二レンジァ ミ ン と過酸化水素の入った基質液を添加し酵素反応させる。 室温で 3 0 分間反応させた後、 2 N硫酸を添加して酵素反応を停止させ、 マイ ク ロプレー 卜 リ ーダーで 4 9 2 nmの吸光度を測定した。 図 2 にその 結果を示した。
C 11— 15のみの固相化ではあま り検出感度が低いが、 c 11一 15に c 11一 3や c 11— 7を混合して固相化するこ とにより、 検出感度が 上昇する こ とが示された。
実施例 11. ェピ トープキメ ラ抗原の発現と精製
大腸菌形質転換体 C E P MZH B 1 0 1株を 1 0 O ^ g Zmlアン ピシ リ ンを含む L B培地で 3 7 °C—夜培養した。 これを 1 %濃度で 1 0 0 μ g Z mlアンピシ リ ンを含む M 9 — C Aに接種し、 3 7。C一 夜培養した。 培養終了後遠心により菌体を集め、 5 O mlの L y s i s液 〔 5 0 mM T r i s - H C 1 (pH 8. 5 ) ， 3 0 mM N a C 1 ， 5 mM E D T A〕 に再懸濁し、 1 mlのリ ゾチーム液 1 0 mgZ ml L y s o z y m e ) を加え、 3 7 °Cにおいて 1時間処理した。 この 懸濁液を超音波処理 （ 1 5 0 W、 9 0秒で 2回） にかける こ とによ り細胞を破壊した。 1 5 0 0 O rpm で、 4 °Cにおいて 3 0分間遠心 し不溶性分画を回収した。 不溶性分画を 5 O mlの N P 4 0を 1 %含 む A溶液 〔 5 0 mM T r i s - H C 1 (pH 8. 5 ) 〕 に再懸濁しホ モジナイズ （ 1 5 0 O rpm で 5 ス ト ローク） した。 懸濁液を 1 5 0 0 O rpm で、 4 °Cにおいて 3 0分間遠心し不溶性分画を回収した。 不溶性分画を 5 0 mlの 2 M尿素を含む A溶液に再懸濁しホ乇ジナイ ズ （ 1 5 0 O rpm で 5 ス ト ローク） した。 懸濁液を 1 5 0 0 O rpm で、？ 4 °Cにおいて 3 0分間遠心し不溶性分画を回収した。 不溶性分 画を 5 0 mlの 6 M尿素を含む A溶液に再懸濁しホモジナイズ （ 1 5 0 0 rpm で 5 ス トローク） した。 懸濁液を 1 5 0 0 0 rpm で、 4 °C において 3 0分間遠心し可溶性分画を回収した。
6 M尿素を含む溶液で可溶化した抗原溶液から、 Sセファー口一 ス H Pカラム （ファルマシァ社） を用いたィォン交換法と S u p e r d e x 7 5 p g (フアルマシア社） を用いたゲル濾過法によりェ ピ トープキメ ラ抗原を精製した。
なお、 上記キメ ラ抗原をコ— ドする D N Aの塩基配列を配列番号 ： 1 0 に示し、 キメ ラ抗原のアミ ノ酸配列を配列番号 ： 1 1 に示す 特許協力条約第 13規則の 2の寄託された微生物への言及及び寄託 機関
寄託機関 名 称 ： 工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名 ： 日本国茨城県つく ば市東 1丁目 1 一 3 微生物（1) 表 示 ： HC11 3
寄託番号 ： FERM BP- 6002
寄託日 ： 1997年 7月 4 日
(2) 表 示 ： HC11— 7
寄託番号 ： FERM BP- 6003
寄託日 ： 1997年 7月 4 日
(3) 表 示 ： HC11 - 10
寄託番号 ： FERM BP- 6004
寄託日 ： 1997年 7月 4 日
(4) 表 示 ： HC11- 11
寄託番号 ： FERM BP 6005
寄託日 ： 1997年 7月 4 日 (5) 表 示 ： HC11- 4 寄託番号 ： FERM BP- 6006 寄託日 ： 1997年 7月 4 日
(6) 表 示 ： HC11- 15
寄託番号 ： FERM BP- 6782 寄託日 ： 1999年 7月 16日

Claims

請 求 の 範 囲
1 . C型肝炎ウィルス （H C V) の測定方法において、 炭素原子 数 1 0個以上のアルキル基と第 2〜第 4級ア ミ ンとを有する界面活 性剤も し く は非イ オ ン界面活性剤、 又はこの両者の存在下で、 H C Vコア抗原をそのプローブとの結合により測定するこ とを特徴とす る方法。
2. 前記アルキル基と第 2 〜第 4級ァ ミ ンとを有する界面活性剤 、 炭素原子数 1 2〜 1 6個のアルキル基と第 3級又は第 4級ア ミ ンとを有する界面活性剤である、 請求項 1 に記載の方法。
3 . 前記第 3級又は第 4級ァ ミ ン界面活性剤が、 ドデシルー N— サルコ シ ン酸、 セチルも し く は ドデシル ト リ メ チルア ンモニゥ ム塩 、 3 — （ ドデシルジメ チルア ンモニォ） 一 1 一プロパンスルホ ン酸 、 ドデシルピリ ミ ジゥム塩、 又はデカノ ィル一 N—メ チルグルカ ミ ド （ M E G A— 1 0 ) である、 請求項 1 又は 2 に記載の方法。
4. 前記非イオ ン性界面活性剤が、 1 2 〜 1 4 の親水疎水比 （H L B ) を有する界面活性剤である、 請求項 1 〜 3 のいずれか 1 項に 記載の方法。
5. 前記非イオ ン性界面活性剤が、 ポ リ オキシエチレ ンイ ソォク チルフ ヱ二ルテ一テル、 又はポ リ ォキシエチ レ ンノ ニルフ ヱニルェ —テルである請求項 1 〜 4 のいずれか 1 項に記載の方法。
6. C型肝炎ウィルス （H C V) の測定方法において、 請求項 1 〜 5 に記載の方法による H C Vコア抗原の測定と共に、 抗 H C V抗 体を、 そのプローブとの結合により測定するこ とを特徴とする方法
7 . 前記抗 H C V抗体のためのプローブが、 H C V関連ポ リぺプ チ ドである、 請求項 6 に記載の方法。
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