KR20010024340A - Ｃ형 간염 바이러스의 측정방법 - Google Patents

Ｃ형 간염 바이러스의 측정방법 Download PDF

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Abstract

C형 간염 바이러스(HCV)의 측정방법에 있어서 양이온성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제 또는 그 양자의 존재 하에서 CHV 코어 항원 및 CHV 코어 항체를 그 프로브와의 결합에 의하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.

Description

Ｃ형 간염 바이러스의 측정방법{METHOD FOR ASSAYING HEPATITIS C VIRUS}
＜110＞ Yasumoto Toru; Advanced Life Science Institute, Inc.
＜120＞ Method for Measurement of Hepatitis C Virus
＜130＞ KP-CH-003898
＜150＞ JP 10-216094
＜151＞ 1998-07-30
＜160＞ 11
＜170＞ KOPATIN 1.5
＜210＞ 1
＜211＞ 177
＜212＞ PRT
＜213＞ Hepatitis Virus
＜400＞ 1
Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly Ser Leu Asp Arg Asp Pro Glu
1 5 10 15
Phe Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr
20 25 30
Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val
35 40 45
Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg
50 55 60
Ala Thr Arg Lys Thr Ser Lys Arg Ser Gln Pro Arg Gly Gly Arg Arg
65 70 75 80
Pro Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro
85 90 95
Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly
100 105 110
Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp
115 120 125
Pro Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr
130 135 140
Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Phe Arg Val Gly Ala Phe
145 150 155 160
Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu
165 170 175
Asp
＜210＞ 2
＜211＞ 160
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＜213＞ Hepatitis Virus
＜400＞ 2
Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn
1 5 10 15
Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly
20 25 30
Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala
35 40 45
Thr Arg Lys Thr Ser Lys Arg Ser Gln Pro Arg Gly Gly Arg Arg Pro
50 55 60
Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly
65 70 75 80
Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp
85 90 95
Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro
100 105 110
Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys
115 120 125
Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Phe Arg Val Gly Ala Phe Leu
130 135 140
Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp
145 150 155 160
＜210＞ 3
＜211＞ 20
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ recognition site: 21Asp - 40Arg
＜400＞ 3
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Leu Pro Arg Arg
20
＜210＞ 4
＜211＞ 10
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ recognition site: 41Gly - 50Arg
＜400＞ 4
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＜210＞ 5
＜211＞ 21
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ recognition site: 100Pro - 120Gly
＜400＞ 5
Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg His Arg
1 5 10 15
Ser Arg Asn Val Gly
20
＜210＞ 6
＜211＞ 20
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ recognition site: 111Asp - 130Phe
＜400＞ 6
Asp Pro Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu
1 5 10 15
Thr Cys Gly Phe
20
＜210＞ 7
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Probe
＜400＞ 7
gaattcatgg gcacgaatcc taaa 24
＜210＞ 8
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ probe
＜400＞ 8
ttagtcctcc agaacccgga c 21
＜210＞ 9
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＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ recognition site: 15Thr - 30Ile
＜400＞ 9
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1 5 10 15
＜210＞ 10
＜211＞ 1197
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ nucleotide sequence coding for chimeric antigen
＜400＞ 10
gaattcacca aagtgccggt tgcttatgcg gccaaaggtt ataaggtcct ggttctggac 60
ccgagcgttg ccagcaccct gggtttcggc gcgtatctga gcaaggccca tggtgtgaac 120
ccgaacatcc gcacgggcat ccgtaccgtt accaccggtg ctccggtgac ctattccacc 180
tacggtaaat acctggcgga cggcggttgc gccggcggtg cgtacgatgt gatcggatct 240
ggagaggagg tggccctgtc taacactgga gaggtcccct tctatggccg cgcgatcccg 300
atcgaagcga tcaaaggcgg tcgccatctg gttttctgcc atagcaagga gaaatgcgat 360
gaactggcga gcgcgctgtc cggattgggt ctgaacgctg tggcattcta tcgcggtctg 420
gacgtgagca ttatcccgac ccagggcgat gtggttatcg ttagcaccga tgcgctgatg 480
accggtttta ccggcgattt tgactcagtg gtcgactgta acacatgcat cacccaggga 540
tctggactgg taagcttcgc gagccatgtg ccgtacatcg agcagggtat gcaactgagc 600
gaacaattta agcagaagag cctgggtctg ctgcagaccg cgaccaaaca ggcggaggcg 660
gccgccccgg tggttggcac cccgaaaagc cgccgtccgg aaggtcgtgc ctgggcgcaa 720
ccgggtacca tcatcctgag cggtcgtccg gcggttgtac cggatcgtga agtgctgtat 780
caagaatttc tcgaggcctc tagagcggct ctcattgaag aggggcaacg gatagccgag 840
atgctgaagt ccaagatcca gggcttactg cagcaagcct ccaagcaggc ccaagacata 900
aaaatcgacg gtaccctgat tattccgaaa gatcgtcgca gcaccggtaa aagctggggt 960
aaaccgggct tcctcatcga tagcttgcat atcaaccagc gagccgtcgt tgcaccggac 1020
aaggaggtcc tttatgaggc ttttgatgag atggagctcg ccatgggcac caacccgaaa 1080
ccggagcgta aaagcaagcg taacaccaac cgtaaaccgc aggatattaa attcccgggt 1140
agtggtcagg tggtgggtgg tgtgtacctg gtgccgcgtc gtggtccgta aggatcc 1197
＜210＞ 11
＜211＞ 396
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ amino acid sequence of chimeric antigen
＜400＞ 11
Glu Phe Thr Lys Val Pro Val Ala Tyr Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Val
1 5 10 15
Leu Val Leu Asp Pro Ser Val Ala Ser Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr
20 25 30
Leu Ser Lys Ala His Gly Val Asn Pro Asn Ile Arg Thr Gly Ile Arg
35 40 45
Thr Val Thr Thr Gly Ala Pro Val Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Tyr
50 55 60
Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ala Gly Gly Ala Tyr Asp Val Ile Gly Ser
65 70 75 80
Gly Glu Glu Val Ala Leu Ser Asn Thr Gly Glu Val Pro Phe Tyr Gly
85 90 95
Arg Ala Ile Pro Ile Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Val Phe
100 105 110
Cys His Ser Lys Glu Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ser Ala Leu Ser Gly
115 120 125
Leu Gly Leu Asn Ala Val Ala Phe Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Ile
130 135 140
Ile Pro Thr Gln Gly Asp Val Val Ile Val Ser Thr Asp Ala Leu Met
145 150 155 160
Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Val Asp Cys Asn Thr Cys
165 170 175
Ile Thr Gln Gly Ser Gly Leu Val Ser Phe Ala Ser His Val Pro Tyr
180 185 190
Ile Glu Gln Gly Met Gln Leu Ser Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Gly Leu Leu Gln Thr Ala Thr Lys Gln Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val
210 215 220
Val Gly Thr Pro Lys Ser Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln
225 230 235 240
Pro Gly Thr Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Val Val Pro Asp Arg
245 250 255
Glu Val Leu Tyr Gln Glu Phe Leu Glu Ala Ser Arg Ala Ala Leu Ile
260 265 270
Glu Glu Gly Gln Arg Ile Ala Glu Met Leu Lys Ser Lys Ile Gln Gly
275 280 285
Leu Leu Gln Gln Ala Ser Lys Gln Ala Gln Asp Ile Lys Ile Asp Gly
290 295 300
Thr Leu Ile Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly
305 310 315 320
Lys Pro Gly Phe Leu Ile Asp Ser Leu His Ile Asn Gln Arg Ala Val
325 330 335
Val Ala Pro Asp Lys Glu Val Leu Tyr Glu Ala Phe Asp Glu Met Glu
340 345 350
Leu Ala Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Glu Arg Lys Ser Lys Arg Asn
355 360 365
Thr Asn Arg Lys Pro Gln Asp Ile Lys Phe Pro Gly Ser Gly Gln Val
370 375 380
Val Gly Gly Val Tyr Leu Val Pro Arg Arg Gly Pro
385 390 395
HCV(C형 간염 바이러스)의 감염에 의하여 일어나는 간염은 만성화되는 빈도가 높으며, 감염기간이 장기화함에 따라, 간경변, 간암으로 종종 이행된다. 그러나 HCV 감염은, 주로 혈액 및 혈액 유도성분에 의하여 초래되므로 감염원을 특정하고, 배제함으로써 감염 경로를 차단할 수 있다. 현재 감염원을 특정하는 방법으로는, 주로 HCV 폴리펩티드에 대한 항체를 검출하는 방법이 채택되고 있으나, 보다 높은 정밀도로 감염원을 특정할 수 있는 방법이 요구되고 있다.
이와 같은 요구의 배경에는, HCV 감염후 항원은 존재하나 항체가 생성되지 않는 이른바 윈도우기(Window period)라고 불리는 시기가 존재하기 때문이다. 이 기간에 있는 혈청은 항체 검사에 의하여 감염 유무를 판별할 수 없다. 항체검사에서는 윈도우기에 있는 검체를 배제할 수 없으므로 항체 검사에 의하여 스크리닝을 실시하고 있는 수혈이나 혈액성분, 혈액제제등의 혈액 유래 물질을 이용하는 경우에는 윈도우기에 있는 검체에 의한 이차 감염의 위험성이 존재하고 있다. 이 때문에 HCV 폴리펩티드에 대한 항체가 아니라, HCV 그 자체 즉 HCV 파티클 (particle)을 검출할 필요가 있었다.
HCV 그 자체를 검출, 측정하는 것은 HCV 파티클을 구성하고 있는 항원 또는 유전자(RNA)를 검출함으로써 가능하게 된다. 이 때 HCV 파티클을 구성하고 있는 항원은 코어 항원, 엔벨로프 항원(E1, E2)이라고 생각되고 있다.
이 중 엔벨로프 항원은 초가변영역(Hyper Variable Region)으로 대표되는 바와 같이, 항원성이 높은 영역에서 변이가 많다. 또한 유전자형 사이에서의 차이도 보고되고 있다. 이러한 변이, 차이를 모두 검출하려면 복수의 영역에 특이적으로 결합하는 프로브를 사용할 필요가 있다.
또한 이 때의 프로브란 항원에 특이적으로 결합하는 분자, 예를 들면 리셉터, 항체, 재조합 항체, 기능성 분자, 또는 기능성 구조물과 같이, 항원 분자를 인식하여 결합하는 것을 말한다.
한편 코어 항원은 아미노산 서열 레벨로 서열이 보존되고 있고, 영역을 선택함으로써, 복수 종류의 유전자형이 보고되고 있는 HCV 중 어느 하나의 유전자형의 항원도 검출할 수 있는 프로브를 얻을 수 있으므로, 유전자형에 의존하지 않는 검출방법을 구축할 수 있게 된다.
그러나 항원을 검출하는 계를 구축하려면 유의하여야 할 점이 있다. 즉, 피험자인 검체중에는 항체가 존재할 가능성이 높고, 이들 항체가, 항원을 검출하기 위한 프로브와 결합부위를 경합하여, 프로브의 결합을 저해함으로써 항원의 검출 감도를 떨어뜨린다. 이 때문에 항원을 효율성있게 검출하려면, 항체가 결합하지 않는 영역 또는 항체의 결합에 의하여 프로브의 결합이 간섭받지 않는 영역을 인식하는 프로브를 사용하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나, HCV 코어 항원과 같이 복수의 항체 결합 부위가 보고되고 있는 분자에 있어서, 전술한 조건을 충족하는 프로브를 작성하는 것은 곤란하다.
이 때문에 항원분자를 검출하려면, 프로브의 결합을 저해하는 항체를 제거할 필요가 있다. 제거하는 방법으로는 물리적인 원리에 따라 제거하는 방법, 예를 들면 분자량의 차이를 이용하여 HCV 파티클과 항체를 분리 분별하는 방법이 있다. 이 예로서, 겔 여과, 최원심 분리법, 밀도 구배 원심 분리법, 한외(限外) 여과막 등의 막을 이용한 분자량 분획법이 있다. 그러나 종종 항체는 다른 생체 고분자와 복합체를 형성하여, 고분자량으로 변화하므로, 물리적인 원칙에 따른 방법으로는 HCV 파티클과의 분별이 곤란하게 된다. 또한 이들 방법은 처리 행정에 특수한 기기를 사용하는 등으로 인하여 혈액 스크리닝 등의 매스 스크리닝에 적용하는 것이 곤란하다.
한편, 생화학적인 원리에 기초한 방법, 예를 들면 PEG (폴리에틸렌 글리콜)등의 물 환경을 변화시킴으로써, HCV 파티클과 다른 혈청성분과의 화학적 성질의 차이, 예를 들면 물에 대한 용해성의 차이를 이용하여 HCV 파티클을 우선적으로 침전시킴으로써 분별하는 방법도 있으나, 항체 또는 항체 복합체는 종종 파티클과 동일한 분획으로 침전하여 분획하는 것 자체가 곤란하게 된다. 또한 HCV 파티클은, 종종 HCV 파티클을 구성하고 있는 항원과 이를 인식하는 항체와의 면역 복합체를 형성하고 있어, 면역 복합체로부터 항체 또는 항원만을 분리하는 것은 곤란하다.
이 때문에 프로브의 기능을 저해하는 물질(항체 등)을 기능적으로 파괴함으로써 제거하는 방법을 취하게 된다. 항체의 기능을 잃는 방법으로서는, 단백질을 변성시키는 조건으로 노출시킴으로써 항체 단백질을 변성시키는 방법을 생각할 수 있으나, 이 때 중요한 것은 항체의 기능을 잃게 하나, 목적으로 하는 항원의 기능, 즉 프로브와 결합하는 기능, 즉 프로브와 항체의 경우에는 에피토프를 소실시키지 않거나 또는 에피토프를 재제시(再提示)시키는 조건이다.
HCV의 감염 유무를 판별하는 방법에 요구되는 기능은 그 목적에 따라 다르다.
항체 검사는 검체 중에 HCV에 대한 항체가 존재하는 지 여부를 판별하는 방법이나, 검체 중에 HCV에 대한 항체가 존재하는 경우, 그 검체의 공여자가 현재 HCV에 감염되어 있고 검체 중에 HCV가 존재하고 있는 경우도 있으나, 이미 치료 또는 자연 치유에 의하여 HCV가 체내로부터 배제되어 있는 경우도 있고, 항체의 유무에 의하여 이들을 구별하는 것은 곤란하다.
항원 검사는 HCV가 검체 중에 존재하고 있는지의 여부 또는 존재하고 있는 경우에는 그 양의 다과를 알려주는 것이 중요한 기능이며, 그 때 항체가 존재하고 있는 지 여부는 문제가 되지 않는다.
치료 시에는 간염이 HCV를 주원인으로 하는 지 여부를 결정하기 위하여 HCV의 항체 검사가 중요한 정보를 제공하나, 최종적으로는 HCV의 항원의 유무가 확정 진단에 요구된다. 또한 치료 효과 판정에는 HCV가 체내로부터 배제되고 있는 지 여부를 판정하는 것이 중요하고, 판정에는 항원의 양의 다과를 아는 것이 중요하다. 즉 항체의 유무에 관계없이 항원의 유무, 그 양을 아는 것이 치료에 중요하다. 즉 치료에 있어서는, 항원의 유무와 그 양을 부여하는 검사방법이 가장 중요한 방법이다.
한편 혈액 및 혈액 유도제제에 있어서는, 이차 감염을 억제하는 것이 가장 중요한데, 그러기 위하여 HCV의 감염원으로서의 위험성 유무의 판별이 검사방법으로 요구된다. 현재 이 분야에서는 주 검사방법으로서 항체검사가 사용되고 있다.
그러나 전술한 바와 같이, HCV 감염후의 윈도우기에 있는 혈청은, 항체검사에 의하여 감염 유무를 판별할 수 없다. 따라서, 항체 검사에 의하여 스크리닝을 실시하고 있는 수혈이나 혈액 성분, 혈액제제 등의 혈액 유도 물질을 이용하는 경우는, 윈도우기에 있는 검체에 의한 2차 감염의 위험성이 존재한다.
위험성을 더욱 경감시키려면, 항원 검사의 병용이 요구되나 헌혈 등의 혈액 검사와 같은 매스 스크리닝에서는 아직 항원 검사는 실시되고 있지 않다.
이론적으로는 100%의 정밀도 (감도, 특이도)로 항원의 유무를 판정할 수 있는 검사방법이 존재하면, 이를 유일한 검사방법으로 하면 되나, 어떠한 검출방법도 검출 감도가 존재하며, 검출 감도 이하의 것은 측정할 수 없다. 따라서 100%의 정밀도로 판별할 수 있는 검사방법은 존재하지 않는다. 또한 특수한 예에 있어서는 항원 검사만으로는 감염원을 놓칠 가능성이 있고, 그 때문에 이 분야에서는 항체와 항원의 양자를 측정하는 것이 이차 감염의 위험성을 경감시키는데 필요하다.
매스 스크리닝에 적용할 수 있고, 높은 감도, 특이성을 나타내는 항원 검출 방법이 사용되게 된 경우, 항원과 항체의 양쪽을 측정하는 것이 요구되어, 동일 검체수에서의 검사수가 현재보다 증가하고, 비용증가의 요인이 된다.
이와 같은 점에서, 항원과 항체를 동일방법으로 측정하는 것이 가능하게 되면, 당해 분야에 있어서는 검사수의 경감을 꾀할 수 있고, 큰 효과를 줄 수 있다는 것을 알 수 있다.
이미 기술한 바와 같이, 항체를 검출하는 방법, 항원을 검출하는 방법은 개발되어 있으나, 전술한 바와 같이 항체를 검출하는 조건으로는, 항원을 검출하려고 하면, 항원을 검출하는 프로브의 결합을 저해하는 항체가 존재함으로써 항원을 효율 좋게 검출할 수 없다. 한편 항원을 검출하는 조건에서도 전술한 바와 같이, 항원의 검출을 경합 저해하는 항체를 제외하는 방법을 취하게 되므로, 항체를 검출할 수 없다. 그 때문에 이미 보고되어 있는 방법으로는 항원과 항체를 동일 방법으로 검출할 수 없다.
발명의 요약
혈액 및 혈액 유도 물질을 이용할 때의 이차 감염 경감의 목적에 있어서는, 감염자, 감염 경력자를 구별할 필요가 없고, 항체 또는 항원이 존재하는지의 여부를 판별할 수 있으면 된다. 즉, 본 발명은 윈도우기와 같이 항체가 존재하지 않는 시기의 검체로는 항원을 검출하고, 항체가 존재하는 시기의 검체에서는 항원을 또는 항원과 항체를 검출하는 방법을 제공함으로써, 혈액 및 혈액 유도 물질의 검사에 요구되는 새로운 검사방법을 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 C형 간염 바이러스(HCV)의 측정방법에 있어서 알킬기와 제 2 내지 제 4급 아민을 가지는 계면활성제 또는 비이온 계면활성제, 또는 이 양자의 존재 하에서, HCV 코어 항원을 그 프로브와의 결합에 의하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의한 HCV 코어 항원의 측정과 함께 HCV 코어 항체를 그 프로브와의 결합에 의하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명은 C형 간염 바이러스(HCV)의 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 HCV 코어 항원을 측정하거나, 또는 HCV 코어 항원과 HCV 코어 항체를 동시에 측정하기 위한 방법에 관한 것이다. 이 방법은 다수의 혈액 시료 등을 스크리닝하는데 특히 유효하다.
도 1은 모노클로날 항체 C11-15의 항체가를 다른 모노클로날 항체 C11-3, C11-7, C11-10 및 C11-14의 항체가와 비교하여 도시한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 여러 가지 모노클로날 항체를 단독으로, 또는 혼합하여 일차 항체로서 고상으로 고정하여 사용하고, HCV-RNA 양성 검체를 측정한 경우의 ELISA의 결과를 도시하는 그래프이다.
본 발명이 제공하는 HCV 감염 검출방법은 윈도우기와 같이 항체가 존재하지 않는 시기의 검체에서는 항원을 검출하고, 항체가 존재하는 시기는 항원을 또는 항원과 항체의 양자를 검출하는 방법이다.
즉 항체가 존재하지 않는 시기, 윈도우기에 있어서는 항체가 존재하지 않으므로, 항원을 검출할 때에 항체를 제거할 필요가 없다. 따라서 항원을 검출하기 위하여 필요한 전처리를 할 필요가 없어진다.
그러나, HCV 파티클에 포함되는 항원을 검출하려면, 검출을 위하여 사용하는 프로브의 인식 부위를 노출시키는 것이 중요하다. HCV 바이러스 파티클은 게놈인 핵산과 코어 항원이 복합체를 형성하여 입자를 형성하고, 이 입자를 지질막과 엔벨로프 단백질로 구성되는 외막이 덮고 있는 구조를 하고 있다고 생각된다. 또한 혈액 중에는 저밀도 리포프로테인(LDL)이나 HCV에 대한 항체 등과의 복합체를 형성하여 존재하고 있다고 생각되고 있다. 그 때문에, 혈액 중에 존재하는 바이러스 파티클인 채로는 프로브는 코어 항원을 인식하여 결합할 수 없다. 따라서 코어 항원을 검출하려면, 코어 항원을 둘러싼 이러한 구조물을 제거하는 등의 처리를 하여, 코어 항원이 프로브에 인식되도록 할 필요가 있다.
즉, 본 발명에 있어서는, 검체 중에 포함되는 HCV 파티클 중의 코어 항원을 코어 항원을 인식하기 위한 프로브가 인식될 수 있도록 노출시키는 반응조건, 반응시키는 계로 구성되는 반응방법, 및 반응시키는 계를 포함하는 시약도 제공한다.
한편 항체가 충분히 존재하고 있는 시기에 있어서는, 전술한 바와 같이, 검체 중에는 프로브의 결합부위와 경합하는 코어 항원에 대한 항체가 존재하고 있는 경우가 있으나, 이 경우에는 코어 항원의 검출 감도가 저하될 가능성이 있다. 또한 코어 항원을 프로브와 결합할 수 있도록 노출시킨 경우에는, 프로브와 경합하는 코어 항원에 대한 항체가 포함되는 경우, 항체는 노출된 코어 항원에 흡수되고, 항체를 면역 복합체를 검출하는 방법에 의하여 검출하므로 항원에 결합하는 코어 항원에 대한 항체의 양이 감소되고, 검출 감도가 저하될 가능성이 있다.
그 때문에 항체의 검출에 사용하는 항원은, 코어 항원의 에피토프만으로 구성되는 것이어도 무방하나, 바람직하게는 코어 항원 이외의 HCV 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 또한 HCV 에피토프를 모방하는 HCV 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드 이외의 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 화합물이어도 된다.
단, 코어 항원을 검출하기 위한 프로브와 HCV 에피토프 또는 HCV 에피토프를 대체하는 화합물로는 상호 인식함으로써 결합하는 것이 아닌 것이 바람직하다.
HCV 코어 항원을 위한 프로브로서의 항체 또는 HCV 코어 항원을 검출하기 위하여 표지되는 항체는, 마우스, 토끼, 닭, 염소, 양, 소 등의 실험동물을 면역하여 얻어지는 폴리클로날 항체 면역된 개체로부터 비장 세포를 분리하고, 미에로마 세포와 융합시킴으로써 얻어지는 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체; 또는 비장세포, 혈중 백혈구를 EB 바이러스에 의하여 불사화(不死化)시킨 세포가 생산하는 모노클로날 항체; HCV에 감염되어 있는 사람 또는 침팬지 등이 생산하고 있는 모노클로날 항체;
마우스, 사람 등의 임뮤노글로블린의 cDNA 또는 감염체 DNA로부터 얻어지는 가변 영역 유전자 단편, 또는 임뮤노글로블린의 cDNA 또는 감염체 DNA의 일부와 인공적으로 제작한 서열을 조합함으로써 구성되는 가변 영역 유전자 단편, 인공적인 유전자 서열을 사용하여 구성되는 가변 영역 유전자 단편 또는 이들 재료에 유전자 재조합 수단에 의하여 제조되는 가변 영역 유전자 단편을, 임뮤노글로블린 정상 영역 유전자 단편을 조합함으로써 구성되는 재조합 항체 유전자에 의하여 형질 전환된 세포가 생산되는 재조합 항체 ; 상기 가변 영역 유전자 단편과 예를 들면 박테리오 파지의 구조 단백질과 융합시켜 만들어지는 파지 항체; 상기 가변 청역 유전자 단편을 다른 적용 가능한 유전자 단편, 예를 들면 myc 유전자의 일부 등과 조합함으로써 구성되는 재조합 유전자에 의하여 형질 전환된 세포가 생산하는 재조합 항체 등이다.
트립신 분자에 가변 영역을 인공적으로 도입함으로써 생성되는 프로브, 리셉터 등의 단백질에 특이적으로 결합하는 분자를 인공적으로 개변함으로써 얻어지는 프로브, 기타 콤비나트리얼케미스트리 기술에 의하여 제조된 프로브 등, 코어 항원에 높은 특이성, 친화성을 보이는 분자이면 이를 이용할 수 있다.
상기 모노클로날 항체는, 당업자에 의하여 용이하게 제작할 수 있다. 하이브리도마에 의한 모노클로날 항체의 제조는 잘 알려져 있다. 예를 들면 BALB/c 마우스 등의 복강내 또는 피(皮)내에 상기 융합 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 (이하, 본 항원)를 단독 또는 BSA, KLH 등과 결합시킨 항원으로서 단순 또는 프로인트 완전 애주번트 등의 애주번트와 혼합하여 정기적으로 면역한다. 혈중의 항체가가 상승된 시점에서, 추가 면역으로서 본 항원을 꼬리정맥내에 투여하고, 무균적으로 비장을 적출한 후, 적당한 마우스 골수종 세포주와 세포 융합하고, 하이브리도마를 얻는다. 본 방법은 Kohler와 Milstein의 방법(Nature 256: 495-497, 1975)에 의하여 실시할 수 있다.
상기 방법에 의하여 얻어진 하이브리도마 세포주를 적당한 배양액 중에서 배양하고, 그 후 본 항원에 대하여 특이 반응을 나타내는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선택하여 클론화한다. 항체 생산 하이브리도마의 클로닝에는 한계 희석법 외에 연한천법(Eur, J. Immunol. 6: 511-519, 1976) 등을 이용할 수 있다. 또한 생산된 모노클로날 항체를 프로테인 A 등을 이용한 칼럼 크로마토그래피 등의 방법에 의하여 정제한다.
상기 모노클로날 항체 이외에도 프로브로서 사용하는 분자는 제작할 수 있다. 예를 들면 재조합 항체에 대하여는 Hoogenboon의 총설 등에 상세하게 기재되어 있다 (Trends in Biotechnology, 15: 62-70, 1997).
본 발명에 있어서, 검체 중의 HCV 코어 항체를 위한 프로브로서의 항원 또는 상기 HCV 코어 항체를 제조하기 위한 항원은 구체적으로는 예를 들면 서열번호: 1 또는 2에 도시하는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 또는 서열번호: 3 내지 6에 기재된 복수의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드이고, 이들은 이들을 코드하는 DNA의 재조합 발현에 의하여 얻을 수 있다.
이 때의 검출 원리는 산소 표지 항체 방법, 형광 표지방법, 방사능 동위원소 표지방법 등 통상의 면역측정법에 사용되는 방법을 사용하더라도 무방하며, 산소 표지 항체법에 있어서 효소 검출 원리는 비색법, 형광법, 화학 발광법 등이 있다. 또한 항체의 검출에는 이항원 샌드위치법과 같은 항체 검출에 일반적으로 사용되는 방법을 사용하여도 무방하며, 또한 항원의 검출에도 동일한 스텝 샌드위치계 등의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 태양 중 하나는 이하와 같은 반응계이다. (1) HCV 코어 항원에 대한 프로브, 예를 들면 HCV 코어 항원에 대한 항체와, (2) HCV 에피토프를 포함하는 화합물, 예를 들면 HCV 폴리펩티드의 에피토프를 포함하는 펩티드, 펩티드 화합물 또는 폴리펩티드 및 이들의 혼합물을 면역 측정법에 사용되는 담체, 예를 들면 마이크로 타이터플레이트에 고상화시킨다. 고상화시킨 담체를 HCV 파티클, 또는 파티클 복합체로부터 HCV 코어 항원을 프로브가 인식할 수 있도록 노출시키고, 또한 HCV 에피토프에 대한 항체의 기능을 저해시키지 않는 성분을 함유하는 반응 완충액중에서 피검체와 반응시키고, 검체 중에 포함되는 코어 항원 및 HCV 에피토프에 대한 항체를 담체에 특이적으로 결합시킨다.
다음으로 결합되지 않은 검체 중의 성분을, 예를 들면 담체를 적당한 완충액으로 세정함으로써 제거한 후 담체에 결합한 코어 항원을 인식하는 프로브, 예를 들면 코어 항원에 대한 효소 등으로 표지된 항체와, 담체와 결합한 HCV 에피토프에 대한 항체를 인식하는 프로브, 예를 들면 효소 등으로 표지된 항-사람 항체 마우스 모노클로날 항체를 포함하는 반응액과 반응시킴으로써, 담체에 결합한 코어 항원과 HCV 에피토프에 대한 항체에 특이적으로 결합시킨다. 반응 종료후, 미반응 성분을 제거하기 위하여 예를 들면 담체를 적당한 완충액으로 세정한 후, 표지를 적당한 방법으로 검출함으로써, 검체 중에 포함되는 코어 항원과 HCV 에피토프에 대한 항체를 검출할 수 있게 된다.
또한 임뮤노크로마토법 등의 일반적인 면역 측정법에 사용할 수 있는 B/F 분리법에도 적용 가능한 것은 당해 분야의 연구자에게는 자명하다.
항원 검출에 적합한 반응조건
본 발명이 제공하는 계에 있어서 항원 검출에 적합한 반응계로는 HCV 항원 에피토프에 대한 항체의 기능을 잃지 않을 정도의 마일드한 조건이면서, 검체 중에 존재하는 복잡한 구조체인 HCV 파티클로부터 HCV 항원을 인식하는 프로브인 항체가 인식하는 영역을 충분히 노출하는 조건으로 구성되는 계이다.
이미 초원심법으로 분리한 바이러스 파티클(Takahashi et al., 1996, J. Gen. virol, 73:667-672), 폴리에틸렌글리콜에 의하여 응집 침전시킨 HCV 파티클을 Tween 80이나 TritonX 100과 같은 비이온성 계면활성제에 의하여 처리함으로써 (Kashiwakuma et al., 1996, J. Immunological methods 190: 79-89), 코어 항원이 검출 가능한 것으로 나타나 있으나, 전자에 있어서는 그 검출 감도가 불충분하고, 충분하게 항원이 노출되어 있는 지는 의문이다. 또한 후자에 있어서는 다른 처리제를 가함으로써 항체의 활성을 잃게 하여, 계면활성제의 효과 그 자체에 대하여는 언급되어 있지 않다.
본 발명에 있어서는, 먼저 계면활성제를 기본으로 조건을 검토하고, 반응액을 계면활성제를 중심으로 한 조성으로 함으로써, 이미 보고되어 있는 HCV 항원 검출계와 같이, 원심조작이나 가열 등의 조작으로 구성되는 전처리법을 적용하지 아니하고, 단순히 반응액중에서 검체를 희석하는 것만으로, HCV 파티클 중의 항원을 효율적으로 검출할 수 있게 되었다.
효과적으로 바이러스 입자 중으로부터 코어 항원을 추출하고, 또한 혈청중의 여러 가지 물질과의 상호반응을 억제하여, 효율적으로 프로브와 항원이 반응할 수 있는 조건을 부여하는 것이 필요하다. 이 때의 효과적인 계면활성제로서는 알킬기와 제 2 내지 제 4급 아민을 동일 분자 내에 가지는 계면활성제, 또는 비이온성 계면활성제를 들 수 있다.
상기 알킬기와 제 2 내지 제 4급 아민을 가지는 계면활성제에 있어서, 알킬기는 바람직하게는 직쇄 알킬기이고, 그 탄소 원자수는 바람직하게는 10개 이상, 또한 바람직하게는 12 내지 16개이다. 아민으로서는 제 3 아민 또는 제 4 아민 (암모늄)이 바람직하다. 구체적인 계면활성제로서는 도데실-N-설코신산, 도데실 트리메틸 암모늄염, 세틸드리메틸암모늄염, 3-(도데실디메틸암모니오)-1-프로판 술폰산, 3-(테트라데실디메틸암모니오)-1-프로판술폰산, 도데실피리미듐염, 세틸피리미듐염, 데카노일-N-메틸글루카미드(MEGA-10), 도데실-N-베타인 등을 들 수 있다. 도데실-N-설코신산 및 도데실트리메틸암모늄염이 바람직하다.
상기 비이온성 계면활성제로서는 12 내지 14 사이의 친수 소수비를 가지는 것이 바람직하고, 폴리옥시에틸렌이소옥틸페닐에테르류, 예를 들면 TritonX100, TritonX114 등, 또는 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르류, 예를 들면 Nonidet p40, TritonN101, Nikkol NP 등이 바람직하다.
본 발명에 있어서는, 상기 두 가지 타입의 계면활성제를 단독으로 사용하여도 무방하나, 병용하는 것이 더욱 바람직하며, 병용에 의하여 상승효과가 얻어진다.
또한 HCV 에피토프에 대한 항체를 검출하도록, HCV 에피토프를 포함하는 항원과, HCV 항원을 검출하기 위한 항체를 고상화한 담체와 본 발명이 제공하는 반응액으로 희석한 검체와 반응시킴으로써, HCV 항체가 존재하지 않고 HCV 항원을 포함하는 검체에 있어서는, 항원을 효율성 좋게 검출하고 HCV 항원이 존재하지 않고 항체만이 존재하는 항체에 있어서는 효율 좋게 항체를 검출하고, 또한 항원과 항체가 존재하는 검체에서는 항원과 항체를 동시에 검출함으로써 높은 시그널을 부여하고 있는 것을 밝혀내어 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
바이러스의 항원과 바이러스 항원에 대한 항체를 동시 검출하는 방법은, 먼저 HIV에서 보고되고 있다 (Weber et al, J. Clinic. Microbiol., 36:2235-2239, 1998). HIV의 경우에는 바이러스 항원 검사로서 gag 단백질인 p24를 검출하는 것이 유효하다. 한편 바이러스 항원에 대한 항체 검사에서는 엔벨로프 단백질과 gag 단백질인 p19에 대한 항체를 검출하는 것이 유효하다. 그 때문에 바이러스 항원과 바이러스 항원에 대한 항체를 동시에 검출하는 방법은, 항원검사로서 gag 단백질인 p24를 검출하고, 항체 검사로서 엔벨로프 단백질과 gag 단백질의 일부인 p19에 대한 항체를 검출하는 방법을 조합함으로써 달성된다.
이와 같이 바이러스 항원 검출에 사용되는 항원의 에피토프와 바이러스 항체검출에 사용되는 피검체중의 항체가 인식하는 에피토프가 다른 경우, 바이러스 항원과 바이러스 항원에 대한 항체를 동시에 검출하는 방법의 구축은 비교적 용이하다. 왜냐하면 예를 들여 HIV 검사의 경우, 항원 검출에 사용하는 프로브, 예를 들면 HIV 검사의 경우, 항원검출에 사용되는 프로브, 예를 들면 HIV 에피토프에 대한 모노클로날 항체가 인식하는 항원 p24와 항체 검사로 피험자의 시료 중에 포함되는 항체가 인식하는 항원은 엔벨로프 단백질과 gag 단백질의 일부인 p19와는 다른 단백질이고, 항원 검사에 사용되는 프로브가 엔벨로프 단백질과 gag 단백질의 일부인 p19를 인식하는 경우는 없다. 따라서 프로브가 항체 검출에 사용하는 HIV 에피토프에 결합함으로써 발생하는 경합반응에 의한 감도저하, 비특이반응 등, 항원검출계, 항체검출계가 서로 다른 계를 간섭하는 경우가 발생하기 어렵기 때문이다.
그러나 HCV 에피토프에 대한 항체 검출에 있어서, 코어 항원 에피토프에 대한 항체를 검출하는 것이 임상적으로 상당히 유용하다 (Chiba et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4641-4645, 1991, Bresters et al., Vox Sang., 62:213-217, 1992). 따라서 항체 검출에 있어서 코어 항원 에피토프에 대한 항체를 검출하는 것은 필수 요건이다. 한편, 항원 검출에 있어서는, 바이러스 파티클을 구성하는 항원 중, 코어 항원은 다른 항원, E1, E2보다 변이율이 낮으므로, 코어 항원을 검출하는 것은 HCV항원 검출에 있어서도 더욱 유효한 방법이다. 즉, 효과적인 HCV의 항원 검출에 있어서도 가장 유효한 방법이다. 즉, 효과적인 HCV의 항체 동시 측정을 구축하기 위하여 항원 검출계와 항체 검출계로 동일한 항원, 코어 항원을 사용할 필요가 있다.
때문에 아무런 처리도 하지 않고 코어 항원을 사용한 경우, 항원 검출에 사용한 코어 항원에 대한 모노클로날 항체가, 항체 검출에 사용하는 코어 항원에 결합하여, 흡수되고 피검체중의 항원의 검출감도가 저하되는, 항체 검출에 사용하는 항원에 결합하여, 항원 검사의 비특이반응을 유발하는, 항체 검사를 위한 HCV 에피토프가 마스크되어 감도가 저하되는 등의 문제가 발생한다.
본 발명자 등은 이 문제를 해결하기 위하여 항원 검출에 사용하는 모노클로날 항체의 에피토프와 피검체중에 존재하는 코어 항원에 대한 항체의 에피토프를 분할시킴으로써, 항원과 항체를 동시에 효율성 있게 검출할 수 있다는 것을 밝혀내고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
이하 실시예를 상세하게 설명함으로써, 항원과 항체의 동시측정을 위한 적절한 에피토프의 조합예를 제시한다.
코어 항원에 대한 피검체중의 항체의 에피토프에 대하여는, 여러 가지 에피토프 해석의 결과로부터, 가장 중요한 영역이 코어 항원의 N-말단, 특히 HCV 폴리펩티드의 제 1위부터 제 40위에 존재하는 것이 나타나 있다 (Okamoto et al, Hapatology 15: 180-186, 1992, Sallberg et al, J. Clinical. Microbiol., 30: 1989-1994, 1992, Sallsberg et al., J Med. Vilol, 43: 62-68, 1994). 또한 유전자형 특이적으로 반응하는 에피토프가 HCV 폴리펩티드의 제 66위부터 제 80위에 있다 (Machida Hepatology 16: 886-891 '92, 특개평 9-209522). 그 때문에 HCV 에피토프에 대한 항체를 검출하기 위한 항원으로서, HCV 폴리펩티드의 제 1위부터 제 40위, 제 66위부터 제 80위의 서열을 가지는 것이 중요하다. 따라서 HCV 항체를 검출하는 항원으로서는, HCV 폴리펩티드의 제 1위부터 제 42위, 제 66위부터 제 80위의 서열을 포함하는 항원 CEPM을 적절한 서열을 가진 항원 폴리펩티드로서 실시예에 개시한다. 또한 CEPM은 HCV 폴리펩티드의 아래에 도시하는 영역을 아래의 순으로 열거한 인구(人口) 서열로 구성되는 항원이고, 이 구축방법은 일본공개 특허공보 평9-209522에 기재되어 있다. 또한 서열은 서열 번호 10에 기재되어 있다.
CEPM의 HCV 에피토프의 서열의 결합:
(1238-1313) - (1363-1460) - (1712-1751) - (66-80) -
(1686-1704) - (1716-1751) - (66-80) - (1690-1713) -
(1-42)
한편, 항원 검출에 있어서는, 피검체 중에 코어 항원에 대한 항체가 비교적 존재하지 않는 영역, 즉 HCV 폴리펩티드의 제 100위로부터 130위를 인식하여 결합하는 모노클로날 항체를 제 1차 반응에, 제 1차 항체에 결합한 코어 항원을 검출하기 위한 제 2차 항체의 인식 부위로서는, 항체 검사에 사용하지 않는 영역, HCV 폴리 펩티드의 제 40위로부터 50위를 인식하는 모노클로날 항체를 사용하여, HCV 폴리펩티드의 제 100위부터 제 130위에 대한 항체에 의하여 유지된 코어 항원을 검출한다. 이들 모노클로날 항체는 어느 것이든, HCV 항체를 검출하기 위하여 사용하고 있는 HCV 폴리펩티드 제 1위부터 42위까지를 포함하는 항원에는 결합하지 않으므로, 상기 모노클로날 항체, 상기 항원을 사용함으로써, 결합에 의한 항원 검출계, 항체 검출계에 대한 반응 저해가 발생하지 않고, 각각의 측정계를 동시에 기능시킬 수 있게 된다.
이하 실시예에 의거하여 본 발명을 상세하게 설명한다.
실시예 1. HCV 유도 폴리펩티드의 발현 및 정제
(A) 발현 플라스미드의 구축
HCV의 코어 영역에 상당하는 발현 플라스미드는 이하의 방법으로 구축하였다. C11-C21 클론 및 C10-E12 클론 (일본공개 특허공보 평6-38765)을 pUC119에 집어넣어 얻어진 플라스미드 pUC·C11-C21 및 pUC·C10-E12의 각 DNA 1μg을 제한 효소반응액 20μl(50mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM MgCl2, 1mM DTT, 100mM NaCl, 15단위의 EcoRI 및 15단위의 Clal 효소)중, 및 (10mM Tris-HCl (pH7.5), 10mM MgCl2, 1mM DTT, 50mM NaCl, 15 단위의 ClaI 및 15 단위의 KpnI 효소)중에서 각각 37℃ 1시간 절단하고, 그 후 0.8% 아가로스 겔 전기 영동을 실시하고, 약 380bp의 EcoRI-ClaI 단편 및 약 920bp의 ClaI-KpnI 단편을 정제하였다.
이 두 가지 DNA 단편과 pUC 119를 EcoRI 및 KpnI로 절단한 벡터에 10×리가제용 완충액〔660mM Tris-HCl (pH7.5), 66mM MgCl2, 100mM 디티오스레틀, 1mM ATP〕5μl, T 4 리가제 1μl (350 단위/μl)에 물을 가하여 50μl로 하고, 16℃ 에서 하룻밤 보온하고, 연결 반응을 실시하였다. 이 플라스미드를 사용하여 대장균 JM109를 형질 전환시키고, 플라스미드 pUC·C21-E12를 얻었다.
이 플라스미드 pUC·C21-E12 DNA 1ng를 두 가지 프라이머-(5-GAATTCATGGGCACGAATCCTAAA - 3' (서열 번호: 7), 5' - TTAGTCCTCCAGAACCCGGAC -3' (서열번호 : 8))를 사용하여 PCR을 실시한다. PCR은 GeneAmpTM (DNA Amplification Reagent Kit, Perkin Elmer Cetus 제)의 키트를 사용하여 DNA 변성 95℃ 1.5분, 어닐링 50℃ 2분, DNA 합성 70℃ 3분의 조건으로 실시하고, 얻어진 DNA 단편을 0.8% 아가로스겔 전기영동에 의하여 분해한 후, 글라스 파우더법(Gene Clean)으로 정제하였다.
한편, pUC 19를 제한효소 SmaI로 절단하고, PCR법에 의하여 얻어진 DNA 단편을 10×리가제용 완충액 〔660mM Tris-HCl (pH 7.5), 66mM MgCl2, 100mM 디티오스레틀, 1mM ATP〕 5μl, T4 리가제 1μl (350 단위/μl)에 물을 가하여 50μl로 하고, 16℃로 하룻밤 보온하고, 연결 반응을 실시하였다. 이 플라스미드를 사용하여 대장균 JM109를 형질 전환시켜, 플라스미드 pUC 19·C21 - E12·SmaI를 얻었다.
이 플라스미드 DNA 1μg를 제한 효소반응액 20μl(150mM NaCl, 6mM Tris-HCl (pH7.5), 6mM MgCl2, 15단위의 EcoRI 및 15단위의 BamHI 효소)중에서 37℃ 1시간 절단반응을 실시한 후 0.8% 아가로스겔 전기영동을 실시하고, 약 490bp의 EcoRI-BamHI 단편을 분리하고, 이를 글래스파우더법으로 정제하였다.
다음으로 발현 벡터인 Trp·TrpE (일본공개 특허공보 평5-84085)의 DNA 1μg를 제한효소 반응액 20μl(150mM NaCl, 6mM Tris-HCl (pH7.5), 6mM MgCl2, 15단위의 EcoRI 및 15단위의 BamHI 효소)중에서 37℃에서 1시간 절단하고, 그 반응액에 물 39μl을 가하여, 70℃로 5분간 열처리한 후에 박테리아 알칼리성 포스파타제(BAP) 1μl(250단위/μl)를 가하여 37℃에서 1시간 보온하였다.
이 반응액에 페놀을 가하고 페놀 추출을 하고, 얻어진 수층을 에탄올 침전하고, 침전물을 건조시켰다. 얻어진 EcoRI-BamHI 처리 벡터-DNA 1μg과 상술한 코어 140 단편을 10×리가제용 완충액 (660mM Tris-HCl (pH7.5), 66mM MgCl2, 100mM 디티오트레이톨, 1mM ATP) 5μl, T4 리가제 1μl (350단위 / μl)에 물을 가하여 50μl로 하고, 16℃에서 하룻밤 보온하고, 연결반응을 하였다.
이 반응액의 10μl을 사용하여 대장균 HB101주를 형질 전환하였다. 형질전환에 사용한 감수성 대장균주는 염화칼슘법(Mandel, M과 Higa, A., J.Mol.Biol., 53, 159-162 (1970))에 의하여 만들어진다. 형질전환 대장균을 25μg/ml의 앰피실린을 포함한 LB 플레이트 (1% 트립톤, 0.5%, NaCl, 1.5% 한천)상에 도포하고, 37℃로 하룻밤 보온하였다. 플레이트 상에 발생한 균의 콜로니를 1백금 잘라내어, 25μg/ml의 앰피실린을 포함하는 LB 배지로 옮기고 하룻밤 37℃로 배양하였다.
1.5ml의 균 배양액을 원심분리하여 집균하고, 플라스미드 DNA 의 미니프레퍼레이션을 알칼리법〔Manniatis들, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982)〕에 의하여 실시하였다. 얻어진 플라스미드 DNA 1μg을 제한효소 반응액 20μl 〔150mM NaCl, 6mM Tris-HCl (pH7.5), 6mM MgCl2, 15단위의 EcoRI 및 15단위의 BamHI 효소〕중에서 37℃, 1시간 절단하고, 아가로스겔 전기영동을 실시하여, 약 490bp의 EcoRI·BamHI 단편이 생기는 Trp·TrpE 코어 160 발현 플라스미드를 선별하였다.
(B) 클론 코어(160)에서 코드되는 폴리펩티드의 발현 및 정제
발현 플라스미드 Trp·TrpE 코어 (160)를 가지는 대장균 HB101주를 50μg/ml의 앰피실린을 포함하는 3ml의 2YT배지 (1.6% 트립톤, 1% 효모 엑기스, 0.5% NaCl)에 접종하고, 37℃에서 9시간 배양한다. 이 배양액 1ml을 50μg/ml의 앰피실린을 포함하는 100ml의 M9-CA배지 (0.6% Na2HPO4, 0.5% KH2PO4, 0.5%, NaCl, 0.1% NH4Cl, 0.1mM CaCl2, 2mM MgSO4, 0.5% 카사미노산, 0.2% 글루코스)에 옮기고 37℃에서 배양하였다. OD600=0.3의 시에 종농도(終濃度) 40mg/l가 되도록 인돌 아크릴산을 가한 후, 16시간 배양하였다. 이 배양액을 원심 분리하여 균체를 모았다.
균체에 20ml의 완충액 A(50mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA, 30mM NaCl)를 가하여 현탁하고, 다시 원심분리를 하여 발현 균체 2.6g을 얻었다. 얻어진 균체를 완충액 A 10ml중에 현탁하고, 초음파 파쇄에 의하여 대장균막을 파쇄한 후에 원심 분리를 실시하고, HCV cDNA로 코드되는 폴리펩티드와 TrpE의 융합 폴리펩티드를 포함하는 불용성 획분을 얻었다. 이 획분에 10ml의 6M 요소를 포함하는 완충액 A를 가하고 융합 폴리펩티드를 가용화 추출하였다. 가용화한 추출물을 S-Sepharose를 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피로, 융합 폴리펩티드의 정제를 실시하였다.
실시예 2. 하이브리도마의 작제법
상기 방법에 의하여 조제한 융합 폴리펩티드(TrpC11)를 6M 요소 용해후, 0.15M NaCl을 포함하는 10mM 인산 완충액(pH7.3)에 종농도 1.0mg/ml가 되도록 희석하고, 등량의 TiterMax 혼화하고, TrpC11 현탁액으로 하였다. TrpC11 농도가 0.01 내지 0.05mg/ml이 되도록 정제한 그 현탁액을 4 내지 6주된 BALB/c계 마우스에 복강내 투여하였다. 먼저 약 8주간 후, 면역화 동물에 TrpC11 농도가 0.005 내지 0.03mg/ml가 되도록 정제한 생리식염수 용액을 미정맥내에 투여하였다.
최종 추가면역후 3일째에 이 면역동물로부터 무균적으로 비강을 적출하고, 가위로 잘라 절편으로 만들고 메쉬(Mesh)를 사용하여 비장을 개개의 세포로 나누고 RPMI-1640 배지로 3회 세정하였다. 8-아자구아니딘 존재 하에 수일간 배양하고, 복귀 돌연 변이체를 완전하게 제거한 대수증식기의 마우스 골수종 세포주 PAI를 상기와 마찬가지로 세정한 후, 그 세포 1.8×107개와 비장세포 1.0×108개를 50ml용의 원심관에 넣어 혼합하였다. 200×g, 5분간 원심 분리하여, 상등액을 제거하고, 37℃로 보온한 50% 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 4000 (Merck Co. 제조)를 포함하는 RPMI-1640 배지 1ml을 가하여 세포 융합시켰다.
융합세포는 원심분리 (200×g, 5분간)에 의하여 PEG를 제거한 후, 96 웰 플레이트를 사용하고, 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (이하, HAT로 생략)을 포함하는 RPMI-1640 배지 중에서 1 내지 2주간 배양하고 하이브리도마만을 증식시켰다. 그 후, HAT를 포함하지 않는 배지로 성장시키고, 약 2주간 후 목적하는 항체를 산생하는 클론을 ELISA법으로 검색하여, 소망하는 반응 특이성을 가지는 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻었다.
얻어진 하이브리도마에 대하여 상법의 한계 희석법에 따라, 목적으로 하는 항체의 산생주(産生株)의 검색 및 단일 클론화를 실시하고, 얻어진 하이브리도마를 HC11-14, HC 11-10, HC11-3, 및 HC11-7이라 명명하였다. 그 4종류의 하이브리도마에 관하여는 미생물 공업기술연구소에 1997년 7월 4일자로 FERM BP-6006, FERM BP-6004, FERM BP-6002 및 FERM BP-6003으로 기탁하였다.
실시예 3. 모노클로날 항체의 제조법
실시예 2에 기재된 방법에 의하여 얻어진 하이브리도마를 프리스탄 등으로 처리한 마우스 복강에 이식하고, 복수중에 산생되는 모노클로날 항체를 취득하였다. 그 모노클로날 항체의 정제는 프로틴 A를 결합시킨 세파로스칼럼에 의하여 IgG 플랙션을 분리하였다.
상기 5종류의 하이브리도마로부터 산생된 각각의 모노클로날 항체, C11-14, C11-10, C11-7 및 C11-3의 아이소타입은 토끼 항마우스 Ig 각 아이소타입 항체 (Zymed 사 제조)를 사용한 이중면역확산법에 의하여 C11-10 및 C11-7이 IgG2a, C11-14 및 C11-3이 IgG1인 것이 밝혀졌다. 얻어진 4종류의 모노클로날 항체에 대하여, HCV/코어 영역 유도 서열에 의하여 합성한 20의 펩티드를 사용하고 에피토프 해석을 실시한 결과, 표 1에 표시하는 바와 같이 코어 영역의 일부를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체인 것을 알게 되었다.
항체 인 식 부 위
C11-14 41Gly -50Arg (서열번호 4)
C11-10 21Asp -40Arg (서열번호 3)
C11-3 100Pro -120Gly (서열번호 5)
C11-7 111Asp -130Phe (서열번호 6)
실시예4 항원을 전처리 조작없이 효율적으로 검출시키기 위한 방법
HCV 파티클을 포함하는 검체를 계면활성제를 가한 반응액에 희석하고, HCV 코어 항원의 검출되는 효율을 검토하였다.
또한 HCV 코어 항원의 검출은 HCV 코어 항원에 대한 모노클로날 항체를 사용한 샌드위치 효소 면역 검정 (EIA)으로 실시하였다. 실시예 3에서 얻어진 모노클로날 항체 중, C11-3과 C11-7을 코어 항원을 보충하는 항체로 사용하고, C11-10, C11-14를 보충된 코어 항원을 검출하기 위한 항체로서 사용하였다.
EIA는 기본적으로 이하의 조건으로 실시하였다. 모노클로날 항체 C11-3, C11-7을 초산완충액에 각각 4μg/ml가 되도록 희석한 용액을 마이크로타입 플레이트에 가하고, 4℃에서 하룻밤 보온하였다. 인산 완충액으로 세정한 1% BSA를 포함하는 인산 완충액을 가함으로써 블록킹 조작을 실시하였다. 이 때 반응액 100μl, 검체 100μl를 가하고, 교반후, 실온에서 1.5시간 반응시켰다. 저농도의 계면활성제를 가한 인산 완충액으로 세정함으로써 미반응물을 제거한 후, 알칼리 포스파타제로 표지한 모노클로날 항체 C11-10, C11-14를 가하고, 실온 30분 반응시켰다.
반응 종료후, 저농도의 계면활성제를 가한 인산 완충액으로 세정하여 미반응물을 제거하고, 기질액(CDP-Star/emerald 11)을 가하여 실온 15분 반응후, 발광량을 측정하였다.
일차 반응액 중에 각종 계면활성제를 가하여 그 효과를 검토하였다. HCV에 대한 항체의 역가가 검출 감도 이하이고, HCV에 대한 항체를 거의 포함하지 않는 것으로 생각되는 HCV 항원 양성 혈청을 사용하여, 발광량의 다과에 따라 코어 항원의 검출감도를 조사하고 건강한 정상인의 혈청의 발광량을 1.0으로 하고, 그에 대한 반응비율로 나타내었다. 결과를 다음 표 2 및 표 3에 나타내었다.
이 결과로부터, TritonX100으로 대표되는 바와 같이, HLB치가 12 내지 14 사이를 나타내는 비이온성 계면활성제의 첨가에 의하여 HCV 항원 양성 혈청으로는 건강한 정상인의 혈청과 비교하여 발광량이 증대되고, 검출 감도가 상승하는 것이 판명되었다. 또한, 마찬가지로 도데실-N-살코신산나트륨이나 도데실트리메틸암모늄으로 대표되는 바와 같이, 직쇄 알킬기와 제 2 내지 제 4급 아민을 동시에 그 구조에 가지는 계면활성제의 첨가에 의하여, HCV 항원 양성 혈청에 있어서 검출감도가 상승하는 것도 판명되었다. 탄소수 8 이하의 알킬기를 가지는 상기 계면활성제는 그와 같은 감도 상승 효과는 인정되지 않았다.
또한 이들 2 종류의 계면활성제를 혼합(표 2에서는 2% 도데실-N-살코신산나트륨과 2% Triton X100을 혼합) 첨가함으로써, HCV 항원 양성 혈청에 있어서 검출감도가 상승하는 것도 판명되었다.
실시예 5. HCV 감염후의 HCV 항체 출현 전 (윈도우기)의 검체 중의 코어 항원 검출
시판되고 있는 세로콘와젼 파넬 PHV905 (B.B.I. in c.)를 반응액 중에 2%의 TritonX100 및 2% 도데실-N-살코신산 나트륨 첨가하고, 실시예 4에 준하여 측정하였다. 여기서 사용한 PHV 905 파넬은 관찰 개시후 21일째 (혈청 번호 PHV 905-7)에 항 HCV 항체 검사(오르토 EIA. 3.0)로 양전화를 보인 것으로, 그 항체가는 컷오프 인덱스(S/CO)로 표시되고 있고, 1.0 이상이 양성으로 판정된다. HCV 코어 항원 활성 (발광량)은 건강한 정상인 혈청의 발광량을 1.0으로 하고, 그에 대한 비율(S/N)로 표시하였다.
표 4에 도시한 바와 같이, 아직 항 HCV 항체가 양성이 되기 전에 코어 항원 활성이 인정되고, 이 계면활성제의 첨가에 의하여 바이러스 입자로부터 코어 항원성이 노출되고, 고상화된 모노클로날 항체와 반응하여, 검출되어 있다는 것이 확인되었다.
혈청 No. 관찰 개시후 일수 HCV 코어 항원 활성(S/N) 항HCV 항체가(S/CO)
PHV 905-1 0 5.32 0.000
905-2 4 8.30 0.000
905-3 7 15.63 0.000
905-4 11 4.37 0.300
905-5 14 14.75 0.700
905-6 18 7.57 0.700
905-7 21 4.82 2.500
905-8 25 3.31 5.000
905-9 28 1.61 5.000
실시예 6. 검체중에 포함되는 HCV 항체의 검출과 코어항원과의 동시검출
HCV 에피토프에 대한 항체가 포함되고, 또한 HCV 항원이 거의 포함되지 않는 검체 (사람 혈청)를 사용하고, 계면활성제를 포함하는 일차 반응액 중에서 HCV 에피토프에 대한 항체가 활성이 없어지지 아니한 채, HCV 폴리펩티드에 결합되고, 2차 반응액 중에 항사람 항체를 가함으로써 검출 가능하다는 것과 코어 항원이 존재하는 경우에는 항체를, 그 양자가 포함되는 때에는 그 양자를 검출 가능하다는 것을 이하의 방법에 의하여 확인하였다.
EIA는 기본적으로는 이하의 조건으로 실시하였다. HCV 에피토프를 포함하는 재조합 항원 CEPM을 요소를 포함하는 인산 완충액에 희석하고, 마이크로 타이터플레이트에 첨가하고, 4℃ 하룻밤 보온한다. 인산 완충액으로 세정한 후, 플레이트에 모노클로날 항체 C11-3, C11-7을 초산 완충액으로 희석한 용액을 가하고, 4℃ 하룻밤 보온하였다. 또한 재조합 항원 CEPM의 작성방법은 특원평 9-209522에 기재되어 있다. 항체 용액을 제거한 후, 인산 완충액으로 세정하고 1% BSA를 포함하는 인산 완충액을 가함으로써 블로킹 조작을 실시하였다.
여기서 TritonX100, 도데실-N-살코신산나트륨 및 요소를 포함하는 일차 반응 완충액 100μl, 검체 100μl을 순차적으로 가하고, 교반후, 실온에서 1.5 시간 반응시켰다. 저농도의 계면활성제를 가한 인산 완충액으로 세정함으로써 미반응물을 제거한 후, 호스 래디쉬 퍼옥시다제로 표지한 HCV 코어 항원에 대한 모노클로날 항체 C11-14와, 사람 IgG에 대한 마우스 모노클로날 항체를 포함하는 2차 반응 완충액을 가하고, 실온 30분 반응시켰다.
반응 종료후, 미반응물을 저농도의 계면활성제를 가한 인산 완충액으로 세정함으로써 제거하고, 기질액 (오르토-페닐렌디아민)을 가하여 실온 20분 반응후, 흡광도를 측정하였다.
HCV 코어 항원을 거의 포함하지 않는 것이 확인되어 있는 HCV 항체 양성 사람 혈청을 말 혈청에 의하여 희석한 것을 검체로 하고, HCV 에피토프에 대한 항체가 검출되어 있는 것을 확인한 바, 농도 의존적으로 반응하는 것이 확인되고, 항체가 일차 반응액중에서 활성을 잃지 않고 검출되는 것이 확인되었다.
HCV 항원과 HCV 항체의 동시 측정
표지항체: 비교예 비교예 본 발명
POD-표지c11-14 POD-표지항사람 IgG POD-표지c11-14와POD-표지항사람 IgG
고 상 c11-3과c11-7 CEPM c11-3과c11-7과CEPM
샘재조합코어항원ng/ml 플양성 혈청희석배수
-5012.53.10.780.20.048- ---×2048×512×128×32×8 0.0012.7842.8221.5860.4230.0850.0140.000 0.0000.0000.0000.2100.5391.1391.7462.161 0.0002.8342.7581.3410.8151.1511.6211.824
(값은OD492/OD690)
한편 재조합 코어 항원을 말 혈청에 가하고, 말 혈청에 의하여 희석한 것을 검체로 하고, 측정하였더니 농도 의존적으로 재조합 코어 항원이 검출될 수 있다는 것이 확인되었다.
코어 항원과 사람 혈청을 적당량 가한 말 혈청을 검체로 하여 측정하였더니, 표 4에 도시하는 바와 같이, 재조합 코어 항원만을 포함하는 경우에는 재조합 코어 항원에 의한 시그날이 얻어지고, 사람 HCV 항체 양성 혈청만을 포함하는 경우에는 HCV 항체만의 시그날이 얻어지고, 양자를 포함하는 경우에는 양자의 시그널이 가산된 시그널이 얻어진다. 고로 항원 검출계, 항체 검출계의 양자가 서로 다른 것을 간섭하지 않고 기능하고, HCV 항원과 HCV 폴리펩티드의 에피토프에 대한 항체가 검출되었다는 것을 알았다.
실시예 7. 사람 혈청중의 항원 항체 측정법
건강한 정상인 검체와 환자 검체, 및 혈청 양전화 패널 검체(BBI inc.)를 사용하여, 실시예 6에 기재된 방법에 따라 항원과 항체의 동시 측정을 실시하였다. 또한 패널 혈청에 대하여는 판매원이 제공하고 있는 HCV 항체 검출시약에서의 판정결과와 비교하였다.
건강한 정상인의 검체 18예를 사용하여 측정한 결과를 표 6에 도시하나, 건강한 정상인에서는 반응하지 않는다는 것이 확인되었다. 건강한 정상인의 분포로부터 양성과 음성의 판별치를 0.1로 설정하였다.
표 7에 도시하는 바와 같이 HCV 양성 검체에서는 모두 양성의 값을 부여하였다.
한편 표 8에 도시하는 바와 같이, 패널 혈청에서는 항체 검사에서 양성이라는 것을 판별할 수 없었던 포인트 1부터 6 사이의 양성 판정을 부여하였다. 이들 포인트는 Amplicor HCV test의 판정 결과는 양성 판정이 부여되어 있어, 이른바 윈도우 피리어드에 상당하나, 윈도우 피리어드의 검체에서도 양성 판정을 부여하는 것이 확인되었다.
검체번호 흡광도
건강한 정상인 12345671011131415161718192021 0.0630.0570.0660.0250.0450.0630.0470.0330.0360.0370.0300.0280.0310.0400.0510.0520.0310.053
평균치 0.044
환자검체 흡광도
3164584 2.892 양성2.335 양성0.394 양성2.769 양성
패널혈청 흡광도 판정 항체분석 Amplicor HCV test
PHV907-1 0.557 양성2 0.397 양성3 0.357 양성4 0.224 양성5 0.192 양성6 0.247 양성7 2.414 양성 음성 양성음성 양성음성 양성음성 양성음성 양성음성 양성음성 양성
실시예 8. 모노클로날 항체의 제조
실시예 3에 기재된 방법에 의하여 새로운 하이브리도마를 만들고, HC11-15라고 명명하였다. 미생물 공업기술연구소에 1999년 7월 16일자로 FEAM BP-9782로서 기탁되었다. 이 하이브리도마로부터 만들어진 모노클로날 항체를 정제하고, 아이소타입을 검정하였더니 IgGI인 것이 밝혀졌다. 이 모노클로날 항체는 코어 영역의 서열에 의하여 합성된 20의 펩티드를 사용한 에피토프 해석의 결과,15Thr-30Ile(서열번호 9)을 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체임을 알게 되었다.
실시예 9. 모노클로날 항체의 항체가 검정
재조합 코어 항원 (Trp c11)을 6M 요소를 함유하는 10mM 인산 완충액 (pH7.3)에 종농도 2μg/ml이 되도록 희석하고, 마이크로 플레이트의 각 웰에 100μl씩 첨가하였다. 4℃로 하룻밤 정치한 후, 흡인하고, 10mM 인산 완충액 (pH7.3)으로 2회 세정하였다. 0.5% 카제인을 함유하는 10mM 인산 완충액 (pH7.3)으로 2회 세정하였다. 0.5% 카제인을 함유하는 10mM 인산 완충액 (pH7.3)을 350μl씩 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이터한 후, 흡인하였다. 반응액에서 연속적으로 희석한 각 모노클로날 항체 (C11-3, C11-7, C11-10, C11-14 또는 C11-15)를 각 웰에 첨가하고, 1시간 반응시켰다. 세정후, 펠옥시다제 표지 항마우스 항체를 첨가하여, 30분간 반응시키고, 세정후 올트페닐렌디아민과 과산화수소가 들어간 기질액을 첨가하여 효소 반응시켰다. 실온에서 30분간 반응시킨 후, 2N 황산을 첨가하여 산소반응을 정지시키고, 마이크로 플레이트 리더로 492nm의 흡광도를 측정하였다. 도 1에 그 결과를 도시하였다.
C11-15가 가장 항체가가 높고, 2차 항체로서 사용한 경우 감도 높게 검출할 수 있는 것으로 나타났다.
실시예10. 고상화 모노클로날 항체의 차이에 의한 샌드위치 ELISA 검정
각 모노클로날 항체 (C11-3과 C11-5과 C11-15; C11-3과 C11-7; C11-3과 C11-15; C11-3 단독; C11-7 단독; 또는 C11-15 단독)을 10am 인산 완충액(pH7.3)으로 최종 농도 6μg/ml가 되도록 희석하고, 마이크로플레이트의 각 웰에 100μl씩 첨가하였다. 4℃로 하룻밤 정치한 후, 흡인하고, 10mM 인산 완충액 (pH7.3)으로 2회 세정하였다. 0.5% 카제인을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH7.3)을 350μl 씩 첨가하고, 실온에서 2시간 인큐베이터한 후, 흡인하였다. HCV-RNA 양성으로 항 HCV 항체 음성 검체 100μl과 반응액 100μl을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 세정후, 펠옥시다제 표지 항코어 항원 모노클로날 항체(C11-14 ＆ 11-10의 혼합물)를 첨가하여 30분간 반응시키고, 세정후, 올트페닐렌디아민과 과산화수소가 들어간 기질액을 첨가하여 산소 반응시킨다. 실온에서 30분간 반응시킨 후, 2N 황산을 첨가한 효소반응을 정지시키고, 마이크로플레이트 리더로 492nm 흡광도를 측정하였다. 도 2에 그 결과를 도시하였다.
C11-15만의 고상화로는 검출 감도가 너무 낮으나, c11-15에 c11-3이나 c11-7을 혼합하여 고상화함으로써 검출 감도가 상승하는 것으로 나타났다.
실시예 11. 에피토프 키메라 항원의 발현과 정제
대장균 형질 전환체 CEPM/HB101주를 100μg/ml 앰피실린을 함유하는 LB배지에서 37℃로 하룻밤 배양하였다. 이를 1% 농도로 100μg/ml 앰피실린을 함유하는 M9-CA에 접종하고, 37℃로 하룻밤 배양하였다. 배양 종료후 원심에 의하여 균체를 모으고, 50ml의 Lysis액〔50mM Tris-HCl(pH8.5), 30mM NaCl, 5mM EDTA〕에 재현탁하고, 1ml의 리조자임액 10mg/ml Lysozyme)을 가하고, 37℃에 있어서 1시간 처리하였다. 이 현탁액을 초음파처리(150W, 90초로 2회)에 의하여 세포를 파괴하였다. 15000rpm 4℃에 있어서 30분간 원심하여 불용성 분획을 회수하였다. 불용성 분획을 50ml의 NP40을 1% 포함하는 A용액 〔50mM Tris-HCl (pH8.5)〕에 재현탁하고 균질화(1500rpm으로 5 스트로크)하였다. 현탁액을 15000rpm으로, 4℃에 있어서 30분간 원심분리하고 불용성 분획을 회수하였다. 불용성 분획을 50ml의 2M 요소를 포함하는 A용액에 재현탁하고 균질화시켰다 (1500rpm으로 5 스트로크). 현탁액을 15000rpm으로 4℃에 있어서 30분간 원심분리하고 불용성 분획을 회수하였다. 불용성 분획을 50ml의 6M 요소를 포함하는 A용액에 재현탁하고 균질화 (1500rpm으로 5 스트로크)하였다. 현탁액을 15000rpm으로 4℃에 있어서 30분간 원심분리하고 불용성 분획을 회수하였다. 불용성 분획을 50ml의 6M 요소를 포함하는 A용액에 재현탁하여 균질화(1500rpm으로 5 스트로크)하였다. 현탁액을 15000rpm으로, 4℃에 있어서 30분간 원심분리시켜 가용성 분획을 회수하였다.
6M 요소를 포함하는 용액으로 가용화한 항원용액으로부터 S 세파로스 HP칼럼 (파르마시아사)을 사용한 이온 교환법과 Superdex 75pg (파르마시아사)를 사용한 겔 여과법에 의하여 에피토프 키메라 항원을 정제하였다.
또한, 상기 키메라 항원을 코드하는 DNA의 염기서열을 서열번호:10으로 나타내고, 키메라 항원의 아미노산 서열을 서열번호:11로 나타낸다.
특허협력조약규칙 제 13조 2의 기탁된 미생물에 대한 언급 및 기탁기관
기탁기관 명칭: 공업기술원 생명공학 공업기술연구소
주소: 일본국 이바라키현 쓰쿠바시 히가시 1-쪼메 1-3
미생물 (1) 표시 : HC11-3
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(2) 표시 : HC11-7
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(3) 표시 : HC11-10
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(4) 표시 : HC11-11
기탁번호 : FERM BP-6005
기탁일 : 1997년 7월 4일
(5) 표시 : HC11-4
기탁번호 : FERM BP-6006
기탁일 : 1997년 7월 4일
(6) 표시 : HC11-15
기탁번호 : FERM BP-6782
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Claims (7)

  1. C형 간염 바이러스(HCV)의 측정방법에 있어서, 탄소원자수 10개 이상의 알킬기와 제2 내지 제4급 아민을 갖는 계면활성제 또는 비이온 계면활성제, 또는 이 양자의 존재 하에서 HCV 코어 항원을 그 프로브와의 결합에 의하여 측정하는 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스(HCV)의 측정방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 알킬기와 제 2 내지 제 4급 아민을 갖는 계면활성제가, 탄소 원자수 12 내지 16개의 알킬기와 제 3급 또는 제 4급 아민을 갖는 계면활성제인 C형 간염 바이러스(HCV)의 측정방법
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 제3급 또는 제 4급 아민 계면활성제가 도데실-N-살코신산, 세틸 또는 도데실트리메틸암모늄염, 3-(도데실디메틸암모니오) -1-프로판술폰산, 도데실피리미듐염, 또는 데카노일-N-메틸글루카미드(MEGA-10)인 C형 간염 바이러스(HCV)의 측정방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 12 내지 14의 친수-소수비 (HLB)를 가지는 계면활성제인 C형 간염 바이러스(HCV)의 측정방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌이소옥틸페닐에테르, 또는 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르인 C형 간염 바이러스(HCV)의 측정방법.
  6. C형 간염 바이러스(HCV)의 측정방법에 있어서, 청구항 제 1항 내지 제 5항에 기재된 방법에 의한 HCV 코어 항원의 측정과 함께, 항 HCV항체를 그 프로브와의 결합에 의하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 항HCV 항체를 위한 프로브가 HCV 관련 폴리펩티드인 C형 간염 바이러스(HCV)의 측정방법.
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