JP7044721B2 - Hcvコア抗原の迅速な検出のための前処理法 - Google Patents
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Description
C型肝炎ウイルス(HCV)は、ゲノムとして+鎖一本鎖RNAを含む、フラビウイルス科(Flaviviridae)、ヘパシウイルス属(Hepacivirus)の小型エンベロープウイルスである。HCV粒子において、コアタンパク質は、RNAゲノムと会合して、カプシド様構造を形成し、該構造は、ウイルス糖タンパク質E1およびE2を含む膜に囲まれている。HCVは、少なくとも6または7の遺伝子型を含み、そして非A非B肝炎としてもまた知られるC型肝炎の原因病原体と同定された。
したがって、特にスループット増加に関して、少なくとも部分的に先行技術の欠点を回避しつつ、HCVを検出するための改善された手段および方法を提供することが本発明の目的である。
この問題は、独立クレームの特徴を持つ、本発明の手段および方法によって解決される。単離された方式でまたは任意の恣意的な組み合わせで実現可能な好ましい態様は、従属クレームに列挙される。
(a)前記試料を、陽イオン性界面活性剤を含む表面活性剤と接触させ;
(b)前記試料を結合化合物と接触させ;そして
(c)前記試料における前記HCVのコアポリペプチドを検出する
工程を含み;
工程a)の直後に工程b)が続く、前記方法に関する。
(a)試料を、pHシフトを誘導する剤と、そして陽イオン性界面活性剤を含む表面活性剤と接触させ、それによって、前記試料、pHシフトを誘導する前記剤および前記表面活性剤が相互作用することを可能にする反応混合物を生成し、その直後に
(b)前記コアポリペプチドに特異的に結合する少なくとも2つの結合化合物を添加し、1つの態様において連続して添加し、前記の少なくとも2つの結合化合物の少なくとも1つが捕捉化合物であり、そして前記の少なくとも2つの結合化合物の少なくとも1つが検出剤化合物であり、
(c)前記反応混合物を前記結合化合物と混合することによって、免疫反応混合物を形成し、
(d)前記免疫反応混合物を、前記試料中に存在する前記コアポリペプチドが、少なくとも2つの結合化合物と免疫反応して、免疫反応産物を形成することを可能にするために十分な期間、維持し、そして
(e)前記免疫反応産物のいずれかの存在および/または濃度を検出する
工程を含む。
(a)前記試料を、陽イオン性界面活性剤を含む表面活性剤と接触させ;
(b)前記試料を結合化合物と接触させ;
(c)前記試料において、前記HCVのコアポリペプチドを検出し、そしてそれによって
(d)前記HCVを検出する
工程を含み、工程a)の直後に工程b)が続く、前記方法である。
(a)前記試料処理装置に適用された試料を、陽イオン性界面活性剤を含む表面活性剤と、そして任意に、pHシフトを誘導する剤と接触させ、その直後に
(b)前記試料を結合化合物と接触させる
が実行されることを指示するように適応される、前記デバイスにも関する。
用語「デバイス」は、本明細書において、検出結果が得られることを可能にするように、互いに機能可能であるように連結された、少なくとも前述の手段を含む、手段のシステムに関する。試料を、陽イオン性界面活性剤を含む表面活性剤と接触させるための、そしてコアポリペプチドを検出するための好ましい手段は、本発明の方法と関連して、上に開示される。操作可能な方式で、手段を連結する方法は、デバイスに含まれる手段のタイプに応じるであろう。1つの態様において、手段は、単一デバイスに含まれる。本発明にしたがって、デバイスは、上に示すような工程(a)の本発明の意味の直後に、上に示すような工程(b)が続くことを可能にするように適応され、すなわち1つの態様において5分未満、1つの態様において4分未満、さらなる態様において3分未満、さらなる態様において2分未満、さらなる態様において1分未満、さらなる態様において45秒未満、さらなる態様において30秒未満、さらなる態様において15秒未満で行われる。したがって、1つの態様において、コントローラー装置は、明記する時間枠内で、示すような工程が実行されることを指示するように設定される。
-少なくとも1つのプロセッサを含むコンピュータまたはコンピュータネットワークであって、該プロセッサが、本明細書記載の態様の1つにしたがって方法を実行するように適応されている、前記コンピュータまたはコンピュータネットワーク、
-コンピュータ装填可能データ構造であって、該データ構造がコンピュータ上で実行されている間、本明細書記載の態様の1つにしたがって方法を実行するように適応されている、前記コンピュータ装填可能データ構造、
-コンピュータプログラムであって、該プログラムがコンピュータ上で実行されている間、本明細書記載の態様の1つにしたがって方法を実行するように適応されている、前記コンピュータプログラム、
-コンピュータプログラムであって、該コンピュータプログラムがコンピュータまたはコンピュータネットワーク上で実行されている間、本明細書記載の態様の1つにしたがって方法を実行するためのプログラム手段を含む、前記コンピュータプログラム、
-先行する態様に記載のプログラム手段を含むコンピュータプログラムであって、該プログラム手段がコンピュータ読み取り可能保存媒体上に保存されている、前記コンピュータプログラム、
-保存媒体であって、データ構造が該保存媒体上に保存され、そして該データ構造がコンピュータまたはコンピュータネットワークのメインおよび/または作業ストレージに装填された後、本明細書記載の態様の1つにしたがって方法を実行するように適応されている、前記保存媒体、および
-プログラムコード手段を有するコンピュータプログラム製品であって、該プログラムコード手段がコンピュータまたはコンピュータネットワーク上で実行された際に、本明細書記載の態様の1つにしたがって方法を実行するため、該プログラムコード手段が、保存媒体上に保存可能であるかまたは保存されている、前記コンピュータプログラム製品
を開示する。
1. 被験体由来の試料において、C型肝炎ウイルス(HCV)のコアポリペプチドを検出するための方法であって
(a)前記試料を、陽イオン性界面活性剤を含む表面活性剤と接触させ;
(b)前記試料を結合化合物と接触させ;そして
(c)前記試料における前記HCVのコアポリペプチドを検出する
工程を含み;
工程a)の直後に工程b)が続く、前記方法。
5. 前記陽イオン性界面活性剤が、四級アンモニウム界面活性剤である、態様1~4のいずれか1つの方法。
9. コアポリペプチドの前記検出が、捕捉化合物によって、1つの態様において捕捉抗体によって、固体表面に前記コアポリペプチドを捕捉する工程を含む、態様1~8のいずれか1つの方法。
11. 前記コアポリペプチドの前記検出が、サンドイッチイムノアッセイにおいて前記コアポリペプチドを検出する工程を含む、態様1~10のいずれか1つの方法。
13. 前記試料が免疫グロブリンを含む試料、1つの態様において血液、血清、または血漿試料である、態様1~12のいずれか1つの方法。
15. 前記塩基がブレンステッド-ローリー塩基、1つの態様において水溶液中でさらなる水酸化物イオンを含むかまたは生成する化合物、さらなる態様においてアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物である、態様14の方法。
17. 前記塩基が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、または水酸化リチウム、1つの態様において水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、態様14~16のいずれか1つの方法。
19. 前記試料を塩基と接触させる工程が、前記塩基の0.25mol/l溶液の1部分を、前記試料の2部分に添加する工程を含む、態様14~18のいずれか1つの方法。
24. 前記中和が、0.2mol/l緩衝剤、1つの態様において0.2mol/lリン酸緩衝剤の少なくとも0.4部分を、試料/塩基混合物の1部分に添加する工程を含む、態様22または23の方法。
27. 前記酸がブレンステッド-ローリー酸、1つの態様において水溶液中でさらなるオキソニウムイオン(ヒドロニウムイオン)を含むかまたは生成する化合物、さらなる態様において酸性pHを有する緩衝剤である、態様26の方法。
29. 前記緩衝剤が、リン酸緩衝剤、1つの態様においてリン酸カリウム緩衝剤である、態様27または28の方法。
31. 前記試料を酸と接触させる工程が、最大6、1つの態様において最大5.5、さらなる態様において最大5のpHで、前記試料をインキュベーションする工程を含む、態様26~30のいずれか1つの方法。
35. 前記中和が、0.1mol/l中和緩衝剤、1つの態様において0.1mol/lリン酸緩衝剤の少なくとも0.4部分を、試料/酸混合物の1部分に添加する工程を含む、態様33または34の方法。
39. 前記コアポリペプチドを検出する前に、変性ポリペプチドを試料から除去しない、態様1~38のいずれか1つの方法。
41. 前記被験体が、HCVに感染していると推測される被験体である、態様1~40のいずれか1つの方法。
45.前記陽イオン性界面活性剤が、四級アンモニウム界面活性剤、1つの態様においてヘキサデシル-トリメチルアンモニウム塩、1つの態様においてヘキサデシル-トリメチルアンモニウムクロリド(HTAC、CAS番号112-02-7)である、態様43または44の使用。
50. pHシフトを誘導する前記剤が塩基である、態様43~49のいずれか1つの使用。
55. 酸が緩衝剤、1つの態様においてリン酸緩衝剤、さらなる態様においてリン酸カリウム緩衝剤である、態様54の方法。
57. 試料において、HCVのコアポリペプチドを検出するための分析デバイスであって、試料処理装置を含む分析装置を含み、前記分析装置がコントローラー装置に連結され、前記コントローラー装置が以下の:
(a)前記試料処理装置に適用された試料を、陽イオン性界面活性剤を含む表面活性剤、そして任意に、pHシフトを誘導する剤と接触させ、その直後に
(b)前記試料を結合化合物と接触させる
工程が実行されることを指示するように適応されている、前記分析デバイス。
59. 直後が1秒~5分未満の時間枠であり、そして工程a)およびb)の間の時間枠が前記試料に前記界面活性剤を添加することで始まり、そして前記結合化合物を添加することで終わる、態様1~42のいずれか1つの方法、態様43~56のいずれか1つの使用、態様57の分析デバイス、または態様58の分析システム。
本発明のさらなる任意の特徴および態様は、実施例態様の続く説明において、特に従属クレームと組み合わせて、より詳細に開示されるであろう。ここで、それぞれの任意の特徴は、当業者が認識するであろうように、単離方式で、ならびに恣意的な実現可能な組み合わせで、達成可能である。本発明の範囲は、提供する実施例によって制限されない。
組換えDNA技術
Sambrook, J.ら, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されるように、標準法を用いてDNAを操作した。製造者の指示にしたがって、分子生物学試薬を用いた。
化学合成によって、Geneart GmbH(ドイツ・レーゲンスブルク)で、所望の遺伝子セグメントを調製した。合成した遺伝子断片を、増殖/増幅のため、大腸菌(E. coli)プラスミド内にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって検証した。あるいは、化学的に合成したオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、またはPCRを通じて、短い合成DNA断片を組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドを、metabion GmbH(ドイツ・プラネック-マルティンスリート)によって調製した。
所望の遺伝子/タンパク質(例えば全長抗体重鎖、全長抗体軽鎖、またはオリゴグリシンをN末端に含有するFc鎖)の発現のため、以下の機能要素を含む転写単位を用いた:
-ヒトサイトメガロウイルス由来の、イントロンAを含む、極初期エンハンサーおよびプロモーター(P-CMV)、
-ヒト重鎖免疫グロブリン5’-非翻訳領域(5’UTR)、
-ネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
-発現しようとする遺伝子/タンパク質(例えば全長抗体重鎖)、および
-ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGHpA)。
-大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする、ベクターpUC18由来の複製起点、および
-大腸菌においてアンピシリン耐性を与える、ベータ-ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。
ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて計算した分子消光係数を用いて、または比色BCA法を用いて、280nmの光学密度(OD)を決定することによって、精製ポリペプチドのタンパク質濃度を決定した。
当業者に知られるような標準的ハイブリドーマ技術によって、または組換え核酸技術によって、モノクローナル抗体が調製されてきている。
ビオチンおよびルテニウム部分、それぞれの、抗体へのカップリング:
当業者には完全によく知られている最新技術の方法にしたがって、抗体を得て、そして精製した。
プロトタイプElecsys HCVコア抗原アッセイ
Elecsys HCVコア抗原アッセイを自動化cobas(登録商標)e801分析装置(Roche Diagnostics GmbH)上で行った。
酸性前処理のため、実験HCVコア抗原アッセイを以下のように行った。HCV抗原陽性試料または血液ドナー試料の30μlの正常ヒト血清、および15μlの界面活性剤含有前処理試薬PT(200mMリン酸カリウム、pH5.0、1.125M KCl、1.5%ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド(HTAC)、0.5%オクチルグリコシド)を、ともに9分間インキュベーションして、抗原を放出させた。
上に明記するような捕捉抗体-ビオチンコンジュゲートを含む緩衝剤R1が、およそ12秒後、デバイスで作業可能となったら可能な限り迅速に添加されることを除いて、条件はプロトタイプアッセイに関するものと同じであった。
Claims (15)
- 被験体由来の試料において、C型肝炎ウイルス(HCV)のコアポリペプチドを検出するための方法であって、
(a)該試料を、陽イオン性界面活性剤を含む表面活性剤と接触させ;
(b)該試料を結合化合物と接触させ;そして
(c)該試料におけるHCVのコアポリペプチドを検出する
工程を含み;
工程a)の直後に工程b)が続き、直後は1秒~2分未満の時間枠であり、そして工程a)およびb)の間の該時間枠が該試料に該表面活性剤を添加することで始まり、そして該結合化合物を添加することで終わり、そして
工程(a)が、少なくとも2 pH単位のpHシフトを誘導する剤と前記試料を接触させる工程をさらに含む、
前記方法。 - 前記試料を、前記pHシフトを誘導する剤と、そして前記表面活性剤と同時に接触させる、請求項1の方法。
- 直後が1分未満、45秒未満、30秒未満、または15秒未満の時間枠である、請求項1または2の方法。
- 前記陽イオン性界面活性剤が、四級アンモニウム界面活性剤、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩、またはヘキサデシル-トリメチル-アンモニウムクロリド(HTAC、CAS番号112-02-7)である、請求項1~3のいずれか一項の方法。
- 前記表面活性剤が、非イオン性界面活性剤、アルキル-グリコシド、またはオクチルグリコシド(n-オクチル-β-D-グルコシド、CAS番号29836-26-8)をさらに含む、請求項1~4のいずれか一項の方法。
- 前記結合化合物が検出剤化合物または検出剤抗体である、請求項1~5のいずれか一項の方法。
- コアポリペプチドの前記検出が、捕捉化合物によって、または捕捉抗体によって、固体表面に該コアポリペプチドを捕捉する工程を含む、請求項1~6のいずれか一項の方法。
- 前記コアポリペプチドの検出が、サンドイッチイムノアッセイにおいて該コアポリペプチドを検出する工程を含む、請求項1~7のいずれか一項の方法。
- 前記pHシフトを誘導する剤が、塩基、ブレンステッド-ローリー塩基、水溶液中でさらなる水酸化物イオンを含むかまたは生成する化合物、またはアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物である、請求項1~8のいずれか一項の方法。
- 前記pHシフトを誘導する剤が、酸、ブレンステッド-ローリー酸、水溶液中でさらなるオキソニウムイオン(ヒドロニウムイオン)を含むかまたは生成する化合物、または酸性pHを有する緩衝剤である、請求項1~8のいずれか一項の方法。
- HCVコアポリペプチドの検出のため、被験体由来の試料をプレプロセシングするための方法であって、(a)該試料を、陽イオン性界面活性剤を含む表面活性剤と、そして少なくとも2 pH単位のpHシフトを誘導する剤と接触させ、その直後に、(b)該試料を結合化合物と接触させる工程を含み、直後が1秒~2分未満の時間枠であり、そして工a)およびb)の間の該時間枠が該試料に該表面活性剤を添加することで始まり、そして該結合化合物を添加することで終わる、前記方法。
- 試料において、HCVを検出するためのプレプロセシング試薬の使用であって、該プレプロセシング試薬が、陽イオン性界面活性剤を含む表面活性剤および少なくとも2 pH単位のpHシフトを誘導する剤を含み、該使用がa)該試料を、該プレプロセシング試薬と接触させ、その直後に、b)該試料を結合化合物と接触させる工程を含み、直後が1秒~2分未満の時間枠であり、そして工程a)およびb)の間の該時間枠が該試料に該表面活性剤を添加することで始まり、そして該結合化合物を添加することで終わる、前記使用。
- 前記プレプロセシング試薬が、1.3%(w/v)~2%(w/v)の濃度の前記陽イオン性界面活性剤、および少なくとも0.25%(w/v)、0.25%(w/v)~2.5%(w/v)、または0.3%(w/v)~1.5%(w/v)の濃度の非イオン性界面活性剤を含む、請求項12の使用。
- 試料において、HCVのコアポリペプチドを検出するための分析デバイスであって、試料処理装置を含む分析装置を含み、該処理装置が試料のための容器、陽イオン性界面活性剤を含む表面活性剤、pHシフトを誘導する剤、および少なくとも1つの検出剤化合物を含み、該分析装置がコントローラー装置に連結され、そして該コントローラー装置が以下の工程
(a)該試料処理装置に適用された試料を、陽イオン性界面活性剤を含む表面活性剤と、そして少なくとも2 pH単位のpHシフトを誘導する剤と接触させ、その直後に
(b)該試料を結合化合物と接触させる
が実行されることを指示するように適応され、
直後が1秒~2分未満の時間枠であり、工程a)およびb)の間の該時間枠が該試料に該表面活性剤を添加することで始まり、そして該結合化合物を添加することで終わり、そしてコントローラー装置が、特定の時間枠内に工程(a)および(b)が行われることを指示するように設定されている、前記分析デバイス。 - 請求項14の分析デバイスおよび評価デバイスを含む、分析システム。
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