JPS6024451A - 体液中のデルタ抗原決定 - Google Patents
体液中のデルタ抗原決定Info
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- JPS6024451A JPS6024451A JP11635284A JP11635284A JPS6024451A JP S6024451 A JPS6024451 A JP S6024451A JP 11635284 A JP11635284 A JP 11635284A JP 11635284 A JP11635284 A JP 11635284A JP S6024451 A JPS6024451 A JP S6024451A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5765—Hepatitis delta antigen
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、体液試料中のB型肝炎に係るデルタ抗原の定
性的及び/又は定量的検出方法及びかかる方法を実施す
るだめのテストキットに関する。
性的及び/又は定量的検出方法及びかかる方法を実施す
るだめのテストキットに関する。
1940年代に、黄10症例の主原因がウィルス性病原
体、即ち肝炎ウィルスであることが発見された。
体、即ち肝炎ウィルスであることが発見された。
A型及びB型肝炎ウィルスが確認されている。更に、い
わゆる非A型、非B型肝炎もあるが、これ等の病原体に
ついては何等確認されていない。正しく診断し、該診断
に基いて黄痘を適切に治療りるためには、考えられる病
原体を確認することが当然必要(二なる。肝炎ウィルス
は先ず疾恣の臨床経過に基づいて識別可能である。しか
しながら、より高い信頼度で以って識別するには、免疫
化学的な特性づけを必要とする。公知の種類の肝炎ウィ
ルスの抗原、及びこれ等抗原に対する抗体の検出は、現
在、BT炎を患っていると思われる患者の血液たりてな
く、疾患の臨床的症状が発現してい(7い潜7を保菌者
、特に供血者の血液に対しても大規模に実施されている
。
わゆる非A型、非B型肝炎もあるが、これ等の病原体に
ついては何等確認されていない。正しく診断し、該診断
に基いて黄痘を適切に治療りるためには、考えられる病
原体を確認することが当然必要(二なる。肝炎ウィルス
は先ず疾恣の臨床経過に基づいて識別可能である。しか
しながら、より高い信頼度で以って識別するには、免疫
化学的な特性づけを必要とする。公知の種類の肝炎ウィ
ルスの抗原、及びこれ等抗原に対する抗体の検出は、現
在、BT炎を患っていると思われる患者の血液たりてな
く、疾患の臨床的症状が発現してい(7い潜7を保菌者
、特に供血者の血液に対しても大規模に実施されている
。
供血者の血液は、肝炎ウィルスに特有な物質の有無、特
にB型肝炎ウィルス(1−I B V ’)の抗原の有
無、おJ、び一般的にこれ等抗原に対する抗体の有無に
ついても定期検査でスクリーンにかけられる。こうする
ことにより、事実、例えば米国では、幅面が原因で肝炎
を患った患者数が1769%から5.9%にイr(減し
た。ウィルス性肝炎の発現を絶えず抑制づるためには、
患者及び非患者を定期的スクリーニングにかけウィルス
を特徴づける物質を出来るだけ多く検出する必要がある
。
にB型肝炎ウィルス(1−I B V ’)の抗原の有
無、おJ、び一般的にこれ等抗原に対する抗体の有無に
ついても定期検査でスクリーンにかけられる。こうする
ことにより、事実、例えば米国では、幅面が原因で肝炎
を患った患者数が1769%から5.9%にイr(減し
た。ウィルス性肝炎の発現を絶えず抑制づるためには、
患者及び非患者を定期的スクリーニングにかけウィルス
を特徴づける物質を出来るだけ多く検出する必要がある
。
最近、l−I B Mに係る新しいタイプの抗原、いわ
ゆるデルタ抗原(δ−AU)、及びこれに3Jする免疫
グロブリン(anti−δ)が発見された。この発見は
、B型肝炎ウィルスに特有な物質に陽性を示した慢性肝
疾患患者を生検して冑た肝細胞中に、この新しい抗原が
存在することが組織化学的(免疫螢光法により)に検出
されたことに端を発している。恐らく、我々は、生命機
能(vital 1ifefunctions )の多
くがB型肝炎ウィルスに依存覆る、RNAウィルス抗原
を扱っているの(゛あろう。
ゆるデルタ抗原(δ−AU)、及びこれに3Jする免疫
グロブリン(anti−δ)が発見された。この発見は
、B型肝炎ウィルスに特有な物質に陽性を示した慢性肝
疾患患者を生検して冑た肝細胞中に、この新しい抗原が
存在することが組織化学的(免疫螢光法により)に検出
されたことに端を発している。恐らく、我々は、生命機
能(vital 1ifefunctions )の多
くがB型肝炎ウィルスに依存覆る、RNAウィルス抗原
を扱っているの(゛あろう。
従って、肝臓中の抗δ−Aq1及び血液中の抗−δの存
在は、慢性1−I B M感染による生命危機を更に強
める超感染(super−infect−ion )
ノ’Q候と’jlなされる。δ感染は、しばしば極めて
重症な急性肝炎に移行し、成る場合には、非常に突然に
劇症を伴って起り、遂には死亡する場合もある。
在は、慢性1−I B M感染による生命危機を更に強
める超感染(super−infect−ion )
ノ’Q候と’jlなされる。δ感染は、しばしば極めて
重症な急性肝炎に移行し、成る場合には、非常に突然に
劇症を伴って起り、遂には死亡する場合もある。
追認試験によれば、従来は非A型、非B型肝炎と見なさ
れていた肝炎感染の大多数が実際にはδ感染であった。
れていた肝炎感染の大多数が実際にはδ感染であった。
他の試験でも、HB V感染の全思者数の約7%が、δ
−八へにも感染していることが知見されている。しかし
ながら、定期的に血液、又は白液類から得られた産物(
proclt+cts)を受けたII BV感染患者の
場合、δ感染の危険性がはるかに人きい。従って、イタ
リア、ドイツ、及び米国では、被検1−I B V感染
血友病患者の約50%もがδ−八へに感染していると推
定される。
−八へにも感染していることが知見されている。しかし
ながら、定期的に血液、又は白液類から得られた産物(
proclt+cts)を受けたII BV感染患者の
場合、δ感染の危険性がはるかに人きい。従って、イタ
リア、ドイツ、及び米国では、被検1−I B V感染
血友病患者の約50%もがδ−八へに感染していると推
定される。
δ−八へが肝臓生検で発見された慢性B型肝炎患省の場
合、常に血中に、一般にδ感染の指標とみなされている
抗−δが存在している。δ−A(]に対する免疫グ[1
プリンの存在が常に、活性δ感染の指標となるわけでは
なく、δ感染に対して幅−の信頼出来るパラメータは血
中にδ−八へ自身が存在Jるか否かである。血中のδ−
A(lを確実に検出する方法は、現在のところ余り利用
されていないが感染を確実に診断する場合にも、又、供
血者からδ感染に特有な物質を完全にスクリーニングす
る場合にもこれらの方法は極めて重要(゛ある。
合、常に血中に、一般にδ感染の指標とみなされている
抗−δが存在している。δ−A(]に対する免疫グ[1
プリンの存在が常に、活性δ感染の指標となるわけでは
なく、δ感染に対して幅−の信頼出来るパラメータは血
中にδ−八へ自身が存在Jるか否かである。血中のδ−
A(lを確実に検出する方法は、現在のところ余り利用
されていないが感染を確実に診断する場合にも、又、供
血者からδ感染に特有な物質を完全にスクリーニングす
る場合にもこれらの方法は極めて重要(゛ある。
本発明は、体液中のδ−八へを非常に?’A感1qで検
出し1qる方法を提供する。
出し1qる方法を提供する。
本発明による方法は、被検体液試料を↑トリアに結合さ
れた、B型肝炎表面抗原に対する免疫グロブリン(以後
抗−HB5と言う)とインキュベートし、その後固相を
液相から分離し、界面活性剤とδ−八へに対する免疫グ
ロブリン(抗−δ)との存在下で同相をインキコベ−1
〜し、次いでδ−A!+と抗−δとの結合(possi
blr+ hondiH)を調べて、試料内のδ−A(
]の右無を定性的及び/又は定W的に測定することを特
徴とする。
れた、B型肝炎表面抗原に対する免疫グロブリン(以後
抗−HB5と言う)とインキュベートし、その後固相を
液相から分離し、界面活性剤とδ−八へに対する免疫グ
ロブリン(抗−δ)との存在下で同相をインキコベ−1
〜し、次いでδ−A!+と抗−δとの結合(possi
blr+ hondiH)を調べて、試料内のδ−A(
]の右無を定性的及び/又は定W的に測定することを特
徴とする。
抗−1−I B Sのためのキャリアは、キャリア結合
相及び非キャリア結合相を互いに分前し冑るイーr怠の
形状又は大きさを有するものであれば良く、且つこの目
的に適する任意の材料で製造され得る。
相及び非キャリア結合相を互いに分前し冑るイーr怠の
形状又は大きさを有するものであれば良く、且つこの目
的に適する任意の材料で製造され得る。
抗−It B sは直接又は間接的にキャリアに結合さ
れ得る。適切なキャリアは、例えば、ガラス、プラスデ
ック、又は天然物製の試験管、ミクロ滴定用ストリップ
父はプレートのウェル、及びロッド。
れ得る。適切なキャリアは、例えば、ガラス、プラスデ
ック、又は天然物製の試験管、ミクロ滴定用ストリップ
父はプレートのウェル、及びロッド。
ビーズ、又はディスクである。
本発明方法で用いられる界面活性剤(d13ter−g
ent )は、例えば硫酸ドデシルナトリウム、ドデシ
ル−N−ザルコシン酸ナトリウム、臭化セチルトリメデ
ル)アンモニウム、塩化ドデシルごリミジウム、バルミ
1〜イルーリゾレシチン、ドデシル−N−ベタイン、ポ
リオキシエチレンアルコール。
ent )は、例えば硫酸ドデシルナトリウム、ドデシ
ル−N−ザルコシン酸ナトリウム、臭化セチルトリメデ
ル)アンモニウム、塩化ドデシルごリミジウム、バルミ
1〜イルーリゾレシチン、ドデシル−N−ベタイン、ポ
リオキシエチレンアルコール。
ポリ第4−シJチレンーイソアルコール、ポリオキシJ
チレン−p−t−オクチル−フェノール、ポリAヤシ]
−チレンノニルフェノール、脂肪酸のポリ′:A:1ニ
ジエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトール
エステル、ドデシルスルホン酸ナトリウム、臭化テトラ
デシルアンモニウム、及びリボニンである。非イオン性
界面活性剤が好ましい。
チレン−p−t−オクチル−フェノール、ポリAヤシ]
−チレンノニルフェノール、脂肪酸のポリ′:A:1ニ
ジエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトール
エステル、ドデシルスルホン酸ナトリウム、臭化テトラ
デシルアンモニウム、及びリボニンである。非イオン性
界面活性剤が好ましい。
非常に好適な非イオン性界面活性剤は、ブリ(Bry)
、t−リドン(Triton ) 、ノニデート(N
onidet) −P −40,及びトウィーン(Tw
eed)等のポリAキシエヂ1ノン誘尋体である。
、t−リドン(Triton ) 、ノニデート(N
onidet) −P −40,及びトウィーン(Tw
eed)等のポリAキシエヂ1ノン誘尋体である。
δ−八へと抗−δどの結合は免疫化学における慣用の4
1意の方法により検出され得る。例えば、このために、
凝集反応、又はいわゆるサンドイッチ反応を用いること
が可能である。
1意の方法により検出され得る。例えば、このために、
凝集反応、又はいわゆるサンドイッチ反応を用いること
が可能である。
凝集反応を利用してδ−八へを決定する際、δ−八へを
粒子に結合した抗−δでインキコベートづる。δ−八へ
が存在すれば粒子の凝集が起るので、δ−A!+が定性
的又は定m的に検出され得る。この方法で使用される粒
子は、例えば、赤面球、ラテックス粒子、染別ゾル粒子
、又は金属或いは金属化合物のゾル粒子であり得る。
粒子に結合した抗−δでインキコベートづる。δ−八へ
が存在すれば粒子の凝集が起るので、δ−A!+が定性
的又は定m的に検出され得る。この方法で使用される粒
子は、例えば、赤面球、ラテックス粒子、染別ゾル粒子
、又は金属或いは金属化合物のゾル粒子であり得る。
リンドイッチ反応を利用してδ−八へを決定する際には
、δ−A(lをキャリアに結合された抗−δ及び標識試
薬に結合された抗−δでインキュベート覆る。両方の抗
−δ試薬が1つのδ−AQへジョイン]へ結合すれば標
識試薬がキャリアへ結合するの゛C1キトリア結合標識
試薬の検出によりδ−ΔOと抗−δとの結合、従って試
料中に存在するδ−Δgが検査される。抗−1−1[3
sの場合のように、使用されるキャリアは適当な物質で
製造可能であり、又キャリア結合相及び非キャリア結合
相を分−1し得る適切な形状と大きさであり得る。
、δ−A(lをキャリアに結合された抗−δ及び標識試
薬に結合された抗−δでインキュベート覆る。両方の抗
−δ試薬が1つのδ−AQへジョイン]へ結合すれば標
識試薬がキャリアへ結合するの゛C1キトリア結合標識
試薬の検出によりδ−ΔOと抗−δとの結合、従って試
料中に存在するδ−Δgが検査される。抗−1−1[3
sの場合のように、使用されるキャリアは適当な物質で
製造可能であり、又キャリア結合相及び非キャリア結合
相を分−1し得る適切な形状と大きさであり得る。
本発明方法で使用可能なキャリア結合抗−1−l B
s及び抗−δは各4種々のキャリアに結合可能であり、
又、被検試料と同時に又は互いに別個に接触させること
も、或いは1つの同一のキャリアに連帯的に(conj
ointly)結合せることも可能である。
s及び抗−δは各4種々のキャリアに結合可能であり、
又、被検試料と同時に又は互いに別個に接触させること
も、或いは1つの同一のキャリアに連帯的に(conj
ointly)結合せることも可能である。
この最後の方法に困るのが、一般に実施が最も簡単な測
定法である。かかる方法に於いては、仝Cの慣用の標識
試薬がδ−八への検出に使用可能であり、例えば、酵素
、放射性原子又は化合物、螢光物質2着色化合物、染斜
ゾル、金属類又は金属化合物のゾルなどが使用され得る
。
定法である。かかる方法に於いては、仝Cの慣用の標識
試薬がδ−八への検出に使用可能であり、例えば、酵素
、放射性原子又は化合物、螢光物質2着色化合物、染斜
ゾル、金属類又は金属化合物のゾルなどが使用され得る
。
本発明は更に、本発明方法を実施覆るに必要な少なくと
も幾つかの成分を含有するテストキットに関する。即ち
、本発明のデストキツ1〜は少なくとも、キャリアに結
合された抗−HB Sと抗−δどを含有Jる。抗−δは
、例えば、7スト1ツト中に粒子に結合された形態で存
在しても良いが、一方、テストキットはキl?リアに結
合しlこ抗−δ及び標識試薬に結合した抗−δの両省を
含(iすることが出来る。後者のテストキットでは、抗
−HB5 及び抗−δが1つのキャリア上に連帯的に、
又は別のキャリア」二に存在することか出来る。キャリ
アとして、例えば、ガラス、プラスチック。
も幾つかの成分を含有するテストキットに関する。即ち
、本発明のデストキツ1〜は少なくとも、キャリアに結
合された抗−HB Sと抗−δどを含有Jる。抗−δは
、例えば、7スト1ツト中に粒子に結合された形態で存
在しても良いが、一方、テストキットはキl?リアに結
合しlこ抗−δ及び標識試薬に結合した抗−δの両省を
含(iすることが出来る。後者のテストキットでは、抗
−HB5 及び抗−δが1つのキャリア上に連帯的に、
又は別のキャリア」二に存在することか出来る。キャリ
アとして、例えば、ガラス、プラスチック。
又は天然物製の試験管、ミクロ滴定用プレート或いはス
トリップ、又はロンド、ビーズ或いはディスクを用いる
ことが可能である。本発明のテスト、1−ットでは、標
識試薬として、例えば、酵素、放口Ifl同位体或いは
放射性同位体含有化合物、螢光物賀又は容色化合物、或
いは染料ゾル、金属類又【よ金属化合物のゾルなどを含
有し得る。テストキットは父、所望により、測定用助剤
、例えば、標識試薬検出用助剤(例えば、酵素基質)、
洗浄用バッファ・及び/又は界面活+(1剤などを含有
することが出来る。例えば本発明のテストキットでは抗
−δに結合される粒子として、赤血球、ラテックス粒子
、或いは染料、金屈類、又は金属化合物のゾル粒子を含
有することが出来る。
トリップ、又はロンド、ビーズ或いはディスクを用いる
ことが可能である。本発明のテスト、1−ットでは、標
識試薬として、例えば、酵素、放口Ifl同位体或いは
放射性同位体含有化合物、螢光物賀又は容色化合物、或
いは染料ゾル、金属類又【よ金属化合物のゾルなどを含
有し得る。テストキットは父、所望により、測定用助剤
、例えば、標識試薬検出用助剤(例えば、酵素基質)、
洗浄用バッファ・及び/又は界面活+(1剤などを含有
することが出来る。例えば本発明のテストキットでは抗
−δに結合される粒子として、赤血球、ラテックス粒子
、或いは染料、金屈類、又は金属化合物のゾル粒子を含
有することが出来る。
本発明を下記非限定的実施例により更に説明される。
丈1」LL
A:方法
(1) ポリスチレンデユープの被覆
20℃で24時間、pH9,Oの重炭M塩バッファ中で
δ−AnとIlr3SAgに対すルヒト免1i ’)
El 7リンとの混合物をインキュベートしc1ポリス
チレンヂコーブの内面を抗−HBs及び抗−δで・被覆
した。その後、前記デユープをllN7.2の0.15
モル/リットル燐酸塩バッファで洗浄した。
δ−AnとIlr3SAgに対すルヒト免1i ’)
El 7リンとの混合物をインキュベートしc1ポリス
チレンヂコーブの内面を抗−HBs及び抗−δで・被覆
した。その後、前記デユープをllN7.2の0.15
モル/リットル燐酸塩バッファで洗浄した。
■ 抗−δの西洋ワサビペルオキシダーゼへのカップリ
ング δ−AHに対する免疫グロブリン及び西洋ワリビペルオ
キシダーゼ(+−I RP ’)の抱合体(con−j
uoate)をN akanc & K awaoiの
方法(J。
ング δ−AHに対する免疫グロブリン及び西洋ワリビペルオ
キシダーゼ(+−I RP ’)の抱合体(con−j
uoate)をN akanc & K awaoiの
方法(J。
Histochem、 Cytochem、1974,
22.1084−1091) ニ従って調製した。
22.1084−1091) ニ従って調製した。
(3)被覆されたポリスチレンチューブの白酒によるイ
ンキュベーション 被覆ポリスチレンチューブをi、omIAの被検面清ど
、ρ87.2の0.15モル/リットル燐酸塩バッフン
・による希釈皮を次第に増加させて、37℃で2時間イ
ンキュベートした。
ンキュベーション 被覆ポリスチレンチューブをi、omIAの被検面清ど
、ρ87.2の0.15モル/リットル燐酸塩バッフン
・による希釈皮を次第に増加させて、37℃で2時間イ
ンキュベートした。
(4) 界面活性剤にJ:るインキュベーショント記(
3)で得られたチューブをN onidet −P−4
0のpl−17,2、0,15モル/リットル燐酸塩バ
ッファ溶液1.0−で37℃、2時間インキュベートし
た。
3)で得られたチューブをN onidet −P−4
0のpl−17,2、0,15モル/リットル燐酸塩バ
ッファ溶液1.0−で37℃、2時間インキュベートし
た。
その後チューブを吸引で空にし、fll−17,2の0
.15モル/リットル燐酸バッファで3回洗浄後、再び
吸引した。
.15モル/リットル燐酸バッファで3回洗浄後、再び
吸引した。
(5) 抗−δ−HRP−抱合体によるインキュベーシ
ョン L記(4)で得られたデユープの各々に■で得られた抱
合体111iヲ加えた後、pi−17,277) 0.
15[ル/リットル燐酸塩バッフ1で希釈した。37℃
で1時間インキュベートした後、チューブを吸引し、p
H7,2の0.15モル/リッ1〜ル燐11QJiバッ
ファ 2−で3回洗浄し、再び吸引した。
ョン L記(4)で得られたデユープの各々に■で得られた抱
合体111iヲ加えた後、pi−17,277) 0.
15[ル/リットル燐酸塩バッフ1で希釈した。37℃
で1時間インキュベートした後、チューブを吸引し、p
H7,2の0.15モル/リッ1〜ル燐11QJiバッ
ファ 2−で3回洗浄し、再び吸引した。
(6) I−I RPに対する基質とのインキュベーシ
ョンその後、0.41110/m(!のAルトーフエニ
レンジアミン及び0.41ng/mf!の尿素過酸化物
の混合物の111−15.0 、0.15モル/リッI
・ル耐酸プトリウム溶液1meをチューブに加えた。3
0分間のインキュベーション後、2モル/リットル硫酸
溶液1#li!を加えて反応を停止さゼた。
ョンその後、0.41110/m(!のAルトーフエニ
レンジアミン及び0.41ng/mf!の尿素過酸化物
の混合物の111−15.0 、0.15モル/リッI
・ル耐酸プトリウム溶液1meをチューブに加えた。3
0分間のインキュベーション後、2モル/リットル硫酸
溶液1#li!を加えて反応を停止さゼた。
(7) 測定
ポリスチレンチューブ内のこのJ、うにして得られた溶
液の吸収を、492nIIlの波長で光度計により測定
した。
液の吸収を、492nIIlの波長で光度計により測定
した。
B:結果
慢性++13V感染患者の血清試料及びヒト対照1銅清
試料を用いた、上記の方法による各希釈度に於()る吸
収測定の結果を第1表に示す。
試料を用いた、上記の方法による各希釈度に於()る吸
収測定の結果を第1表に示す。
ダニ1表
実施例2
肝炎の臨床的症状発現の前後に、臨床肝炎罹4.L’。
患者から血液試料を採取し、これ等の試別から血清がU
!jallされた。ミクロ滴定用プレートのつ■ルの内
面上に被覆された抗−HB5及び1]ツド上に被覆され
た抗−δを使用する系で前記+n+循を検査した。
!jallされた。ミクロ滴定用プレートのつ■ルの内
面上に被覆された抗−HB5及び1]ツド上に被覆され
た抗−δを使用する系で前記+n+循を検査した。
Δ:方法
(1) ポリスチレンミクロ滴定用プレートの被覆pH
9,0の重炭酸塩バッファ中で、抗−1−I B sを
HBSIIに対するヒト免疫グロブリンで室温。
9,0の重炭酸塩バッファ中で、抗−1−I B sを
HBSIIに対するヒト免疫グロブリンで室温。
24時間インキコベートし、続いてl’1l17.2の
0,15モル/リットル燐酸塩バッファで洗浄して、ポ
リスチレンミクロ滴定板用プレートのつ1ルの内面を抗
−ト113s、で被覆した。
0,15モル/リットル燐酸塩バッファで洗浄して、ポ
リスチレンミクロ滴定板用プレートのつ1ルの内面を抗
−ト113s、で被覆した。
■ ポリスチレンロッドの被覆
ミクロ滴定用プレートのウェルに嵌合り°るような寸法
のポリスチレン[Iラドを、(1)と同様にしててδ〜
八へに対する免疫グロブリンで被覆した1゜(3) 抗
−δの西洋ワサビペルオキシダーゼとのカップリング この抱合体を実施例1の八〇に記載の方v1で調製した
。
のポリスチレン[Iラドを、(1)と同様にしててδ〜
八へに対する免疫グロブリンで被覆した1゜(3) 抗
−δの西洋ワサビペルオキシダーゼとのカップリング この抱合体を実施例1の八〇に記載の方v1で調製した
。
(4) ミク[1滴定用プレートの被検面精とのインキ
ュベーション 被検白酒0.1−をミクロ滴定プレー1〜のつTルにピ
ペットで注入し、37℃で1時間インキュベートした。
ュベーション 被検白酒0.1−をミクロ滴定プレー1〜のつTルにピ
ペットで注入し、37℃で1時間インキュベートした。
その後ウェルを吸引し、pl−17,2のtAMバッフ
ァ0.3meで5回洗浄した。
ァ0.3meで5回洗浄した。
6) 界面活性剤によるインキュベーションソノ後、N
onidet −P −403o/リツトルのpH7
,2+燐酸塩バッファ溶液0.1m1jを各つ、1ルに
尋人し、次いで■で得られた抗−δぐ被覆されたポリス
チレンロッドを各ウェルに浸漬させた。
onidet −P −403o/リツトルのpH7
,2+燐酸塩バッファ溶液0.1m1jを各つ、1ルに
尋人し、次いで■で得られた抗−δぐ被覆されたポリス
チレンロッドを各ウェルに浸漬させた。
37℃、1時間のインキュベーション後、ロッドを液か
ら取り出し、11H7,2の燐酸塩バッファ中に連続的
に5回「1ツドを浸漬して洗浄した。各浸漬毎に新しい
バッファが用いられた。
ら取り出し、11H7,2の燐酸塩バッファ中に連続的
に5回「1ツドを浸漬して洗浄した。各浸漬毎に新しい
バッファが用いられた。
〈6) 抗−δ−LI RP抱合体によるインキュベー
ション このように処理されたポリスチレンロッドを(3)で1
qられた抱合体の溶液に逐次浸漬し、37℃、1時間の
インキュベート後0と同様にして洗浄した。
ション このように処理されたポリスチレンロッドを(3)で1
qられた抱合体の溶液に逐次浸漬し、37℃、1時間の
インキュベート後0と同様にして洗浄した。
<7) HRPにり・1する基質によるインキュベーシ
ョン その後、これ等の1]ツドをミクロ滴定用プレー1への
ウールに配置したが、該ウェルには0.4m(1/dの
Aルトー7Tニレンジアミンと0.4mD/lneのr
′jA免過酸化物との混合物のpHs、、o、バッファ
/溶液0.2dが含有されていた。30分間インキュベ
ー1〜した後、[]ツドを取出し、2モル/リットル硫
酸0.1mQをつ■ル内液体に添加した。
ョン その後、これ等の1]ツドをミクロ滴定用プレー1への
ウールに配置したが、該ウェルには0.4m(1/dの
Aルトー7Tニレンジアミンと0.4mD/lneのr
′jA免過酸化物との混合物のpHs、、o、バッファ
/溶液0.2dが含有されていた。30分間インキュベ
ー1〜した後、[]ツドを取出し、2モル/リットル硫
酸0.1mQをつ■ル内液体に添加した。
(0) 測定
これ等Q溶液の吸収を492nlllの波長(A 49
2)ぐ光度E1により測定した。
2)ぐ光度E1により測定した。
B:結果
δ感染が種々の段階にある患者の自消の吸収を、上記方
法により検査し、その結果を第2表にまとめIC6 実施例3 20人の健庫人及び12人の慢性)IBV患者(6人の
急性肝炎患者を含む)の血清を対象として、1−I83
A(1,目Be Ao、Dane #子、及びδ−八へ
の有無を調べた。トIBV患者の場合、生検により得ら
れた肝細胞についでもδ−八へのイj無を調べた。
法により検査し、その結果を第2表にまとめIC6 実施例3 20人の健庫人及び12人の慢性)IBV患者(6人の
急性肝炎患者を含む)の血清を対象として、1−I83
A(1,目Be Ao、Dane #子、及びδ−八へ
の有無を調べた。トIBV患者の場合、生検により得ら
れた肝細胞についでもδ−八へのイj無を調べた。
A:方法
(1)肝生検試お1中のデルタ抗原決定生検して得た肝
細胞中のδ−八への存在が、R1ZZettoらの方F
)i (Gllj、 1977.18.99710+1
3)に従って免疫螢光により明らかにされた。
細胞中のδ−八への存在が、R1ZZettoらの方F
)i (Gllj、 1977.18.99710+1
3)に従って免疫螢光により明らかにされた。
■ 血清中のHB Sへ〇検出
血清中のHBSA(l検出には、G、 WOltOrら
によるELISA法(J 、 C,in、 P ath
ol、、1976゜岨、873−879)が用いられた
。
によるELISA法(J 、 C,in、 P ath
ol、、1976゜岨、873−879)が用いられた
。
(3) ttn th中のIIBeA!7検出而情中の
l−I B eΔ9をM、 van de Waart
らによるELISA法(J 、 Med、V 1ro1
..19794゜43−49 )を用いて測定した。
l−I B eΔ9をM、 van de Waart
らによるELISA法(J 、 Med、V 1ro1
..19794゜43−49 )を用いて測定した。
(4) 血清中のD ane粒子
1) ane粒子の検出は、電子顕微鏡を用いて血清を
調べた。
調べた。
6) 血清中のδ−八へ検出
血清中のδ−八へは実施例2に記載の方法により検査さ
れた。
れた。
(以下余白)
B:結果
被検白酒の種々の測定結果を第3表にまとめる。
これ等の結果から、本発明による血清中のδ−Agに対
するテストは、ヒト血M(ft白。
するテストは、ヒト血M(ft白。
HBe AQ 、Dane粒子中にみられるI−I B
cΔ0゜又は[)ane粒子自体と反応Uず、又HB
sAgども反応しないことが知見された。血清中のδ−
Aoに対Jるテストでは、急性肝炎患者は錫↑ノF示し
、肝細胞中にδ−A(Jが検出された。
cΔ0゜又は[)ane粒子自体と反応Uず、又HB
sAgども反応しないことが知見された。血清中のδ−
Aoに対Jるテストでは、急性肝炎患者は錫↑ノF示し
、肝細胞中にδ−A(Jが検出された。
第3表
1−1[3V患者の血清中δ−A!+及び対照血清中δ
−A(1実施例4 テスiヘキット 実施例1によるδ−八へ決定に用いられるデスト4ツi
−は、次の成分からなるニ ー西洋ワυどペルオキシダーゼで標識された、δ−Ao
に対するヒト免疫グロブリンの凍結乾無品を入れたアン
プル; 一アルミニウムラミネートにパッケージされ、δ−Ai
l及び1iBsAoに対する免疫グロブリンで内側を被
覆されたポリスチレンデユープ;−l1l−17,2の
燐酸塩バッファを含有するびんニーN onidet
−p −40の溶液を含有するびん;−Aルトーフlニ
レンジアミンを含有する発泡性錠剤を入れたびん; −ブリスターストリップ中の過酸化尿素錠剤ニー酢酸ナ
トリウムバッファ; 一δ−へ〇陰性対照血消を入れたフラスコニーδ−Δg
陽性対照白酒を入れたフラスコニーテスト実施のための
使用説明書。
−A(1実施例4 テスiヘキット 実施例1によるδ−八へ決定に用いられるデスト4ツi
−は、次の成分からなるニ ー西洋ワυどペルオキシダーゼで標識された、δ−Ao
に対するヒト免疫グロブリンの凍結乾無品を入れたアン
プル; 一アルミニウムラミネートにパッケージされ、δ−Ai
l及び1iBsAoに対する免疫グロブリンで内側を被
覆されたポリスチレンデユープ;−l1l−17,2の
燐酸塩バッファを含有するびんニーN onidet
−p −40の溶液を含有するびん;−Aルトーフlニ
レンジアミンを含有する発泡性錠剤を入れたびん; −ブリスターストリップ中の過酸化尿素錠剤ニー酢酸ナ
トリウムバッファ; 一δ−へ〇陰性対照血消を入れたフラスコニーδ−Δg
陽性対照白酒を入れたフラスコニーテスト実施のための
使用説明書。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1) 体液試料中のB型肝炎に係るデルタ抗原の定性
的及び/又は定量的な検出方法であって、被検試料をキ
ャリアに結合されたB型肝炎表面抗原に対する免疫グロ
ブリンと共にインキュベートし、その後液相から固相を
分離し、界面活性剤とデルタ抗原【こ対する免疫グロブ
リンとの存在下で同相をインキュベートし、次いでデル
タ抗原に対Jる免疫グロブリンと前記抗原との結合を調
べ、該結合から試第31中のデルタ抗原の存在を定性的
/及び又は定量的に測定する方法。 (2) デルタ抗原に対する免疫グロブリンとのインキ
ュベーションを、キャリアに結合された免疫グロブリン
及び標識試薬に結合された免疫グロブリンを用いて実施
され、そしてその後デルタ抗原に対する免疫グロブリン
と該抗原との結合を、キャリアに結合された前記デルタ
抗原に対する免疫グロブリンと標識試薬との結合を調べ
ることによって測定することを特徴とする特許請求の範
囲第1項に記載の方法。 (3113型肝炎表面抗原に対でる、及びデルタ抗原に
対する免疫グロブリンを帯同的に結合するキャリアが使
用されることを特徴とする特許請求の範囲第2項に記載
の方法。 (4) 酵素が標識試薬として用いられることを特徴と
する特許請求の範囲第2項又は第3項に記載の方法。 (5) デルタ抗原に対する免疫グロブリンによるイン
キュベーションが粒子に結合された免疫グロブリンにJ
:り実施されることを特徴とする特h1請求の範囲第1
項に記載の方法。 (6) 粒子として、赤血球、ラテックス粒子。 染料ゾル又は金属ゾルが用いられることを特徴とする特
許請求の範囲第5項に記載の方法。 (1) 表面活性剤が非イオン性表面活性剤であること
を特徴とする特許請求の範囲第1項乃至第6項のいずれ
かに記載の方法。 (8) 非イオン性界面活性剤がポリAギシエチレン銹
η体であることを特徴とする特許請求の範囲第7項に記
載の方法。 (9) 特許請求の範囲第1項に記載の方法を実施する
ためのテストキットであって、該キットが歩容くども、 一キレリアに結合された、B型肝炎表面抗原に対する免
疫グロブリンと、 一デルタ抗原に対1゛る免疫グロブリンと、からなるこ
とを特徴とするテストキット。 (10) テストキットは少な(とも、−B型肝炎表面
抗原に対する、及びデルタ抗原に対する免疫グ1]プリ
ンが結合されるキ髪・リアと、−標識試薬に結合された
、デルタ抗原に対する免疫グロブリンと、 からなることを特徴とする特許請求の範囲第91nに記
載のテストキット。 (11) テストキットは少なくとも、−第1のキャリ
アに結合された、B型肝炎表面抗原に対する免疫グロブ
リンど、 一第2のキャリアに結合された、デルタ抗原に対する免
疫グロブリンと、 一標識試薬に結合された、デルタ抗原に対する免疫グロ
ブリンと、 からなることを特徴とする特5′F請求の範囲第9項に
記載のテストキット。 (12) 標識試薬として酵素を含有することを特徴と
する特許請求の範囲第10項または第11項に記載のデ
ス1ヘキツト。 (13) 酵素に対リ−る基質を更に含有することを特
徴とする特許請求の範囲第12項に記載のテスト−1ツ
1〜。 (14) テストキットは少なくとも、−キャリアに結
合された、B型肝炎表面抗原に対する免疫グ[1プリン
と、 一粒子に結合された、デルタ抗原に対する免疫グ[1プ
リンと、 からなることを特徴とする特許請求の範囲第9項に記載
のテストキット。 (15) 粒子として、赤血球、ラテックス粒子。 染料ゾル、又は金属ゾルを含有することを特徴とする特
許請求の範囲第14項に記載のテストキット。 (16) テストキットは更に界面活性剤を含むことを
特徴とする特許請求の範囲第9項乃至第15項のいずれ
かに記載のテストキット。 (11) 主1/リアと、該キャリアに結合した、デル
タ抗原に対する及びB型肝炎表面抗原に対する免疫グロ
ブリンとを含む免疫化学テスト試薬。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NL8302038 | 1983-06-08 | ||
NL8302038 | 1983-06-08 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6024451A true JPS6024451A (ja) | 1985-02-07 |
Family
ID=19841974
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP11635284A Pending JPS6024451A (ja) | 1983-06-08 | 1984-06-06 | 体液中のデルタ抗原決定 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0131974A1 (ja) |
JP (1) | JPS6024451A (ja) |
DK (1) | DK283484A (ja) |
FI (1) | FI842276A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000007023A1 (fr) * | 1998-07-30 | 2000-02-10 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Procede pour la determination de l'hepatite a virus de type c |
US6623921B2 (en) | 1998-07-30 | 2003-09-23 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Method for measurement of hepatitis C virus |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL192267C (nl) * | 1984-07-31 | 1997-04-03 | Tno | Deoxyribonucleïnezuur, micro-organisme, diagnostisch hulpmiddel voor het vaststellen van HDV infectie en gebruik daarvan. |
EP0213653B1 (en) * | 1985-08-19 | 1989-11-15 | Akzo N.V. | Device for the carrying out of an immunochemical determination |
DE3788902T3 (de) * | 1986-06-17 | 2004-11-25 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Hepatitis-Delta-Diagnostika und Impfstoffe, ihre Herstellung und Verwendung. |
CA2267207C (en) * | 1997-08-04 | 2008-10-28 | Tonen Corporation | Methods for detecting or assaying virus |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ZA741802B (en) * | 1973-04-23 | 1975-02-26 | Abbott Lab | Hepatitis b virus detection by the reversed passive hemagglutination method |
CA1148859A (en) * | 1979-06-14 | 1983-06-28 | Lacy R. Overby | Simultaneous assay of two hepatitis viruses using a solid phase |
US4305924A (en) * | 1979-08-08 | 1981-12-15 | Ventrex Laboratories, Inc. | Method and apparatus for performing in vitro clinical diagnostic tests using a solid phase assay system |
DE3116882A1 (de) * | 1980-06-27 | 1982-01-21 | Univ Georgetown | Stabile form des zur hepatitis b gehoerenden delta-antigens und verfahren zu seiner isolierung |
-
1984
- 1984-05-25 EP EP84200762A patent/EP0131974A1/en not_active Withdrawn
- 1984-06-06 JP JP11635284A patent/JPS6024451A/ja active Pending
- 1984-06-06 FI FI842276A patent/FI842276A/fi not_active Application Discontinuation
- 1984-06-08 DK DK283484A patent/DK283484A/da not_active Application Discontinuation
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000007023A1 (fr) * | 1998-07-30 | 2000-02-10 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Procede pour la determination de l'hepatite a virus de type c |
US6623921B2 (en) | 1998-07-30 | 2003-09-23 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Method for measurement of hepatitis C virus |
US7316905B1 (en) | 1998-07-30 | 2008-01-08 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Method for measurement of hepatitis C virus |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK283484D0 (da) | 1984-06-08 |
FI842276A0 (fi) | 1984-06-06 |
FI842276A (fi) | 1984-12-09 |
DK283484A (da) | 1984-12-09 |
EP0131974A1 (en) | 1985-01-23 |
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