JPH0552844A - 特異抗体の作成方法 - Google Patents
特異抗体の作成方法Info
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- JPH0552844A JPH0552844A JP21183291A JP21183291A JPH0552844A JP H0552844 A JPH0552844 A JP H0552844A JP 21183291 A JP21183291 A JP 21183291A JP 21183291 A JP21183291 A JP 21183291A JP H0552844 A JPH0552844 A JP H0552844A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 比較的簡便な操作によって交差反応の発生し
難い特異抗体を作成し得る方法を提供する。 【構成】 抗原を動物に免疫して得られたポリクローナ
ル抗体と、該ポリクローナル抗体に対して上記抗原と交
差反応性を有する交差反応性物質とを、溶液中で反応さ
せることにより、ポリクローナル抗体の交差反応を引き
起こす抗原結合部位をブロッキングし、それによって交
差反応性を喪失させる、特異抗体の作成方法。
難い特異抗体を作成し得る方法を提供する。 【構成】 抗原を動物に免疫して得られたポリクローナ
ル抗体と、該ポリクローナル抗体に対して上記抗原と交
差反応性を有する交差反応性物質とを、溶液中で反応さ
せることにより、ポリクローナル抗体の交差反応を引き
起こす抗原結合部位をブロッキングし、それによって交
差反応性を喪失させる、特異抗体の作成方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的測定法等にお
いて用いられる特異抗体の作成方法に関し、より詳細に
は、交差反応性物質による交差反応を回避することを可
能とした特異抗体の作成方法に関する。
いて用いられる特異抗体の作成方法に関し、より詳細に
は、交差反応性物質による交差反応を回避することを可
能とした特異抗体の作成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、免疫反応による診断試薬に用いら
れる抗体として、動物に抗原を免疫し、該免疫された動
物から得られたポリクローナル抗体が多用されていた。
このようにして得られたポリクローナル抗体は、免疫抗
原の任意の抗原決定基に対応した抗原結合部位を有す
る。従って、例えばヒトアルブミンを免疫物質とした場
合のウシアルブミン、あるいはヒト絨毛性ゴナドトロピ
ン（以下、ＨＣＧと略す。）に対する黄体形成ホルモン
（以下、ＬＨと略す。）等のように、免疫物質に対し
て、該免疫物質に類似した物質が存在する場合、上記ポ
リクローナル抗体は、上記のような免疫物質に類似した
物質と交差反応を起こす。
れる抗体として、動物に抗原を免疫し、該免疫された動
物から得られたポリクローナル抗体が多用されていた。
このようにして得られたポリクローナル抗体は、免疫抗
原の任意の抗原決定基に対応した抗原結合部位を有す
る。従って、例えばヒトアルブミンを免疫物質とした場
合のウシアルブミン、あるいはヒト絨毛性ゴナドトロピ
ン（以下、ＨＣＧと略す。）に対する黄体形成ホルモン
（以下、ＬＨと略す。）等のように、免疫物質に対し
て、該免疫物質に類似した物質が存在する場合、上記ポ
リクローナル抗体は、上記のような免疫物質に類似した
物質と交差反応を起こす。
【０００３】従って、ヒトアルブミンやＨＣＧを兎や山
羊等に免疫し、それによって産生されたポリクローナル
抗体の中には、免疫に用いた物質と、免疫に用いた物質
と類似した構造を有する上記のような交差反応性物質と
に共通した抗原決定基に対応した抗原結合部位を有する
抗体も存在する。よって、上記ポリクローナル抗体を診
断に使用した場合、試料中に測定対象抗原と類似した構
造を有する交差反応性物質が存在すると、該交差反応性
物質と交差反応するため、測定対象抗原を正確に測定す
ることができないことがあった。
羊等に免疫し、それによって産生されたポリクローナル
抗体の中には、免疫に用いた物質と、免疫に用いた物質
と類似した構造を有する上記のような交差反応性物質と
に共通した抗原決定基に対応した抗原結合部位を有する
抗体も存在する。よって、上記ポリクローナル抗体を診
断に使用した場合、試料中に測定対象抗原と類似した構
造を有する交差反応性物質が存在すると、該交差反応性
物質と交差反応するため、測定対象抗原を正確に測定す
ることができないことがあった。
【０００４】他方、上記のような交差反応を起こさない
特異抗体を得るために、モノクローナル抗体を使用する
方法も行われている（例えば、特開平２−６６４５８号
公報等）。しかしながら、モノクローナル抗体の作成に
は、多大の労力及び期間を必要とし、価格が大幅に高く
つくという問題があった。また、交差反応性物質をセル
ロース等に固定化したゲルを充填したアフィニティーク
ロマトグラフィーカラムに、前記抗体を通すことによ
り、交差反応する抗体を除去する方法も提案されてい
る。しかしながら、上記のような複雑な操作を必要と
し、しかも収率も十分でなかった。
特異抗体を得るために、モノクローナル抗体を使用する
方法も行われている（例えば、特開平２−６６４５８号
公報等）。しかしながら、モノクローナル抗体の作成に
は、多大の労力及び期間を必要とし、価格が大幅に高く
つくという問題があった。また、交差反応性物質をセル
ロース等に固定化したゲルを充填したアフィニティーク
ロマトグラフィーカラムに、前記抗体を通すことによ
り、交差反応する抗体を除去する方法も提案されてい
る。しかしながら、上記のような複雑な操作を必要と
し、しかも収率も十分でなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上述
した従来法の問題点を解決するものであり、交差反応性
のない特異抗体を比較的簡単な操作により作成し得る方
法を提供することにある。
した従来法の問題点を解決するものであり、交差反応性
のない特異抗体を比較的簡単な操作により作成し得る方
法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の特異抗体の作成
方法は、抗原を動物に免疫して得られたポリクローナル
抗体と、前記ポリクローナル抗体に対して前記抗原と交
差反応性を有する交差反応性物質または該交差反応性物
質の抗原決定基を有する物質とを溶液中で反応させて、
前記ポリクローナル抗体の交差反応を起こす抗原結合部
位をブロッキングすることを特徴とする、特異抗体の作
成方法である。
方法は、抗原を動物に免疫して得られたポリクローナル
抗体と、前記ポリクローナル抗体に対して前記抗原と交
差反応性を有する交差反応性物質または該交差反応性物
質の抗原決定基を有する物質とを溶液中で反応させて、
前記ポリクローナル抗体の交差反応を起こす抗原結合部
位をブロッキングすることを特徴とする、特異抗体の作
成方法である。
【０００７】なお、以下においては、表現の簡略化のた
めに、交差反応性物質なる用語は、交差反応性物質自体
だけでなく、交差反応性物質の抗原決定基を有する物質
をも含むものとして用いることとする。本発明の特異抗
体の作成方法では、上記のように特異抗体の交差反応を
起こす抗原結合部位がブロッキングされるため、交差反
応性物質による交差反応の生じない特異抗体を得ること
ができる。
めに、交差反応性物質なる用語は、交差反応性物質自体
だけでなく、交差反応性物質の抗原決定基を有する物質
をも含むものとして用いることとする。本発明の特異抗
体の作成方法では、上記のように特異抗体の交差反応を
起こす抗原結合部位がブロッキングされるため、交差反
応性物質による交差反応の生じない特異抗体を得ること
ができる。
【０００８】従って、試料中に混在することが予想され
る交差反応性物質と抗体とを溶液中で本発明に従って反
応させることにより、測定対象抗原に対する特異性に優
れた抗体を得ることができ、免疫学的測定法において、
測定対象抗原を正確に検出することができる。以下、本
発明の特異抗体の作成方法の詳細を説明する。
る交差反応性物質と抗体とを溶液中で本発明に従って反
応させることにより、測定対象抗原に対する特異性に優
れた抗体を得ることができ、免疫学的測定法において、
測定対象抗原を正確に検出することができる。以下、本
発明の特異抗体の作成方法の詳細を説明する。
【０００９】本発明において用いられるポリクローナル
抗体は、常法に従って抗原を動物に免疫することにより
産生されるものである。ポリクローナル抗体を得るため
に抗原を免疫する動物種は、特に限定されない。また、
抗原についても、特に限定されないが、多くの交差反応
が予想される物質、例えば薬物、ホルモン類、または血
中蛋白質等、より具体的には、例えばヘモグロビン、ア
ルブミンまたはＨＣＧ等が本発明に好適に用いられる。
抗体は、常法に従って抗原を動物に免疫することにより
産生されるものである。ポリクローナル抗体を得るため
に抗原を免疫する動物種は、特に限定されない。また、
抗原についても、特に限定されないが、多くの交差反応
が予想される物質、例えば薬物、ホルモン類、または血
中蛋白質等、より具体的には、例えばヘモグロビン、ア
ルブミンまたはＨＣＧ等が本発明に好適に用いられる。
【００１０】また、交差反応性物質についても、用いる
抗原に対応する抗体に対して交差反応を生じる物質であ
り、かつ測定試料中に存在が予想される物質が適宜用い
られる。この場合、ポリクローナル抗体と反応される交
差反応性物質は、一種に限定されるものではなく、必要
に応じ複数種であってもよい。本発明では、上記ポリク
ローナル抗体は、交差反応性物質と溶液中で反応され
る。具体的には、ポリクローナル抗体含有緩衝液と、交
差反応性物質を含有する溶液とを４〜５０℃、好ましく
は２０〜４０℃の温度で混合することにより上記反応が
行われる。反応に際してのｐＨは、５〜１０、好ましく
は６〜８とされる。
抗原に対応する抗体に対して交差反応を生じる物質であ
り、かつ測定試料中に存在が予想される物質が適宜用い
られる。この場合、ポリクローナル抗体と反応される交
差反応性物質は、一種に限定されるものではなく、必要
に応じ複数種であってもよい。本発明では、上記ポリク
ローナル抗体は、交差反応性物質と溶液中で反応され
る。具体的には、ポリクローナル抗体含有緩衝液と、交
差反応性物質を含有する溶液とを４〜５０℃、好ましく
は２０〜４０℃の温度で混合することにより上記反応が
行われる。反応に際してのｐＨは、５〜１０、好ましく
は６〜８とされる。
【００１１】本発明の特異抗体の作成方法では、上記の
ようにポリクローナル抗体と交差反応性物質との反応に
より、ポリクローナル抗体の交差反応を起こす抗原結合
部位がブロッキングされる。このように、交差反応性抗
原結合部位がブロッキングされた抗体溶液は、ゲル濾過
またはイオン交換等の簡単な操作を施すことにより、抗
体と、交差反応性物質とを分離し得る。もっとも、上記
分離の必要がない場合には、抗体と、交差反応性物質と
を分離することなく使用してもよい。
ようにポリクローナル抗体と交差反応性物質との反応に
より、ポリクローナル抗体の交差反応を起こす抗原結合
部位がブロッキングされる。このように、交差反応性抗
原結合部位がブロッキングされた抗体溶液は、ゲル濾過
またはイオン交換等の簡単な操作を施すことにより、抗
体と、交差反応性物質とを分離し得る。もっとも、上記
分離の必要がない場合には、抗体と、交差反応性物質と
を分離することなく使用してもよい。
【００１２】上記のようにして得られた特異抗体は、酵
素免疫測定法、ラテックス凝集法または免疫比濁法等の
免疫学的測定手法を用いた臨床検査試薬に好適に用いら
れ、交差反応による測定精度の低下を確実に防止するこ
とができる。
素免疫測定法、ラテックス凝集法または免疫比濁法等の
免疫学的測定手法を用いた臨床検査試薬に好適に用いら
れ、交差反応による測定精度の低下を確実に防止するこ
とができる。
【００１３】
【作用】本発明の特異抗体の作成方法では、予めポリク
ローナル抗体と、該ポリクローナル抗体に対して抗原と
交差反応性を有する交差反応性物質とが溶液中で反応さ
れ、ポリクローナル抗体の交差反応を起こす抗原結合部
位がブロッキングされるため、測定対象抗原に対して優
れた特異性を示す抗体を簡便な操作で得ることができ
る。
ローナル抗体と、該ポリクローナル抗体に対して抗原と
交差反応性を有する交差反応性物質とが溶液中で反応さ
れ、ポリクローナル抗体の交差反応を起こす抗原結合部
位がブロッキングされるため、測定対象抗原に対して優
れた特異性を示す抗体を簡便な操作で得ることができ
る。
【００１４】
【実施例】以下、実施例及び比較例を挙げることによ
り、本発明を明らかにする。実施例１；抗ヒトアルブミン（山羊）抗体 （１）特異抗体の作成方法 ヒトアルブミン（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ社製、以下、ＨＳＡと略す。）を常法に従って山羊に
免疫した。得られた抗血清を硫安塩析により精製し、γ
−グロブリン分画を得た。得られたγ−グロブリン分画
を１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように、０．３Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ＝７．２）により希釈し、γ−グロブリン
（抗ＨＳＡ抗体）溶液を得た。
り、本発明を明らかにする。実施例１；抗ヒトアルブミン（山羊）抗体 （１）特異抗体の作成方法 ヒトアルブミン（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ社製、以下、ＨＳＡと略す。）を常法に従って山羊に
免疫した。得られた抗血清を硫安塩析により精製し、γ
−グロブリン分画を得た。得られたγ−グロブリン分画
を１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように、０．３Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ＝７．２）により希釈し、γ−グロブリン
（抗ＨＳＡ抗体）溶液を得た。
【００１５】他方、ＨＳＡに対して交差反応性を示す物
質として、ウシ血清アルブミン（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ社製、以下、ＢＳＡと略す）を濃度１
ｍｇ／ｍｌとなるように０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝
７．２）により希釈した溶液を作成した。上記γ−グロ
ブリン溶液及びＢＳＡ溶液を１ｍｌずつ分取し、混合
し、３７℃の温度で１時間攪拌し、反応させ、特異抗体
溶液を得た。
質として、ウシ血清アルブミン（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ社製、以下、ＢＳＡと略す）を濃度１
ｍｇ／ｍｌとなるように０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝
７．２）により希釈した溶液を作成した。上記γ−グロ
ブリン溶液及びＢＳＡ溶液を１ｍｌずつ分取し、混合
し、３７℃の温度で１時間攪拌し、反応させ、特異抗体
溶液を得た。
【００１６】（２）特異抗体の評価 ＨＳＡまたはＢＳＡ結合マイクロプレートの作成 ９６穴マイクロプレートを用意し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の
ＨＳＡ溶液またはＢＳＡ溶液を１ウエルあたり３００μ
ｌずつ分注し、３７℃で２時間静置させた。静置後、生
理食塩水でウエルを５回洗浄し、多数のＨＳＡ結合ウエ
ル及びＢＳＡ結合ウエルを作成した。
ＨＳＡ溶液またはＢＳＡ溶液を１ウエルあたり３００μ
ｌずつ分注し、３７℃で２時間静置させた。静置後、生
理食塩水でウエルを５回洗浄し、多数のＨＳＡ結合ウエ
ル及びＢＳＡ結合ウエルを作成した。
【００１７】抗体の特異性のアッセイ 実施例の試料として（１）で作成した特異抗体を用い、
比較例として（１）においてＢＳＡ溶液と反応させる前
のγ−グロブリン溶液を用いた。実施例の特異抗体溶液
を、で作成したＨＳＡ結合ウエル及びＢＳＡ結合ウエ
ルに、５０μｌ滴下した。同様に、比較例のγ−グロブ
リン分画溶液をで作成したＨＳＡ結合ウエル及びＢＳ
Ａ結合ウエルに、同じく５０μｌ滴下した。しかる後、
実施例及び比較例の抗体溶液が滴下されたＨＳＡ結合ウ
エル及びＢＳＡ結合ウエルを３７℃で２時間静置した。
比較例として（１）においてＢＳＡ溶液と反応させる前
のγ−グロブリン溶液を用いた。実施例の特異抗体溶液
を、で作成したＨＳＡ結合ウエル及びＢＳＡ結合ウエ
ルに、５０μｌ滴下した。同様に、比較例のγ−グロブ
リン分画溶液をで作成したＨＳＡ結合ウエル及びＢＳ
Ａ結合ウエルに、同じく５０μｌ滴下した。しかる後、
実施例及び比較例の抗体溶液が滴下されたＨＳＡ結合ウ
エル及びＢＳＡ結合ウエルを３７℃で２時間静置した。
【００１８】静置後、各結合ウエルを、生理食塩水で５
回洗浄した後、０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）
で１０００倍に希釈されたホースラディッシュパーオキ
シダーゼ（以下、ＨＲＰ）標識抗ヤギＩｇＧ（コスモバ
イオ社製）を１００μｌ加えた。しかる後、各結合ウエ
ルを３７℃で１時間静置した後、再度生理食塩水で５回
洗浄した。さらに、生理食塩水で洗浄された各ＨＳＡま
たはＢＳＡ結合ウエルに、オルトフェニレンジアミン
（以下、ＯＰＤ）を０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
２）で濃度２ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した溶液１０
０μｌを加えた。
回洗浄した後、０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）
で１０００倍に希釈されたホースラディッシュパーオキ
シダーゼ（以下、ＨＲＰ）標識抗ヤギＩｇＧ（コスモバ
イオ社製）を１００μｌ加えた。しかる後、各結合ウエ
ルを３７℃で１時間静置した後、再度生理食塩水で５回
洗浄した。さらに、生理食塩水で洗浄された各ＨＳＡま
たはＢＳＡ結合ウエルに、オルトフェニレンジアミン
（以下、ＯＰＤ）を０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
２）で濃度２ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した溶液１０
０μｌを加えた。
【００１９】ブランクとして、抗体を結合させずにＯＰ
Ｄのみを加えたＨＳＡまたはＢＳＡ結合ウエルも用意し
た。上記のようにしてＯＰＤを加えた各ウエルを３７℃
で１５分間静置して発色反応を行い、しかる後１Ｎ硫酸
を１００μｌ加えて発色を停止した。最後に、マイクロ
プレートリーダーによって、４９２ｎｍの波長で発色を
測定した。結果を下記の表１に示す。
Ｄのみを加えたＨＳＡまたはＢＳＡ結合ウエルも用意し
た。上記のようにしてＯＰＤを加えた各ウエルを３７℃
で１５分間静置して発色反応を行い、しかる後１Ｎ硫酸
を１００μｌ加えて発色を停止した。最後に、マイクロ
プレートリーダーによって、４９２ｎｍの波長で発色を
測定した。結果を下記の表１に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】表１から明らかなように、実施例１におい
て作成された特異抗体では、免疫された物質であるヒト
アルブミンを固定したマイクロウエルとは反応している
が、交差反応性物質であるウシ血清アルブミンを固定し
たマイクロウエルとはブランクのウエルの結果と比較す
れば明らかなように、ほとんど反応していないことがわ
かる。これに対して、比較例１では、ヒトアルブミンだ
けでなくウシ血清アルブミンとも反応している。
て作成された特異抗体では、免疫された物質であるヒト
アルブミンを固定したマイクロウエルとは反応している
が、交差反応性物質であるウシ血清アルブミンを固定し
たマイクロウエルとはブランクのウエルの結果と比較す
れば明らかなように、ほとんど反応していないことがわ
かる。これに対して、比較例１では、ヒトアルブミンだ
けでなくウシ血清アルブミンとも反応している。
【００２２】従って、比較例１の抗体においては、免疫
したヒトアルブミンと反応しているだけでなく、ウシ血
清アルブミンとの交差反応をも起こしているのに対し、
実施例１の特異抗体ではヒトアルブミンのみと反応して
いるため、特異性が効果的に高められていることがわか
る。実施例２；抗ヒトＨＣＧ（ウサギ）抗体 （１）特異抗体の作成方法 ヒト絨毛性ゴナドトロピン（コスモバイオ社製、以下Ｈ
ＣＧと略す）を常法に従ってウサギに免疫した。得られ
た抗血清を硫安塩析により精製し、γ−グロブリン分画
を得た。得られたγ−グロブリン分画を濃度５０μｇ／
ｍｌとなるように、０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
２）で希釈した。交差反応性物質としてヒト黄体形成ホ
ルモン（コスモバイオ社製、以下ＬＨ）を濃度５０μｇ
／ｍｌとなるように０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
２）で希釈した溶液を作成した。上記γ−グロブリン溶
液及びＬＨ溶液を、各１ｍｌずつ分取した後、混合し、
３７℃の温度で１時間静置し、特異抗体溶液を調製し
た。
したヒトアルブミンと反応しているだけでなく、ウシ血
清アルブミンとの交差反応をも起こしているのに対し、
実施例１の特異抗体ではヒトアルブミンのみと反応して
いるため、特異性が効果的に高められていることがわか
る。実施例２；抗ヒトＨＣＧ（ウサギ）抗体 （１）特異抗体の作成方法 ヒト絨毛性ゴナドトロピン（コスモバイオ社製、以下Ｈ
ＣＧと略す）を常法に従ってウサギに免疫した。得られ
た抗血清を硫安塩析により精製し、γ−グロブリン分画
を得た。得られたγ−グロブリン分画を濃度５０μｇ／
ｍｌとなるように、０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
２）で希釈した。交差反応性物質としてヒト黄体形成ホ
ルモン（コスモバイオ社製、以下ＬＨ）を濃度５０μｇ
／ｍｌとなるように０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
２）で希釈した溶液を作成した。上記γ−グロブリン溶
液及びＬＨ溶液を、各１ｍｌずつ分取した後、混合し、
３７℃の温度で１時間静置し、特異抗体溶液を調製し
た。
【００２３】（２）抗体の評価 ＨＣＧまたはＬＨ結合マイクロプレートの作成 ９６穴マイクロプレートのウエルに、０．１ｍｇ／ｍｌ
のＨＣＧ溶液またはＬＨ溶液を３００μｌ分注し、３７
℃で２時間静置し、静置後、生理食塩水で５回ウエルを
洗浄した。次に、各ウエルに、１重量％ＢＳＡ水溶液を
３００μｌ分注し、３７℃で２時間静置させ、さらに生
理食塩水で５回洗浄することにより、ＨＣＧ結合ウエル
及びＬＨ結合ウエルを作成した。
のＨＣＧ溶液またはＬＨ溶液を３００μｌ分注し、３７
℃で２時間静置し、静置後、生理食塩水で５回ウエルを
洗浄した。次に、各ウエルに、１重量％ＢＳＡ水溶液を
３００μｌ分注し、３７℃で２時間静置させ、さらに生
理食塩水で５回洗浄することにより、ＨＣＧ結合ウエル
及びＬＨ結合ウエルを作成した。
【００２４】なお、上記と同じ９６穴マイクロプレート
の他のウエルにおいて、前記ＨＣＧまたはＬＨに代え
て、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ水溶液を３００μｌ分注
し、さらに上記と同様に処理することにより、ブランク
測定用ＢＳＡ結合ウエルを作成した。 抗体の特異性のアッセイ 実施例２として、（１）で作成した特異抗体溶液を、比
較例２として（１）においてＬＨ溶液と反応させる前の
γ−グロブリン溶液を用意した。実施例２の特異抗体溶
液を、で作成したＨＣＧ結合ウエル、ＬＨ結合ウエル
及びＢＳＡ結合ウエルにそれぞれ５０μｌずつ滴下し
た。同様に、比較例２のγ−グロブリン溶液について
も、で作成したＨＣＧ結合ウエル、ＬＨ結合ウエル及
びＢＳＡ結合ウエルにそれぞれ５０μｌずつ滴下した。
しかる後、実施例２及び比較例２の抗体溶液がそれぞれ
滴下された各ウエルを３７℃で２時間静置した後、生理
食塩水で５回洗浄し、さらに０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝７．２）で１０００倍に希釈されたＨＲＰ標識抗ウ
サギＩｇＧ（コスモバイオ社製）を１００μｌ加えた。
次に、３７℃で１時間静置した後、各ウエルを生理食塩
水で５回洗浄した。さらに、発色剤として、ＯＰＤを
０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）で濃度２ｍｇ／
ｍｌとなるように溶解して得られた溶液１００μｌを各
ウエルに加えた。ブランクとして抗体を結合させずにＯ
ＰＤのみを加えたＨＣＧ、ＬＨまたはＢＳＡ結合ウエル
も用意した。次に、上記のようにしてＯＰＤを加えた各
ウエルを、３７℃で１５分間静置することにより発色反
応を行い、しかる後１Ｎ硫酸を１００μｌ加えて発色を
停止した。
の他のウエルにおいて、前記ＨＣＧまたはＬＨに代え
て、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ水溶液を３００μｌ分注
し、さらに上記と同様に処理することにより、ブランク
測定用ＢＳＡ結合ウエルを作成した。 抗体の特異性のアッセイ 実施例２として、（１）で作成した特異抗体溶液を、比
較例２として（１）においてＬＨ溶液と反応させる前の
γ−グロブリン溶液を用意した。実施例２の特異抗体溶
液を、で作成したＨＣＧ結合ウエル、ＬＨ結合ウエル
及びＢＳＡ結合ウエルにそれぞれ５０μｌずつ滴下し
た。同様に、比較例２のγ−グロブリン溶液について
も、で作成したＨＣＧ結合ウエル、ＬＨ結合ウエル及
びＢＳＡ結合ウエルにそれぞれ５０μｌずつ滴下した。
しかる後、実施例２及び比較例２の抗体溶液がそれぞれ
滴下された各ウエルを３７℃で２時間静置した後、生理
食塩水で５回洗浄し、さらに０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝７．２）で１０００倍に希釈されたＨＲＰ標識抗ウ
サギＩｇＧ（コスモバイオ社製）を１００μｌ加えた。
次に、３７℃で１時間静置した後、各ウエルを生理食塩
水で５回洗浄した。さらに、発色剤として、ＯＰＤを
０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）で濃度２ｍｇ／
ｍｌとなるように溶解して得られた溶液１００μｌを各
ウエルに加えた。ブランクとして抗体を結合させずにＯ
ＰＤのみを加えたＨＣＧ、ＬＨまたはＢＳＡ結合ウエル
も用意した。次に、上記のようにしてＯＰＤを加えた各
ウエルを、３７℃で１５分間静置することにより発色反
応を行い、しかる後１Ｎ硫酸を１００μｌ加えて発色を
停止した。
【００２５】最後に、上記のようにして発色された各ウ
エルの発色の程度を、実施例１と同様にして測定した。
結果を表２に示す。
エルの発色の程度を、実施例１と同様にして測定した。
結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】表２から明らかなように、実施例２で作成
した抗体は、プレートのブロッキングに用いたＢＳＡや
交差反応性物質として用いたＬＨと反応せず、免疫に用
いたＨＣＧのみと反応していることがわかる。これに対
して、比較例２の抗体では、ブロッキングに用いたＢＳ
Ａとは反応していないが、交差反応性物質であるＬＨと
反応しており、従って特異性が低いことがわかる。
した抗体は、プレートのブロッキングに用いたＢＳＡや
交差反応性物質として用いたＬＨと反応せず、免疫に用
いたＨＣＧのみと反応していることがわかる。これに対
して、比較例２の抗体では、ブロッキングに用いたＢＳ
Ａとは反応していないが、交差反応性物質であるＬＨと
反応しており、従って特異性が低いことがわかる。
【００２８】
【発明の効果】以上のように、本発明によれば、ポリク
ローナル抗体が、交差反応性物質と溶液中で反応され、
該ポリクローナル抗体と交差反応を起こす抗原結合部位
がブロッキングされるため、交差反応性が著しく低めら
れた特異抗体を比較的簡便な操作で得ることができる。
よって、本発明により得られる特異抗体を用いて免疫学
的測定法に使用する試薬を作成すれば、交差反応の影響
を回避して測定対象抗原を高精度に検出することが可能
となる。
ローナル抗体が、交差反応性物質と溶液中で反応され、
該ポリクローナル抗体と交差反応を起こす抗原結合部位
がブロッキングされるため、交差反応性が著しく低めら
れた特異抗体を比較的簡便な操作で得ることができる。
よって、本発明により得られる特異抗体を用いて免疫学
的測定法に使用する試薬を作成すれば、交差反応の影響
を回避して測定対象抗原を高精度に検出することが可能
となる。
Claims (1)
- 【請求項１】 抗原を動物に免疫して得られたポリクロ
ーナル抗体と、前記ポリクローナル抗体に対して前記抗
原と交差反応性を有する交差反応性物質または該交差反
応性物質の抗原決定基を有する物質とを溶液中で反応さ
せて、前記ポリクローナル抗体の交差反応を起こす抗原
結合部位をブロッキングすることを特徴とする、特異抗
体の作成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21183291A JPH0552844A (ja) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | 特異抗体の作成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21183291A JPH0552844A (ja) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | 特異抗体の作成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0552844A true JPH0552844A (ja) | 1993-03-02 |
Family
ID=16612334
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21183291A Pending JPH0552844A (ja) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | 特異抗体の作成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0552844A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017033846A1 (ja) * | 2015-08-21 | 2017-03-02 | 扶桑薬品工業株式会社 | 免疫試験方法および免疫試験キット |
| US11174310B2 (en) | 2016-10-26 | 2021-11-16 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Disulfide-type HMGB1-specific antibody, method for measuring disulfide-type HMGB1 and kit for said measurement, and measurement method capable of quantitating all of HMGB1 molecules including reduced HMGB1, disulfide-type HMGB1 and thrombin-cleavable HMGB1 and kit for said measurement |
-
1991
- 1991-08-23 JP JP21183291A patent/JPH0552844A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017033846A1 (ja) * | 2015-08-21 | 2017-03-02 | 扶桑薬品工業株式会社 | 免疫試験方法および免疫試験キット |
| JPWO2017033846A1 (ja) * | 2015-08-21 | 2018-06-07 | 扶桑薬品工業株式会社 | 免疫試験方法および免疫試験キット |
| US11174310B2 (en) | 2016-10-26 | 2021-11-16 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Disulfide-type HMGB1-specific antibody, method for measuring disulfide-type HMGB1 and kit for said measurement, and measurement method capable of quantitating all of HMGB1 molecules including reduced HMGB1, disulfide-type HMGB1 and thrombin-cleavable HMGB1 and kit for said measurement |
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