CH630115A5

CH630115A5 - Verwendung von zubereitungen mit affinitaet zum hepatitisvirus zur entfernung oder konzentrierung von hepatitisviren aus bzw. in gemischen biologischen materials.

Info

Publication number: CH630115A5
Application number: CH864976A
Authority: CH
Inventors: Lars-Olov Dr Andersson; Hakan Gunnar Dipl Ing Borg; Gudrun Monica Einarsson-Lindh
Original assignee: Kabi Ab
Priority date: 1975-07-09
Filing date: 1976-07-06
Publication date: 1982-05-28
Also published as: NO148339C; IT1062511B; DE2630753A1; NZ181384A; NL7607647A; IE43952L; ES449670A1; FR2317309A1; DK148874C; PL105363B1; IE43952B1; IL49752A; CA1076956A; PL191019A1; US4168300A; NO762392L; ATA500576A; DK308476A; FI55868C; CS223818B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Zubereitungen mit Affinität zum Hepatitisvirus zur Entfernung oder Konzentrierung von Hepatitisviren aus bzw. in Gemischen biologischen Materials, welche Hepatitisviren enthalten.

Das Hepatitisvirus vom Typ B, gleichfalls bekannt unter der Bezeichnung Serumhepatitis, wird verbreitet durch biologisches Material, wie Blut, Plasma, Serum, Urin und Fäces. Typ B Hepatitis kann demzufolge übertragen werden durch Plasmafraktionen, wie sie für therapeutische Behandlungen verwendet werden. Das Virus kann gleichfalls zugegen sein in Kloakenwasser oder anderen Abwasserarten, welche biologische Materialien in genügender Menge zur Verbreitung dieser Krankheit enthalten.

Hepatitisvirus Typ B kann entdeckt werden durch immunologische Methoden, welche auf die Struktur des viralen Oberflächenantigens, HBsAg, ansprechen, welches Antigen gleichfalls bekannt ist unter der Bezeichnung Australia-Antigen, Au-antigen. Die Methoden zum Nachweis des Au-Antigens, auf welche bei den Arbeiten zur vorliegenden Erfindung abgestellt wurde, sind die folgenden:

Ausria II 125, radio-immunologischer Test, Abbott Laboratories North Chicago, USA,

Hepanosticon, umgekehrter Hämagglutinations-Test, Organon, Oss, Holland

Immunodiffusion, ID Berg und Mitarbeiter, Vox Sang, Band 22(1972), Seite 1, und s Immunoelektro-Osmophorese, IEOP, Hansson und Johnson, Vox Sang, Band21 (1971), Seite 531.

Bei der Prüfung von Blutproben weist der Ausria-Test die höchste Empfindlichkeit auf. Bei der Prüfung von Frak-lo tionen von biologischen Materialien steigert sich indessen die Genauigkeit der Wirkungsbewertung, wenn zusätzliche Tests unter Verwendung einer anderen Prüfmethode durchgeführt werden.

Verlässt man sich im Spital-Routinebetrieb nur auf Blut-15 spender, die nach der empfindlichsten Testmethode hepa-titis-negativ sind, so ist es möglich, das Risiko einer Hepatitisübertragung beträchtlich zu vermindern. Hierbei wird aber ein wesentlicher Teil der verfügbaren Blutmengen nicht gebraucht, solche Materialien, die einer Bearbeitung im tech-20 nischen Massstab zugänglich sind, wie auch eine Methode, die geeignet ist zur industriellen Plasmafraktionierung unter selektiver Entfernung von Hepatitisviren, stellen eine vermehrte Lieferung von Blutserum, Plasma und Plasmafraktionen an Spitälern sicher.

25 Obgleich die Testempfindlichkeit durch die Radioimmunotest-Technik wesentlich verbessert werden konnte, bleibt gleichwohl ein Risiko des Rückbehaltes von Hepatitis in Blut und Plasmafraktionen mit negativen Testergebnissen erhalten. Die Konzentrierung des Hepatitisvirus ermöglicht 30 eine Prüfung von hochkonzentrierten Proben, wodurch die Sicherheit des angewendeten Hepatitis-Testsystems sehr weitgehend verbessert werden kann. Auf einem Meeting der American Chemical Society vom August 1972, New York, USA, präsentierten S.E. Charm und B.L. Wong eine Methode 35 zur Entfernung von Hepatitisviren aus Blutplasma unter Verwendung von Ziegenantikörpern gegen Hepatitisvirus. Diese Arbeit wurde publiziert in Biotech. Bioeng., Band 16 (1974), Seite 593. Die Durchführung dieser Methode im technischen Massstab wird entscheidend eingeengt durch die begrenzte 40 Verfügbarkeit von Antikörpern. Zusätzlich muss das Risiko vom Auslaufen immunogenen Materials aus dem Antikörperträger in Betracht gezogen werden, falls die Methode angewendet wird auf Fraktionen von Plasma menschlicher Herkunft und die erhaltenen Plasmafraktionen in Spitälern 45 verwendet werden sollen.

Gegenstand der Erfindung ist nun die Verwendung einer neuen Zubereitung, die im Patentanspruch 1 definiert ist und die Nachteile der früher bekannten Techniken nicht aufweist. Die erfindungsgemässe Verwendung lässt sich leicht verso wenden in technischem Massstab nach technischen

Methoden ausführen, die an sich bekannt sind. Die Zubereitungen enthalten kein immunogenes Material. Ihre Affinität zum Hepatitisvirus ist hoch und spezifisch und die Reaktion zwischen den Wirkstoffen und dem Hepatitisvirus verläuft 55 schnell und irreversibel, so dass keinerlei Risiko von Leckschäden vorliegt, nachdem das Hepatitisvirus an die Zubereitungen gebunden ist. Die erfindungsgemäss verwendeten Zubereitungen mit Affinität zum Hepatitisvirus enthalten ein wasserdurchlässiges Matrixmaterial, z.B. ein wasserunlös-60 liches Gel in Gestalt eines hochmolekularen Kohlenhydrates oder eines Kunststoffes, gegebenenfalls mit einem Spacer* in der Matrix, woran ein hydrophober Ligand gebunden ist, welcher mit Vorteil eine Kohlenstoffkette von mehr als 7 Kohlenstoffatomen oder ein kondensiertes Ringsystem dar-65 stellt.

*Der in der Gelchromatographie (Affinitätchromatographie) gebräuchliche Ausdruck «Spacer» bedeutet eine Abstandsgruppe häufig mit 6 C-Atomen, die eine freie Car-

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boxyl- oder primäre Aminogruppe trägt.

Die aktiven Substanzen der beschriebenen Zubereitungen können erhalten werden durch Kuppeln eines passenden Liganden an das gelbildende Matrixmaterial.

Alle geprüften kovalenten Bindungen der Formeln:

-0-C-NH-; -0-C-NH-NH-; -NH-(CH2)2-6-NH-;

II II

NH NH

-C-0-NH-: -NH-CO-

erwiesen sich als äquivalent und beeinflussten die Wirksamkeit der Liganden in keiner Weise.

Auch die Art des wasserdurchlässigen Matrixmaterials, z.B. Polyamide, wie Polyacrylamid, ferner Kohlenhydratma-trices, wie Cellulose, Agarose, wobei diese polymeren Stoffe gegebenenfalls vernetzt sein können durch Bisepoxid, Glu-tardialdehyd, Divinylsulfon, Dibrompropanol, Epichlorhy-drin, ist von geringem Einfluss auf die Wirksamkeit des Liganden.

Entscheidend für die Affinität zum Hepatitisvirus ist dagegen der hydrophobe Charakter des Liganden, wie dies in der folgenden Tabelle gezeigt wird. Darin sind Versuchsergebnisse zusammengestellt über die Entfernung von Hepatitisvirus aus menschlichem Plasma, verseucht mit Hepatitis. In der Tabelle wird das Ausbringen von Hepatitisvirus aus hochgradig Au-positivem Humanplasma aufgezeigt. Bei den Versuchen wurde immer das gleiche Matrixmaterial verwendet und lediglich der Ligand daran variiert.

Die Affinität des Hepatitisvirus zur Zubereitung wurde getestet mittels den oben erwähnten immunologischen Testmethoden. Eine starke und vollständige Bindung von Hepatitisvirus an die Zubereitung wird aufgeführt als -, womit angedeutet werden soll, dass kein Hepatitisvirus nach der Behandlung in der Plasmaprobe gefunden werden kann. Die Bezeichnung + bedeutet die Gegenwart von unerheblichen Rückständen an Hepatitisvirus in der Plasmaprobe, wogegen die Bezeichnung + + angibt, dass nach der Behandlung im Plasma unveränderte oder höchstens leicht veränderte Mengen an Au-Antigen gefunden wurden.

Ligand-Kohlenstoffkette Au-Antigen in der Plasmaprobe nach Behandlung

In den Versuchen wurde immmer die gleiche Matrix «Sepharose 4B» (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) verwendet.

Hexylamin + +

Glycyl-norleucin + +

Glycyl-DL-phenylalanin + +

Cyclopentylamin + +

Cycloheptylamin + +

Phenyläthylamin + +

Hexamethylendiamin (Spacer)-benzoesäure + +

Hexamethylendiamin (Spacer)-heptancarbonsäure + +

Hexamethylendiamin (Spacer)-bernsteinsäure + +

Hexamethylendiamin (Spacer)-phthalsäure + + Octylamin Decylamin Dodecylamin Octadecylamin

Hexamethylendiamin (Spacer)-octylbernsteinsäure Cystamin (Spacer)-octylbernsteinsäure (Bsp. 11) Hexamethylendiamin (Spacer)-naphthylessigsäure (Bsp. 12)

Hexamethylendiamin (Spacer)-cholesterin hydrogensuccinat (Bsp. 13)

Hexamethylendiamin (Spacer)-cholsäure (Bsp. 14) Äthylendiamin (Spacer)-octylbernsteinsäure (Bsp.

1)

Butylendiamin (Spacer)-octylbernsteinsäure (Bsp.

1)

Hexamethylendiamin (Spacer)-octylbernsteinsäure (Bsp. 1)

Hexamethylendiamin

(Spacer)-dodecylbernsteinsäure (Bsp. 2)

Caprylhydrazid (Bsp. 3)

Tetradecylamin (Bsp. 6)

(2-Amino-dodecan) (Bsp. 7)

Äthylendiamin (Spacer)-undecen-10-säure (Bsp. 8)

Matrix im nachfolgenden Versuch: Polyacrylamid (Bio-Rad, Richmond, Californien, USA).

Propylen (Spacer)-decylamin (Bsp. 10)

Beispiel 1

Ausbringen von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an «Sepharose»-(Äthylendiamin-octylbernsteinsäure)-Kon-jugat

Herstellung des Gelderivats

Die Aktivierung von «Sepharose» wurde durchgeführt durch sorgfältiges Waschen von 100 ml geeignet sedimen-tierter «Sepharose 4B» (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) mit Wasser. Der Überschuss an Flüssigkeit wurde anschliessend abgesaugt, bevor das Gel übergeführt wurde in eine Lösung von 4 g Bromcyan in 100 ml destilliertem Wasser. Nach Stehenlassen zur Gleichgewichtseinstellung während 15 Minuten unter Rühren und Eiskühlung wurde die Gelsuspension beim pH-Wert 11,0 während 6 bis 7 Minuten aktiviert. Der pH-Wert wurde konstant gehalten durch Zufügen von 4-m Natriumhydroxid.

Zum Kuppeln mit Äthylendiamin wurde das aktivierte Gel auf einem Glasfilter gewaschen mit kalter 0,5-Natriumbicar-bonat-carbonatlösung vom pH-Wert 9,8, bevor es in Kontakt gebracht wurde mit einer Lösung von 10 g Äthylendiamin in 100 ml destilliertem Wasser, deren pH-Wert mit konzentrierter Salzsäure auf 9,8 eingestellt worden war. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rühren 20 Stunden lang bei Zimmertemperatur gehalten. Das derart erhaltene Gelprodukt wurde gründlich gewaschen.

25 ml einer wässrigen Suspension des erhaltenen Spacer-gels wurden suspendiert in 20 ml Dioxan. Eine frische Lösung von 6 g Octylbernsteinsäureanhydrid in 60 ml Dioxan wurde tropfenweise unter Rühren bei Zimmertemperatur hinzugegeben. Der pH-Wert wurde zwischen 7,5 und 8 durch Zugabe von verdünnter Natriumhydroxidlösung gehalten. Das Adsorbens wurde gründlich gewaschen mit Dioxan, Dioxan/Wasser 2:1, Wasser, 1-M Natriumchlorid und einem Puffer, bestehend aus 0,05-M TRIS, 0,02-M Natri-umcitrat und 0,10-M Natriumchlorid vom pH-Wert 7,5. Im Nachfolgenden wird dieser Puffer als Testpuffer bezeichnet. Die Kupplungsausbeute bezogen auf Octylbernsteinsäure wurde getestet vermittels protonmagnetischer Resonanz (HA 100) und zu 4,8% befunden.

Anstelle von Äthylendiamin können auch mit gleichen Ergebnissen 1,4-Diaminobutan oder 1,6-Diaminohexan verwendet werden.

Au-Antigentest

Eine Menge von Au-Antigen-positivem Plasma mit einem s

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Titer von 1:64 gemäss IEOP und 1:32 gemäss ID wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Die Titerwerte werden angegeben in bezug auf einen Standard-Antigen.

In jedes von 6 Teströhrchen wurden 2 ml Au-Antigen-posi-tives Plasma und 2 ml einer Suspension von drei Teilen völlig sedimentiertem Adsorbens im Gleichgewicht mit Testpuffer und ein Teil dieses Puffers hinzugegeben. Die Proben wurden 1,2,5,10,20 und 30 Minuten lang geschüttelt und die Gele nachher durch Zentrifugieren abgetrennt. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden getestet auf Au-Antigen und erwiesen sich als negativ im Test ID, IEOP und Hepanosticon.

Beispiel 2

Ausbringen von Au-Antigen aus Plasma vermittels Adsorption an «Sepharose»-Hexamethylendiamin-dodecyl-bernsteinsäure-Konjugat

Herstellung des Gelderivates

Zur Vernetzung von «Sepharose» wurden 100 ml des Gels gemischt mit 2 ml Epichlorhydrin und 0,5 g Natriumborhydrid. Das Gemisch wurde gründlich geschüttelt bei 60°C während einer Stunde. Nachher wurde das Gel ausgiebig gewaschen mit warmem Wasser und gemischt mit einer Lösung von 0,2 g Natriumborhydrid, gelöst in 50 ml 2-M Natriumhydroxid. Das Gemenge wurde im Autoklaven eine Stunde lang auf 120°C erwärmt. Nachher wurde das Gel gewaschen mit einer alkalischen Natriumborhydridlösung. Nun wurde konzentrierte Essigsäure langsam hinzugefügt, bis der pH-Wert des Gemisches ungefähr 4 erreichte. Schliesslich wurde das Gel mit einem beträchtlichen Volumen Wasser gewaschen.

Die Herstellung des «Sepharose»-Hexamethylendiamin-Spacergels wurde durchgeführt gemäss Beispiel 1.

25 ml des erhaltenen Spacergels wurden aufgebracht auf ein Glasfilter und gewaschen mit Dioxan/Wasser 2:1. Nachher wurde trockengesaugt und das Gel anschliessend in eine frische Lösung von 1 g Dodecylbernsteinsäure, 1,5 g wasserlösliches Carbodiimid, N-Cyclohexyl-N'-[ß-(N-meth-ylmorpholinoäthyl)]-carbodiimid-p-toluolsulfonat in 60 ml Dioxan/Wasser (2:1) gebracht. Das Gemenge wurde bei Zimmertemperatur eine Stunde lang gerührt, bevor es wieder auf ein Glasfilter gebracht und darauf gründlich gewaschen wurde mit Dioxan, Dioxan/Wasser 2:1,1-M Natriumchlorid, Wasser und dem Testpuffer.

Die Kupplungsausbeute, bezogen auf die verwendete Fettsäure, erwies sich im Test vermittels protonmagnetischer Resonanz (HA 100) zu 2,0%.

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma vom Titer 1:128 gemäss ID und IEOP wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Eine Säule (d = 1,6 h = 1,0 cm) wurde gepackt mit dem Gelderivat, welches sich im Gleichgewicht mit dem Testpuffer befand. 7 ml Au-Antigen-positives Plasma wurden durch die Säule gepumpt mit einer Durchflussrate von 5 ml/Stunde. Testpuffer wurde aufgepumpt bis kein weiteres Proteinmaterial mehr eluiert wurde, was vermittels UV-Scanning geprüft wurde. Die vereinigten Eluate erwiesen sich als negativ gegenüber ID, IEOP und Hepanosticon. Vermittels Druckdialyse wurde das Eluat zehnmal konzentriert und erwies sich dann immer noch als negativ in den Hepatitistests.

Beispiel 3

Ausbringen von Au-Antigen aus Plasma vermittels Adsorption an «Sepharose»-Caprylhydrazid-Konjugat

Herstellung des Gelderivates

Äthylcaprylat wurde übergeführt in das entsprechende

Hydrazid vermittels Hydrozinolyse. 10 ml des Äthylesters wurden gemischt mit 10 ml 98%igem Hydrazinhydrat. Es wurden 22 ml Äthanol als Lösungsmittel hinzugefügt, bis das Reaktionsgemisch aufklarte, wonach die Lösung bei Zimmertemperatur 15 Stunden lang stehen gelassen wurde. Das auskristallisierte Hydrazid wurde abfiltriert und gewaschen mit Eiswasser und anschliessend mit Methanol 1:1 bei Zimmertemperatur.

«Sepharose 4B» wurde aktiviert gemäss Beispiel 1.

Das Gel wurde gewaschen mit einer Lösung des Kupplungsagens und im Vakuum filtriert. Die Kupplung wurde durchgeführt durch Überführen des aktivierten Gels in 100 ml einer gesättigten Lösung von Caprylhydrazid, aufgelöst in Dimethylformamid (DMF) und 0,2-M Natriumdicarbonat 1:1. Der pH-Wert blieb während der Kupplungsreaktion unverändert, wobei die Reaktion unter Rühren bei Zimmertemperatur 15 Stunden lang dauern gelassen wurde. Das erhaltene Produkt wurde gründlich gewaschen mit DMF, DMF/Wasser 1:1,1-M Natriumchlorid, Wasser und Test-puffer.

Die Kupplungsausbeute, bezogen auf Hydrazid, wurde getestet vermittels protonmagnetischer Resonanz (HA 100) und erwies sich zu 2,3%.

Au-Antigentest

Ein Au-Antigen-positives Plasma vom Titer 1:128 gemäss ID und IEOP wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Zu 2 ml einer Suspension, bestehend aus 3 Teilen gründlich sedimentiertem Adsorbens im Gleichgewicht mit Testpuffer und einem Teil dieses Puffers wurde hinzugefügt zu 2 ml Au-Antigen-positivem Plasma. Das Gemisch wurde milde geschüttelt während 30 Minuten, worauf das Gel abzentrifu-giert wurde. Die überstehende Flüssigkeit erwies sich im Au-Antigentest gemäss ID, IEOP und Hepanosticon als negativ.

Beispiel 4

Ausbringen von Au-Antigen aus Albuminlösung vermittels Adsorption an «Sepharose»-(Äthylendiamin-octylbern-steinsäure)-Konjugat

Herstellung des Gelderivates

Das Gelkonjugat wurde hergestellt gemäss Beispiel 1.

Au-Antigentest

Eine Au-Antigen-positive Albuminlösung vom Titer 1:64 gemäss ID und IEOP und erhalten durch Fraktionieren von Au-Antigen-positivem Plasma wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Die Adsorption wurde ansatzweise gemäss Beispiel 3 durchgeführt. Die überstehende Lösung wurde getestet auf Au-Antigen und erwies sich als negativ im Test mit ID-IEOP und Hepanosticon.

Beispiel 5

Ausbringen von Au-Antigen aus einem Koagulations-faktor-Konzentrat durch Adsorption an «Sepharose»-(Äthy-lendiamin-octylbernsteinsäure)-Konjugat

Herstellung des Gelderivates

Das Gelkonjugat wurde hergestellt gemäss Beispiel 1.

Au-Antigentest

Ein Au-Antigen-positives Plasma wurde verwendet zur Fraktionierung eines Konzentrates, enthaltend die Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X. Eine l%ige Proteinlösung wurde hergestellt und zeigte einen Au-Antigentiter von 1:32 gemäss ID. Auf ein Glasfilter, welches ein Bett von 5 ml des Gelderivates im Gleichgewicht mit Testpuffer trug, wurden 10 ml der Proteintestlösung hinzugefügt und das Gel gewa-

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sehen mit dreimal je 5 ml Testpuffer. Die Eluate wurden getestet auf Au-Antigen gemäss ID, IEOP und Hepanosticon und erwiesen sich als negativ.

Beispiel 6

Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an «Sepharose»-Tetradecylamin-Konjugat

Herstellung des Gelderivates

«Sepharose» wurde aktiviert gemäss Beispiel 1.

Zur Kupplung wurden 100 ml «Sepharose», die mit Brom-eyan aktiviert war, und die in Gleichgewicht gebracht worden war mit 95% Äthanol und trockengesaugt, hinzugefügt zu einer Lösung von 22 g Tetradecylamin in 100 ml 95%igem Äthanol. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur 48 Stunden lang gerührt. Dann wurde das Gel gründlich gewaschen mit warmem 95%igem Äthanol, wässrigem Äthanol 1:1,1-M Natriumchlorid, Wasser und Testpuffer. Getestet mit protonmagnetischer Resonanz (HA 100) zeigte sich eine Kupplungsausbeute von 4,3%.

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma vom Titer 1:128 entsprechend ID und IEOP wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Auf ein Glasfilter, welches 10 ml des Gelderivates im Gleichgewicht mit Testpuffer trug, wurden 35 ml Plasma aufgegeben. Das Material wurde gewaschen mit dreimal je 10 ml Testpuffer und die Eluate wurden getestet auf Au-Antigen. Sie erwiesen sich als negativ im Test ID, IEOP, Hepanosticon und Ausria.

Beispiel 7

Ausbringen von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an «Sepharose»-(2-Aminododecan)-Konjugat

Herstellung des Gelderivates

Dodecanon-(2) wurde übergeführt in das entsprechende Amin durch Reaktion mit Hydroxylamin und katalytische Hydrierung des so erhaltenen Oxims sowie Abtrennen von Wasser. Die verwendete «Sepharose» wurde erhalten gemäss Beispiel 1.

Zur Kupplung wurden 100 ml von mit Bromcyan aktiviertem Gel nach Waschen mit 95%igem Äthanol und Trok-kensaugen hinzugegeben zu einer Lösung von 10 g 2-Amino-dodecan in 100 ml 95%igem Äthanol. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur 48 Stunden lang gerührt, wonach das Gel gründlich gewaschen wurde mit warmem 95%igem Äthanol, wässrigem Äthanol 1:1,1-M Natriumchlorid, Wasser und Testpuffer. Die Kupplungsausbeute betrug im Test mit protonmagnetischer Resonanz 1,0%.

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma vom Titer 1:128 gemäss ID und IEOP wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Der Test wurde durchgeführt gemäss Beispiel 3 und die überstehende Flüssigkeit erwies sich als negativ im Test ID, IEOP und Hepanosticon.

Beispiel 8

Ausbringen von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an «Sepharose»-(Äthylendiamin-undecen-(10)-säure)-Kon-jugat

Herstellung des Gelderivates

Das «Sepharose»-Äthylendiamin wurde erhalten gemäss Beispiel 1. Zu einer frischen Lösung von 1,85 g Undecylen-säure und 2,1 g Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 100 ml Dioxan, wurden 100 ml «Sepharose»-Äthylendiamin-Kon-

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jugat hinzugefügt, worauf Gleichgewichtseinstellung mit Dioxan und Vakuumfiltration erfolgte. Die Gelsuspension wurde 15 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt, nachher gewaschen mit Dioxan, Dioxan/Wasser 1:1,1-M Natriumchlorid und Testpuffer. Die Kupplungsausbeute, bezogen auf die Fettsäure, erwies sich mittels protonmagnetischer Resonanz zu 2,3%.

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma vom Titer 1:128 nach ID und IEOP wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Der Test wurde durchgeführt gemäss Beispiel 3. Die überstehenden Flüssigkeiten erwiesen sich als Au-Antigen-negativ im Test ID, IEOP und Hepanosticon.

Beispiel 9

Ausbringen von Au-Antigen aus Plasminogen-Konzentrat durch Adsorption an «Sepharose»-Caprylhydrazid-Kon-jugat

Herstellung des Gelderivates

Das Gelkonjugat wurde erhalten gemäss Beispiel 3.

Au-Antigentest

Zu 2 ml einer Plasminogenlösung wurden 0,5 ml hoch-Au-positives Plasma hinzugefügt, welches Gemisch sich als hoch-Au-positiv gemäss ID und Ausria erwies. Das Gemisch wurde passiert durch eine 4 cm Säule, die gepackt war mit 10 ml Gelkonjugat im Gleichgewicht mit Testpuffer. Die Fraktionen wurden gesammelt und getestet. Das Plasminogen-enthaltende Eluat erwies sich als negativ im Test ID und Ausria.

Beispiel 10

Ausbringen von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption anPolyacrylamid-(propylen-decylamin)-Konjugat

Herstellung des Gelderivates

Polyacrylamid «Biogel P 300» (Bio-Rad, Richmond, California, USA) wurde in Wasser gequollen und nachher gründlich gewaschen mit 0,05-M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,0. Zur Aktivierung wurden 20 ml der Gelsuspension im Puffer (0,5 g trockenes Gel pro 25 ml Puffer), gemischt mit 5,0 ml Glutardialdehyd und inkubiert bei 37°C während 18 Stunden. Hernach wurde das Gel gründlich gewaschen mit Dioxan, Dioxan/Wasser 3:2, Wasser und Testpuffer.

Die Verbindung wurde erreicht durch Zugabe von Trok-kengel zu einer Lösung von 3 g Decylamin in 30 ml Dioxan/ Wasser (60/40 Vol.%) vom pH-Wert 8. Das Gemisch wurde dann unter Rühren bei 4°C während 18 Stunden gehalten, und hernach wurde das Gel mit Dioxan, Dioxan/Wasser (60/40 Vol.%), Wasser und Testpuffer gewaschen.

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma vom Titer 1:128 nach ID und IEOP wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Der Test wurde durchgeführt gemäss Beispiel 3. Die überstehenden Lösungen erwiesen sich als Au-negativ gemäss ID, IEOP und Hepanosticon.

Beispiel 11

Ausbringen von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an «Sepharose»-(Cysteamin-octylbernsteinsäure)-Konjugat

Herstellung des Gelderivates

Das «Sepharose»-Cysteamin wurde erhalten durch Reduktion von «Sepharose»-Cysteamin, welches hergestellt

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wurde gemäss Beispiel 2 mit 0,05-M Mercaptoäthanol in 0,1 -M Carbonatpuffer vom pH-Wert 8,5 während einer Stunde. Das Gel wurde gründlich gewaschen mit dem Carbonatpuffer, Wasser und schliesslich Dioxan. Zu einer Lösung von 1,2 g Octylbernsteinsäure in 40 ml Dioxan wurde eine Lösung von 1,84 g Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Dioxan und 25 ml «Sepharose»-Cysteamin hinzugefügt. Nach zwei Stunden Rühren bei Zimmertemperatur wurden weitere 1,84 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Zwei Stunden später wurde das Gel gewaschen mit Dioxan. Die Reaktion wurde wiederholt und anschliessend wurde gründlich gewaschen mit Dioxan, Dioxan/Wasser, Wasser und 0,1 -M Carbonat vom pH-Wert 8,5. Restliche Thiolgruppen wurden blockiert durch Behandlung des Gels mit 60 mg Jodacetamid während 45 Minuten. Schliesslich wurde das Gel gewaschen mit Testpuffer.

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma vom Titer 1:32 nach ID wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Die Adsorption wurde anteilweise durchgeführt gemäss Beispiel 3. Die überstehenden Lösungen wurden getestet auf Au-Antigen und erwiesen sich als negativ in den Testen ID, IEOP und Hepanosticon.

Beispiel 12

Ausbringen von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an «Sepharose»-(Hexamethylendiamin-naphthyl-1 -essig-säure)-Konjugat

Herstellung des Gelderivates

Das «Sepharose»-Hexamethylendiamin wurde hergestellt gemäss Beispiel 1.

25 ml des erhaltenen Spacergels wurden aufgebracht auf ein Glasfilter und gewaschen mit Dioxan/Wasser 3:2. Anschliessend wurde trockengesaugt und das Gel übergeführt in eine frische Lösung von 1,1g Naphthyl-l-essigsaure in 30 ml Dioxan/Wasser 3:2. Zur Gelsuspension wurden 2,65 wasserlösliches Carbodiimid, N-Cyclohexyl-N'-[ß-(N-meth-ylmorpholinäthyl)]-carbodiimid-p-toluolsulfonat hinzugegeben, wobei gerührt wurde und der pH-Wert mit verdünnter Salzsäure auf 4,8 eingestellt wurde. Nach einer Stunde bei Zimmertemperatur wurden 2,65 g wasserlösliches Carbodiimid ein zweites Mal hinzugegeben. Das Gemisch wurde eine weitere Stunde lang gerührt bevor es aufgebracht wurde auf ein Glasfilter und darauf gründlich gewaschen wurde mit Dioxan, Dioxan/Wasser 3:2,1-M Natriumchlorid und Wasser und Testpuffer. Die Kupplungsausbeute bezogen auf Naphthyl-l-essigsäure betrug 3,0% im protonmagnetischen Resonanztest (HA 100).

Au-Antigentest

Ein Au-Antigen-positives Plasma vom Titer 1:32 nach ID und vom Titer 1:64 nach IEOP wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Die Adsorption wurde ansatzweise durchgeführt gemäss Beispiel 3. Die überstehende Flüssigkeit wurde getestet auf Au-Antigen und erwies sich als negativ in den Tests ID, IEOP und Hepanosticon.

Beispiel 13

Ausbringen von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an «Sepharose»-(Hexamethylendiamin-cholesterin-hydro-gensuccinat)-Konjugat

Herstellung des Gelderivates

Das «Sepharose»-Hexamethylendiamin wurde erhalten gemäss Beispiel 1.

20 ml des erhaltenen Spacergels wurden aufgebracht auf ein Glasfilter und gewaschen mit Dioxan, 10%igem Triäthyl-amin in Dioxan und erneut mit Dioxan. Nachher wurde trok-kengesaugt und das Gel eingebracht in eine frische Lösung von 0,5 g Cholesterin-hydrogensuccinat in 25 ml Dioxan. Die Reaktion wurde gestartet durch Zugabe von 0,35 g Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 1 ml Dioxan. Die Kupplung wurde durchgeführt unter Rühren bei Zimmertemperatur. Nach zwei Stunden wurde eine zusätzliche Portion Carbodiimid hinzugefügt. Zwei Stunden später wurde das gekuppelte Gel gründlich gewaschen mit Dioxan, Dioxan/Wasser, Wasser und schliesslich mit Testpuffer.

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma vom Titer 1:64 gemäss ID und 1:128 gemäss IEOP wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Die Adsorption wurde ansatzweise durchgeführt gemäss Beispiel 3. Die überstehende Lösung wurde getestet auf Au-Antigen und erwies sich negativ in den Tests ID, IEOP und Hepanosticon.

Beispiel 14

Ausbringen von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an «Sepharose»-(Hexamethylendiamin-cholsäure)-Konjugat

Herstellung des Gelderivates

Das «Sepharose»-Hexamethylendiamin wurde erhalten gemäss Beispiel 1. Die Kupplung der Cholsäure an das Spa-cergel wurde durchgeführt gemäss Beispiel 13 mit der Ausnahme, dass 0,5 g Cholsäure aufgelöst wurden in 100 ml Dioxan.

Die Kupplungsausbeute, bezogen auf Cholsäure, erwies sich zu 5,8% im protonmagnetischen Resonanztest (HA 100).

Au-Antigentest

Au-Antigen-positives Plasma vom Titer 1:32 nach ID wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Die Adsorption wurde portionenweise durchgeführt gemäss Beispiel 3. Die überstehende Lösung wurde getestet auf Au-Antigen und erwies sich negativ in den Tests ID, IEOP und Hepanosticon.

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Claims

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1. Verwendung von Zubereitungen mit Affinität zum Hepatitisvirus, die ein wasserdurchlässiges Matrixmaterial, gegebenenfalls mit darin einverleibtem Spacer, enthalten, woran ein hydrophober Ligand gebunden ist, zur Entfremdung oder Konzentrierung von Hepatitisviren aus bzw. in Gemischen biologischen Materials, dadurch gekennzeichnet, dass man das mit den Hepatitisviren verunreinigte Material mit der Zubereitung in Kontakt bringt.

2. Verwendung nach Anspruch 1 einer Zubereitung, die in kovalenter Bindung eine der Gruppen

-0-C-NH-; -0-C-NH-NH-; -NH-(CH2)2-6-NH;

NH

-CO-NH-; -NH-CO- enthält.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 einer Zubereitung, in welcher das wasserdurchlässige Matrixmaterial ein hochmolekulares Kolenhydrat oder Polyamid, vorzugsweise vernetzt mit Bisepoxid, Glutardialdehyd, Divinylsulfon, Dibrompropanol oder Epichlorhydrin, ist.

4. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche einer Zubereitung, in welcher das wasserdurchlässige Matrixmaterial ein Konjugat von dreidimensional ver-netzter Agarose, vorzugsweise vernetzt mit Äthylendiamin-octylbernsteinsäure, Hexamethylendiamin, Dodecylbern-steinsäure, Caprylhydrazid, Tetradexylamin, 2-Aminodo-decan, Äthylendiamin-undecen-(10)-säure, Cysteamin-octyl-bernsteinsäure, Hexamethylendiamin-naphthyl-1 -essigsäure, Hexamethylendiamin-cholesterinhydrogensuccinat oder mit Hexamethylendiamin-cholsäureist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3 einer Zubereitung, in welcher das wasserdurchlässige Matrixmaterial ein Konjugat eines vernetzten Polyacrylamids, vorzugsweise vernetzt mit Propylen-decylamin, ist.

6. Verwendung nach Anspruch 1 einer Zubereitung, in welcher der hydrophobe Ligand eine Kohlenstoffkette mit mehr als

7 Kohlenstoffatomen aufweist oder ein kondensiertes Ringsystem ist.