JPH08338841A - サンドイッチイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 貴重な抗体の使用量を少なくし、安価で安定
なサンドイッチイムノアッセイ系を提供する。 【構成】 標識操作も限定分解も行わない一次抗体、抗
原性物質および抗原性物質でニワトリを免疫して得られ
るＩｇＹからなる標識二次抗体を反応させて得られるサ
ンドイッチ複合体を、一次抗体とは親和性を有するが、
二次抗体とは親和性を有しない抗体結合物質（ただし、
抗抗体およびアビジンならびにその類似物質を除く）を
担持した不溶性担体と結合させた後、Ｂ／Ｆ分離を行う
ことを特徴とするサンドイッチイムノアッセイ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なサンドイッチイ
ムノアッセイに関する。

【０００２】

【従来の技術】生体成分中の微量の抗原性物質を測定す
る方法としては、抗原抗体反応を利用した様々なイムノ
アッセイが行われている。その一つとして、抗原に少な
くとも２種の異なる抗体を反応させることを特徴とする
サンドイッチ法があり、現在広く利用されている。この
方法では、普通一次抗体を何らかの不溶性担体に結合
し、二次抗体には何らかの標識を行ったものを用いる。
抗原は、固相に結合した一次抗体と標識された二次抗体
との間でサンドイッチ複合体を形成し、最終的には固相
に捕捉された標識物質の量を測定することによって、目
的とする抗原の量を知るというものである。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】固相に一次抗体を結合
させて使用する方法（図２参照）は、生体成分中の微量
の抗原を測定できるが、欠点として固相に用いる抗体が
大量に必要であることが挙げられる。近年、生体成分中
の微量物質の測定技術の進歩は著しく、高感度の測定が
可能となってはきているが、そうなればなるほど抗体を
産生するために使用する免疫用の抗原を手に入れる困難
さは大きくなっている。よって、貴重な抗原を用いて免
疫を行って得た抗体は非常に貴重で高価なものとなり、
できるだけ抗体の使用量を抑えたアッセイ系が求められ
ている。

【０００４】この要望に応えるために、近年固相として
抗抗体やアビジン類（例えばストレプトアビジン）を用
いる方法が開発されている。

【０００５】これらの方法のうち抗抗体を用いる方法
は、固相に一次抗体と反応する抗体（抗一次抗体）を使
用し、その抗体によって抗原抗体反応を起こしたサンド
イッチ複合体（一次抗体−抗原物質−標識二次抗体）を
固相に捕捉しようというものである（図３参照）。一次
抗体と反応する抗体は、抗原に対する抗体と比べて比較
的安価である。しかし、抗一次抗体は一次抗体の様々な
部分と反応するので、反応する部分によっては、本当に
必要とする抗原抗体反応を抑制してしまう可能性があ
る。また、固相に抗一次抗体を使用する系においては、
従来標識抗体（二次抗体）としては一次抗体とは異なる
動物種の抗体を使用するのが常識となっている。しかし
ながら、異なる動物種の抗体を用いた場合も、近縁の種
においては交差反応性が認められる場合があり、抗体の
選定はかなり困難であった。

【０００６】また、アビジン類、例えばストレプトアビ
ジンを固相に用いる方法（図４参照）では、固相に結合
したストレプトアビジンはビオチンとしか反応しないの
で、一次抗体にはビオチンを標識しなければならない
が、標識操作は抗体の安定性を損ねたり、貴重な抗体そ
のものを損失する可能性が大きいので余り良い方法では
ない。できれば抗体を標識操作による修飾をしないで使
用した方がより安定な測定系が組める。

【０００７】本発明は、上記の事情に鑑みなされたもの
で、安価で安定なサンドイッチイムノアッセイ系を提供
することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、標識操作も限
定分解も行わない一次抗体、抗原性物質および抗原性物
質でニワトリを免疫して得られるＩｇＹからなる標識二
次抗体を反応させて得られるサンドイッチ複合体を、一
次抗体とは親和性を有するが、二次抗体とは親和性を有
しない抗体結合物質（ただし、抗抗体およびアビジンな
らびにその類似物質を除く）を担持した不溶性担体と結
合させた後、Ｂ／Ｆ分離を行うことを特徴とするサンド
イッチイムノアッセイを提供する。

【０００９】以下に本発明のサンドイッチイムノアッセ
イ法を詳しく説明する。なお、本発明の方法を図１に模
式図として示す。

【００１０】本発明に使用する一次抗体としては、抗原
性物質を用いてヤギ、ウサギまたはマウスを免疫して得
られるＩｇＧが好適である。また、一次抗体はビオチン
標識等の標識操作及び限定分解などの抗体の安定性を損
なう恐れのある処理は行わなず、自然なままの形で使用
する。このようなＩｇＧは常法により容易に調製でき
る。

【００１１】二次抗体としては、抗原性物質を用いてニ
ワトリを免疫して得られるＩｇＹが好適である。ＩｇＹ
は哺乳類におけるＩｇＧクラスの抗体に相当する卵黄由
来の抗体である。ＩｇＹは哺乳類ＩｇＧと比較していく
つかの異なる性質を有するが、抗体の基本的性質である
抗原認識活性の面では同等である。ＩｇＹは抗原性物質
を用いてニワトリを免疫し、その鶏卵卵黄から移行抗体
として調製できる（例えば、Nippon Nogeikagaku Kaish
i, 68:1457-1462, 1994参照）。

【００１２】二次抗体の標識は公知の技術を使用するこ
とによって行われる。標識物質としては、例えば蛍光色
素、酵素、アイソトープ、発光基質が用いられる。酵素
標識が好ましく、例えば標識用酵素として、アルカリ性
フォスファターゼ（ＡＬＰ）、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼなどを用いる
ことができる。二次抗体の処理については、標識操作だ
けにとどめ、それ以外の操作は行わない。

【００１３】本発明のサンドイッチイムノアッセイにお
いて測定可能な抗原は、ハプテン以外のものならばとく
に制限されない。

【００１４】抗体結合物質としては、一次抗体とは親和
性を有するが、二次抗体とは親和性を有しない物質を用
いることができ、例えばプロテインＡ、プロテインＧ、
またはそれらの抗体結合部位のみを有する物質が好適に
用いられる。プロテインＡおよびプロテインＧはそれぞ
れ、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）および
Ｇ群レンサ球菌（Streptocuccus）の細胞壁タンパク質
で、ヒトや種々の動物のＩｇＧと特異的に結合する性質
を有する。これらの抗体結合タンパク質は、近年遺伝子
操作法によって大量に調製されており、安価で、また品
質的に安定しているので好ましい。また、本発明におい
ては、抗一次抗体やアビジンおよびその類似物質（例え
ばストレプトアビジン）は抗体結合物質に含まない。

【００１５】本発明のサンドイッチイムノアッセイで
は、まず上記抗体結合物質を不溶性担体に担持させる。
不溶性担体への担持には公知技術を用いて行うことがで
き、例えば抗体結合物質を緩衝液、例えば、リン酸緩衝
液やホウ酸緩衝液に溶解して担体に吸着させることなど
により固定することができる。

【００１６】使用できる不溶性担体は、とくに制限され
ず公知のものが使用できる。例えば、マイクロプレー
ト、プラスチック試験管、ラテックス、ガラスビーズ、
ゼラチン、デキストランゲル、赤血球等が挙げられる。

【００１７】次いで、一次抗体、抗原性物質および標識
物質による標識操作のみを行った二次抗体を反応させて
得られるサンドイッチ複合体を、抗体結合物質を担持し
た不溶性担体と結合させる。本発明のサンドイッチイム
ノアッセイにおいては、固相が抗体結合物質を担持した
反応容器である場合は、反応容器内で抗原を含む検体、
一次抗体及び標識二次抗体を混合することによって実施
することができる。また、固相が抗体結合物質を担持し
た粒状物質である場合、抗原を含む検体、一次抗体、標
識二次抗体及び固相を含む液体を混合することによって
実施することができる。反応は室温で実施することがで
きるが、混合物を適当な温度、例えば３７℃で加温する
ことによって反応時間を短くすることができる。

【００１８】このようにして、本発明のサンドイッチイ
ムノアッセイにおいては、水溶液中で抗原と一次抗体及
び標識された二次抗体とが反応して抗原抗体複合体（サ
ンドイッチ複合体）を形成する。次に、複合体を形成し
た一次抗体と固相上の抗体結合物質とが結合する。水溶
液中の余剰の一次抗体及び標識された二次抗体は、公知
手段によって分離（Ｂ／Ｆ分離）される。例えば、界面
活性剤などを含む蒸留水や適当な緩衝液により洗浄して
未結合標識化抗体を除去した後に検出反応を行う。

【００１９】固相上に捕えられた抗原は、二次抗体に結
合した標識物質に応じて適当な検出手段が用いられ、測
定される。例えば、標識用酵素として、アルカリ性フォ
スファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ホースラデ
ィッシュパーオキシダーゼを用いる場合には、それぞれ
の酵素基質であるそれぞれ、ＰＮＰまたは４−メチルウ
ンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）、２−ニトロフェ
ニルーβ−Ｄ−ガラクトシド、過酸化水素と３，３’
５，５’−テトラメチルベンチジンの組み合わせなどを
用いて検出できる。これらの酵素基質は、酵素の作用を
受けて変化することにより変色または発色し、検出され
うる。

【００２０】

【作用】本発明で用いられるプロテインＡやプロテイン
Ｇは、細菌由来の抗体結合タンパクであり、その抗体結
合部位が抗体のＦc 部分と結合する。これらの抗体結合
タンパクは、ヤギ、ウサギまたはマウスを免疫して得ら
れた抗体に対しては親和性を有するが、ニワトリを免疫
して得られるＩｇＹに対しては親和性を有しない。この
ため、ニワトリのＩｇＹを二次抗体として用いると、未
反応の二次抗体が固相に結合することがなく、後の測定
に悪影響を及ぼさない。

【００２１】また、プロテインＡやプロテインＧを担持
させた不溶性担体は測定する抗原性物質の種類を問わず
に使用できる。したがって、このような抗体結合タンパ
ク質を担持させた不溶性担体、例えばマイクロプレート
を用意しておけば、上記した一次抗体および標識二次抗
体を用いてどのような抗原性物質でも測定が可能とな
る。

【００２２】さらに、本発明の方法で二次抗体としてニ
ワトリのＩｇＹを使用すると以下の利点も得られる： （１）ニワトリの特異的抗体生産能力が高い（ニワトリ
１羽が１年間に産卵する鶏卵から約４０ｇのＩｇＹが得
られる）； （２）採血という手段を用いずに採卵という簡単な方法
で抗体原料を集めることができる； （３）鶏卵卵黄中にはＩｇＹのみが存在し、種々のクラ
スの抗体が共存する血清と比較して抗体の精製が容易で
ある； （４）ウサギなどの哺乳類に比べてニワトリでは大量飼
育が可能であり、動物コストや飼料コストも安価であ
る； （５）ニワトリでは鶏病予防のワクシネーションがすで
にシステム化されているので、ケージから出す必要なく
連続的に免疫注射ができる。

【００２３】以下に本発明のサンドイッチイムノアッセ
イの例を詳しく述べるが、本発明の範囲はこれらの実施
例に限定されない。

【００２４】

【実施例】

実施例１ 本発明の方法はここではプロテインＡを結合したプレー
トを作製し、そこに抗ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）ウ
サギ抗体とＢＳＡ及びＢＳＡで免疫したニワトリから得
た卵黄より精製したＩｇＹにアルカリフォスファターゼ
を標識したものを添加する。すると固相のプロテインＡ
にウサギ抗体、ＢＳＡ、酵素標識卵黄抗体が結合しサン
ドイッチ複合体を形成する。洗浄を行うことによって過
剰の酵素標識卵黄抗体を除去した後、残った酵素量をＰ
ＮＰを添加して波長４００ｎｍの吸光度を用いて測定す
る。

【００２５】実施例において測定系に使用した試薬は下
記の通りである。

【００２６】（１）プロテインＡ結合プレート：プロテ
インＡ（ファルマシアバイオテク社製）を10ug/ml にな
るように10mMリン酸緩衝液で希釈し、ＥＩＡ用のマイク
ロプレートに50ulずつ分注した。結合は４℃一夜で行っ
た。その後ミルクカゼインを1mg/mlで含む10mMリン酸緩
衝液を各ウェルに３00ulずつ分注し、プレート表面をコ
ーティングした。

【００２７】（２）抗ＢＳＡウサギ抗体：抗ＢＳＡウサ
ギ抗体は以下の方法によって得た。再結晶化したＢＳＡ
をフロイントの完全アジュバンドと等量混合し、家兎の
皮下に１羽当たり３００μｇ免疫した。２週間ごとに追
加免疫を行い、抗体価が上昇したところで採血を行い実
験に使用した。抗体価のチェックはオクタロニー法で行
い、ＢＳＡと血清が沈降輪を形成することで抗体価の上
昇を確認した。

【００２８】得られた抗血清は、硫酸アンモニウムによ
る塩析を行った後イオン交換クロマトグラフを行いＩｇ
Ｇを精製した。ＢＳＡ特異的なＩｇＧは、ＢＳＡを結合
したアガロースを充填したカラムを用いることによって
得た。精製後の抗ＢＳＡウサギ抗体はミルクカゼイン1m
g/ml 含む50mMリン酸緩衝液中で保存した。

【００２９】このようにして得られた抗ＢＳＡウサギ抗
体をミルクカゼイン1mg/mlを含む10mMリン酸で適当に希
釈して使用した。

【００３０】（３）酵素標識抗ＢＳＡ卵黄抗体：ニワト
リへのＢＳＡの免疫も家兎と同様な方法で行った。得ら
れた鶏卵の卵黄からのＩｇＹの精製法はいくつか報告さ
れており、どの方法を用いても簡単に大量の抗体を得る
ことができる（Nippon Nogeikagaku Kaishi, 68:1457-1
462, 1994参照）。ここでは、カラギーナン法を用いて
卵黄の蛋白を除去した後、イオン交換クロマトグラフを
用いてＩｇＹを精製した。ＢＳＡ特異的なＩｇＹの精製
は家兎と同様なアフィニティークロマトグラフを用い
た。

【００３１】精製したＩｇＹとウシ小腸由来のアルカリ
フォスファターゼ（ＡＬＰ）の結合には２価性試薬であ
るＭＢＳ（マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク
シイミドエステル）を用いた。ＩｇＹとＡＬＰを等モル
混合した溶液に、モル比で１０倍量のＭＢＳを添加し、
室温で２時間反応させた。その後ゲル濾過を行い、酵素
抗体結合物を分離した。これをミルクカゼインを1mg/ml
で含む10mMリン酸緩衝液で適当に希釈して使用した。

【００３２】（４）酵素基質溶液：ＰＮＰ100mMを0.1M
トリス塩酸緩衝液pH9.8に溶解したもの。

【００３３】（５）酵素反応停止液：水酸化ナトリウム
を１Ｎになるように水で希釈したもの。

【００３４】（６）洗浄液：0.1% Tween 20を含む生理
食塩水。

【００３５】上記試薬を用いて以下の方法で測定を実施
した。

【００３６】プロテインＡ結合プレートの各ウェルに抗
ＢＳＡウサギ抗体、酵素標識抗ＢＳＡ卵黄抗体、ＢＳＡ
を種々の濃度で含むサンプル溶液を各々50ul分注する。
３７℃で１時間反応後、液を捨てた後に洗浄液を添加し
プレートを洗浄する。洗浄したプレートに酵素基質溶液
100ulを添加し、３７℃１時間の酵素反応を行う。反応
停止液を50ulを分注してから、波長４００ｎｍで吸光度
を測定した。

【００３７】本発明による吸光度測定を行った結果を図
５に示す。試料中のＢＳＡ量に応じて酵素活性が高くな
り、４００ｎｍにおける吸光度値が高くなることが確認
された。ＢＳＡの1〜100ug／mlが良好に測定できた。

【００３８】

【発明の効果】本発明によれば、どのような抗原を測定
する場合も、固相に使用するのは例えばプロテインＡを
結合したもの１つであり、抗原ごとに変える必要がな
い。一般的な抗体を用いてこの方法を行なうとすると、
酵素標識抗体としてはプロテインＡとの結合部位を除い
たＦ(ab)'やＦ(ab)'₂を使用する必要があり、酵素標識
操作と抗体の限定分解という２つの大きな処理を抗体に
対して行わなければならなくなる。これらの操作は貴重
な抗体の活性を弱めるとともに、最終的に得られる酵素
標識抗体の量も僅かになってしまう。ニワトリ由来の抗
体を使用することにより、酵素を標識する場合も抗体に
対して何も処理しない状態で標識操作を行うことがで
き、抗体活性の損失も抗体量の損失も最低限に防ぐこと
ができる。またニワトリ抗体は卵黄から精製することが
できるので、免疫個体を傷つけることもなく長時間にわ
たって抗体を得ることができ、抗体の安定供給の面から
も有利である。

【００３９】また本発明においては、抗原抗体反応は液
層で起こるため、反応時間が速くなりより短い時間で高
感度な測定が可能になるものと期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法によるサンドイッチイムノアッセ
イを示す模式図である。

【図２】固相に一次抗体を結合させる従来法を示す模式
図である。

【図３】固相に抗一次抗体を結合させる従来法を示す模
式図である。

【図４】固相にアビジン類を結合させる従来法を示す模
式図である。

【図５】本発明によってＢＳＡを測定した結果を示す図
である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標識操作も限定分解も行わない一次抗
   体、抗原性物質および抗原性物質でニワトリを免疫して
   得られるＩｇＹからなる標識二次抗体を反応させて得ら
   れるサンドイッチ複合体を、一次抗体とは親和性を有す
   るが、二次抗体とは親和性を有しない抗体結合物質（た
   だし、抗抗体およびアビジンならびにその類似物質を除
   く）を担持した不溶性担体と結合させた後、Ｂ／Ｆ分離
   を行うことを特徴とするサンドイッチイムノアッセイ。
2. 【請求項２】 抗体結合物質が、プロテインＡ、プロテ
   インＧ、またはそれらの抗体結合部位のみを有する物質
   である請求項１記載のサンドイッチイムノアッセイ。
3. 【請求項３】 一次抗体が、抗原性物質でヤギ、ウサギ
   またはマウスを免疫して得られるＩｇＧである請求項１
   または２記載のサンドイッチイムノアッセイ。
4. 【請求項４】 一次抗体、抗原性物質および標識二次抗
   体を液相中で反応させてサンドイッチ複合体を形成させ
   る請求項１〜３のいずれか１項に記載のサンドイッチイ
   ムイノアッセイ。