DE2630753C2

DE2630753C2 -

Info

Publication number: DE2630753C2
Application number: DE2630753A
Authority: DE
Inventors: Lars-Olov Dr. Knivsta Se Andersson; Hakan Gunnar Huddinge Se Borg; Geb. Lindh Gudrun Monica Dr. Uppsala Se Einarsson
Original assignee: KABI STOCKHOLM SE AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1975-07-09
Filing date: 1976-07-08
Publication date: 1989-01-19
Also published as: DK148874B; NO762392L; JPS641444B2; GB1531558A; AU510068B2; PL191019A1; CA1076956A; ES449670A1; IL49752A; FI55868B; NO148339C; US4168300A; DK308476A; PL105363B1; AU1568476A; IE43952L; CH630115A5; DK148874C; JPS5210416A; FR2317309A1

Description

Die Anmeldung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Entfernung von Hepatitisviren. Der Anspruch 2 betrifft eine Ausgestaltung dieses Verfahrens.

Virus-B-Heptatitis, auch bekannt als Serumhepatitis, wird verbreitet durch biologisches Material wie Blut, Plasma, Serum, Urin und Stuhl. Sie kann auch verbreitet werden durch Plasmafraktionen, die für therapeutische Zwecke angewandt werden. Das Virus kann auch in Abwasser und anderen Abfällen, umfassen biologisches Material, in ausreichender Menge vorhanden sein, um die Krankheit zu verbreiten.

Hepatitisvirus B kann nachgewiesen werden durch immunologische Verfahren, beruhend auf der Struktur des Virenoberflächenantigens HB _sAg, das bekannt ist als Australia-Antigen, Au-Antigen.

Wenn man in der klinischen Praxis nur auf anerkannte Blutspender zurückgreift, die auch bei dem empfindlichsten Bestimmungsverfahren Hepatitis-negativ sind, ist es möglich, die Gefahr einer Hepatitisübertragung wesentlich herabzusetzen. Um dies zu erreichen, wird ein wesentlicher Teil der verfügbaren Blutmenge nicht ausgenutzt und Substanzen, die für eine industrielle Technologie geeignet sind sowie ein Verfahren, das zur industriellen Plasmafraktionierung zur selektiven Entfernung von Hepatitisvirus geeignet ist, sichert eine bessere Versorgung der Krankenhäuser bezüglich Blutserum, Plasma und Plasmafraktionen.

Obwohl die Empfindlichkeit der Bestimmungen wesentlich verbessert wurde durch die radioimmunologischen Verfahren, bleibt noch die Gefahr, daß Hepatitis im Blut und Plasmafraktionen auch dann vorhanden ist, wenn man ein negatives Untersuchungsergebnis erhält.

Auf einem Treffen der American Chemical Society im August 1972 in New York, USA, zeigten S. E. Charm und B. L. Wong ein Verfahren zur Entfernung von Hepatitisvirus aus Blutplasma mit Hilfe von Ziegenantikörpern gegen Hepatitisvirus. Diese Untersuchung wurde in Biotechn. Bioeng. Band 16 (1974), Seite 593, veröffentlicht. Eine technische Anwendung dieses Verfahrens ist jedoch stark eingeschränkt durch die begrenzte Verfügbarkeit von Antikörpern. Außerdem muß die Gefahr eines Auslaugens von immunogenem Material aus dem Antikörperträger in betracht gezogen werden, wenn das Verfahren auf die Fraktionierung von Plasma menschlichen Ursprungs angewandt werden soll und die entsprechenden Plasmafraktionen in Krankenhäusern angewandt werden sollen.

In Journal of Biological Chemistry 245, S. 3059 bis 3065 (1970) sind allgemein Stoffe für die Affinitäts-Chromatographie beschrieben, die aus Träger-Substanz, Bindeglied und Liganden bestehen. Auf die Entfernung von Hepatitisviren aus einem biologischen Material findet sich jedoch kein Hinweis. Auch in DE-OS 24 13 362, Biochem. J. 126, S. 765 bis 767 (1972), Methode in Enzymology, Bd. 34, S. 126 bis 140 (1974), Anal. Biochem. 68, S. 274 bis 280 (1975) sind ähnliche Substanzen angegeben. Auch in diesen Druckschriften ist jedoch nicht darüber ausgesagt, daß es möglich sein könnte, mit Hilfe der dort angegebenen, für die Affinitäts- Chromatographie geeigneten Substanzen, speziell Hepatitis- Viren aus biologischem Material zu entfernen.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dessen Hilfe Hepatitisviren schnell irreversibel und spezifisch aus biologischen Materialien entfernt werden könne, ohne daß die Gefahr eines Auslaufens der Viren besteht. Die bei dem Verfahren angewandten Materialien sollen leicht verfügbar sein und kein immunologisches Material erfordern.

Diese Aufgabe wird gelöst durch das im Hauptanspruch angegebene Verfahren. Eine besonders vorteilhafte Ausgestaltung dieses Verfahrens ist im Anspruch 2 angegeben.

Zur Bestimmung des Antigens wurden die folgenden Methoden angewandt:

Ausria II 125, Analyseneinheit zur Durchführung radioimmunologischer Bestimmungen, Abbott Laboratories, North Chicago, USA;
Hepanosticon, Analyseneinheit zur Durchführung umgekehrter Hämagglutinationsverfahren, Organon, Oss, Holland;
Immunodiffusion, ID, Berg et al., Vox Sang. Band 22 (1972) Seite 1;
Immunoelektro-Osmoforesis, IEOP, Hansson und Johnsson, Vox. Sang. Band 21 (1971), Seite 531.

Bei der Anwendung zur Untersuchung von Blutproben besitzt der Ausriatest die höchste Empfindlichkeit, aber zur Untersuchung von Fraktionen von biologischem Material nimmt die Genauigkeit bei der Bestimmung der Wirkung der durchgeführten Stufen zu, wenn weitere Tests unter Anwendung eines anderen Bestimmungssystems durchgeführt werden.

Eine Konzentrierung von Hepatitisviren nach dem erfindungsgemäßen Verfahren macht eine Untersuchung hochkonzentrierter Proben möglich, wodurch die Genauigkeit des angewandten Verfahrens für Hepatitis wesentlich verbessert wird.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandten Mittel werden erhalten durch Kupplung des betreffenden Liganden an ein gelbildendes Matrixmaterial.

Alle der untersuchten kovalenten Bindungen

erwiesen sich als gleichwertig und von geringerer Bedeutung als die Struktur des Liganden für die Durchführbarkeit des Verfahrens.

Auch die Art des wasserdurchlässigen Matrixmaterials, z. B. Polyacrylamid, Kohlenhydrate wie Cellulose, Agarose - gegebenenfalls vernetzt durch Bis-epoxid, Glutardialdehyd, Divinylsulfon, Dibrompropanol, Epichlorhydrin - ist von geringerer Bedeutung gegenüber dem Liganden.

In hohem Maße bestimmend für die Affinität zu Hepatitisvirus ist der hydrophobe Charakter des Liganden wie durch die folgende Tabelle gezeigt wird, die die Untersuchungen zur Entfernung von Hepatitisvirus aus menschlichem Plasma, das mit Hepatitisvirus infiziert ist, zusammenfaßt.

Tabelle Bindung von Hepatitisvirus aus stark Au-positivem menschlichem Plasma

Wie aus der Tabelle hervorgeht, wurde das gleiche Matrixmaterial angewandt und nur der Ligand variiert.

Die Affinität von Hepatitisviren zu den Mitteln wurde bestimmt durch die oben angegebenen immunologischen Bestimmungsverfahren. Eine starke und vollständige Bindung von Hepatitisviren an ein Mittel wird als "-" bezeichnet, was bedeutet, daß kein Hepatitisvirus in der Plasmaprobe nach der Behandlung nachweisbar ist. Die Bezeichnung "+" bezeichnet unwesentliche verbleibende Mengen an Hepatitisvirus in der Plasmaprobe, "++" bezeichnet unveränderte oder leicht verringerte Mengen an Au-Antigen in der Plasmaprobe nach der Behandlung.

Ligand/KohlenstoffketteAu-Antigen in der Plasmaprobe
nach der Behandlung

Die Matrix bei dieser Versuchsreihe
war ein Polysaccharidgel (Sepharose 4B)

Vergleich
-Hexylamin++ -Glycyl-norleucin++ -Glycyl-DL-phenylalanin++ -Cyclopentylamin++ -Cycloheptylamin++ -Phenyläthylamin++ -Hexamethylen-diamin (Bindeglied)-Benzoesäure++ -Hexamethylen-diamin (Bindeglied)-Heptansäure++ -Hexamethylen-diamin (Bindeglied)-Bernsteinsäure++ -Hexamethylen-diamin (Bindeglied)-Phtalsäure

erfindungsgemäß
-Octylamin- -Decylamin- -Dodecylamin- -Octadecylamin- -Hexamethylendiamin (Bindeglied)-Octylbernsteinsäure- -Cysteamin (Bindeglied)-Octylbernsteinsäure
(Beispiel 11)- -Hexamethylendiamin (Bindeglied)-Naphthylessigsäure
(Beispiel 12)- -Hexamethylendiamin (Bindeglied-Cholesterin-hydrogensuccinat
(Beispiel 13)- -Hexamethylendiamin (Bindeglied)-Chol-säure
(Beispiel 14)-

Die Matrix dieser Reihe war Sepharose 4B,
die auf verschiedene Weise vernetzt war

-Äthylendiamin (Bindeglied)-Octylbernsteinsäure
(Beispiel 1)- -Butylendiamin (Bindeglied)-Octylbernsteinsäure
(Beispiel 1)- -Hexamethylendiamin (Bindeglied)-Octylbernsteinsäure
(Beispiel 1)- -Hexamethylendiamin (Bindeglied)-Dodecylbernsteinsäure
(Beispiel 2)- -Caprylhydrazid (Beispiel 3)- -Tetradecylamin (Beispiel 6)- -(2-Amino-dodecan) (Beispiel 7)- -Äthylendiamin (Bindeglied)-Undecen-10-säure
(Beispiel 8)-

Die Matrix in dieser Reihe war Polyacrylamid

-Propylen (Bindeglied)-Decylamin (Beispiel 10)-

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an Sepharose-(Äthylendiamin-Octyl- bernsteinsäure)-Konjugate Herstellung des Gelderivats

Die Aktivierung von Sepharose wurde durchgeführt durch vorsichtiges Waschen von 100 ml entsprechend sedimentierter Sepharose 4B mit Wasser. Die überschüssige Flüssigkeit wurde anschließend abgesaugt, bevor das Gel in eine Lösung von 4 g Cyanogenbromid in 100 ml destilliertem Wasser gegeben wurde. Nach 15 Minuten langer Gleichgewichtseinstellung (Äquilibrierung) unter Rühren und Eiskühlung wurde die Gelsuspension 6 bis 7 Minuten bei einem pH-Wert von 11,0 aktiviert. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 4 M Natriumhydroxidlösung konstant gehalten.

Zur Kupplung mit Äthylendiamin wurde das aktivierte Gel auf einem Glasfilter mit kalter 0,5 M Natriumbicarbonatlösung pH 9,8 gewaschen, bevor es in eine Lösung von 10 g Äthylendiamin in 100 ml destilliertem Wasser, deren pH-Wert mit Hilfe von konz. Salzsäure auf 9,8 eingestellt war, gegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rühren 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Das entstehende Gelprodukt wurde gründlich gewaschen.

25 ml der wäßrigen Suspension des entstehenden mit dem Bindeglied versehenen Gels wurden in 20 ml Dioxan suspendiert. Eine frische Lösung von 6 g Octylbernsteinsäureanhydrid in 60 ml Dioxan wurde unter Rühren bei Raumtemperatur zugetropft. Der pH-Wert wurde durch Zugabe einer verdünnten Natriumhydroxidlösung zwischen 7,5 und 8 gehalten. Das Adsorptionsmittel wurde gründlich mit Dioxan, Dioxan-Wasser (2 : 1), Wasser 1 M Natriumchloridlösung und einem Puffer, bestehend aus 0,05 M Tris, 0,02 M Natriumcitrat und 0,10 M Natriumchlorid pH 7,5 gewaschen. Dieser Puffer wird im folgenden als Testpuffer bezeichnet.

Die Ausbeute an Kupplungsprodukt, bezogen auf Octylbernsteinsäure, wurde durch das protonmagnetische Resonanzspektrum bestimmt und erwies sich als 4,8%.

1,4-Diaminobutan und 1,6-Diaminohexan können mit entsprechenden Ergebnissen anstelle von Äthylendiamin verwendet werden.

Au-Antigentest

Eine zusammengegebene Menge von Au-Antigen- positivem Plasma mit einem Titer von 1 : 64, entsprechend IEOP und 1 : 32 entsprechend ID, wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Die Titerwerte sind im Verhältnis zu einem Standard-Antigen angegeben.

Zu jedem von 6 Prüfröhrchen wurden 2 ml Au-Antigen-positives Plasma und 2 ml einer Suspension von 3 Teilen gründlich sedimentiertem Adsorbens, das mit Testpuffer äquilibriert war, und ein Teil des gleichen Puffers gegeben. Die Proben wurden 1, 2, 5, 10, 20 bzw. 30 Minuten bewegt und die Gele durch Zentrifugieren abgetrennt. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden auf Au-Antigen untersucht und erwiesen sich entsprechend ID, IEOP und Hepanosticon als negativ.

Beispiel 2 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an Sepharose-(Hexamethylendiamin- Dodecylbernsteinsäure)-Konjugate Herstellung des Gelderivats

Zur Vernetzung von Sepharose wurden 100 ml des Gels mit 2 ml Epichlorhydrin und 0,5 g Natriumborhydrid vermischt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 60°C stark gerührt. Das Gel wurde gründlich mit warmem Wasser gewaschen und mit einer Lösung von 0,25 g Natriumborhydrid in 50 ml 2 M Natriumhydroxidlösung vermischt. Das Gemisch wurde 1 Stunde im Autoklaven auf 120°C erhitzt. Das Gel wurde anschließend mit einer alkalischen Natriumborhydridlösung gewaschen. Es wurde konz. Essigsäure langsam zugegeben, bis der pH-Wert des Gemisches 4 betrug. Schließlich wurde das Gel mit reichlich Wasser gewaschen.

Die Herstellung des Sepharose-Hexamethylendiamingels erfolgte entsprechend Beispiel 1.

25 ml des entstehenden mit dem Bindeglied versehenen Gels wurden auf einen Glasfilter gegeben und mit Dioxan- Wasser (2 : 1) gewaschen und anschließend trocken gesaugt und in eine frische Lösung von 1 g Dodecylbernsteinsäure, 1,5 g wasserlöslichem Carbodiimid, N-Cyclohexyl-N′-[β-(N-methylmorpholino-äthyl)]-carbodiimid-p-toluol-sulfonat in 60 ml Dioxan-Wasser (2 : 1) gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, bevor es auf einen Glasfilter gegeben und gründlich mit Dioxan, Dioxan-Wasser (2 : 1), 1 M Natriumchloridlösung, Wasser und dem Testpuffer gewaschen wurde.

Die Ausbeute an Kupplungsprodukt in Werten für die angewandte Fettsäure wurde durch protonenmagnetische Resonanz bestimmt und ergab sich als 2%.

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma, Titer 1 : 128 nach ID und IEOP wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Eine Säule (D = 1,6 H = 1,0 cm) wurde mit dem mit Testpuffer äquilibrierten Gel gepackt. 7 ml des Au-Antigen-positiven Plasmas wurden in Kontakt mit dem Gel gebracht, wobei 5 ml/h hindurchflossen. Der Testpuffer wurde zugegeben (zugepumpt) bis kein Proteinmaterial mehr eluiert wurde, was durch UV-Untersuchung nachgewiesen wurde. Das gesammelte Eluat war nach ID, IEOP und Hepanosticon negativ. Durch Druckdialyse wurde das Eluat 10fach konzentriert und war bei den Hepatitistests immer noch negativ.

Beispiel 3 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an Sepharose-Caprylhydrazid- Konjugat Herstellung des Gelderivats

Äthylcaprylat wurde durch Hydrazinolyse in das entsprechende Hydrazin umgewandelt. 10 ml des Äthylesters wurden mit 10 ml 98%igem Hydrazinhydrat vermischt. 22 ml Äthanol wurden als Lösungsmittel zugegeben, bis das Reaktionsgemisch klar wurde und anschließend wurde die Lösung 15 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Das kristallisierende Hydrazid wurde abfiltriert, mit Eiswasser und wäßrigem Methanol (1 : 1) von Raumtemperatur gewaschen.

Die Sepharose 4B wurde entsprechend Beispiel 1 aktiviert.

Das Gel wurde mit einer Lösung des Kupplungsmittels gewaschen und vakuumfiltriert. Die Kupplung wurde erreicht durch Überführung des aktivierten Gels in 100 ml einer gesättigten Lösung von Caprylhydrazid in Dimethylformamid (DMF)-0,2 M Natriumbicarbonat (1 : 1). Der pH-Wert wurde während der Kupplungsreaktion, die innerhalb von 15 Stunden bei Raumtemperatur stattfand, unverändert gelassen. Das entstehende Produkt wurde gründlich mit DMF, DMF-Wasser (1 : 1), 1 M Natriumchloridlösung, Wasser und Testpuffer gewaschen.

Die Ausbeute an Kupplungsprodukt, bezogen auf Hydrazid wurde durch protonenmagnetische Resonanz bestimmt und ergab sich als 2,3%.

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma, Titer 1 : 128, entsprechend ID und IEOP, wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Zu 2 ml einer Suspension, bestehend aus 3 Teilen sorgfältig sedimentiertem Adsorbans, äquilibriert mit dem Testpuffer und einem Teil des gleichen Puffers, wurden 2 ml Au-Antigen-positives Plasma gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten leicht bewegt und das Gel durch Zentrifugieren abgetrennt. Die überstehende Flüssigkeit war Au- Antigen-negativ, entsprechend ID, IEOP und Hepanosticon.

Beispiel 4 Entfernung von Au-Antigen von einer Albuminlösung durch Adsorption an Sepharose-(Äthylen diamin-Octylbernsteinsäure)-Konjugat Herstellung des Gelderivats

Das Gelkonjugat wurde entsprechend Beispiel 1 hergestellt.

Au-Antigentest

Eine Au-Antigen-positive Albuminlösung, Titer 1 : 64, entsprechend ID und IEOP, die erhalten worden war durch Fraktionierung von Au-Antigen-positivem Plasma, wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Die Adsorption wurde ansatzweise entsprechend Beispiel 3 durchgeführt. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf Au-Antigen untersucht und erwies sich, entsprechend ID, IEOP und Hepanosticon, als negativ.

Beispiel 5 Entfernung von Au-Antigen aus einem Coagulationsfaktor-Konzentrat durch Adsorption an Sepharose-(Äthylendiamin-Octylbernsteinsäure)- Konjugat Herstellung des Gelderivats

Das Gelkonjugat wurde entsprechend Beispiel 1 hergestellt.

Au-Antigentest

Ein Au-Antigen-positives Plasma wurde zur Fraktionierung eines Konzentrats, enthaltend die Coagulationsfaktoren II, VII, IX und X, angewandt, Eine 1%ige Proteinlösung wurde hergestellt und es zeigte sich, daß sie einen Au-Antigentiter von 1 : 32 entsprechend ID besaß. Auf einen Glasfilter, enthaltend ein Bett von 5 ml des Gelderivats, das mit dem Testpuffer äquilibriert war, wurden 10 ml der zu untersuchenden Proteinlösung gegeben und das Gel mit 3 × 5 ml des Testpuffers gewaschen. Die Eluate wurden auf Au-Antigen, entsprechend ID, IEOP und Hepanosticon, untersucht. Sie erwiesen sich als negativ.

Beispiel 6 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an Sepharose-Tetradecylamin- Konjugat Herstellung des Gelderivats

Sepharose wurde entsprechend Beispiel 1 aktiviert.

Für die Kupplungsreaktion wurden 100 ml mit Cyanogenbromid aktivierter Sepharose, die mit 95% Äthanol äquilibriert und durch Absaugen getrocknet worden war, zu einer Lösung von 22 g Tetradecylamin in 100 ml 95%igem Äthanol gegeben. Das Gemisch wurde 48 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Gel wurde gründlich mit warmem 95%igen Äthanol, wäßrigem Äthanol (1 : 1), 1 M Natriumchloridlösung, Wasser und Testpuffer gewaschen. Die Ausbeute der Kupplungsreaktion wurde durch protonenmagnetische Resonanz bestimmt und ergab sich als 4,3%.

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma, Titer 1 : 128 nach ID und IEOP wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Auf einen Glasfilter, enthaltend ein Bett von 10 ml des Gelderivats, äquilibriert mit dem Testpuffer, wurden 35 ml Plasma gegeben. Das Material wurde mit 3 × 10 ml Testpuffer gewaschen und die Eluate auf Au-Antigen untersucht. Sie erwiesen sich nach ID, IEOP, Hepanosticon und Ausria als negativ.

Beipiel 7 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an Sepharose-(2-Amino-dodecan)- Konjugat Herstellung des Gelderivats

2-Dodecan wurde durch Umsetzung mit Hydroxylamin unter Bildung des Oxims und anschließende katalytische Hydrierung und Eliminierung von Wasser in das entsprechende Amin umgewandelt. Die angewandte Sepharose wurde entsprechend Beispiel 1 erhalten.

Zur Kupplung wurden 100 ml mit Cyanogenbromid aktivierten Gels, das mit 95%igem Äthanol gewaschen und durch Absaugen getrocknet worden war, zu einer Lösung von 10 g 2-Amino-dodecan in 100 ml 95%igem Äthanol gegeben.

Das Gemisch wurde 48 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur stehengelassen, anschließend gründlich mit warmem 95%igem Äthanol, wäßrigem Äthanol (1 : 1), 1 M Natriumchloridlösung, Wasser und Testpuffer gewaschen.

Die Ausbeute an Kupplungsprodukt wurde durch protonenmagnetische Resonanz bestimmt und ergab sich zu 1%.

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma, Titer 1 : 128 nach ID und IEOP wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Der Versuch wurde entsprechend Beispiel 3 durchgeführt und die überstehende Flüssigkeit erwies sich nach ID, IEOP und Hepanosticon als negativ.

Beispiel 8 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an Sepharose-(Äthylendiamin- Undecen-10-säure)-Konjugat Herstellung des Gelderivats

Das Sepharose-Äthylendiamin wurde entsprechend Beispiel 1 erhalten.

Zu einer frischen Lösung von 1,85 g Undecylensäure und 2,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Dioxan wurden 100 ml Sepharose-Äthylendiamin-Konjugat nach Äquilibrierung mit Dioxan und Vakuumfiltration zugegeben. Die Gelsuspension wurde 15 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur stehengelassen, mit Dioxan, Dioxan-Wasser (1 : 1), 1 M Natriumchloridlösung und Testpuffer gewaschen.

Die Kupplungsausbeute, bezogen auf die Fettsäure, wurde durch protonenmagnetische Resonanz bestimmt und ergab sich zu 2,3%.

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma, Titer 1 : 128 nach ID und IEOP, wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Der Versuch wurde entsprechend Beispiel 3 durchgeführt. Es zeigte sich, daß die überstehende Flüssigkeit entsprechend ID, IEOP und Hepanosticon Au-Antigen-negativ war.

Beispiel 9 Entfernung von Au-Antigen aus Plasminogenkonzentrat durch Adsorption an Sepharose- Caprylhydrazid-Konjugat Herstellung des Gelderivats

Das Gelderivat wurde entsprechend Beispiel 3 erhalten.

Au-Antigentest

Zu 2 ml einer Plasminogenlösung wurden 0,5 ml stark Au-positives Plasma gegeben und das Gemisch war stark Au- positiv nach ID und Ausria. Das Gemisch wurde durch eine 4-cm-Säule geleitet, die mit 10 ml Gelkonjugat beschickt war, das mit Testpuffer äquilibriert war. Die Fraktionen wurden gesammelt und untersucht. Das plasminogenhaltige Eluat erwies sich nach ID und Ausria als negativ.

Beispiel 10 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an Polyacrylamid-(Propylen-Decylamin)-Konjugat Herstellung des Gelderivats

Polyacrylamid wurde in Wasser gequollen und gründlich mit 0,05 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 gewaschen. Für die Aktivierung wurden 20 ml der Gelsuspension in Puffer (0,5 trockenes Gel/25 ml Puffer) mit 5,0 ml Glutardialdehyd vermischt und 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde das Gel gründlich mit Dioxan, Dioxan- Wasser (3 : 2), Wasser und Testpuffer gewaschen.

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma, Titer 1 : 128 nach ID und IEOP, wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Der Versuch wurde entsprechend Beispiel 3 durchgeführt. Die überstehende Flüssigkeit erwies sich bei der Untersuchung entsprechend ID, IEOP und Hepanosticon als Au-negativ.

Beispiel 11 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an Sepharose-(Cysteamin-Octylbernsteinsäure)-Konjugat Herstellung des Gelderivats

Das Sepharose-Cysteamin wurde erhalten durch Reduktion von Sepharose-Cysteamin, das entsprechend Beispiel 1 hergestellt worden war, mit 0,05 M Mercaptoäthanol in 0,1 M Caronatpuffer pH 8,5 innerhalb einer Stunde. Das Gel wurde ausgiebig mit dem Carbonatpuffer, Wasser und schließlich mit Dioxan gewaschen. Zu einer Lösung von 1,2 g Octylbernsteinsäure in 40 ml Dioxan wurde eine Lösung von 1,84 g Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Dioxan und 25 ml Sepharose-Cysteamin zugegeben. Nach 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurden weitere 1,84 g Dicyclo-hexylcarbodiimid zugegeben. Zwei Stunden später wurde das Gel mit Dioxan gewaschen. Die Reaktion wurde wiederholt und anschließend ausgiebig mit Dioxan, Dioxan- Wasser, Wasser und 0,1 M Carbonat pH 8,5 gewaschen. Die verbleibenden Thiolgruppen wurden durch Behandlung des Gels mit 60 mg Jodacetamid innerhalb von 45 Minuten blockiert. Schließlich wurde das Gel mit dem Testpuffer gewaschen.

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma, Titer 1 : 32 nach ID, wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Die Adsorption wurde ansatzweise entsprechend Beispiel 3 durchgeführt. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf Au-Antigen untersucht und erwies sich nach ID, IEOP und Hepanosticon als negativ.

Beispiel 12 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an Sepharose-(Hexamethylen-di amin-Naphtyl-1-essigsäure)-Konjugat Herstellung des Gelderivats

Das Sepharose-Hexamethylendiamin wurde entsprechend Beispiel 1 erhalten.

25 ml des entstehenden mit dem Bindeglied versehenen Gels wurden auf einen Glasfilter gegeben und mit Dioxan- Wasser (3 : 2) gewaschen und durch Absaugen getrocknet und zu einer frischen Lösung von 1,1 g Naphtyl-1-essigsäure in 30 ml Dioxan-Wasser (3 : 2) gegeben. Zu der Gelsuspension wurden 2,65 g wasserlösliches Carbodiimid,N-Cyclohexyl-N′- [β-(N-methylmorpholinoäthyl)]-carbodiimid-p-toluol- sulfonat unter Rühren zugegeben und anschließend der pH- Wert mit verdünnter Salzsäure auf 4,8 eingestellt. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurden 2,65 g wasserlösliches Carbodiimid nochmals zugegeben. Das Gemisch wurde eine weitere Stunde unter Rühren stehengelassen und anschließend auf einen Glasfilter gegeben und gründlich mit Dioxan, Dioxan-Wasser (3 : 2), 1 M Natriumchloridlösung, Wasser und dem Testpuffer gewaschen.

Die Kupplungsausbeute, bezogen auf Naphtyl-1-essigsäure, wurde durch protonenmagnetische Resonanz bestimmt und ergab sich zu 3%.

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma, Titer 1 : 128 nach ID und Titer 1 : 64 nach IEOP wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Die Adsorption wurde entsprechend Beispiel 3 ansatzweise durchgeführt. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf Au-Antigen untersucht und erwies sich nach ID, IEOP und Hepanosticon als negativ.

Beispiel 13 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an Sepharose-(Hexamethylen-di amin-Cholesterin-hydrogen-succinat)-Konjugat Herstellung des Gelderivats

Das Sepharose-Hexamethylendiamin wurde entsprechend Beispiel 1 erhalten.

20 ml des mit dem Bindeglied versehenen Gels wurden auf einen Glasfilter gegeben und mit Dioxan, 10% Triäthylamin in Dioxan und wieder mit Dioxan gewaschen und anschließend trocken gesaugt und zu einer frischen Lösung von 0,5 g Cholesterinhydrogen-succinat in 25 ml Dioxan gegeben. Die Reaktion wurde eingeleitet durch Zugabe von 0,35 g Dicyclohexylcarbodiimid in 1 ml Dioxan. Die Kupplung wurde unter Rühren bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach 2 Stunden wurde eine weitere Menge Carbodiimid zugegeben und weitere 2 Stunden später wurde das gekuppelte Gel ausgiebig mit Dioxan, Dioxan-Wasser, Wasser und schließlich mit dem Testpuffer gewaschen.

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma, Titer 1 : 64 nach ID und 1 : 128 nach IEOP, wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Die Adsorption wurde ansatzweise entsprechend Beispiel 3 durchgeführt. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf Au-Antigen untersucht und erwies sich nach ID, IEOP und Hepanosticon als negativ.

Beispiel 14 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an Sepharose-(Hexamethylen-diamin- Cholsäure)-Konjugat Herstellung des Gelderivats

Das Sepharose-Hexamethylendiamin wurde entsprechend Beispiel 1 erhalten.

Die Kupplung von Cholsäure an das mit dem Bindeglied versehene Gel wurde entsprechend Beispiel 13 durchgeführt mit der Ausnahme, daß 0,5 g Cholsäure in 100 ml Dioxan gelöst wurden.

Die Kupplungsausbeute, bezogen auf Cholsäure, wurde durch protonenmagnetische Resonanz untersucht und ergab sich zu 5,8%.

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma, Titer 1 : 32 nach ID wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Die Adsorption wurde ansatzweise entsprechend Beispiel 3 durchgeführt. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf Au-Antigen untersucht und erwies sich nach ID, IEOP und Hepanosticon als negativ.

Claims

1. Verfahren zur Entfernung von Hepatitisviren aus einem biologischen Material durch Zusammenbringen des biologischen Materials mit einer wasserdurchlässigen Matrix aus einem hochmolekularen Kohlenhydrat oder Polyacrylamid, an die, gegebenenfalls über ein Bindeglied, ein Ligand kovalent gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand hydrophob ist und ausgewählt ist aus Octyl-, Decyl-, Dodecyl-, Tetradecyl- und Octadecylamin, 2-Amino-dodecan, Caprylhydrazid, Octyl- und Dodecyl- bernsteinsäure, Cholesterinhydrogensuccinat, Naphtylessigsäure, Heptansäure, Undecen-10-säure oder Cholsäure.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindeglied ausgewählt ist aus Propylen oder einem C₂-C₆-Alkylendiamin.