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STABILE FORM DES ZUR HEPATITIS B
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GEHÖRENDEN DELTA-ANTIGENS UND VER-FAHREN ZU SEINER ISOLIERUNG
Die
Erfindung betrifft eine stabile Form des zur Hepatitis B gehörenden Delta-Antigens,
ein Verfahren zu dessen Isolierung, seine Verwendung zum Nachweis des korrespondierenden
Åntikörpers und zur Diagnose der damit verbundenen Krankheit.
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Das zur Hepatitis B gehörende Delta-Antigen und sein zugehöriger Antikörper
sind reaktive Substanzen, welche in Trägern von Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg)
nachgewiesen wurden, vgl.
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M. Rizzetto et al., Immunofluorescence Detection of a New Antigen-Antibody
System (6/anti-8) Associated With the Hepatitis B Virus In the Liver and In the
Serum of HBsAg Carriers, Gut 18, Seiten 997 bis 1003 (1977).
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Die Analyse von infiziertem Leber-Gewebe durch Immunofluoreszenz zeigt,
daß das zum Hepatitis-B-Virus gehörende Delta-Antigen sich von den bekannten Hepatitis-B-Virus
(HBV)-Antigenen unterscheidet und sich im Hepatocyten-Kern befindet, wo es ein Färbemuster
zeigt, welches dem des Hepatitis-B-Coreantigens (HBcAg) ähnlich ist. Es wurden jedoch
keine Coreteilchen oder andere definierte Strukturen mittels Elektronenmikroskopie
in Delta-Antigen enthaltenden Hepatocyten beobachtet, vgl. M.G.Canese et al., An
Ultrastructural and Immunohistochemical Study on the 6 Antigen Associated to the
Hepatitis B Virus, J. Path, 128, Seiten 169 bis 176 (1979). Auch im Blut von HBsAg-Trägern,
in deren Leber das Antigen vorkommt, kann das Delta-Antigen nicht nachgewiesen werden.
Dies ist möglich aufgrund der Interferenz von Testverfahren für das Antigen durch
hohe Titer des korrespondierenden Antikörpers, welche in Trägersubjekten entwickelt
werden und mit dem Antigen eine Bindung eingehen (dieses inaktivieren). Aus diesem
Grunde war die weitere Charakterisierung des Delta-Antigens bislang begrenzt und
seine Zugänglichkeit als ein diagnostisches Mittel zur Untersuchung von HBV-infizierten
Individuen (durch in-vitro immunologische Tests für den korrespondierenden Antikörper)
existierte nicht.
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Untersuchungen des Vorkommens von Delta-Antigen und -Antikörper in
menschlichen Populationen und Obertragungsexperimente in Schimpansen zeigen an,
daß das Antigen mit einem übertragbaren pathogenen Agens verbunden ist, bei dem
es sich entweder um eine HBV-Mutante mit den Eigenschaften eines unvollständigen
interferierenden Teilchens oder um ein neues Mittel handelt, welches Hilfsfunktionen
der HBV benötigt zu seiner Entfaltung.
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Somit ist es sehr wünschenswert, daß eine stabile Form des Delta-Antigens
zugänglich ist, welche frei von störenden Substanzen als ein Diagnose-Mittel zur
Diagnose der Gegenwart des Pathogens (wie sie durch die Gegenwart des korrespondierenden
Antikörpers angezeigt wird) eingesetzt werden kann. Da das Antigen immer mit dem
HBV verbunden ist, liefert der Nachweis der Gegenwart des korrespondierenden Antikörpers
ebenfalls ein Mittel zur Diagnose der HBV-Infektion bei Menschen. Das ist von besonderer
Bedeutung, da Hinweise existieren, daß die Gegenwart des Delta-Antigens bei den
bekannten Verfahren zur Diagnose von HBV-Infektionen stören kann.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man leicht das Delta-Antigen
von Hepatocyten-Kernen von infizierten Lebern in einer stabilen Form isolieren,
die zum Nachweis des korrespondierenden Antikörpers brauchbar und somit zur Diagnose
der damit verbundenen Krankheit geeignet ist.
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Die Erfindung betrifft das zum Hepatitis-B-Virus gehörende Delta-Antigen
in einer stabilen Form ohne störendes Begleitmaterial und verbundenes Leber-Gewebe,
das den korrespondierenden Antikörper binden kann. Die gereinigte, isolierte und
stabile Form des Antigens ist für Testverfahren zur Diagnose von Hepatitis-B-Virusinfektionen
und Krankheiten, die mit der Gegenwart des Delta-Antigens zusammenhängen, geeignet.
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Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Isolierung und Stabilisierung
des zur Hepatitis B gehörenden Delta-Antigens, welches üblicherweise in den entsprechenden,
durch Viren infizierten Leber-Geweben von Menschen und Schimpansen gefunden wird.
Das Verfahren umfaßt das Zerreißen der Kernmembran der das Antigen enthaltenden
Leberkerne, Dissoziieren des Antigens aus seinem Verbund mit dem Antikörper und
beliebigen störenden Materialien und Isolierung des abgetrennten Delta-Antigens
in stabiler Form.
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Der Begriff "störendes Material", wie er in der Beschreibung und in
den Ansprüchen verwendet wird, bedeutet ein Material, das sich chemisch oder physikalisch
mit dem Antigen verbindet und dadurch die Fähiykeit des Antigens, mit dem Antikörper
zu reagieren, durch Blockierung epitopischer Bereiche des Antigens inaktiviert.
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Figu-r 1 ist eine graphische Darstellung der isopyknischen Bandenbildung
von Delta-Antigen in einem Cäsiumchlorid-Gradienten.
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Figur 2 ist eine graphische Darstellung der Auftrennung in Zonen durch
unterschiedliche Geschwindigkeiten von Delta-Antigen in verschiedenen Rohrzucker-Dichtegradienten.
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Figur 3 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse der Gelfiltration
von Delta-Antigen und zeigt dessen Molekulargewicht.
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Figur 4 ist eine graphische Darstellung einer Titrationskurve auf
der Basis mehrfacher Verdünnungen des Delta-Antigens.
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Das immunologische System Delta-Antigen/Antikörper gehört zur Hepatitis
vom Typ B bei Menschen. Zur Zeit ist die menschliche
Leber, welche
Delta-Antigen enthält, die einzige praktische Quelle für das Antigen. Die Isolierung
des Delta-Antigens aus der Leber wird durch Gegenwart von Antikörpern in den Seren
der infizierten Patienten kompliziert, da der Antikörper sich sofort mit dem Antigen
verbindet und das Delta-Antigen für eine weitere Bindung zu einem von außerhalb
der Leberquelle stammenden Antikörper inaktiviert. Zusätzlich bildet das Delta-Antigen
ein Aggregat mit gleichen Teilchen (mit sich selbst) und mit bestimmten störenden
Materialien, welche in Leber-Geweben vorhanden sind. Dadurch wird die Fähigkeit
des Antigens, mit einem von außen stammenden Antikörper zu reagieren inaktiviert
und entfernt. Aus allen diesen Gründen waren stabile Formen des Delta-Antigens,
die für den Nachweis des verwandten Antikörpers durch Reaktion damit geeignet sind,
vor dem Zeitpunkt der Anmeldung nicht zugänglich.
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Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die Extraktion des Delta-Antigens
aus Delta-Antigen enthaltenden Lebern in einer stabilen, konzentrierten Form, die
als ein diagnostisches Mittel zum Nachweis des zugehörigen Antikörpers und der damit
verbundenen Krankheit geeignet ist, zur Verfügung gestellt.
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Das Lebermaterial, welches das Delta-Antigen enthält, kann zur Extraktion
des Antigens vorbereitet werden, indem zunächst das Gewebe unter Anwendung einer
herkömmlichen Homogenisierungs-Vorrichtung zu einer homogenen Masse zerkleinert
wird. Aus dieser homogenen Masse kann das Delta-Antigen nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren extrahiert werden. Alternativ dazu kann das Homogenisat zuerst zentrifugiert
werden, um die Hepatocyt-Kerne von dem Rückstand an Leber-Gewebe und Cytoplasma-Bestandteilen
abzutrennen und das gewünschte Antigen von den abgetrennten Kernen extrahiert werden.
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In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens werden das
homogenisierte Leber-Gewebe oder die abgetrennten Hepatocyten-Kerne behandelt, um
die Kernmembran zu zerreißen. Das Zerreißen der Membran kann in herkömmlicher Weise
ausgeführt werden durch eine beliebige herkömmliche Technik, wie beispielsweise
durch Einwirkung von Ultraschall auf die Kerne. Die Analyse der Kerne oder des Lebergewebe-Gemisches,
welches im Anschluß an die Behandlung mit Ultraschall erhalten wird (durch die Technik
der Radioimmuno-Analyse [RIA]) zeigt eine damit im Einklang stehende rasche Abnahme
der Aktivität von Delta-Antigen. Das bedeutet ein rasches Verschwinden jeglicher
bedeutsamen Menge des Antigens, welches mit dem zugehörigen Antikörper reagiert
oder ihn bindet. Der rasche Verlust an Delta-Antigen-Aktivität in der mit Ultraschall
behandelten Kernfraktion ist auf die Gegenwart eines Rückstandes von Antikörpern
in der mit Ultraschall behandelten Präparation zurückzuführen, welcher sich mit
dem Antigen verbindet und dessen epitopische Bereiche inaktiviert. Das Delta-Antigen
kann sich selbst zu Aggregaten zusammenballen und auch Aggregate mit störenden Materialien,
die in dem mit Ultraschall behandelten Gemisch vorhanden sind, bilden.
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Eine Vielzahl an physikalischen und chemischen Behandlungen wurde
bislang in erfolglosen Versuchen zur Disaggregation oder Dissoziation des Antigen/Antikörper-Komplexes
in den mit Ultraschall behandelten Gemischen und zur Stabilisierung des Antigens
in einer verwendbaren Form eingesetzt. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen, Behandlung
mit hohen Konzentrationen von Salzen und Behandlung mit Detergentien zeigten geringen
oder keinen bedeutsamen Effekt zur Stabilisierung des Delta-Antigens.
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Ultraschall-Behandlung führt zur Dissoziation der Delta-Antigen-Aggregate,
jedoch nur für sehr kurze Zeitabschnitte.
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Nach dem.erfindungsgemäßen Verfahren werden bestimmte Dissoziations-Mittel
eingesetzt, welche das Delta-Antigen vom Antikörper und störenden Begleitmaterialien
freisetzen und es für einen hinreichend langen Zeitabschnitt stabilisieren, so daß
eine stabile, konzentrierte Form des gewünschten Antigens erhalten wird. Die Dissoziations-Mittel
können während oder nach der Behandlung mit Ultraschall eingesetzt werden.
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Die erfindungsgemäß verwendeten Dissoziations-Mittel können als Denaturierungsmittel
für den mit dem Delta-Antigen verwandten Antikörper definiert werden. Diese Denaturierungsmittel
dienen ebenso der Blockierung der Bindung des Antigens mit sich selbst oder mit
störenden Materialien.
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Beispiele für Dissoziations-Mittel sind Harnstoff, Mercaptoäthanol
(ME), Guanidinhydrochlorid (GuHCl) und deren Gemische.
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Die Dissoziations-Mittel , insbesondere Harnstoff und Guanidin-HC1,
erhöhen deutlich die Delta-Antigen-Aktivität (3000- bis 40 000-fach) in dem durch
Behandlung mit Ultraschall des Kernmaterials erhaltenen Gemisch, indem die Aggregate
und Komplexe des Delta-Antigens und seines Antikörpers aufgebrochen werden.
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Der Dissoziations-Schritt kann durch Vermischen des zerstörte Kerne
enthaltenden Gemisches mit dem Dissoziations-Mittel durchgeführt werden. Die Konzentration
des verwendeten Dissoziations-Mittels kann derart gewählt werden, daß die Konzentration
in dem erhaltenen Gemisch im Bereich von etwa 2 M bis etwa zur Sättigung, vorzugsweise
im Bereich von etwa 4 M bis etwa 7 M und höchst bevorzugt bei etwa 6 M liegt. Bei
Konzentrationen im Reaktionsgemisch unterhalb von etwa 2 M zeigt das Mittel keinen
wesentlichen Effekt bezüglich der Disaggregation von Delta-Antigen oder dessen Blockierung
gegenüber einer Bindung mit dem Antikörper.
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Im'Anschluß an die Dissoziation oder Behandlung mit dem Dissoziations-Mittel
aggregiert das Antigen erneut oder bildet mit dem zugehörigen Antikörper einen Komplex,
sofern es nicht rasch, d.h. innerhalb von etwa 30 Minuten, von der Gegenwart des
Dissoziations-Mittels befreit wird.
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Somit wird das gewünschte Delta-Antigen im Anschluß an die Dissoziation
vorteilhaft von dem Dissoziations-Reaktionsgemisch so schnell wie möglich abgetrennt,
vorzugsweise innerhalb von 30 Minuten. Die Abtrennung der freien, stabilen Form
des Delta-Antigens aus dem das Dissoziations-Mittel enthaltenden Gemisch kann durch
Verdünnung des das Dissoziations-Mittel enthaltenden Gemisches in hinreichendem
Maße, um die Konzentration des Mittels auf unterhalb von etwa 2 M abzusenken, bequem
erreicht werden. Das verdünnte Mittel kann sodann aus dem verdünnten Gemisch durch
beliebige herkömmliche Mittel vollständig entfernt werden, wie beispielsweise durch
Dialyse und ähnliche Techniken.
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Die rasche Entfernung des Dissoziations-Mittels aus dem durch Dissoziations-Behandlung
erhaltenen Gemisch führt zu einer Form des Delta-Antigens, welche bei Lagerung bei
Temperaturen von etwa -70°C für über ein Jahr lang stabil bleibt.
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Eine Charakterisierung des Delta-Antigens in seiner stabilen Form
kann durch isopyknische Bandenbildung in Cäsiumchlorid, Gelfiltration, Zonenwanderungsgeschwindigkeits-Techniken
und durch die Wirkungen verschiedener chemischer und enzymatischer Reaktionen erhalten
werden. Im allgemeinen ist das Antigen in seiner isolierten freien Form stabil gegenüber
mäßiger Hitze, Einwirkung von Säure und Abbau-Versuchen mit Nucleasen und Glycosidasen.
Das stabile Antigen wird durch Alkali und durch Digerieren mit proteolytischen Enzymen
inaktiviert. Das Delta-Antigen bildete bei 1,28 g/cm3 in Cäsiumchlorid eine Bande
und sedimentierte in Sucrose-Gradienten als ei-ne lösliche
Komponente
in Gegenwart von GuHCl. Gelfiltration in GuHCl zeigte ein ermitteltes Molekulargewicht
für das Delta-Antigen von 68 000. Somit ist das Delta-Antigen ein lösliches Protein
mit-einem Molekulargewicht von etwa 68 000 und seine Aktivität hängt nicht von Kohlenhydrat-Anteilen
ab.
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Die nachfolgenden Beispiele und Präparationen beschreiben die Art
und das Verfahren zur Herstellung und Verwendung des Gegenstandes der Erfindung.
Sie erläutern die seitens der Erfinder betrachteten Weise der Durchführung der Erfindung,
sollen diese jedoch nicht auf die Beispiele beschränken.
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Herstellung der Reagentien Die 22 nm große Teilchenform von HBsAg
wird aus Plasma eines chronischen HBsAg-Trägers gereinigt, wie in der Literaturstelle
J.L. Gerin, Biophysical Characterization of the adr Subtype of Hepatitis B Antigen
and Preparation of anti-r-Sera in Rabbits, J. Immunology, 115, Seiten 100 bis 105
(1975) beschrieben wurde.
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Ein Konzentrat von Dane-Partikeln wird durch Pelletierung des Serums
eines DNA-Polymerase-positiven Trägers durch ein Kissen von 20 % (Gewicht/Volumen)
Sucrose in einer phosphat-gepufferten Kochsalzlösung nach Dulbecco (0,85 % NaCl,
0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,4; im weiteren einfach als "PBS" bezeichnet) für 4 Stunden
bei 20 000 Upm hergestellt.
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Die HBcAg-Teilchen werden aus von HBcAg befallener menschlicher Leber
isoliert, wie in der Literaturschrift A.Budkowska et al, Immunochemistry and Polypeptide
Composition of Hepatitis B Core Antigen (HBcAg), J. Immunology, 118, Seiten 1300
bis 1305 (1977) beschrieben wurde.
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Das Vergleichs-Anti-BHs/ad (vom Schwein) wurde von der Research Resources
Branch, NIAID, NIH (Katalog Nr. V801-503-r58) erhalten.
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Das Standard-Delta-Antikörper-Serum wurde von einem 29 Jahre alten
männlichen HBsAg-Träger mit chronischert lange bestehender Hepatitis erhalten, dessen
Serum einen hohen Titer (1:1000) des Antikörpers (bestimmt nach der IFL-Methode),
einen niedrigen Titer (1:600) an Ati-HBc (bestimmt nach der SP-RIA-Methode) und
keine HBeAg-, Anti-HBs- oder Anti-HBe-Aktivität (bestimmt nach der SP-RIA-Methode)
enthielt.
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Die IgG-Fraktionen der Sera wurden durch DE-52-Chromatographie isoliert
und nach dem Chloramin-T-Verfahren von Hunter und Greenwood radiojodiert auf eine
spezifische Aktivität von annähernd 15 pCi/g; vgl. W.M.Hunter und F.C.Greenwood,
Preparation of Iodine-131 Labeled Human Growth Hormone of High Specific Activity,
Nature, 194, Seiten 495 bis 496 (1962).
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Proben HBsAg und Anti-HBs wurden mit handelsüblichen Radioimmunoproben
(Austria II und Ausab, Abbot Laboratories, N. Chicago, I.L.) und HBeAg und Anti-HBe
durch herkömmliche Immunodiffusion und Festphasen-Radioimmunotests (SP-RIA) bestimmt.
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Die Tests für polymerisiertes menschliches Serum-Albumin (Poly-HSA)
und Anti-Poly-HSA wurden nach dem Verfahren von B.G.Hansson und R.H.Purcell, Sites
That Bind Polymerized Albumin on Hepatitis B Surface Antigen Particles, Detection
by Radioimmunoassay, Infection and Immunity, 26, Seiten 125 bis 130 (1979) durchgeführt.
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Die Aktivitäten von HBcAg und Anti-HBc wurden nach dem Mikrotiter-SP-RIA-Ve=fahren
von Purcell et al., Radioimmunoassay for the Detection of the Core of the Dane Particle
and Antibody to it, Intervirology, 2, Seiten 231 bis 243 (1974) bestimmt.
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Eine Modifizierung des vorstehend erwähnten Verfahrens von Purcell
et al. wurde zur Entwicklung eines SP-RIA-Tests für Delta-Antigen verwendet. Das
modifizierte Verfahren wurden folgendermaßen durchgeführt: Polyvinyl-Mikrotiterplatten
(Cooke Laboratories, Inc., Alexandria, VA) wurden 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Jede Bohrung der Platten enthielt 75 ul einer 1:1000 Verdünnung eines Standard-Delta-Antikörperserums.
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Die beschichteten Bohrungen wurden mit PBS gewaschen und sodann mit
25 ul serieller zweifacher Verdünnungen von Delta-Antigen in PBS beschickt. Die
Beschickungen wurden bei 4"C inkubiert und 24 Stunden bei einer Temperatur von 4"C
gehalten. Am Ende dieser Zeit wurden die Bohrungen mit PBS gewaschen und in jede
Bohrung wurden 50 ul 125J-IgG, welche den Antikörper enthielten, dem Delta-Antigen
zugesetzt. Nach einer 4-stündigen Inkubation bei 37"C wurden die Platten gewaschen
und die einzelnen Bohrungen ausgeschnitten und bezüglich ihrer Radioaktivität untersucht.
Die Ergebnisse wurden als Zählvorgang pro Minute (cpm) angegeben.
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Herstellung 1 Quelle von Delta-Antigen Das Delta-Antigen wurde aus
der durch Autopsie erhaltenen Leber eines 42 Jahre alten HBsAg-Trägers, der an Magenblutungen
(Hämatemesis) starb, isoliert. Aus dem rechten und linken Lappen herausgeschnittene
Blöcke wurden zerschnitten und hinsichtlich des Delta-Antigens untersucht, wobei
HBcAg und HBsAg durch direkte
Immunofl uores zenz (IFL) unter Verwendung
der oben beschriebenen Methode von Rizzetto et al. untersucht oder in Glutaraldehyd
fixiert und nach Kern-Coreteilchen durch Elektronenmikroskopie (EM) unter Verwendung
der vorstehend beschriebenen Methode von Canese et al. untersucht wurden. Ein großer
Anteil der Hepatocyten-Kerne war positiv in Bezug auf das Delta-Antigen nach der
IFL-Methode, jedoch negativ hinsichtlich der HBcAg-Teilchen nach dem IFL- und EM-Verfahren;
Spuren von cytoplasmatischem HBsAg wurden durch IFL beobachtet. Die Leber wurde
in 50 g schwere Stücke zerteilt und in gefrorenem Zustand bei -70°C gelagert.
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Herstellung 2 Isolierung von Kernen aus der Leber Aus der vorstehend
beschriebenen Herstellung 1 erhaltene Leberteilchen (50 g) wurden aufgetaut, mit
einer Schere zerteilt und mit einer kalten phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (-PBS)
nach Dulbecco gewaschen. Das zerkleinerte Gewebe wurde in 0,5 M Sucrose in TKM (2
mM MgC12, 25 mM KC1 und 5 mM Tris-(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl),
pH 7,4) suspendiert und ein 10 %-iges (Gewicht/Volumen) Homogenisat wurde unter
Verwendung eines Omnimixers nach Sorvall und eines Homogenisators mit einem lose
angepaßten Pistill nach Dounce hergestellt. Nach dem Filtrieren durch Mull und Organze
wurde das Homogenisat bei 3000 Upm für 5 Minuten zentrifugiert und das Pellet in
2,2 M Sucrose in TKM-Puffer erneut suspendiert.
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45-minütiges Zentrifugieren bei 17 000 x g ergab ein Kern-Pellet und
eine dicke Schicht von Cytoplasma-Teilchen, zerbrochenen Kernen und unzerbrochenen
Zellen im oberen Teil der Sucrose.
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Das Kern-Pellet wurde 2mal in 0,25 M Sucrose in TKM-Puffer gewaschen
und in PBS (Kerne aus 10 g Leber pro ml PBS) resuspendiert. Die direkte IFL eines
Ausstrichs der Kernpräparation nach Fixierung mit Ether (5 Minuten bei Raumtemperatur
)
und Verwendung des FITC-konjugierten Anti-Delta-Antigen-IgG offenbarte, daß etwa
25 % der Kerne die Delta-Antigen-Aktiasität aufwiesen.
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Beispiel 1 Die Kernpräparation nach der oben beschriebenen Präparation
2 wird 3 Minuten mit Ultraschall in einer Ultraschallbad-Vorrichtung nach Zusatz
einer hinreichenden Menge GuHCl behandelt, um ein 6 M-Gemisch bezüglich der GuHCl
herzustellen. Die mit Ultraschall behandelte Kernfraktion wird sodann auf 30 mg/ml
Protein eingestellt (Verfahren nach O.H.Lowry et al., Protein Measurement with the
Folin Phenol Reagent, J. of Biol. Chem., 193, Seiten 265 bis 275 (1951)).
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Die mit Ultraschall behandelte und eingestellte Kernfraktion wird
sodann mit einer hinreichenden Menge PBS verdünnt, um eine 1,2 M GuHCl-Mischung
zu erhalten. Das erhaltene verdünnte Gemisch wird sodann für 4 Stunden bei Raumtemperatur
stehengelassen und nachfolgend 24 Stunden gegen PBS dialysiert, um GuHCl zu entfernen.
Während der Dialyse bildet sich ein Niederschlag, der durch Zentrifugieren mit niedriger
Geschwindigkeit abgetrennt, 4 Stunden mit 3 M GuHCl reextrahiert und gegen PBS dialysiert
wird. Nach der Klärung wird die überstehende Flüssigkeit zusammen mit derjenigen
der ursprünglichen Dialyse gesammelt und durch Dialyse gegen Polyäthylenglykol (PEG,
Molekulargewicht 20 000) konzentriert, um Wasser zu entfernen. Das Konzentrat enthält
Delta-Antigen in einer stabilen, konzentrierten Form, die bei Lagerungstemperaturen
von etwa -70QC für 1 Jahr stabil ist.
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Beispiel 2 Charakterisierung des Delta-Antigens Es wurde eine Titrationskurve
durch Reihenverdünnung des in Beispiel 1 hergestellten Konzentrats von Delta-Antigen
mit PBS hergestellt Die verdünnten Fraktionen wurden einer Mikrotiter-Radioimmunobestilnnlung
unterworfen und die Ergebnisse graphisch aufgetragen (vgl. Figur 4 der anliegenden
Darstellungen). Eine Verdünnung, welche 5000 Impulse pro Minute im linearen Bereich
der Verdünnungskurve lieferte, wurde wie nachstehend beschrieben zur weiteren Charakterisierung
des Delta-Antigens verwendet.
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Die ausgewählte Verdünnung wurde in einige aliquote Teile geteilt
und jeder aliquote Teil wurde nachfolgend einer Behandlung oder Einwirkung durch
einige verschiedene Chemikalien und Enzyme unterworfen. Im einzelnen wurden Detergentien
(Natriumdeoxycholat, Nonidet P-40 und Tween 80) jeweils getrennt zugegeben zu einer
vorgegebenen Standardmenge eines vorstehend beschriebenen aliquoten Teils bis zu
einer endgültigen Konzentration von 0,5 % des Detergens. Getrennt davon wurde Natriumäthylendiamintetraacetat
einem aliquoten Teil zugesetzt zu einer Endkonzentration von 2 mM. Im Anschluß an
diese Zugaben wurden die Gemische hinsichtlich ihrer Aktivität an Delta-Antigen
untersucht. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I dargestellt.
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Getrennt davon wurden aliquote Teile der Delta-Antigen-Verdünnungen
auf Werte von 3 M und 6 M bezüglich Guanidin-HCl und 5 M bezüglich Natriumthiocyanat
eingestellt. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Präparationen
gegen PBS dialysiert und hinsichtlich ihrer Aktivität an DeTta-Antigen untersucht.
Die Ergebnisse sind ebenfalls in der nachfolgenden Tabelle I dargestellt.
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Ebenfalls getrennt davon wurden aliquote Teile der konzentrierten
Lösungen des Delta-Antigens 30 Minuten entweder mit 0,2 M Glycin-HCl (pH 2,4) oder
Glycin-NaOH (pH 10,6) und nachfolgender Zugabe von 1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) behandelt
und dann auf Delta-Antigen untersucht. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden
Tabelle I angegeben.
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Die Ather-Stabilität des Delta-Antigens wurde ermittelt durch Zugabe
eines gleichen Volumens ether zu einem mit (Z)-Sorbitanmono-9-octadecenoat-poly-(oxy-1
,2-äthandiyl (Tween 80)-behandelten (0,5 %) aliquoten Teil des verdünnten Delta-Antigen-Konzentrats,
das vorstehend beschrieben wurde. Das erhaltene Gemisch wurde 30 Minuten bei 6000
Upm zentrifugiert. Der zurückbleibende Ather wurde aus der wäßrigen Phase entfernt,
indem Stickstoffgas durch die Probe vor der Untersuchung mittels der modifizierten
SP-RIA-Methode durchgeleitet wurde. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle
I dargestellt.
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Aliquote Teile des im vorstehenden Beispiel 1 erhaltenen verdünnten
Konzentrats wurden ebenfalls Abbauversuchen mit einer Vielfalt von Enzymen ausgesetzt.
Im einzelnen wurde das verdünnte Delta-Antigen mit 1 % RNase (Mann Research Laboratories)
und 1 % DNase (Worthington) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,3) für 1 Stunde bei 37"C
behandelt. Zu dem Reaktionsgemisch der DNase I wurde Mg12 zu einer Endkonzentration
von 50 mM zugesetzt und die Reaktion wurde mit Na EDTA (50 mM) beendet.
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Digerieren mit 0,1 % Trypsin (Worthington), 0,1 % Chymotrypsin (Worthington)
oder 0,1 % Pronase (Calbiochem) wurde in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8) für 1 Stunde
bei 37"C durchgeführt. Die Trypsin-Reaktion wurde beendet durch Zugabe einer gleichen
Gewichtsmenge an Sojabohnen-Inhibitor (Worthington) und die Chymotrypsin- und Pronase-Reaktionen
wurden durch Kochen der Probe für 15 Minuten beendet. Der Abbau der Delta-Antigen-
Präparation
mit 0,5 » D.pneumoniae-Glycosidasen wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,4) für 1
Stunde bei 370C durchgeführt und ein gleiches Volumen von 0,3 M Phosphatpuffer (pH
7,4) wurde am Ende der Inkubationsperiode zugesetzt. Die Ergebnisse sind in der
nachfolgenden Tabelle I dargestellt.
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TABELLE 1 Wirkung der chemischen und enzymatischen Behandlung auf
die Aktivität von Delta-Antigen Behandlungsmittel Aktivitäts-Verlust * Na EDTA,
2 mM 0 Na Deoxycholat, 0,5 % 0 Nonidet P-40, 0,5 % 0 Tween 80, 0,5 % 0 äther 0 Glycin-HCl,
0,2 M, pH 2,4 0 Glycin-NaOH, 0,2 M, pH 10,6 65 Na-Thiocyanat, 5 M 43 Guanidin-HCl,
3 M 40 Guanidin-HCl, 6 M 62 Trichloressigsäure, 1 % 92 DNase I, 1 % 0 RNase A, 1
% 0 D.pneumoniae-Glycosidasen,0,5 % 0 Trypsin, 0,1 % 34 Chymotrypsin, 0,1 % 69 Pronase,
0,1 % 96 * Die Messungen erfolgten nach einer modifizierten SP-RIA-Untersuchungsmethode
und sind ausgedrückt als Differenz
in Impulsen pro Minute zwischen
dem unbehandelten und dem behandelten Antigen durch die Impulse pro Minute des unbehandelten
Antigens x 100.
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Wie der vorstehenden Tabelle I zu entnehmen ist, wurde das Delta-Antigen
durch die Behandlung mit Natriumäthylendiamintetraacetat-Detergentien oder Äther
nicht beeinträchtigt.
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Es war 30 Minuten stabil be; einem pH-Wert von 2,4, wurde jedoch weitgehend
inaktiviert bei einem pH-Wert von 10,4. Hohe molare Konzentrationen von Thiocyanat
und Guanidin-HCl führten zu einer teilweisen Inaktivierung. Delta-Antigen war empfindlich
gegenüber proteolytischen Enzymen, jedoch nicht gegenüber Nucleasen oder Glycosidasen.
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Beispiel 3 Um die Spezifizität des im vorstehend beschriebenen Beispiel
1 dargestellten stabilisierten Delta-Antigens abzuschätzen, wurden Mikrotiter-Platten,
die mit dem Standard-Antikörper zum Delta-Antigen (1:1000) beschichtet waren, mit
HBcAg oder HBsAg und nachfolgend mit 125J-Anti-Delta-Antigen-IgG oder den 125J-IgG-Fraktionen
der Referenz-Anti-HSc oder Anti-HBs inkubiert. Gereinigte HBsAg, unversehrte Dane-Teilchen,
mit Detergentien behandelte Dane-Teilchen oder Coreteilchen, die aus der Leber isoliert
worden waren, gingen keine Bindung mit den Platten ein, die mit dem Anti-Delta-Antigen
beschichtet waren, wie durch das Fehlen einer Bindung von 125J-Anti-HBc, 125J-Anti-HBs
oder 125J-Anti-Delta-Antigen-IgG angezeigt wurde.
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Die mit Delta-Antikörper-Serum und Delta-Antigen beschichteten Platten
gingen keine Bindung mit dem 125J-IgG des Referenz-Anti-HBc oder Anti-HBs ein. Umgekehrt
gingen diejenigen Platten, die mit Referenz-Anti-HBc und Anti-HBs und nachfolgend
mit HBcAg bzw. HBsAg beschichtet worden waren, keine Bindung mit
dem
125J-Anti-Delta-Antigen-IgG ein. Weder das Standard-Delta-Antikörper-Serum noch
das Delça-Antigen nach Beispiel 1 wiesen eine HBeAg oder Anti-HBe-Aktivität auf
(untersucht nach dem SP-RIA-Verfahren). Die Reaktionen des Delta-Antigens und Anti-Delta-Antigens
waren negativ hinsichtlich der Tests auf Poly-HSA und Anti-Poly-HSA.
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Beispiel 4 Versuchte weitere Reinigung von Delta-Antigen Das im vorstehend
beschriebenen Beispiel 1 hergestellte stabile Delta-Antigen wurde 20 Minuten unter
geringem Verlust an Antigen-Aktivität gekocht. Die Entfernung eines schweren Niederschlags
durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit führte zu einer weiteren Reinigung
des Antigens. Jedoch war eine noch weitere Reinigung aufgrund des raschen Verlustes
an Aktivität weitgehend erfolglos. Wurde das gekochte Antigen auf eine Säule des
Typs Bio-Rad A-5m aufgetragen, die mit PBS oder PBS mit 2 mM EDTA äquilibriert worden
war, so eluierte das Delta-Antigen in dem Leervolumen (void volume) mit einem wesentlichen
Verlust an Bindungs-Aktivität. Ein weiterer Verlust an Antigen-Aktivität trat bei
der Ionenaustausch-Chromatographie auf. Das Aufbringen von Delta-Antigen auf Immunoadsorbens-Säulen
(Sepharose 4B verknüpft mit Delta-Antikörper) und nachfolgender Eluierung mit 0,2
M Glycin-HCl (pH 2,4), 5 M Natriumthiocyanat oder 6 M GuHCl führte zur Rückgewinnung
von lediglich Spuren der Delta-Antigen-Aktivität, welche beim Stehen rasch verschwand.
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hinreichenden Menge GuHCl , um eine Konzentration von 1,5 M GuHCl
herzustellen und mit 0,5 % 2-ME in PBS vermischt und auf einen linearen 10 bis 30
%-igen (Gewicht/Gewicht) Sucrose-Gradienten, der 1,5 M GuHCl und 0,5 % 2-ME in PBS
enthielt, geschichtet. Ein aliquoter Teil des gekochten Delta-Antigens wurde sodann
in PBS verdünnt und auf einen linearen 10 bis 30 %-igen (Gewicht/Gewicht) Sucrose-Gradienten
in PBS allein geschichtet.
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Die Gradienten wurden 6 Stunden bei 4"C und 40 000 Upm in dem SW 41-Rotor
zentrifugiert. Die Fraktionen von den behandelten (Darstellungslinie C-0) und unbehandelten
(Darstellungslinie 0-0) Gradienten wurden durch Bodendurchstoß gesammelt und bezüglich
des Delta-Antigens untersucht. In Gegenwart von GuHCl verhielt sich das Antigen
wie ein lösliches Protein und in Abwesenheit von GuHCl sedimentierte es zum Boden
der Röhre.
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Da die Anwesenheit von GuHCl zur Verhinderung einer Aggregation notwendig
erschien, wurde die Analyse des Molekulargewichts des Delta-Antigens in Sephacryl
G200-Säulen durchgeführt, welche mit 1,5 M oder 6 M GuHCl äquilibriert und eluiert
wurden.
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Die Gelfiltration des Antigens in 1,5 M GuHCl und 0,5 % 2-ME wurde
auf eine Sephacryl G200-Säule (16 x 90 mm), die in dem gleichen Medium äquilibriert
worden war, geschichtet. Die Fraktionen (1,7 ml) wurden gesammelt und 50 ul von
jeder Fraktion wurden hinsichtlich des Delta-Antigens untersucht. Die Ergebnisse
sind in Figur 3 dargestellt, vgl. Darstellungslinie -.
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Die Säule wurde mit blauem Dextran (Molekulargewicht z 2 Millionen),
menschlichem IgG (H.IgG, Molekulargewicht 160 000), Rinder-Serumalbumin (BSA, Molekulargewicht
68 000) und Rinder-Cytochrom C (Molekulargewicht 11 700) kalibriert. Jedes Standard-Protein
wurde mit blauem Dextrannach Auflösung in 1,5 M GuHCl einzeln laufengelassen. Die
Positionen der Standards in dem Säuleneluat wurden colorimetrisch bestimmt bezüglich
des blauen Dextrans und des Cytochroms C und durch turbidimetrische Analyse für
H.IgG und BSA nach Ausfällung mit 2,5 % TCA;
B e i s p i e 1 5
Physiochemische Eigenschaften des Delta-Antigens Da das Delta-Antigen gegenüber
weiteren Versuchen zur Reinigung (vgl. vorstehendes Beispiel 4) instabil war, wurde
das nach dem vorstehenden Beispiel 4 gekochte Antigen eingesetzt, um bestimmte biophysikalische
Chrakteristika des Antigens festzustellen.
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In Figur 1 ist eine graphische Darstellung der isopyknischen Bandenbildung
des Delta-Antigens in Cäsiumchlorid zu sehen.
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Eine aliquote Menge (2,75 ml) des gekochten Antigens wurde mit einem
gleichen Volumen von 1,6 g/cm3 CsCl in 0,01 M Tris-HC1 (pH 7,2) vermischt und bei
50 000 Upm in einem SW 50.1 Rotor 56 Stunden bei 4°C zentrifugiert. Fraktionen (0,25
ml) wurden durch Durchstoßen des Bodens gesammelt und hinsichtlich der CsCl-Dichte
(Darstellungslinie 0-0) und Delta-Antigen (25 Cll.
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Darstellungslinie (0-0) analysiert. Die mit der Peak-Fraktion durchgeführte
Elektronenmikroskopie zeigte ein Oberwiegen der 35 bis 37 nm-Teilchen. Wie der Figur
1 entnommen werden kann, bewegt sich das Delta-Antigen wie ein aus Teilchen zusammengesetztes
Gebilde und liefert Banden in einem Cäsiumchlorid-Gradienten wie eine gesonderte
Einheit bei einer Dichte, die wenig niedriger als die von Hepatitis B-Virusteilchen
ist. Die Peak-Fraktion zeigt, daß die Grenzdichte (buoyant density) des Antigens
in CsCl 1,28 g/cm3 beträgt. Die Grenzdichte wurde durch Vorbehandlung des Delta-Antigens
mit ether oder 1 % Tween 80 nicht verändert. Da ein Teil der Instabilität des Delta-Antigens
auf extensive Aggregation zurückzuführen zu sein schien, wurde die Zonengeschwindigkeits-Zentrifugation
in Sucrose-Gradienten in Anwesenheit und in Abwesenheit von GuHCl durchgeführt.
Figur 2 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse der Zonensedimentationsgeschwindigkeit.
Eine Probe des gekochten Antigens nach Beispiel 4 wurde mit einer
der
Pfeil gibt das Zentrum des Peaks an. Menschliches IgG wurde unter diesen Bedingungen
nicht zu seinen konstituierenden Polypeptiden gelöst. Das Delta-Antigen wurde in
dem Leervolumen und in dem monomeren BSA-Bereich von der Säule rückgewonnen. Der
Anteil des rückgewonnenen Delta-Antigens in dem Leervolumen war umgekehrt proportional
zur Molarität an GuHCl , das bedeutet, daß die höhere Konzentration an GuHCl die
Zusammenballung des Antigens verhinderte. Das Molekulargewicht des 11monomeren Delta-Antigens
wird auf etwa 68 000 abgeschätzt, wie in Figur 3 zu sehen ist.
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Beispiel 6 Mit Standard-Delta-Antikörper-Serum beschichtete Mikrotiter-Platten
wurden über Nacht bei einer Temperatur von 40C mit dem Delta-Antigen nach dem vorstehend
beschriebenen Beispiel 1 inkubiert. Nach dem Waschen wurden 50 ul des Standard-Antikörpers
zum Delta-Antigen-Serum (1:50 in PBS) und 5 Sera (jeweils 1:50), die Delta-Antigen-Antikörper
enthielten (ermittelt durch direkte oder indirekte IFL) in Doppelbohrungen gegeben.
Verdünnungen (1:50) von HBsAg-negativen Sera ohne Delta-Antigen-Antikörper, Sera
mit Autoantikörpern gegenüber Kern- und cytoplasmatischen Autoantigenen und Referenz-Anti-HBc
und Anti-HBs-Sera dienten als Kontrollen. Nach 3 Stunden bei einer Temperatur von
370C wurden die Bohrungen gewaschen und jede Bohrung hinsichtlich 125J in einem
Gamma-Zähler analysiert. Das Standard-Antikörper-Serum und die 5 Sera mit dem Antikörper
(mittels IFL) inhibierten die Bindung von 125J-Anti-Delta-Antigen-IgG an die Platte.
Keine Inhibition wurde beobachtet bei den verschiedenen Typen von Kontroll-Sera.
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Dieses Beispiel demonstriert die Verwendbarkeit der stabilen Form
des Delta-Antigens, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, d.h. durch Bindung
mit dem Anti-Delta-Antigen erhalten wird. Der Fachmann wird es begrüßen, daß die
stabile Form des Antigens zum Nachweis und zur Bestimmung des Vorhandenseins des
Anti-Delta-Antigens verwendet werden kann. Dies stellt ein Mittel zur Diagnose der
Gegenwart des Antikörpers und des zugehörigen Hepatitis-B-Virus zur Verfügung.