KR102156994B1 - Hcv 코어 항원의 신속한 검출을 위한 전처리 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대상체로부터의 샘플 내 간염 C 바이러스 (HCV) 의 코어 폴리펩티드의 검출 방법으로서, (a) 상기 샘플을, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시키는 단계; (b) 상기 샘플을, 결합 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 샘플 내 상기 HCV 의 코어 폴리펩티드를 검출하는 단계를 포함하고; 이때 단계 a) 이후 단계 b) 가 즉시 후속되는 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 HCV 코어 폴리펩티드의 검출을 위한 대상체로부터의 샘플을 전처리하는 방법에 관한 것으로서, (a) 상기 샘플을, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시키고, 임의로는 pH 변화를 유도하는 제제와 접촉시키는 단계, 이후 즉시 (b) 상기 샘플을 결합 화합물과 접촉시키는 단계를 후속시켜 포함하는 방법에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 추가로 상술된 방법과 관련된 용도, 장치, 및 분석 시스템에 관한 것이다.

Description

HCV 코어 항원의 신속한 검출을 위한 전처리 방법
본 발명은 대상체로부터의 샘플 내 간염 C 바이러스 (HCV) 의 코어 (core) 폴리펩티드의 검출 방법으로서, 하기 단계를 포함하고: (a) 상기 샘플을, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시키는 단계; (b) 상기 샘플을, 결합 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 샘플 내 상기 HCV 의 코어 폴리펩티드를 검출하는 단계; 이때, 단계 a) 이후 단계 b) 가 즉시 후속되는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 HCV 코어 폴리펩티드의 검출을 위한 대상체로부터의 샘플을 전처리하는 방법으로서, (a) 상기 샘플을 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와, 및 임의로는 pH 변화를 유도하는 제제와 접촉시키는 단계, 이후 즉시 (b) 상기 샘플을 결합 화합물과 접촉시키는 단계를 후속시켜 포함하는 방법에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 추가로, 상술된 방법들과 관련된 용도, 장치, 및 분석 시스템에 관한 것이다.
간염 C 바이러스 (HCV) 는 플라비비리대 (Flaviviridae) 과의 작은 외피보유 바이러스인, +-가닥, 단일-가닥 RNA 을 게놈으로서 포함하는 속 (genus) 헤파시바이러스 (Hepacivirus) 이다. HCV 입자에서, 코어 단백질은 바이러스성 당단백질 E1 및 E2 를 포함하는 막으로 둘러싸인 캡시드-형 구조를 형성하는 RNA 게놈과 연관된다. HCV 는 적어도 6 또는 7 개의 유전자형을 포함하고, 비-A-비-B (non-A-non-B) 간염으로도 공지되어 있는 간염 C 의 원인 인자로서 동정되었다.
HCV 감염 진단은 통상적으로 혈액-유래 샘플에서 수행되고, 전형적으로는 면역학적으로 바이러스성 코어 단백질을 검출하거나 항-HCV 항체를 검출하거나 또는 양자를 검출하거나, 또는 PCR 로써 바이러스성 게놈을 검출하는 것이다. HCV 를 검출하기 위한, 특히 HCV 코어 폴리펩티드를 검출하기 위한 면역검정에서 일반적으로 중요한 관점은 감염 후 모든 상에서의 감염된 샘플을 확실하게 검출하는 매우 민감하고 매우 특이적인 테스트를 제공하는 것과 동시에 잘못된 결과의 수, 예를 들어 거짓 양성을 가능한 한 적게 유지해야 한다는 점이다. 게다가, 간섭에 대한 취약성도 역시 바람직하지 않은데, 이는 종종 더 비싸고 시간-소모적인 조사를 필연적이게 하는 불분명하거나 잘못된 결과를 초래하기 때문이다. 당업계에서 사용된 면역학적 방법은 세제 및/또는 카오트로픽제 (chaotropic agent) 의 존재 하에서 산성 또는 중성 처리의 다양한 조합을 포함하거나 (EP 0 967 484 A1, EP 1 020 727 A1, EP 1 691 198 A1), 알칼리성 pH 에서 카오트로픽제로 펠릿화된 바이러스 또는 샘플을 처리하거나 (JP 1999178174A; EP 2 327 987 A2; Tanaka et al. (1995), J Hepatol 23: 742), 검정 민감성을 증가시키기 위해 바이러스성 입자를 해체시키는 것을 목표로하였다. 동일한 목적을 위해, 높은 염 농도가 또한 사용되었다 (EP 1 083 428 A2). HCV 를 검출하기 위한 당업계에 공지되어 있는 방법은 완전한 변성을 보장하여, 최적의 민감성을 수득하기 위해, 10 내지 60 분 동안 또는 심지어 그 이상 동안 상기 조건 하에서 샘플을 유지하는 인큐베이션 단계를 포함한다. 그러나, 검정에 인큐베이션 시간을 부가하면 처리량이 감소되고, 이는 특히 현대의 고 처리량 임상 분석에서 바람직하지 않다.
따라서, 선행 기술의 단점을 적어도 일부분 피하면서, 특히 처리량 증가와 관련하여, HCV 를 검출하는 개선된 수단 및 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명의 개요
이 과제는 독립항의 특징을 갖는 본 발명의 수단 및 방법에 의해 해결된다. 단리된 방식으로 또는 어떤 임의의 조합으로 실현될 수 있는 바람직한 구현예가 종속항에 열거된다.
그러므로, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 대상체로부터의 샘플 내 간염 C 바이러스 (HCV) 의 코어 폴리펩티드의 검출 방법에 관한 것이다:
(a) 상기 샘플을, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 샘플을, 결합 화합물과 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 샘플 내 상기 HCV 의 코어 폴리펩티드를 검출하는 단계;
(이때, 단계 a) 이후 단계 b) 가 즉시 후속됨).
하기에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가진다", "포함한다" 또는 "포함된다" 또는 이의 임의의 문법적 변형은 비배타적으로 사용된다. 즉, 이들 용어는 이들 용어들에 의해 도입된 특징 외에, 더 이상의 추가 특징들이 그 문맥에서 기술된 내용에 존재하지 않는 상황 및 하나 이상의 추가 특징이 존재하는 상황 양자 모두를 지칭할 수 있다. 예로서, 표현 "A 는 B 를 가진다", "A 는 B 를 포함한다" 및 "A 에는 B 가 포함된다" 는 B 외에 A 에는 다른 어떠한 요소도 존재하지 않는 상황 (즉, A 가 단독으로 및 배타적으로 B 로 이루어지는 상황), 및 B 외에 하나 이상의 추가 요소가, 예컨대 요소 C, 요소 C 와 D, 또는 심지어 추가 요소들이 개체 A 에 존재하는 상황을 모두 지칭할 수 있다.
나아가, 하기에 이용되는 바와 같이, 용어 "바람직하게", "더 바람직하게", "가장 바람직하게", "특히", "더 특히", "구체적으로", "보다 구체적으로" 또는 유사 용어가 임의의 특징과 함께 추가 가능성을 제외시키지 않으면서 이용된다. 따라서, 이들 용어에 의해 도입된 특징들은 임의의 특징으로 어떠한 식으로든 청구범위의 영역을 제한하지 않는다. 본 발명은 당업자가 인지할 수 있는 바와 같이 대체 특징들을 이용함으로써 수행될 수 있다. 마찬가지로, "본 발명의 구현예에서" 도입된 특징 또는 유사 표현은 본 발명의 추가 구현예에 대해 어떠한 제한도 가하지 않고, 본 발명의 영역에 대해 어떠한 제한도 가하지 않고, 기타 임의의 또는 임의적이지 않은 본 발명의 특징들과 이러한 방식으로 도입된 특징들을 조합할 수 있는 가능성에 대해 어떠한 제한도 가하지 않은 임의적인 특징인 것으로 의도된다. 또한, 달리 지시되지 않는다면, "약"이라는 용어는 관련 분야에서 통상적으로 받아들여지는 기술적인 정밀도를 갖는 표시된 값을 지칭하며, 한 구현예에서는 표시된 값 ± 20% 을 지칭한다.
본 발명의 HCV 의 코어 폴리펩티드를 검출하는 방법은 한 구현예에서 시험관 내 (in vitro) 방법이다. 더욱이, 이는 상기 명시적으로 언급된 것들에 부가적으로 단계들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계는, 예컨대 단계 (a) 에 대한 샘플을 수득하거나, 또는 단계 (b) 에서 측정값 또는 보정된 측정값을 산출하는 것과 관련될 수 있다; 특히, 이 방법은 단계 (a) 에서 상기 샘플을 pH 변화를 유도하는 제제와 접촉시키는 것을 추가적으로 포함할 수 있다. 나아가, 상기 단계들 중 하나 이상은 자동화된 장비에 의해 수행될 수 있다.
따라서, 한 구현예에서, HCV 의 코어 폴리펩티드를 검출하는 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 샘플을, pH 변화를 유도하는 제제 및 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시켜, 상기 샘플, pH 변화를 유도하는 상기 제제 및 상기 계면활성제가 상호 작용되게 하는 반응 혼합물을 생성시키는 단계, 이후 즉시,
(b) 상기 코어 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 적어도 2 개의 결합 화합물을 첨가하고, 하나의 구현예에서는 연속적으로 첨가하고, 이때 상기 적어도 2 개의 결합 화합물 중 적어도 하나는 포획 화합물이고, 상기 적어도 2 개의 결합 화합물 중 적어도 하나는 검출자 화합물인 단계,
(c) 상기 반응 혼합물을 상기 결합 화합물과 혼화함 (admix) 으로써 면역반응 혼화물을 형성하는 단계,
(d) 상기 샘플에 존재하는 상기 코어 폴리펩티드가 적어도 2 개의 결합 화합물과 면역반응하여 면역반응 생성물을 형성하기에 충분한 시간 기간 동안 상기 면역반응 혼화물을 유지하는 단계, 및
(e) 상기 면역반응 생성물 중 임의의 것의 존재 및/또는 농도를 검출하는 단계.
당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 대상체의 샘플에서 바이러스의 코어 폴리펩티드를 검출하는 것은 통상적으로 바이러스의 존재를 가리키는 것일 것이다. 그러므로, 한 구현예에서, HCV 의 코어 폴리펩티드의 검출 방법은 하기 단계를 포함하는, 대상체로부터의 샘플에서 HCV 를 검출하는 방법이다:
(a) 상기 샘플을, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 샘플을, 결합 화합물과 접촉시키는 단계;
(c) 상기 샘플에서 상기 HCV 의 코어 폴리펩티드를 검출하는 단계, 및 이에 의해
(d) 상기 HCV 를 검출하는 단계;
이때, 단계 a) 이후 즉시 단계 b) 가 후속됨.
하나의 구현예에서, 상술된 방법에서, 코어 폴리펩티드는 비크기 차별 검출법 (non-size discriminatory detection method), 즉 하나의 구현예에서 검출된 분석물 (analyte) 의 분자량을 검출하지 않고 상기 코어 폴리펩티드의 특징을 검출하는 방법에 의해 검출된다. 따라서, 하나의 구현예에서, 상술된 방법은 샌드위치 면역검정, 특히 이중 항체 샌드위치 면역검정, 예를 들어 샌드위치 ELISA 또는 샌드위치 ECLIA 를 포함한다.
하나의 구현예에서, HCV 의 코어 폴리펩티드의 검출 방법은 적어도 75%, 하나의 구현예에서, 적어도 80%, 추가 구현예에서, 적어도 85%, 추가 구현예에서, 적어도 90%, 추가 구현예에서, 적어도 95% 의 평균 회수율을 갖고, 이때 용어 회수율은, 본 발명의 방법에 의해 샘플에서 검출된 코어 폴리펩티드의 양 (퍼센트로 표시) 의, 동일한 방법으로, 그러나 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제 및 임의로는 pH 변화를 유도하는 제제와, 그러나 결합 화합물의 부재 하에서의 샘플의 예비인큐베이션 (preincubation) 을 9 분 동안 포함하는 방법으로 검출된 코어 폴리펩티드의 양에 대한 비율에 대한 것이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 회수율은 (결합 화합물의 즉각적인 첨가로 수득된 시그널 / 9 분 예비인큐베이션으로 수득된 시그널 * 100%) 로 산출된다. 하나의 구현예에서, 평균 회수율은 5 개의 HCV 항원 양성 샘플에서 수득된 회수율의 평균으로서 산출된다.
용어 "바이러스"는 당업자에게 자명하다. 용어 "간염 C 바이러스" 또는 "HCV" 는 당업자에게 또한 공지되어 있는 헤파시바이러스 속의 구성원에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, HCV 는 문헌 [Smith et al. (2014), Hepatology 59(1): 318] 에 기술된 HCV 중 하나이다. 추가 구현예에서, HCV 는 특히 Genbank Acc No.: NC_004102.1 GI:22129792 에 명시된 바와 같은 게놈을 갖는 HCV 유전자형 1; 특히 Genbank Acc No.: NC_009823.1 GI:157781212 에 명시된 바와 같은 게놈을 갖는 HCV 유전자형 2; 특히 Genbank Acc No.: NC_009824.1 GI:157781216 에 명시된 바와 같은 게놈을 갖는 HCV 유전자형 3; 특히 Genbank Acc No.: NC_009825.1 GI:157781208 에 명시된 바와 같은 게놈을 갖는 HCV 유전자형 4; 특히 Genbank Acc No.: NC_009826.1 GI:157781210 에 명시된 바와 같은 게놈을 갖는 HCV 유전자형 5; 특히 Genbank Acc No.: NC_009827.1 GI:157781214 에 명시된 바와 같은 게놈을 갖는 HCV 유전자형 6, 또는 특히 Genbank Acc No.: EF108306.2 GI:763907344 에 명시된 바와 같은 게놈을 갖는 HCV 유전자형 7, 특히 유전자형 7a 이다. 추가 구현예에서, HCV 는 HCV 유전자형 1, 특히 Genbank Acc No.: NC_004102.1 GI:22129792 에 명시된 바와 같은 게놈을 갖는 HCV 유전자형 1 이다.
용어 "접촉시키다"는 본 발명의 방법의 문맥 하에서 이용되는 바와 같이 당업자에게 자명하다. 하나의 구현예에서, 이 용어는 본 발명의, 화합물, 특히 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제, 및/또는 pH 변화를 유도하는 제제를, 샘플과 또는 추가 화합물과 물리적으로 접촉시킴으로써, 그 화합물 및 추가 화합물이 상호 작용할 수 있게 허용하는 것에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 용어 "샘플을 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시키다"란, 본원에서 명시된 바와 같은 샘플을 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시키는 것, 즉 희석제로 희석된 샘플 또는 희석되지 않은 샘플을 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시키는 것에 대한 것으로서, 이때 상기 희석제는 본원에서 명시된 바와 같은 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제를 포함하지 않는다. 그러므로, 하나의 구현예에서, 임의로는 침전 단계가 선행된 원심분리에 의해 샘플로부터 펠릿을 수득하고 상기 펠릿을 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시키는 것은, 본 발명에 따른 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 샘플을 접촉시키는 것이 아니다. 본원에서 이용되는 바, 용어 "반응 혼합물"은 제 1 화합물을 제 2 화합물과, 예를 들어, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제를 샘플과 접촉시켜, 상기 제 1 및 제 2 화합물이 반응되게 만드는 임의의 혼합물에 대한 것이다.
용어 "계면활성제"는 본원에서 이용되는 바와 같이, 양친매성 특성을 갖는 화합물 또는 그 화합물들의 혼합물로서, 이들을 포함하는 액체의 표면 장력도 낮추는 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 지칭하며, 이때 하나의 구현예에서 계면활성제는 양이온성 세제를 포함한다. 본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "세제"는 넓은 의미로 사용되며, 계면활성제 성질을 지닌 화합물 또는 혼합물에 관한 것이다. 양이온성 세제는 당업계에 공지되어 있으며, 비제한적으로는 4차 암모늄 세제를 포함한다. 하나의 구현예에서, 양이온성 세제는 헥사데실-트리메틸암모늄 염이고, 하나의 구현예에서는, 헥사데실-트리메틸암모늄클로라이드 (HTAC, CAS Number 112-02-7) 이다. 추가 구현예에서, 계면활성제는 추가로 비이온성 (nonionic) 세제를 포함하고, 즉 계면활성제는 양이온성 세제와 비이온성 세제의 혼합물이다. 하나의 구현예에서, 비이온성 세제는 알킬-글리코시드, 추가 구현예에서 n-알킬-글리코시드, 추가 구현예에서 옥틸글리코시드 (n-옥틸-β-D-글루코시드, CAS Number 29836-26-8) 이다. 하나의 구현예에서, 계면활성제는 상기 양이온성 세제 및 상기 비이온성 세제로 이루어진다.
하나의 구현예에서, 샘플을, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시키는 것은, 상기 샘플을 양이온성 세제와, 0.25% (w/v) 내지 1% (w/v), 하나의 구현예에서, 0.3% (w/v) 내지 0.8% (w/v), 추가 구현예에서, 0.4% (w/v) 내지 0.6% (w/v), 추가 구현예에서, 약 0.5% (w/v), 추가 구현예에서, 0.5% (w/v) 의 농도로 접촉시키는 것을 포함한다. 하나의 구현예에서, 샘플을, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시키는 것은, 상기 샘플을 비이온성 세제와, 적어도 0.1% (w/v), 하나의 구현예에서, 0.1% (w/v) 내지 2.5% (w/v), 추가 구현예에서, 0.12% (w/v) 내지 1.5% (w/v), 추가 구현예에서, 0.15% (w/v) 내지 0.5% (w/v) 의 농도로 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 따라서, 하나의 구현예에서, 샘플을 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시키는 것은, 샘플 2 부를, 0.75% (w/v) 내지 3% (w/v), 하나의 구현예에서, 0.9% (w/v) 내지 2.4% (w/v), 추가 구현예에서, 1.2% (w/v) 내지 1.8% (w/v), 추가 구현예에서, 약 1.5% (w/v), 추가 구현예에서, 1.5% (w/v) 의 농도로 양이온성 세제를 포함하는 전처리 시약 1 부로 희석시키는 것을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 전처리 제제는 추가로 적어도 0.3% (w/v), 하나의 구현예에서, 0.3% (w/v) 내지 7.5%, 추가 구현예에서, 0.36% (w/v) 내지 4.5% (w/v), 추가 구현예에서 0.45% (w/v) 내지 1.5% (w/v) 의 농도의 비이온성 세제를 포함한다.
본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "즉시"는 넓은 의미로 사용되고 5 분 미만의 타임 프레임 (time frame) 에 대한 것이다. 하나의 구현예에서, 즉시는 4 분 미만, 추가 구현예에서, 3 분 미만, 추가 구현예에서, 2 분 미만, 추가 구현예에서, 1 분 미만, 추가 구현예에서, 45 초 미만, 추가 구현예에서, 30 초 미만, 추가 구현예에서, 15 초 미만의 타임 프레임이다. 추가 구현예에서, 용어 즉시는 가능한 한 기술적으로 짧은 타임 프레임에 관한 것이다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 가능한 한 기술적으로 짧은 타임 프레임은, 하나의 구현예에서, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제가 첨가된 후 샘플에 결합 화합물을 첨가하기 위해 조작자 또는 기계가 필요로 하는 기간이며, 상기 기간은 상기 명시된 기간보다 적으며, 특히 1 분 미만, 하나의 구현예에서, 45 초 미만, 추가 구현예에서, 30 초 미만, 추가 구현예에서, 15 초 미만이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 용어 즉시는 결합 화합물의 부재 하에서 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 샘플을 인큐베이션하기 위한 전용 인큐베이션 시간을 포함하지 않는 시간 기간에 대한 것이다. 하나의 구현예에서, 용어 즉시는 1 초 내지 5 분 미만, 하나의 구현예에서, 2 초 내지 1 분, 추가 구현예에서, 5 초 내지 30 분, 추가 구현예에서, 10 초 내지 20 초의 타임 프레임에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 샘플을 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시키는 것과 상기 샘플을 결합 화합물과 접촉시키는 것 사이의 타임 프레임은 상기 계면활성제를 상기 샘플에 첨가하는 것으로부터 출발하고, 상기 결합 화합물을 첨가하는 것으로 마무리된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 코어 폴리펩티드를 검출하는 방법은, 샘플을 pH 변화를 유도하는 제제와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는데, 하나의 구현예에서는 상기 샘플을 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시키기 이전, 이후 및/또는 동시에, 샘플을 pH 변화를 유도하는 제제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 샘플은 pH 변화를 유도하는 상기 제제와, 및 상기 계면활성제와 동시에 접촉된다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 용어 "동시에 접촉시키다"란, 하나의 구현예에서, 샘플, pH 변화를 유도하는 제제 및 계면활성제가 통상의 용액에 본원 어딘가 다른 곳에서 명시된 바와 같은 결합제를 첨가하는데 요구되는 최소한의 시간 동안 존재하는 방식으로, 샘플이 pH 변화를 유도하는 제제와 및 계면활성제와 접촉되는 절차와 관련된다. 이에 따라, 동시 처리는 pH 변화를 유도하는 제제가 즉시 중화되고, 공식적으로 더이상 존재하지 않는 경우를 포함해야 한다. 하나의 구현예에서, 샘플을 pH 변화를 유도하는 제제와 접촉시키는 것, 및 상기 샘플을 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시키는 것은 pH 변화를 유도하는 상기 제제와 양이온성 세제를 포함하는 상기 계면활성제 양자 모두를 포함하는 용액을 상기 샘플에 첨가함으로써 수행된다.
본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "pH 변화"는 적어도 1 pH 단위, 하나의 구현예에서, 적어도 2 pH 단위, 추가 구현예에서, 2 pH 단위 초과의, 샘플 또는 샘플 / 시약 혼합물의 pH 변동에 대한 것이다. 하나의 구현예에서, pH 변화는 2 pH 단위 이상의 샘플 또는 샘플 / 시약 혼합물의 pH 감소, 또는 3 pH 단위 이상의 샘플 또는 샘플 / 시약 혼합물의 pH 증가이다. 하나의 구현예에서, pH 변화는 급격한 pH 변화, 즉 최대 1 분 내에서, 하나의 구현예에서, 최대 10 초 내에서 발생하는 pH 변화이다. 하나의 구현예에서, 수성 용액의 pH 는 DIN EN ISO 10523 (April 2012) 에 따라 결정된다.
용어 "pH 변화를 유도하는 제제"는 본원에서 이용되는 바와 같이 상기 본원에 명시된 바와 같은 pH 변화가 샘플에서 발생되게 하는 화학적 화합물에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, pH 변화를 유도하는 제제는 염기이다. 추가 구현예에서, pH 변화를 유도하는 제제는 산이다.
용어 "염기"는 본원에서 이용되는 바와 같이 수성 용액에서 pH 의 증가를 유도하는 화합물에 대한 것이다. 하나의 구현예에서, 염기는 브론스테드-로리 (Brønsted-Lowry) 염기이다. 추가 구현예에서, 염기는 수성 용액에서 히드록시드 이온을 포함하거나 생성하는 화합물이다. 추가 구현예에서, 염기는 알칼리 금속 히드록시드, 예를 들어, LiOH, NaOH, KOH, 또는 RbOH 이거나; 또는 알칼리 토금속 히드록시드, 예를 들어, Be(OH)2, Mg(OH)2, 또는 Ca(OH)2 이다. 또 다른 구현예에서, 염기는 4 이하, 하나의 구현예에서 3 이하, 추가 구현예에서, 2 이하의 pKB 값을 갖는다. 추가 구현예에서, 염기는 나트륨 히드록시드 또는 칼륨 히드록시드, 특히 칼륨 히드록시드이다.
하나의 구현예에서, 샘플을 염기와 접촉시키는 것은 상기 샘플 내 pH 를 적어도 10.5 로, 추가 구현예에서, 적어도 11.6, 추가 구현예에서, 적어도 11.75, 하나의 구현예에서 적어도 11.9, 추가 구현예에서 적어도 12, 추가 구현예에서 적어도 12.1 로 변화시키는 것을 포함한다. 당업자에게 자명할 바와 같이, 강 알칼리성 pH 는 코어 폴리펩티드를 비롯한 폴리펩티드들의 가수분해를 야기할 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 샘플에서의 pH 는 14 이하, 추가 구현예에서 13.2 이하, 추가 구현예에서 13 이하로 변화된다. 또 다른 구현예에서, 샘플에서의 pH 는 11.75 내지 12.75, 하나의 구현예에서, 11.9 내지 12.6, 추가 구현예에서 12 내지 12.5 로 변화된다. 추가 구현예에서, 샘플을 염기와 접촉시키는 것은 샘플을 상기 지시된 바와 같은 pH 의 버퍼, 하나의 구현예에서, 상기 지시된 바와 같은 pH 에서 일 이상의 pKB 를 갖는 버퍼 화합물을 포함하는 버퍼와 접촉시키는 것이다.
하나의 구현예에서, 샘플을 염기와 접촉시키는 것은 상기 샘플을, 하나의 구현예에서 염기의 수성 용액과 접촉시키는 것을 포함하며, 이때 상기 용액 중 상기 염기의 농도는 0.1 mol/l 내지 1 mol/l, 하나의 구현예에서, 0.15 mol/l 내지 0.5 mol/l, 하나의 구현예에서, 0.2 mol/l 내지 0.3 mol/l, 하나의 구현예에서, 약 0.25 mol/l, 하나의 구현예에서, 0.25 mol/l 이다. 하나의 구현예에서, 샘플 및 염기의 용액은 이러한 경우에는 약 2 : 1 (샘플 : 염기 용액) 의 비로, 추가 구현예에서 2 : 1 (샘플 : 염기 용액) 의 비로 혼합된다. 따라서, 하나의 구현예에서, 샘플을 염기와 접촉시키는 것은, 상기 염기를 상기 샘플에 0.05 mol/l 내지 0.17 mol/l, 하나의 구현예에서, 0.07 mol/l 내지 0.09 mol/l 의 최종 농도까지 첨가하는 것을 포함한다.
용어 "산"은 넓은 의미로 본원에서 사용되고, 수성 용액 중 pH 의 감소를 유도하는 모든 화합물을 포함한다. 따라서, 용어 산은 하나의 구현예에서, 그 용어의 고전적 의미의 산뿐 아니라 산성 pH 를 갖는 버퍼도 포함한다. 하나의 구현예에서, 산은 브론스테드-로리산이다. 추가 구현예에서, 산은 수성 용액 중 부가적인 옥소늄 이온 (히드로늄 이온) 을 포함하거나 생성하는 화합물이다. 추가 구현예에서, 산은 본원 다른 곳에 명시된 바와 같은 산성 pH 를 갖는 유기 또는 무기 버퍼이다. 또 다른 구현예에서, 산성 버퍼는 6 이하, 하나의 구현예에서 5.5 이하, 추가 구현예에서 5 이하의 pKA 값을 가진다. 하나의 구현예에서, 산, 특히 산성 버퍼는 6 이하, 하나의 구현예에서 5.5 이하, 추가 구현예에서 5 이하의 pH 를 가진다. 추가 구현예에서, 산은 포스페이트 버퍼, 하나의 구현예에서, 산성 pH, 특히 6 이하, 하나의 구현예에서 5.5 이하, 추가 구현예에서 5 이하의 pH 를 갖는 칼륨 포스페이트 버퍼이다.
하나의 구현예에서, 샘플을 산과 접촉시키는 것은 상기 샘플에서 pH 를 6 이하, 추가 구현예에서 5.5 이하, 추가 구현예에서 5 이하로 변화시키는 것을 포함한다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 강 산성 pH 는 코어 폴리펩티드를 비롯한 폴리펩티드들의 가수분해를 야기할 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 상기 샘플에서의 pH 는 적어도 2, 추가 구현예에서 적어도 3, 추가 구현예에서 적어도 4 로 변화된다. 또 다른 구현예에서, 샘플에서의 pH 는 3 내지 6, 하나의 구현예에서 4 내지 5.75, 추가 구현예에서 4.5 내지 5.5 의 pH 로 변화된다. 추가 구현예에서, 샘플을 산과 접촉시키는 것은 샘플을 상기 지시된 바와 같이 샘플에서 pH 를 유도하는 유기 또는 무기산과 접촉시키는 것이다.
하나의 구현예에서, 샘플을 산과 접촉시키는 것은, 상기 샘플을, 하나의 구현예에서, 산의 수성 용액과 접촉시키는 것을 포함하며, 이때 상기 용액 중 상기 산의 농도는 0.1 mol/l 내지 1 mol/l, 하나의 구현예에서 0.15 mol/l 내지 0.5 mol/l, 하나의 구현예에서 0.175 mol/l 내지 0.4 mol/l, 하나의 구현예에서 약 0.2 mol/l, 하나의 구현예에서 0.2 mol/l 이다. 하나의 구현예에서, 샘플 및 산의 용액은 이 경우에 약 2 : 1 (샘플 : 산 용액) 의 비로, 추가 구현예에서 2 : 1 (샘플 : 산 용액) 의 비로 혼합된다. 따라서, 하나의 구현예에서, 상기 샘플을 산과 접촉시키는 것은 1 부의 0.2 mol/l 산 용액, 특히 산성 버퍼를 2 부의 상기 샘플에 첨가하는 것을 포함한다. 또한, 하나의 구현예에서, 샘플을 산과 접촉시키는 것은 상기 산을 상기 샘플에 0.03 mol/l 내지 0.3 mol/l, 하나의 구현예에서 0.05 mol/l 내지 0.17 mol/l 의 최종 농도까지 첨가시키는 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은 10℃ 내지 50℃, 하나의 구현예에서 20℃ 내지 45℃, 추가 구현예에서 30℃ 내지 40℃, 추가 구현예에서 37±3℃ 의 샘플 온도 및/또는 샘플/시약 혼합물 온도에서 수행된다.
이해될 바와 같이, 특히 사용된 결합 화합물(들)의 성질에 따라, 샘플을 결합 화합물과 접촉시키기 전에 pH 변화를 유도하는 제제를 중화시키는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 방법은 단계 b) 에서 결합 화합물과 상기 샘플을 접촉시키기 이전 또는 동안 pH 변화를 유도하는 제제를 중화시키는 추가의 단계를 포함한다. 그러나, 중화는 또한 예를 들어 처리된 샘플이 pH 변화를 유도하는 제제로 처리 후 강하게 희석되는 경우 및/또는 사용된 결합 화합물(들) 이 비(非)중성 조건에 민감하지 않은 경우에 불필요할 수도 있다. 하나의 구현예에서, 샘플은 7±2 의 pH, 하나의 구현예에서 7±1.5 의 pH, 추가 구현예에서 7±1 의 pH 로 중화된다. 당업자는 수성 용액에서 pH 변화를 유도하는 제제를 중화시키는 적절한 방법을 알고 있다. 하나의 구현예에서, 중화는 적절한 pH 에서 완충된 버퍼 화합물을, 하나의 구현예에서 적어도 0.4 부의 0.1 내지 0.2 mol/l 버퍼, 추가 구현예에서 0.1 내지 0.2 mol/l 포스페이트 버퍼, 추가 구현예에서 0.1 내지 0.2 mol/l 칼륨 포스페이트 버퍼를, 1 부의 샘플/시약 혼합물에 첨가함으로써 수행된다. pH 변화를 유도하는 제제가 염기인 경우, 하나의 구현예에서 상기 0.2 mol/l 버퍼는 5.5 내지 7.5, 추가 구현예에서 6 내지 7, 추가 구현예에서 약 6.5, 추가 구현예에서 6.3 내지 6.5 의 pH 를 갖는 것이다. pH 변화를 유도하는 제제가 산인 경우, 하나의 구현예에서, 상기 0.1 mol/l 버퍼는 6 내지 8, 추가 구현예에서 6.5 내지 7.5, 추가 구현예에서 약 7, 추가 구현예에서 7 의 pH 를 갖는 것이다. 하나의 구현예에서, 중화는 샘플이 본 발명의 결합 화합물과 접촉되기 이전에 수행된다. 추가 구현예에서, 본 발명의 결합 화합물(들)은 중화에 사용된 중화 용액에 포함되고, 즉 중화는 상기 HCV 를 결합 폴리펩티드와 접촉시키면서 수행된다.
하나의 구현예에서, 샘플에 존재하는 폴리펩티드는 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제로 상기 샘플을 처리하기 이전에 샘플로부터 제거되지 않는다. 하나의 구현예에서, 변성 폴리펩티드는 pH 변화 처리 이후, 특히 염기를 중화한 후에 샘플에서 제거되지 않는다. 추가 구현예에서, 변성 폴리펩티드는 카오트로픽제의 첨가에 의해 가용화되지 않는다.
본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "검출하다"란 샘플에서 검출될 HCV 의 코어 폴리펩티드의, 적어도 하나의 특징, 하나의 구현예에서 면역학적 특징을, 정성적 또는 정량적으로 검출하는 것을 일컫는다. 본 발명에 따른 특징은 하나의 구현예에서 샘플에서 코어 폴리펩티드의 검출을 용이하게 하는 코어 폴리펩티드의 구조적 특징으로, 예를 들어 상기 특징에 특이적으로 결합하는 결합 화합물을 이용하는 것에 의한다. 하나의 구현예에서, 상기 특징은 면역학적 수단에 의한 코어 폴리펩티드의 동정, 추가 구현예에서는 정량화를 용이하게 한다. 전형적인 이용가능한 특징은 샘플에 존재하는 다른 화학적 화합물과 상기 코어 폴리펩티드의 감별을 용이하게 하는 특징이다. 하나의 구현예에서, 코어 폴리펩티드를 검출하는 것은 코어 폴리펩티드가 상기 방법의 검출 한계보다 큰 역가로 샘플에 존재 또는 부재하는지를 확립하는 것이다. 주어진 방법에 대한 검출 한계를 확립하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 희석 적정 실험이 포함된다. 추가 구현예에서, 검출하는 것은 샘플에서 HCV 또는 코어 폴리펩티드의 양 또는 역가를 반정량적 또는 정량적으로 검출하는 것이다. 정량적 검출에 있어서, 코어 폴리펩티드 또는 HCV 의 절대 또는 정확한 양이 검출되거나 또는 코어 폴리펩티드 또는 HCV 의 상대량이 검출될 것이다. 상대량은 정확한 양이 검출될 수 없거나 검출되어서는 안되는 경우에 검출될 수 있다. 상기의 경우, 코어 폴리펩티드 또는 HCV 의 존재량은, 제 2 의 양, 하나의 구현예에서는 소정의 양으로 상기 코어 폴리펩티드 또는 HCV 를 포함하는 제 2 의 샘플에 대하여 증가 또는 감소되는지 여부를 검출할 수 있다.
당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 코어 폴리펩티드를 검출하는 방법은 선택된 검정 포맷에 좌우될 것이다. 하나의 구현예에서, 검정이란, 분석물, 예를 들어 HCV, 그의 캡소머 (capsomer) 또는 그의 코어 폴리펩티드가 고체 표면에 결합된 포획 화합물에 결합되어 있고, 포획된 분석물의 양은 본원 하기에서 명시되는 바와 같은 검출자 화합물의 상기 포획된 분석물과의 결합에 의해 검출되는 샌드위치 검정이다. 하나의 구현예에서, 포획 및/또는 검출자 화합물은 항체이고, 샌드위치 검정은 샌드위치 면역검정이다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 하나의 구현예에서, 분석물의 검출가능한 특징은 분석물 상에 1 회 초과로 존재할 수 있고; 이러한 경우, 포획 화합물 및 검출자 화합물은 모두 상기 특징을 인지할 수 있거나; 또는 포획 화합물은 제 1 의 특징을 인지하고 검출자 화합물은 제 2 의, 즉 구조적으로 상이한 특징을 인지한다. 그러나, 분석물의 특이적인 검출가능한 특징은 분석물 상에 오직 1 회만 존재할 수 있고; 그러한 경우, 하나의 구현예에서, 포획 화합물은 제 1 의 특징을 인지하고 검출자 화합물은 제 2 의, 즉, 구조적으로 상이한 특징을 인지한다.
하나의 구현예에서, 검출된 HCV 및/또는 코어 폴리펩티드의 특징은 상기 HCV 의 코어 폴리펩티드에 포함된 에피토프이다. HCV 의 문맥에서 용어 "코어 폴리펩티드"는 바이러스 입자 내 바이러스성 RNA 에 결합하는 폴리펩티드와 관련한 것으로서 당업자에게 공지되어 있다; 그러한 이유에서, HCV 가 대부분의 다른 바이러스에서 알려진 바와 같은 규칙적인 캡시드 구조를 형성하지 않더라도 코어 폴리펩티드는 또한 "캡시드 폴리펩티드" 또는 "캡시드 단백질"로서도 지칭된다. 따라서, 하나의 구현예에서, 용어 코어 폴리펩티드는 바이러스 코어의 주요한 구조 성분인 폴리펩티드에 대한 것이며, 이때 하나의 구현예에서, 코어의 구조 성분은 구조적으로 정상적인 코어를 형성하고/형성하거나 감염성 바이러스성 입자를 형성하는데 요구되는 성분이다. 추가 구현예에서, 코어 폴리펩티드는 캡시드 또는 캡시드-형 구조 당 적어도 5 카피, 하나의 구현예에서 캡시드 또는 캡시드-형 구조 당 적어도 10 카피로 바이러스 코어에 존재하는 폴리펩티드이다. 추가 구현예에서, HCV 의 코어 폴리펩티드는 바이러스성 코어 폴리펩티드 p21 또는 p19 이고, 특히 SEQ ID NO: 1 또는 2 의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 방법은 상기 명시된 바와 같은 HCV 의 코어 폴리펩티드를 검출하는 것을 포함하고; 그러므로, 상기 방법에서 검출될 "분석물"은, 하나의 구현예에서, 상기 코어 폴리펩티드이다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 이 방법은 추가의 분석물, 예를 들어 하나 이상의 추가 코어 폴리펩티드(들)을 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 당업자가 또한 이해할 수 있는 바와 같이, 분석물로서 바이러스성 코어 폴리펩티드를 검출하는 것은, 하나의 구현예에서 상기 코어 폴리펩티드의 올리고머를 검출하는 것을 포함할 수 있고/있거나 무손상 (intact) 캡시드를 검출하는 것을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 코어 폴리펩티드를 검출하는 것은 샘플을 결합 화합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "결합 화합물"은 본 발명의 분석물, 하나의 구현예에서 코어 폴리펩티드에 결합하는 화학적 분자에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 결합 화합물은 유기 분자 또는 그 복합체, 추가 구현예에서, 생물학적 고분자 (macromolecule), 특히 폴리펩티드 또는 그 복합체이다. 하나의 구현예에서, 결합 화합물은 항체, 특히 모노클로날 항체이다. 따라서, 본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "면역반응 생성물"은 하나의 구현예에서 적어도 하나의 항체와 본 발명의 코어 폴리펩티드, 특히 HCV 코어 폴리펩티드 사이의 특이적 복합체에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 결합 화합물은 분석물 및 결합 화합물을 포함하는 복합체의 검출을 허용하기에 충분한 친화도로 본 발명의 분석물에 직접 또는 간접적으로 결합한다. 하나의 구현예에서, 분석물/결합 화합물 복합체의 해리 상수 (Kd) 는 10-7 mol/l 이하, 추가 구현예에서, 10-8 mol/l 이하, 추가 구현예에서, 10-9 mol/l 이하이다. 하나의 구현예에서, 결합 화합물은 코어 폴리펩티드 및 결합 화합물을 포함하는 복합체의 검출을 허용하기에 충분한 친화도로 본 발명의 코어 폴리펩티드에 간접적 또는 직접적으로 결합한다. 하나의 구현예에서, 결합 화합물은 본 발명의 분석물, 특히 코어 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 화합물이다. 하나의 구현예에서, 결합 화합물은 특이적으로 (i) 알칼리-처리된 코어 폴리펩티드, 또는 (ii) 알칼리-처리된 코어 폴리펩티드 및 비(非)-알칼리-처리된 코어 폴리펩티드에 결합하고/결합하거나, 특이적으로 (i) 산-처리된 코어 폴리펩티드, 또는 (ii) 산-처리된 코어 폴리펩티드 및 비(非)-산 처리된 코어 폴리펩티드에 결합하므로; 따라서 하나의 구현예에서, 결합 화합물은 본원 다른 곳에서 명시된 바와 같은 pH 변화 처리에 의해 변성되지 않은 코어 폴리펩티드의 에피토프에 결합한다. 추가 구현예에서, 결합 화합물은 인접한 (선형) 에피토프, 즉 분석물, 예를 들어 코어 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 인접한 아미노산에 의해 형성된 에피토프에 결합한다. 따라서, 하나의 구현예에서 결합 화합물은 분석물의 구조적 에피토프에 결합하지 않는 결합 화합물이다. 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 결합 화합물이 하나의 구현예에서 SEQ ID NO:1 의 아미노산 157-169 에 상응하는 HCV 코어 단백질의 아미노산 157-169 에 상응하는 에피토프에 결합한다. 추가 구현예에서, 적어도 하나의 결합 화합물은 하나의 구현예에서 SEQ ID NO:1 의 아미노산 102-112 에 상응하는 HCV 코어 단백질의 아미노산 102-112 에 상응하는 에피토프에 결합한다. 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 결합 화합물은 하나의 구현예에서 SEQ ID NO:1 의 아미노산 157-169 에 상응하는 HCV 코어 단백질의 아미노산 157-169 에 상응하는 에피토프에 결합하고, 적어도 하나의 추가 결합 화합물은 하나의 구현예에서 SEQ ID NO:1 의 아미노산 102-112 에 상응하는 HCV 코어 단백질의 아미노산 102-112 에 상응하는 에피토프에 결합한다.
당업자가 인지할 수 있는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합하는" 또는 그의 문법적인 변형은 샘플에 존재하는 다른 화합물, 전형적으로는 생체분자가 본 발명의 리간드, 특히 결합 화합물에 특이적으로 결합하지 않는다는 점을 지시하는데 사용된다; 하나의 구현예에서, 이는 분석물과의 상호작용에 관여하지 않는 결합 화합물의 영역에 대한 화학적 화합물, 예를 들어 간섭 화합물의 결합을 배제하지 않는다. 하나의 구현예에서, 결합 화합물의, 분석물 이외의 화합물과의 결합 수준은 각각 최대 10% 이하, 5% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 분석물에 대한 친화도인 결합 친화도를 도모한다.
하나의 구현예에서, 코어 폴리펩티드를 검출하는 것은 포획 화합물을 이용함으로써 코어 폴리펩티드의 고체 표면으로의 포획을 포함한다. 본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "포획 화합물"은 본원 다른 곳에서 명시된 바와 같은 고체 표면에 부착된 또는 부착되도록 적합화된 결합 화합물에 관한 것이다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 포획 화합물은 샘플과 상기 포획 화합물을 접촉시키기 전, 동시 또는 이후에 고체 표면에 부착될 수 있다. 하나의 구현예에서, 포획 화합물은 상기 포획 화합물을 샘플과 접촉시킴과 동시에, 예를 들어 상기 샘플, 상기 포획 화합물 및 상기 고체 표면 (이 경우, 비드 형태일 수 있음) 을 혼합시킴으로써, 고체 표면에 부착된다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 고체-표면 결합된 포획 화합물을 샘플과 접촉시키는 것은, (존재한다면) 상기 샘플에 포함된 다른 화합물로부터 상기 포획 화합물에 의해 결합된 분석물을 특이적으로 분리시키는 것을 가능하게 한다. 고체 표면에, 결합 화합물, 예를 들어 생물학적 분자, 전형적으로 폴리펩티드를 부착시키는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있고, 예를 들면 소수성 상호작용, 비오티닐화 및 고정화된 스트렙타비딘을 통한 결합, 공유 결합, 항체-항원 상호작용 등, 또는 이들 상호작용의 조합에 의한 결합을 포함한다.
하나의 구현예에서, 포획 화합물은 또한 포획 복합체일 수 있다. 하나의 구현예에서, 포획 화합물은 항체이다. 추가 구현예에서, 포획 화합물은 모노클로날 항체이다. 또 다른 구현예에서, 포획 화합물은 항체, 즉 포획 항체, 특히 모노클로날 항체이다. 하나의 구현예에서, 포획 항체는 비오틴에 공유 결합되어 있다.
하나의 구현예에서, 코어 폴리펩티드를 검출하는 것은 상기 코어 폴리펩티드를 검출자 화합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "검출자 화합물"은 본원 다른 곳에서 명시된 바와 같은 지시자에 결합된 결합 화합물에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 검출자 화합물은 고체 표면에 결합되지 않고 고체 표면에 결합되도록 적합화되어 있지 않다. 하나의 구현예에서, 검출자 화합물은 본 발명의 분석물, 하나의 구현예에서, 코어 폴리펩티드에 직접적으로 결합하는 화합물이다. 하나의 구현예에서, 검출자 화합물은 또한 검출자 복합체일 수도 있다. 당업자는 결합 화합물 또는 결합 복합체가 지시자에, 선택된 지시자에 따라 어떻게 결합하는지에 대해 알고 있다. 하나의 구현예에서, 결합제와 검출자 화합물 내 지시자 간의 결합은 공유 결합이다. 하나의 구현예에서, 검출자 화합물은 항체, 즉 검출자 항체이다. 추가 구현예에서, 검출자 화합물은 모노클로날 항체이다. 또 다른 구현예에서, 검출자 화합물은 루테늄 이온을 포함하는 복합체, 예를 들어 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄(II)-복합체에 공유 결합된 항체, 특히 모노클로날 항체이다.
하나의 구현예에서, 포획 화합물의 결합 화합물 및 검출자 화합물의 결합 화합물은 동일하지 않다. 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 포획 화합물 또는 결합 화합물은 하나의 구현예에서 SEQ ID NO:1 의 아미노산 157-169 에 상응하는 HCV 코어 단백질의 아미노산 157-169 에 상응하는 에피토프에 결합한다. 추가 구현예에서, 적어도 하나의 검출자 화합물 또는 결합 화합물은 하나의 구현예에서 SEQ ID NO:1 의 아미노산 102-112 에 상응하는 HCV 코어 단백질의 아미노산 102-112 에 상응하는 에피토프에 결합한다. 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 포획 화합물은 하나의 구현예에서 SEQ ID NO:1 의 아미노산 157-169 에 상응하는 HCV 코어 단백질의 아미노산 157-169 에 상응하는 에피토프에 결합한다. 추가 구현예에서, 적어도 하나의 검출자 화합물은 하나의 구현예에서 SEQ ID NO:1 의 아미노산 102-112 에 상응하는 HCV 코어 단백질의 아미노산 102-112 에 상응하는 에피토프에 결합한다. 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 포획 화합물은 하나의 구현예에서 SEQ ID NO:1 의 아미노산 157-169 에 상응하는 HCV 코어 단백질의 아미노산 157-169 에 상응하는 에피토프에 결합하고, 적어도 하나의 검출자 화합물은 하나의 구현예에서 SEQ ID NO:1 의 아미노산 102-112 에 상응하는 HCV 코어 단백질의 아미노산 102-112 에 상응하는 에피토프에 결합한다.
용어 "지시자"는, 본원에서 이용되는 바와 같이, 상기 지시자를 포함하는 분자 또는 복합체의 존재를 검출가능하게 만드는 데 적합화된 화합물에 관한 것이다. 전형적으로, 지시자는 검출가능한 특성, 전형적으로는 광학적 및/또는 효소적 특성을 갖는다. 그러나, 상기 검출가능한 특성은 방사능을 방출하는 특성인 것으로도 고려된다.
용어 "광학적 특성"은 본원에서 이용되는 바와 같이 광학적 장치로 검출될 수 있는 임의의 특성에 대한 것이다. 구체적으로는, 광학적으로 측정가능한 특성은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 특성일 수 있거나 이를 포함할 수 있다: 반사 특성, 투과 특성, 방출 특성, 산란 특성, 형광 특성, 인광 특성, 회절 특성 및 편광 특성. 본 발명에 의해 고려되는 추가 광학적 특성은 색, 형광, 발광 또는 굴절이다. 하나의 구현예에서, 본원에서 지칭되는 바와 같은 광학적으로 측정가능한 특성은 광 흡수, 광 방사, 광 완화, 또는 이와 관련된 특성과 같이 광학적으로 검출될 수 있는 화학적 화합물의 특성에 관한 것이다. 본원에서 이용되는 바와 같은 광학적으로 측정가능한 특성을 검출하는 것은 이전에 검출할 수 없었던 특성의 존재의 검출, 이전에 검출된 바 있는 특성의 부재의 검출, 및 특성의 정량적 변화의 검출, 즉 적어도 하나의 광학적 특성의 변화의 정도와 상관 관계가 있는 시그널 강도의 변화의 검출을 포함한다는 점은 자명할 것이다. 용어 "광헉적으로 측정가능한 특성"은 하나의 구현예에서 또한 전기생성 화학발광 (electrogenerated chemiluminescence) 으로도 공지되어 있는 전기화학발광 (electrochemiluminescence) 에 대한 것이기도 하다는 점은 자명하다.
용어 "효소적 특성"은 본원에서 이용되는 바 생물학적 촉매작용을 통해 기질로부터 검출가능한 생성물을 생성하는 지시자의 특성에 관한 것이다. 따라서, 효소적 특성은 상기 지시자에서 상기 효소적 특성을 갖는 폴리펩티드의 존재에 의해 통상적으로 부여된다. 전형적으로, 효소적 특성은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소적 활성이다: 포스파타아제 활성 (예, 알칼리성 포스파타아제), 퍼옥시다아제 활성 (예, 겨자무 퍼옥시다아제), 및 글리코시다아제 활성 (예, 베타-갈락토시다아제). 효소적 활성을 위한 전형적인 기질은 당업계에 익히 공지되어 있다. 전형적으로, 상기 효소적 활성은 상기 본원에 명시된 바와 같은 측정가능한 광학적 특성을 가진 생성물을 생성하고/하거나 상기 효소적 활성은 전기 장치에 의해 측정가능한 생성물을 생성한다.
본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "고체 표면"은 본 발명의 포획 화합물을 결합하기에 적합화되고, 샘플로부터 예를 들어 물리적인 수단에 의해 분리되기에 적합화된 임의의 적합한 고체 표면에 대한 것이다. 하나의 구현예에서, 상기 고체 표면은 비드, 하나의 구현예에서, 마이크로비드, 예를 들어 자성 또는 상자성 마이크로비드의 표면이다. 하나의 구현예에서, 상기 표면은 예를 들어 포획 화합물의 하부구조를 결합하는 분자를 공유 또는 비공유적으로 부착시킴으로써 포획 화합물의 결합을 개선하도록 적합화된다. 포획 화합물의 하부구조를 결합하는 전형적인 분자는 예를 들어 항체, 스트렙타비딘, 착화된 니켈 이온, 등이다. 추가 구현예에서, 고체 표면은 공유 및/또는 비공유 결합에 의해, 예를 들어 소수성 상호 작용에 의해 상기 포획 화합물을 결합한다. 따라서, 하나의 구현예에서, 상기 고체 표면은 멀티-클러스터 (multi-cluster) 플레이트의 표면이다. 하나의 구현예에서, 멀티-클러스터 플레이트의 표면은 포획 화합물의 결합에 대한 친화도 및/또는 수용력을 증진시키도록 전처리된다. 적합한 전처리는 당업계에 공지되어 있다.
용어 "샘플"은 본원에서 이용되는 바와 같이 본 발명의 HCV 또는 그의 구성 성분 부분을 포함하는 것으로 의심받는 샘플에 대한 것이다. 하나의 구현예에서, 샘플은 본 발명의 코어 폴리펩티드, 특히 HCV 코어 폴리펩티드를 포함하는 것으로 의심받는 샘플이다. 하나의 구현예에서, 샘플은 체액의 샘플, 조직 또는 장기로부터의 샘플, 또는 세정/린스액의 샘플 또는 외부 또는 내부 신체 표면으로부터 얻은 면봉 또는 도말표본 (smear) 이거나 또는 이를 포함한다. 하나의 구현예에서, 대변, 소변, 타액, 뇌척수액, 혈액, 혈청, 혈장 또는 눈물액의 샘플이 본 발명의 방법에 의해 샘플로서 포함된다. 샘플은 브러시, (코튼) 면봉, 주걱, 린스/세정액, 펀치 생검 장치, 바늘이나 란셋으로 구멍을 뚫는 천자 (puncture) 를 이용함으로써 또는 수술 도구에 의해 수득될 수 있다. 그러나, 하나의 구현예에서, 비뇨생식관, 항문 주위, 항문관, 구강, 상부 호흡소화관 및 표피로부터의 스크랩, 면봉 또는 생검을 비롯한 익히 공지되어 있는 기술로 얻은 샘플이 또한 본 발명의 샘플로서 포함된다. 무세포 액체가 균질화와 같은 용해 기술로써 및/또는 여과 또는 원심분리와 같은 분리 기술로써 체액 또는 조직 또는 장기로부터 수득될 수 있다. 하나의 구현예에서, 샘플은 본 발명의 HCV 및/또는 HCV 코어 폴리펩티드를 포함하는 것으로 공지된 체액으로부터, 즉 하나의 구현예에서, 혈액, 혈장, 혈청, 타액 등으로부터 수득된다. 샘플이 본 발명의 방법을 수행하기 위해 추가로 처리될 수 있음은 자명하다. 특히, 세포는 당업계에 공지된 방법 및 수단에 의해 샘플로부터 제거될 수 있다. 하나의 구현예에서, 샘플은 면역글로불린을 포함하는 샘플, 하나의 구현예에서, 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플, 추가 구현예에서, 혈청 또는 혈장 샘플이다.
용어 "대상체"는 본원에서 이용되는 바와 같이 동물, 하나의 구현예에서 포유류, 추가 구현예에서 영장류, 추가 구현예에서 인간에 대한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 대상체는 HCV 에 감염된 것으로 의심되는 대상체이고; 그러므로, 하나의 구현예에서, 대상체는 본원 다른 곳에서 명시된 바와 같고 당업자에게 공지되어 있는 HCV 감염의 적어도 하나, 추가 구현예에서, 적어도 2 가지의 증상을 보이는 대상체이다. 그러나, 대상체는 HCV 에 감염된 것으로 진단받은 대상체의 성 파트너, 가족 구성원, 가구원, 동료 근로자, 놀이상대, 및/또는 보호자라는 점도 또한 고려된다.
용어 "항체"는 본원에서 이용되는 바와 같이, 이들이 본원 다른 곳에서 명시된 바와 같은 원하는 결합 활성을 나타내는 한, 모노클로날 항체, 적어도 2 개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 하나의 구현예에서, 항체는 전장 항체 또는 항체 단편이다.
그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (면역글로불린)은 상이한 부류로 배치될 수 있다. 면역글로불린의 5 가지의 주요 부류가 존재하고: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 이들 중 몇 가지는 더 하위부류 (이소타입) 로 나뉘어질 수 있다: 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2. 면역글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조 및 3차원적 입체구조는 널리 공지되어 있으며, 일반적으로 예를 들면 문헌 [Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed., W. B. Saunders, Co. (2000)] 에 기술되어 있다. 항체는 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드와 항체의 공유 또는 비공유 결합에 의해 형성된 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"가 이하에 정의된 바와 같은 항체 단편이 아닌, 실질적으로 무손상 형태로의 항체를 지칭하는데 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 특히 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다. "항체 단편"은 하나의 구현예에서 그의 항원-결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 부분을 포함한다. 항체 단편의 예에는 하기가 포함된다: Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디 (diabodies); 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자, 나노바디, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체. 항체의 파파인 (papain) 소화로, "Fab" 단편이라고 불리우는 2 개의 상동 항원-결합 단편 (각각은 단일의 항원-결합 부위를 가짐) 및 잔여 "Fc" 단편 (이의 명칭은 쉽게 결정화할 수 있는 이의 능력을 반영함) 이 초래된다. 펩신 처리는 2 개의 항원-조합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교-결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 산출한다. "Fv" 는 완전한 항원-결합 부위를 포함하는 최소의 항체 단편이다. 하나의 구현예에서, 2-쇄 Fv 종은 단단하고, 비공유적으로 결합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 다이머로 이루어진다. 단일-쇄 Fv (scFv) 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서의 것과 유사한 "다이머성" 구조로 결합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 결합될 수 있다. 이 입체구조에서, 각 가변 도메인의 3 개의 과가변 영역 (HVR) 은 상호 작용하여 항원-결합 부위를 정의내린다. 총체적으로, 6 개의 HVR 이 항체에 대한 항원-결합 특이성을 부여한다.
그러나, 단일의 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3 개의 HVR 만을 포함하는 Fv 의 절반) 조차도 비록 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도에서지만 항원을 인지하고 결합하는 능력을 가진다. 용어 "디아바디"는 2 개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭하며, 이때 이 단편은 경쇄 가변 도메인 (VL) 에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) 을 동일한 폴리펩티드 사슬에서 (VH-VL) 포함한다. 너무 짧아 동일한 사슬 상 2 개의 도메인간에 쌍을 이루는 것을 허용하지 않는 링커를 이용함으로써, 도메인은 또 다른 사슬의 상보적인 도메인과 쌍을 이루어 2 개의 항원-결합 부위를 만들게 된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는 예를 들어 EP 0 404 097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]; 및 [Hollinger et al., PNAS USA 90 (1993) 6444-6448] 에 보다 자세하게 기재되어 있다. 트리아바디 (triabodies) 및 테트라바디 역시 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134] 에 기재되어 있다.
본원에서 이용되는 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단 (population) 으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단에 포함된 개개의 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 특질을 개별 항체의 혼합물이 아니라는 것으로서 지시한다. 특정 구현예에서, 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로 분석물을 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 이때 분석물-결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터 단일의 분석물 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 프로세스에 의해 수득되었다. 예를 들어, 선택 프로세스는 하이브리도마 클론, 파아지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀 (pool) 과 같은 복수의 클론으로부터 특유의 클론의 선택일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선하도록, 표적-결합 서열을 인간화하도록, 세포 배양에서의 이의 생산을 개선하도록, 생체 내 이의 면역원성을 감소시키도록, 다중특이적 항체를 만들도록 등, 추가적으로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체가 또한 본 발명의 모노클로날 항체이기도 하다는 점은 자명하다. 상이한 결정인자 (에피토프) 에 대항하여 지시되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 모노클로날-항체 제제의 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일의 결정인자에 대항하여 지시된다. 그들의 특이성에 부가적으로, 모노클로날-항체 제제는 이들이 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.
항체 또는 그의 단편은 예를 들어 문헌 [Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988] 에 기재된 방법을 이용함으로써 수득될 수 있다. 모노클로날 항체는 면역화된 포유류 유래의 비장 세포로의 마우스 골수종 세포의 융합을 포함하는 문헌 [Koehler and Milstein, Nature 256 (1975), 495, 및 Galfr
Figure 112018129131572-pct00001
, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3] 에 본래 기재된 기술에 의해 제조될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 코어 폴리펩티드의 검출 방법은 상기 샘플을 추가 화합물과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와의 처리와 동시에 이용될 수 있는 추가 화합물은 비제한적으로 알칼리 금속 할로게나이드, 하나의 구현예에서, 알칼리 금속 클로라이드, 특히 칼륨 클로라이드를, 하나의 구현예에서 0.1 mol/l 내지 1 mol/l, 하나의 구현예에서, 0.2 mol/ 내지 0.5 mol/l, 추가 구현예에서 약 0.375 mol/l, 추가 구현예에서 0.375 mol/l 의 농도로 포함할 수 있다: 더욱이, 하나의 구현예에서, 본 발명의 코어 폴리펩티드를 검출하는 방법은 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제로의 처리 후에 상기 샘플을 검출 검정, 특히 면역학적 검정에서 통상 사용되는 추가 화합물, 예컨대 버퍼, 예를 들어 칼륨 포스페이트 버퍼, 음이온성, 비이온성 및/또는 쯔비터이온성 (zwitterionic) 세제를 비롯한 추가의 세제, 보존제, 폴리펩티드 또는 그 혼합물, 예를 들어 소혈청 알부민, 면역글로불린 등과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 코어 폴리펩티드를 검출하는 방법은 샘플을 술프히드릴 화합물과 접촉시키는 것을 포함하지 않는다. 추가 구현예에서, 본 발명의 코어 폴리펩티드를 검출하는 방법은 샘플을 환원제와 접촉시키는 것을 포함하지 않는다. 용어 "술프히드릴 화합물"은 본원에서 이용되는 바와 같이, 예를 들어 디티오트레이톨, β-메르캅토에탄올, β-메르캅토에탄아민, β-메르탑토에탄 술폰산 등과 같이 적어도 하나의 -SH 기를 포함하는 화합물, 하나의 구현예에서 유기 화합물에 대한 것이다. 용어 "환원제"는 당업자에 의해 이해된다. 하나의 구현예에서, 상기 용어는 폴리펩티드의 -S-S- 기를 환원시키는 제제에 대한 것이다.
추가 구현예에서, 본 발명의 코어 폴리펩티드를 검출하는 방법은 우레아와 같은 카오트로픽제와 샘플을 접촉시키는 것을 포함하지 않는다. 용어 "카오트로픽제"는 본원에서 이용되는 바와 같이 고분자, 특히 폴리펩티드의 3차 구조를 파괴하는 화합물에 대한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명에 따르면, 양이온성 세제 및 비이온성 세제는 카오트로픽제가 아니다.
유리하게도, HCV 코어 폴리펩티드를 검출하기 위해서, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 함께 샘플의 연장된 인큐베이션을 요구하지 않는다는 것이 본 발명의 기초가 되는 연구에서 발견되었다. 놀랍게도, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제의 효과는 본질적으로 즉각적이고, 검출 항체의 첨가가 계면활성제의 첨가를 즉각적으로 뒤따라올 수 있다는 점을 발견했다.
상기 정의는 다음에서 준용한다. 하기에서 추가로 형성된 추가적인 정의 및 설명도 또한 본 명세서에서 기재된 모든 구현예에 준용된다.
본 발명은 추가로 HCV 코어 폴리펩티드의 검출을 위한 대상체로부터의 샘플을 전처리하는 방법에 관한 것으로서, 이는 (a) 상기 샘플을, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제 및 임의로는 pH 변화를 유도하는 제제와 접촉시킨 후, 즉시 (b) 상기 샘플을 결합 화합물과 접촉시키는 것을 포함한다.
대상체로부터의 샘플을 전처리하는 방법은 또한 명시적으로 언급된 것들 이외의 단계를 포함할 수도 있다. 더욱이, 이 방법은 하나의 구현예에서 시험관 내 방법이다.
또한, 본 발명은 샘플에서 HCV 의 검출을 위한 전처리 시약의 용도에 관한 것으로서, 상기 전처리 시약은 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제 및 임의로는 pH 변화를 유도하는 제제를 포함하고, 이때 상기 용도는 상기 샘플을 상기 전처리제와 접촉시킨 후 즉시 상기 샘플을 결합 화합물과 접촉시키는 것을 포함한다.
용어 "전처리 시약"은 본원에서 이용되는 바와 같이 샘플을 결합 화합물과 접촉시키기 이전에 상기 샘플을 전처리하는데 사용되는 지시된 성분을 포함하는 용액, 하나의 구현예에서 수성 용액에 관한 것이다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 용어 "전처리"란, 예를 들어 검출 단계의 결과를 개선시키는 것을 목표로 하여 실제 검출 단계 이전에 수행되는 본 발명의 진단 방법에서와 같이 검출 방법에서 통상적으로 임의적인 작업 단계에 대한 것이다. 따라서, 추가의 전처리 단계는 예를 들어 조직 샘플을 균질화하는 것, 혈액 샘플로부터 혈액 세포를 제거하는 것 등에 대한 것일 수 있다. 하나의 구현예에서, 전처리 시약은 3배 농축제이고, 즉 1 부의 전처리 시약은 2 부의 비(非)전처리 시약, 예를 들어 하나의 구현예에서 2 부의 샘플로 희석되고, 이때 상기 샘플은 적절한 희석제로 희석될 수 있거나, 또는 추가 구현예에서 비희석된 샘플이다. 하나의 구현예에서, 계면활성제는 본원 다른 곳에서 명시된 바와 같은 비이온성 세제를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 전처리 시약은 본원 다른 곳에서 명시된 바와 같은 술프히드릴 (-SH) 기를 포함하는 화합물을 포함하지 않고, 하나의 구현예에서는 환원제를 포함하지 않는다. 하나의 구현예에서, 전처리 시약은 알칼리-금속 할로게나이드, 하나의 구현예에서 알칼리-금속 클로라이드, 특히 칼륨 클로라이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 알칼리-금속 할로게나이드는 전처리 시약 중에 0.5 mol/l 내지 2 mol/l, 하나의 구현예에서 1 mol/l 내지 1.5 mol/l, 추가 구현예에서 약 1.125 mol/l, 추가 구현예에서 1.125 mol/l 의 농도로 포함된다.
더욱이, 본 발명은 또한 샘플 처리 유닛을 갖는 분석 유닛을 포함하는 샘플 중의 HCV 의 코어 폴리펩티드를 검출하기 위한 분석 장치에 관한 것으로서, 상기 분석 유닛은 제어 유닛과 연결되고, 상기 제어 유닛은 하기의 단계들을 수행되게 지시하도록 적합화되어 있다:
(a) 상기 샘플 처리에 적용된 샘플을, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와, 및 임의로는 pH 변화를 유도하는 제제와 접촉시키는 단계, 이후 즉시
(b) 상기 샘플을 결합 화합물과 접촉시키는 단계.
하나의 구현예에서, 분석 유닛의 샘플 처리 유닛은 제어 유닛과 연결되고, 상기 제어 유닛은 상기 명시된 바와 같은 단계들이 수행되게 지시하도록 적합화되어 있다.
용어 "장치"는 본원에서 이용되는 바와 같이 검출 결과가 얻어지도록 서로 작동 가능하게 연결된 상술된 수단을 적어도 포함하는 수단의 시스템에 대한 것이다. 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 샘플을 접촉시키고 코어 폴리펩티드를 검출하기 위한 바람직한 수단은 본 발명의 방법과 연계되어 상기 개시되어 있다. 가동 방식으로 수단들을 연결하는 방법은 장치에 포함된 수단의 형태에 좌우될 것이다. 하나의 구현예에서, 수단은 단일 장치에 의해 포함된다. 본 발명에 따르면, 장치는 상기 지시된 바와 같은 단계 (a) 후에 즉시 상기 지시된 바와 같은 단계 (b) 를 본 발명의 의미 내에서, 즉 하나의 구현예에서 5 분 미만, 하나의 구현예에서 4 분 미만, 추가 구현예에서 3 분 미만, 추가 구현예에서 2 분 미만, 추가 구현예에서 1 분 미만, 추가 구현예에서 45 초 미만, 추가 구현예에서 30 초 미만, 추가 구현예에서 15 초 미만 내에 후속시키도록 적합화되어 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 제어 유닛은 특정된 타임 프레임 내에서 수행되도록 언급된 바와 같은 단계들이 지시되도록 구성된다.
하나의 구현예에서, 샘플 처리 유닛은 샘플용 리셉터클 (receptacle) 을 포함한다. 리셉터클은 직접적으로 샘플과 접촉할 수 있거나, 또는 샘플을 수용하는 추가 수단용 리셉터클일 수 있고, 이때 추가 수단은 예를 들어 한 샘플 또는 다수의 샘플이 적용될 수 있는 멀티-웰 플레이트일 수 있다. 더욱이, 샘플 처리 유닛은 하나의 구현예에서 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제 및 임의로는 pH 변화를 유도하는 제제를, 예를 들어, 건조 형태로 또는 투약 수단에 연결된 저장기, 예를 들어 펌프에 연결된 배관에 포함한다. 임의로는, 샘플 처리 유닛은 샘플을 pH 변화를 유도하는 상기 제제와 접촉시킨 후 샘플에서의 pH 를 재조정하기 위한 중화 수단을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 샘플 처리 유닛은 적어도 하나의 검출자 화합물을, 예를 들어 건조된 형태로, 또는 투약 수단에 연결된 저장소에, 예를 들어 펌프에 연결된 배관에 포함한다. 추가 구현예에서, 샘플 처리 유닛은 혼합 수단 및 반응 혼합물의 온도를 조절하는 수단을 포함한다.
하나의 구현예에서, 검출 결과는 사용자에 의한 육안 검사로써 또는 적절한 장치 상에서 검출 측정을 수행함으로써 수득될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 장치의 분석 유닛은 본 발명의 코어 폴리펩티드를 검출하기 위한 검출 유닛, 하나의 구현예에서 본 발명의 코어 폴리펩티드의 양을 검출하기 위한 검출 유닛을 추가로 포함한다. 본 발명에 따른 검출 유닛으로서 적절한 수단은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면 측광 장치가 포함된다. 하나의 구현예에서, 분석 장치는 분석물의 전기화학적 검출용 분석 장치이고, 적어도 하나의 전극, 하나의 구현예에서 적어도 하나의 작업 전극을 추가로 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 분석 장치는 부가적인 전극, 예를 들어 상대 전극 및/또는 기준 전극을 포함할 수 있다; 분석 장치는 또한 조합된 상대 전극/기준 전극을 포함할 수도 있다. 적합한 전극 구현예는 당업자에게 공지되어 있다. 하나의 구현예에서, 적어도 작업 전극이 장치의 샘플 리셉터클에서 또는 상기 명시된 바와 같은 샘플을 수용하기 위한 추가 수단에서 포함된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 장치는 검출 유닛에 연결된, 데이터 출력 유닛을 추가로 포함한다. 데이터 출력 유닛은 하나의 구현예에서 검출 유닛에 의해 수득된 데이터를 출력하도록 적합화된다. 적절한 데이터 출력 유닛은 당업자에게 공지되어 있으며, 코어 폴리펩티드가 검출 역치 초과로 검출되었다는 것을 지시하는 지시자 램프 또는 디스플레이와 같은 단순한 출력 유닛을 포함한다. 출력 유닛은 그러나 또한 평가 장치에 대한 인터페이스일 수도 있는데, 이때 상기 인터페이스는 예를 들어 USB 와 같은 케이블 연결, 무선 LAN, 블루투스 등과 같은 무선 연결, 또는 인스턴트 메세징, 이메일 등에 의한 데이터 전송과 같은 간접 연결을 비롯한 데이타를 전송하는 임의 종류의 수단일 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 장치는 분석 시스템의 일부이며, 상기 분석 시스템은 추가로 평가 장치를 포함한다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 평가 장치는 예를 들어 평가 유닛과 같이 본 발명의 장치와 동일한 하우징 내에 포함될 수 있거나, 또는 별도의 장치일 수 있다. 하나의 구현예에서, 평가 장치는 본 발명의 장치의 출력 유닛으로부터 출력 데이터를 수신하고 상기 출력 데이터의 평가를 제공하는 논리 연산을 수행하도록 프로그래밍된 마이크로프로세서를 포함한다. 출력 데이터의 평가는 예를 들어 하나 이상의 제어 검출 반응에서 측정된 값들에 대한 데이터를 보정하는 것, 통계적 산출, 예를 들어 2 이상의 병렬 검출 반응의 수단을 산출하는 것, 희석 인자에 대한 데이터를 보정하는 것, 출력 데이터를 기준값과 비교하는 것, 리스트에서 데이터를 컴파일링하는 것 등을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 평가 장치는 데이터 저장 유닛을 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 상기 데이터 저장 유닛은 기준값들을, 예를 들어 기준값 데이터 베이스에 포함한다. 나아가, 하나의 구현예에서, 데이터 저장 유닛은 상기 명시된 바와 같이 본 발명의 장치로부터 수신된 출력 데이터를 저장하도록 적합화되어 있다.
하나의 구현예에서, 상기 바이러스의 코어 폴리펩티드를 자동으로 검출하는 수단이 적용되는 경우, 상기 자동 작동 수단에 의해 수득된 데이터는 예를 들어 진단을 지지하는 분석 결과를 확립시키기 위해 (즉, HCV 에 감염된 대상체를 식별하는 것) 컴퓨터 프로그램으로 프로세싱될 수 있다. 검출을 위한 전형적인 수단은 상기 본 발명의 방법에 관한 구현예와 연계하여 개시되어 있다. 이러한 경우에, 상기 수단은 시스템의 사용자가 설명서에 주어진 지시 및 해석 덕택으로 양의 측정 결과 및 그의 진단값을 합친다는 점에서 작동적으로 연결되어 있다. 당업자라면 추가 진보적인 기술 없이도 수단을 연결하는 방법을 실현할 것이다. 전형적인 장치는 전문 임상의의 특정 지식 없이도 적용될 수 있는 것, 예를 들어, 단순히 샘플을 로딩하는 것을 필요로 하는 테스트 스트라이프 (test stripe) 또는 전자 장치이다. 결과는 파라미터 진단 원 데이터 (diagnostic raw data) 의 출력물로서, 바람직하게는 절대 또는 상대량으로서 제공될 수 있다. 이들 데이터가 임상의에 의한 해석을 필요로 한다는 것은 이해되어야 한다. 그러나, 출력에 처리되어진 진단 원 데이터가 포함되어 있고, 이의 해석은 전문 임상의를 필요로 하지 않는 전문가 시스템 장치도 또한 고려된다. 장치의 추가 구현예는 본 발명의 방법에 따르는 상기에 언급된 분석 유닛/장치 (예, 바이오센서, 어레이, 폴리펩티드를 특이적으로 인지하는 리간드에 커플링된 고체 지지체, 플라스몬 표면 공명 장치, NMR 분광계, 질량 분광계 등) 또는 평가 유닛/장치를 포함한다.
본 발명은 프로그램이 분석 장치, 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크 상에서 실행될 때 본원에서 포함된 구현예들 중 하나 이상에서 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 컴퓨터-실행가능 명령어를 포함하는 컴퓨터 프로그램을 추가로 개시하고 제안한다. 특히, 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터-판독가능한 데이터 캐리어에 저장될 수 있다. 따라서, 구체적으로, 상기 지시된 바와 같은 방법 단계들 중 하나, 하나 초과 또는 심지어 모두가 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크를 이용함으로써, 바람직하게는 컴퓨터 프로그램을 이용함으로써 수행될 수 있다.
본 발명은 추가로 프로그램이 분석 장치, 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크 상에서 실행될 때 본원에서 포함된 구현예들 중 하나 이상에서 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해, 프로그램 코드 수단을 갖는 컴퓨터 프로그램 제품을 개시 및 제안한다. 특히, 프로그램 코드 수단은 컴퓨터-판독가능한 데이터 캐리어 상에 저장될 수 있다.
나아가, 본 발명은 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크의 작업 메모리 또는 메인 메모리와 같은 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크로의 로딩 후 본원에서 개시된 구현예들 중 하나 이상에 따른 방법을 수행할 수 있는 데이터 구조가 저장된 데이터 캐리어를 개시 및 제안한다.
본 발명은 프로그램이 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크 상에서 실행될 때 본원에서 개시된 구현예들 중 하나 이상에 따른 방법을 수행하도록 기계-판독가능한 캐리어 상에 저장된 프로그램 코드 수단을 갖는 컴퓨터 프로그램 제품을 추가로 제안 및 개시한다. 본원에서 이용되는 바와 같이, 컴퓨터 프로그램 제품은 거래가능한 제품으로서의 프로그램을 지칭한다. 제품은 일반적으로 임의의 형식으로, 예컨대 종이 형식으로 또는 컴퓨터-판독가능한 데이터 캐리어 상에 존재할 수 있다. 특히, 컴퓨터 프로그램 제품은 데이터 네트워크를 통해 배포될 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 본원에서 기재된 구현예들 중 하나 이상에 따른 방법을 수행하기 위해 컴퓨터 시스템 또는 컴퓨터 네트워크에 의해 판독가능한 명령들을 포함하는 변조된 데이터 시그널을 제안 및 개시한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 컴퓨터-구현 양태를 참조하면, 본원에서 개시된 구현예들 중 하나 이상에 따른 방법의 방법 단계들 중 하나 이상 또는 심지어 전부가 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크를 이용함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 일반적으로, 데이터의 제공 및/또는 조작을 포함하는 방법 단계들 중 임의의 것은 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크를 이용함으로써 수행될 수 있다. 일반적으로, 이들 방법 단계들은 전형적으로 샘플 및/또는 실제 측정을 수행하는 특정 양태를 제공하는 것과 같이 수작업을 요구하는 방법 단계는 제외한, 임의의 방법 단계를 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 추가로 하기를 개시한다:
- 적어도 하나의 프로세서를 포함하는 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크로서, 상기 프로세서는 본 명세서에서 기재된 구현예들 중 하나에 따른 방법을 수행하도록 적합화된, 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크,
- 데이터 구조가 컴퓨터 상에서 실행되는 동안, 본 기재에서 기재된 구현예들 중 하나에 따른 방법을 수행하도록 적합화된 컴퓨터 로딩가능한 데이터 구조,
- 컴퓨터 프로그램으로서, 프로그램이 컴퓨터 상에서 실행되는 동안, 본 기재에서 기재된 구현예들 중 하나에 따른 방법을 수행하도록 컴퓨터 프로그램이 적합화된, 컴퓨터 프로그램,
- 컴퓨터 프로그램이 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크 상에서 실행되는 동안 본 기재에서 기재된 구현예들 중 하나에 따른 방법을 수행하기 위한 프로그램 수단을 포함하는 컴퓨터 프로그램,
- 상기 구현예에 따른 프로그램 수단을 포함하는 컴퓨터 프로그램으로서, 이때 프로그램 수단은 컴퓨터로 판독가능할 수 있는 저장 매체 상에 저장되는, 컴퓨터 프로그램,
- 저장 매체로서, 데이터 구조가 저장 매체에 저장되고, 데이터 구조는 컴퓨터의 또는 컴퓨터 네트워크의 메인 및/또는 작업 저장 공간에 로딩된 후 본 기재에 기재된 구현예들 중 하나에 따른 방법을 수행하도록 적합화된, 저장 매체, 및
- 프로그램 코드 수단을 갖는 컴퓨터 프로그램 제품으로서, 이때 프로그램 코드 수단이 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크 상에서 실행된다면 본 기재에 기재된 구현예들 중 하나에 따른 방법을 수행하기 위해 프로그램 코드 수단이 저장 매체에 저장될 수 있거나 또는 저장된, 컴퓨터 프로그램 제품.
본 발명의 발견을 요약하면, 하기의 구현예가 특히 고려된다:
1. 하기 단계를 포함하는 대상체로부터의 샘플 내 간염 C 바이러스 (HCV) 의 코어 폴리펩티드의 검출 방법으로서:
(a) 상기 샘플을, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 샘플을, 결합 화합물과 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 샘플에서 상기 HCV 의 코어 폴리펩티드를 검출하는 단계;
이때, 단계 a) 후에 즉시 단계 b) 가 후속되는, 검출 방법.
2. 구현예 1 에 있어서, 단계 (a) 는 상기 샘플을 pH 변화를 유도하는 제제와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 검출 방법으로서, 하나의 구현예에서 상기 샘플은 pH 변화를 유도하는 상기 제제 및 상기 계면활성제와 동시에 접촉되는, 검출 방법.
3. 구현예 1 또는 2 에 있어서, 즉시란 5 분 미만, 하나의 구현예에서 4 분 미만, 추가 구현예에서 3 분 미만, 추가 구현예에서 2 분 미만, 추가 구현예에서 1 분 미만, 추가 구현예에서 45 초 미만, 추가 구현예에서 30 초 미만, 추가 구현예에서 15 초 미만의 타임 프레임인, 검출 방법.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 즉시란 기술적으로 가능한 한 짧은 타임 프레임인, 검출 방법.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 양이온성 세제가 4차 암모늄 세제인, 검출 방법.
6. 구현예 5 에 있어서, 상기 4차 암모늄 세제가 헥사데실트리메틸암모늄 염, 하나의 구현예에서 헥사데실-트리메틸-암모늄클로라이드 (HTAC, CAS Number 112-02-7) 인, 검출 방법.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 계면활성제는 비이온성 세제, 하나의 구현예에서 알킬-글리코시드, 추가 구현예에서 옥틸글리코시드 (n-옥틸-β-D-글루코시드, CAS Number 29836-26-8) 를 추가로 포함하는, 검출 방법.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 결합 화합물이 검출자 화합물, 하나의 구현예에서, 검출자 항체인, 검출 방법.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 코어 폴리펩티드를 검출하는 상기 단계는 상기 코어 폴리펩티드를 포획 화합물에 의해, 하나의 구현예에서 포획 항체에 의해 고체 표면에 포획하는 것을 포함하는, 검출 방법.
10. 구현예 8 또는 9 에 있어서, 상기 포획 항체 및/또는 상기 검출자 항체가 모노클로날 항체인, 검출 방법.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 코어 폴리펩티드를 검출하는 상기 단계는 상기 코어 폴리펩티드를 샌드위치 면역검정으로 검출하는 것을 포함하는, 검출 방법.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플은 체액의 샘플, 하나의 구현예에서 소변, 타액, 뇌척수액, 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플인, 검출 방법.
13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플은 면역글로불린을 포함하는 샘플, 하나의 구현예에서 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플인, 검출 방법.
14. 구현예 2 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 pH 변화를 유도하는 제제는 염기인, 검출 방법.
15. 구현예 14 에 있어서, 상기 염기는 브론스테드-로리 염기, 하나의 구현예에서, 수성 용액 중 추가적인 히드록시드 이온을 포함하거나 생성하는 화합물, 추가 구현예에서 알칼리 금속 히드록시드 또는 알칼리 토금속 히드록시드인, 검출 방법.
16. 구현예 14 또는 15 에 있어서, 상기 염기는 4 이하, 하나의 구현예에서 3 이하, 추가 구현예에서 2 이하의 pKB 값을 갖는, 검출 방법.
17. 구현예 14 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 염기는 나트륨 히드록시드, 칼륨 히드록시드, 또는 리튬 히드록시드, 하나의 구현예에서 나트륨 히드록시드 또는 칼륨 히드록시드인, 검출 방법.
18. 구현예 14 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 염기는 칼륨 히드록시드인, 검출 방법.
19. 구현예 14 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플을 염기와 접촉시키는 것은 1 부의 0.25 mol/l 의 상기 염기 용액을 2 부의 상기 샘플에 첨가하는 것을 포함하는, 검출 방법.
20. 구현예 14 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플을 염기와 접촉시키는 것은 상기 샘플을 11.75 이상, 하나의 구현예에서 11.9 이상, 추가 구현예에서 12 이상, 추가 구현예에서 12.1 이상의 pH 에서 인큐베이션하는 것을 포함하는, 검출 방법.
21. 구현예 14 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플을 염기와 접촉시키는 것은 상기 샘플을 11.75 내지 12.75, 하나의 구현예에서 11.9 내지 12.6, 추가 구현예에서 12 내지 12.5 의 pH 에서 인큐베이션하는 것을 포함하는, 검출 방법.
22. 구현예 14 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플을 결합 화합물과 단계 b) 에서 접촉시키기 이전 또는 동안에 상기 염기의 추가 중화 단계를 포함하는, 검출 방법.
23. 구현예 14 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플을 결합 화합물과 접촉시킴과 동시에 상기 염기의 추가 중화 단계를 포함하는, 검출 방법.
24. 구현예 22 또는 23 에 있어서, 상기 중화는 적어도 0.4 부의 0.2 mol/l 버퍼, 하나의 구현예에서 0.2 mol/l 포스페이트 버퍼를 1 부의 샘플/염기 혼합물에 첨가하는 것을 포함하는, 검출 방법.
25. 구현예 14 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 포획 화합물 및/또는 상기 검출자 화합물은 (i) 알칼리-처리된 코어 폴리펩티드, 또는 (ii) 알칼리-처리된 코어 폴리펩티드 및 비-알칼리-처리된 코어 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 화합물인, 검출 방법.
26. 구현예 2 내지 13 중 어느 하나에 있어서, pH 변화를 유도하는 상기 제제는 산인, 검출 방법.
27. 구현예 26 에 있어서, 상기 산은 브론스테드-로리산, 하나의 구현예에서 수성 용액 중 추가적인 옥소늄 이온 (히드로늄 이온) 을 포함하거나 생성하는 화합물, 추가 구현예에서 산성 pH 를 갖는 버퍼인, 검출 방법.
28. 구현예 26 또는 27 에 있어서, 상기 버퍼는 6 이하, 하나의 구현예에서 5.5 이하, 추가 구현예에서 5 이하의 pKA 값을 갖는, 검출 방법.
29. 구현예 27 또는 28 에 있어서, 상기 버퍼는 포스페이트 버퍼, 하나의 구현예에서 칼륨 포스페이트 버퍼인, 검출 방법.
30. 구현예 26 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플을 산과 접촉시키는 것은, 1 부의 0.2 mol/l 의 상기 버퍼 용액을 2 부의 상기 샘플에 첨가하는 것을 포함하는, 검출 방법.
31. 구현예 26 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플을 산과 접촉시키는 것은 상기 샘플을 6 이하, 하나의 구현예에서 5.5 이하, 추가 구현예에서 5 이하의 pH 에서 인큐베이션하는 것을 포함하는, 검출 방법.
32. 구현예 26 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플을 산과 접촉시키는 것은 상기 샘플을 3 내지 6, 하나의 구현예에서 4 내지 5.5, 추가 구현예에서 4.5 내지 5.5 의 pH 에서 인큐베이션하는 것을 포함하는, 검출 방법.
33. 구현예 26 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 코어 폴리펩티드를 단계 b) 에서 결합 화합물과 접촉시키기 이전 또는 동안에 상기 산의 추가 중화 단계를 포함하는, 검출 방법.
34. 구현예 26 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플을 결합 화합물과 접촉시키는 것과 동시에 상기 산의 추가 중화 단계를 포함하는, 검출 방법.
35. 구현예 33 또는 34 에 있어서, 상기 중화는 적어도 0.4 부의 0.1 mol/l 중화 버퍼, 하나의 구현예에서 0.1 mol/l 포스페이트 버퍼를 1 부의 샘플/산 혼합물에 첨가하는 것을 포함하는, 검출 방법.
36. 구현예 26 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 포획 화합물 및/또는 상기 검출자 화합물은 (i) 산-처리된 코어 폴리펩티드, 또는 (ii) 산-처리된 코어 폴리펩티드 및 비-산-처리된 코어 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 화합물인, 검출 방법.
37. 구현예 1 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플을 접촉시키는 상기 단계는 상기 샘플을 10℃ 내지 50℃, 하나의 구현예에서 20℃ 내지 45℃, 추가 구현예에서 30℃ 내지 40℃, 추가 구현예에서 37±3℃ 의 온도에서 인큐베이션하는 것을 포함하는, 검출 방법.
38. 구현예 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플을 pH 변화를 유도하는 제제와 접촉시키는 것 및 상기 샘플을 계면활성제와 접촉시키는 것이 동시에 수행되는, 검출 방법.
39. 구현예 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 변성 폴리펩티드는 상기 코어 폴리펩티드가 검출되기 이전에 샘플로부터 제거되지 않는, 검출 방법.
40. 구현예 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 포유류, 하나의 구현예에서 영장류, 추가 구현예에서 인간인, 검출 방법.
41. 구현예 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 HCV 에 감염된 것으로 의심되는 대상체인, 검출 방법.
42. HCV 코어 폴리펩티드의 검출을 위한 대상체로부터의 샘플의 전처리 방법으로서, (a) 상기 샘플을, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와, 및 임의로는 pH 변화를 유도하는 제제와 접촉시키는 단계, 이후 즉시 (b) 상기 샘플을 결합 화합물과 접촉시키는 단계를 후속시켜 포함하는, 전처리 방법.
43. 샘플에서 HCV 검출을 위한 전처리 시약의 용도로서, 상기 전처리 시약은 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제 및 임의로는 pH 변화를 유도하는 제제를 포함하고, 이때 상기 용도는 a) 상기 샘플을 상기 전처리제와 접촉시키는 것, 이후 즉시 b) 상기 샘플을 결합 화합물과 접촉시키는 것을 후속시켜 포함하는, 용도.
44. 구현예 43 에 있어서, 상기 계면활성제는 추가로 비이온성 세제를 포함하는, 용도.
45. 구현예 43 또는 44 에 있어서, 상기 양이온성 세제는 4차 암모늄 세제, 하나의 구현예에서 헥사데실-트리메틸암모늄 염, 하나의 구현예에서 헥사데실-트리메틸암모늄클로라이드 (HTAC, CAS Number 112-02-7) 인, 용도.
46. 구현예 43 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 비이온성 세제는 알킬-글리코시드, 추가 구현예에서 옥틸글리코시드 (n-옥틸-β-D-글루코시드, CAS Number 29836-26-8) 인, 용도.
47. 구현예 43 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 전처리 시약은 알칼리 금속 할로게나이드, 하나의 구현예에서 KCl 또는 NaCl, 추가 구현예에서 KCl 를 추가로 포함하는, 용도.
48. 구현예 43 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 전처리 시약은 상기 알칼리 금속 할로게나이드를 0.5 mol/l 내지 2 mol/l, 하나의 구현예에서 0.75 내지 1.75 mol/l, 추가 구현예에서 1 mol/l 내지 1.25 mol/l, 추가 구현예에서 약 1.125 mol/l, 추가 구현예에서 1.125 mol/l 의 농도로 포함하는, 용도.
49. 구현예 43 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 전처리 시약은 3배 농축된 시약인, 용도.
50. 구현예 43 내지 49 중 어느 하나에 있어서, pH 변화를 유도하는 상기 제제는 염기인, 용도.
51. 구현예 50 에 있어서, 상기 염기는 나트륨 히드록시드, 칼륨 히드록시드 또는 리튬 히드록시드, 하나의 구현예에서 나트륨 히드록시드 또는 칼륨 히드록시드, 추가 구현예에서 칼륨 히드록시드인, 용도.
52. 구현예 50 또는 51 에 있어서, 상기 전처리 시약 중 상기 염기의 농도는 0.1 mol/l 내지 1 mol/l, 하나의 구현예에서 0.15 mol/l 내지 0.5 mol/l, 하나의 구현예에서 0.2 mol/l 내지 0.3 mol/l, 하나의 구현예에서 약 0.25 mol/l, 하나의 구현예에서 0.25 mol/l 인, 용도.
53. 구현예 50 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 전처리 시약은 상기 양이온성 세제를 1.3% (w/v) 내지 2% (w/v) 의 농도로, 및 상기 비이온성 세제를 적어도 0.25% (w/v), 하나의 구현예에서 0.25% (w/v) 내지 2.5%, 추가 구현예에서 0.3% (w/v) 내지 1.5% (w/v) 의 농도로 포함하는, 용도.
54. 구현예 43 내지 49 중 어느 하나에 있어서, pH 변화를 유도하는 상기 제제는 산인, 용도.
55. 구현예 54 에 있어서, 산은 버퍼, 하나의 구현예에서 포스페이트 버퍼, 추가 구현예에서 칼륨 포스페이트 버퍼인, 용도.
56. 구현예 54 또는 55 에 있어서, 버퍼는 6 이하, 하나의 구현예에서 5.5 이하, 추가 구현예에서 5 이하의 pH 를 갖는, 용도.
57. 샘플 처리 유닛을 가진 분석 유닛을 포함하고, 상기 분석 유닛은 제어 유닛과 연결되고, 상기 제어 유닛은 하기 단계들이 수행되게 지시하도록 적합화된, 샘플 내 HCV 의 코어 폴리펩티드를 검출하기 위한 분석 장치:
(a) 상기 샘플 처리 유닛에 적용된 샘플을, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와, 및 임의로는 pH 변화를 유도하는 제제와 접촉시키는 단계, 이후 즉시
(b) 상기 샘플을 결합 화합물과 접촉시키는 단계.
58. 구현예 57 의 분석 장치 및 평가 장치를 포함하는 분석 시스템.
59. 즉시란 1 초 내지 5 분 미만의 타임 프레임이고, 단계 a) 와 b) 간의 타임 프레임은 상기 계면활성제를 상기 샘플에 첨가하는 것으로 시작하며 상기 결합 화합물을 첨가하는 것으로 종료되는, 구현예 1 내지 42 중 어느 하나의 방법, 구현예 43 내지 56 중 어느 하나의 용도, 구현예 57 의 분석 장치, 또는 구현예 58 의 분석 시스템.
60. 제어 유닛이 명시된 타임 프레임 내 단계 (a) 및 (b) 가 수행되게 지시하도록 구조화된, 구현예 59 의 분석 장치 또는 분석 시스템.
본 발명의 추가적인 임의적인 특징 및 구현예는 특히 종속항과 함께 예시적인 구현예의 후속 설명에서 보다 상세히 개시될 것이다. 여기서, 각각의 임의적인 특징들은 당업자가 알 수 있는 바와 같이 임의의 가능한 조합뿐만 아니라 격리된 방식으로 실현될 수 있다. 본 발명의 범위는 제공된 실시예에 의해 제한되지 않는다.
실시예
실시예 1: 방법
재조합 DNA 기술
문헌 [Sambrook, J.et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 에 기술된 바와 같이 DNA 를 조작하는데 표준 방법을 이용하였다. 분자 생물학적 시약을 제조자 지침에 따라 이용하였다.
유전자 및 올리고뉴클레오티드 합성
원하는 유전자 분절을 Geneart GmbH (Regensburg, Germany) 에서의 화학 합성으로 제조하였다. 합성된 유전자 단편을 E. coli 플라스미드에 전파/증폭을 위해 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 시퀀싱으로써 확인하였다. 대안적으로, 짧은 합성 DNA 단편을 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 어닐링함으로써 또는 PCR 을 통해 어셈블링하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Germany) 에 의해 제조되었다.
기본/표준 포유류 발현 플라스미드의 설명
원하는 유전자/단백질 (예를 들어, 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 또는 그의 N-말단에 올리고글리신을 함유하는 Fc-사슬) 의 발현을 위해, 하기의 작용 요소를 포함하는 전사 단위를 이용하였다:
- 인트론 A 를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터 조기 초기 인핸서 (immediate early enhancer) 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역 (5'UTR),
- 쥣과동물 면역글로불린 중쇄 시그널 서열,
- 발현될 유전자/단백질 (예, 전장 항체 중쇄), 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA).
발현될 원하는 유전자를 포함하는 발현 유닛/카세트 외에, 기본/표준 포유류 발현 플라스미드는 하기를 포함한다:
- E.coli 내 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 개시점, 및
- E.coli 에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자.
단백질 측정
정제된 폴리펩티드의 단백질 농도는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 산출된 몰 흡광 계수를 이용하여, 또는 비색 BCA 방법을 이용하여, 280 nm 에서의 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 측정하였다.
모노클로날 항체
모노클로날 항체는 당업자에게 공지된 표준 하이브리도마 기술로써 또는 재조합 핵산 기술로써 제조하였다.
선택된 모노클로날 항체 중 하나를 하기 실시예에서 포획 화합물로서 이용하였고, HCV 코어 단백질의 에피토프 aa 157-169 에 결합시켰다. 매우 유사한 에피토프가 EP 1 308 507 에 이미 개시되어 있다. 검출 화합물로서, EP 0 967 484 및 EP 1 308 507 에 또한 기술된 에피토프와 관련된 에피토프, 에피토프 aa 102-112 에 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 선택하였다. 마우스의 면역화를 위해, HCV 유전자형 1 에 의해 인코딩된 완전 다단백질을 개시한 Genbank Acc. No: P26664.3 GI:130455 에 따르는 유전자형 1a 의 HCV 코어 항원성 서열을 이용하였다. 특히, WO 03/000878 A2, US 2009/0291892 A1, WO 2013/107633 A1 에 개시된 절차에 따라 E.coli SlyD 와의 재조합 융합 단백질로서 아미노산 110-171 로부터의 펩티드를 면역화에 이용하였다. 부가 접근법에서, KLH (keyhole limpet hemocyanin; 키홀 림펫 헤모시아닌) 과 커플링된 아미노산 82-117 로부터의 다수의 펩티드를 공지된 방법에 따라 면역화를 위해 이용하였다.
실시예 2: 항체의 라벨링
비오틴 및 루테늄 모이어티 (moiety) 각각의 항체와의 커플링:
항체를 당업자에게 충분히 익숙한 최첨단 절차에 따라 수득하고 정제하였다.
이의 라벨링을 하기 전에, 오직 검출 항체만을 정제하였다. 이것을 펩신으로 절단하여, F(ab')2 단편을 수득하고 간섭 받기 쉬운 Fc 단편을 제거하였다 (이 방법은 문헌 [A. Johnstone and R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific 1987] 에 기재되어 있음). 정제된 F(ab')2 단편을 동형이작용성 (homobifunctional) 가교 디숙신이미딜 수베레이트 (disuccinimidyl suberate; DSS) 로 추가 중합하고 S400 겔 여과 크로마토그래피에 적용시켜 최적 크기의 F(ab')2 중합체를 모았다 (그 원리는 DE3640412 에 기재되어 있음).
커플링에 있어서, 일반적으로 항체의 리신 ε-아미노기는, N-히드록시-숙신이미드 활성화 화합물에 의해 표적화되었다. 10 mg/ml 의 단백질 농도에서, 항체를 N-히드록시-숙신이미드 활성화 비오티닐화 시약 및 N-히드록시-숙신이미드 활성화 루테늄 라벨링 시약 각각과 반응시켰다. 비오티닐화 또는 루테늄 라벨링 시약의 라벨/단백질 비는 각각 5:1 또는 15:1 이었다. 반응 버퍼는 50 mM 칼륨 포스페이트 (pH 8.5), 150 mM KCl 였다. 반응을 실온에서 15 분 동안 수행하고 L-리신을 10 mM 의 최종 농도로 첨가하여 중단하였다. 라벨의 가수분해 비활성화를 피하기 위해, 각각의 스톡 (stock) 용액을 건조된 DMSO (Sigma-Aldrich, Germany) 에서 제조했다. 커플링 반응 후, 미반응된 자유 비오틴/라벨을, 겔 여과 컬럼 (Superdex 200 HI Load) 을 통해 미정제 (crude) 항체 컨쥬게이트를 통과시키거나 또는 투석에 의해 제거하였다.
실시예 3:
프로토타입 (prototype) Elecsys HCV 코어 항원 검정
Elecsys HCV 코어 항원 검정을 자동화 cobas® e801 분석기 (Roche Diagnostics GmbH) 상에서 수행하였다.
측정을 샌드위치 검정 포맷으로 수행했다. cobas® e801 분석기에서의 시그널 검출은 전기화학발광에 기초한다. 상기 샌드위치 검정에서 비오틴-컨쥬게이트 (즉, 포획 항체) 를 스트렙타비딘-코팅된 자석 비드의 표면 상에 고정화하였다. 검출-항체는 시그널링 모이어티로서 복합화 루테늄 양이온을 가진다. 분석물의 존재 하에서, 루테늄 복합체는 고체 상에 브릿징되고, cobas® e801 분석기의 측정 전지에 포함되어 있는 백금 전극에서 여기 후에 620 nm 에서 빛을 방출한다. 시그널 출력은 임의의 빛 단위이다. 측정을 여러 공급원으로부터 구입한 HCV 코어 항원 양성 및 음성 인간 혈청 및 혈장 샘플로 수행했다.
프로토타입 검정 (예비인큐베이션 이용)
산성 전처리를 위해, 실험적 HCV 코어 항원 검정을 다음과 같이 수행하였다. 30 ㎕ 의 정상 인간 혈청, HCV 항원 양성 샘플 또는 혈액 공여체 샘플 및 15 ㎕ 의 전처리 시약 PT 를 함유하는 세제 (200 mM 칼륨 포스페이트, pH 5.0, 1.125 M KCl, 1.5% 헥사데실트리메틸암모늄클로라이드 (HTAC), 0.5% 옥틸글리코시드) 를, 9 분 동안 함께 인큐베이션하여 항원을 방출하였다.
예비인큐베이션 후 동일한 검정 버퍼 R1 및 R2 (100 mM 칼륨 포스페이트, pH 7.0, 225 mM KCl, 0.5% 나트륨 타우로데옥시콜레이트, 0.3% 쯔비터이온제 (zwittergent) 3-14, 0.1% 옥시피리온, 0.01% 메틸이소티아졸리논, 0.2% 소 혈청 알부민, 0.2% 소 IgG, 50 ㎍/ml MAK33-IgG1, 50 ㎍/ml MAK33-F(ab')2-Poly, 50 ㎍/ml MAK IgG2b/Fab2a-Poly) 에서 21 ㎕ 의 2 ㎍/ml 포획 항체-비오틴 컨쥬게이트 및 24 ㎕ 의 1 ㎍/ml 검출 항체 루테늄 라벨 컨쥬게이트의 첨가를 후속시켰다. 추가적인 9 분 인큐베이션 시간 후, 30 ㎕ 스트렙타비딘-코팅된 상자성 미립자를 첨가하고 추가 9 분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, HCV 코어 항원을 검출하였다 (이들 실험에서 생성된 전기화학발광 시그널을 통해).
알칼리성 전처리의 경우, 전처리 시약 PT 가 1.125 M KCl, 1.5% HTAC, 0.5% 옥틸글루코시드, 0.25 M KOH 인 점, 및 검정 버퍼 R1 및 R2 가 200 mM 칼륨 포스페이트, pH 6.5, 225 mM KCl, 0.5% 나트륨 타우로데옥시콜레이트, 0.3% 쯔비터이온제 3-14, 0.1% 옥시피리온, 0.01% 메틸이소티아졸리논, 0.2% 소 혈청 알부민, 0.2% 소 IgG, 50 ㎍/ml MAK33-IgG1, 50 ㎍/ml MAK33-F(ab')2-Poly, 50 ㎍/ml MAK IgG2b/Fab2a-Poly 인 점을 제외하고는, 검정은 동일하였다.
예비인큐베이션 부재 하 검정
조건은 상기에 명시된 바와 같은 포획 항체-비오틴 컨쥬게이트를 포함하는 버퍼 R1 을, 장치로 작동할 수 있을 만큼 빠르게 (약 12 초 후) 첨가한다는 점을 제외하고는 프로토타입 검정의 조건과 동일하였다.
표 1 의 데이터는 HCV 항원 양성 샘플 및 정상 샘플에서 측정된 실질 카운트뿐 아니라 회수율 (= 예비인큐베이션 부재 하 측정된 카운트/예비인큐베이션 존재 하 측정된 카운트 * 100%) 을 나타낸다. HCV 항원 양성 샘플에 대한 예비인큐베이션 부재 하 평균 회수율은 산성 전처리로는 95%, 알칼리성 전처리로는 97.6% 였다.
Figure 112018129131572-pct00002
SEQUENCE LISTING <110> Roche Diagnostic GmbH F.Hoffmann-La Roche AG Roche Diagnostics Operations, Inc <120> RD33542PC <130> Pretreatment method for rapid detection of HCV core antigen <150> EP16172155.0 <151> 2016-05-31 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 191 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 1 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Lys Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala 180 185 190 <210> 2 <211> 177 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 2 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Lys Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 Phe

Claims (15)

  1. 대상체로부터의 샘플 내 간염 C 바이러스 (HCV) 의 코어 폴리펩티드의 검출 방법으로서,
    (a) 상기 샘플을, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 샘플을, 결합 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 샘플 내 상기 HCV 의 코어 폴리펩티드를 검출하는 단계;
    를 포함하고, 단계 a) 이후 단계 b) 가 즉시 후속되고, 이때, 즉시란 1 초 내지 5 분 미만의 타임 프레임이며, 단계 a) 와 b) 간의 타임 프레임은 상기 계면활성제를 상기 샘플에 첨가하는 것으로 시작하며 상기 결합 화합물을 첨가하는 것으로 종료되며, 단계 (a) 는 적어도 2 pH 단위의 pH 변화를 유도하는 제제와 상기 샘플을 접촉시키는 것을 추가로 포함하는, 검출 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 샘플은 pH 변화를 유도하는 상기 제제와 접촉되고 동시에 상기 계면활성제와 접촉되는, 검출 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 즉시는 5 분 미만, 또는 4 분 미만, 또는 3 분 미만, 또는 2 분 미만, 또는 1 분 미만, 또는 45 초 미만, 또는 30 초 미만, 또는 15 초 미만의 타임 프레임인, 검출 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 양이온성 세제는 4차 암모늄 세제이거나, 또는 헥사데실트리메틸암모늄 염이거나, 또는 헥사데실-트리메틸-암모늄클로라이드 (HTAC, CAS Number 112-02-7) 인, 검출 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 계면활성제는 비이온성 세제, 또는 알킬-글리코시드, 또는 옥틸글리코시드 (n-옥틸-β-D-글루코시드, CAS Number 29836-26-8) 를 추가로 포함하는, 검출 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 화합물은 검출자 화합물, 또는 검출자 항체인, 검출 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 코어 폴리펩티드를 검출하는 상기 단계는 상기 코어 폴리펩티드를 포획 화합물에 의해, 또는 포획 항체에 의해 고체 표면에 포획하는 것을 포함하는, 검출 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코어 폴리펩티드를 검출하는 상기 단계는 샌드위치 면역검정에서 상기 코어 폴리펩티드를 검출하는 것을 포함하는, 검출 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, pH 변화를 유도하는 상기 제제는 염기이거나, 또는 브론스테드-로리 (Brønsted-Lowry) 염기이거나, 또는 수성 용액 중 부가적인 히드록시드 이온을 포함 또는 생성하는 화합물이거나, 또는 알칼리 금속 히드록시드 또는 알칼리 토금속 히드록시드인, 검출 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, pH 변화를 유도하는 상기 제제는 산이거나, 또는 브론스테드-로리 산이거나, 또는 수성 용액 중 부가적인 옥소늄 이온 (히드로늄 이온) 을 포함 또는 생성하는 화합물이거나, 또는 산성 pH 를 가진 버퍼인, 검출 방법.
  11. HCV 코어 폴리펩티드의 검출을 위한 대상체로부터의 샘플의 전처리 방법으로서, (a) 상기 샘플을 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와, 및 적어도 2 pH 단위의 pH 변화를 유도하는 제제와 접촉시키는 단계, 이후 즉시 (b) 상기 샘플을 결합 화합물과 접촉시키는 단계를 후속시켜 포함하고, 이때, 즉시는 1 초 내지 5 분 미만의 타임 프레임이고, 단계 a) 와 b) 간의 타임 프레임은 상기 계면활성제를 상기 샘플에 첨가하는 것으로 시작하며 상기 결합 화합물을 첨가하는 것으로 종료되는, 전처리 방법.
  12. 샘플 내 HCV 를 검출하기 위한 전처리 시약으로서, 상기 전처리 시약은 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제, 및 적어도 2 pH 단위의 pH 변화를 유도하는 제제를 포함하고, 상기 검출은 a) 상기 샘플을 상기 전처리 제제와 접촉시키는 것, 이후 즉시 b) 상기 샘플을 결합 화합물과 접촉시키는 것을 후속시켜 포함하며, 이때, 즉시는 1 초 내지 5 분 미만의 타임 프레임이고, 단계 a) 와 b) 간의 타임 프레임은 상기 계면활성제를 상기 샘플에 첨가하는 것으로 시작하며 상기 결합 화합물을 첨가하는 것으로 종료되는, 전처리 시약.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 전처리 시약은 상기 양이온성 세제를 1.3% (w/v) 내지 2% (w/v) 의 농도로, 및 비이온성 세제를 0.25% (w/v) 이상의 농도로, 또는 0.25% (w/v) 내지 2.5%, 또는 0.3% (w/v) 내지 1.5% (w/v) 의 농도로 포함하는, 전처리 시약.
  14. 샘플 처리 유닛을 가진 분석 유닛을 포함하고, 상기 처리 유닛은 샘플용 리셉터클 (receptacle), 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제, pH 변화를 유도하는 제제, 및 적어도 하나의 검출자 화합물을 포함하고, 상기 분석 유닛은 제어 유닛과 연결되고, 상기 제어 유닛은 하기 단계들이 수행되게 지시하도록 적합화된, 샘플 내 HCV 의 코어 폴리펩티드를 검출하기 위한 분석 장치로서,
    (a) 상기 샘플 처리 유닛에 적용된 샘플을, 양이온성 세제를 포함하는 계면활성제와, 및 적어도 2 pH 단위의 pH 변화를 유도하는 제제와 접촉시키는 단계, 이후 즉시
    (b) 상기 샘플을 결합 화합물과 접촉시키는 단계,
    이때, 즉시는 1 초 내지 5 분 미만의 타임 프레임이고, 단계 a) 와 b) 간의 타임 프레임은 상기 계면활성제를 상기 샘플에 첨가하는 것으로 시작하며 상기 결합 화합물을 첨가하는 것으로 종료되며, 제어 유닛은 단계 (a) 및 (b) 가 지정된 시간 프레임 내에서 수행되게 지시하도록 구성된, 분석 장치.
  15. 제 14 항의 분석 장치 및 평가 장치를 포함하는 분석 시스템.
KR1020187037298A 2016-05-31 2017-05-31 Hcv 코어 항원의 신속한 검출을 위한 전처리 방법 KR102156994B1 (ko)

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