JP2852307B2 - ウイルスの除去された蛋白質製剤の製造法 - Google Patents
ウイルスの除去された蛋白質製剤の製造法Info
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- JP2852307B2 JP2852307B2 JP1030312A JP3031289A JP2852307B2 JP 2852307 B2 JP2852307 B2 JP 2852307B2 JP 1030312 A JP1030312 A JP 1030312A JP 3031289 A JP3031289 A JP 3031289A JP 2852307 B2 JP2852307 B2 JP 2852307B2
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- virus
- protein
- protein preparation
- hydrophobic carrier
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は医療用蛋白質製剤の製造方法に関する。さら
に詳しくは、本発明は脂質性のエンベロープ（以下、脂
質膜という）を有するウイルスを実質的に夾雑しない医
療用蛋白質製剤の製造法に関する。
に詳しくは、本発明は脂質性のエンベロープ（以下、脂
質膜という）を有するウイルスを実質的に夾雑しない医
療用蛋白質製剤の製造法に関する。
ウイルスの混入している恐れのある原料から医薬品を
製造しようとする場合、その製造工程中にウイルスを不
活化するか、除去するための工程を組み込むことが必要
である。ウイルス不活化の方法としては、液状または乾
燥状態で加熱処理を行って不活化する方法、紫外線照射
によって不活化する方法、β−プロピオノラクトン等で
化学修飾して不活化する方法等が知られている。また、
ウイルスを除去する方法としては、ウイルス粒子の大き
さに着目し、一定のポアサイズをもった膜で除去する方
法、ポリエチレングリコールのように分子量の大きなも
ので沈澱除去させることによって除去する方法がある。
製造しようとする場合、その製造工程中にウイルスを不
活化するか、除去するための工程を組み込むことが必要
である。ウイルス不活化の方法としては、液状または乾
燥状態で加熱処理を行って不活化する方法、紫外線照射
によって不活化する方法、β−プロピオノラクトン等で
化学修飾して不活化する方法等が知られている。また、
ウイルスを除去する方法としては、ウイルス粒子の大き
さに着目し、一定のポアサイズをもった膜で除去する方
法、ポリエチレングリコールのように分子量の大きなも
ので沈澱除去させることによって除去する方法がある。
ところで、現在医療上特に問題となっているウイルス
は、HIV（エイズウイルス）、HBウイルス、非Ａ非Ｂ肝
炎ウイルス等の脂質膜を有するウイルスであり、これら
ウイルスはいずれも蛋白質製剤、特に血漿蛋白質製剤、
尿由来製剤においてその夾雑が危惧され、上記の処理に
よっては当該ウイルスは十分不活化ないしは除去するこ
とができない場合がある。
は、HIV（エイズウイルス）、HBウイルス、非Ａ非Ｂ肝
炎ウイルス等の脂質膜を有するウイルスであり、これら
ウイルスはいずれも蛋白質製剤、特に血漿蛋白質製剤、
尿由来製剤においてその夾雑が危惧され、上記の処理に
よっては当該ウイルスは十分不活化ないしは除去するこ
とができない場合がある。
従って、本発明の目的は当該ウイルスを蛋白質製剤か
ら、効率的に、かつ有効に除去することによって安全な
医療用蛋白質製剤を提供することである。
ら、効率的に、かつ有効に除去することによって安全な
医療用蛋白質製剤を提供することである。
上記目的は本発明、即ち医療用蛋白質製剤の製造に際
して、脂質膜を有するウイルスを夾雑する可能性ある蛋
白を疎水性担体によって処理することによって達成され
る。
して、脂質膜を有するウイルスを夾雑する可能性ある蛋
白を疎水性担体によって処理することによって達成され
る。
本発明は脂質膜を有するウイルスが特異的に疎水性担
体に吸着する性質を利用したものである。
体に吸着する性質を利用したものである。
（１） 出発原料 本発明が適用される出発原料は、当該ウイルスの夾雑
が危惧される蛋白質であり、例えば人血漿蛋白質、尿由
来蛋白質が例示される。人血漿蛋白質としては、例えば
血液凝固因子、アルブミン、免疫グロブリン、ハプトグ
ロビン、アンチトロンビンIII等が例示され、尿由来蛋
白質としては、例えばウロキナーゼ、カリクレイン、ト
リプシンインヒビター等が例示されるが、本発明の処理
対象はこれら蛋白質に限定されるものではなく、広く当
該ウイルスの夾雑が危惧される蛋白質である。
が危惧される蛋白質であり、例えば人血漿蛋白質、尿由
来蛋白質が例示される。人血漿蛋白質としては、例えば
血液凝固因子、アルブミン、免疫グロブリン、ハプトグ
ロビン、アンチトロンビンIII等が例示され、尿由来蛋
白質としては、例えばウロキナーゼ、カリクレイン、ト
リプシンインヒビター等が例示されるが、本発明の処理
対象はこれら蛋白質に限定されるものではなく、広く当
該ウイルスの夾雑が危惧される蛋白質である。
本発明の処理は、蛋白質製剤の製造工程の任意の工程
において実施するばよいが、最終工程付近で行うことが
効率上好ましい。
において実施するばよいが、最終工程付近で行うことが
効率上好ましい。
（２） 対象とされるウイルス 本発明において除去の対象とされるウイルスは脂質膜
を有するウイルスであり、特にウイルスの表面膜を脂質
性の膜によって構成されているウイルスをいい、具体的
にはVSV、ヘルペスシンプレックス、CHV、シンドビス、
ムンプス、ワクチニア、Measle、Rubella、インフルエ
ンザ、ヘルペスゾスター、サイトメガロ、パラ−インフ
ルエンザ、EB、HIV、HA、HB、NANB、ALT等が例示され
る。
を有するウイルスであり、特にウイルスの表面膜を脂質
性の膜によって構成されているウイルスをいい、具体的
にはVSV、ヘルペスシンプレックス、CHV、シンドビス、
ムンプス、ワクチニア、Measle、Rubella、インフルエ
ンザ、ヘルペスゾスター、サイトメガロ、パラ−インフ
ルエンザ、EB、HIV、HA、HB、NANB、ALT等が例示され
る。
（３） 疎水性担体 本発明で使用される疎水性担体は、疎水性のリガンド
をもつ担体であれば特に制限はなく、たとえばブチル
基、プロピル基等のアルキル基、フェニル基等のアリル
基等の基を有するものが例示され、具体的には、親水性
ビニルポリマーを基材としてブチル基又はフェニル基を
導入した疎水性担体が挙げられる。より具体的には、ブ
チル・トヨパール（商標）およびフェニル・トヨパール
（商標）等が挙げられる。ブチル・トヨパール（商標）
およびフェニル・トヨパール（商標）は、東ソー（株）
製である。
をもつ担体であれば特に制限はなく、たとえばブチル
基、プロピル基等のアルキル基、フェニル基等のアリル
基等の基を有するものが例示され、具体的には、親水性
ビニルポリマーを基材としてブチル基又はフェニル基を
導入した疎水性担体が挙げられる。より具体的には、ブ
チル・トヨパール（商標）およびフェニル・トヨパール
（商標）等が挙げられる。ブチル・トヨパール（商標）
およびフェニル・トヨパール（商標）は、東ソー（株）
製である。
（４） 処理条件 （ａ）担体の前処理 本発明の疎水性担体による処理を行うに際しては、当
該処理前に、疎水性担体に対して前処理が行われている
ことが好ましい。当該前処理としては、通常緩衝液によ
る処理が例示される。前処理緩衝液としては、具体的に
は食塩水、リン酸緩衝液、硫安溶液等が例示され、より
具体的には前記緩衝液にて0.1〜4M、特に好ましくは3M
の濃度にて前もって平衡化された疎水性担体が使用され
る。
該処理前に、疎水性担体に対して前処理が行われている
ことが好ましい。当該前処理としては、通常緩衝液によ
る処理が例示される。前処理緩衝液としては、具体的に
は食塩水、リン酸緩衝液、硫安溶液等が例示され、より
具体的には前記緩衝液にて0.1〜4M、特に好ましくは3M
の濃度にて前もって平衡化された疎水性担体が使用され
る。
（ｂ）処理条件 処理対象である蛋白の塩濃度は前記と同様の緩衝液に
て、特に好ましくは食塩で、２〜4M、特に好ましくは3M
程度に調整し、pH6.5〜8.5、好ましくはpH7.5程度とし
た後、前記の通り平衡化処理した疎水性担体を充填した
カラムにアプライする。そして２〜4M、特に好ましくは
3Mの食塩溶液等の前記の如き緩衝液で目的物を通過画分
に回収し、脂質膜を有するウイルスを疎水性担体に吸着
させる。
て、特に好ましくは食塩で、２〜4M、特に好ましくは3M
程度に調整し、pH6.5〜8.5、好ましくはpH7.5程度とし
た後、前記の通り平衡化処理した疎水性担体を充填した
カラムにアプライする。そして２〜4M、特に好ましくは
3Mの食塩溶液等の前記の如き緩衝液で目的物を通過画分
に回収し、脂質膜を有するウイルスを疎水性担体に吸着
させる。
（ｃ）後処理 ウイルスを吸着した疎水性担体は、例えば食塩を除い
た0.02Mクエン酸緩衝液等で充分洗浄することによって
再生することができる。
た0.02Mクエン酸緩衝液等で充分洗浄することによって
再生することができる。
（６） 精製 当該ウイルスの除去された非吸着画分からの目的とす
る蛋白質の回収は常套手段によって行えばよく、例えば
次の如き方法が例示される。即ち、当該処理後、蛋白質
を含有する組成物を、例えばアフィニティークロマトグ
ラフィーで処理する。アフィニティークロマトグラフィ
ーによって夾雑物、特に非脂質膜性のウイルス、エコー
ウイルス、パルボウイルス等が除去される。アフィニテ
ィークロマトグラフィーは蛋白質の種類によって適宜に
選択される。例えばアンチトロンビン−IIIの場合には
固定化へパリンが使用される。
る蛋白質の回収は常套手段によって行えばよく、例えば
次の如き方法が例示される。即ち、当該処理後、蛋白質
を含有する組成物を、例えばアフィニティークロマトグ
ラフィーで処理する。アフィニティークロマトグラフィ
ーによって夾雑物、特に非脂質膜性のウイルス、エコー
ウイルス、パルボウイルス等が除去される。アフィニテ
ィークロマトグラフィーは蛋白質の種類によって適宜に
選択される。例えばアンチトロンビン−IIIの場合には
固定化へパリンが使用される。
実施例１ アンチトロンビン−IIIを含む溶液にVSVを添加し、食
塩3Mに調製後、食塩3Mで平衡化したブチル・トヨパール
にアプライした。その結果、第１表および第１図に示す
ように、アンチトロンビン−IIIは通過画分に素通り
し、VSVは通過画分には検出されなかった。そして、バ
ッファーから食塩を除去した0.02Mのクエン酸緩衝液で
洗浄することにより、吸着していたVSVが初めて溶出さ
れた。通過画分を脱塩・濃縮した後、凍結乾燥すること
によってアンチトロンビン−III凍結乾燥を得た。
塩3Mに調製後、食塩3Mで平衡化したブチル・トヨパール
にアプライした。その結果、第１表および第１図に示す
ように、アンチトロンビン−IIIは通過画分に素通り
し、VSVは通過画分には検出されなかった。そして、バ
ッファーから食塩を除去した0.02Mのクエン酸緩衝液で
洗浄することにより、吸着していたVSVが初めて溶出さ
れた。通過画分を脱塩・濃縮した後、凍結乾燥すること
によってアンチトロンビン−III凍結乾燥を得た。
一方、アンチトロンビン−IIIを含む溶液に脂質膜を
含まないエコーウイルスを添加し、同様にして操作した
ところ、第２表および第２図に示すように、エコーウイ
ルスは通過画分にもかなりの量が検出されカラムよりだ
らだらと溶出された。
含まないエコーウイルスを添加し、同様にして操作した
ところ、第２表および第２図に示すように、エコーウイ
ルスは通過画分にもかなりの量が検出されカラムよりだ
らだらと溶出された。
〔効果〕 上記実験例からも明らかなように、本発明の処理によ
って、蛋白質製剤から脂質膜を有するウイルスが効率的
に、かつ有効に除去され、従って本発明によって安全な
医療用蛋白質製剤が提供されるという効果がもたらされ
る。
って、蛋白質製剤から脂質膜を有するウイルスが効率的
に、かつ有効に除去され、従って本発明によって安全な
医療用蛋白質製剤が提供されるという効果がもたらされ
る。
第１図は本発明処理によるアンチトロンビン−IIIと脂
質膜をもつウイルスとの分離状況を示すグラフであり、
第２図はアンチトロンビン−IIIと非脂質膜性ウイルス
との分離状況を示すグラフである。 第１図中、●は脂質膜をもつウイルスのウイルス感染価
を、○はアンチトロンビン−IIIの溶出パターンを示
し、第２図中、●はエコーウイルスのウイルス感染価
を、○はアンチトロンビン−IIIの溶出パターンを示
す。
質膜をもつウイルスとの分離状況を示すグラフであり、
第２図はアンチトロンビン−IIIと非脂質膜性ウイルス
との分離状況を示すグラフである。 第１図中、●は脂質膜をもつウイルスのウイルス感染価
を、○はアンチトロンビン−IIIの溶出パターンを示
し、第２図中、●はエコーウイルスのウイルス感染価
を、○はアンチトロンビン−IIIの溶出パターンを示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 武智 和男 大阪府枚方市招提大谷２―1180―１ 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 横山 和正 大阪府枚方市招提大谷２―1180―１ 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭52−10416（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−51116（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 38/00 - 38/58
Claims (4)
- 【請求項１】医療用蛋白質製剤の製造に際して、ウイル
スの夾雑可能性のある蛋白質溶液の塩濃度を２〜4Mに調
整し、疎水性担体にウイルスを吸着させ、目的蛋白質を
通過画分に回収することを特徴とする脂質性のエンベロ
ープを有するウイルスが実質的に除去された医療用蛋白
質製剤の製造法。 - 【請求項２】ウイルスの夾雑可能性のある蛋白質溶液が
pH6.5〜8.6であることを特徴とする請求項１記載の製造
法。 - 【請求項３】疎水性担体がアルキル基またはアリル基を
有する疎水性担体である請求項１または２記載の製造
法。 - 【請求項４】蛋白質がアンチトロソビン−IIIである請
求項１〜３のいずれかに記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1030312A JP2852307B2 (ja) | 1989-02-09 | 1989-02-09 | ウイルスの除去された蛋白質製剤の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1030312A JP2852307B2 (ja) | 1989-02-09 | 1989-02-09 | ウイルスの除去された蛋白質製剤の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02209814A JPH02209814A (ja) | 1990-08-21 |
| JP2852307B2 true JP2852307B2 (ja) | 1999-02-03 |
Family
ID=12300269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1030312A Expired - Lifetime JP2852307B2 (ja) | 1989-02-09 | 1989-02-09 | ウイルスの除去された蛋白質製剤の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2852307B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008120801A1 (ja) | 2007-04-02 | 2008-10-09 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | アンチトロンビン組成物の製造方法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1712284B1 (en) * | 2005-04-15 | 2012-10-10 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Cell separation method using hydrophobic solid supports |
| US8158411B2 (en) | 2006-08-21 | 2012-04-17 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method of separating microorganism using nonplanar solid substrate and device for separating microorganism using the same |
| US20080070282A1 (en) * | 2006-08-21 | 2008-03-20 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method and device for obtaining or amplifying nucleic acid from a cell using a nonplanar solid substrate |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL49752A (en) * | 1975-07-09 | 1979-07-25 | Kabi Ab | Compositions having affinity for hepatitis virus and method for hepatitis virus removal or concentration |
| US4540573A (en) * | 1983-07-14 | 1985-09-10 | New York Blood Center, Inc. | Undenatured virus-free biologically active protein derivatives |
-
1989
- 1989-02-09 JP JP1030312A patent/JP2852307B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008120801A1 (ja) | 2007-04-02 | 2008-10-09 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | アンチトロンビン組成物の製造方法 |
| US8076462B2 (en) | 2007-04-02 | 2011-12-13 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd | Method for producing antithrombin composition |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02209814A (ja) | 1990-08-21 |
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