JP2017093464A - イオン性界面活性剤による細胞の選択的溶解 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、特願2014−513963号を基礎とする分割出願である。
血液試料からの微生物の回収
各5mlのヒトの全血に、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)またはカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の約1,000個のコロニー形成ユニット(cfu)を打ち込んだ。同量の溶解緩衝液(500mMの炭酸Na(pH10.0)、及び1.0%Triton X−100(最終濃度)または1%ドデシル硫酸ナトリウム(最終濃度)を添加し、その混合物を室温(約23℃)で3分間インキュベートした。
微生物DNAの検出
フィルタからの溶出、及び微生物のアルカリ溶解のために、50mMのNaOH及び0.25%SDSを含む100μlの溶解溶液中に微生物細胞を再懸濁させた。その後、試料を70℃で10分間インキュベートし、室温まで急速に冷却し、30μlの500mMトリス−HCl、pH7.0を添加することにより中和した(最終濃度150mMのトリス、即ちNaOH濃度の3倍を得た)。
Claims (16)
- 微生物を含むか、または含んでいると予想される試料中の真核細胞を選択的に溶解する方法であって、
a)微生物を含むか、または含んでいると予想される真核細胞を含む試料を用意する工程、
b)前記試料にイオン性界面活性剤及び緩衝液を添加して、pHが約9.0以上の溶液を得る工程、
c)前記真核細胞を溶解するのに十分な時間、前記溶液をインキュベートする工程
を含む方法。 - 前記試料が哺乳類血液試料である請求項1に記載の方法。
- 前記血液試料が全血である請求項2に記載の方法。
- 前記微生物が細菌及び真菌からなる群から選択される請求項1〜3の何れか一項に記載の方法。
- 前記インキュベート工程c)が、30秒〜10分間行われる請求項1〜4の何れか一項に記載の方法。
- 添加する界面活性剤及び添加する緩衝液の容量と試料の容量との比が、2/1〜1/10である請求項1〜5の何れか一項に記載の方法。
- 前記イオン性界面活性剤が、前記溶液中に、0.1〜5%(w/v%またはv/v%)の濃度で含まれる請求項1〜6の何れか一項に記載の方法。
- 前記イオン性界面活性剤が、アニオン性界面活性剤及びカチオン性界面活性剤からなる群から選択され、前記アニオン性界面活性剤は、好ましくは、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸塩、ドキュセート、スルホン酸塩フッ素系界面活性剤、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルアリールエーテルリン酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルカルボン酸塩及びカルボン酸塩フッ素系界面活性剤からなる群から選択され、より好ましくは、ラウリル硫酸アンモニウム、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、デオキシコール酸ナトリウム、n−ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム(SLES)、ミレス硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、ペルフルオロオクタンスルホン酸塩(PFOS)、ペルフルオロブタンスルホン酸塩、ステアリン酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ペルフルオロノナン酸塩及びペルフルオロオクタン酸塩(PFOAまたはPFO)からなる群から選択され、かつ前記チオン性界面活性剤は、好ましくは、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、塩化セチルトリメチルアンモニウム(CTAC)、塩化セチルピリジニウム(CPC)、ポリエトキシ化獣脂アミン(POEA)、塩化ベンザルコニウム(BAC)、塩化ベンゼトニウム(BZT)、5−ブロモ−5−ニトロ−1,3−ジオキサン、塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、及び臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム(DODAB)からなる群から選択される請求項1〜7の何れか一項に記載の方法。
- 前記イオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム(SDS)である請求項8に記載の方法。
- 前記インキュベートした溶液を遠心分離し、そして前記微生物を分離する工程を更に含む請求項1〜9の何れか一項に記載の方法。
- 前記インキュベートした溶液を、その上に微生物が保持される細孔径を有するフィルタで濾過する工程を更に含む請求項1〜9の何れか一項に記載の方法。
- 前記微生物を溶解する工程を更に含む請求項1〜11の何れか一項に記載の方法。
- 核酸ベースの分子分析を更に含む請求項1〜12の何れか一項に記載の方法。
- 微生物を含むか、または含んでいると予想される試料中の真核細胞の選択的溶解と、前記微生物の検出のためのパーツキットであって、少なくとも、アルカリ性緩衝液とイオン性界面活性剤を含むパーツキット。
- 試料中の微生物を検出するための装置(1)であって、
− 1〜20mlの容量の試料流体を受容する溶解チャンバ(2)と、
− 前記溶解チャンバ(2)に接続された、pHが約9.0以上のアルカリ性緩衝液を含み、かつイオン性界面活性剤を含むリザーバ(3)、またはpHが約9.0以上のアルカリ性緩衝液(31)を含むリザーバ、及びイオン性界面活性剤(32)を含むリザーバと、
− 前記溶解チャンバ(2)に接続され、溶解後の前記試料を濾過するためのフィルタ(4)であって、その上に細菌を保持する細孔径を有するフィルタ(4)と、
− DNAの存在を分析するための検出チャンバ(5)と
を含む装置。 - 前記アルカリ性緩衝液が9.0超のpKaを有し、及び/または前記イオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである請求項15に記載の装置。
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