CN102265160B - 肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法 - Google Patents

肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102265160B
CN102265160B CN200980152582.2A CN200980152582A CN102265160B CN 102265160 B CN102265160 B CN 102265160B CN 200980152582 A CN200980152582 A CN 200980152582A CN 102265160 B CN102265160 B CN 102265160B
Authority
CN
China
Prior art keywords
glu
hepatitis
marker
phe
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200980152582.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102265160A (zh
Inventor
曾我朋义
杉本昌弘
末松诚
本间雅
山本武人
铃木洋史
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Keio University
Original Assignee
Keio University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Keio University filed Critical Keio University
Priority to CN201410334142.1A priority Critical patent/CN104198718B/zh
Publication of CN102265160A publication Critical patent/CN102265160A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102265160B publication Critical patent/CN102265160B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/497—Physical analysis of biological material of gaseous biological material, e.g. breath
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5761—Hepatitis B
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G01N33/6812—Assays for specific amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/60—Complex ways of combining multiple protein biomarkers for diagnosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

测定血液中的γ-Glu-X(X为氨基酸和胺)肽类的浓度或AST、ALT的值，由该测定值进行例如多元逻辑回归，从而鉴定健康人、药物性肝损伤、无症状乙型肝炎携带者、无症状丙型肝炎携带者、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、肝癌、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、单纯性脂肪肝(SS)等肝病。

Description

肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法
技术领域
本发明涉及肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法，特别是，涉及将各种肝病患者与健康人识别开从而能够进行筛选的肝病标记物、其测定方法、装置和使用了该肝病标记物的医药品的检验方法。 
背景技术
肝病包括药物性肝炎、乙型、丙型肝炎、肝硬化、肝癌等多种多样的肝病，另外还存在无症状的乙型、丙型病毒的携带者。特别是，七成的丙型肝炎病毒(HCV)感染者由于慢性的肝脏的炎症(慢性肝炎)而逐渐丧失正常的肝细胞，肝脏纤维化，然后发展为肝硬化，进而甚至发展为肝癌。据报道，在10-15％的丙型慢性肝炎患者、80％的肝硬化患者中会产生肝癌。虽然慢性肝炎的状态下不会对生命造成危险，但若产生肝癌，或者肝硬化发展而引起肝功能衰竭的话，则生命的危险迫在眉睫。因此，需要在早期诊断丙型肝炎，驱除病毒。 
丙型肝炎会无症状地从肝硬化发展为肝癌，肝脏的功能极度降低，产生倦怠感、黄疸、意识障碍等各种障碍，但目前在该阶段还没有有效的治疗法。因此，需要在肝脏的功能恶化前，尽早检测症状的发展，实施干扰素给药等治疗等。但是，现状是尚未确立可正确且迅速地鉴定各种肝病的方法。 
通常若被怀疑是肝病，会进行问诊、视诊、触诊，同时测定血中的AST、ALT、γ-GTP、碱性磷酸酶(AL-P)、胆碱酯酶(ChE)、胆红素等肝功能标记物。这些生物化学检查值存在异常时，进行乙型或丙型肝炎病毒检查、超声波检查、X射线、 CT等图像检查。癌的判定中测定血中的AFP、PIVKA-II、CEA等蛋白质的肿瘤标记物。此外，需要正确判断的情况下，进行腹腔镜检查、肝活检(需要住院一周左右)(非专利文献1)。 
这样为了鉴定肝病，必须接受许多检查，在得到判断之前需要花费数天。另外，腹腔镜检查和肝活检还会将患者暴露于危险之下，使其遭受肉体的痛苦。腹腔镜检查和肝活检对患者的负担较大，因此不能为了进行病情的确认等而频繁进行。此外，在现有方法中，许多检查和判断必须由专家来进行，将负担强加于短缺的医疗工作者。因此，强烈期望一种不对患者造成负担、迅速、正确且简便的肝病的判断方法。 
已知的是，肝炎、肝硬化、肝癌等许多肝损伤都是因活性氧的生成(氧化应激)和将其除去的生物体的防御系统的破绽而引起的(非专利文献2)。针对活性氧等氧化应激的生物体的防御中的主要一种是由谷胱甘肽系统产生的。作为组织中以最高浓度存在的抗氧化物质，有还原型谷胱甘肽(GSH：以下称为谷胱甘肽)，通过谷胱甘肽与活性氧、亲电物质结合，这些物质被还原，氧化应激得到抑制。 
但是，若谷胱甘肽减少，则组织、细胞暴露于氧化应激中，会引起各种病情(非专利文献3)。据报道，实际上肝损伤中也会因乙型或丙型肝炎病毒的感染，氧化应激亢进，谷胱甘肽减少，或者在丙型肝炎、肝硬化、肝癌的患者或小鼠中谷胱甘肽减少(非专利文献2、4)。 
通过服用药物而诱发的药物性肝炎也会因氧化应激而引起。解热镇痛药扑热息痛(APAP)在肝脏代谢，生成高毒性的亲电物质N-乙酰对苯醌亚胺(NAQPI)。该NAQPI通过与在肝脏中以高浓度存在的谷胱甘肽(GSH)结合，从而被解毒、排泄掉。但是，亲电物质大量存在的情况下，谷胱甘肽会枯竭， 亲电物质在细胞内蓄积(氧化应激)，与生物体高分子反应。其结果，已知细胞的功能紊乱，引起药物性肝炎等病态。 
迄今为止发明人发现：若对小鼠大量投与APAP，则为了将由APAP的代谢生成的亲电物质NAQPI解毒，谷胱甘肽减少，视晶酸与之成反比地剧增(参见图1的(B))，肝脏和血中的视晶酸的增加表明肝脏的谷胱甘肽由于亲电物质而枯竭(专利文献1、非专利文献5)。 
其机制如下所述。如图1所示，谷胱甘肽(γ-Glu-Cys-Gly)和视晶酸(γ-Glu-2AB-Gly)是由相同的两种酶即γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶生物合成的三肽，差别在于底物(起始物质)为半胱氨酸(Cys)或2-氨基丁酸(2AB)。在图1的(A)所示的通常的还原状态下，肝脏内大量存在谷胱甘肽，最初的酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶被反馈(FB)抑制。因此，视晶酸几乎不被生物合成。但是，如图1的(B)所示的氧化状态那样，若存在亲电物质或活性氧种，则由于解毒而消耗谷胱甘肽。通过谷胱甘肽的减少，反馈抑制被解除，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活化，谷胱甘肽和视晶酸被生物合成。视晶酸在肝脏内蓄积，还排泄到血中。这样通过亲电物质等而形成氧化状态时，肝脏或血液的视晶酸增加，因此视晶酸成为氧化应激的生物标记物。 
另外，还有文献报道，在因肥胖而内脏脂肪增加从而出现问题的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)中，氧化应激标记物的血清硫氧还蛋白(TRX)对于由肝硬化向肝癌发展的非酒精性脂肪肝炎(NASH)和有一个良性过程的单纯性脂肪肝(SS)的识别有用(非专利文献6)。 
另一方面，根据基于毛细管电泳-质谱仪(CE-MS)的试样中的代谢物质测定法的、细胞内的代谢物质的网罗性的测定方法(例如，参见非专利文献5、7和8)，为了监测人或动物的身体状态，定性地且/或定量地确定来自该人或动物的身体的液体样品的低分子化合物(代谢物质)模式和/或肽模式，这里，该液体样品的代谢物质和肽通过毛细管电泳而被分离，接着直接被离子化，然后用通过接口与计算机连接的质谱仪进行检测。为了长期监测该人或动物的身体状态，将表示该状态的参照值和样品值、以及由该值导出的偏差和一致性自动存储于数据库中。在组合毛细管电泳和质量分析而对阴离子性化合物进行分离分析的情况下，已知一种阴离子性化合物的分离分析方法，其特征在于，使用毛细管的内表面预先包覆为阳离子性的包覆毛细管，将电渗流反转(例如，参见专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007-192746号公报 
专利文献2：日本专利第3341765号公报 
非专利文献 
非专利文献1：Callewaert，N.et al.Nat.Med.10，429-434，2004. 
非专利文献2：Loguercio，Carmela et al.Free Radic.Biol.Med.34，1-10，2003. 
非专利文献3：Yadav，Dhiraj et al.Am.J.Gastroenterol.97，2634-2639，2002. 
非专利文献4：Moriya，K.et al.Cancer Res.61，4365-4370，2001. 
非专利文献5：Soga，T.et al.J.Biol.Chem.281，16768-16776，2006. 
非专利文献6：谷川久一编“氧化应激和肝病<第5卷>”Medical Tribune公司，3-37页，2009.5.7. 
非专利文献7：Soga，T.et al.J.Proteome Res.2.488-494，2003. 
非专利文献8：Hirayama，A.et al.Cancer.Res.69：(II).(June1，2009)4918-4925 
非专利文献9：Pignatelli，B.et al.Am.J.Gastroenterol.96，1758-1766，2001. 
发明内容
发明要解决的问题
但是，一直以来，难以通过一次检查识别并鉴定药物性肝炎、乙型、丙型肝炎、肝硬化、肝癌、无症状的乙型或丙型病毒携带者等。 
本发明是为了消除上述现有问题而进行的，其课题在于，通过测定血液中的低分子生物标记物，能够迅速鉴定药物性肝炎、乙型、丙型肝炎、肝硬化、肝癌、无症状的乙型或丙型病毒携带者、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、单纯性脂肪肝(SS)等肝病。 
用于解决问题的方案
如上所述，肝炎、肝硬化、肝癌等许多肝损伤与氧化应激具有很深的关系，因而可以预测视晶酸浓度因各种肝病而变动。因此，从健康人(control：C)、药物性肝损伤(drug induced liver injury：DI)患者、无症状乙型肝炎携带者(asymptomatic hepatitis B carrier：AHB)、无症状丙型肝炎携带者(asymptomatic hepatitis C carrier：AHC)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B：CHB)、慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C：CHC)、肝癌(hepatocellular carcinoma：HCC)的患者采集血液，测定血清中的视晶酸。但是，与小鼠不同，从健康人或药物性肝炎患者中几乎未检测到视晶酸。(小鼠的血清中的视晶酸的浓度为约 2μM，人的血清中的浓度为约1/20左右，在健康人或药物性肝炎患者中几乎未检测到。) 
但是，发明人发现了在各种肝炎患者的血清中显著增加的物质，鉴定这些物质为γ-Glu-X肽类(注：X表示氨基酸和胺)。此外，通过使用血清中的肝功能标记物即AST和ALT的值和γ-Glu-X肽类的浓度，根据多元逻辑回归模式进行多变量分析，从而成功地将各种肝炎患者与其他对象进行区分。 
根据本发现，通过测定血液中的γ-Glu-X肽类的浓度和AST、ALT的值，能够迅速地鉴定健康人、药物性肝损害、无症状乙型肝炎携带者、无症状丙型肝炎携带者、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、肝癌等肝病。 
此外，还能够用于非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、单纯性脂肪肝(SS)的识别。 
本发明是基于上述见解而进行的，涉及一种肝病标记物，其特征在于，其为用于检测哺乳动物的组织中的亲电物质毒性和活性氧(氧化应激)的标记物，并且其为γ-Glu-Gly、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Val、γ-Glu-Thr、γ-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Ile、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Asn、γ-Glu-Asp、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Lys、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Met、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-Glu-Arg、γ-Glu-瓜氨酸、γ-Glu-Tyr中的任一种。 
另外，一种健康人识别用的肝病标记物，其特征在于，其为上述肝病标记物，并且其选自由γ-Glu-Phe、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Glu组成的组。 
另外，一种肝病标记物，其特征在于，其为上述的肝病标记物，并且其还为两个以上的γ-Glu-X(X为氨基酸和胺)肽的组合。这里，可以使所述组合为从多元逻辑回归分析中选择的组合。 
另外，一种药物性肝炎识别用的肝病标记物，其特征在于，其为上述肝病标记物，并且其为至少含有γ-Glu-Thr、γ-Glu-Leu、 γ-Glu-His、γ-Glu-Phe的组合。 
另外，一种肝癌识别用的肝病标记物，其特征在于，其为上述肝病标记物，并且其为至少含有γ-Glu-Val、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Tyr的组合。 
另外，一种无症状乙型肝炎携带者识别用的肝病标记物，其特征在于，其为上述肝病标记物，并且其为至少含有γ-Glu-Val、γ-Glu-Gln、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe的组合。 
另外，一种慢性乙型肝炎识别用的肝病标记物，其特征在于，其为上述肝病标记物，并且其至少含有γ-Glu-Lys。 
另外，一种无症状丙型肝炎携带者识别用的肝病标记物，其特征在于，其为上述肝病标记物，并且其为至少含有AST、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Phe的组合。 
另外，一种慢性丙型肝炎识别用的肝病标记物，其特征在于，其为上述肝病标记物，并且其为至少含有γ-Glu-Ser、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Tyr的组合。 
另外，一种肝病标记物，其特征在于，其为γ-Glu-X肽，X为氨基酸和胺，并且其用于非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)或单纯性脂肪肝(SS)的识别。 
另外，本发明涉及一种肝病标记物的测定方法，其特征在于，测定样品中的γ-Glu-Gly、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Val、γ-Glu-Thr、γ-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Ile、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Asn、γ-Glu-Asp、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Lys、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Met、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-Glu-Arg、γ-Glu-瓜氨酸、γ-Glu-Tyr中的任一者作为肝病标记物。 
另外，涉及一种肝病标记物的测定装置，其特征在于，其具备以下单元：由样品制作适于分析的试样的单元；分析单元，用于测定试样中的γ-Glu-Gly、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Val、γ-Glu-Thr、γ-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Ile、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Asn、γ-Glu-Asp、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Lys、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Met、 γ-Glu-His、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-Glu-Arg、γ-Glu-瓜氨酸、γ-Glu-Tyr中的任一者作为肝病标记物。 
另外，涉及一种医药品的检验方法，其特征在于，其包括以下工序：在医药品的给药前和给药后采集的人的血液中测定上述任一项所述的肝病生物标记物的浓度的工序；在所述医药品的给药前的血液和给药后的血液之间比较所述测定的结果的工序。 
另外，涉及一种医药品的检验方法，其特征在于，其包括以下工序：对于在人中从由投与医药品的一个以上的个体组成的第1组中采集的血液和从由未给药所述医药品的一个以上的个体组成的第2组中采集的血液，测定上述任一项所述的肝病标记物的浓度的工序；在第1组和第2组之间比较所测定的所述肝病标记物的浓度的工序。 
另外，涉及一种肝病标记物的测定方法，其特征在于，测定从除人以外的哺乳动物采集的脏器中的γ-Glu-Gly、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Val、γ-Glu-Thr、γ-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Ile、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Asn、γ-Glu-Asp、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Lys、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Met、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-Glu-Arg、γ-Glu-瓜氨酸、γ-Glu-Tyr中的任一者。 
另外，本发明的肝病的诊断方法的特征在于，其包括以下工序：从作为诊断对象的一个以上的人个体采血的工序；通过上述任一项所述的测定方法测定采集的血液中的本发明的标记物的浓度的工序；将该标记物的浓度与一个以上的正常个体的血液中的标记物浓度进行比较的工序。 
另外，本发明的医药品的亲电性的毒性副作用(投与医药品的情况下产生的氧化应激)的诊断方法的特征在于，其包括以下工序：由医药品给药前和医药品给药后的人的个体采血的工序；通过上述任一项所述的测定方法测定采集的血液中的本发明的标记物的浓度的工序；将该标记物的浓度与一个以上的正常个体的血液中的标记物浓度进行比较的工序。这里，医药品可以为任意种类。 
这里，测定标记物的浓度的工序包括：分别测定从个体采集的血液的工序；测定从两个以上的个体采集的血液的血池(pool)的工序。另外，比较所测定的标记物的浓度的工序包括：逐一比较各测定中得到的浓度的工序；比较各测定中得到的浓度的累加值或者平均值的工序。 
为了检测组织中的氧化应激，可以使用标记物的哺乳动物只要是根据组织中的氧化应激能够在血中测定本发明的标记物的哺乳类，则没有限制，优选为人。 
对于采集用于该诊断方法的血液的哺乳动物没有特别限定，优选为其血液中存在至少一种上述标记物的哺乳动物，更优选为小鼠、大鼠等啮齿类或人、猴、狗。 
发明的效果
根据本发明，通过测定血液中的γ-Glu-X肽类的浓度和AST、ALT的值等，能够迅速地鉴定健康人、药物性肝损害、无症状乙型肝炎携带者、无症状丙型肝炎携带者、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、肝癌、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、单纯性脂肪肝(SS)等肝病。 
附图说明
图1为示意性地示出通过亲电物质和活性氧(氧化应激)生物合成视晶酸的机制的图。 
图2为示出对健康人和肝癌患者的血清中的γ-Glu-X(X为氨基酸和胺)肽类的LC-MS测定结果进行比较的图。 
图3为示出对健康人和各肝炎患者的血清中的AST、ALT、γ-Glu-X肽类的测定结果进行比较的图。 
图4为示出利用AST、ALT、γ-Glu-X肽类的正常情况、各肝病的筛选检查的精度的图。 
图5为示出对肝癌患者和胃癌患者的血清中的γ-Glu-X肽类的浓度进行比较的图。 
图6为示出对投与BSO、DEM小鼠的肝脏中的γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly的定量结果进行比较的图。 
图7为示意性地示出在各种肝病患者中生物合成γ-Glu-X肽类的机制的图。 
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行详细说明。 
如上所述，已知肝炎、肝硬化、肝癌等许多肝损伤与氧化应激具有很深的关系。因此，测定10名健康人(C)、31名药物性肝损害(DI)患者、8名无症状乙型肝炎携带者(AHB)、8名无症状丙型肝炎携带者(AHC)、10名慢性乙型肝炎(CHB)患者、21名慢性丙型肝炎(CHC)患者、14名肝癌(HCC)患者的血清，利用毛细管电泳-飞行时间质谱(CE-TOFMS)法测定视晶酸浓度。但是，发现其他物质在各肝炎患者中优势增加，鉴定它们均为γ-Glu-X肽类(注：X表示氨基酸和胺)。 
1.从血清提取代谢物质 
将从健康人和各种肝炎患者采集的血清(100μl)加入到添加有标准物质的甲醇900μl中，使酶失活，停止代谢的亢进。加入400μl的超纯水、1000μl的氯仿后，在4℃以4600g离心5分钟。静置后，使分离的水-甲醇相750μl通过分级分子量为5kDa的离心超滤器，除去蛋白质。冷冻干燥滤液后，加入50μl的Milli-Q水，将其供于CE-TOFMS和LC-MS测定。 
2.利用毛细管电泳-质谱仪(CE-TOFMS)测定血清中的代 谢物 
使用CE-TOFMS，同时测定健康人和肝炎患者的血清中的低分子代谢产物。 
CE-TOFMS分析条件 
a.毛细管电泳(CE)的分析条件 
毛细管使用熔融石英毛细管(内径50μm、外径350μm、全长100cm)。缓冲液使用1M甲酸(pH约1.8)。以施加电压为+30kV、毛细管温度为20℃的条件进行测定。使用加压法，以50mbar、3秒(约3nl)注入试样。 
b.飞行时间质谱仪(TOFMS)的分析条件 
使用正离子模式，设定为离子化电压4kV、碎裂器电压75V、锥孔电压(skimmer voltage)电压50V、Oct RF电压125V。干燥气体使用氮气，设定为温度300℃、压力10psig。鞘液使用50％甲醇溶液，为了用于质量校正而混入0.5μM利血平(m/z609.2807)，以10μl/min输送液体。对使用利血平(m/z609.2807)和甲醇的加合离子(m/z83.0703)的质量数得到的全部数据进行自动校正。 
3.利用液相色谱仪-质谱仪(LC-MSMS)测定血清中的γ-Glu-X肽类 
为了高灵敏度地进行测定，使用LC-MSMS测定血清中的γ-Glu-X肽类。 
a.液相色谱仪(LC)的分析条件 
分离柱使用野村化学(Nomura Chemical Co.Ltd.)公司制造的Develosil RPAQUEOUS-AR-3(内径2mm×长度100mm、3μm)，柱温箱设定为30℃。注入1μl试样。流动相A使用0.5％甲酸、流动相B使用乙腈，利用B液为0％(0min)-1％(5min)-10％(15min)-99％(17min)-99％(19min)的流速0.2ml/min的梯 度洗脱法将γ-Glu-X肽类分离。 
b.三重串联四极杆质谱仪(QqQMS)的分析条件 
使用Applied Biosystem公司制造的API3000三重串联四极杆质谱仪，以正离子模式的MRM模式进行测定。各质谱仪的参数如下所示。 
离子源喷射电压：5.5kV 
喷雾器气体压力：12psi 
气帘气体压力：8psi 
碰撞气体：8单位 
氮气温度：550℃ 
将为了测定各γ-Glu-X肽类而最优化的MRM参数示于表1。 
[表1] 
4.肝损伤生物标记物的探索和评价 
图2示出了使用LC-MS测定健康人和肝癌(HCC)患者的血清中的γ-Glu-X肽类的结果。可知，与健康人相比，许多γ-Glu-X肽类在肝癌患者(HCC)中增加。另外，在其他肝损伤中，γ-Glu-X肽类的浓度也比健康人显著更高。 
图3示出了健康人(C)和各种肝炎患者的血清中的AST、ALT值和γ-Glu-X肽类的测定结果。图中，箭头表示最大值、最小值，箱的上方表示上四分位数，箱的下方表示下四分位数，箱中的横线表示中位数。 
以往的肝功能检查值即AST、ALT值在药物性肝炎(DI)、慢性乙型肝炎(CHB)、慢性丙型肝炎(CHC)中上升，但在其他肝炎中与健康人的值没有显著性差异。 
但是，与健康人(C)相比，γ-Glu-Ser、γ-Glu-Thr等γ-Glu-X肽类在药物性肝炎(DI)中浓度高，在其他肝炎中显示出更高的值。特别是在无症状乙型肝炎(AHB)、无症状丙型肝炎(AHC)、肝癌(HCC)中γ-Glu-X肽类均显示出高值。另外，具体来看，对于几种γ-Glu-X肽类而言，与无症状乙型肝炎(AHB)相比在无症状丙型肝炎(AHC)中更高，或者与无症状乙型肝炎(AHB)相比在慢性乙型肝炎(CHB)中更高，或者即便是相同的丙型肝炎，随着疾病以无症状(AHC)、慢性肝炎(CHC)、肝癌(HCC)的步骤发展，观察到值降低的倾向。 
这样，AST、ALT和各γ-Glu-X肽类的血药浓度因各疾病而异，因而考虑是否可以利用这些成分的值来判断各疾病。因此，以选择用于区别各肝病的生物标记物为目标，进行了多变量分析手法的多元逻辑回归分析。结果示于表2。 
[表2] 
在多元逻辑回归分析中，对于作为目标变量的比率p，使用k个解释变量x1、x2、x3、...、xk，求出 
ln(p/1-p)＝b0+b1x1+b2x2+b3x3+...+bkxk…(1) 
这样的p的回归式，表2中的参数的值为放入(1)式的b0、b1、...bk中的具体值。(Intercept，截矩)指常数项(b0)的值。 
另外，根据病例计算概率时，例如在药物性肝炎DI的组中，使表中的(Intercept，截矩)的值27.3为b0、ALT的值0.0401为b1、γ-Glu-Thr的值21.5为b2、...、γ-Glu-Phe的值41.5为b5，将ALT 的定量值代入x1、γ-Glu-Thr的定量值代入x2、...、γ-Glu-Phe的定量值代入x5，得出具体的值。将推定的参数的标准误差和95％置信区间也示于表中。 
由该分析结果发现了能够选择性地区别包括健康人(C)在内的多种肝炎患者的候补生物标记物。例如，可知识别健康人(C)的生物标记物为γ-Glu-Phe，通过γ-Glu-Phe的值而能够与其他肝病区分。另外，由图3可知，还能够使用γ-Glu-Ser、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Glu。 
另外，药物性肝炎(DI)的生物标记物为ALT、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Leu、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe，通过将它们组合，进行例如逻辑回归分析，p的值大于规定值、例如大于0.5，从而能够与其他肝病区分。其中，表示定量值x1增加1时概率p有多大变化的比数比在(odds ratio)超过1的、最大的γ-Glu-Phe的值，最有助于药物性肝炎(DI)的判断。另一方面，比数比接近0的γ-Glu-Leu或γ-Glu-His，这些物质的增加有助于除药物性肝炎以外(非DI)的判断。ALT的比数比为1.04，接近伴随着变量增加而p无变化的1.0，因此贡献较小，可以省略。 
另外，肝癌(HCC)的生物标记物为AST、ALT、γ-Glu-Val、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Tyr，通过将它们组合，进行例如逻辑回归分析，p的值大于规定值、例如大于0.5，从而能够与其他肝病区分。其中，比数比超过1的、最大的γ-Glu-Tyr的值，最有助于肝癌(HCC)的判断。另一方面，比数比接近0的γ-Glu-Thr或γ-Glu-Leu，伴随着这些物质的增加，有助于除肝癌以外(非HCC)的判断。AST和ALT的比数比分别为1.16、0.807，接近1，贡献率小，因此可以省略。 
同样地，对于其他疾病，也发现了表2所示的各个候补生物标记物。无症状乙型肝炎携带者(AHB)的生物标记物为ALT、 γ-Glu-Val、γ-Glu-Gln、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe，慢性乙型肝炎(CHB)的生物标记物为AST、γ-Glu-Lys，无症状丙型肝炎携带者(AHC)的生物标记物为AST、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Phe，慢性丙型肝炎(CHC)的生物标记物为γ-Glu-Ser、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Tyr。其中，比数比接近1的生物标记物，例如判断AHB时的ALT(1.04)、判断CHB时的AST(1.01)等也可以省略。 
实施逐步变量选择，寻找所需最小的标记物的组合。即，采用从最初变量0个开始重复追加重要度高的变量、删减重要度低的变量，从而求出最适组合的变量增减法。本次，追加和删减均利用p值＝0.25作为阈值。 
但是，对于这些生物标记物的贡献率而言，根据病例数据的追加，重新研究模型，进行各判断中使用的生物标记物的组合和逻辑模型中的系数的修正，还可以进一步提高逻辑模型的精度。 
接下来，通过接受者操作特征曲线(ROC曲线)对利用这些生物标记物的各肝病筛选检查的精度进行评价。结果示于图4和表3中。 
[表3] 
图4和表3中示出了区别某个疾病组与其他所有疾病组的多元逻辑回归模型的精度。例如，在药物性肝损害(DI)的情况 下，进行DI与除DI以外所有疾病的区分。如图4和表3中所示，所有疾病的ROC曲线下面积(area under the receiver-operating curve：AUC)为0.81～0.99，可以确认利用了这些生物标记物的各肝病筛选检查能够以高精度鉴定各疾病。特别是，可知通过本法可以以极高的精度鉴定健康人(C：AUC＝0.939)、药物性肝损伤(DI：AUC＝0.998)、无症状乙型肝炎携带者(AHB：AUC＝0.933)、无症状丙型肝炎携带者(AHC：AUC＝0.944)、肝癌(HCC：AUC＝0.937)。 
5.其他疾病中的γ-Glu-X肽的评价 
确认γ-Glu-X肽类在其他疾病中是否也上升。图5示出了肝癌患者(HCC)和胃癌患者(gastric cancer：GC)的血清中的γ-Glu-X肽类的浓度。在胃癌患者中，γ-Glu-X肽类的浓度与健康人相同，没有观察到肝癌患者那样的γ-Glu-X肽类的增加。(注：有文献报道，幽门螺旋杆菌的感染是胃癌的原因，由于幽门螺旋杆菌的感染，氧化应激得到抑制(参考文献10)。由于胃癌没有暴露于氧化应激下，因此推测γ-Glu-X肽类的浓度低。) 
另外，在糖尿病患者中，血中的γ-Glu-X肽类的浓度也低，肝病特异性地观察到血中的γ-Glu-X肽类的增加。 
6.γ-Glu-X肽类的生物合成机制的阐明 
使用小鼠阐明γ-Glu-X肽类的生物合成机制。如图1的(B)所示，可知，在利用活性氧和亲电物质的氧化应激条件下，为了除去这些物质，谷胱甘肽枯竭，与之相伴γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)被活化，各种氨基酸成为底物(起始物质)，生物合成γ-Glu-X二肽类或γ-Glu-X-Gly三肽类。以下示出实验步骤。 
a.对小鼠投与GCS抑制剂BSO和活化剂DEM 
对断食一晚的雄性小鼠腹膜内注射戊巴比妥钠(每1Kg体 重为60mg)使其麻醉后，分别以每1Kg体重为4mmol/kg(BSO888mg、DEM688mg)的量腹腔内注射γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)抑制剂BSO、亲电物质(GCS活化剂)马来酸二乙酯(DEM)、以及作为正常情况的生理盐水。给药1小时后从小鼠采集肝脏(约300mg)(各5次)。 
b.从肝脏提取代谢物质 
将从小鼠中摘除的肝脏(约300mg)立即放入添加有内标物质的甲醇1ml中，均质化而使酶失活，停止代谢的亢进。加入500μl的纯水后，取出300μl的溶液，加入200μl的氯仿并充分搅拌后，再在4℃的条件下以15000rpm离心15分钟。静置后，使分离的水-甲醇相300μl通过分级分子量为5kDa的离心超滤器，除去蛋白质。冷冻干燥滤液后，加入50μl的Milli-Q水，将其供于CE-TOFMS测定。 
c.示出氧化应激的γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly肽类生物标记物的鉴定结果 
将投与生理盐水(正常情况)、BSO、DEM后的小鼠的肝脏和血清中的氨基酸、γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly肽类的测定结果的一部分示于图6。左侧表示从投与各试剂的小鼠的肝脏检测出的氨基酸(X)、γ-Glu-X肽、γ-Glu-X-Gly肽的定量结果，右侧表示血清中的氨基酸(X)、γ-Glu-X肽、γ-Glu-X-Gly肽的定量结果。 
例如，最上面为Cys、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Cys-Gly(谷胱甘肽)的结果。与正常情况相比，肝脏中的谷胱甘肽量在投与BSO、DEM的小鼠中急剧减少(投与BSO的情况下，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶被抑制，因此谷胱甘肽减少；投与亲电物质DEM的小鼠中，为了解毒而有所消耗，因此谷胱甘肽减少)。从血清中未检测出谷胱甘肽相关物质。 
通过以下方法确认所检测出的γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly肽类由谷胱甘肽生物合成路径合成。如图7所示，如果这些肽类是由谷胱甘肽生物合成路径合成的，则肝脏中的γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly肽应该会因BSO给药(由于γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶被抑制)而与正常的情况相比减少，因亲电物质DEM给药(由于γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶被活化)而增加。如图6所示，与谷胱甘肽相关的除γ-Glu-Cys、GSH、γ-Glu-Ser-Gly以外的肝脏中的γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly肽类物质，与正常的情况相比因BSO给药而减少，因DEM给药而增加，确认了的确是由谷胱甘肽生物合成路径而生成的。 
即，可知，这些γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly肽类通过活性氧、亲电物质等氧化应激在谷胱甘肽减少时在肝脏内生物合成。 
d.利用苏氨酸同位素追踪生物合成路径 
进而，腹腔内投与苏氨酸(Thr)的13C、15N的同位素，加入产生亲电物质、提供氧化应激的APAP，结果从小鼠的肝脏中检测出Thr的13C、15N的γ-Glu-Thr、γ-Glu-Thr-Gly，确认到的确在氧化应激条件下由Thr生物合成γ-Glu-Thr、γ-Glu-Thr-Gly。 
另一方面，在小鼠的血清中的物质中，与正常的情况相比因BSO给药而减少、因亲电物质DEM给药而增加的γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly肽类仅为γ-Glu-2AB和视晶酸(γ-Glu-2AB-Gly)(图6)。因此认为，在小鼠的情况下，通过亲电体等氧化应激，在谷胱甘肽减少时在血中增加的仅为γ-Glu-2AB和视晶酸。 
但是，在各种肝炎患者的血清测定中，与γ-Glu-2AB、视晶酸相比，其他γ-Glu-X肽类的浓度更高。该差异推测是因为，在生物物种间，底物浓度、代谢酶的底物特异性或活性、转运体的种类、功能、表达量等不同。 
利用了本发明的血清中的γ-Glu-X肽类测定的诊断法，还可以对肝硬化(cirrhosis)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性肝炎(NASH)、单纯性脂肪肝(SS)等各种肝病进行诊断。本次记载了各种肝损伤的候补标记物AST、ALT、γ-Glu-X肽类的组合的例子，但不限定于此，今后通过进一步进行多样品的详细调查，也可以改变候补生物标记物的种类组合。 
另外，本次血清中的γ-Glu-X肽类测定使用了LC-MS法，不限定于气体色谱法(GC)、液相色谱法(LC)、毛细管电泳(CE)、芯片LC、芯片CE、对它们组合了质谱仪(MS)的GC-MS、LC-MS、CE-MS法、各种MS单独的测定法、NMR法、将γ-Glu-X肽类衍生为荧光物质或UV吸收物质后进行测定的方法、制作抗体后用ELISA法等进行测定等的测定法，能够用所有分析法进行测定。 
本发明的医药品的检验方法为在哺乳动物中对于从投与了该医药品的哺乳动物采集的血液和从未投与该医药品的哺乳动物采集的血液测定本发明的标记物的浓度的方法。需要说明的是，对于采集用于该检验方法的血液的哺乳动物没有特别限定，优选为其血液中存在至少一种上述标记物的哺乳动物，更优选为小鼠、大鼠等啮齿类或人、猴、狗。 
这里，在检验医药品作为针对亲电物质毒性和活性氧(氧化应激)的治疗药的有效性的情况下，适用医药品的对象疾病只要是由氧化应激所产生的疾病则没有限定，与上述那样的作为标记物的使用对象的疾病相同。另外，在检验由医药品给药所产生的氧化应激的强度的情况下，医药品的种类完全不受限定，例如，有害药物也包含在医药品中。 
需要说明的是，本发明的检验方法的目的为，检验作为针对由氧化应激所产生的疾病的治疗药的医药品的有效性、以及检验由医药品给药所产生的氧化应激的强度，具体地说可在各 种情况下使用。以下，对代表性的使用例进行说明，但本发明的检验方法不限于这些例子。 
(1)作为治疗药的有效性的检验 
以下，说明针对肝炎的使用例，但本发明的检验方法不限于这些例子。 
(1-1)特定个体中的药效检验 
例如，使用本发明的检验方法，可以判断某种肝炎治疗药是否对治疗特定患者的肝炎有效。首先，在对患有肝炎的患者投与肝炎治疗药的前后，从该患者采集血液。接下来，在该血液中，测定肝炎诊断标记物的浓度。在投与肝炎治疗药的前后对如此得到的血液中的标记物浓度进行比较。此时，如果肝炎治疗药给药后的血液中标记物浓度与给药前相比显著降低，则可以判断肝炎治疗药对治疗该患者的肝炎有效。 
(1-2)一般性药效检验 
进而，通过将本发明的检验方法适用于两个以上的人个体，从而还可以检验该医药品作为肝炎治疗药的一般性有效性。 
例如，在患有肝炎的两个以上的人中，通过在投与肝炎治疗药的前后比较肝炎诊断标记物的浓度，从而能够调查该物质作为治疗药的普遍效果。 
或者，作为其他方式，也可以在两组之间比较作为医药品的效果。首先，将患肝炎的患者分为两组。对一组患者投与肝炎治疗药，对另一组患者不投与该治疗药，或给药安慰剂。从这两组患者采集血液。接下来，在该血液中测定肝炎诊断标记物的浓度。此外，在两组之间对由该测定得到的血液中的标记物浓度进行比较。 
需要说明的是，“组”可以仅包含一个个体，也可以包含两个以上的个体，两组的个体数可以相同，也可以不同。测定中， 可以将从相同组的个体中采集的血液形成血池(pool)，测定该血液中的标记物浓度，但优选对各个个体的血液分别测定标记物浓度。 
医药品给药的前后或给药的有无等、包含多种血液的组间的标记物浓度的比较，可以对每一个血液分别进行比较，也可以将属于相同组的多种血液中的标记物浓度的累加值或平均值在组间进行比较。该比较可以使用本领域技术人员公知的任何统计学方法来进行。这样比较的结果，如果在治疗药的给药后与给药前相比血液中标记物浓度显著降低，或者在治疗药的给药组中与非给药组相比显著降低的话，则可以判断该治疗药对于肝炎的治疗有效。另外，还可以根据降低的程度来判断具有何种程度的有效性。 
这样，通过对作为肝炎治疗药的一般性有效性进行检验，能够进行肝炎治疗药的筛选。另外，通过使用两种以上的肝炎治疗药，对不同浓度的各肝炎治疗药进行治疗效果的调查，比较依赖于浓度的药效的差异，从而还可以调查各肝炎治疗药的强度。 
(2)氧化应激的强度的检验 
氧化应激强时副作用的表现强，因此，以下，作为一个例子对于针对医药品的副作用的使用例进行说明，但本发明的检验方法不限于这些例子。 
(2-1)鉴定个体中的副作用的强度的检验 
使用本发明的检验方法，可以判断某种医药品是否会对特定的哺乳动物个体带来副作用。首先，在对个体投与治疗用的医药品的前后，从该个体采集血液。接下来，在该血液中测定氧化应激检测标记物的浓度。在投与医药品的前后对如此得到的血液中的标记物浓度进行比较。此时，若医药品给药后的血 液中标记物浓度与给药前相比显著增加，则可以判断所给药的医药品在该个体中产生氧化应激，对该个体带来了副作用。 
(2-2)一般性副作用的强度的检验 
此外，通过将本发明的检验方法适用于两个以上的哺乳动物个体，还可以检验某种医药品的一般性副作用的强度。 
例如，在患有某种疾病的两个以上的个体中，通过在投与该疾病治疗用医药品的前后对氧化应激检测标记物的浓度进行比较，能够调查该医药品一般性副作用的强度。 
或者，作为其他方式，也可以在两组之间比较副作用的强度。首先，将患有某种疾病的哺乳动物分为两组。对一组个体投与该疾病治疗用医药品，对另一组个体不投与该医药品或投与安慰剂。从这两组个体采集血液。接下来，在该血液中测定氧化应激检测标记物的浓度。此外，在两组之间对由该测定得到的血液中的标记物浓度进行比较。需要说明的是，“组”可以仅包含一个个体，也可以包含两个以上的个体，两组的个体数可以相同，也可以不同。测定中，可以将从相同组的个体中采集的血液形成血池(pool)，测定该血液中的标记物浓度，但优选对各个个体的血液分别测定标记物浓度。 
组间的标记物浓度的比较可以对每一个血液分别进行比较，也可以将属于相同组的多种血液中的标记物浓度的累加值或平均值在组间进行比较。该比较可以使用本领域技术人员公知的任何统计学方法来进行。这样比较的结果，如果在医药品的给药后与给药前相比血液中标记物浓度显著上升，或者在医药品的给药组中与非给药组相比显著上升的话，则可以判断该医药品具有副作用。 
这样，通过检验作为医药品的副作用的强度，能够进行副作用弱的医药品的筛选。另外，通过使用两种以上的医药品， 对不同浓度的各医药品调查作为医药品的效果，同时比较依赖于浓度的副作用的差异，从而还可以对各医药品作为治疗药的适应性进行比较。 
如上所述，本发明的氧化应激检测标记物能够用于肝病治疗用医药品的检验或者医药品的副作用的强度的检验、以及疾病的诊断等中。此时，通过使用两个以上的标记物，能够提高检验精度和诊断精度。另外，也可以将除本发明的标记物以外的检验方法、诊断方法进行组合。 
产业上的可利用性
本发明中发现的通过在生物体中产生的氧化应激而表现出谷胱甘肽的枯竭的γ-Glu-X肽生物标记物，不仅作为各种肝病患者的迅速的筛选法有用，而且作为掌握生物体的氧化应激的标记物，能够在广泛的生命科学领域中使用。 

Claims (9)

1.γ-Glu-X肽在制备用于检测人的组织中的氧化应激的肝病标记物中的应用，所述γ-Glu-X肽为γ-Glu-Gly、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Val、γ-Glu-Thr、γ-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Ile、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Asn、γ-Glu-Asp、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Lys、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Met、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-Glu-Arg、γ-Glu-瓜氨酸、γ-Glu-Tyr中的任一种，其中，γ-Glu-Phe、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Gly或γ-Glu-Glu用于制备识别健康人和肝炎患者的肝病标记物，所述肝炎为药物性肝炎、无症状乙型肝炎携带者、无症状丙型肝炎携带者、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎或肝癌，γ-Glu-Thr、γ-Glu-Leu、γ-Glu-His或γ-Glu-Phe用于制备药物性肝炎的标记物，γ-Glu-Val、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Phe或γ-Glu-Tyr用于制备肝癌标记物，γ-Glu-Val、γ-Glu-Gln、γ-Glu-His或γ-Glu-Phe用于制备无症状乙型肝炎携带者的标记物，γ-Glu-Lys用于制备慢性乙型肝炎的标记物，γ-Glu-Gly或γ-Glu-Phe用于制备无症状丙型肝炎携带者的标记物，γ-Glu-Ser、γ-Glu-Phe或γ-Glu-Tyr用于制备慢性丙型肝炎的标记物。
2.γ-Glu-X肽在制备识别健康人和肝病患者的肝病标记物中的应用，其特征在于，所述γ-Glu-X肽选自由γ-Glu-Phe、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Glu组成的组中的任一种，所述肝病为药物性肝炎、无症状乙型肝炎携带者、无症状丙型肝炎携带者、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎或肝癌。
3.两个以上的γ-Glu-X肽的组合在制备肝病标记物中的应用，其特征在于，所述γ-Glu-X肽选自γ-Glu-Gly、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Val、γ-Glu-Thr、γ-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Ile、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Asn、γ-Glu-Asp、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Lys、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Met、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-Glu-Arg、γ-Glu-瓜氨酸、γ-Glu-Tyr，其中，γ-Glu-Phe、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Glu中的两个以上的组合用于制备识别健康人和肝炎患者的肝病标记物，所述肝炎为药物性肝炎、无症状乙型肝炎携带者、无症状丙型肝炎携带者、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎或肝癌，γ-Glu-Thr、γ-Glu-Leu、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe中的两个以上的组合用于制备药物性肝炎的标记物，γ-Glu-Val、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Tyr中的两个以上的组合用于制备肝癌标记物，γ-Glu-Val、γ-Glu-Gln、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe中的两个以上的组合用于制备无症状乙型肝炎携带者的标记物，γ-Glu-Gly和γ-Glu-Phe用于制备无症状丙型肝炎携带者的标记物，γ-Glu-Ser、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Tyr中的两个以上的组合用于制备慢性丙型肝炎的标记物。
4.两个以上的γ-Glu-X肽的组合在制备药物性肝炎识别用的肝病标记物中的应用，其特征在于，所述γ-Glu-X肽选自γ-Glu-Gly、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Val、γ-Glu-Thr、γ-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Ile、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Asn、γ-Glu-Asp、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Lys、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Met、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-Glu-Arg、γ-Glu-瓜氨酸、γ-Glu-Tyr，并且所述两个以上的γ-Glu-X肽的组合为至少含有γ-Glu-Thr、γ-Glu-Leu、γ-Glu-His或γ-Glu-Phe的组合。
5.两个以上的γ-Glu-X肽的组合在制备肝癌识别用的肝病标记物中的应用，其特征在于，所述γ-Glu-X肽选自γ-Glu-Gly、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Val、γ-Glu-Thr、γ-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Ile、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Asn、γ-Glu-Asp、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Lys、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Met、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-Glu-Arg、γ-Glu-瓜氨酸、γ-Glu-Tyr，并且所述两个以上的γ-Glu-X肽的组合为至少含有γ-Glu-Val、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Phe或γ-Glu-Tyr的组合。
6.两个以上的γ-Glu-X肽的组合在制备无症状乙型肝炎携带者识别用的肝病标记物中的应用，其特征在于，所述γ-Glu-X肽选自γ-Glu-Gly、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Val、γ-Glu-Thr、γ-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Ile、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Asn、γ-Glu-Asp、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Lys、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Met、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-Glu-Arg、γ-Glu-瓜氨酸、γ-Glu-Tyr，并且所述两个以上的γ-Glu-X肽的组合为至少含有γ-Glu-Val、γ-Glu-Gln、γ-Glu-His或γ-Glu-Phe的组合。
7.至少含有γ-Glu-Lys的γ-Glu-X肽的组合在制备慢性乙型肝炎识别用的肝病标记物中的应用，其特征在于，所述γ-Glu-X肽为γ-Glu-Gly、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Val、γ-Glu-Thr、γ-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Ile、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Asn、γ-Glu-Asp、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Lys、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Met、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-Glu-Arg、γ-Glu-瓜氨酸、γ-Glu-Tyr中的任一种。
8.两个以上的γ-Glu-X肽的组合在制备无症状丙型肝炎携带者识别用的肝病标记物中的应用，其特征在于，所述γ-Glu-X肽选自γ-Glu-Gly、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Val、γ-Glu-Thr、γ-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Ile、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Asn、γ-Glu-Asp、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Lys、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Met、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-Glu-Arg、γ-Glu-瓜氨酸、γ-Glu-Tyr，并且所述两个以上的γ-Glu-X肽的组合为至少含有γ-Glu-Gly或γ-Glu-Phe的组合。
9.至少含有γ-Glu-Ser、γ-Glu-Phe或γ-Glu-Tyr的γ-Glu-X肽的组合在制备慢性丙型肝炎识别用的肝病标记物中的应用，其特征在于，所述γ-Glu-X肽为γ-Glu-Gly、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Val、γ-Glu-Thr、γ-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Ile、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Asn、γ-Glu-Asp、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Lys、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Met、γ-Glu-His、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-Glu-Arg、γ-Glu-瓜氨酸、γ-Glu-Tyr中的任一种。
CN200980152582.2A 2008-12-24 2009-11-26 肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法 Active CN102265160B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410334142.1A CN104198718B (zh) 2008-12-24 2009-11-26 肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008328133 2008-12-24
JP2008-328133 2008-12-24
PCT/JP2009/069950 WO2010073870A1 (ja) 2008-12-24 2009-11-26 肝臓疾患マーカー、その測定方法、装置及び医薬品の検定方法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410334142.1A Division CN104198718B (zh) 2008-12-24 2009-11-26 肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102265160A CN102265160A (zh) 2011-11-30
CN102265160B true CN102265160B (zh) 2014-07-23

Family

ID=42287488

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980152582.2A Active CN102265160B (zh) 2008-12-24 2009-11-26 肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法
CN201410334142.1A Active CN104198718B (zh) 2008-12-24 2009-11-26 肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410334142.1A Active CN104198718B (zh) 2008-12-24 2009-11-26 肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20110256561A1 (zh)
EP (1) EP2381259B1 (zh)
JP (2) JP5676275B2 (zh)
CN (2) CN102265160B (zh)
WO (1) WO2010073870A1 (zh)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102971632B (zh) * 2010-06-18 2015-09-02 学校法人庆应义塾 肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法
WO2012030177A2 (ko) 2010-09-01 2012-03-08 엘지전자 주식회사 디지털 수신기 및 디지털 수신기에서의 3d 컨텐트 처리 방법
JP6260275B2 (ja) * 2011-06-30 2018-01-17 味の素株式会社 脂肪肝の評価方法、脂肪肝評価装置、脂肪肝評価方法、脂肪肝評価プログラム、脂肪肝評価システム、および端末装置
WO2013005790A1 (ja) * 2011-07-07 2013-01-10 味の素株式会社 生体酸化の評価方法、生体酸化評価装置、生体酸化評価方法、生体酸化評価プログラム、生体酸化評価システム、情報通信端末装置、および生体酸化の予防・改善物質の探索方法
WO2013011919A1 (ja) * 2011-07-15 2013-01-24 味の素株式会社 Ｎａｓｈの評価方法、ｎａｓｈ評価装置、ｎａｓｈ評価方法、ｎａｓｈ評価プログラム、ｎａｓｈ評価システム、情報通信端末装置、およびｎａｓｈの予防・改善物質の探索方法
US20140315327A1 (en) * 2011-12-02 2014-10-23 C2N Diagnostics Methods for Measuring Concentrations of Biomolecules
CN103901212B (zh) * 2014-03-28 2015-07-22 西北大学 一种基于唾液糖结合蛋白鉴别肝系列病的糖芯片及其应用
WO2016163539A1 (ja) * 2015-04-10 2016-10-13 社会福祉法人恩賜財団大阪府済生会吹田病院 肝疾患の病態を判別する方法
EP3465216B1 (en) * 2016-05-31 2020-04-08 Roche Diagnostics GmbH Pretreatment method for rapid detection of hcv core antigen
EP3373012A1 (en) * 2017-03-07 2018-09-12 Biopredictive Method of diagnosis of drug induced liver injury
CN107090013A (zh) * 2017-03-31 2017-08-25 华南理工大学 一种寡肽及其制备方法与应用
CN106977583A (zh) * 2017-03-31 2017-07-25 华南理工大学 一种寡肽及其制备方法与应用
US20200124619A1 (en) * 2017-10-25 2020-04-23 Pharmk Corporation Biomarkers for liver function
CN110501443B (zh) * 2019-09-17 2020-09-29 山东农业大学 无创识别/预警脂肪肝奶牛的新型生物标记物
KR102521988B1 (ko) * 2021-07-08 2023-04-17 경북대학교 산학협력단 감마-글루타밀티로신을 포함하는 암 치료 또는 예방용 약제학적 조성물

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1155571C (zh) * 1997-12-25 2004-06-30 克莱格门特制药有限责任公司 含有γ-谷氨酰基和β-天冬氨酰基的免疫调制剂化合物及其制备方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5786336A (en) * 1991-04-29 1998-07-28 Terrapin Technologies, Inc. Target-selective protocols based on mimics
JP3620037B2 (ja) * 1998-09-14 2005-02-16 ニプロ株式会社 γ−グルタミルトランスフェラーゼ活性測定用試薬
DE602004004775T2 (de) * 2004-08-12 2007-11-22 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Diagnose von Leberfibrose.
WO2006113522A2 (en) * 2005-04-15 2006-10-26 Kye-Hyung Paik Methods of detecting hepatitis c virus
CA2621910A1 (en) * 2005-09-07 2007-03-15 Human Metabolome Technologies, Inc. Method for calibrating detected mass in mass spectrometry system
FR2893136A1 (fr) * 2005-11-10 2007-05-11 Sanofi Aventis Sa Procedes de diagnostic de maladies hepatiques et de criblage de molecules pour le traitement de ces maladies
JP4840804B2 (ja) * 2006-01-20 2011-12-21 学校法人慶應義塾 酸化ストレスの判定方法
WO2008156662A1 (en) * 2007-06-14 2008-12-24 George Mason Intellectual Properties, Inc. Methods of diagnosing non-alcoholic steatohepatitis (nash)
JP5270684B2 (ja) * 2007-11-02 2013-08-21 メタボロン、インコーポレイテッド 脂肪肝疾患用のバイオマーカー及びその使用方法
CA2733518A1 (en) * 2008-08-06 2010-02-11 Sciclone Pharmaceuticals, Inc. Treatment or prevention of hepatitis c with immunomodulator compounds
JP2011232164A (ja) * 2010-04-27 2011-11-17 Keio Gijuku 肝臓疾患マーカー、その測定方法、装置及び医薬品の検定方法
CN102971632B (zh) * 2010-06-18 2015-09-02 学校法人庆应义塾 肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1155571C (zh) * 1997-12-25 2004-06-30 克莱格门特制药有限责任公司 含有γ-谷氨酰基和β-天冬氨酰基的免疫调制剂化合物及其制备方法

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Akira Kanazawa.Identification ofγ-glutamylserine, γ-glutamylalanine, γ-glutamylvaline and S-methylglutahione of bovine brain.《Biochimica Et Biophysica ACTA》.1965,第3卷
Glutathione:Systemic Protectant Against Oxidative and Free Radical Damage;Parris M.Kidd;《Alternative Medicine Review》;19971231;第2卷(第3期);155-176 *
Identification ofγ-glutamylserine, γ-glutamylalanine, γ-glutamylvaline and S-methylglutahione of bovine brain;Akira Kanazawa;《Biochimica Et Biophysica ACTA》;19651231;第3卷;第90页Summary *
Interaction of γ-Glutamyl Transpetidase with Amino Acids, Dipeptides, and Derivatives and Analogs of Glutathione;Suresh S. Tate;《The Journal Of Biological Chemsitry》;19741210;第249卷(第23期);7593页左栏第1段，表VII *
Marian ORLOWSKI.Metabolism of r-Glutamyl Amino Acids and Peptides in Mouse Liver and Kidney in vivo.《European Journal Biochemistry》.1976,第71卷
Metabolism of r-Glutamyl Amino Acids and Peptides in Mouse Liver and Kidney in vivo;Marian ORLOWSKI;《European Journal Biochemistry》;19761231;第71卷;第552页表2 *
Parris M.Kidd.Glutathione:Systemic Protectant Against Oxidative and Free Radical Damage.《Alternative Medicine Review》.1997,第2卷(第3期),155-176.
Suresh S. Tate.Interaction of γ-Glutamyl Transpetidase with Amino Acids, Dipeptides, and Derivatives and Analogs of Glutathione.《The Journal Of Biological Chemsitry》.1974,第249卷(第23期),

Also Published As

Publication number Publication date
JP5946104B2 (ja) 2016-07-05
EP2381259A1 (en) 2011-10-26
EP2381259A4 (en) 2012-06-20
CN104198718A (zh) 2014-12-10
JP2015057616A (ja) 2015-03-26
CN104198718B (zh) 2017-11-10
US20110256561A1 (en) 2011-10-20
WO2010073870A1 (ja) 2010-07-01
US20130330749A1 (en) 2013-12-12
EP2381259B1 (en) 2016-09-21
JP5676275B2 (ja) 2015-02-25
CN102265160A (zh) 2011-11-30
JPWO2010073870A1 (ja) 2012-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102265160B (zh) 肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法
Zhou et al. Noninvasive detection of nonalcoholic steatohepatitis using clinical markers and circulating levels of lipids and metabolites
CN102971632B (zh) 肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法
CN102119330B (zh) 诊断胃改道手术及其相关状况的工具和方法
Issaq et al. Utility of separation science in metabolomic studies
CN107076748A (zh) 评估乳腺癌的生物标志物
Yilmaz et al. Decreased plasma levels of soluble receptor for advanced glycation endproducts (sRAGE) in patients with nonalcoholic fatty liver disease
Serag et al. Sweat metabolome and proteome: Recent trends in analytical advances and potential biological functions
CN104111284A (zh) 一种快速、灵敏的检测血液中丙戊酸钠的方法
Tolan et al. Analytical performance of three whole blood point-of-care lactate devices compared to plasma lactate comparison methods and a flow-injection mass spectrometry method
Thorstensen et al. Development of UHPLC-MS/MS methods to quantify 25 antihypertensive drugs in serum in a cohort of patients treated for hypertension
US20110180703A1 (en) Method for the diagnosis of non-alcoholic steatohepatitis based on a metabolomic profile
Azagra et al. Ammonium quantification in human plasma by proton nuclear magnetic resonance for staging of liver fibrosis in alcohol‐related liver disease and nonalcoholic fatty liver disease
Mishra et al. A new extraction method for the determination of oxytocin in milk by enzyme immune assay or high-performance liquid chromatography: validation by liquid chromatography–mass spectrometry
CN112858552B (zh) 联合型代谢标志物的试剂在制备用于诊断食管上皮非典型增生疾病的试剂盒中的用途
Bakkenist et al. Quantitative analysis of ATM phosphorylation in lymphocytes
Wu et al. Increased detection rate of melamine-containing calcium urolithiasis by using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique in clinical practice
Gug et al. Salivary Biomarkers in Toxicology: An Update Narrative
Pontoni et al. Diagnosis and follow-up of cystinuria: use of proton magnetic resonance spectroscopy
WO2023233945A1 (ja) 胆道がん検査方法
US20210349110A1 (en) Method for providing information on diagnosis or prognostic measurement of histological severity of nonalcoholic fatty liver disease
JP2011106994A (ja) 大腸癌のバイオマーカー、および、大腸癌のバイオマーカーの測定法
Arun et al. Metabolomics and its application in advance diagnostic microbiology field
US8771975B2 (en) Quantitation of GCP activity in biological samples
WO2017077120A1 (en) Diagnosis of diabetes

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Free format text: FORMER OWNER: UNIV TOKYO

Effective date: 20140619

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20140619

Address after: Tokyo, Japan, Japan

Applicant after: Kelo University

Address before: Tokyo, Japan, Japan

Applicant before: Kelo University

Applicant before: Univ Tokyo

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant