CN103518132B - 通过离子型表面活性剂选择性裂解细胞 - Google Patents

通过离子型表面活性剂选择性裂解细胞 Download PDF

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Abstract

本发明披露了用于选择性裂解在包含微生物（如细菌或单细胞真菌）的样品中的真核细胞的方法、成套试剂盒以及装置。该选择性裂解是通过在碱性条件下在离子型表面活性剂中孵育该样品而获得的。

Description

通过离子型表面活性剂选择性裂解细胞
发明领域
本发明涉及真核细胞的裂解，具体地说涉及动物细胞(如血细胞)的裂解。本发明进一步涉及在含有大量其他细胞的样品中的少量微生物(如细菌或真菌)的检测。
发明背景
分子诊断学旨在快速检测在样品(如血液)中微量的病原体(典型地是细菌)。然而，血液是一种复杂的基质，并且包含用于适应性免疫系统的白细胞(白血球)、用于氧输送的红细胞(红血球)、以及用于伤口愈合的血小板(凝血细胞)。这种组成使得在含有大量细胞物质的样品(如全血)中直接检测病原体变得复杂。
经典的检测方法包括在选择性介质和/或含有指示剂的介质上使细菌生长。在可以进行细菌鉴定之前，这样的分析典型地需要至少1天或2天的培养步骤。
对基于PCR的方法而言，在新鲜血样中的细菌量在理论上高到足以在没有进一步培养存在于这样的样品之内的细菌的情况下被检测到。然而，为了允许及早检测到微量的细菌，需要较大体积的血液。特别是在白细胞中的大量DNA显著增加了基于DNA的检测方法中的背景。来自血红蛋白中的血红素的存在也强烈降低了DNA聚合酶的活性。一微升人全血含有大约4,000到11,000个白细胞和大约150,000到400,000个血小板。DNA在血液中的浓度在30μg/ml与60μg/ml之间。在体积为10ml的全血中检测大约10到100,000个的细菌种类的存在是极其挑战性的。
大量的白细胞DNA可能产生不相关的PCR产物，或者可能清除为检测细菌DNA所设计的引物。这使得在可以通过PCR或其他方法检测细菌DNA之前的真核DNA的彻底DNA纯化和分离成为必需。
除干扰PCR反应本身之外，哺乳动物DNA的量增加了样品的粘度。另外，来自于裂解的哺乳动物细胞的蛋白质和膜形成妨碍样品过滤的复合物。这对小型化装置而言尤其是个问题。进一步稀释较大样品体积导致不可接受的较长操作步骤。
针对以上原因，相应地需要从血样中去除人类DNA的方法。
在哺乳动物DNA存在下明确分析细菌DNA的方法是已知的。来自于SIRS实验室公司(companySIRSLab)的LooxtersTM使用一种方法来富集来自样品的甲基化DNA。由于细菌DNA被强烈甲基化，这种方法导致细菌DNA的富集。来自Molzym公司的MolysisTM使用离液剂和洗涤剂来选择性裂解哺乳动物细胞。在这个裂解步骤之后用不受这种离液剂/洗涤剂影响的DNA酶消化。替代途径(如由罗氏(Roche)商业化的SeptifastTM)依赖于特别设计为防止与人类DNA的非特异性结合和人类DNA的扩增的PCR引物对。
US6,803,208描述了一种方法，其中在37℃下使掺杂有细菌的血小板的高度稀释悬浮液裂解15分钟，随后可能在0.4μm过滤器上过滤少量的裂解样品，以用于目视检查保留在过滤器上的细菌。然而这种方法不允许在环境温度下处理较大体积的样品。
皇家菲利浦电子有限公司(KoninklijkePhilipsElectronicsN.V.)的未出版国际专利申请PCT/IB2010/055628披露了一种用于选择性裂解在含有或疑似含有微生物的样品中的真核细胞的方法，其中向包含真核细胞的样品中添加非离子型洗涤剂(如TritonX-100(聚乙二醇p-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基醚)和缓冲剂以获得具有至少9.5的pH值的溶液，并且孵育所述溶液持续充分长到足以裂解真核细胞的时间段。通过裂解在样品中的白细胞和红细胞，在保持病原性微生物完整的同时使血细胞DNA降解，这种方法允许处理具有5ml的体积的血样，并且可以随后通过离心或过滤进行富集。
在H.Heerklotz的论文“表面活性剂与脂质膜的相互作用(Interactionsofsurfactantswithlipidmembranes)”(生物物理学季评(QuarterlyReviewsofBiophysics)41(2008)，第205-264页)中，其论述了选择性裂解哺乳动物细胞的假设分子机制，并且假设所述选择性裂解依赖于不同的步骤。首先，表面活性剂确保白细胞和红细胞的裂解。为了实现这个目的，表面活性剂需要被插入细胞膜的外层中。在第二个步骤中，表面活性剂将进行所谓的翻转(flip-flop)，并且被转移到细胞膜的内层中。一旦在内细胞膜和外细胞膜中存在足量的表面活性剂，细胞将被裂解。发现非离子型表面活性剂(如TritonX-100)良好地适合用于细胞裂解，因为它们在数百毫秒的时间范围内进行上述步骤。相比之下，SDS需要10到30秒才能插入PC囊泡中。另外，如SDS在室温下所显示的，据报道具有更大的或带电的头基的表面活性剂穿过膜可能需要数小时或数天。
如已经在科学文献中所描述的(参见Heerklotz,H.)，这个假设可以解释为何离子型表面活性剂不适合于获得哺乳动物细胞的快速裂解。包含大的、庞大的或带电的亲水基团的表面活性剂(如)、具有长PEG链的离子型表面活性剂和Triton的翻转运动(flip-flopmovement)缓慢，并且因此不适合于获得快速细胞裂解。另外，具有极疏水性质的表面活性剂(如或TritonX-45)在其初始插入细胞膜中将遇到困难。离子型表面活性剂被视为不适合用于获得哺乳动物细胞的快速裂解，这是因为，由于必须穿过亲脂性膜的带电亲水基团的存在，这些离子型表面活性剂的带电亲水基团不能容易地进行翻转转移。
与科学知识相反，意外地发现当离子型表面活性剂与高pH值组合使用时，所述离子型表面活性剂可以在保持微生物病原体完整的同时用于选择性裂解白细胞和红细胞。因此，在第一方面，本发明提供了一种用于选择性裂解在含有或疑似含有微生物的样品内的真核细胞的方法。在第二方面，本发明提供了一种用于进行选择性裂解在含有或疑似含有微生物的样品内的真核细胞的方法的成套部件。在一个另外的方面，本发明提供了一种用于检测在含有真核细胞的样品中的微生物的装置。
发明概述
本发明的特定和优选方面陈述于附随的独立和从属权利要求中。在适当情况下，来自从属权利要求的特征可以与独立权利要求的特征和其他从属权利要求的特征组合，而不是仅仅如在权利要求所明确陈述的。
本发明的一个方面涉及一种用于选择性裂解在含有或疑似含有微生物的样品内的真核细胞(尤其是动物细胞)的方法。这种方法包括以下步骤：提供含有或者疑似含有微生物的具有真核细胞(尤其是动物细胞)的样品；向样品添加具有大约9.0或更大pH值(优选大约9.5或更大pH值)的缓冲剂和离子型表面活性剂，以获得具有大约9.0或更大pH值(优选大约9.5或更大pH值)的溶液；以及孵育该溶液充分长到足以裂解真核细胞(尤其是动物细胞)的时间段。
在具体实施例中，该样品是血样，例如像全血。优选地，该样品是脊椎动物样品，更优选哺乳动物样品，尤其是家养动物、役用动物或农场动物样品，并且最优选地是人类样品。
根据具体实施例，所述孵育进行30秒到10分钟。
在其他具体实施例中，这些微生物是细菌和/或单细胞真菌。本发明的方法也可以适合于检测单细胞真核病原体，如有鞭毛的原生动物(flagellatedprotozoan)或顶复门寄生虫(apicomplexanparasite)。
根据具体实施例，添加的表面活性剂和添加的缓冲剂的体积与样品体积之间的比率是在2/1与1/10之间。
根据具体实施例，该离子洗涤剂是以0.1％到5％(w/v％或v/v％)浓度在溶液中存在。
根据具体实施例，该离子型表面活性剂选自下组，该组由以下各项组成：阴离子型表面活性剂和阳离子型表面活性剂，该阴离子型表面活性剂优选地选自下组，该组由以下各项组成：烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、多库酯盐、磺酸盐氟表面活性剂、烷基苯磺酸盐、烷基芳基醚磷酸盐、烷基醚磷酸盐、烷基羧酸盐以及羧酸盐氟表面活性剂，更优选地选自下组，该组由以下各项组成：十二烷基硫酸铵、十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠、正十二烷基苯磺酸钠、十二烷基醚硫酸钠(SLES)、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠、琥珀酸二异辛酯磺酸钠、全氟辛烷磺酸盐(PFOS)、全氟丁烷磺酸盐、硬脂酸钠、月桂酰肌氨酸钠、全氟壬酸盐以及全氟辛酸盐(PFOA或PFO)，并且该阳离子型表面活性剂优选地选自下组，该组由以下各项组成：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、氯化十六烷基吡啶(CPC)、牛油胺聚氧乙烯醚(POEA)、苯扎氯铵(BAC)、苄索氯铵(BZT)、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷、双十八烷基二甲基氯化铵以及双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB)。
根据具体实施例，所述方法进一步包括离心所述孵育溶液和分离所述微生物的步骤，或可选地进一步包括在过滤器上过滤所述孵育溶液的步骤，该过滤器具有将微生物保留在所述过滤器上的孔径。
在具体实施例中，如在此所使用的碱性缓冲剂具有高于9的pKa值。在本文中的实例是硼酸盐、碳酸盐、CAPS(N-环己基-3-氨基丙磺酸)、CAPSO(3-(环己氨基)-2-羟基-1-丙磺酸)、CHES(2-(N-环己氨基)乙磺酸)、焦磷酸盐以及乙醇胺。一个具体实例是碳酸钠。
在具体实施例中，该方法进一步包括以下步骤：在具有将微生物保留在过滤器上的孔径的过滤器(如具有小于0.5μm的孔径的过滤器)上过滤所孵育的溶液。
在具体实施例中，该方法进一步包括以下步骤：在选择性裂解之后添加酸或酸性缓冲剂以获得在裂解溶液中的在大约7和8之间的pH值，为“中和步骤”。
在具体实施例中，在如以上所描述的方法之后继之为裂解存在于或疑似存在于样品中的微生物。
根据具体实施例，所述方法进一步包括基于核酸的分子检测。
本发明的另一方面涉及用于选择性裂解在含有或疑似含有微生物的样品内的动物细胞并检测所述微生物的成套试剂盒，该成套试剂盒至少包含碱性缓冲剂和离子型表面活性剂。
本发明的另一方面涉及用于进行在此处上文中所描述的方法的成套试剂盒。该试剂盒至少包括碱性缓冲剂和离子型表面活性剂。在优选实施例中，该试剂盒包括处于固定比率的碱性缓冲剂和离子型表面活性剂的混合物。在替代实施例中，该试剂盒包括用于具有大约9.0或更大pH值(优选大约9.5或更大pH值)的碱性缓冲剂、以及用于离子型表面活性剂的单独小瓶，使得使用者可以按所希望的比率组合所述碱性缓冲剂与所述离子型表面活性剂。
在一个具体实施例中，该成套试剂盒可以进一步包括酸或酸性缓冲剂，以用于在碱性裂解在样品内的真核细胞之后将溶液的pH调节到在大约7与8之间的值。在又另一个或另外的实施例中，该试剂盒可以包括用于在已经微生物富集之后裂解微生物的并且用于释放微生物DNA的裂解缓冲剂。
在具体实施例中，该成套试剂盒包括至少一个用于获得、处理和/或储存样品或在处理样品期间所产生或获得的任何溶液的工具。
在另一个或另外的实施例中，成套试剂盒包括至少一个用于过滤所孵育溶液的工具。所述工具可以是例如具有将微生物保留在过滤器上的孔径的过滤器。过滤器可以具有小于0.5μm的孔径。过滤器可以呈滤筒形式或呈套筒的一部分的形式。
本发明的另一方面涉及一种用于检测在样品中的微生物的装置(1)，该装置包括：一个用于接受体积在1ml与20ml之间的样品流体的裂解室(2)；一个连接到该裂解室的包含具有大约9.0或更大的pH(优选具有大约9.5或更大的pH)的碱性缓冲剂、并且包含离子型表面活性剂的贮器，或者连接到该裂解室的具有大约9.0或更大的pH(优选具有大约9.5或更大的pH)的碱性缓冲剂的贮器(31)、一个包含离子型表面活性剂的贮器(32)；一个连接到该裂解室的用于在裂解之后过滤样品的过滤器(4)，该过滤器具有将细菌保留在该过滤器上的孔径；以及一个用于分析DNA的存在的检测室(5)。
此处的碱性缓冲剂典型地具有高于9.0的pKa，并且该离子型表面活性剂典型地是十二烷基硫酸钠。
根据本发明的方法可以在保持细菌和真菌完整(死的或活的)的同时选择性裂解在样品中的白细胞和红细胞。
根据本发明的方法可能在无需实质上稀释一种样品的情况下处理这个样品，并且因此允许处理更大体积的样品。另外，不需要通过例如DNA酶使DNA酶促降解，使得这种方法相比于现有技术中的已知方法更不复杂。
如在本发明中所描述的方法导致具有低粘度和最少聚集物的裂解样品，这使得可能在保留细菌的过滤器上过滤该裂解样品。在这样的过滤器上进一步处理细菌可以用大约100-500μl之间的体积进行，这使得可能为了随后程序而处理较大样品体积，并且可以在一体化套筒中全自动地进行所需要的操作，如中和与洗涤。
根据以下详细说明，结合通过举例说明本发明的原理的附图，本发明的以上和其他特性、特征和优点将变得明显。所给出的本说明是为了举例，而不限制本发明的范围。以下引用的参考图是指附图。
附图简要说明
图1显示了一个用于进行如在本发明的实施例中所描述的选择性裂解的装置的实施例的示意性概观。
图2显示了一个包括如在本发明实施例中所描述的选择性裂解单元的一体化装置的实例。
图3显示了从全血样品中富集的铜绿假单胞菌(P.aeroginosa)的定量RT-PCR结果。
图4显示了从全血样品中富集的白色念珠菌(C.albicans)的定量RT-PCR结果。
将根据具体实施例并参考某些附图描述本发明，但本发明并不因此限制于此，而是仅由权利要求书限制。权利要求书中的任何参考符号均不应当被视为限制该范围。所描述的附图仅是示意性的，并且是非限制性的。在附图中，出于说明性目的可能夸大一些要素的尺寸，并且不按比例尺绘制。在本发明的说明书和权利要求书中使用术语“包含/包括(comprising)”的情况下，并不排除其他要素或步骤。在使用不定冠词或定冠词的情况下，当参考单数名词(例如“一个/一种(a/an)”或“该(the)”)时，除非特别陈述其他情况，这包括多个名词。
此外，在说明书和权利要求书中的术语第一(first)、第二(second)、第三(third)等等用于区别类似要素，而不必用于描述顺序或时间次序。应当理解的是，如此使用的术语在适当情况下可以互换，并且在此所描述的本发明的实施例能够以在此所描述或说明的顺序之外的其他顺序运行。
以下术语或定义仅仅是为了辅助理解本发明而提供的。这些定义的范围不应当被视为具有小于本领域的普通技术人员所理解的范围。
实施例的详细说明
在本发明上下文中的“血细胞”涉及在血液中存在的哺乳动物细胞，并且包括红细胞(红血球)、白细胞(白血球)和血小板(凝血细胞)。
在本发明上下文中的“全血”涉及包含血浆和细胞的未处理血液，可能用抗凝剂处理。
“样品”涉及包含细胞物质的水性悬浮液，并且包含体液(如淋巴)、脑脊髓液、血液(全血和血浆)、唾液，并且还包含例如经均质化的悬浮液的水性成分，例如像肌肉、大脑、肝脏、或者其他组织。
本发明中的“真核”涉及任何类型的真核生物，如动物，尤其是含有血液的动物，并且包括无脊椎动物，如甲壳动物和脊椎动物。脊椎动物包括冷血动物(鱼类、爬行动物、两栖动物)和温血动物(鸟类和哺乳动物)两者。哺乳动物尤其包括灵长类动物，并且更明确地说人类。本发明中的术语“真核”不包括真核单细胞生物，如病原性或机会性单细胞真菌和原生动物。
当在样品(如血液)中保持完整的微生物细胞(如细菌细胞)在这个样品中的百分比显著高于保持完整的来自在从其中收集该样品的生物的真核细胞的百分比(例如2、5、10、20、50、100、250、500或1,000倍)时，获得了如在本发明中使用的“选择性裂解”。
如在本发明中所使用的“微生物”涉及存在于已经从其中收集样品的生物中的细菌(革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、以及细菌芽孢)和单细胞真菌(如酵母和霉菌)，典型地是病原体。
本发明的第一方面涉及一种用于选择性裂解在含有或疑似含有微生物(如细菌)的样品内的真核细胞(尤其动物细胞)的方法。该方法的目标是增加用于检测在样品中的微量微生物(即，每毫升样品中的微生物少于10,000、1,000、100或甚至更少)的试验的敏感性。如在发明背景中所解释的，在样品中的来自真核细胞(尤其来自动物细胞)的DNA干扰基于PCR的检测方法，并且这种DNA与蛋白质和膜一起形成聚集物，这些聚集物在裂解之后增加粘度并且对裂解样品的过滤具有显著影响。为了解决这个问题，选择性裂解真核细胞(尤其是动物细胞)，由此这些微生物的大部分(即，超过20％、40％、60％、80％、90％或甚至超过95％)保持有活性，或者在如果通过处理杀死时仍然在细胞壁内包含细菌DNA。在如本发明中所描述的方法中着手解决了上述问题。
如在本发明中所描述的方法适用于其中来自微生物(尤其是来自细菌)的DNA的检测被包含DNA的其他细胞(尤其来自其中微生物以病原体形式存在的宿主的细胞)的存在削弱的任何类型的样品。
现在针对其中研究哺乳动物血样中的微量细菌或真菌细胞的存在的实施例来进一步说明如在本发明中所描述的方法。
血样可以被储存为全血或者经过处理的成分(如血浆或血小板制剂)。典型地，如在本发明中所描述的方法是针对新鲜分离的全血进行的。通常用例如肝素、EDTA或柠檬酸盐处理这样的样品以避免凝固。
作为替代方案，该方法是通过从血管(如动脉或静脉)将血液直接收集在具有洗涤剂和缓冲剂的试管中而针对新鲜血液进行的。
相应地，新鲜血样或保存的样品中补充有缓冲剂和离子型表面活性剂。缓冲剂的选择以及其浓度被选择为了补偿所提供血样的缓冲能力，并且获得大约9.0或更大的pH值，优选地获得大约9.5或更大的pH值，其中高于11.5的pH值尤其适合于革兰氏阳性细菌和真菌。在一个具体实施例中，缓冲剂具有9.0或更大的pH。在一个优选实施例中，缓冲剂具有在大约9.5与大约11.5之间，优选地在大约9.5与大约10.5之间的pH。在一个具体实施例中，在获得包含样品的溶液中的pH值在大约9.5与大约11.5之间，甚至更具体在大约9.5与大约10.5之间。同样，缓冲剂是充分浓缩的，使得至多具有样品体积的200％、150％、100％、50％、20％或者10％的体积的缓冲剂被添加到样品中，以获得所希望的在pH值方面的变化。
在本发明上下文中的适合的缓冲剂典型地具有高于9、高于9.5或甚至高于10的pKa，并且包括硼酸盐、碳酸盐、CAPS、CAPSO、CHES、焦磷酸盐、乙醇胺以及具有在上述pH值范围内的最优缓冲能力的其他常用缓冲剂。
适合的表面活性剂是离子型表面活性剂，其一方面仅对真核细胞(尤其是动物细胞)具有裂解作用，并且另一方面对DNA和蛋白质具有增溶作用。该离子型表面活性剂可以是阴离子型表面活性剂或者阳离子型表面活性剂(即，具有阳离子基团的表面活性剂分子)。
阴离子型表面活性剂具有阴离子基团，基于永久性阴离子(如硫酸盐、磺酸盐或磷酸盐)或基于pH值依赖性阴离子(如羧酸盐)。阴离子型表面活性剂选自下组，该组由以下各项组成：烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、多库酯盐、磺酸盐氟表面活性剂(sulfonatefluorosurfactant)、烷基苯磺酸盐、烷基芳基醚磷酸盐、烷基醚磷酸盐、烷基羧酸盐以及羧酸盐氟表面活性剂。阴离子型表面活性剂的实例是十二烷基硫酸铵、十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠、正十二烷基苯磺酸钠、十二烷基醚硫酸钠(SLES)、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠(sodiummyrethsulfate)、琥珀酸二异辛酯磺酸钠、全氟辛烷磺酸盐(PFOS)、全氟丁烷磺酸盐、硬脂酸钠、月桂酰肌氨酸钠、全氟壬酸盐、以及全氟辛酸盐(PFOA或PFO)。
阳离子型表面活性剂包含阳离子基团，并且pH值依赖性阳离子型表面活性剂是基于伯胺、仲胺或叔胺，而永久性带电阳离子型表面活性剂是基于季铵阳离子。阳离子型表面活性剂的实例是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、氯化十六烷基吡啶(CPC)、牛油胺聚氧乙烯醚(POEA)、苯扎氯铵(BAC)、苄索氯铵(BZT)、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷、双十八烷基二甲基氯化铵以及双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB)。
表面活性剂的最有效浓度取决于不同的表面活性剂而变化，但典型地在0.1％与5％之间，更具体地说在0.1％与1％之间的范围内。取决于洗涤剂(固体或液体)，％分别是指w/v％或v/v％。
在缓冲剂和洗涤剂的存在下的血样的孵育是在10分钟内，优选地在30秒与10分钟之间，且更优选地在大约1到3分钟之间，在大约1到5分钟之间，在大约1到8分钟之间、或在大约1到10分钟之间，在10℃与30℃之间的温度下进行的。根据本发明的方法具有的优点在于在0.5到3分钟内在低于30℃的温度下获得选择性裂解。相应地，这些方法通常可以在环境温度下进行，而不需要加热样品。
任选地，在裂解之后，通过添加酸或者酸性缓冲剂将裂解样品的pH值调到中性值(即，在7与8之间)。发现处于中性pH的裂解样品可以被储存持续延长的时间(长达1、2、6、12或甚至24小时)，而不发生细菌细胞的进一步裂解，并且在裂解样品的流体特性方面没有显著变化。
在本发明的方法中研究的另一个参数是在裂解之后的血样的流体特性的评估。这可以通过验证可以通过具有2.5cm直径的0.22μm过滤器过滤的裂解血液的体积而进行测定。根据本发明的方法允许过滤至少2、5、7.5或甚至10mL的通过向1体积样品添加1体积缓冲剂/洗涤剂溶液而稀释的全血。
通常，根据本发明的方法包含其中从样品中分离完整微生物的步骤，典型地通过离心或过滤而进行。在具体实施例中，通过使裂解样品穿过孔径在1μm以下的保留微生物(典型地具有在0.5μm与10μm之间大小)的过滤器(如具有0.4μm或0.22μm孔径的可商购的过滤器)而从该样品中分离完整微生物。为了过滤样品，存在多种多样可商购的装置，如适合于安装在针筒上的过滤器，使得在针筒内裂解之后，可以通过对针筒的柱塞手动施压使流体穿过过滤器。这些装置可以是本发明的成套试剂盒的一部分。
此后可以研究微生物在过滤器上的存在。在具体实施例中，通过PCR研究微生物的存在。为了这个目的，可以将微生物从过滤器上洗掉，并且进一步处理用于PCR扩增。作为替代方案，用裂解缓冲剂冲洗过滤器以便使DNA从微生物释放，该DNA进一步用于PCR反应。
可以在一个装置内进行样品的裂解、微生物的过滤和检测(示意性地描绘于图1中)。相应地，本发明的一个方面涉及一种装置(1)，包括用于接受具有体积在1ml与10ml之间的样品流体的裂解室(2)；包含具有如上文所描述的表面活性剂的碱性缓冲剂的贮器，或者包含如上文所描述的碱性缓冲剂的贮器(31)和包含如上文所描述的表面活性剂的贮器(32)，这些贮器连接到裂解室(2)。在该装置内，该裂解室连接到过滤器(4)，该过滤器用于在裂解之后过滤样品由此将微生物保留在该过滤器上。该装置进一步包括从过滤器中去除微生物并且将它们在分离室中裂解的通道。作为替代方案，该装置进一步包括用于裂解在过滤器上的微生物的工具、以及将来自裂解细菌或真菌细胞的DNA从过滤器转移到分离室中的通道。该装置可以进一步包含用于分析DNA的存在的DNA纯化和检测室(5)。检测室通常是PCR模块。
一种其中进行选择性裂解以及随后的DNA纯化和鉴定的装置的实例描绘于图2中。
体现本发明的系统和方法的其他安排对于本领域的技术人员而言将是显而易见的。
应当理解的是，虽然针对根据本发明的装置在此已经论述了优选的实施例、特定构造和配置、以及材料，可以在不脱离本发明的范围和精神的情况下做出在形式和细节方面的各种变化或修改。
实例1
从血样回收微生物
在每5mL人类全血样品中掺入大约1,000菌落形成单位(cfu)的铜绿假单胞菌或白色念珠菌。添加相等体积的裂解缓冲剂(500mM碳酸钠(pH10.0)和1.0％TritonX-100(终浓度)或1％十二烷基硫酸钠(终浓度)，并且在室温(大约23℃)下将混合物孵育3分钟。
在孵育之后，用1MTris溶液中和裂解样品以恢复pH值。将样品离心，并且用1mL磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤。此后，通过添加预加热的200mMNaOH、1％SDS将这些微生物裂解，并且使用标准硅离心柱(silicaspincolumn)在用1M柠檬酸中和洗脱液之后将它们的DNA纯化。
实例2
微生物DNA的检测
为了从过滤器中洗脱并为了碱性裂解微生物，将微生物细胞再悬浮于100μl的含有50mMNaOH和0.25％SDS的裂解溶液中。随后将样品在70℃孵育10分钟，快速冷却到室温，并且通过添加30μl500mMTris-HCl(pH7.0)进行中和(产生150mMTris的终浓度，即NaOH浓度的3倍)。
为了粗裂解物的PCR，通过离心(5分钟，14,000g)从样品去除未裂解的细胞和碎片。将1μl上清液添加到25μl的PCR反应物中。经由PCR的检测是基于靶向rRNA基因的TaqmanPCR分析(阿波罗(Apollo))。使用500nM正向引物和300nM反向引物以及FAM-BHQ1标记探针(所有寡核苷酸由BiolegioBV定制合成)，在Taqman通用预混液(TaqmanUniversalmastermix)(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))中进行PCR反应。在伯乐(Biorad)CFX实时PCR系统中进行PCR反应。在95℃10分钟的初始加热步骤以活化热启动聚合酶之后，使用50个在95℃15秒接着在60℃1分钟的循环以用于扩增。在60℃步骤期间的每一次循环中检测荧光信号。用伯乐CFX软件进行数据分析。
Ct(循环阈值)被定义为使荧光信号越过阈值(即，超出背景水平)所需要的循环数。Ct水平与在样品中的目标核酸的量成反比(即Ct水平越低，在样品中的目标核酸的量越高)。Ct值<29是强阳性反应，指示在样品中的丰富目标核酸。30-37的Ct值是阳性反应，指示中等量的目标核酸。38-40的Ct值是弱反应，指示最低量的目标核酸(可能代表环境污染)。
图3和4展示了来自全血的微生物的差异裂解和富集的TaqmanPCR分析的结果。图3显示了在最初来自5ml血液中的1,000cfu的铜绿假单胞菌DNA的PCR扩增期间所获得的相对荧光，其中用TritonX-100或十二烷基硫酸钠进行白细胞和红细胞的裂解。图4显示了在最初来自5ml血液中的1,000cfu的白色念珠菌DNA的PCR扩增期间所获得的相对荧光，其中用TritonX-100或十二烷基硫酸钠进行白细胞和红细胞的裂解。图3和图4两者显示了导致类似的荧光产率(fluorescenceyield)的非离子型表面活性剂和离子型表面活性剂。因此，可以得出结论，离子型表面活性剂在裂解血细胞和去除PCR抑制化合物中与非离子型表面活性剂是一样有效的。因此，离子型表面活性剂适合于血细胞的选择性裂解，并且可以与高pH值组合用于差异裂解血细胞，同时使存在于血样中的微生物保持完整。此外，铜绿假单胞菌是革兰氏阴性细菌，并且很容易受到洗涤剂损害。它仍然在血细胞的裂解后存活。白色念珠菌是单细胞真菌，并且因其坚硬的细胞壁和难以裂解而熟知。然而，本发明的方法允许检测在通常从患者获得的标准体积的血样(用于基于常规培养的诊断学)之内的少量白色念珠菌细胞。此外，该方法可以在环境温度下(如室温)进行，并且不需要添加任何用于降解和去除真核细胞的核酸和蛋白质的酶。

Claims (13)

1.一种用于选择性裂解在含有或疑似含有微生物的哺乳动物血液样品内的哺乳动物血细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供一种含有或疑似含有微生物的具有哺乳动物血细胞的哺乳动物血液样品，
b)向所述样品添加一种离子型表面活性剂和一种缓冲剂，以获得具有大约9.0或更高的pH的溶液，
c)孵育所述溶液持续充分长到足以裂解这些哺乳动物血细胞的时间段；
其中该离子型表面活性剂选自下组，该组由以下各项组成：阴离子型表面活性剂和阳离子型表面活性剂，
该阴离子型表面活性剂选自下组，该组由以下各项组成：十二烷基硫酸铵、十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠、正十二烷基苯磺酸钠、十二烷基醚硫酸钠(SLES)、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠、琥珀酸二异辛酯磺酸钠、全氟辛烷磺酸盐(PFOS)、全氟丁烷磺酸盐、硬脂酸钠、月桂酰肌氨酸钠、全氟壬酸盐以及全氟辛酸盐，并且
该阳离子型表面活性剂选自下组，该组由以下各项组成：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、氯化十六烷基吡啶(CPC)、牛油胺聚氧乙烯醚(POEA)、苯扎氯铵(BAC)、苄索氯铵(BZT)、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷、双十八烷基二甲基氯化铵以及双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述血液样品是全血。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物选自下组，该组由以下各项组成：细菌和真菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述孵育步骤c)进行30秒到10分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所添加离子型表面活性剂和所添加缓冲剂的体积与样品体积之间的比率在2/1与1/10之间。
6.根据权利要求1所述的方法，其中该离子型表面活性剂是以0.1％到5％(w/v％或v/v％)浓度在溶液中存在。
7.根据权利要求1所述的方法，其中该离子型表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括离心所述孵育溶液和分离所述微生物的步骤。
9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在过滤器上过滤所述孵育溶液的步骤，该过滤器具有将微生物保留在所述过滤器上的孔径。
10.根据权利要求1所述的方法，进一步包括裂解所述微生物的步骤。
11.根据权利要求1所述的方法，进一步包括基于核酸的分子检测。
12.一种用于检测在样品中的微生物的装置(1)，包括：
一个用于接受具有在1ml与20ml之间的体积的哺乳动物血液样品流体的裂解室(2)，
一个包含具有大约9.0或更高的pH的碱性缓冲剂并且包含离子型表面活性剂的贮器，或者一个包含具有大约9.0或更高的pH的碱性缓冲剂的贮器(31)和一个包含离子型表面活性剂的贮器(32)，所述贮器连接到裂解室(2)，并且其中该离子型表面活性剂选自下组，该组由以下各项组成：阴离子型表面活性剂和阳离子型表面活性剂，该阴离子型表面活性剂选自下组，该组由以下各项组成：十二烷基硫酸铵、十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠、正十二烷基苯磺酸钠、十二烷基醚硫酸钠(SLES)、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠、琥珀酸二异辛酯磺酸钠、全氟辛烷磺酸盐(PFOS)、全氟丁烷磺酸盐、硬脂酸钠、月桂酰肌氨酸钠、全氟壬酸盐以及全氟辛酸盐，并且该阳离子型表面活性剂选自下组，该组由以下各项组成：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、氯化十六烷基吡啶(CPC)、牛油胺聚氧乙烯醚(POEA)、苯扎氯铵(BAC)、苄索氯铵(BZT)、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷、双十八烷基二甲基氯化铵以及双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB)，
一个连接到裂解室(2)以用于在裂解之后过滤该样品的过滤器(4)，所述过滤器(4)具有将细菌保留在该过滤器上的孔径，以及
一个用于分析DNA的存在的检测室(5)。
13.根据权利要求12所述的装置，其中该碱性缓冲剂具有高于9.0的pKa且/或该离子型表面活性剂是十二烷基硫酸钠。
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Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
PT2556171E (pt) 2010-04-05 2015-12-21 Prognosys Biosciences Inc Ensaios biológicos codificados espacialmente
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
RU2013153507A (ru) * 2011-06-06 2015-07-20 Биокарти Нв Селективный лизис клеток с помощью ионных поверхностно-активных веществ
ES2749351T3 (es) * 2011-12-21 2020-03-19 Geneohm Sciences Canada Inc Enriquecimiento y aislamiento de células microbianas y ácidos nucleicos microbianos a partir de una muestra biológica
EP2684947A1 (en) * 2012-07-09 2014-01-15 Biocartis SA A method for filtering a biological sample
CN103571824B (zh) 2012-08-09 2016-04-13 财团法人工业技术研究院 用于分离核酸的组合物及方法
EP2900819B1 (en) 2012-09-28 2020-10-28 Cepheid Methods for dna and rna extraction from fixed paraffin-embedded tissue samples
JP6177009B2 (ja) * 2013-06-03 2017-08-09 株式会社日立ハイテクノロジーズ 血球破壊試薬及びそれを用いる血球破壊方法
CN105849275B (zh) 2013-06-25 2020-03-17 普罗格诺西斯生物科学公司 检测样品中生物靶标的空间分布的方法和系统
EP3049531B8 (en) 2013-09-24 2019-08-14 AIT Austrian Institute of Technology GmbH Method for pathogen diagnosis using an electric field
JP6466437B2 (ja) * 2013-10-30 2019-02-06 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ 微生物を複雑な試料から単離する方法
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
CN106661606B (zh) 2014-06-13 2021-12-21 Q-莱纳公司 用于检测和表征微生物的方法
EP3172317B1 (en) 2014-07-24 2019-05-01 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Process for the purification of poliovirus from cell cultures
NL2013266B1 (en) 2014-07-25 2016-05-19 Microbiome Ltd Novel test for microbial blood infections.
WO2016024263A1 (en) * 2014-08-14 2016-02-18 Molecular Detection Israel Ltd. Methods for isolating microbial dna from a blood sample
RU2716991C2 (ru) 2014-11-05 2020-03-17 Вояджер Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды aadc для лечения болезни паркинсона
IL292999A (en) 2014-11-14 2022-07-01 Voyager Therapeutics Inc Preparations and methods for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis
JP6863891B2 (ja) 2014-11-14 2021-04-21 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 調節性ポリヌクレオチド
WO2016094783A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
WO2016153355A2 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Microbiome Limited Novel isolation and amplification process control
EP3530752B1 (en) 2015-04-10 2021-03-24 Spatial Transcriptomics AB Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
GB201507026D0 (en) 2015-04-24 2015-06-10 Linea Ab Q Medical sample transportation container
EP3347485B1 (en) * 2015-09-11 2021-11-03 Bacteria Detection Ltd Methods for isolating microbial cells from a blood sample
WO2017075335A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
GB2554767A (en) 2016-04-21 2018-04-11 Q Linea Ab Detecting and characterising a microorganism
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US11326182B2 (en) 2016-04-29 2022-05-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
IL302748A (en) 2016-05-18 2023-07-01 Voyager Therapeutics Inc modulatory polynucleotides
BR112018073472A2 (pt) 2016-05-18 2019-08-27 Voyager Therapeutics Inc composições e métodos de tratamento da doença de huntington
KR102165623B1 (ko) * 2016-05-31 2020-10-15 에프. 호프만-라 로슈 아게 바이러스 항원의 혈청학적 탐지 방법
JP7044721B2 (ja) * 2016-05-31 2022-03-30 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｈｃｖコア抗原の迅速な検出のための前処理法
CA3035522A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
GB201617713D0 (en) 2016-10-19 2016-11-30 Q-Linea Ab Method for recovering microbial cells
EP4252629A3 (en) 2016-12-07 2023-12-27 Biora Therapeutics, Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
EP3562576B1 (en) * 2016-12-29 2023-09-06 Intus Biosciences, LLC Combined lysis protocol for comprehensive cell lysis
CN106893680B (zh) * 2017-03-03 2020-10-02 上海市临床检验中心 一种从血液样本中富集丝状真菌的方法
CN111108198A (zh) 2017-05-05 2020-05-05 沃雅戈治疗公司 治疗亨廷顿病的组合物和方法
AU2018261790A1 (en) 2017-05-05 2019-11-28 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
US11497576B2 (en) 2017-07-17 2022-11-15 Voyager Therapeutics, Inc. Trajectory array guide system
US20200237799A1 (en) 2017-10-16 2020-07-30 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2019079240A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
WO2019173434A1 (en) 2018-03-06 2019-09-12 Voyager Therapeutics, Inc. Insect cell manufactured partial self-complementary aav genomes
US20190316171A1 (en) * 2018-03-22 2019-10-17 Idexx Laboratories, Inc. Methods for measuring bacteria in biological samples
US20210214749A1 (en) 2018-05-16 2021-07-15 Voyager Therapeutics, Inc. Directed evolution
US20210207167A1 (en) 2018-05-16 2021-07-08 Voyager Therapeutics, Inc. Aav serotypes for brain specific payload delivery
WO2020010042A1 (en) 2018-07-02 2020-01-09 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
JP2021530548A (ja) 2018-07-24 2021-11-11 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドVoyager Therapeutics, Inc. 遺伝子治療製剤を生産するための系および方法
US20210348242A1 (en) 2018-10-04 2021-11-11 Voyager Therapeutics, Inc. Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles
EP3894585A2 (en) 2018-12-10 2021-10-20 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US20220064671A1 (en) 2019-01-18 2022-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Methods and systems for producing aav particles
WO2020176788A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 10X Genomics, Inc. Profiling of biological analytes with spatially barcoded oligonucleotide arrays
EP3938538A1 (en) 2019-03-15 2022-01-19 10X Genomics, Inc. Methods for using spatial arrays for single cell sequencing
WO2020198071A1 (en) 2019-03-22 2020-10-01 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
TW202106879A (zh) 2019-04-29 2021-02-16 美商航海家醫療公司 於生物反應器中生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(biic)之系統及方法
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
WO2021030125A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
TW202122582A (zh) 2019-08-26 2021-06-16 美商航海家醫療公司 病毒蛋白之控制表現
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
WO2021097255A1 (en) 2019-11-13 2021-05-20 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
CN115004260A (zh) 2019-11-18 2022-09-02 10X基因组学有限公司 用于组织分类的系统和方法
AU2020388573A1 (en) 2019-11-21 2022-06-23 10X Genomics, Inc, Spatial analysis of analytes
CN117746422A (zh) 2019-11-22 2024-03-22 10X基因组学有限公司 使用基准对齐对分析物进行空间分析的系统和方法
CN111621496A (zh) * 2020-05-06 2020-09-04 南京世和基因生物技术股份有限公司 一种痰液宏基因组去宿主化提取试剂盒
EP4153775A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
CN111896757B (zh) * 2020-08-04 2023-08-29 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种改善全血样本测值的d-二聚体测定试剂盒、制备方法及应用
US20230295656A1 (en) 2020-08-06 2023-09-21 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
US20240141377A1 (en) 2021-03-03 2024-05-02 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
US20240141378A1 (en) 2021-03-03 2024-05-02 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
WO2024054983A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6027750A (en) * 1986-09-04 2000-02-22 Gautsch; James Systems and methods for the rapid isolation of nucleic acids
WO2000072970A1 (en) * 1999-05-28 2000-12-07 Cepheid Cartridge for conducting a chemical reaction
CN101374960A (zh) * 2005-12-12 2009-02-25 简珀恩特联合股份有限公司 用于检测样品中靶细胞存在与否的方法
CN101560545A (zh) * 2000-01-21 2009-10-21 简珀恩特联合股份有限公司 细胞分离方法
WO2009135048A2 (en) * 2008-04-30 2009-11-05 Gradalis, Inc. Highly pure plasmid dna preparations and processes for preparing the same

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS54105877A (en) * 1978-02-06 1979-08-20 Terumo Corp Blood sampling tube for measuring blood sugar level
CA1317860C (en) 1987-04-01 1993-05-18 Daniel Louis Kacian Techniques for preparing specimens for bacterial assays
SE9703532D0 (sv) * 1997-09-30 1997-09-30 Pharmacia Biotech Ab A process for the purification of plasmid DNA
US6803208B2 (en) 2001-07-30 2004-10-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Automated epifluorescence microscopy for detection of bacterial contamination in platelets
BRPI0718231A2 (pt) * 2006-10-06 2013-11-12 Promega Corp Métodos e estojos para isolar células
MX2011003982A (es) * 2008-10-31 2011-09-21 Bio Merieux Inc Métodos para la separación, caracterización y/o identificación de microorganismos usando espectroscopia.
EP2361377B1 (en) 2008-10-31 2018-01-31 Biomerieux, Inc Method for identification of microorganisms using raman spectroscopy
US20110076706A1 (en) * 2009-06-26 2011-03-31 Genprime, Inc. Methods and kits for the rapid detection of microorganisms
EP2333105A1 (en) * 2009-12-08 2011-06-15 Koninklijke Philips Electronics N.V. Selective lysis of cells
RU2013153507A (ru) * 2011-06-06 2015-07-20 Биокарти Нв Селективный лизис клеток с помощью ионных поверхностно-активных веществ

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6027750A (en) * 1986-09-04 2000-02-22 Gautsch; James Systems and methods for the rapid isolation of nucleic acids
WO2000072970A1 (en) * 1999-05-28 2000-12-07 Cepheid Cartridge for conducting a chemical reaction
CN101560545A (zh) * 2000-01-21 2009-10-21 简珀恩特联合股份有限公司 细胞分离方法
CN101374960A (zh) * 2005-12-12 2009-02-25 简珀恩特联合股份有限公司 用于检测样品中靶细胞存在与否的方法
WO2009135048A2 (en) * 2008-04-30 2009-11-05 Gradalis, Inc. Highly pure plasmid dna preparations and processes for preparing the same

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