JPWO2017033846A1 - 免疫試験方法および免疫試験キット - Google Patents
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Abstract
ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１の両方に結合する抗体を用いて試料中のＨＭＧＢ１を測定する際に、ＨＭＧＢ２吸収剤（ＨＭＧＢ２抗体および／またはＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合を阻害するＨＭＧＢ２由来のペプチド）を共存させることで、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体との反応を抑制できることを見出した。すなわち、ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下でＨＭＧＢ１抗体と試料を接触させることにより、該試料中のＨＭＧＢ１のみを測定または検出できることが明らかとなった。
Description
本発明は、敗血症等の疾患マーカーとなり得るＨｉｇｈ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｇｒｏｕｐ Ｂｏｘ １（以下「ＨＭＧＢ１」と略すことがある）の測定または検出方法および測定または検出用キット等に関する。
Ｈｉｇｈ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｇｒｏｕｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ（以下「ＨＭＧ」）は、クロマチン構造に含まれる非ヒストンタンパク質であり、多くの高等動植物に共通して含まれるタンパク質である。ＨＭＧには、例えばＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２、ＨＭＧＢ３、ＨＭＧＢ８、ＨＭＧＢ１７等、いくつかの種類が存在する。これらＨＭＧは、互いにアミノ酸配列の相同性が高いことが特徴として挙げられる。例えは、ヒト由来のＨＭＧＢ１に対するヒト由来のＨＭＧＢ２の相同性は８０％以上である。
１９９９年、Ｗａｎｇら（非特許文献１）により、ＨＭＧＢ１が敗血症のマーカーとなり得ることが示され、ＨＭＧＢ１は敗血症性ショック時の晩期に発現するメディエーターとして注目されるようになった。また、ＨＭＧＢ１は、敗血症発症時に核外へと遊離され、重度の細胞障害性を示すことから、敗血症時の致死性に関与する可能性が指摘されている。
一方、ＨＭＧＢ２の血中放出に関する報告もある（非特許文献２）。丸山らはウエスタンブロットにより、潰瘍性大腸炎患者の血清中にＨＭＧＢ２が放出されていることを確認している。つまり、ヒトの血中においては、ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２が同時に検出される可能性がある。そのため敗血症の判別においては、ＨＭＧＢ２共存下であっても、ＨＭＧＢ１を特異的に測定する方法や測定試薬が必要である。
一方、ＨＭＧＢ２の血中放出に関する報告もある（非特許文献２）。丸山らはウエスタンブロットにより、潰瘍性大腸炎患者の血清中にＨＭＧＢ２が放出されていることを確認している。つまり、ヒトの血中においては、ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２が同時に検出される可能性がある。そのため敗血症の判別においては、ＨＭＧＢ２共存下であっても、ＨＭＧＢ１を特異的に測定する方法や測定試薬が必要である。
特許第５０５５５９８号（特許文献１）には、試料中のＨＭＧＢ１を特異的に測定するための方法として、ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２を識別し得る抗体の獲得に関する記載がある。具体的には、先ず、ＨＭＧＢ１のアミノ酸配列を含むペプチドを免疫原として動物に免疫し、ＨＭＧＢ１抗体の産生を促す。しかし前述したように、ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２のアミノ酸配列の相同性が極めて高い。そのため実際には、ＨＭＧＢ１だけではなくＨＭＧＢ２にも結合するＨＭＧＢ１抗体が数多く産生される。そこで、抗体産生後に、ＨＭＧＢ２をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィー法によりＨＭＧＢ２にも結合するＨＭＧＢ１抗体を除去し、ＨＭＧＢ１特異的に結合するＨＭＧＢ１抗体を獲得している。
ＳＣＩＥＮＣＥ、 ２８５、２４８〜２５１、１９９９
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９、９、１５３５〜１５３７、２００３
ロックランドイムノケミカルズ社 / Rockland Immunochemicals, Inc. ホームページ、[online]、[平成27年6月1日検索]、インターネット <URL：http://www.rockland-inc.com/uploadedFiles/Support/Protocols/Peptide-Competition-Protocol.pdf>
Intensive Care Medicine、３３、１３４７〜１３５３、２００７
Blood Purification，３２、１３９−１４２，２０１１
前述したように、敗血症の判別においては、ＨＭＧＢ２共存下であってもＨＭＧＢ１を特異的に測定することが求められる。しかし、ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２のアミノ酸配列の相同性が極めて高いために、免疫動物にＨＭＧＢ１抗体を産生させた場合、ＨＭＧＢ１だけではなくＨＭＧＢ２にも結合するＨＭＧＢ１抗体が数多く産生される。
産生された抗体の中からＨＭＧＢ１のみに結合するＨＭＧＢ１抗体を取得する手段として、前述の特許第５０５５５９８号に示されるように、アフィニティークロマトグラフィー法による方法が知られている。しかしこの方法は、工程数が増えるだけではなく精製により目的物の回収量も減少するため、製造コストが上昇するという問題がある。
このように、ＨＭＧＢ１を特異的に測定する手段の確立が求められる一方で、ＨＭＧＢ１特異的に結合するＨＭＧＢ１抗体の取得は容易ではない。本発明はこのような状況を鑑みてなされたものであり、ＨＭＧＢ１抗体を用いてＨＭＧＢ１を選択的に測定または検出する方法および当該方法に使用するためのキット等を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果本発明者らは、ＨＭＧＢ２にも結合するＨＭＧＢ１抗体を用いて試料中のＨＭＧＢ１を測定する際に、ＨＭＧＢ２吸収剤を共存させることで、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合を抑制し、ＨＭＧＢ１を特異的に検出できることを見出した。
本発明はこのような知見に基づくものであり、試料に含まれるＨＭＧＢ１をＨＭＧＢ１抗体を用いて測定または検出するための方法であって、ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下において試料とＨＭＧＢ１抗体を接触させることを特徴とする方法に関する。
また本発明は、ＨＭＧＢ１抗体を用いて試料に含まれるＨＭＧＢ１を測定または検出するためのキットまたは試薬であって、少なくとも、ＨＭＧＢ１抗体およびＨＭＧＢ２吸収剤を具備し、ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下において試料とＨＭＧＢ１抗体を接触させて使用することを特徴とするキットまたは試薬に関する。
本発明はこのような知見に基づくものであり、試料に含まれるＨＭＧＢ１をＨＭＧＢ１抗体を用いて測定または検出するための方法であって、ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下において試料とＨＭＧＢ１抗体を接触させることを特徴とする方法に関する。
また本発明は、ＨＭＧＢ１抗体を用いて試料に含まれるＨＭＧＢ１を測定または検出するためのキットまたは試薬であって、少なくとも、ＨＭＧＢ１抗体およびＨＭＧＢ２吸収剤を具備し、ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下において試料とＨＭＧＢ１抗体を接触させて使用することを特徴とするキットまたは試薬に関する。
本発明の方法では、試料中にＨＭＧＢ１抗体とＨＭＧＢ２吸収剤を共存させることで、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合を抑制することができる。それゆえ、試料中にＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２の両方が含まれている場合にも、ＨＭＧＢ１を正確に測定することが可能となる。
さらに、本発明の方法では、ＨＭＧＢ２にも結合性を示すＨＭＧＢ１抗体を利用することができる。それゆえ、一般的に知られる免疫動物を用いた抗体産生技術により容易に獲得される多くのＨＭＧＢ１抗体を、本発明の方法に利用することが出来る。
さらに、本発明の方法では、ＨＭＧＢ２吸収剤として、ＨＭＧＢ２抗体を利用することができる。ＨＭＧＢ２抗体は一般的に知られる免疫動物を用いた抗体産生技術により獲得できるため、容易にＨＭＧＢ２吸収剤を作製できる。
さらに、本発明の方法では、ＨＭＧＢ２吸収剤として、式（Ｉ）または（ＩＩ）に記載のＨＭＧＢ２由来のアミノ酸配列を含むペプチドを利用することができる。これらのペプチドは容易に合成することができるため、より安価にＨＭＧＢ２吸収剤を作製することが出来る。
(Ｉ) : MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
(ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）
(Ｉ) : MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
(ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）
さらに、本発明のキット、試薬では、ＨＭＧＢ２吸収剤をキット、試薬に具備させておけばよく、測定時に試料と混合するだけで、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合を抑制することが出来る。それゆえ、簡素なキット、試薬の構成で、ＨＭＧＢ１を正確に測定することが出来る。
さらに、本発明のキット、試薬では、ＨＭＧＢ２にも結合性を示すＨＭＧＢ１抗体を利用することができる。それゆえ、一般的に知られる免疫動物を用いた抗体産生技術により獲得される多くのＨＭＧＢ１抗体の利用が可能となり、容易にキット、試薬を作製することができる。
さらに、本発明のキット、試薬では、ＨＭＧＢ２吸収剤として、ＨＭＧＢ２抗体を利用することができる。ＨＭＧＢ２抗体は一般的に知られる免疫動物を用いた抗体産生技術により獲得できるため、容易にＨＭＧＢ２吸収剤を作製できる。
さらに、本発明のキット、試薬では、ＨＭＧＢ２吸収剤として、式（Ｉ）または（ＩＩ）に記載のＨＭＧＢ２特異的なアミノ酸を含むペプチドを利用することができる。これらのペプチドは容易に合成することができるため、より安価にＨＭＧＢ２吸収剤を作製することが出来る。
(Ｉ) : MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
(ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）
(Ｉ) : MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
(ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）
本発明は、より具体的には以下〔１〕から〔１７〕に関する。
〔１〕ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下でＨＭＧＢ１抗体と試料を接触させる工程を含む、該試料中のＨＭＧＢ１の測定または検出方法。
〔２〕ＨＭＧＢ１抗体がＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２の両方に結合性を示す抗体である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくともＨＭＧＢ２抗体を含む、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくとも次式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む、〔１〕または〔２〕に記載の方法；
（Ｉ）: MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
（ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）。
〔５〕ＨＭＧＢ１の測定または検出を免疫試験方法によって行うことを特徴とする、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕少なくともＨＭＧＢ１抗体を含む第１の試薬およびＨＭＧＢ２吸収剤を含む第２の試薬を含む、ＨＭＧＢ１の測定または検出用キット。
〔７〕ＨＭＧＢ１抗体がＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２の両方に結合性を示す抗体である、〔６〕に記載のキット。
〔８〕ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくともＨＭＧＢ２抗体を含む、〔６〕または〔７〕に記載のキット。
〔９〕ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくとも次式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む、〔６〕または〔７〕に記載のキット；
（Ｉ）: MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
（ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）。
〔１０〕免疫試験方法を使用してＨＭＧＢ１を測定または検出するために用いるための〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載のキット。
〔１１〕少なくともＨＭＧＢ１抗体およびＨＭＧＢ２吸収剤を含む、ＨＭＧＢ１の測定または検出用試薬。
〔１２〕ＨＭＧＢ１抗体がＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２の両方に結合性を示す抗体である、〔１１〕に記載の試薬。
〔１３〕ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくともＨＭＧＢ２抗体を含む、〔１１〕または〔１２〕に記載の試薬。
〔１４〕ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくとも次式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む、〔１１〕または〔１２〕に記載の試薬；
（Ｉ）: MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
（ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）。
〔１５〕免疫試験方法を使用してＨＭＧＢ１を測定または検出するために用いるための〔１１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の試薬。
〔１６〕次式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチドであって、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合を阻害するペプチド：
（Ｉ）: MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
（ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）。
〔１７〕〔１６〕に記載のペプチドを含む試料。
〔１〕ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下でＨＭＧＢ１抗体と試料を接触させる工程を含む、該試料中のＨＭＧＢ１の測定または検出方法。
〔２〕ＨＭＧＢ１抗体がＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２の両方に結合性を示す抗体である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくともＨＭＧＢ２抗体を含む、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくとも次式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む、〔１〕または〔２〕に記載の方法；
（Ｉ）: MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
（ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）。
〔５〕ＨＭＧＢ１の測定または検出を免疫試験方法によって行うことを特徴とする、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕少なくともＨＭＧＢ１抗体を含む第１の試薬およびＨＭＧＢ２吸収剤を含む第２の試薬を含む、ＨＭＧＢ１の測定または検出用キット。
〔７〕ＨＭＧＢ１抗体がＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２の両方に結合性を示す抗体である、〔６〕に記載のキット。
〔８〕ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくともＨＭＧＢ２抗体を含む、〔６〕または〔７〕に記載のキット。
〔９〕ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくとも次式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む、〔６〕または〔７〕に記載のキット；
（Ｉ）: MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
（ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）。
〔１０〕免疫試験方法を使用してＨＭＧＢ１を測定または検出するために用いるための〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載のキット。
〔１１〕少なくともＨＭＧＢ１抗体およびＨＭＧＢ２吸収剤を含む、ＨＭＧＢ１の測定または検出用試薬。
〔１２〕ＨＭＧＢ１抗体がＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２の両方に結合性を示す抗体である、〔１１〕に記載の試薬。
〔１３〕ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくともＨＭＧＢ２抗体を含む、〔１１〕または〔１２〕に記載の試薬。
〔１４〕ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくとも次式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む、〔１１〕または〔１２〕に記載の試薬；
（Ｉ）: MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
（ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）。
〔１５〕免疫試験方法を使用してＨＭＧＢ１を測定または検出するために用いるための〔１１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の試薬。
〔１６〕次式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチドであって、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合を阻害するペプチド：
（Ｉ）: MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
（ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）。
〔１７〕〔１６〕に記載のペプチドを含む試料。
本発明により、試料中のＨＭＧＢ１を特異的に測定または検出する方法および試料中のＨＭＧＢ１を特異的に測定または検出するためのキットおよび試薬が提供された。本発明の方法やキット、試薬は、ＨＭＧＢ２吸収剤（ＨＭＧＢ２抗体および／またはＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合を阻害するＨＭＧＢ２由来ペプチド）の存在下で、ＨＭＧＢ１抗体と試料を接触させることを特徴とする。本発明においては、取得が困難なＨＭＧＢ１特異的抗体ではなく、ＨＭＧＢ２にも結合性を示すＨＭＧＢ１抗体を利用することができる。そのような抗体は、一般的に知られる免疫動物を用いた抗体産生技術により容易に取得することができる。したがって本発明の方法やキット、試薬を用いると、容易かつ簡便に、試料中のＨＭＧＢ１を選択的に検出することが可能である。
また本発明のＨＭＧＢ２吸収剤を構成する物質のうちＨＭＧＢ２抗体とＨＭＧＢ２由来ペプチド(ＩＩ）（CREEHKKKHPDSSVNFAEFS／配列番号：４）は、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合を阻害する効果、またはＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合と競合する効果に加え、ＨＭＧＢ１抗体とＨＭＧＢ１の結合を促進あるいは増幅する効果をも有する。したがってＨＭＧＢ２吸収剤としてＨＭＧＢ２抗体やＨＭＧＢ２由来ペプチド(ＩＩ）を使用する場合、より効率的に、試料中のＨＭＧＢ１を選択的に検出することが可能である。
また本発明のＨＭＧＢ２吸収剤を構成する物質のうちＨＭＧＢ２抗体とＨＭＧＢ２由来ペプチド(ＩＩ）（CREEHKKKHPDSSVNFAEFS／配列番号：４）は、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合を阻害する効果、またはＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合と競合する効果に加え、ＨＭＧＢ１抗体とＨＭＧＢ１の結合を促進あるいは増幅する効果をも有する。したがってＨＭＧＢ２吸収剤としてＨＭＧＢ２抗体やＨＭＧＢ２由来ペプチド(ＩＩ）を使用する場合、より効率的に、試料中のＨＭＧＢ１を選択的に検出することが可能である。
以下、本発明について詳細に説明する。なお、以下に示す実施の形態はあくまでも一例であって、本発明は必ずしも以下の内容に限定されるものではない。
本発明は、ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下でＨＭＧＢ１抗体と試料を接触させる工程を含む、該試料中のＨＭＧＢ１の測定または検出方法に関する。
本発明において試料とは、ＨＭＧＢ１が含まれるもしくは含まれると疑われる溶液を意味する。例えば、ヒトやその他の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、犬、猫、牛、馬、豚、ヤギ、羊、サル（例えば、アカケザル、カニクイザル）、チンパンジー、鶏、ゼブラフィッシュなど）由来の血液、血清、血漿、尿、精液、ずい液、唾液、汗、涙、腹水、羊水など単離された生体試料、あるいはそれらを含む希釈液などを挙げることができるが、これらに限定されない。さらに、ＨＭＧＢ１が含まれるもしくは含まれると疑われる溶液を緩衝液などと混合して得られる溶液も、本発明の試料に含まれる。これらの試料の取得方法は当業者に周知である。混合あるいは希釈する溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。例えば、精製水、生理食塩水、またはトリス緩衝液、リン酸緩衝液もしくはリン酸緩衝液生理食塩水などの各種緩衝液を挙げることができるがこれらに限定されない。さらに、緩衝液のｐＨについても特に限定されず、適宜、好適なｐＨを選択することができる。一般的には、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることができるが、これに限定されない。また溶媒には、被測定物質の構造的な保護を目的として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼインなどのタンパク質、各種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウムもしくは抗生物質などの各種防腐剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等のうち１種または２種以上を適宜含有させてもよい。
本発明において試料とは、ＨＭＧＢ１が含まれるもしくは含まれると疑われる溶液を意味する。例えば、ヒトやその他の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、犬、猫、牛、馬、豚、ヤギ、羊、サル（例えば、アカケザル、カニクイザル）、チンパンジー、鶏、ゼブラフィッシュなど）由来の血液、血清、血漿、尿、精液、ずい液、唾液、汗、涙、腹水、羊水など単離された生体試料、あるいはそれらを含む希釈液などを挙げることができるが、これらに限定されない。さらに、ＨＭＧＢ１が含まれるもしくは含まれると疑われる溶液を緩衝液などと混合して得られる溶液も、本発明の試料に含まれる。これらの試料の取得方法は当業者に周知である。混合あるいは希釈する溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。例えば、精製水、生理食塩水、またはトリス緩衝液、リン酸緩衝液もしくはリン酸緩衝液生理食塩水などの各種緩衝液を挙げることができるがこれらに限定されない。さらに、緩衝液のｐＨについても特に限定されず、適宜、好適なｐＨを選択することができる。一般的には、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることができるが、これに限定されない。また溶媒には、被測定物質の構造的な保護を目的として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼインなどのタンパク質、各種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウムもしくは抗生物質などの各種防腐剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等のうち１種または２種以上を適宜含有させてもよい。
本発明においては、ＨＭＧＢ１の由来は限定されない。本発明においては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、犬、猫、牛、馬、豚、ヤギ、アカケザル、カニクイザル、チンパンジー、鶏、ゼブラフィッシュ等由来のＨＭＧＢ１を測定または検出することができるが、これらに限定されない。
以下に、各々のＨＭＧＢ１のアミノ酸配列のNCBI (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine) databaseにおけるアクセッション番号と、本願明細書における配列番号を示す。
・ヒト[Homo sapiens] CAG33144.1／配列番号：１
・マウス[Mus musculus] AAI10668.1／配列番号：７
・ラット[Rattus norvegicus] NP_037095.1／配列番号：８
・ウサギ[Oryctolagus cuniculus] NP_001164752.1／配列番号：９
・イヌ[Canis lupus familiaris] AAN11319.1／配列番号：１０
・ネコ[Felis catus] XP_006927254.1／配列番号：１１
・ウシ[Bos taurus] AAI02930.1／配列番号：１２
・ウマ[Equus caballus] BAF33339.1／配列番号：１３
・ブタ[Sus scrofa] NP_001004034.1／配列番号：１４
・ヤギ[Capra hircus] XP_005687595.1／配列番号：１５
・アカケザル[Macaca mulatta] AFJ72047.1／配列番号：１６
・カニクイザル[Macaca fascicularis] NP_001270285.1／配列番号：１７
・チンパンジー[Pan troglodytes] XP_509611.1／配列番号：１８
・ニワトリ[Gallus gallus] NP_990233.1／配列番号：１９
・ゼブラフィッシュ[Danio rerio] AAH67193.1／配列番号：２０
以下に、各々のＨＭＧＢ１のアミノ酸配列のNCBI (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine) databaseにおけるアクセッション番号と、本願明細書における配列番号を示す。
・ヒト[Homo sapiens] CAG33144.1／配列番号：１
・マウス[Mus musculus] AAI10668.1／配列番号：７
・ラット[Rattus norvegicus] NP_037095.1／配列番号：８
・ウサギ[Oryctolagus cuniculus] NP_001164752.1／配列番号：９
・イヌ[Canis lupus familiaris] AAN11319.1／配列番号：１０
・ネコ[Felis catus] XP_006927254.1／配列番号：１１
・ウシ[Bos taurus] AAI02930.1／配列番号：１２
・ウマ[Equus caballus] BAF33339.1／配列番号：１３
・ブタ[Sus scrofa] NP_001004034.1／配列番号：１４
・ヤギ[Capra hircus] XP_005687595.1／配列番号：１５
・アカケザル[Macaca mulatta] AFJ72047.1／配列番号：１６
・カニクイザル[Macaca fascicularis] NP_001270285.1／配列番号：１７
・チンパンジー[Pan troglodytes] XP_509611.1／配列番号：１８
・ニワトリ[Gallus gallus] NP_990233.1／配列番号：１９
・ゼブラフィッシュ[Danio rerio] AAH67193.1／配列番号：２０
本発明のＨＭＧＢ１抗体は、ＨＭＧＢ１に対する結合活性を有するものであれば特に限定されない。本発明においては、ＨＭＧＢ１に特異的に結合するＨＭＧＢ１抗体、ＨＭＧＢ１およびＨＭＧＢ２の両方に結合性を示すＨＭＧＢ１抗体のいずれも使用することができるが、後者の抗体が好適に用いられる。
また本発明においては、ＨＭＧＢ１抗体の種類や由来なども限定されない。例えば、Ｍｏｕｓｅ、Ｒａｂｂｉｔ、Ｇｏａｔ等の種々の免疫動物から獲得される抗体が利用できる。また、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体からなる抗血清、モノクローナル抗体、またはこれらの抗体の断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'等）や低分子化抗体（例えば、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ）、ダイアボディー（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ｓｃ（Ｆｖ）２（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ （Ｆｖ）２等）、これらの多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も利用することができる。
例えば、ポリクローナル抗体は、精製したＨＭＧＢ１若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血ぺいを除去することにより調製することが可能である。またモノクローナル抗体は、ＨＭＧＢ１若しくはその一部のペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。
抗体断片は、抗体を酵素で消化して生成させることができる。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知である。あるいは、これら抗体断片をコードするＤＮＡを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる。
ｓｃＦｖは、抗体のＶＨとＶＬとを連結することにより得られる。ｓｃＦｖにおいて、ＶＨとＶＬは、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば３から２５残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。ダイアボディーは、２本のｓｃＦｖから構成されるダイマーである。ｓｃ（Ｆｖ）２は、２つのＶＨおよび２つのＶＬをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である。ｓｃ（Ｆｖ）２は、例えば、２つのｓｃＦｖをリンカーで結ぶことによって作製できる。
本発明のＨＭＧＢ１抗体は、例えば、ＨＭＧＢ２のアミノ酸配列との間で相同性の低いＨＭＧＢ１由来のアミノ酸配列を含む領域を認識する抗体とすることができる。ＨＭＧＢ２との間でアミノ酸配列の相同性の低いＨＭＧＢ１由来のアミノ酸配列を含む領域とは、ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２の間でアミノ酸配列が一致しないアミノ酸配列の領域であって、ＨＭＧＢ１由来のアミノ酸配列を含む領域、あるいはＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２の間で立体構造が異なるアミノ酸配列の領域であってＨＭＧＢ１由来のアミノ酸配列を含む領域と言い換えることもできる。このような領域として、例えば、式（Ｉ'）または（ＩＩ'）に記載のＨＭＧＢ１特異的なアミノ酸配列を含む領域を挙げることができるが、これらに限定されない。
(Ｉ') : MGKGDPKKPRGKMSSYA（配列番号：５／ヒト全長ＨＭＧＢ１（配列番号：１）の１〜１７番目に記載のアミノ酸配列）
(ＩＩ'）: CREEHKKKHPDASVNFSEFS（配列番号：６／ヒト全長ＨＭＧＢ１（配列番号：１）の２３〜４２番目に記載のアミノ酸配列）
(Ｉ') : MGKGDPKKPRGKMSSYA（配列番号：５／ヒト全長ＨＭＧＢ１（配列番号：１）の１〜１７番目に記載のアミノ酸配列）
(ＩＩ'）: CREEHKKKHPDASVNFSEFS（配列番号：６／ヒト全長ＨＭＧＢ１（配列番号：１）の２３〜４２番目に記載のアミノ酸配列）
本発明においては、２種類のＨＭＧＢ１抗体を使用することもできる。その場合、２種類の抗体のいずれもが、ＨＭＧＢ１特異的抗体であってもよいし、ＨＭＧＢ１およびＨＭＧＢ２の両方に結合性を示すＨＭＧＢ１抗体であってもよい。あるいは本発明においては、ＨＭＧＢ１特異的抗体とＨＭＧＢ１およびＨＭＧＢ２の両方に結合性を示すＨＭＧＢ１抗体を組み合わせて使用することもできる。しかし本発明においては、２種類の抗体のいずれも、ＨＭＧＢ１およびＨＭＧＢ２の両方に結合性を示す抗体であることが好ましい。例えば、後述するＥＬＩＳＡ法においては、固相化抗体および酵素標識抗体の両抗体が、ＨＭＧＢ１およびＨＭＧＢ２の両方に結合性を示すＨＭＧＢ１抗体であることが好ましい。
さらに、ＨＭＧＢ１およびＨＭＧＢ２の両方に結合性を示すＨＭＧＢ１抗体は、ＨＭＧＢ１に対する結合の強さとＨＭＧＢ２に対する結合の強さの異同も特に限定されない。例えば、ＨＭＧＢ１に対する結合性とＨＭＧＢ２に対する結合性は同程度であってもよいし、ＨＭＧＢ２よりもＨＭＧＢ１に対して強く結合してもよい。また、２種類のＨＭＧＢ１抗体のうち一方をＨＭＧＢ１に対する結合性とＨＭＧＢ２に対する結合性が同程度のＨＭＧＢ１抗体とし、他方をＨＭＧＢ２よりもＨＭＧＢ１に対して強く結合するＨＭＧＢ１抗体とすることもできる。
さらに、ＨＭＧＢ１およびＨＭＧＢ２の両方に結合性を示すＨＭＧＢ１抗体は、ＨＭＧＢ１に対する結合の強さとＨＭＧＢ２に対する結合の強さの異同も特に限定されない。例えば、ＨＭＧＢ１に対する結合性とＨＭＧＢ２に対する結合性は同程度であってもよいし、ＨＭＧＢ２よりもＨＭＧＢ１に対して強く結合してもよい。また、２種類のＨＭＧＢ１抗体のうち一方をＨＭＧＢ１に対する結合性とＨＭＧＢ２に対する結合性が同程度のＨＭＧＢ１抗体とし、他方をＨＭＧＢ２よりもＨＭＧＢ１に対して強く結合するＨＭＧＢ１抗体とすることもできる。
本発明においてＨＭＧＢ２吸収剤とは、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合を阻害する物質、またはＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合と競合する物質をいう。
本発明の吸収剤は、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合を阻害またはＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合と競合する作用（以下、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害作用）を有する限り特に限定されるものではないが、例えば以下のものを例示することができる。
・ＨＭＧＢ２抗体
・式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含む、または式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列からなる、ＨＭＧＢ２由来のペプチド
(Ｉ) : MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３／ヒト全長ＨＭＧＢ２（配列番号：２）の１〜１７番目に記載のアミノ酸配列）
(ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４／ヒト全長ＨＭＧＢ２（配列番号：２）の２３〜４２番目に記載のアミノ酸配列）
・式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列において１または複数（例えば２、３、４、５又は１０個）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害作用を有するＨＭＧＢ２由来のペプチド
本発明の吸収剤は、これらの抗体またはペプチドの１つまたは複数を含むことができる。
本発明の吸収剤は、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合を阻害またはＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合と競合する作用（以下、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害作用）を有する限り特に限定されるものではないが、例えば以下のものを例示することができる。
・ＨＭＧＢ２抗体
・式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含む、または式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列からなる、ＨＭＧＢ２由来のペプチド
(Ｉ) : MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３／ヒト全長ＨＭＧＢ２（配列番号：２）の１〜１７番目に記載のアミノ酸配列）
(ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４／ヒト全長ＨＭＧＢ２（配列番号：２）の２３〜４２番目に記載のアミノ酸配列）
・式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列において１または複数（例えば２、３、４、５又は１０個）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害作用を有するＨＭＧＢ２由来のペプチド
本発明の吸収剤は、これらの抗体またはペプチドの１つまたは複数を含むことができる。
ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２の同一性は、ヒトの場合、アミノ酸レベルで８１．２％と高く、また、アミノ酸配列の共通する領域も多く認められる（図１３）。ゆえに、ＨＭＧＢ１を通常の方法で免疫して得られるポリクローナル抗体やモノクローナル抗体は、ＨＭＧＢ１のみならず、弱いながらも同一性の高いＨＭＧＢ２にも結合することがある（図１４Ａ）。このような非特異的な結合を防止する方法として、Peptide competition assay (PCA)やblocking peptideと呼ばれる方法がよく使われている。ある抗原のペプチド配列(A)とAの一部が修飾された、もしくは1〜数個のアミノ酸を置換したA'ペプチド配列を持つ抗原が共存している場合に、Aのみを特異的に認識したい場合、Aを認識する抗体のblocking peptideとして、A'ペプチドを反応系に共存させるもしくはA'を認識する抗体とあらかじめ反応させておくことで、Aを認識する抗体がA'と非特異的に結合することを防止する。
ＨＭＧＢ２を認識するＨＭＧＢ２抗体はＨＭＧＢ２に反応し、ＨＭＧＢ１抗体Ａが認識するＨＭＧＢ２に存在するエピトープ類似配列付近をマスクし、もしくはその立体障害により、ＨＭＧＢ１抗体ＡがＨＭＧＢ２に反応するのを阻害する。これにより、ＨＭＧＢ１抗体のＨＭＧＢ１への結合が容易になる（図１４Ｂ）。また、抗体分子は分子量が大きいため、立体障害が起こりやすい。そのため、異なるエピトープを認識するＨＭＧＢ１抗体Ｂ等による非特異的反応が阻害される（図１４Ｂ）。
一方、ＨＭＧＢ２ペプチドは、ＨＭＧＢ２と競合的に働き、ＨＭＧＢ２に対するＨＭＧＢ１抗体ＡがＨＭＧＢ２に結合するのを阻害する。よって、抗ＨＭＧＢ１抗体ＡはＨＭＧＢ１に特異的に反応する（図１４Ｃ）。しかしながら、ＨＭＧＢ２ペプチドは分子量が小さいため、類似したエピトープのみにしか競合阻害効果を発揮できないと考えられる。すなわち、ＨＭＧＢ１抗体Ｂのような抗体は、ペプチドによる阻害が困難である（図１４Ｃ）。その際、抗体のエピトープに近い部分のペプチドを選択した場合、ペプチドによる阻害が可能であると考えられる。
なお、実施例に示すように、ペプチド（ＩＩ）（HM2-2ペプチド）添加群ではＨＭＧＢ１測定において、濃度依存的な反応の上昇が認められた。すなわち本発明のペプチド（ＩＩ）（HM2-2ペプチド）は、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害活性に加え、ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ１抗体の結合の増強効果作用を有する。この増強効果を考察する。ＨＭＧＢ１の立体構造モデルを図１５に示す。クロマチン構造に含まれる非ヒストンタンパク質であるＨＭＧＢ１は、ここに示した３つのヘリックス構造（H1〜H3）で挟み込むようにDNAを結合することが知られている（図１５中の楕円の領域にDNAが結合する）。HM2-2ペプチドは図１５のリボン模型において、斜線部分に該当するペプチドである。また、HM2-2ペプチド領域にはリジン（Ｋ）が多く含まれるドメイン構造が含まれている。このような塩基性アミノ酸であるリジンやアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）が連続または１−２アミノ酸置きに出現する構造はヘパリン（BBXB等: Bは塩基性アミノ酸）やフォスファチジルセリン等、マイナスにチャージした分子（ＨＭＧＢ１結合性阻害物質）が結合しやすい領域である。
ＨＭＧＢ１に結合するDNAやRNA、ヘパリンなどは高分子体である為、ＨＭＧＢ１に対して立体障害を起こしやすいと考えられる。故にＨＭＧＢ１やＨＭＧＢ２の塩基性アミノ酸を含むペプチドは、抗体のエピトープにあまり依存せずにＨＭＧＢ１に対する立体障害を除去できる。その為、HM2-2ペプチドは様々なＨＭＧＢ１抗体の結合を増強させる事ができたと考えられる。
ＨＭＧＢ１に結合する物質による立体障害防止には、ＨＭＧＢ１抗体による反応の特異性を担保するためにも、ＨＭＧＢ２ペプチドを使用する必要がある。ＨＭＧＢ１ペプチドでも結合物質の除去は可能であるが、同時に抗体が結合してしまう恐れがあるためである。
ＨＭＧＢ１に結合する物質による立体障害防止には、ＨＭＧＢ１抗体による反応の特異性を担保するためにも、ＨＭＧＢ２ペプチドを使用する必要がある。ＨＭＧＢ１ペプチドでも結合物質の除去は可能であるが、同時に抗体が結合してしまう恐れがあるためである。
このように本発明においては、HM2-2ペプチドを試料中に共存させることにより、反応系に存在するヘパリン等の微量なＨＭＧＢ１結合性阻害物質にHM2-2ペプチドが結合する。これによりＨＭＧＢ１の立体障害が解消され、抗ＨＭＧＢ１抗体が容易にＨＭＧＢ１に結合できるようになったと考えられる（図１６）。
本発明の吸収剤を構成するＨＭＧＢ２ペプチドは、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害作用に加え、ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ１抗体の結合の増強作用を有していてもよい。このような作用を有するペプチドを用いれば、特に効率よくＨＭＧＢ１を特異的に測定または検出することができる。
本発明の吸収剤を構成するＨＭＧＢ２ペプチドは、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害作用に加え、ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ１抗体の結合の増強作用を有していてもよい。このような作用を有するペプチドを用いれば、特に効率よくＨＭＧＢ１を特異的に測定または検出することができる。
このようなことから、ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２の間のアミノ酸配列の比較の結果同一性が低く、なおかつ、抗原性解析により抗原性の強い領域であることが確認された式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ＨＭＧＢ１抗体に弱く反応し、試料中に含まれるＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体との結合を抑制することが期待される。したがって、このようなペプチドは、ＨＭＧＢ１の抗体を用いたイムノアッセイにおいて、blocking peptideとして利用できる。
本発明においては、ＨＭＧＢ２抗体は、試料中に含まれるＨＭＧＢ２に対し選択的に結合し、その結果、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合が阻害あるいは抑制する。それゆえ、本発明において用いられるＨＭＧＢ２抗体は、ＨＭＧＢ２と結合する性質を有している限り、抗体の種類や由来等は限定されない。例えば、Ｍｏｕｓｅ、Ｒａｂｂｉｔ、Ｇｏａｔ等の種々の免疫動物から獲得される抗体を利用することができる。また、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体からなる抗血清、モノクローナル抗体、または、これらの抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'等のフラグメントや低分子化抗体（例えば、ｓｃＦｖ、ダイアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）２等）も利用可能である。これらは当業者に周知の方法によって取得することができる。
本発明のＨＭＧＢ２抗体は、ＨＭＧＢ２のみに結合性を示す抗体であってもよいし、ＨＭＧＢ２に加えＨＭＧＢ１にも結合性を示す抗体であってもよい。ただし、ＨＭＧＢ１にも結合性を示すＨＭＧＢ２抗体を使用する場合は、ＨＭＧＢ１よりもＨＭＧＢ２に対して大きな結合活性を有する抗体が好適である。抗体の結合活性は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、免疫沈降法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法等、当業者に周知の方法によって測定することができる。
本発明においてＨＭＧＢ２抗体は、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合を阻害できるものである限り、当該抗体が結合するＨＭＧＢ抗原の結合部位は限定されない。しかし、ＨＭＧＢ２抗体のＨＭＧＢ２に対する結合性は、ＨＭＧＢ２抗体のＨＭＧＢ１に対する結合性よりも大きいことが好ましいことから、本発明において使用するＨＭＧＢ２抗体は、式（Ｉ）または（ＩＩ）に示すアミノ酸配列を認識する抗体であることが望ましい。これらのアミノ酸配列は、ＨＭＧＢ１のアミノ酸配列と相同性が少ないため、ＨＭＧＢ２に対する強い抗原性が期待できるためである。
また実施例に示すように、ＨＭＧＢ２抗体Ｎｏ．１および２添加群では、ＨＭＧＢ１測定において、濃度依存的な反応の上昇が認められた。すなわち本発明のＨＭＧＢ２抗体Ｎｏ．１および２は、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害活性に加え、ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ１抗体の結合の増強効果を有する。本発明の吸収剤を構成するＨＭＧＢ２抗体は、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害活性に加え、ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ１抗体の結合の増強作用を有するものであってもよい。
また実施例に示すように、ＨＭＧＢ２抗体Ｎｏ．１および２添加群では、ＨＭＧＢ１測定において、濃度依存的な反応の上昇が認められた。すなわち本発明のＨＭＧＢ２抗体Ｎｏ．１および２は、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害活性に加え、ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ１抗体の結合の増強効果を有する。本発明の吸収剤を構成するＨＭＧＢ２抗体は、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害活性に加え、ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ１抗体の結合の増強作用を有するものであってもよい。
一方本発明のＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害作用を有するＨＭＧＢ２由来のペプチドは、ＨＭＧＢ１の対応する領域との間で一致しないアミノ酸残基を含むペプチドであることが好ましい。当該アミノ酸残基が、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の間の結合阻害に重要と考えられるためである。本発明の式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むＨＭＧＢ２由来のペプチドは、いずれも、ＨＭＧＢ１の対応する領域との間で一致しないアミノ酸を含む。
本発明においては、式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むＨＭＧＢ２由来のペプチドは、例えば３０アミノ酸未満、好ましくは２５アミノ酸未満、より好ましくは２２アミノ酸未満、特に好ましくは２０アミノ酸未満からなる。本発明においては、式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列からなるＨＭＧＢ２由来のペプチドが特に好ましいがこれらに限定されない。
例えば式（Ｉ）で表されるペプチド（配列番号：３）は、７番目のアミノ酸が、ＨＭＧＢ１の対応する領域と異なる（ＨＭＧＢ１ではリジン／Ｋであるのに対し、ＨＭＧＢ２ではアスパラギン／Ｎである）。
また式（ＩＩ）で表されるペプチド（配列番号：４）は、１２番目と１７番目のアミノ酸が、ＨＭＧＢ１の対応する領域と異なる（１２番目については、ＨＭＧＢ１ではアラニン／Ａであるのに対しＨＭＧＢ２ではセリン／Ｓである。１７番目については、ＨＭＧＢ１ではセリン／Ｓであるのに対しＨＭＧＢ２ではアラニン／Ａである）。
また式（ＩＩ）で表されるペプチド（配列番号：４）は、１２番目と１７番目のアミノ酸が、ＨＭＧＢ１の対応する領域と異なる（１２番目については、ＨＭＧＢ１ではアラニン／Ａであるのに対しＨＭＧＢ２ではセリン／Ｓである。１７番目については、ＨＭＧＢ１ではセリン／Ｓであるのに対しＨＭＧＢ２ではアラニン／Ａである）。
本発明における、式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害作用を有するＨＭＧＢ２由来のペプチドは、ＨＭＧＢ１の対応する領域との間で一致しないアミノ酸残基が保存され、それ以外のアミノ酸残基が改変されたペプチドであることが好ましい。
なお、一般に、ペプチドにおける１つまたは複数（例えば３、４、５、又は１０）のアミノ酸の改変（例えば、保存的な置換、欠失、挿入、および／または付加）は、そのペプチドの機能に影響を及ぼさず、または元のタンパク質の機能を強化しさえすることが知られている。アミノ酸は、その側鎖の特徴に応じて、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）に分類される。またアミノ酸の側鎖は、脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、ヒドロキシル基を含む側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子を含む側鎖（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸およびアミドを含む側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基を含む側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、および芳香族を含む側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）に分類することもできる。式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに含まれるアミノ酸を、同じ特徴を有するグループに分類される他のアミノ酸で改変されたペプチドもまた、本発明のＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害作用を有するＨＭＧＢ２由来のペプチドに含まれる。ただし、本発明のＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害作用を有するＨＭＧＢ２由来のペプチドは、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体との結合を抑制する効果を保持する限り、非保存的改変も含んでよい。
ペプチドの獲得方法に関しては、特に限定されない。例えば、ヒトまたは他の動物の体液、細胞、組織もしくは臓器等から、公知の方法によりＨＭＧＢ２を抽出し、目的のペプチドを獲得する方法が挙げられる。また、目的のアミノ酸配列をコードしたＤＮＡ断片をベクターに組み込み、大腸菌等に取り込ませ、ペプチドを産生させるという、遺伝子工学的なペプチド合成方法も利用できる。さらには、ペプチド固相合成法に代表されるペプチド合成方法により、手技もしくは自動合成装置を用いて上記ペプチドを獲得することが可能である。
本発明において、ＨＭＧＢ２吸収剤としてＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害作用を有するＨＭＧＢ２由来ペプチドを使用する場合、ＨＭＧＢ１抗体と当該ペプチドの組み合わせは特に限定されるものではないが、例えばＨＭＧＢ１抗体は、ＨＭＧＢ２由来ペプチドのアミノ酸配列に対応するＨＭＧＢ１上のアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体とすることができる。具体的には、例えば、ＨＭＧＢ２由来ペプチドとしてＨＭＧＢ２上の１〜１７番目のアミノ酸配列を含むペプチドを用いる場合、ＨＭＧＢ１抗体は、ＨＭＧＢ２由来ペプチドのアミノ酸配列に対応するＨＭＧＢ１上のアミノ酸配列、すなわち、ＨＭＧＢ１上の１〜１７番目のアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体とすることができるが、これに限定されない。
ＨＭＧＢ２抗体の濃度や配合量としては、好ましくは０．５〜５００μｇ／ｍｌ、特に好ましくは５〜５０μｇ／ｍｌが挙げられるが、これらに限定されない。
ＨＭＧＢ２由来ペプチドの濃度、配合量としては、好ましくは１０〜１０００μｇ／ｍｌ、特に好ましくは５０〜５００μｇ／ｍｌが挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、ＨＭＧＢ２吸収剤は液状、乾燥状態いずれのものであってもよい。
ＨＭＧＢ２由来ペプチドの濃度、配合量としては、好ましくは１０〜１０００μｇ／ｍｌ、特に好ましくは５０〜５００μｇ／ｍｌが挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、ＨＭＧＢ２吸収剤は液状、乾燥状態いずれのものであってもよい。
本発明においては、上記ＨＭＧＢ２抗体やＨＭＧＢ２由来ペプチドは、緩衝液などと混合あるいは希釈した溶液として使用することもできる。混合あるいは希釈する溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。例えば、精製水、生理食塩水、またはトリス緩衝液、リン酸緩衝液もしくはリン酸緩衝液生理食塩水などの緩衝液や、グッドの緩衝液を挙げることができるが、これらに限定されない。さらに、緩衝液のｐＨについても特に限定されず、適宜、好適なｐＨを選択することができる。一般的に、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることができるがこれに限定されない。また、被測定物質の構造的な保護を目的として、溶媒にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼインなどのタンパク質、各種糖類、ポリマー類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウムもしくは抗生物質などの各種防腐剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等のうち１種または２種以上を適宜含有させてもよい。
ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下でＨＭＧＢ１抗体と試料を接触させる手段もまた、特に限定されない。本発明においては、ＨＭＧＢ２吸収剤、試料、ＨＭＧＢ１抗体をいずれの順番で接触させてもよい。即ち、試料の存在する容器にＨＭＧＢ２吸収剤及びＨＭＧＢ１抗体が加えられてもよい（ＨＭＧＢ２吸収剤とＨＭＧＢ１抗体を加える順序は問わない。例えば試料とＨＭＧＢ１抗体を先に接触させその後にＨＭＧＢ２吸収剤を接触させてもよいし、試料とＨＭＧＢ２吸収剤を先に接触させその後にＨＭＧＢ1抗体を接触させてもよい。ＨＭＧＢ２吸収剤とＨＭＧＢ１抗体を同時に試料と混合してもよい）。
また、ＨＭＧＢ２吸収剤の存在する容器に、試料とＨＭＧＢ１抗体が加えられてもよい（試料とＨＭＧＢ１抗体を加える順序は問わない。例えば、ＨＭＧＢ２吸収剤と試料を先に接触させその後にＨＭＧＢ１抗体と接触させてもよいし、ＨＭＧＢ２吸収剤とＨＭＧＢ１抗体を先に接触させその後に試料と接触させてもよい。あるいは、試料とＨＭＧＢ１抗体を同時にＨＭＧＢ２吸収剤に混合してもよい）。
また、ＨＭＧＢ１抗体の存在する容器にＨＭＧＢ２吸収剤と試料を加えてよい（ＨＭＧＢ２吸収剤と試料を加える順序は問わない。例えば、ＨＭＧＢ１抗体とＨＭＧＢ２吸収剤を先に接触させその後に試料と接触させてもよいし、ＨＭＧＢ１抗体と試料を先に接触させその後にＨＭＧＢ２吸収剤と接触させてもよい。ＨＭＧＢ２吸収剤と試料を同時にＨＭＧＢ１抗体に混合してもよい）。
その他、あらゆる順序を取り得る。
また、ＨＭＧＢ２吸収剤の存在する容器に、試料とＨＭＧＢ１抗体が加えられてもよい（試料とＨＭＧＢ１抗体を加える順序は問わない。例えば、ＨＭＧＢ２吸収剤と試料を先に接触させその後にＨＭＧＢ１抗体と接触させてもよいし、ＨＭＧＢ２吸収剤とＨＭＧＢ１抗体を先に接触させその後に試料と接触させてもよい。あるいは、試料とＨＭＧＢ１抗体を同時にＨＭＧＢ２吸収剤に混合してもよい）。
また、ＨＭＧＢ１抗体の存在する容器にＨＭＧＢ２吸収剤と試料を加えてよい（ＨＭＧＢ２吸収剤と試料を加える順序は問わない。例えば、ＨＭＧＢ１抗体とＨＭＧＢ２吸収剤を先に接触させその後に試料と接触させてもよいし、ＨＭＧＢ１抗体と試料を先に接触させその後にＨＭＧＢ２吸収剤と接触させてもよい。ＨＭＧＢ２吸収剤と試料を同時にＨＭＧＢ１抗体に混合してもよい）。
その他、あらゆる順序を取り得る。
本発明においては、ＨＭＧＢ１の測定または検出方法も特に限定されるものではなく、公知の手法が利用できる。例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、免疫沈降法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法などの免疫試験方法を挙げることができるが、これらに限定されない。また、本発明における測定または検出は、用手法で行ってもよいし、分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
例えば、酵素免疫測定法を用いる場合は、第一のＨＭＧＢ１抗体が固相化されたマイクロプレートと、ＨＭＧＢ２吸収剤、ＨＲＰ等の酵素が修飾された第二のＨＭＧＢ１抗体、洗浄緩衝液、及び発光／発色基質溶液を用いて行うことができる。またＨＭＧＢ１の測定または検出は、第二のＨＭＧＢ１抗体に修飾されている酵素に、その至適条件下で前記酵素の基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法により測定することによって行うことができる。
また、蛍光免疫測定法を用いる場合には、第一のＨＭＧＢ１抗体が固相化された光導波路やマイクロプレートと、ＨＭＧＢ２吸収剤、蛍光物質が修飾された第二のＨＭＧＢ１抗体、洗浄緩衝液を用いて行うことができる。ＨＭＧＢ１の測定または検出は、第二のＨＭＧＢ１抗体に修飾されている蛍光物質に励起光を照射し、その蛍光物質が発する蛍光強度を測定することにより行うことができる。さらに放射免疫測定法を用いる場合には、前述した方法と同様の操作により、放射性物質による放射線量を測定することによって、発光免疫測定法を用いる場合には、発光反応系による発光量を測定することによって、ＨＭＧＢ１を測定または検出することができる。
ウエスタンブロット法やドットブロット法を用いる場合は、電気泳動後の転写膜や直接サンプルをアプライしたメンブレンをBSAやスキムミルクでブロッキングした後、ＨＭＧＢ２吸収剤、ＨＲＰ等の酵素が修飾されたＨＭＧＢ１抗体、洗浄緩衝液、及び発光／発色基質溶液を用いて行うことができる。また、第一のＨＭＧＢ１抗体に対して、酵素や蛍光色素等で直接標識した二次抗体を反応させてもよい。
ＨＭＧＢ１の測定または検出は、ＨＭＧＢ１抗体や二次抗体に修飾されている酵素に、その至適条件下で前記の基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法により測定することにより行うことができる。
ＨＭＧＢ１の測定または検出は、ＨＭＧＢ１抗体や二次抗体に修飾されている酵素に、その至適条件下で前記の基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法により測定することにより行うことができる。
免疫沈降法を用いる場合は、サンプルとＨＭＧＢ１抗体等を反応させる際にBSAやスキムミルク等のブロッキング剤と共にＨＭＧＢ２吸収剤を添加しておくことができる。沈降はＨＭＧＢ１抗体に直接結合させた磁気ビーズやアガロース単体等を用いて行う、もしくはそれらのビーズ等を結合した二次抗体を用いて行うことができる。
また、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法などを用いる場合には、エンドポイント法またはレート法により透過光や散乱光を測定することによりＨＭＧＢ１を測定または検出することができる。そして、イムノクロマトグラフィー法を用いる場合には、テストライン上に現れる標識物質の色を目視的に確認することができる。なお、この目視的に確認する替わりに、分析装置等の機器を用いてもよい。
前記免疫測定方法に用いる固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス、または、磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック、メンブレン、または試験片等の形状の固相担体などを用いることができるが、これらに限定されない。
前記ＨＭＧＢ１抗体の固相化方法としては、公知の固相化方法が利用できる。例えば、物理吸着法としては、抗体と担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させる方法、また、緩衝液などに溶解した抗体と担体を接触させる方法が挙げられるが、これらに限定されない。
また、化学的結合法によりＨＭＧＢ１抗体を固相化する場合も公知の方法に従い調整することができる。例えば、抗体と担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステルまたはマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させて、抗体と担体双方のアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、または水酸基等と反応させる方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、非特異的反応や、ＨＭＧＢ１抗体を固相化させた担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、公知の方法により処理することができる。例えば、抗体を固相化させた担体の表面または内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤または脱脂粉乳等を接触させ、被覆させる方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
前記第二のＨＭＧＢ１抗体への標識物質の修飾方法としては、公知の修飾方法が利用できる。物理吸着法としては、第二のＨＭＧＢ１抗体と標識物質を緩衝液などの溶液中で混合し接触させる方法、緩衝液などに溶解した抗体と標識物質を接触させる方法などが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、標識物質が金コロイドやラテックスである場合は物理吸着法が有効であり、抗体と金コロイドとを緩衝液中で混合し接触させることで、金コロイド標識を有する抗体を得ることができる。
また、化学的結合法により第二のＨＭＧＢ１抗体に標識物質を修飾させる場合には、公知の方法に従い調整することができる。例えば、抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステルまたはマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させて、抗体と標識物質双方のアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、または水酸基等と反応させる方法などが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、標識物質が蛍光物質や酵素、または化学発光物質である場合、化学結合法が有効である。
また、非特異的反応や、標識物質を修飾させた抗体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、公知の方法により処理することができる。例えば、標識物質を結合させた抗体に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤または脱脂粉乳等を接触させ、被覆させる方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
また標識物質としては、酵素免疫測定法の場合、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、またはアミラーゼ等を用いることができるが、これらに限定されない。
また、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリアジンイソチオシアネート、シアニン、またはメロシアニン等を用いることができるが、これらに限定されない。
また、放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５またはヨウ素１３１等を用いることができるが、これらに限定されない。
また、発光免疫測定法の場合には、ルミノール系、ルシフェラーゼ系、アクリジニウムエステル系、またはジオキセタン化合物系等を用いることができるが、これらに限定されない。
また、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法の場合には、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン酸共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、金属コロイド、セラミックス、または磁性体等の材質よりなる微粒子を用いることができるが、これらに限定されない。
また本発明は、ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下でＨＭＧＢ１抗体と試料を接触させる工程を含む該試料中のＨＭＧＢ１の測定または検出方法を使用して該試料中のＨＭＧＢ１を測定または検出する工程を含む、敗血症、もしくは全身性炎症等の敗血症関連疾患の診断方法に関する。本発明の診断方法においては、ＨＭＧＢ１が検出された場合、被験者は敗血症もしくはその関連疾患に罹患していると判定される。本発明においては、ＨＭＧＢ１が検出された被験者に対し公知の敗血症もしくはその関連疾患の治療薬を投与するもしくは公知の治療法を施す工程を含むことができる。
敗血症やその関連疾患の重症度とＨＭＧＢ１の血中濃度の相関性について、今後のさらなる研究が必要であるが、敗血症患者ではＨＭＧＢ１の血中濃度が高い事が知られている（Wang 1999／非特許文献１）。また、ＨＭＧＢ１血中濃度と敗血症の診断基準の一つであるＳＯＦＡスコアやｌａｃｔａｔｅ値、ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ値などと、高い相関性が報告されている（Gibot 2007／非特許文献４）。また、敗血症発症後、死亡しなかった患者では時間経過に伴ってＨＭＧＢ１の血中濃度が低下するが、予後が悪く、発症後死亡した患者では、ＨＭＧＢ１の血中濃度が時間経過に伴って高くなることが報告されている（Gibot 2007／非特許文献４）。また、敗血症患者に血液浄化療法を行ったところ、高かったＨＭＧＢ１濃度が正常にまで回復し、最終的に退院した治療例も報告されている（Nakamura 2011／非特許文献５）。このようにＨＭＧＢ１の血中濃度は様々な治療の開始や離脱に重要な情報となる。
敗血症やその関連疾患の重症度とＨＭＧＢ１の血中濃度の相関性について、今後のさらなる研究が必要であるが、敗血症患者ではＨＭＧＢ１の血中濃度が高い事が知られている（Wang 1999／非特許文献１）。また、ＨＭＧＢ１血中濃度と敗血症の診断基準の一つであるＳＯＦＡスコアやｌａｃｔａｔｅ値、ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ値などと、高い相関性が報告されている（Gibot 2007／非特許文献４）。また、敗血症発症後、死亡しなかった患者では時間経過に伴ってＨＭＧＢ１の血中濃度が低下するが、予後が悪く、発症後死亡した患者では、ＨＭＧＢ１の血中濃度が時間経過に伴って高くなることが報告されている（Gibot 2007／非特許文献４）。また、敗血症患者に血液浄化療法を行ったところ、高かったＨＭＧＢ１濃度が正常にまで回復し、最終的に退院した治療例も報告されている（Nakamura 2011／非特許文献５）。このようにＨＭＧＢ１の血中濃度は様々な治療の開始や離脱に重要な情報となる。
また本発明は、少なくともＨＭＧＢ１抗体を含む第１の試薬およびＨＭＧＢ２吸収剤を含む第２の試薬を含む、試料に含まれるＨＭＧＢ１を測定または検出するためのキットに関する。さらに本発明は、少なくともＨＭＧＢ１抗体を含む第１の試薬およびＨＭＧＢ２吸収剤を含む第２の試薬を含む、敗血症の診断用キットに関する。本発明のこれらのキットは、ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下でＨＭＧＢ１抗体と試料を接触させて使用することを特徴とする。本発明のキットは、ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下で試料中のＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ１抗体の結合が起こるように構成される限り特に限定されない。
前述の通り、ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下でＨＭＧＢ１抗体と試料を接触させる手段は、特に限定されない。例えば、ＨＭＧＢ２吸収剤、試料、ＨＭＧＢ１抗体固相化担体がいずれの順番で加えられてもよく、また、ＨＭＧＢ２吸収剤が液状、あるいは、乾燥状態で加えられてもよい。即ち、試料、ＨＭＧＢ２吸収剤、ＨＭＧＢ１抗体固相化担体のいずれか１つまたは２つを含む容器に、他の２つまたは１つを加えてもよい。この際、他の２つを加える順序は問わず、同時に加えることもできる。また、ＨＭＧＢ２吸収剤、試料、ＨＭＧＢ１抗体固相化担体を同時に接触させることもできる。その他、あらゆる手段を取り得る。
さらに、本発明のキットの構成においては、ＨＭＧＢ２吸収剤をその他の試薬と組み合わせてもよいし、あるいは、固相にあらかじめ付着させておいてもよい。例えば、その他の試薬に組み合わせておく場合、組み合わせる試薬としては、試料中のＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ１抗体の結合に必要な緩衝液、試料希釈液、酵素などの標識物質を含有するＨＭＧＢ１抗体溶液、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、発色などのシグナルの生成に関与する物質を含有する試薬、較正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬などが挙げられる。また、前記固相の例としては、免疫試験キットに用いられる担体や試験紙、マイクロプレート、ガラス板、マイクロチューブ、ろ紙、ポリマー樹脂等を挙げることができる。
本発明においてキットとは、ＨＭＧＢ１の測定または検出に必要な試薬等を含むキットをさす。ＨＭＧＢ１の測定または検出に必要な種々の試薬のセット、ＨＭＧＢ１の測定または検出に必要な種々の試薬を充填した使いきりタイプのキット、複数の試料を同時に測定するためのマイクロプレートタイプの試験キットや、内部に試薬等を含み目視による結果の判定が可能なイムノクロマトグラフィーや、試験紙も、本発明のキットに含まれる。
例えば、使いきりタイプのキットの形態の一例としては、第一のＨＭＧＢ１抗体が固相化された球状や棒状の担体、ＨＭＧＢ２吸収剤、試薬希釈液、ＡＬＰ等の酵素が修飾された第二のＨＭＧＢ１抗体、洗浄液、および発光基質溶液などを、検査容器に充填する構成が考えられるがこれらに限定されない。
検査容器の形状は、試料中のＨＭＧＢ１の測定または検出を行うことができる限り特に限定されるものではない。例えば、反応槽や試薬格納槽が複数並んだ舟型の容器や、板状の基体に溝を設け、反応槽や格納槽を流路で繋いだ流路型の容器が挙げられるがこれに限定されない。また、検査容器の大きさも特に限定されるものではないが、自動分析装置等に組み込んで用いるためには、１０センチメートル×１０センチメートル程度以下の小型であることが望ましい。さらに、反応槽への異物の混入や、試薬格納槽に充填しておいた試薬の蒸発・劣化を避けるために、各槽の上部をシールすることもできる。例えば、アルミニウム箔や高分子フィルム等を検査容器の反応槽と格納槽の上部に接着させる方法があげられる。特に、アルミニウム箔によるシールは、分析装置の穿孔機構や分注チップの先端で容易に開封できるので好ましい。検査容器の素材としては、被測定物質を測定するための反応を阻害しない限り特に限定されるものではない。例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂等が挙げられるがこれらに限定されない。
また、マイクロプレートタイプのキットの形態としては、以下の構成が考えられる。例えば、第一のＨＭＧＢ１抗体が固相化されたマイクロプレートと共に、ＨＭＧＢ２吸収剤、試料希釈液、ＨＲＰ等の酵素が修飾された第二のＨＭＧＢ１抗体、洗浄液、および発色基質溶液などを、それぞれ試薬ボトルとして付属する構成である。また、ＨＭＧＢ２吸収剤を予め試料希釈液に含有させておいても良いし、マイクロプレート上に乾燥状態で付着させておいても良い。
イムノクロマトグラフィーの形態としては、ハウジングケース、サンプルパット、コンジュゲートパット、メンブレンフィルター、吸収パットから構成されるラテラルフローが好適である。また、ラテラルフローは以下の手順により作製される。まず、金コロイドや着色ビーズを標識した第一のＨＭＧＢ１抗体を作製し、これをコンジュゲーションパットに塗布・乾燥させる。一方で、第二のＨＭＧＢ１抗体をメンブレンフィルターのテストライン上に塗布・乾燥させる。さらに、前記第二のＨＭＧＢ１抗体を特異的に認識する第三の抗体をメンブレンフィルターのコントロールライン上に塗布・乾燥させる。最後に、このフィルターに前記コンジュゲーションパット、サンプルパット、吸収パットを貼りつけたものをラテラルフローとする。そして、ＨＭＧＢ２吸収剤を、上記のラテラルフローに付属し、これをイムノクロマト測定試験キットとすることができる。また、ＨＭＧＢ２吸収剤をサンプルパットやコンジュゲートパットに塗布・乾燥させておき、これを前記メンブレンフィルターに貼りつけたものをイムノクロマト測定試験キットとしてもよい。
本発明のさらに具体的な実施形態として、例えば、ＨＭＧＢ２吸収剤を含む溶液とＨＭＧＢ１抗体固相化担体とを含み、試料中のＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ１抗体の結合反応の際に、前記吸収剤の濃度が、ＨＭＧＢ２抗体の場合は５〜５０μｇ／ｍｌ、式（Ｉ）または（ＩＩ）で表わされるペプチドの場合は５０〜５００μｇ／ｍｌとなるようなＨＭＧＢ１の測定または検出用キットを例示できる。このようなキットは、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法など、あらゆる免疫試験に用いることができる。また、それぞれの方法に合わせ、適宜、ＨＭＧＢ１抗体を修飾し、あるいは、担体に固定してもよい。さらに、本発明のキットは、ラテックスビーズ、マイクロチューブ、あるいは、イムノクロマトグラフィー法に用いられる場合は、ハウジングケース、サンプルパット、コンジュゲートパット、メンブレンフィルター、吸収パット、コロイドなどを含むことができる。
あるいは、別の例として、ＨＭＧＢ２吸収剤が付着したＨＭＧＢ１抗体固相化マイクロプレートを含み、試料中のＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ１抗体の結合反応の際に、前記吸収剤の濃度が、ＨＭＧＢ２抗体の場合は５〜５０μｇ／ｍｌ、式（Ｉ）または（ＩＩ）で表わされるペプチドの場合は５０〜５００μｇ／ｍｌとなるようなＨＭＧＢ１の測定または検出用キットを例示できる。このようなキットは、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、等の免疫試験に用いることができる。また、それぞれの方法に合わせ、適宜、ＨＭＧＢ１抗体は修飾されていてもよい。さらに、免疫試験キットは、基質溶液などを含むことができる。
また本発明は、少なくともＨＭＧＢ１抗体およびＨＭＧＢ２吸収剤を含む、試料に含まれるＨＭＧＢ１を測定または検出するための試薬に関する。また本発明は、少なくともＨＭＧＢ１抗体およびＨＭＧＢ２吸収剤を含む、敗血症の診断用試薬に関する。本発明のこれらの試薬は、ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下でＨＭＧＢ１抗体と試料を接触させて使用することを特徴とする。
本発明において、試薬の形状は特に限定されず、前記ＨＭＧＢ２抗体やペプチド、またその両方を含む、溶液であってもよいし、あるいは、それらのタブレット、粉末、容器に付着させた乾燥状態など、目的となる試験にあわせた容量、形状をとることができる。
また本発明は、式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列において１または複数（例えば２、３、４、５又は１０個）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害作用を有するペプチドに関する。
(Ｉ) : MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
(ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）
これらのペプチドは、ＨＭＧＢ１の検出に使用することができる。具体的には、これらのペプチドを含む試料にＨＭＧＢ１抗体（例えば、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１の両方に結合性を示すＨＭＧＢ１抗体）を接触させると、ＨＭＧＢ１のみを特異的に検出することができる。
(Ｉ) : MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
(ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）
これらのペプチドは、ＨＭＧＢ１の検出に使用することができる。具体的には、これらのペプチドを含む試料にＨＭＧＢ１抗体（例えば、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１の両方に結合性を示すＨＭＧＢ１抗体）を接触させると、ＨＭＧＢ１のみを特異的に検出することができる。
さらに本発明は、
上述の式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または
式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列において１または複数（例えば２、３、４、５又は１０個）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害作用を有するペプチド
を含む試料に関する。このような試料もまた、ＨＭＧＢ１抗体（例えば、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１の両方に結合性を示すＨＭＧＢ１抗体）を使用してＨＭＧＢ１のみを特異的に検出するために使用することができる。
上述の式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または
式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列において１または複数（例えば２、３、４、５又は１０個）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合阻害作用を有するペプチド
を含む試料に関する。このような試料もまた、ＨＭＧＢ１抗体（例えば、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１の両方に結合性を示すＨＭＧＢ１抗体）を使用してＨＭＧＢ１のみを特異的に検出するために使用することができる。
また本発明は、ＨＭＧＢ１の測定または検出剤の製造における、ＨＭＧＢ１抗体およびＨＭＧＢ２吸収剤の使用に関する。また本発明は、ＨＭＧＢ１の測定または検出剤の製造におけるＨＭＧＢ１抗体およびＨＭＧＢ２吸収剤の使用であって、ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下で試料とＨＭＧＢ１抗体を接触させる工程を含む使用に関する。
また本発明は、試料中のＨＭＧＢ１の測定または検出に用いるためのＨＭＧＢ１抗体およびＨＭＧＢ２吸収剤に関する。また本発明は、試料中のＨＭＧＢ１の測定または検出に用いるためのＨＭＧＢ１抗体およびＨＭＧＢ２吸収剤であって、ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下で試料とＨＭＧＢ１抗体を接触させる工程を含む、ＨＭＧＢ１抗体およびＨＭＧＢ２吸収剤に関する。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
また本発明は、試料中のＨＭＧＢ１の測定または検出に用いるためのＨＭＧＢ１抗体およびＨＭＧＢ２吸収剤に関する。また本発明は、試料中のＨＭＧＢ１の測定または検出に用いるためのＨＭＧＢ１抗体およびＨＭＧＢ２吸収剤であって、ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下で試料とＨＭＧＢ１抗体を接触させる工程を含む、ＨＭＧＢ１抗体およびＨＭＧＢ２吸収剤に関する。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に制限されるものではない。
実施例１：抗ＨＭＧＢ２抗体を用いた競合ELISA法によるＨＭＧＢ１特異的測定法
ＨＭＧＢ１を特異的に測定するために、抗ＨＭＧＢ２抗体を共存させた競合ELISAを行い、ＨＭＧＢ２に対する非特異的な反応を減少できるかどうか検討した。
96 well ELISA plate (Maxsorp, Nunc)に10μg/mLの抗ＨＭＧＢ１抗体HMa166を100μL加え、定法に従い、固相化し、イムノブロック（DSファーマバイオメディカル）を精製水で5倍希釈したものを200μL分注し、ブロッキングを行った。TBSt (10 mM Tris pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20)で洗浄した後、1,400 ng/mLとなるようにＨＭＧＢ２を加え、室温で２時間反応させ、TBStで洗浄後、HRP標識した抗ＨＭＧＢ１抗体CP11-1を加え、洗浄後、定法に従って発色基質TMBZ（KPL）を加え、リン酸で反応を終了させ、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸収を測定した。また、競合剤として表１に示した市販の抗ＨＭＧＢ２抗体を10μg/mLとなるように反応系に添加し、抗ＨＭＧＢ２抗体による反応の低下を観察した。
ＨＭＧＢ１を特異的に測定するために、抗ＨＭＧＢ２抗体を共存させた競合ELISAを行い、ＨＭＧＢ２に対する非特異的な反応を減少できるかどうか検討した。
96 well ELISA plate (Maxsorp, Nunc)に10μg/mLの抗ＨＭＧＢ１抗体HMa166を100μL加え、定法に従い、固相化し、イムノブロック（DSファーマバイオメディカル）を精製水で5倍希釈したものを200μL分注し、ブロッキングを行った。TBSt (10 mM Tris pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20)で洗浄した後、1,400 ng/mLとなるようにＨＭＧＢ２を加え、室温で２時間反応させ、TBStで洗浄後、HRP標識した抗ＨＭＧＢ１抗体CP11-1を加え、洗浄後、定法に従って発色基質TMBZ（KPL）を加え、リン酸で反応を終了させ、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸収を測定した。また、競合剤として表１に示した市販の抗ＨＭＧＢ２抗体を10μg/mLとなるように反応系に添加し、抗ＨＭＧＢ２抗体による反応の低下を観察した。
ＨＭＧＢ１を免疫して得られたMHa166抗体とCP11-1抗体によるサンドイッチELISAを用いてＨＭＧＢ２を測定したところ、ＨＭＧＢ１特異的では無く、ＨＭＧＢ２にも非特異的に反応することがわかった。1,400 ng/mLのＨＭＧＢ２では0.56の吸光度を示した（図1 吸収剤無し）。しかしながらこの反応系に10 ng/mLの抗ＨＭＧＢ２抗体を共存させたところ、使用した抗体により差は認められたが、吸収剤がない場合に比べて、それぞれ約50%まで吸光度が低下した。抗ＨＭＧＢ２抗体の共存により、非特異的反応が抑えられる効果が認められた。
ＨＭＧＢ２の非特異的反応を吸収する効果のあった市販抗ＨＭＧＢ２抗体が、ＨＭＧＢ１の測定にどのような影響を与えるか調べるために、抗ＨＭＧＢ１抗体MHa166を固相化し、イムノブロック（DSファーマバイオメディカル）を精製水で5倍希釈したものでブロッキングを行った後、HRP標識した抗ＨＭＧＢ１抗体CP11-1を用いて行うELISA系に表1で示した抗ＨＭＧＢ２抗体を10μg/mLとなるように添加した状態で0-50μg/mLのＨＭＧＢ１を用いて検量線を作製し、各抗ＨＭＧＢ２抗体の影響を観察した。
ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２のアミノ酸配列の相同性を考慮した場合、添加した抗HMGB2抗体が一部HMGB1に結合し、立体障害等によりＨＭＧＢ１抗体の結合を妨げるため、見かけ上反応が低下する事が予測されたが、結果、抗ＨＭＧＢ２抗体の添加により、No. 3のＨＭＧＢ２抗体を加えた場合、ＨＭＧＢ１の測定に影響は全く認められなかった（図２）。また、No. 1, No. 2の抗ＨＭＧＢ２抗体を添加した場合は、むしろＨＭＧＢ１の測定値が若干上昇した（図２）。この増幅効果について、詳細は不明であるが、少なくともNo. 3の抗ＨＭＧＢ２抗体はＨＭＧＢ１の測定に影響を与えないことが分かった。
また、ＨＭＧＢ１を免疫して得られたMHa166抗体とCP11-1抗体によるサンドイッチELISAを用いて、0-1,300μg/mLのＨＭＧＢ２を測定し、MHa166抗体とCP11-1抗体によるELISAによってどの程度ＨＭＧＢ２が反応するかを観察した。また、そのように作製したＨＭＧＢ２の検量線に対して抗ＨＭＧＢ２抗体を10μg/mLとなるように添加し、吸収効果が得られるかどうか観察した。
結果、ＨＭＧＢ１を免疫して得られたMHa166抗体とCP11-1抗体によるサンドイッチELISAでも、ＨＭＧＢ２に対する反応が認められ、その反応は162.5 ng/mLのＨＭＧＢ２では約0.26もの吸光値（A450）を示した（図３）。一方、この系に各種抗ＨＭＧＢ２抗体を共存させると、抗体により差は見られたが162.5 ng/mLのＨＭＧＢ２では約0.08にまで吸光値（A450）を低下させることができた。ＨＭＧＢ１の測定に影響を与えず、かつ吸収効果が高かったのはNo. 3の抗ＨＭＧＢ２抗体であった（図2、3）。
実際の生体由来測定サンプルによっては、ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２が混在していることが想定されるが、その際に抗ＨＭＧＢ２抗体を用いて混在するＨＭＧＢ２を吸収し、ＨＭＧＢ１のみ特異的に測定できるか観察した。表２に従って、ＨＭＧＢ１を50 ng/mLから二段階希釈したものと、ＨＭＧＢ２を1820 ng/mLからそれぞれ二段階希釈したものを混合し、擬似的な混在サンプルを作製した。
混在サンプルをNo. 3抗ＨＭＧＢ２抗体の共存、非共存下でMHa166抗体とCP11-1抗体によるサンドイッチELISAにより測定した。結果を図4Aに示す。また、本実験で用いたＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２混合物の120 ng/mL以下のレンジの実験結果を図4Bに詳細に示した。このように、吸収剤がない場合では実際のＨＭＧＢ１の濃度よりも見かけ上、大きな値を示すことがわかった。一方、吸収剤としてNo. 3抗HMBG2抗体を10μg/mLとなるように添加した群では、ＨＭＧＢ２への非特異的反応が抑えられ、ＨＭＧＢ１のみが特異的に測定できることが分かった。
さらに、同様の実験について、ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２混合物（ＨＭＧＢ１/２）に加えて、混合したＨＭＧＢ１と同濃度のＨＭＧＢ１に吸収剤である抗ＨＭＧＢ２抗体を添加した物についても測定し、実際の濃度とどれほどの解離が認められるかを検討した。
図5に示すように、ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２混合物では図4の実験結果と同様、見かけ上高い値を示し、さらに吸収剤として抗ＨＭＧＢ２抗体を添加した場合はＨＭＧＢ２に対する非特異的反応が押さえられた。その際の結果はＨＭＧＢ１のみを測定した値にほぼ一致するか、近い値を示し、ＨＭＧＢ１で作成した検量線にほぼ一致した。これらのことから、抗ＨＭＧＢ２抗体の添加により、ＨＭＧＢ１特異的な測定が可能であることが明らかとなった。
また、標識抗体を変えた場合でも、ＨＭＧＢ２に対する非特異的反応を市販の抗ＨＭＧＢ２抗体が抑制できるかを検討した。96 well ELISA plate (Maxsorp, Nunc)に10μg /mLの抗ＨＭＧＢ１抗体HMa166を固相化し、イムノブロック（DSファーマバイオメディカル）を精製水で5倍希釈したものを200μL分注し、ブロッキングを行った。TBSt (10 mM Tris pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20)で洗浄した後、ＨＭＧＢ１を50 ng/mL もしくはＨＭＧＢ２を1,820 ng/mLとなるように加え、さらに競合剤として市販の抗ＨＭＧＢ２抗体No. 3を最終濃度が10 μg/mLとなるように反応系に添加し、37℃ 2時間反応後、TBStで洗浄し、次いでウサギにヒトＨＭＧＢ１合成ペプチドもしくは組換えヒトＨＭＧＢ１を免疫して得られたＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体No. 12もしくはＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体No. 14をそれぞれHRP標識した物を加え、室温で１時間反応させた。反応後、TBStで洗浄し、定法に従って発色基質TMBZ（KPL）を加え、リン酸で反応を終了させ、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸収を測定し、抗ＨＭＧＢ２抗体による反応の低下を観察した。
結果、No. 12もしくはNo. 14いずれのＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体を標識抗体として用いた場合でも、ＨＭＧＢ１の測定に抗ＨＭＧＢ２抗体は大きな影響を与えなかった（図 6A、図 7A）。一方、高濃度のＨＭＧＢ２を用いた場合、No. 12もしくはNo. 14いずれのポリクローナル抗体の場合でもＨＭＧＢ２に対する非特異的反応が認められたが、抗ＨＭＧＢ２抗体を共存させたところ、その反応はNo. 12ポリクローナル抗体では70%に、No. 14ポリクローナル抗体では82%まで低下し、それぞれ抗ＨＭＧＢ２抗体による吸収効果が得られた。（図 6B、図 7B）
実施例２：ＨＭＧＢ２ペプチドを用いた競合ELISA法によるＨＭＧＢ１特異的測定法
抗リン酸化抗体などを用いた実験の場合、非特異的な反応を防ぐために、あらかじめ抗体とリン酸化されていないペプチドをプレインキュベーションしたり、共存させて使用する方法があり、Peptide Competition Assay (PCA: ペプチド競合法)などと呼ばれている（非特許文献3）。同様の効果を期待して、ＨＭＧＢ２ペプチドの添加によるＨＭＧＢ１の特異的測定が可能であるか検討した。
抗リン酸化抗体などを用いた実験の場合、非特異的な反応を防ぐために、あらかじめ抗体とリン酸化されていないペプチドをプレインキュベーションしたり、共存させて使用する方法があり、Peptide Competition Assay (PCA: ペプチド競合法)などと呼ばれている（非特許文献3）。同様の効果を期待して、ＨＭＧＢ２ペプチドの添加によるＨＭＧＢ１の特異的測定が可能であるか検討した。
ＨＭＧＢ２のアミノ酸配列の内、ＨＭＧＢ１とは異なるアミノ酸配列を含み、抗原性検索により抗原性の強い領域から、6種のペプチドを設計し、内２種のペプチドを実験に用いた。
(Ｉ) : MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）（HM2-1）
(ＩＩ) : CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）（HM2-2）
(Ｉ) : MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）（HM2-1）
(ＩＩ) : CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）（HM2-2）
抗ＨＭＧＢ１抗体MHa166を固相化し、HRP標識した抗ＨＭＧＢ１抗体CP11-1を用いて行うELISA系を用いて、1,820 ng/mLのＨＭＧＢ２によって得られる反応がＨＭＧＢ２ペプチドを0-1.0 mg/mLの濃度となるように共存させた場合、ＨＭＧＢ２による非特異的反応が低下するかどうかを検討した（図8B, 9B）。また、共存させるＨＭＧＢ２ペプチドによるＨＭＧＢ１の測定への影響も12.5 ng/mLのＨＭＧＢ１を用いて同様に行った（図8A, 9A）。
結果、ＨＭＧＢ２ペプチドHM2-1は、ＨＭＧＢ１の測定値にほとんど影響を与えず、濃度依存的にＨＭＧＢ２の非特異的反応が吸収できた。ペプチドを用いて非特異的反応を吸収し、ＨＭＧＢ１特異的な測定ができることが分かった（図8）。
また、ＨＭＧＢ２ペプチドHM2-2は濃度依存的にＨＭＧＢ２の非特異的反応を吸収するだけでなく(図9B)、ＨＭＧＢ１測定において、濃度依存的な反応の上昇が認められた。（図9A）。
次に、CP11-1以外の抗体でも同様の効果が得られるかを検討した。抗ＨＭＧＢ１抗体MHa166を固相化したELISA系に、ウサギにヒトＨＭＧＢ１合成ペプチドもしくは組換えヒトＨＭＧＢ１を免疫して得られたＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体No. 12およびNo. 14をHRP標識し、ＨＭＧＢ２ペプチドを0.5 mg/mLの濃度となるように共存させた場合、50 ng/mLのＨＭＧＢ１によって得られる反応がどのように変化するか検討した（図 10A）。また、共存させるＨＭＧＢ２ペプチドによるＨＭＧＢ２の測定への影響も1,820 ng/mLのＨＭＧＢ２を用いて同様に行った（図10B）。
結果、No.12 ポリクローナル抗体を用いたELISAでは、ＨＭＧＢ２ペプチドHM2-1はＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２共に測定に影響を与えなかったが、ＨＭＧＢ２ペプチドHM2-2の添加群ではＨＭＧＢ１との反応を約1.6倍に増強し、さらにＨＭＧＢ２との反応を減弱し、非特異的反応を押さえた（図 10）。
また、No. 14ポリクローナル抗体を用いた場合、ＨＭＧＢ２ペプチドHM2-1はＨＭＧＢ１の測定には何の影響を与えなかったが、ＨＭＧＢ２ペプチドHM2-2はＨＭＧＢ１の反応性を向上させた（図 11A）。しかしながら、ＨＭＧＢ２に対する中和効果はいずれのペプチドの場合でも見られなかった（図 11B）。
さらに別のモノクローナル抗体を用いた系でも同様の検討を行った。抗ＨＭＧＢ１抗体MHa166を固相化したELISA系にＨＭＧＢ１を免疫して得られたHMa176抗体をHRP標識し、ＨＭＧＢ２ペプチドを0.5 mg/mLの濃度となるように共存させた場合、50 ng/mLのＨＭＧＢ１によって得られる反応がどのように変化するか検討した（図12A）。また、共存させるＨＭＧＢ２ペプチドによるＨＭＧＢ２の測定への影響も1,820 ng/mLのＨＭＧＢ２を用いて同様に行った（図12B）。
結果、HMa176抗体を用いたELISAではＨＭＧＢ２ペプチドHM2-2によるＨＭＧＢ１の反応性向上のみが見られた（図12）。
参考例：実施例１で使用した抗体の調製方法
１．モノクローナル抗体ＣＰ１１−１作製法
ハプテンとしてヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸配列167〜180番のペプチド（KPDAAKKGVVKAEK／配列番号：２１）のＣ末にシステイン（Ｃ）を付加し、システインのＳＨ基を用いて、キャリアーであるＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin）と結合させて作製したハプテン−キャリアータンパク質複合体抗原１００μｇをFreundの完全アジュバント（ＦＣＡ）と共にマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に初回免疫し、１４日後に追加免疫として初回免疫に用いたハプテン−キャリアータンパク質複合体５０μｇをFreundの不完全アジュバント（ＦＩＡ）と共に免疫した。以降１４日間隔で５０μｇのハプテン−キャリアータンパク質複合体をＦＩＡと共に計４回免疫を行った。最終免疫後、脾臓を取り出し、定法に従ってリンパ球を調整し、ミエローマSp2/0-Ag14 (ATCC：CRL-1581)と融合した。融合したハイブリドーマをＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹハイブリドーマクローニングキット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を用いて培養、クローニングを行った。得られたクローンをビアコア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてさらに詳細に検討し、ＣＰ１１−１を選択した。
なお、モノクローナル抗体ＣＰ１１−１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号「ＮＩＴＥ Ｐ−０２０２０」として寄託されている。
１．モノクローナル抗体ＣＰ１１−１作製法
ハプテンとしてヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸配列167〜180番のペプチド（KPDAAKKGVVKAEK／配列番号：２１）のＣ末にシステイン（Ｃ）を付加し、システインのＳＨ基を用いて、キャリアーであるＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin）と結合させて作製したハプテン−キャリアータンパク質複合体抗原１００μｇをFreundの完全アジュバント（ＦＣＡ）と共にマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に初回免疫し、１４日後に追加免疫として初回免疫に用いたハプテン−キャリアータンパク質複合体５０μｇをFreundの不完全アジュバント（ＦＩＡ）と共に免疫した。以降１４日間隔で５０μｇのハプテン−キャリアータンパク質複合体をＦＩＡと共に計４回免疫を行った。最終免疫後、脾臓を取り出し、定法に従ってリンパ球を調整し、ミエローマSp2/0-Ag14 (ATCC：CRL-1581)と融合した。融合したハイブリドーマをＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹハイブリドーマクローニングキット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を用いて培養、クローニングを行った。得られたクローンをビアコア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてさらに詳細に検討し、ＣＰ１１−１を選択した。
なお、モノクローナル抗体ＣＰ１１−１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号「ＮＩＴＥ Ｐ−０２０２０」として寄託されている。
２．モノクローナル抗体ＨＭａ１６６、ＨＭａ１７６の作製法
ｒｈＨＭＧＢ１抗原１００μｇをFreundの完全アジュバント（ＦＣＡ）と共にマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に初回免疫した。１４日後に追加免疫として初ｒｈＨＭＧＢ１抗原５０μｇをFreundの不完全アジュバント（ＦＩＡ）と共に免疫した。以降１４日間隔で５０μｇのｒｈＨＭＧＢ１抗原をＦＩＡと共に計４回免疫を行った。最終免疫後、脾臓を取り出し、定法に従ってリンパ球を調整し、ミエローマSp2/0-Ag14 (ATCC：CRL-1581)と融合した。融合したハイブリドーマを定法に従い、限界希釈法により培養、クローニングを行った。得られたクローンをビアコア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてさらに詳細に検討し、ＨＭａ１６６とＨＭａ１７６を選択した。
なお、モノクローナル抗体ＨＭａ１６６は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号「ＮＩＴＥ Ｐ−０２０２１」として寄託されている。
ｒｈＨＭＧＢ１抗原１００μｇをFreundの完全アジュバント（ＦＣＡ）と共にマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に初回免疫した。１４日後に追加免疫として初ｒｈＨＭＧＢ１抗原５０μｇをFreundの不完全アジュバント（ＦＩＡ）と共に免疫した。以降１４日間隔で５０μｇのｒｈＨＭＧＢ１抗原をＦＩＡと共に計４回免疫を行った。最終免疫後、脾臓を取り出し、定法に従ってリンパ球を調整し、ミエローマSp2/0-Ag14 (ATCC：CRL-1581)と融合した。融合したハイブリドーマを定法に従い、限界希釈法により培養、クローニングを行った。得られたクローンをビアコア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてさらに詳細に検討し、ＨＭａ１６６とＨＭａ１７６を選択した。
なお、モノクローナル抗体ＨＭａ１６６は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号「ＮＩＴＥ Ｐ−０２０２１」として寄託されている。
３．モノクローナル抗体作製の為のスクリーニング法
スクリーニングは各クローンの培養上清を５０μＬのｒｈＨＭＨＢ１（２μｇ/ｍＬ）を定法にて固相化し、精製水で５倍希釈したイムノブロック（DSファーマバイオメディカル）でブロッキングしたＥＬＩＳＡプレ−トに加え、２時間インキュベートした後洗浄し、続いて２次抗体としてＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧを加え、２時間インキュベートした後洗浄し、定法に従って発色基質TMBZ（KPL）を加え、リン酸で反応を終了させ、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸収を測定した。
スクリーニングは各クローンの培養上清を５０μＬのｒｈＨＭＨＢ１（２μｇ/ｍＬ）を定法にて固相化し、精製水で５倍希釈したイムノブロック（DSファーマバイオメディカル）でブロッキングしたＥＬＩＳＡプレ−トに加え、２時間インキュベートした後洗浄し、続いて２次抗体としてＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧを加え、２時間インキュベートした後洗浄し、定法に従って発色基質TMBZ（KPL）を加え、リン酸で反応を終了させ、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸収を測定した。
４．No.12およびNo.14のポリクローナル抗体の作製法
No.12（ＦＰＡｂＨ１２）ポリクローナル抗体はハプテンとしてヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸配列167〜180番のペプチド（KPDAAKKGVVKAEK／配列番号：２１）のＣ末にシステイン（Ｃ）を付加し、システインのＳＨ基を用いて、キャリアーであるＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin）と結合させて作製した抗原０．３ ｍｇをFreundの完全アジュバント（ＦＣＡ）と共にウサギ（ニュージーランドホワイト種）に初回免疫し、１０日後に追加免疫として０．０５ ｍｇの組換えヒトＨＭＧＢ１（ｒｈＨＭＧＢ１）をFreundの不完全アジュバント（ＦＩＡ）と共に免疫した。以降１０日間隔で０．０５ｍｇのｒｈＨＭＧＢ１をＦＩＡと共に計５回免疫を行った。最終免疫後、全血液を採取し、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムで精製し、実験に供した。
No.14（ＦＰＡｂＨ１４）ポリクローナル抗体はｒｈＨＭＧＢ１ ０．１ ｍｇをＦＣＡと共ウサギ（ニュージーランドホワイト種）に初回免疫し、１０日後に追加免疫として０．０５ ｍｇのｒｈＨＭＧＢ１をＦＩＡと共に免疫した。以降１０日間隔で０．０５ｍｇのｒｈＨＭＧＢ１をＦＩＡと共に計５回免疫を行った。最終免疫後、全血液を採取し、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムで精製し、実験に供した。
No.12（ＦＰＡｂＨ１２）ポリクローナル抗体はハプテンとしてヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸配列167〜180番のペプチド（KPDAAKKGVVKAEK／配列番号：２１）のＣ末にシステイン（Ｃ）を付加し、システインのＳＨ基を用いて、キャリアーであるＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin）と結合させて作製した抗原０．３ ｍｇをFreundの完全アジュバント（ＦＣＡ）と共にウサギ（ニュージーランドホワイト種）に初回免疫し、１０日後に追加免疫として０．０５ ｍｇの組換えヒトＨＭＧＢ１（ｒｈＨＭＧＢ１）をFreundの不完全アジュバント（ＦＩＡ）と共に免疫した。以降１０日間隔で０．０５ｍｇのｒｈＨＭＧＢ１をＦＩＡと共に計５回免疫を行った。最終免疫後、全血液を採取し、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムで精製し、実験に供した。
No.14（ＦＰＡｂＨ１４）ポリクローナル抗体はｒｈＨＭＧＢ１ ０．１ ｍｇをＦＣＡと共ウサギ（ニュージーランドホワイト種）に初回免疫し、１０日後に追加免疫として０．０５ ｍｇのｒｈＨＭＧＢ１をＦＩＡと共に免疫した。以降１０日間隔で０．０５ｍｇのｒｈＨＭＧＢ１をＦＩＡと共に計５回免疫を行った。最終免疫後、全血液を採取し、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムで精製し、実験に供した。
本発明により、試料中のＨＭＧＢ１のみを正確に測定または検出する方法および試料中のＨＭＧＢ１のみを正確に測定または検出するためのキットおよび試薬が提供された。本発明の方法やキット、試薬は、試料中のＨＭＧＢ１の選択的な測定または検出に有用である。また本発明の方法やキット、試薬は、敗血症の診断マーカーとして有用である。
Claims (17)
- ＨＭＧＢ２吸収剤の存在下でＨＭＧＢ１抗体と試料を接触させる工程を含む、該試料中のＨＭＧＢ１の測定または検出方法。
- ＨＭＧＢ１抗体がＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２の両方に結合性を示す抗体である、請求項１に記載の方法。
- ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくともＨＭＧＢ２抗体を含む、請求項１または２に記載の方法。
- ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくとも次式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１または２に記載の方法；
（Ｉ）: MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
（ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）。 - ＨＭＧＢ１の測定または検出を免疫試験方法によって行うことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 少なくともＨＭＧＢ１抗体を含む第１の試薬およびＨＭＧＢ２吸収剤を含む第２の試薬を含む、ＨＭＧＢ１の測定または検出用キット。
- ＨＭＧＢ１抗体がＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２の両方に結合性を示す抗体である、請求項６に記載のキット。
- ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくともＨＭＧＢ２抗体を含む、請求項６または７に記載のキット。
- ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくとも次式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項６または７に記載のキット；
（Ｉ）: MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
（ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）。 - 免疫試験方法を使用してＨＭＧＢ１を測定または検出するために用いるための請求項６〜９のいずれかに記載のキット。
- 少なくともＨＭＧＢ１抗体およびＨＭＧＢ２吸収剤を含む、ＨＭＧＢ１の測定または検出用試薬。
- ＨＭＧＢ１抗体がＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２の両方に結合性を示す抗体である、請求項１１に記載の試薬。
- ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくともＨＭＧＢ２抗体を含む、請求項１１または１２に記載の試薬。
- ＨＭＧＢ２吸収剤が少なくとも次式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１１または１２に記載の試薬；
（Ｉ）: MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
（ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）。 - 免疫試験方法を使用してＨＭＧＢ１を測定または検出するために用いるための請求項１１〜１４のいずれかに記載の試薬。
- 次式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むペプチドであって、ＨＭＧＢ２とＨＭＧＢ１抗体の結合を阻害するペプチド：
（Ｉ）: MGKGDPNKPRGKMSSYA（配列番号：３）
（ＩＩ）: CREEHKKKHPDSSVNFAEFS（配列番号：４）。 - 請求項１６に記載のペプチドを含む試料。
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