JP3620037B2

JP3620037B2 - γ−グルタミルトランスフェラーゼ活性測定用試薬

Info

Publication number: JP3620037B2
Application number: JP25984698A
Authority: JP
Inventors: 正一西牟田; 正士長澤
Original assignee: Nipro Corp
Current assignee: Nipro Corp
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1998-09-14
Publication date: 2005-02-16
Anticipated expiration: 2018-09-14
Also published as: JP2000083698A

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は血清中の乳ビの影響を受けることなく、さらに溶血ヘモグロビンの影響も回避できるγ−グルタミルトランスフェラーゼ活性測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血清中のγ−グルタミルトランスフェラーゼ（以下、γ−ＧＴと略する）は、グルタチオンや他のγ−グルタミルペプチドからγ−グルタミル基をアミノ酸、ペプチドなどの受容体に転移する酵素であり、各種の閉鎖性黄疸、肝癌、アルコール性肝障害などに現れ、これらの疾患の診断に重要な要素の一つとして、従来から種々の測定法により測定されてきた。
γ−ＧＴの測定法としては、基質として、Ｌ−γ−グルタミル−４−ニトロアニリドまたはＬ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリドなどを用いる測定法が汎用されてきた。これらの酵素基質がγ−ＧＴ、およびグルタミル基受容体の作用により解離する発色化合物、すなわち４−ニトロアニリンまたは３−カルボキシ−４−ニトロアニリンは、通常、波長が４００〜４５０ｎｍの吸光度を有する。この範囲の波長にて吸光度測定を行うと、血清中の乳ビにより、その測定結果が影響されることがしばしば生じる。
【０００３】
従来から吸光度により酵素活性を測定する試薬には、通常、試薬の溶解性または反応溶液の混濁を防止するために、界面活性剤が使用されている。しかしながら、時には予期しない測定干渉や妨害をもたらすことがよく見られる。それ故、臨床診断薬として使用される試薬には、安価でしかもタンパク質の変性を生じない非イオン界面活性剤を使用することが行われている。しかしながら、非イオン界面活性剤を通常の濃度範囲、０．０２〜１．０ｗ／ｖ％の濃度で使用すると、自動酸化による劣化が生じて、測定値に影響を及ぼすことが経験されている。
【０００４】
さらに、非イオン界面活性剤を４００〜４５０ｎｍの領域で吸光度測定を行う測定系では、非イオン界面活性剤の添加濃度が増加するにつれ、血清中に存在する溶血ヘモグロビンの負の影響を増大させることが問題となっている。
【０００５】
溶血ヘモグロビンの影響を回避するために、カチオン系界面活性剤または両性界面活性剤を使用することが公知である（特公平８−７８号公報）。しかしながら、これらの界面活性剤を使用すると、反応液中に存在するタンパク質の電荷がマイナスになっていると、該界面活性剤が結合して濁りを生じる。
【０００６】
また、界面活性剤の１種であるラウリル硫酸ソーダ、セチル硫酸ソーダ、ラウリルアミン酢酸塩、セチルアミン塩酸塩を使用することが公知である（特公平３−５８４６７号公報）。しかしながら、これらの界面活性剤を使用すると、やはり濁りを生じる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、血清中の乳ビの影響を受けることなく、さらに溶血ヘモグロビンの影響も回避できるγ−ＧＴ活性測定用試薬を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために、種々検討したところ、非イオン界面活性剤を従来よりも少量添加することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、本発明は、グルタミル基受容体の存在下に、γ−グルタミルトランスフェラーゼの作用により解離する発色化合物の吸光度が４００〜４５０ｎｍである基質、最終濃度が０．００５〜０．０１ｗ／ｖ％である非イオン界面活性剤および緩衝液を含有することを特徴とするγ−グルタミルトランスフェラーゼ活性測定用試薬である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の基質は、γ−ＧＴの作用により解離する発色化合物が、４００〜４５０ｎｍの吸光度を有する化合物であり、例えばＬ−γ−グルタミル−４−ニトロアニリドまたはＬ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリドなどが例示される。Ｌ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリドから解離される３−カルボキシ−４−ニトロアニリンは、特にγ−ＧＴの測定において、負の結果を奏する程度が大きい。グルタミル基受容体としては、例えばグリシルグリシンなどが挙げられる。
【００１１】
本発明において使用する非イオン界面活性剤とは、親水性部分と疎水性部分を有し、親水性部分に糖またはポリオキシエチレン鎖を有する化合物である。糖鎖としてはグルコシド、チオグルコシドあるいはそれらの類似体がある。ポリオキシエチレン鎖としてはポリオキシエチレン系、フェニルポリオキシエチレン系、ポリオキシエチレンソルビタンエステル系などがある。
疎水性部分（基）としては、デシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、セチル、ステアリル、オレイル、セチル−ステアリル、ヘプチル、デカノイルなどのアルキル基、ｐ−オクチルフェニル、ｐ−イソオクチルフェニル、ｐ−ノニルフェニルなどのアルキルフェニル基などがある。
【００１２】
具体的には、オクチルグリコシド、ヘプチルグリコシド、デカノイル−Ｎ−、メチルグルカミド、ポリオキシエチレンデシルエーテル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレントリドデシルエーテル、ポリオキシエチレンヘプタメチルヘキシルエーテル、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−ｐ−ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、スクロール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、ポリオキシエチレン−モノラウリン酸ソルビタンなどが例示される。これらの中でも、ＨＬＢ値が１０〜１７である非イオン界面活性剤、特にポリオキシエチレンラウリルエーテル（オキシエチレン数＝２３、ＨＬＢ＝１５．３、商品名、Ｂｒｉｊ３５）、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノルエーテル（オキシエチレン数＝９，１０、ＨＬＢ＝１３．５、商品名、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ポリオキシエチレン−モノラウリン酸ソルビタン（オキシエチレン数＝２０、ＨＬＢ＝１６．１、商品名、Ｔｗｅｅｎ２０）が好ましい。
【００１３】
本発明では上記非イオン界面活性剤の濃度は、試薬中、０．００５〜０．０１ｗ／ｖ％（最終濃度）であることが必要である。０．００５ｗ／ｖ％未満であると、乳ビ等の疎水性物質の影響を受け、血清中で濁りを生じる危険性があり、０．０１ｗ／ｖ％を越えると、検体中に存在する溶血ヘモグロビンの影響が増大する危険性がある。
【００１４】
本発明の試薬は、緩衝液、例えばグリシルグリシン緩衝液及び基質、例えばＬ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリドまたはＬ−γ−グルタミル−４−ニトロアニリドを含む。グルタミル基受容体、例えばグリシルグリシンの最終濃度は１００〜２００ｍＭ、基質の最終濃度は２〜１０ｍＭであることが好ましい。また、該試薬は液状試薬であることが好ましい。試薬は１試薬系であっても、また２試薬系であってもよい。２試薬系では、第１試薬として非イオン界面活性剤を含む緩衝液を血清に添加してから、第２試薬として基質を含む水溶液を添加する。
【００１５】
本発明の試薬を用いて、血清中γ−ＧＴを測定するには、通常、検体、例えば血清に試薬を添加してから、３７℃において、予備加温後、単位時間当たり、４００〜４５０ｎｍの吸光度測定を行う。測定方法はレート法であることが好ましい。レート法とは、基質から解離したアグリコンの４００〜４５０ｎｍ域での吸光度の経時的な変化（増加速度）を求め、その測定結果からγ−ＧＴ活性値を算出する方法である。酵素活性１ＩＵ／ｌとは１分間に１μｍｏｌ／ｌの反応を触媒する酵素量と定義されており、吸光度（Ｅ）の経時的変化から酵素活性を求めるためには、吸光度の経時的変化（△Ｅ）から１分間当たりの吸光度変化（△Ｅ／分）を算出し、さらに次式に代入して酵素活性（ＩＵ／ｌ）とする。
【００１６】

【００１７】
ＲＶ：測定に使用した試薬（溶液）の液量
ＳＶ：測定に使用した試料の液量
ε：吸光度を測定する物質の吸光係数
【００１８】
使用する酵素基質は、検体としての血清の条件、使用する基質の種類、その他の使用条件下における種々の要素により、適宜任意の至適濃度を決定すればよく、特に限定されることはない。好ましくは２〜１０ｍＭである。
本発明の試薬の調製および該試薬を用いた酵素活性の測定法については、従来の慣用技術に従う。
【００１９】
【実施例】
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例１
下記試薬を調製した。
第１試薬：（１）１９１．５ｍＭグリシルグリシン緩衝液ｐＨ７．９
非界面活性剤なし
（２）１９１．５ｍＭグリシルグリシン緩衝液ｐＨ７．９
０．００５％Ｂｒｉｊ３５
（３）１９１．５ｍＭグリシルグリシン緩衝液ｐＨ７．９
０．０１％Ｂｒｉｊ３５
（４）１９１．５ｍＭグリシルグリシン緩衝液ｐＨ７．９
０．１％Ｂｒｉｊ３５
Ｂｒｉｊ３５：ポリオキシエチレンラウリルエーテル
（オキシエチレン数＝２３、ＨＬＢ＝１５．３）
第２試薬：３０．６ｍＭ γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド（１水和物）水溶液
【００２０】
検体は以下の方法により調製した。
（ａ）溶血ヘモグロビン濃度が異なる血清試料
管理血清Ｍｏｎｉ−ＴｒｏｌＩＸ（国際試薬製）の血清９容と、ヘモグロビンを含まない水溶液または調製した溶血ヘモグロビン（干渉チェック：国際試薬製）の濃度が０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００ｍｇ／ｄｌの水溶液それぞれ１容を混合して、溶血ヘモグロビン濃度がそれぞれ、０、１００、２００、３００、４００、５００ｍｇ／ｄｌである血清試料を調製した。
（ｂ）乳ビ濃度が異なる血清試料
管理血清Ｍｏｎｉ−ＴｒｏｌＩＸ（国際試薬製）の血清９容と、イントラファット（武田薬品製）を含まない水溶液または調製したイントラファット濃度が０、２０、４０、６０、８０、１００％の水溶液それぞれ１容を混合して、イントラファット濃度がそれぞれ、０、２、４、６、８、１０％である血清試料を調製した。
【００２１】
測定操作は、以下の通りである。
検体８μｌに第１試薬３２０ μｌを加え、３７℃で５分間予備加温した後、第２試薬８０μｌを添加し、２分間撹拌した。次いで４０５ｎｍ（主波長）及び７００ｎｍ（副波長）における単位時間あたりの吸光度の増加速度を測定した。γ−ＧＴ活性値が既知である酵素溶液の吸光度増加速度を元に、各血清中の酵素活性を決定した。測定装置は自動分析装置（日立７１５０）を使用した。
【００２２】
上記試薬を用いて、上記検体中のγ−ＧＴ活性を上記操作に従い、測定した結果を表１及び表２に示す。なお、表中の非イオン界面活性剤の濃度は第１試薬と第２試薬を添加し終えた状態の最終濃度である。
【００２３】
【表１】

【００２４】
【表２】

【００２５】
表１および表２の結果を図１に示す。図１から明らかなように、Ｂｒｉｊ３５の濃度が、０．００５％および０．０１％である試薬では、乳ビの影響を回避でき、さらに溶血ヘモグロビンの影響を回避することができる。Ｂｒｉｊ３５の濃度が０．１％であると、乳ビの影響を回避できても、溶血ヘモグロビンの影響を受ける。また、Ｂｒｉｊ３５を使用しないと乳ビの影響を受ける。
【００２６】
実施例２
実施例１におけるＢｒｉｊ３５に代えて、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノルエーテル（オキシエチレン数＝９，１０、ＨＬＢ＝１３．５）を使用し、同様にしてγ−ＧＴを測定した。その結果を表３および表４に示す。
【００２７】
【表３】

【００２８】
【表４】

【００２９】
また、表３のヘモグロビン５００ｍｇ／ｄｌ及び表４の乳ビ１０％の結果を図２に示す。図２から明らかなように、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度が、０．００５％および０．０１％である試薬では、乳ビの影響を回避でき、さらに溶血ヘモグロビンの影響を回避することができる。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度が０．１％であると、乳ビの影響を回避できても、溶血ヘモグロビンの影響を受ける。またＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用しないと乳ビの影響を受ける。
【００３０】
実施例３
実施例１におけるＢｒｉｊ３５に代えて、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン−モノラウリン酸ソルビタン（オキシエチレン数＝２０、ＨＬＢ＝１６．１）を使用し、同様にしてγ−ＧＴを測定した。その結果を表５および表６に示す。
【００３１】
【表５】

【００３２】
【表６】

【００３３】
また、表５のヘモグロビン５００ｍｇ／ｄｌ及び表６の乳ビ１０％の結果を図３に示す。図３から明らかなように、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が、０．００５％および０．０１％である試薬では、乳ビの影響を回避でき、さらに溶血ヘモグロビンの影響を回避することができる。Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が０．１％であると、乳ビの影響を回避できても、溶血ヘモグロビンの影響を受ける。またＴｗｅｅｎ２０を使用しないと乳ビの影響を受ける。
【００３４】
【発明の効果】
本発明では非イオン界面活性剤の濃度を従来よりも少量、０．００５〜０．０１ｗ／ｖ％（最終濃度）使用することにより、乳ビの影響を回避でき、さらに溶血ヘモグロビンの影響を回避することができる。したがって検体が高脂血清であっても、正確にγ−ＧＴを測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｂｒｉｊ３５の濃度増加による溶血ヘモグロビンおよび乳ビの影響を示すグラフである。
【図２】ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度増加による溶血ヘモグロビンおよび乳ビの影響を示すグラフである。
【図３】Ｔｗｅｅｎ２０の濃度増加による溶血ヘモグロビンおよび乳ビの影響を示すグラフである。

Claims

γ−グルタミルトランスフェラーゼの作用により解離する発色化合物の吸光度が４００〜４５０ｎｍである基質、最終濃度が０．００５〜０．０１ｗ／ｖ％である非イオン界面活性剤および緩衝液を含有することを特徴とするγ−グルタミルトランスフェラーゼ活性測定用試薬。
γ−グルタミルトランスフェラーゼの作用により解離する発色化合物の吸光度が４００〜４５０ｎｍである基質が、Ｌ−γ−グルタミル−４−ニトロアニリドまたはＬ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリドである請求項１記載のγ−グルタミルトランスフェラーゼ活性測定用試薬。
非イオン界面活性剤が商品名、Ｂｒｉｊ３５、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＴｗｅｅｎ２０である請求項１記載のγ−グルタミルトランスフェラーゼ活性測定用試薬。
最終濃度が２〜１０ｍモル／ｍｌであるＬ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド、最終濃度が０．００５〜０．０１ｗ／ｖ％である、商品名、Ｂｒｉｊ３５、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＴｗｅｅｎ２０からなる群から選択された非イオン界面活性剤およびグリシルグリシン緩衝液を含有することを特徴とするγ−グルタミルトランスフェラーゼ活性測定用試薬。